KR101881102B1 - 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents

올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101881102B1
KR101881102B1 KR1020160088181A KR20160088181A KR101881102B1 KR 101881102 B1 KR101881102 B1 KR 101881102B1 KR 1020160088181 A KR1020160088181 A KR 1020160088181A KR 20160088181 A KR20160088181 A KR 20160088181A KR 101881102 B1 KR101881102 B1 KR 101881102B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
self
lasso
building block
scaffold
Prior art date
Application number
KR1020160088181A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180007219A (ko
Inventor
임용범
정우진
최헌진
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to KR1020160088181A priority Critical patent/KR101881102B1/ko
Publication of KR20180007219A publication Critical patent/KR20180007219A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101881102B1 publication Critical patent/KR101881102B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 올가미 형태의 빌딩 블록에 관한 것으로, 보다 상세하게는 올가미 형태의 빌딩 블록과 이를 이용하여 제조된 특이적 구조를 갖는 자가조립 펩타이드 나노구조체에 관한 것이다.

Description

올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법{lariat-type building block, manufacturing method thereof, self-assembly peptide nanostructure comprising thereof, manufacturing method thereof}
본 발명은 올가미 형태의 빌딩 블록에 관한 것으로, 보다 상세하게는 올가미 형태의 빌딩 블록과 이를 이용하여 제조된 특이적 구조를 갖는 자가조립 펩타이드 나노구조체에 관한 것이다.
일반적으로 생체거대분자는 생물학적 기능을 수행하기 위하여, 특정 표적물질에 대해 우수한 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)을 갖는다.
이와 같은 생체거대분자의 활성에 있어서 가장 중요한 요소는 다수의 생체활성을 갖는 리간드가 상기 생체거대분자의 표면에 어떻게 3 차원적으로 분표되어 있는가에 달려있다.
종래에는 유전자 조작을 통해 천연 단백질과 동일한 단백질을 생산하는 유전자를 미생물 또는 동물 세포의 유전자에 도입하고 세포수를 증대시켜 재조합 단백질을 대량생산하였으나, 안정성과 면역반응 및 발현정도가 낮다는 단점이 있었다.
이에 최근 펩타이드 합성기를 이용하여 원하는 아미노산 서열을 유기합성법으로 올리고펩타이드를 제작하고 이들 물질에 대한 다양한 연구가 활발히 진행되었다.
이를 도입하여 목적 물질을 생산하는 방식은 유전자 조작이 불필요하고, 단백질의 전체 아미노산 서열이 아닌 일부 서열을 생산하는데 매우 효과적이었다. 그러나 이러한 아미노산 서열 합성기를 사용하여 단순히 천연 단백질 중에서 핵심적인 역할을 하는 아미노산 서열을 찾고, 이를 제작한 후, 그 유효성을 평가할 뿐, 특정 표적물질에 대해 우수한 친화력과 선택성을 갖는 새로운 구조의 단백질을 개발한 예는 없는 실정이다.
본 발명자들은 표적물질에 대한 친화성 및 선택성이 향상된 펩타이드 구조체를 제공하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0772491호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 올가미 형태의 빌딩 블록 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올가미 형태의 빌딩 블록을 포함하는, 표적물질에 대한 친화성 및 선택성이 우수한 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체를 대량생산할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 스캐폴드 펩타이드; 및 상기 스캐폴드 펩타이드 상에 양 말단이 결합되어 있는 생활성 펩타이드;를 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록을 제공한다.
상기 스캐폴드 펩타이드는 상기 생활성 펩타이드와 결합하여 고리형 구조를 형성하는 제1 펩타이드;와
상기 스캐폴드 펩타이드에서 상기 생활성 펩타이드와 고리형 구조를 형성하지 못하고 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 외부로 돌출되어 있는 선형의 제2 펩타이드로 이루어져 있는 것을 특징으로 한다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 고리형 구조는 다음과 같은 결합을 통해 형성된 것일 수 있다.
ⅰ) 상기 생활성 펩타이드 N 말단과 상기 스캐폴트 펩타이드의 제1 펩타이드 C 말단이 링커를 통해 결합되고(제1 결합),
ⅱ) 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드의 N 말단에 존재하는 라이신 잔기와 상기 생활성 펩타이드의 C 말단이 결합되며(제2 결합),
이때 상기 생활성 펩타이드는 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드의 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group) 또는 주쇄 아민기(α-amino group)에 결합되는 것을 특징으로 한다.
상기 제1 펩타이드는 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선부터, 4 내지 6 번째 나선(turn) 중에서 선택되는 어느 하나의 나선(trun)에 위치하는 아미노산 서열까지(N 말단)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드는 서열번호 1 또는 2일 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드에서 상기 생활성 펩타이드와 고리형 구조로 결합하지 못한 아미노산 서열 부분인 제2 펩타이드는, 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선을 기준으로 5 내지 7 번째 또는 6 내지 7 번째 또는 7 번째 나선을 형성하는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.
