KR20120026927A - 신규한 ｒｎａ 결합 단백질 및 이를 이용한 무표지 마이크로 ｒｎａ 검출방법 - Google Patents

신규한 ｒｎａ 결합 단백질 및 이를 이용한 무표지 마이크로 ｒｎａ 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 RNA 결합 단백질, 이를 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물, 및 이를 이용하여 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 3’말단이 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 RNA 결합 단백질을 이용하여 마이크로 RNA 를 검출하는 방법은, 효소적 표지과정 또는 증폭반응 없이 마이크로 RNA를 탐지하는 무표지 마이크로 RNA 검출 방법으로서, 기존의 마이크로 RNA 분석방법, 즉 효소적 방법으로 표지 후 분석하는 방법 또는 항체를 마이크로 RNA 에 결합하는 방법에 있어서, 공정이 복잡한 단점 또는 불안정한 RNA 구조로 인해 RNA 구조에 특이적인 항체의 개발이 어려운 단점을 해결할 수 있다. 이는 다양한 질환에서 유전자의 발현연구, 질환의 진단마커의 탐색 및 약물의 효율성 평가에 활용할 수 있는 등의 다양한 가능성을 갖는다.

Description

신규한 ＲＮＡ 결합 단백질 및 이를 이용한 무표지 마이크로 ＲＮＡ 검출방법 {Novel structure-specific RNA binding protein and method for array detection of label-free microRNA using the same}
본 발명은 신규한 RNA 결합 단백질, 이를 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물 및 이를 이용하여 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(microRNAs, miRNAs)는 바이러스, 식물 및 동물에서 유전자 발현을 조절하는 작은 비-암호화되는 RNA 의 종류로써(19~25 뉴클레오타이드), 이들은 DNA에 의해 암호화된다. 이들은 게놈으로부터 전사 후, 단편으로 잘라져서 특정 단백질의 생성을 증가시키거나 감소시키는 역할을 한다. 현재까지 포유류에서 알려진 마이크로RNA의 기능은 인슐린 분비 조절, 임파구 분화 조절, 세포분열 조절,세포사멸 조절,바이러스 복제 조절 등이다.최근에는 암을 비롯한 질병과 마이크로RNA의 관련성이 드러나면서 학계뿐만 아니라 산업계의 관심이 쏠리고 있다. 마이크로RNA 발현 패턴을 이용한 질병 진단물질이 매우 활발히 개발돼 암을 발견하기 위한 방법으로 활용되고 있다. 예를 들어 마이크로R-16, let-7과 같은 마이크로RNA들은 획기적인 진단물질로 인정받고 있다.
또한 과학자들은 마이크로RNA가 세포 내 각종 경로에 관여할 것으로 예상한다. 따라서 이 마이크로 RNA는 신약 개발의 유망한 타겟으로 주목받고 있다. 마이크로 RNA 연구의 큰 흐름은 암의 발생 경로에서 기능을 하는 마이크로RNA와 단백질을 살펴보는 것이다. 이렇게 암을 비롯한 질병과 마이크로RNA의 관련성이 드러나면서 학계뿐만 아니라 산업계의 관심이 쏠리고 있으며 이에 마이크로RNA를 탐지하는 기법은 더욱 발전하고 있다.
한편, 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일 분석은 분자 생물학 분야에서 가장 중요한 접근 방법의 하나로 사용되고 있다. 기존 기법은 한 번에 한 개 또는 소수의 유전자들을 대상으로 한 측정방법이었던데 반해, 마이크로어레이 기술은 동시에 수천 개의 유전자발현을 측정할 수 있다.
마이크로 어레이-기반 검출은 동시에 많은 수의 마이크로RNA 발현을 분석하기 위한 효율적인 방법을 제공한다. 다양한 연구들은 마이크로 RNA를 위한 신규의 탐침자를 제작하고, 표지 방법 및 성공적인 어레이-기반 마이크로 RNA 분석 실행을 증명하였다. 그러나, 프로토콜상의 많은 기술적 가변성 때문에 실험방법의 일반화에는 부족한 점이 많아서 임상과 연구 분야에서 이러한 분석의 폭 넓은 사용은 제한되어 있는 실정이다. 특히, 마이크로 RNA 표지 과정은 실험적인 가변성이 발생하는 결정적인 원인이었다.
현재, 대부분의 마이크로 RNA 표지 방법은 칩 표면 탐침자에 혼성화 (hybridization) 하기 전에 (또는 후에) 표적 마이크로 RNA 에 직접 또는 간접 효소 표지 반응을 이용한다. 확실하고 효과적인 분석을 위해서, 더 나은 일관성(consistency)을 가지는 중합과 마이크로 RNA 상의 연결(ligations)반응을 실행하는 것에 초점을 두어왔다. 그러나, 표지와 증폭 반응이 없는 마이크로 RNA 어레이 검출 방법의 개발은 확실하게 과정을 간단하게 할 것이고 마이크로 RNA 분석 연구, 특히 진단 용도에서 더욱 신빙성을 가지게 될 것이다. 하나의 유력한 방법은 표면-결합 마이크로 RNA 에 특이한 항체를 가지고 다양한 항체 검출 방법으로 이 RNA를 검출하는 것이다. 그러나, 지금까지 특이한 RNA 구조에 대한 항체의 개발은 RNA의 불안전한 성질과 같은 이유에서 매우 어려웠다. 오직 하나의 항-RNA 항체 개발의 예가 이미 고도로 구조화되어 있는 표적 RNA 에 대해 보고되었다.
본 발명자들은 이러한 기존의 어려운 마이크로 RNA 의 검출방법에서 벗어나 효소적 표지과정 또는 증폭반응 없이 보다 간단하게 구조-특이적인 RNA 결합 단백질을 이용하여 마이크로RNA를 탐지하는 무표지 마이크로 RNA 검출방법을 고안하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 파즈(PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille) 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 3말단이 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 것인 RNA 결합 단백질을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 이용하여 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 파즈(PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille) 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 3말단이 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 것인 RNA 결합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 3말단이 2 뉴클레오티드 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합할 수 있다.