상기 생활성 펩타이드는 표적 물질과 상보적으로 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 생활성 펩타이드는 HIV-1의 Rev로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 링커는 화학식 1, 화학식 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이거나, 글리신 1 내지 5개가 연속으로 결합되어 있는 아미노산 서열, 글리신-세린, 글리신-세린-글리신-세린, 글리신-글리신-세린 및 글리신-글리신-글리신-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열이거나, 상기 어느 하나의 화합물과 상기 어느 하나의 아미노산 서열의 조합 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
Figure 112016067455019-pat00001
Figure 112016067455019-pat00002
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, Ⅰ) 레진으로부터, 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드; 상기 제1 펩타이드에 결합되어 있는 생활성 펩타이드; 및 상기 생활성 펩타이드의 N 말단에 결합되어 있는 링커;를 포함하는 선형의 펩타이드를 합성하는 단계;
상기 제1 펩타이드는 N 말단이 라이신 잔기인 것을 특징으로 하고,
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계에서 합성된 선형의 펩타이드를 고리화하여 고리형 펩타이드를 제조하는 단계; 및
Ⅲ) 상기 고리형 펩타이드에서의 상기 라이신 잔기의 주쇄 아민기(α-amino group) 또는 측쇄 아민기(ε-amino group)에 상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드를 결합하는 단계;를 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록의 제조방법을 제공한다.
상기 Ⅰ) 단계는 고체상 기반의 펩타이드 합성 기술(solid-phase peptide synthesis technique)을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록을 적어도 하나 이상 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체로,
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 중심은 상기 복수 개의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드가 위치하고,
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면은 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 위치하며,
상기 스캐폴드 펩타이드는 서로 소수성 상호작용을 통해 이중 나선 또는 삼중 나선 또는 사중 나선으로 연결되며,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 서로 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제공한다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 펩타이드들로 구성되어 있다면, 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에서, 상기 생활성 펩타이드가 서로 2 내지 10 ㎚ 거리에 위치하고, 100 내지 150 ° 각도를 갖도록 기울어져 있는 것일 수 있다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제1 펩타이드는 서열번호 1이고,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제2 펩타이드는 서열번호 3이며,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 펩타이드들로 구성되어 있는 것이라면, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 알파-헬릭스 이차 구조를 안정적으로 유지하는 것일 수 있다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제1 펩타이드는 서열번호 2이고,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제2 펩타이드는 서열번호 4이며,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여,
Ⅰ) 자가조립 펩타이드 나노구조체의 기능과 구조를 설계하는 단계;
Ⅱ) 상기 Ⅰ)의 설계에 따라 제1항에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록 중에서 적어도 하나 이상을 선택하여 조합하는 단계; 및
Ⅲ) 상기 조합된 올가미 형태의 빌딩 블록들을 자가조립되도록 반응시키는 단계;를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록은 다양한 구조와 기능을 갖는 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조할 수 있는 새로운 형태의 단위체를 제안하고 있다는 점에서 큰 장점을 갖는다.
또한 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 적절한 조합을 통해 천연 단백질과 매우 유사한 3차 구조를 갖는 나노구조체를 제안할 수 있을 뿐만 아니라, 그 기능에 있어서도 천연 단백질보다 표적물질에 대한 친화성이 현저히 우수하다.
이러한 자가조립 펩타이드 나노구조체는 기능과 구조가 매우 새로우면서 뛰어남에도 불구하고, 제조과정이 자가조립을 통해 형성되기 때문에, 매우 간편하다는 장점을 갖는다.
도 1a는 본 발명에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록의 두 구현예에 대한 구체적인 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다. 상부에 위치한 도면은 1 번째 나선부터 4 번째 나선 아미노산 서열에 생활성 펩타이드가 결합하여 형성된 올가미 형태의 빌딩 블록이고, 하면에 위치한 도면은 1 번째 나선부터 6번째 나선의 아미노산 서열에 생활성 펩타이드가 결합하여 형성된 올가미 형태의 빌딩 블록이다.
도 1b는 본 발명에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록을 제조함에 있어서, α-helix 이중나선 스캐폴드 펩타이드 상에 생체활성 펩타이드(BPS)가 결합(grafting)할 수 있는 다양한 위치들을 전체적으로 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체의 다양한 구조를 나열한 도면이다.
도 1d는 본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체의 다양한 구조를 나열한 도면이다.
도 1e는 본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체의 전반적인 제조과정과, 두가지 구체적인 구현예에서의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 구조를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 제조예 1 및 제조예 2로부터 합성된 올가미 형태의 빌딩 블록의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3a는 PBS 버퍼액 또는 순수물 존재 하에서 제조예 1로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록(αtet(1-4)Rev)의 CD 스펙트럼이다.
도 3b는 PBS 버퍼액 또는 순수물 존재 하에서 제조예 2로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록(αtet(1-6)Rev)의 CD 스펙트럼이다.
도 4a는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(청색) 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(적색)의 SAXS 프로파일이다.
도 4b는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(청색) 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(적색)의 SAXS 분석으로 측정한 pair-distribution를 나타낸 그래프이다.
도 5는 도 4의 SAXS 분석 결과로부터 얻어진 수치들로부터, 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 형태를 재구성하여 나타낸 도면이다.
도 6a는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체를 DLS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체를 DLS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
도 8은 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
도 9는 PBS 버퍼액 존재 하에서 실시예 1 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 CD 스펙트럼이다.
도 10a는 제조예 1의 올가미 형태의 빌딩 블록의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.
도 10b는 제조예 2의 올가미 형태의 빌딩 블록의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.
도 11은 돌연변이형 SLIIB RNA(b)(G46-C74 to C46-G74) 또는 야생형 SLIIB RNA(a)의 시퀀스가 도시된 것이다.
도 12a는 HBS 존재 하에서, SLIIB RNA를 첨가하였 때(적색)와 첨가하지 않았을 때(청색)에 대한 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
도 12b는 HBS 존재 하에서, SLIIB RNA를 첨가하였 때(적색)와 첨가하지 않았을 때(청색)에 대한 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
도 13은 실시예 1, 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체가 SLIIB를 인식하는지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 돌연변이형 SLIIB RNA 또는 야생형 SLIIB RNA를 배양한 후, 이들에 대한 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 결과 이미지이다.
도 14는 실험예 9에서 관찰된 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체(좌측) 및 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체(우측)를 측정한 AFM 이미지이다.
도 15는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA의 응집체(complex)의 분자 무게를 측정하기 위해, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 야생형 SLIIB RNA를 함께 배양한 시료에 대한 실험예 9의 EMSA 레인 4번 밴드를 Ferguson gel 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 16a는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 3차원 입체 구조를 나타낸 도면이다.
도 16b는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 3차원 입체 구조를 나타낸 도면이다.
도 17은 HIV-1 Rev 단백질(대조군), 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체 각각의 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 μM)에 전체길이 RRE RNA 및 yeast tRNA를 함께 배양한 후, 이를 실험방법 11)에 따라 EMSA 분석한 결과이다.
도 18은 본 발명에 따른 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 구체적인 구조를 비교하고 있는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
많은 생체거대분자가 갖는 생물학적 기능은 발현함에 있어서, 상기 생체거대분자 표면에 다수 개의 생활성 펩타이드의 분포가 어떻게 이루어지고 있는가에 따라서 상기 생체거대분자가 갖는 표적물질에 대한 친화성과 선택성이 달라지게 된다.
따라서, 본 발명에서 새로운 구조의 올가미 형태의 빌딩 블록을 제조하고, 이들의 소수성 상호작용에 의한 이중 나선 결합을 통해 자가조립 펩타이드 나노구조체를 형성하여, 상기 나노구조체의 표면에 위치하는 생활성 펩타이드의 분포를 3차원적 또는 입체적으로 제어하는 것을 목적으로 하고 있다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 우선 본 발명의 일 측면은 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 스캐폴드 펩타이드; 및 상기 스캐폴드 펩타이드 상에 양 말단이 결합되어 있는 생활성 펩타이드;를 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록에 관한 것이다.
상기 스캐폴드 펩타이드는 상기 생활성 펩타이드와 결합하여 고리형 구조를 형성하는 제1 펩타이드;와 상기 스캐폴드 펩타이드에서 상기 생활성 펩타이드와 고리형 구조를 형성하지 못하고 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 외부로 돌출되어 있는 선형의 제2 펩타이드;로 이루어져 있다. 이의 일예에 대한 구조가 도 1a에 구체적으로 나타나 있다.
본 발명에서 올가미 형태란 도 1b에 나타난 바와 같이 하나의 고리와 상기 고리로부터 연장된 하나의 끈을 갖는 형태를 의미하고, 본 발명에 따른 올가미 형태 빌딩 블록 역시 하나의 고리형 구조를 이루고 있는 펩타이드 부분(상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드와 생활성 펩타이드)과 상기 고리형 구조로부터 연장된 하나의 끈 형태의 펩타이드(상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드)로 이루어져 있다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 하기 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조하기 위한 하나의 구성 요소로, 이러한 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 스캐폴드 펩타이드에 어떠한 생활성 펩타이드와 결합하는지에 따라 어떤 표적물질에 대해 선택성을 갖는지가 결정되고, 상기 스캐폴드 펩타이드 상에 생활성 펩타이드를 어떠한 방식, 위치에 결합시키느냐에 따라 자가조립 펩타이드 나노구조체의 표적 물질에 대한 친화성(affinity)을 결정할 수 있다.