상기 파즈 도메인은 인간 아르고노트(Argonaute) 단백질 또는 인간 다이서(Diecer) 단백질로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 이중가닥 RNA 결합 도메인은 인간 다이서(Dicer) 단백질, 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) RNA-결합 단백질 A (XlrbpA), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) RNase III (Aa-RNase III) 단백질 및 이 콜라이(Escherichia coli) RNase III (Ec-RNase III) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 융합 단백질은 파즈 도메인의 C 말단에 이중가닥 RNA 결합 도메인이 연결된 구조일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있고, 바람직하게는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 포함된 융합 단백질은 비오틴으로 표지될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 이용하여 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은, 어레이 칩 상에 탐침자 올리고 뉴클레오타이드를 결합시키는 단계; 마이크로 RNA를 포함하는 시료를 첨가하여 상기 탐침자와 마이크로RNA를 상보적 결합시키는 단계; 상기 융합 단백질을 첨가하여 상기 융합 단백질을 상기 탐침자와 결합된 마이크로 RNA에 결합시키는 단계; 및 상기 융합 단백질로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 융합 단백질은 비오틴으로 표지 될 수 있다.
본 발명에서 파즈(PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille) 도메인은 RNA-침묵 (RNA-silencing) 경로의 중요 구성 요소인 다이서(Dicer) 및 아르고노트(Argonaute) 단백질 군의 단백질에 진화적으로 보존된 도메인으로서, 인간 아르고노트 1(Ago1 또는 eIF2C1), 인간 아르고노트 2(Ago2 또는 eIF2C2), 피위(piwi) 유사 1 단백질(Piwi-like 1), 인간 다이서(Diecer) 단백질로부터 유래할 수 있고, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특히, eIF2C1(eukaryotic translation initiation factor 2C 1) 단백질의 파즈 도메인(서열번호 2)은 225-369 아미노산으로 구성되어 있고, 상기 파즈 도메인의 C 말단의 20개의 아미노산은 단일가닥 RNA 에 비특이적으로 결합하므로, 상기 20개 아미노산을 제외한 225-349 아미노산으로 구성된 파즈 도메인(서열번호 1)을 사용할 수 있다.
본 발명에서 이중가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)은 많은 RNA-결합 단백질에 보존된 도메인으로서, 인간 다이서(Dicer) 단백질, 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) RNA-결합 단백질 A (XlrbpA), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) RNase III (Aa-RNase III) 단백질, 이 콜라이(Escherichia coli) RNase III (Ec-RNase III) 단백질로부터 유래할 수 있고, 서열번호 4, 5, 6 또는 7의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 dsRBD 단백질들은 65-70 아미노산의 구조모티브를 가질 수 있다.
도 1에 RNA 결합 모티브을 형성하는 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인의 예를 나타내었다.
또한, 상기 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 파즈(PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille) 도메인 또는 이중가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD) 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시킬 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 10 내지 16의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 유전자 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 다 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본 발명에서 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 모두 포함하도록 재조합한 단백질로서, 본 발명에서 PAZ-dsRBD 단백질도 동일한 의미를 가진다.
상기 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 각 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 클로닝하여 발현시킬 수 있다. 구체적으로는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 핵산을 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질에서, 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 링커 펩타이드로는 통상적으로 사용되는 잘 구부러지는(flexible) 링커 펩타이드를 사용할 수 있고, GGSGGT 아미노산 서열(서열번호 17), GGGGS 아미노산 서열(서열번호 18), GGGGSGGGGS 아미노산 서열(서열번호 19)을 가지는 링커 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 펩타이드는 상기 링커 펩타이드를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 3말단이 2 뉴클레오티드 돌출된 이중가닥 RNA는, 이중가닥 RNA 양쪽의 3' 말단에 돌출된 2 개의 뉴클레오티드 잔기가 나온 이중가닥 RNA를 의미한다. 본 발명에서 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA도 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 인간 아르고노트 1 (eIF2C1) 에서 유래된 파즈 도메인 (225-349 아미노산)(서열번호 1)과 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) RNase III (Aa-RNase III)에서 유래된 dsRBD (서열번호 6)을 결합한 단백질은 칩 표면 또는 단일가닥 포획 탐침자 RNA 와 가장 낮은 비특이적 결합력을 보여 주었다. 또한, 상기 단백질은 단일가닥의 RNA 보다는 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA에 더욱 특이적으로 결합함을 확인하였다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 파즈 도메인만 포함하는 단백질에 비하여 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은 칩 표면에 결합된 이중가닥 마이크로 RNA 에 더욱 향상된 결합 안정성을 보였다. 파즈 도메인이 dsRNA 에 결합하게 되면, dsRNA 의 약 7개의 염기쌍을 덮게 되고, 덮이지 않은 dsRNA에 dsRBD 가 특이적으로 결합하여, 탐침자와 혼성화(hybridized)된 마이크로 RNA 에 대한 파즈 도메인의 결합력을 높일 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서, 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 마이크로 RNA에 대한 PAZ-dsRBD 단백질의 결합력이 단독 파즈 도메인만 포함하는 단백질의 결합력보다 2배 이상 강한 것을 알 수 있었다. PAZ-dsRBD 단백질의 친화력 상수는 7.3nM 로서 이는 보통의 항체-항원 결합과 견줄만한 수치이다.
본 발명에서 마이크로 RNA 검출을 위한 마이크로 어레이 분석은 당해 분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 구체적으로 공지된 방법으로 어레이 칩 상에 탐침자 올리고뉴클레오타이드를 결합시킬 수 있다. 그 후, 무표지 마이크로 RNA 를 포함하는 시료를 첨가하여 상기 탐침자와 마이크로RNA를 상보적 결합시키고, 상기 융합 단백질을 첨가하여 상기 융합 단백질을 상기 탐침자와 결합된 마이크로 RNA에 결합시켜, 상기 융합 단백질로부터 발생하는 신호를 검출할 수 있다. 상기 융합 단백질은 비오틴으로 표지될 수 있고, 스트렙타비딘에 결합된 신호발생물질을 이용하여 신호를 검출할 수 있다. 상기 비오틴 표지는 비오틴화 펩타이드 서열, 예를 들어 GLNDIFEAQKIEWHE (서열번호 20) 을 융합단백질 N-말단에 부가하여 수행할 수 있다. 구체적으로는, 상기 비오틴화 펩타이드 서열이 부가된 융합단백질을 코딩하는 핵산을 발현벡터에 삽입하고, 비오틴 리가아제를 생산하는 숙주 세포를 상기 발현벡터로 형질전환 시키고, 상기 숙주 세포를 비오틴 존재 하에서 배양하여 비오틴 표지된 융합 단백질을 생산할 수 있다.
상기 신호는 형광 신호일 수 있다. 상기 '신호발생물질' 로는 형광을 낼 수 있는 물질을 사용할 수 있으며, 구체적으로 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA)등을 포함하는 로다민계; 플루오세인, FITC (fluorescein isothiocyanate) 및 FAM (fluorecein amidite)등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein); 보디피계(bodipy, boron-dipyrromethene); 알렉사플로어계 (alexa fluor); 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형광 신호는 공지된 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '혼성화'란 두 RNA 서열이 서로 상보적인 부분끼리 결합한 것을 말한다.