상기 생활성 펩타이드와 결합하여 고리형 구조를 형성하는 상기 스캐폴드 펩타이드의 상기 제1 펩타이드는 알파-헬릭스 구조가 안정적으로 고정되어 유지되고 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 고리형 구조는 다음과 같은 결합을 통해 형성될 수 있다.
ⅰ) 상기 생활성 펩타이드 N 말단과 상기 스캐폴트 펩타이드의 제1 펩타이드 C 말단이 링커를 통해 결합되고(제1 결합),
ⅱ) 상기 스캐폴트 펩타이드 제1 펩타이드의 N 말단에 존재하는 라이신 잔기와 상기 생활성 펩타이드의 C 말단이 결합되며(제2 결합),
상기 생활성 펩타이드는 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group) 또는 주쇄 아민기(α-amino group)에 결합되는 것을 특징으로 한다.
이때 상기 생활성 펩타이드가 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group)에 결합되는 것이 가장 바람직한데, 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드의 알파-헬릭스 구조가 가장 안정적으로 고정되어 있어, 버퍼액 또는 수용액 상태에서도 안정한 알파-헬릭스 구조를 장기간 유지할 수 있기 때문이다.
상기 제1 펩타이드 및 상기 제2 펩타이드를 포함하는 상기 스캐폴드 펩타이드는 알파-헬릭스 구조의 모티프(motif)를 갖는 10 내지 80 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
이러한 상기 스캐폴드 펩타이드에서, 제1 펩타이드는 상기 생활성 펩타이드와 그래프팅 결합을 통해 고리형 구조를 형성하는 스캐폴드 펩타이드의 일부로, 바람직하게는 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선부터, 4 내지 6 번째 나선(turn) 중에서 선택되는 어느 하나의 나선(trun)에 위치하는 아미노산 서열까지(N 말단)의 아미노산 서열을 포함한다.
이때, 상기 4 내지 6번째 나선 중에서 선택되는 어느 하나의 나선에 위치하는 아미노산 서열은 라이신 잔기이다. 만일 라이신 잔기가 아닐 경우, 라이신 잔기로 치환한다.
상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드는 서열번호 1 또는 2일 수 있다(N'->C').
[서열번호 1]
Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys Leu Arg Ser Gly Ala
[서열번호 2]
Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln Glu Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys Leu Arg Ser Gly Ala
상기 스캐폴드 펩타이드에서 상기 생활성 펩타이드와 고리형 구조로 결합하지 못한 아미노산 서열 부분인 제2 펩타이드는 올가미 형태 중에서 고리형 구조로부터 연장된 끈 역할을 하며, 상기 스캐폴드 펩타이드 상에 생활성 펩타이드가 그래프팅되는 결합 위치에 따라 조절될 수 있다. 상기 제2 펩타이드는 바람직하게 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선을 기준으로 5 내지 7 번째 또는 6 내지 7 번째 또는 7 번째 나선을 형성하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.
[서열번호 3]
Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln
[서열번호 4]
Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr
상기 생활성 펩타이드와의 결합을 통해 고리형 구조를 형성하는 상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드는 알파-헬릭스 구조를 안정적으로 유지하고 있는데, 이를 통해 상기 올가미 형태의 빌딩 블록 간의 소수성 상호작용을 통해 서로 결합되어 자가조립 펩타이드 나노구조체를 형성할 수 있도록 하는 역할을 한다.
상기 제2 펩타이드는 알파-헬릭스 아미노산 서열을 포함하고 있으나, 고리형 구조 내에 위치하지 않고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 외부로 돌출되어 존재하기 때문에, 알파-헬릭스 구조가 고정되지 못하고 풀어진 선형으로 존재한다.
상기 제2 펩타이드는 2 번째 내지 15 번째 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 형광체를 더 포함할 수 있는데, 바람직하게는 2 번째 아미노산 서열에 포함되는 것이 올가미 형태의 빌딩 블록의 안정적인 구조를 위해 바람직하다. 상기 2 번째 아미노산 서열은 라이신 잔기 또는 알라닌 잔기일 수 있고, 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group) 또는 상기 알라닌 잔기의 측쇄 메틸기에 상기 형광체가 결합되는 것일 수 있다.