본 발명에서의 용어 '탐침자' 또는 '포획 탐침자'란 타겟 핵산과 결합하기 위해 만들어진 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 탐침자 올리고뉴클레오타이드의 길이는 제한되지 않으나, 바람직하게는 15 내지 28 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 탐침자는 타겟 핵산의 서열, 융해 온도(Tm) 등을 고려하여 제작할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 융합 단백질을 이용하여 마이크로 RNA 를 검출한 결과, 타겟 마이크로 RNA 에 특이적인 높은 형광신호를 관찰할 수 있었고, 상기 형광 신호 강도는 타겟 마이크로 RNA 농도에 의존적이었다.
본 발명의 파즈 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 3말단이 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 RNA 결합 단백질을 이용하여 마이크로 RNA 를 검출하는 방법은, 효소적 표지과정 또는 증폭반응 없이 마이크로 RNA를 탐지하는 무표지 마이크로 RNA 검출 방법으로서, 기존의 마이크로 RNA 분석방법, 즉 효소적 방법으로 표지 후 분석하는 방법 또는 항체를 마이크로 RNA 에 결합하는 방법에 있어서, 공정이 복잡한 단점 또는 불안정한 RNA 구조로 인해 RNA 구조에 특이적인 항체의 개발이 어려운 단점을 해결할 수 있다. 이는 다양한 질환에서 유전자의 발현연구, 질환의 진단마커의 탐색 및 약물의 효율성 평가에 활용할 수 있는 등의 다양한 가능성을 갖는다.
도 1은 RNA 결합 모티브을 형성하는 PAZ 도메인과 dsRNA 결합도메인을 나타낸다.
도 2는 단일가닥 RNA 포획 탐침자에 대한 전체길이 (225-369 아미노산) PAZ 도메인과 불완전한 PAZ 도메인 (225-349 아미노산) 의 결합력을 SPR sensorgram으로 측정한 것이다.
도 3은 (A) 인간 eIF2C1 에서 유래한 불완전한 PAZ 도메인(225-349 아미노산)과 (B) PAZ-dsRBD 의 단일가닥 RNA 포획 탐침자와 혼성화된 마이크로 RNA 에 대한 결합력을 SPR sensorgrams으로 측정한 것이다.
도 4는 (A)PAZ 와 (B)dsRBD 의 구조를 모식화한 것이며, (C)혼성화된 dsRNA 에 결합된 PAZ-dsRBD 을 모식화한 도면이다.
도 5는 (A)PAZ 의 N 말단에 dsRBD가 연결된 dsRBD-PAZ 구조의 모식도 (B)PAZ의 C 말단에 dsRBD 가 연결된 PAZ-dsRBD 구조 모식도 (C)단일 비오틴이 BPS (biotinylation peptide sequence)에 의해 PAZ-dsRBD 단백질의 N-말단에 도입된 구조 모식도이다.
도 6은 dsRBD-PAZ 와 PAZ-dsRBD 단백질의 혼성화된 dsRNA에 대한 결합력을 SPR sensorgrams 으로 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 과량의 tRNA (50 ug/mL)가 있을 때, (A) PAZ 도메인과 (B) PAZ-dsRBD이 단일가닥 RNA 포획 탐침자와 혼성화된 이중가닥 마이크로 RNA 에 결합되었을 때 SPR sensorgrams 을 측정한 것이다.
도 8은 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥RNA 와 (A) PAZ 그리고 (B) PAZ-dsRBD 결합상수을 측정한 것이다. 각각 다른 단백질 농도에서의 적합한 안정화된 상태의 결합수준은 다음 등식 Req = CRmax/(Kd + C)에 의해 나타내어 지며, Rmax 와 Kd 값은 각각의 적합한 플롯에 삽입되어 그 값을 얻을 수 있다. 세 번의 독립적인 실험을 수행한 후, 그 평균값을 플롯위에 나타내었다.
도 9는 합성 마이크로 RNA의 마이크로어레이 검출 결과를 나타낸다. (A) 마이크로R96 검출의 형광 이미지로서, 4개의 RNA 포획 탐침자 (마이크로R24, 마이크로R96, 마이크로R1, 마이크로R424)를 유리 슬라이드 위에 스팟시키고 마이크로R96이 다양한 농도로 표면에 적용되었다. 혼성화된 마이크로R96는 실시예에서 설명했듯이 비오틴화 PAZ-dsRBD/Cy3-스트렙타비딘에 의해 검출되었다. (B) 상대적인 마이크로R1(red square)와 마이크로R96(black square)의 형광 강도가 마이크로 RNA 농도 의존적임을 보여준다.
도 10은 PAZ-dsRBD 도메인 구조 (위) 와 단독 PAZ 도메인구조 (아래)의 마이크로 RNA 96 의 어레이 검출결과이다.
도 11은 조직 특이적 전체 RNA 추출물로부터 4개의 마이크로 RNA 인간 형광 마이크로어레이 검출 결과를 나타낸다. 인간 간 (왼쪽 이미지) 또는 심장 (오른쪽 이미지) 전체 RNA 추출물 (5 ug)은 유리 슬라이드에 분별된 탐침자에 직접 적용되었다. 혼성화된 마이크로RNAs는 본문에서 설명했듯이 비오틴화 PAZ-dsRBD/Cy3-스트렙타비딘에 의해 보편적으로 검출되었다. Spike-in 마이크로R96 (100 pM)이 간RNA 추출물 (가운데 이미지)에 더해졌다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 제조예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 및 제조예 들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 제조예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예 및 제조예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1. 구조-특이적인 RNA 결합 단백질인 PAZ - dsRBD 단백질의 제작
1-1. RNA 결합 모티브인 PAZ 도메인과 RNA 결합도메인 (RBD) 특성확인 및 준비
본 실시예에서 PAZ 도메인은 인간 eIF2C1(225-369 아미노산) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 11), 인간 eIF2C1(225-349 아미노산) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 10), 인간 다이서(Diecer) 단백질을 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 12)을 사용하였다. 이 유전자들은 HeLa cDNA 로부터 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭되었다. 이렇게 증폭된 PCR산물은 재조합 단백질을 발현하기 위해 Novagen 에서 제공된 pET28a 발현벡터에 클로닝하였다.
본 실시예에서의 dsRBD (double stranded RNA binding domains) 는 인간 다이서(Dicer) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 13), Xenopus laevis RNA-결합 단백질 A (XlrbpA) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 14), Aquifex aeolicus RNase III (Aa-RNase III) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 15), 그리고 Escherichia coli RNase III (Ec-RNase III) 인코딩하는 유전자에서 유래한 것(서열번호 16)을 사용하였다. 이 dsRBD 단백질은 65-70 아미노산 구조모티브를 가지며, 상기 단백질에 대한 유전자는 합성되어 작제되었다. 상기 작제된 유전자를 또한 pET28a 발현벡터에 클로닝 하였다.
1-2. PAZ 도메인과 RNA 결합도메인( RBD ) 단백질의 발현과 정제
상기 두 도메인을 인코딩하는 유전자를 가진 발현 플라스미드를 Escherichia coli BL21 (DE3) 세포에 형질전환(transformation) 하여, 37℃에서 OD600 = 0.6 까지 배양 한다. 1 mM 의 IPTG (isoprophyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 사용하여, 25℃에 하룻동안 배양하며 단백질 발현을 유도한다. 이렇게 유도된 세포를 초음파를 이용하여 세포를 깬 후, 여기서 얻은 세포 용해물을 0.1 % 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)과 함께 섞어서, RNA 결합 단백질에 비특이적으로 붙었던 핵산을 침전시킨다. 그 다음, 투석으로 잔여 폴리에틸렌이민을 제거하고 니켈-킬레이팅 컬럼과 헤파린 하이트랩 컬럼을 이용하여 PAZ 도메인 단백질과 RNA 결합도메인(RBD)단백질을 정제한다. 정제된 단백질들은 PBS 완충용액으로 투석하고, 추가적으로 100 mM NaCl 과 1 mM DTT을 넣어서 이 단백질을 사용하기 전까지 -20℃에 보관한다.
1-3.가장 이상적인 PAZ 단백질 도메인의 선택
상기 3가지 다른 유래의 PAZ 단백질 도메인 중 가장 RNA 포획 탐침자에 결합력이 높은 이상적인 PAZ 단백질 도메인을 선택하기 위해 SPR sensorgrams 실험을 수행하였다. 그 결과,인간 eIF2C1 단백질에서 유래한 PAZ 도메인은 E.coli 에서 발현이 잘 되었으나. 반면에 인간 다이서 단백질에서 유래한 PAZ 도메인은 높은 불용성을 가졌다. 따라서 가장 이상적인 PAZ 도메인을 선택하고자, 인간 eIF2C1 PAZ 도메인 (225-369 아미노산; 전체길이)을 갖는 PAZ 도메인과 단일가닥 RNA 에 비특이적으로 결합하는 PAZ 도메인의 C 말단의 20개의 아미노산을 제거한 225-349 아미노산을 가진 불완전한 PAZ 도메인을 비교하여 다양한 RNA 에 대한 높은 결합력을 갖는 도메인을 선택하고자 단일가닥 RNA 포획 탐침자에 대한 결합력을 SPR sensorgrams 을 이용하여 측정하였다(도 2).
SPR 측정은 Biacore 3000 장치 (Biacore AB)에서 CM5 골드칩을 사용하여 수행하였다. 보다 상세하게는, Pierce 에서 제공한 NeutrAvidin을 CM5 골드칩의 4개 의 플로우 셀(flow cell)에 동시에 고정시키고, 비오틴화-단일가닥 RNA 포획 탐침자를 각 채널에 유속 10ul/분으로 5분동안 도입하였다. 마이크로 RNA 를 주입함으로써, 2-nt 3' 말단을 가진 이중가닥 RNA 가 형성되었다. 100nM의 PAZ 도메인 단백질을 10ul/분 속도로 주입하였다. 표 1 에 단일가닥 RNA 포획 탐침자 서열을 명시하였다.
Figure pat00001
그 결과, 도 2에서 보여주듯이, 불완전한 PAZ 도메인 (225-349 아미노산)이 전체-길이의 PAZ 도메인 (225-369 아미노산)에 비해, 단일가닥 RNA 포획 탐침자에 낮은 결합력을 가진다는 것을 알 수 있다. 그러나, 마이크로 RNA 어레이 검출방법에서는 포획 탐침자에 비특이적인 결합을 낮추는 것이 더욱 중요하므로, 비록 전체길이의 PAZ 가 이중가닥 RNA 에 조금 높은 결합력을 보였더라도, 본 발명에서는 불완전한 PAZ 도메인 (225-349 아미노산)을 선택하였다.
1-4. 가장 이상적인 RNA 결합도메인( RBD ) 단백질의 선택
상기 4가지 다른 유래의 dsRBD 중에서 dsRNA 에 가장 결합력이 높은 RBD 단백질을 선택하고자 실험을 수행하였다. XlrbpA-dsRBD 을 제외한 대부분의 dsRBD 도메인은 E. coli 에서 발현과 분리가 잘 되었으며, 또한 비슷한 dsRNAs 의 결합력을 보여주었다. 그러나 Aquifex aeolicus RNase III 에서 유래된 dsRBD 은 칩표면과 가장 낮은 비특이적 결합력을 보여 주었다. 따라서, 본 발명에서는 Aquifex aeolicus RNase III 에서 유래된 dsRBD를 선택하여 사용하였다.
1-5. PAZ 도메인과 마이크로 RNA ( ssRNA 또는 dsRNA ) 와의 결합력 실험
우선, 상기 실험을 통해 선택된 인간 아르고노트 eIF2C1 에서 유래된 일부분 끝이 잘린 불완전한 PAZ 도메인(도 3A)을 단일가닥 RNA 탐침자와 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA 에 결합하여 이들의 결합력을 SPR sensorgram 측정하였다.
그 결과, 도 3A 에서 보여주듯이, 단일가닥의 RNA 보다는 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA에 더욱 특이적으로 결합함을 알 수 있다. 그러나, 이 경우에서는 타겟 RNA (ssRNA 와 dsRNA) 에 빠르게 결합을 하는 것을 보였으나, 또한 결합한 RNA 로부터 더욱 빠르게 분리되는 것을 알 수 있다. 따라서 표면 RNA 의 안정적인 검출을 하는데 어려움이 따른다.