바람직하게 상기 형광체는 상기 제2 펩타이드의 라이신 잔기에 결합되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 C 말단으로부터 2 번째에 위치한 라이신 잔기의 측쇄 아민기에 결합되어야, 최종 생성된 올가미 형태의 빌딩 블록에서의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정적으로 고정되어 있어, 버퍼액 또는 수용액상에서 구조적 안정성이 매우 향상된다.
상술한 내용을 근거로 하였을 때 가장 바람직한 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.
상기 형광체는 특별히 이에 제한되지 않으나, DEABA 및 Dapoxyl로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 생활성 펩타이드는 표적물질과 특이적으로 상호작용을 형성할 수 있는 생활성을 갖는 펩타이드이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 HIV-1의 Rev로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게 상기 생활성을 갖는 펩타이드는 HIV-1의 Rev로부터 유래된 10 내지 20 아미노산 잔기로 이루어진 것일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[서열번호 5]
Arg Leu Leu Phe Arg Lys Ile Arg Arg Leu Lys Arg
[서열번호 6]
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg
[서열번호 7]
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg
가장 바람직하게 상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6일 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드는 직접 또는 링커를 포함하여 결합되는 것일 수 있고, 상기 링커는 상기 스캐폴드 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 유동성 및 안정성을 향상시키며, 상기 링커는 화학식 1, 화학식 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이거나, 글리신 1 내지 5개가 연속으로 결합되어 있는 아미노산 서열, 글리신-세린, 글리신-세린-글리신-세린, 글리신-글리신-세린 및 글리신-글리신-글리신-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열이거나, 상기 어느 하나의 화합물과 상기 어느 하나의 아미노산 서열의 조합 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016067455019-pat00003
[화학식 2]
Figure 112016067455019-pat00004

바람직하게 본 발명에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록은 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112016067455019-pat00005
[구조식 2]
Figure 112016067455019-pat00006
상기 구조식 1, 2에서
적색으로 표시된 아미노산 서열은 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 펩타이드이고,
청색으로 표시된 아미노산 서열은 생활성 펩타이드이며,
상기 흑색으로 표시된 부분은 링커이다.
본 발명에 따른 일 구현예에 의하면 상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 형광체를 더 포함할 수 있고, 형광체를 더 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록은 하기 [구조식 3] 또는 [구조식 4]로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 3]
Figure 112016067455019-pat00007
[구조식 4]
Figure 112016067455019-pat00008
상기 구조식 3, 4에서
적색으로 표시된 아미노산 서열은 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 펩타이드이고,
청색으로 표시된 아미노산 서열은 생활성 펩타이드이며,
상기 흑색으로 표시된 부분은 링커이며,
상기 녹색으로 표시된 부분은 형광체 중에서 Dapoxyl이다.
본 발명에 따른 상술한 구조의 올가미 형태의 빌딩 블록은 생물학적 활성을 나타내지 않는다. 허나, 이를 기반으로 하여 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조할 수 있고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록 구조에 따라 자가조립 펩타이드 나노구조체의 표면에 위치하는 생활성 펩타이드의 입체적 분포 및 위치를 조절할 수 있다. 즉 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 구조에 따라 최종 생성되는 자가조립 펩타이드 나노구조체의 선택성 및 친화성을 제어 및 조절할 수 있다는데 매우 큰 의미가 있다.
본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제조방법에 관한 것이다.
Ⅰ) 레진으로부터, 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드; 상기 제1 펩타이드에 결합되어 있는 생활성 펩타이드; 및 상기 생활성 펩타이드의 N 말단에 결합되어 있는 링커;를 포함하는 선형의 펩타이드를 합성하는 단계;
상기 제1 펩타이드는 N 말단이 라이신 잔기인 것을 특징으로 하고,
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계에서 합성된 선형의 펩타이드를 고리화하여 고리형 펩타이드를 제조하는 단계; 및
Ⅲ) 상기 고리형 펩타이드에서의 상기 라이신의 주쇄 아민기(α-amino group) 또는 측쇄 아민기(ε-amino group)에 상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드를 결합하는 단계;를 포함한다.
상술한 제조과정은 도 2에 구체적으로 나타내었다. 이를 참고로 하여 하기에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드를 스캐폴드 펩타이드로 하고 있고, 상기 스캐폴드 펩타이드의 N-말단과 상기 스캐폴드 펩타이드의 상기 알파-헬릭스 이차구조에서 1 번째 나선을 기준으로 4 내지 6 번째 나선 중에서 선택되는 어느 한 지점에 생활성 펩타이드를 결합하여, 고리형 펩타이드를 제조함으로써, 용도에 따라 성질이 다른 새로운 구조의 올가미 형태의 빌딩 블록을 제공하고자 하는 것이다.