따라서, PAZ 도메인에 이차적으로 RNA 결합 모티브(RNA binder)를 도입함으로 더욱 안정적인 RNA-PAZ 복합체를 만들었다 (도 4). PAZ 도메인은 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA 에 특이적으로 결합하는 특성을 가지고(도 4A), PAZ 도메인이 dsRNA 에 결합하게 되면, dsRNA 의 약 7개의 염기쌍을 덮게 된다(도 4A). 이 때, 이차적인 RNA 결합 모티브인 RNA 바인더(dsRBD; double strand RNA Binding Domain)(도 4B)을 도입함으로써, 덮이지 않은 dsRNA에 dsRBD 가 특이적으로 결합하여, 탐침자와 혼성화(hybridized)된 마이크로 RNA 에 대한 PAZ 의 결합력을 높인다 (도 4C).
1-6. PAZ 도메인과 dsRBD 도메인의 최적 연결 구조 확인
앞서 선택된 Aquifex aeolicus RNase III 에서 유래된 dsRBD를 불완전한 PAZ 도메인 N-말단과 C-말단에 연결시킨 후(도 5A,B), 어떤 연결구조가 2-nt 3'말단을 가진 혼성화된 이중가닥 RNA에 더욱 높은 결합력을 가지는지에 대한 실험을 수행하였다 (도 6). 보다 상세하게는 PAZ의 C 말단에 dsRBD 가 연결된 PAZ-dsRBD 구조(도 5B)와 PAZ 의 N 말단에 dsRBD가 연결된 dsRBD-PAZ 구조 (도 5B)의 혼성화된 dsRNA 에 대한 결합력을 SPR sensorgram으로 측정해보았다.
그 결과, 도 6 에서 보여주듯이, PAZ의 C 말단에 dsRBD 가 연결된 PAZ-dsRBD 구조가 PAZ 의 N 말단에 dsRBD가 연결된 dsRBD-PAZ 구조보다 혼성화된 dsRNA 에 대한 결합력이 높음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 PAZ 도메인의 C말단에 dsRBD 를 연결시킨, PAZ-dsRBD 을 사용하였다.
1-7. PAZ - dsRBD 와 마이크로 RNA ( ssRNA 또는 dsRNA ) 와의 결합력 실험
PAZ-dsRBD 의 단일가닥 RNA 탐침자와 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA 에 대한 결합력을 측정하였다(도 3B).
그 결과, 도 3B 에서 보여주듯이, 단일가닥의 RNA 보다는 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 RNA에 더욱 특이적으로 결합함을 알 수 있으며, 도 3A 와 비교하여 PAZ 도메인만 결합하는 경우에서는 결합했던 타겟 RNA (ssRNA 와 dsRNA) 로부터 빠르게 분리되는 것에 반해 PAZ-dsRBD 의 경우는 칩 표면에 결합된 이중가닥 마이크로 RNA 에 더욱 향상된 결합안정성을 보이며, 타겟 RNA (ssRNA 와 dsRNA) 로부터 빠르게 분리되는 것을 늦출 수 있게 되었다(도 3B).
또한 결합용액 PBS 에 과량의 tRNAs (50ug/ml)을 넣어 주었을때 불완전한 PAZ-dsRBD 와 혼성화된 마이크로RNA의 결합력을 실험해 보았다(도 7). 그 결과 심지어 과량의 tRNA가 있을 때에도, PAZ-dsRBD 는 2-nt 3'말단을 가진 혼성화된 마이크로RNA 에 특이하고 안정적으로 결합하는 것을 보였다.반면에 단일가닥 포획 RNA 에는 매우 낮은 결합력을 보였다(도 7B). 더욱 주목할 만한 것은 PAZ-dsRBD의 결합속도가 PAZ 단독으로 있을 때 보다 느리다는 것이다. 그러나, 결합되었던 혼성화된 마이크로 RNA 로부터 떨어지는 속도는 PAZ-dsRBD 가 훨씬 느린것을 알 수 있다. 따라서, 이것으로 PAZ-dsRBD 가 마이크로 RNA 어레이 검출에 적합하다는 것을 알 수 있다.
또한 표면에 결합된 마이크로 RNA (혼성화된 마이크로 RNA)에 대한 PAZ-dsRBD 단백질과 단독 PAZ단백질의 친화력상수 (affinity constant Kd)를 SPR 장치를 사용하여 측정해 보았다(도 8). 보다 상세하게는 SPR 칩 표면을 타겟 이중나선 마이크로 RNA로 덮고, 여기에 다양한 농도의 PAZ 와 PAZ-dsRBD 단백질 (3nM~300nM)을 결합의 안정상태에 이를 때까지 유속 5ul/분으로 고정된 RNA 에 첨가해 주었다. 안정 상태에서 SPR 결합반응은 등식 Req = CRmax/(Kd + C)에 따라서 첨가해준 단백질의 농도에 연관이 된다는 것을 알 수 있다. 여기서 Rmax 은 이론적인 결합력을 나타내며, Kd 는 친화력 상수 (affinity constant)을 나타내며, C 는 단백질의 농도를 나타내고, Req 의 값은 SPR sensorgrams의 안정상태에서 측정 되어진다.
그 결과 도 8 에서 보여주듯이, 상기 등식에 따라 단백질 농도에 따른 안정상태의 결합수준의 가장 적합한 플롯을 그릴 수 있다. 2-nt 3'말단을 가진 이중가닥 마이크로 RNA에 대한 PAZ-dsRBD 단백질의 결합력이 단독 PAZ 단백질의 결합력보다 2배 이상 강한 것을 알 수 있다.PAZ-dsRBD 단백질의 친화력 상수는 7.3nM 로서 이는 보통의 항체-항원 결합과 견줄만한 수치이다.
실시예 2. PAZ - dsRBD 구조를 이용하여 유리슬라이드에서 합성 인간 마이크로RNA 의 어레이 검출실험
제작한 PAZ-dsRBD 을 사용하여, 유리슬라이드에서 합성 인간 마이크로 RNA 을 검출하였다. COOH- 기능화된 유리슬라이드 (COOH-functionalized glass slides)는 Nanocs 에서 제공한 아민-기능화된 유리 슬라이드 (amine-functionalized glass slides)을 DMF 에서 1 M 숙신 무수물(succinic anhydride)과 함께 37℃에서 하룻동안 반응을 시켜서 만든다. 그 결과 만들어진 카르복실 유리 슬라이드는 0.1 M EDC 와 0.025 M NHS 혼합용액에 15분간 둠으로써 활성화 시킨다. C10-아민 변경된 RNA 포획 탐침자는 이 기능화된 칩 위에 스팟으로 위치하게 된다. 표 1 에 본 발명에서 사용한 마이크로RNA 들의 서열과 그에 상응하는 RNA 포획 탐침자의 서열이 명시되어 있다.
스팟 유리 슬라이드상의 마이크로 RNA 의 혼성화는 혼성화 챔버에서 수행 되었다. 유리 슬라이드는 5XSSC, 0.1% SDS 그리고 3ul의 RNase 저해제 (20 unit)을 포함한 0.1ml 의 혼성화 용액 내에서 다양한 농도의 마이크로 RNA 96(50,100,500pM)로 처리되었다. 25℃에서 하룻동안 혼성화 시킨 후, 어레이를 0.1% SDS 를 포함하는 2XSSC 로 세척 후, SDS 가 없는 상태에서 2X SSC 용액으로 37℃ 에서 40~60분 세척과정을 거친다.
그 후, 마이크로 어레이 포맷인 유리슬라이드 (어레이칩) 표면에 3'말단으로 결합되어 있는 마이크로 RNA 탐침자 (마이크로RNA24, 마이크로RNA96, 마이크로RNA1, 마이크로RNA424)에 다양한 농도의 마이크로 RNA 96 (50,100,500pM)를 넣어주었다(도 9A).
이때, 마이크로 RNA 탐침자와 혼성화된 마이크로 RNA 96 은 비오틴화- PAZ-dsRBD/Cy3-스트렙타비딘에 의해 검출되게 된다. 보다 상세하게는, 비오틴-PAZ-dsRBD 단백질 (100 nM)을 유리 슬라이드에 첨가하고, 0.1 mg/mL BSA, 50 ug/mL tRNA, 1 mM DTT, 그리고 0.05% Tween20 으로 유리 슬라이드를 세척한다. 상기 비오틴-PAZ-dsRBD 단백질은 비오틴화 펩타이드 서열인 GLNDIFEAQKIEWHE (서열번호 20) 이 N-말단에 부가된 융합단백질을 코딩하는 핵산을 pProExHTa (Invitrogen) 발현벡터에 삽입하고, 비오틴 리가아제 BirA 를 생산하는 pACYC184 플라스미드를 함하는 AVB101(Avidity) E. Coli B 균주 (hsdR, lon11, SulA1) 세포를 상기 발현벡터로 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 세포를 50uM 비오틴 존재 하에서 배양하여 생산하였다. 결합된 비오틴-PAZ-dsRBD 단백질은 시그마에서 제공된 1 ug/mL Cy3-스트렙타비딘을 표지하게 된다. 이렇게 만들어진 어레이 슬라이드는 PBST 와 0.1X PBS로 세척과정을 거쳐서 질소가스로 말린 후 최종적으로 형광 스캐닝의 분석에 사용되게 된다.
그 결과, 도 9A 에서 보여주듯이 타겟 마이크로 RNA 인 마이크로 RNA 96 에 특이한 높은 형광신호를 관찰할 수 있다.
또한,형광 신호 강도가 마이크로 RNA 의 농도에 의존적인지를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 두 가지 다른 마이크로 RNA인 마이크로 RNA 1 (Red square) 와 마이크로 RNA 96 (black square)의 농도에 따른 상대적인 형광 신호 강도를 측정하였다. 상대적인 형광 신호 강도는 마이크로 RNA 스팟의 형광강도를 포획 RNA 만 존재하는 스팟의 형광강도로 나눈 값으로 얻을 수 있다(도 9B).
그 결과, 도 9B 에서 보여주듯이, 10pM ~500pM 의 농도의 범위에서 형광 신호 강도는 마이크로 RNA 농도에 의존적이었다.
실시예 3. 단독 PAZ 구조와 PAZ - dsRBD 구조를 이용한 마이크로 RNA 96 의 어레이 검출실험
도 3에서 알 수 있듯이 단독 PAZ 도메인은 타겟 RNA 구조로부터 분리가 PAZ-dsRBD 도메인에 비해 훨씬 빠르다는 것을 알 수 있었다. 따라서 비오틴화 PAZ 도메인(biotin-PAZ)과 비오틴화 PAZ-dsRBD (biotin-PAZ-dsRBD)를 사용하여 마이크로 RNA 96 어레이 검출을 수행, 비교해 보았다. 이때, 마이크로 RNA 96은 포화 농도인 1 nM을 포획 탐침자 스팟 슬라이드에 첨가해 주었다.
그 결과, 도 10에서 보여 주듯이, 단독 PAZ 도메인은 PAZ-dsRBD 도메인과 비교하여 마이크로 RNA 96 어레이 검출에서 매우 비효율적이라는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 인간조직에서의 4가지 다른 마이크로 RNA 의 (마이크로 RNA24 , 마이크로RNA96, 마이크로 RNA1 ,마이크로 RNA424 ) 발현패턴 실험
인간 심장 또는 간조직에서 RNA 추출(5ug)한 후 이것을 0.1ml의 혼성화 용액과 함께 포획 탐침자가 있는 마이크로어레이 칩(유리슬라이드)에 직접 도입하여 혼성화 시켰다. 혼성화된 마이크로 RNA 는 비오틴-PAZ-dsRBD/Cy3-스트렙타비딘 단백질에 의해 측정되었다.