상술한 구조의 올가미 형태의 빌딩 블록을 제조하기 위하여 본 발명에서는 고체상 기반의 펩타이드 합성 기술(solid-phase peptide synthesis technique)을 이용하여 레진으로부터, 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드; 상기 제1 펩타이드에 결합되어 있는 생활성 펩타이드; 및 상기 생활성 펩타이드의 N 말단에 결합되어 있는 링커;를 포함하는 선형의 펩타이드를 합성한다(단계 Ⅰ 또는 Step Ⅰ이라 한다.).
단지 상기 제1 펩타이드는 N 말단이 라이신 잔기인 것을 특징으로 한다. 따라서 상기 제1 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 결합은 상기 제1 펩타이드의 N 말단의 라이신 잔기의 측쇄(ε-amino group) 또는 주쇄 아민기(α-amino group)에 상기 생활성 펩타이드가 결합되어 있는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 제1 펩타이드의 N 말단의 라이신 잔기의 측쇄에 상기 생활성 펩타이드가 결합되어야, 추후 상기 제1 펩타이드의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정적으로 고정화될 수 있다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드는 상기 서술한 바와 같이 상기 생활성 펩타이드와 그래프팅 결합을 통해 고리형 구조를 형성하는 스캐폴드 펩타이드의 일부로, 바람직하게는 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선부터, 4 내지 6 번째 나선(turn) 중에서 선택되는 어느 하나의 나선(trun)에 위치하는 아미노산 서열까지(N 말단)의 아미노산 서열을 포함한다.
이때, 상기 4 내지 6번째 나선 중에서 선택되는 어느 하나의 나선에 위치하는 아미노산 서열은 라이신 잔기이다. 만일 라이신 잔기가 아닐 경우, 라이신 잔기로 치환한다.
상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드는 서열번호 1 또는 2일 수 있다.
[서열번호 1]
Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys Leu Arg Ser Gly Ala
[서열번호 2]
Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln Glu Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys Leu Arg Ser Gly Ala
상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 생활성 펩타이드는 표적물질과 특이적으로 상호작용을 형성할 수 있는 생활성을 갖는 펩타이드이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 HIV-1로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[서열번호 5]
Arg Leu Leu Phe Arg Lys Ile Arg Arg Leu Lys Arg
[서열번호 6]
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg
[서열번호 7]
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg
가장 바람직하게 상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6일 수 있다.
상기 링커는 상기 스캐폴드 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 유동성 및 안정성을 향상시키며, 상기 링커는 화학식 1, 화학식 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이거나, 글리신 1 내지 5개가 연속으로 결합되어 있는 아미노산 서열, 글리신-세린, 글리신-세린-글리신-세린, 글리신-글리신-세린 및 글리신-글리신-글리신-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열이거나, 상기 어느 하나의 화합물과 상기 어느 하나의 아미노산 서열의 조합 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016067455019-pat00009
[화학식 2]
Figure 112016067455019-pat00010
다음으로 상기 Ⅰ) 단계에서 합성된 선형의 펩타이드를 고리화 반응하여 고리형 펩타이드로 제조한다(단계 Ⅱ; Step 2).
상기 선형 펩타이드의 C 말단과 상기 선형 펩타이드의 N 말단의 결합을 통해 고리화 반응을 유도하여, 상기 선형의 펩타이드를 고리형 펩타이드를 제조할 수 있다.
이러한 고리화 반응은 디이소프로필에틸아민(DIPEA)에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
최종적으로 Ⅱ) 단계에서 제조된 상기 고리형 펩타이드에서의 상기 라이신 잔기의 주쇄 아민기(α-amino group) 또는 측쇄 아민기(ε-amino group)에 상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드를 결합한다.
상기 고리형 펩타이드에서 상기 라이신 잔기의 주쇄 아민기 또는 측쇄 아민기에 상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드를 결합하기 위하여, 우선 상기 라이신 잔기로부터 보호기를 제거하고, 고체상 기반의 펩타이드 합성 기술(solid-phase peptide synthesis technique)을 이용하여 상기 라이신 잔기의 측쇄 또는 주쇄 아민기로부터 제2 펩타이드를 합성한다.
상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.
[서열번호 3]
Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln
[서열번호 4]
Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr
상기 제2 펩타이드는 알파-헬릭스 아미노산 서열을 포함하고 있으나, 고리형 구조 내에 위치하지 않고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 외부로 돌출되어 존재하기 때문에, 알파-헬릭스 구조가 고정되지 못하고 풀어진 선형으로 존재한다.