그 결과, 도 11에서 보여주듯이 인간 간조직과 심장조직에서 다른 마이크로RNA24 와 마이크로 RNA1 의 발현수준을 관찰할 수 있었다. 심장조직에서 마이크로RNA1이 많이 발현되며, 반면에 간조직에서는 매우 낮은 수준의 마이크로 RNA1 이 발현되었다. 마이크로 RNA24 의 발현패턴은 심장조직에서는 ~205pM, 간조직에서는 ~65pM의 발현 패턴을 보였다. 또한 간조직에 추가적으로 합성 마이크로 RNA96 을 첨가하였을 때 (도 11의 가운데 도), 이것 또한 효율적으로 검출됨을 알 수 있다. 그리고 심장과 간 조직 모두에서 마이크로 RNA424 와 마이크로 RNA96의 발현수준이 매우 낮은 것을 알 수 있다(도 11).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel structure-specific RNA binding protein and method for array detection of label-free microRNA using the same <130> PA100501 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Pro Val Ile Glu Phe Met Cys Glu Val Leu Asp Ile Arg 1 5 10 15 Asn Ile Asp Glu Gln Pro Lys Pro Leu Thr Asp Ser Gln Arg Val Arg 20 25 30 Phe Thr Lys Glu Ile Lys Gly Leu Lys Val Glu Val Thr His Cys Gly 35 40 45 Gln Met Lys Arg Lys Tyr Arg Val Cys Asn Val Thr Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Ser His Gln Thr Phe Pro Leu Gln Leu Glu Ser Gly Gln Thr Val Glu 65 70 75 80 Cys Thr Val Ala Gln Tyr Phe Lys Gln Lys Tyr Asn Leu Gln Leu Lys 85 90 95 Tyr Pro His Leu Pro Cys Leu Gln Val Gly Gln Glu Gln Lys His Thr 100 105 110 Tyr Leu Pro Leu Glu Val Cys Asn Ile Val Ala Gly Gln Arg 115 120 125 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gln Pro Val Ile Glu Phe Met Cys Glu Val Leu Asp Ile Arg 1 5 10 15 Asn Ile Asp Glu Gln Pro Lys Pro Leu Thr Asp Ser Gln Arg Val Arg 20 25 30 Phe Thr Lys Glu Ile Lys Gly Leu Lys Val Glu Val Thr His Cys Gly 35 40 45 Gln Met Lys Arg Lys Tyr Arg Val Cys Asn Val Thr Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Ser His Gln Thr Phe Pro Leu Gln Leu Glu Ser Gly Gln Thr Val Glu 65 70 75 80 Cys Thr Val Ala Gln Tyr Phe Lys Gln Lys Tyr Asn Leu Gln Leu Lys 85 90 95 Tyr Pro His Leu Pro Cys Leu Gln Val Gly Gln Glu Gln Lys His Thr 100 105 110 Tyr Leu Pro Leu Glu Val Cys Asn Ile Val Ala Gly Gln Arg Cys Ile 115 120 125 Lys Lys Leu Thr Asp Asn Gln Thr Ser Thr Met Ile Lys Ala Thr Ala 130 135 140 Arg Ser 145 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Ile Asp Phe Lys Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ile Pro Ser Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val 20 25 30 Phe Lys Leu Glu Asp Tyr Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg 35 40 45 Asn Phe Asp Gln Pro His Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp 50 55 60 Leu Thr Pro Leu Ser Lys Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln 85 90 95 Pro Leu Leu Asp Val Asp His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr 100 105 110 Pro Arg His Leu Asn Gln Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala 115 120 125 Glu Lys Arg Lys Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu 130 135 140 Val Pro Glu Leu Cys Ala Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg 145 150 155 160 Lys Ala Val Cys Leu Pro Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu 165 170 175 <210> 4 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Val Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu Glu Met Glu Pro Glu 1 5 10 15 Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Lys Val Arg 20 25 30 Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys Gly Val Gly Arg 35 40 45 Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu Arg Ser 50 55 60 Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val Pro Asn Ser 65 70 75 <210> 5 <211> 70 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 5 Met Asn Pro Val Gly Ser Leu Gln Glu Leu Ala Val Gln Lys Gly Trp 1 5 10 15 Arg Leu Pro Glu Tyr Thr Val Ala Gln Glu Ser Gly Pro Pro His Lys 20 25 30 Arg Glu Phe Thr Ile Thr Cys Arg Val Glu Thr Phe Val Glu Thr Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Lys Gln Val Ala Lys Arg Val Ala Ala Glu Lys Leu 50 55 60 Leu Thr Lys Phe Lys Thr 65 70 <210> 6 <211> 72 <212> PRT <213> Aquifex aeolicus <400> 6 Met Asp Tyr Lys Thr Ile Leu Gln Glu Ile Thr Gln Lys Arg Trp Lys 1 5 10 15 Glu Arg Pro Glu Tyr Arg Leu Ile Ser Val Glu Gly Pro His His Lys 20 25 30 Lys Lys Phe Ile Val Glu Ala Lys Ile Lys Glu Tyr Arg Thr Leu Gly 35 40 45 Glu Gly Lys Ser Lys Lys Glu Ala Glu Gln Arg Ala Ala Glu Glu Leu 50 55 60 Ile Lys Leu Leu Glu Glu Ser Glu 65 70 <210> 7 <211> 68 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Met Pro Ile Ser Gln Val His Glu Ile Gly Ile Lys Arg Asn Met Thr 1 5 10 15 Val His Phe Lys Val Leu Arg Glu Glu Gly Pro Ala His Met Lys Asn 20 25 30 Phe Ile Thr Ala Cys Ile Val Gly Ser Ile Val Thr Glu Gly Glu Gly 35 40 45 Asn Gly Lys Lys Val Ser Lys Lys Arg Ala Ala Glu Lys Met Leu Val 50 55 60 Glu Leu Gln Lys 65 <210> 8 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 8 Met Ala Gln Pro Val Ile Glu Phe Met Cys Glu Val Leu Asp Ile Arg 1 5 10 15 Asn Ile Asp Glu Gln Pro Lys Pro Leu Thr Asp Ser Gln Arg Val Arg 20 25 30 Phe Thr Lys Glu Ile Lys Gly Leu Lys Val Glu Val Thr His Cys Gly 35 40 45 Gln Met Lys Arg Lys Tyr Arg Val Cys Asn Val Thr Arg Arg Pro Ala 50 55 60 Ser His Gln Thr Phe Pro Leu Gln Leu Glu Ser Gly Gln Thr Val Glu 65 70 75 80 Cys Thr Val Ala Gln Tyr Phe Lys Gln Lys Tyr Asn Leu Gln Leu Lys 85 90 95 Tyr Pro His Leu Pro Cys Leu Gln Val Gly Gln Glu Gln Lys His Thr 100 105 110 Tyr Leu Pro Leu Glu Val Cys Asn Ile Val Ala Gly Gln Arg Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Thr Ile Leu Gln Glu 130 135 140 Ile Thr Gln Lys Arg Trp Lys Glu Arg Pro Glu Tyr Arg Leu Ile Ser 145 150 155 160 Val Glu Gly Pro His His Lys Lys Lys Phe Ile Val Glu Ala Lys Ile 165 170 175 Lys Glu Tyr Arg Thr Leu Gly Glu Gly Lys Ser Lys Lys Glu Ala Glu 180 185 190 Gln Arg Ala Ala Glu Glu Leu Ile Lys Leu Leu Glu Glu Ser Glu 195 200 205 <210> 9 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein encoding sequence <400> 9 gcacagccag tgattgagtt catgtgtgag gtgctggaca tcaggaacat agatgagcag 60 cccaagcccc tcacggactc tcagcgcgtt