상기 제2 펩타이드는 2 번째 내지 15 번째 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 형광체를 더 포함할 수 있는데, 바람직하게는 2 번째 아미노산 서열에 포함되는 것이 올가미 형태의 빌딩 블록의 안정적인 구조를 위해 바람직하다. 상기 2 번째 아미노산 서열은 라이신 잔기 또는 알라닌 잔기일 수 있고, 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group) 또는 상기 알라닌 잔기의 측쇄 메틸기에 상기 형광체가 결합되는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 형광체는 상기 제2 펩타이드의 라이신 잔기에 결합되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 C 말단으로부터 2 번째에 위치한 라이신 잔기의 측쇄 아민기에 결합되어야, 최종 생성된 올가미 형태의 빌딩 블록에서의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정적으로 고정되어 있어, 버퍼액 또는 수용액상에서 구조적 안정성이 매우 향상된다.
상술한 내용을 근거로 하였을 때 가장 바람직한 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.
상기 형광체는 특별히 이에 제한되지 않으나, DEABA 및 Dapoxyl로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 형광체를 더 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록은 하기 [구조식 3] 또는 [구조식 4]로 표시될 수 있다.
[구조식 3]
Figure 112016067455019-pat00011
[구조식 4]
Figure 112016067455019-pat00012
상기 구조식 3, 4에서
적색으로 표시된 아미노산 서열은 제1 펩타이드와 제2 펩타이드를 포함하는 스캐폴드 펩타이드이고,
청색으로 표시된 아미노산 서열은 생활성 펩타이드이며,
상기 흑색으로 표시된 부분은 링커이며,
상기 녹색으로 표시된 부분은 형광체 중에서 Dapoxyl이다.
일반적으로 특정 생체거대분자가 특정 표적 물질에 특이적으로 결합하여 상호작용을 효과적으로 적용하도록 하기 위해서는, 표적 물질에 대한 우수한 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)이 요구된다.
이러한 생체거대분자의 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)은 리간드 역할을 하는, 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 반응 지점을 갖는 생활성 펩타이드의 위치, 분포 등에 의한 어떠한 3차 구조가 형성되는지가 더욱 중요하다.
본 발명에서는 특정 생활성 펩타이드를 사용하여 표적물질에 단순히 상호작용을 유도하는 방식과는 달리 상기 생활성 펩타이드의 위치와 분포를 제어함으로써 자가조립 과정을 통해 형성된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 활성이 현저히 향상될 수 있는 구조를 제안하고자 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 올가미 형태의 빌딩 블록을 적어도 하나 이상 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체에 관한 것이다.
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 중심은 상기 복수 개의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드가 위치하고,
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면은 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 위치하며,
상기 스캐폴드 펩타이드는 서로 소수성 상호작용을 통해 이중 나선 또는 삼중 나선 또는 사중 나선으로 연결되며,
상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 서로 동일하거나 상이한 것일 수 있다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 간의 소수성 상호작용에 따른 결합 특성을 이용하고 있기 때문에, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 효율적으로 노출되는 기하학적 구조를 형성하고 있다.
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 다양한 구조적 예는 도 1c 및 도 1d에 기재하였다.
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상기 올가미 형태의 빌딩 블록을 결합시키느냐에 따라 크게 두가지 방향으로 구조를 나누어 볼 수 있다.
우선 첫 번째로 올가미 형태의 빌딩 블록이 결합하는 개수에 따라 이량체(dimeric) 또는 삼량체(trimeric) 또는 사량체(tetrameric) 구조일 수 있고, 이는 도 1b에 도시되어 있다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 둘일 경우, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 간의 소수성 상호작용을 통해 이중나선을 형성하고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록 사이의 각도는 180 °이다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 셋일 경우 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 간의 소수성 상호작용을 통해 삼중 나선을 형성하며, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록 사이의 각도는 120 °이였다.
상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 넷일 경우 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 간의 소수성 상호작용을 통해 사중 나선을 형성하며, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록 사이의 각도는 90 °이였다.
두 번째로 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 결합 방향 및 종류에 따라 평행(parallel)인지, 비평행(antiparallel) 인지, 동형(homo) 구조인지 이형(hetero) 구조가 가능하다. 이는 도 1c에 도시되어 있다.
상기 각각의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드가 서로 소수성 작호작용을 형성함에 있어서, 서로 동일한 평행 구조로 형성되던가, 또는 비형팽 구조로 형성될 수 있다.
구체적으로 어느 하나의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 아미노산 서열 방향이 C'->N'일 때, 이와 소수성 상호작용을 형성하는 인접하는 다른 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 아미노산 서열 방향도 C'->N'이라면 평행 구조이다.
반면 어느 하나의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 아미노산 서열 방향이 C'->N'일 때, 이와 소수성 상호작용을 형성하는 인접하는 다른 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드 아미노산 서열 방향도 N'->C'이라면 비평행 구조이다.