cgcttcacca aggagatcaa gggcctgaag 120 gtggaagtca cccactgtgg acagatgaag aggaagtacc gcgtgtgtaa tgttacccgt 180 cgccctgcta gccatcagac attcccctta cagctggaga gtggacagac tgtggagtgc 240 acagtggcac agtatttcaa gcagaaatat aaccttcagc tcaagtatcc ccatctgccc 300 tgcctacaag ttggccagga acaaaagcat acctaccttc ccctagaggt ctgtaacatt 360 gtggctgggc agcgcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgatta caaaacgata 420 cttcaggaga tcactcaaaa acgatggaag gaaagaccgg aatacagact cataagtgtt 480 gaaggtcctc accataaaaa gaagttcata gtggaagcaa aaataaaaga gtaccgaaca 540 ctcggcgaag gaaagagcaa aaaggaagct gaacaaaggg cagccgagga attaattaaa 600 ttactggagg aatcagaa 618 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcacagccag tgattgagtt catgtgtgag gtgctggaca tcaggaacat agatgagcag 60 cccaagcccc tcacggactc tcagcgcgtt cgcttcacca aggagatcaa gggcctgaag 120 gtggaagtca cccactgtgg acagatgaag aggaagtacc gcgtgtgtaa tgttacccgt 180 cgccctgcta gccatcagac attcccctta cagctggaga gtggacagac tgtggagtgc 240 acagtggcac agtatttcaa gcagaaatat aaccttcagc tcaagtatcc ccatctgccc 300 tgcctacaag ttggccagga acaaaagcat acctaccttc ccctagaggt ctgtaacatt 360 gtggctgggc agcgc 375 <210> 11 <211> 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gcacagccag tgattgagtt catgtgtgag gtgctggaca tcaggaacat agatgagcag 60 cccaagcccc tcacggactc tcagcgcgtt cgcttcacca aggagatcaa gggcctgaag 120 gtggaagtca cccactgtgg acagatgaag aggaagtacc gcgtgtgtaa tgttacccgt 180 cgccctgcta gccatcagac attcccctta cagctggaga gtggacagac tgtggagtgc 240 acagtggcac agtatttcaa gcagaaatat aaccttcagc tcaagtatcc ccatctgccc 300 tgcctacaag ttggccagga acaaaagcat acctaccttc ccctagaggt ctgtaacatt 360 gtggctgggc agcgctgtat taaaaagctg accgacaacc agacctcgac catgataaag 420 gccacagcta gatcc 435 <210> 12 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gatattgact ttaaattcat ggaagatatt gagaagtctg aagctcgcat aggcattccc 60 agtacaaagt atacaaaaga aacacccttt gtttttaaat tagaagatta ccaagatgcc 120 gttatcattc caagatatcg caattttgat cagcctcatc gattttatgt agctgatgtg 180 tacactgatc ttaccccact cagtaaattt ccttcccctg agtatgaaac ttttgcagaa 240 tattataaaa caaagtacaa ccttgaccta accaatctca accagccact gctggatgtg 300 gaccacacat cttcaagact taatcttttg acacctcgac atttgaatca gaaggggaaa 360 gcgcttcctt taagcagtgc tgagaagagg aaagccaaat gggaaagtct gcagaataaa 420 cagatactgg ttccagaact ctgtgctata catccaattc cagcatcact gtggagaaaa 480 gctgtttgtc tccccagcat actttatcgc cttcactgcc ttttg 525 <210> 13 <211> 222 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gtaccccgtt cccctgtgcg agaattgctt gaaatggaac cagaaactgc caaatttagc 60 ccggctgaga gaacttacga cgggaaggtc agagtcactg tggaagtagt aggaaagggg 120 aaatttaaag gtgttggtcg aagttacagg attgccaaat ctgcagcagc aagaagagcc 180 ctccgaagcc tcaaagctaa tcaacctcag gttcccaata gc 222 <210> 14 <211> 207 <212> DNA <213> Xenopus laevis <400> 14 aatcctgttg gctcactaca ggaattagct gtgcaaaaag gatggcgcct cccagaatat 60 accgtggcac aagagtctgg ccctcctcac aagagagaat tcaccataac ttgccgtgtg 120 gaaacctttg tagaaactgg atcgggaacc tctaaacaag tggctaaaag ggttgctgca 180 gagaaactcc ttaccaaatt taagacc 207 <210> 15 <211> 213 <212> DNA <213> Aquifex aeolicus <400> 15 gattacaaaa cgatacttca ggagatcact caaaaacgat ggaaggaaag accggaatac 60 agactcataa gtgttgaagg tcctcaccat aaaaagaagt tcatagtgga agcaaaaata 120 aaagagtacc gaacactcgg cgaaggaaag agcaaaaagg aagctgaaca aagggcagcc 180 gaggaattaa ttaaattact ggaggaatca gaa 213 <210> 16 <211> 201 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 cccatctcgc aggttcacga gatcggaatt aagcgcaaca tgaccgttca ttttaaggtg 60 ttgcgcgagg aggggccggc gcacatgaag aactttataa cagcctgcat tgtgggatct 120 attgtcaccg aaggagaagg aaatggcaaa aaagtgtcca agaagcgtgc cgcggaaaag 180 atgctggtcg agttgcaaaa g 201 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 17 Gly Gly Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylation peptide sequence <400> 20 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15

Claims (16)

  1. 파즈(PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille) 도메인 및 이중가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 3’말단이 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 것인 RNA 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 3’말단이 2 뉴클레오티드 돌출된 이중가닥 RNA 에 결합하는 것을 특징으로 하는 RNA 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파즈 도메인은 인간 아르고노트(Argonaute) 단백질 또는 인간 다이서(Diecer) 단백질로부터 유래한 것을 특징으로 하는 RNA 결합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 파즈 도메인은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 RNA 결합 도메인은 인간 다이서(Dicer) 단백질, 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) RNA-결합 단백질 A (XlrbpA), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) RNase III (Aa-RNase III) 단백질 및 이 콜라이(Escherichia coli) RNase III (Ec-RNase III) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로부터 유래한 것을 특징으로 하는 RNA　결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이중가닥 RNA 결합 도메인은 서열번호 6 의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA 결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 파즈 도메인의 C 말단에 이중가닥 RNA 결합 도메인이 연결된 구조인 것을 특징으로 하는 RNA 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 8 의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA　결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 8 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 9 의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질은 비오틴으로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단백질을 이용하여 무표지 마이크로 RNA를 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은,
    어레이 칩 상에 탐침자 올리고뉴클레오타이드를 결합시키는 단계;
    마이크로 RNA를 포함하는 시료를 첨가하여 상기 탐침자와 마이크로RNA를 상보적 결합시키는 단계;
    상기 단백질을 첨가하여 상기 단백질을 상기 탐침자와 결합된 마이크로 RNA에 결합시키는 단계; 및
    상기 단백질로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질은 비오틴으로 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
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