또한 상기 각각의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 아미노산 서열에 따라, 서로 동일한 동형 구조와 서로 상이한 이형 구조로 형성될 수 있다.
구체적으로 어느 하나의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 아미노산 서열이 서열번호 1일 경우, 이와 소수성 상호작용을 형성하는 인접하는 다른 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 아미노산 서열이 서열번호 1이라면, 이는 동형(homo) 구조이다.
어느 하나의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 아미노산 서열이 서열번호 1인데, 이와 소수성 상호작용을 형성하는 인접하는 다른 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 아미노산 서열이 서열번호 2라면, 이는 이형(hetero) 구조이다.
본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상술한 구조들 중에서 어느 하나의 구조만 가지거나, 둘 이상의 구조를 동시에 가지고 있을 수 있다. 즉 도 1c의 가장 우측 'hetero-oligomeric'의 경우와 같이 비평행 구조이면서 이형 구조로 형성되어 있는 것이다.
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 종류(스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 아미노산 서열)에 따라, 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체에서 생활성 펩타이드의 분포가 달라지게 된다. 이하 도 1d를 참조하여 구체적으로 설명한다.
만약, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드가 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선부터, 4 번째 나선(turn)에 위치하는 아미노산 서열까지를 포함하는 것일 경우, 이를 이용하여 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체는 3차 구조가 천연 단백질의 3 차 구조와 매우 유사한 구조를 형성하게 되므로, 표적물질에 대하여 천연 단백질 보다 현저히 향상된 친화성(affinity)갖는다는 장점이 있다.
예를 들어 상기 스캐폴드 펩타이드가 서열번호 1의 제1 펩타이드와 서열번호 3의 제2 펩타이드로 이루어진 경우이다.
구체적으로, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 펩타이드들로 구성되어 있다면, 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에서, 상기 생활성 펩타이드가 서로 2 내지 10 ㎚ 거리에 위치하고, 100 내지 150 ° 각도를 갖도록 기울어져 있을 수 있다. 이의 구조는 도 16a에 구체적으로 나타나있다.
상술한 구조의 자가조립 펩타이드 나노구조체를 형성하기 위한, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 서열번호 1의 제1 펩타이드, 서열번호 3의 제2 펩타이드 서열, 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나의 생활성 펩타이드로 이루어진 것일 수 있다.
특히 본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 [구조식 1]로 표시되는 것이고, 이러한 구조의 올가미 형태의 빌딩 블록이 넷이 결합하여 형성된 자가조립 펩타이드 나노구조체는 HIV-1의 Rev 단백질과 3차 구조가 거의 동일한 것을 확인할 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112016067455019-pat00013
일반적으로, HIV-1 Rev 단백질은 하기 도 1d에서와 같이 두 개의 꿈 결합 ARM(arginine-rich motifs) 14 내지 17 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드가 결합되어 형성된 V 형-이량체 구조이고, 상기 V 형 사이의 거리가 5.5 ㎚, 각도가 120-140 °로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는데, 본 발명의 [구조식 1]로 표시되는 올가미 형태의 빌딩 블록이 넷을 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 역시 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드 간의 거리(4-6 ㎚)와 각도(120-140 °)가 HIV-1 Rev 단백질의 3차 구조와 유사하다.
반면 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드가 상기 스캐폴드 펩타이드 1 번째 나선부터 6 번째 나선에 위치하는 아미노산 서열까지(N 말단)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 경우, 이를 이용하여 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체에 있어서, 리간드 역할을 하는 생활성 펩타이드의 2차 구조가 안정적으로 고정되어, 선택성이 향상되는 장점을 갖는다.
상술한 구조의 자가조립 펩타이드 나노구조체를 형성하기 위한, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 서열번호 2의 제1 펩타이드, 서열번호 4의 제2 펩타이드 서열, 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나의 생활성 펩타이드로 이루어진 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 하기 [구조식 2]로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 2]
Figure 112016067455019-pat00014
본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 소수성 상호작용을 통한 자가조립에 의해 형성되고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록을 적절히 선택함으로써, 다양한 기능과 효과를 갖는 새로운 구조의 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 더 나아가 특정 올가미 형태의 빌딩 블록을 사용할 경우 천연 단백질과 유사 3차 구조를 가지면서 친화성은 현저히 향상된 나노구조체를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체는 다양한 올가미 형태의 빌딩 블록의 조합 및 자가조립 과정을 통해, 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 위치하는 생활성 펩타이드의 위치 및 분포를 간단하게 제어할 수 있다는 장점을 갖는다.
또한, 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체는 상기 복수 개의 올가미 형태의 빌딩 블록에서 스캐폴드 펩타이드 간의 소수성 상호작용을 통해 중심 구조가 형성된다.
상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 위치하는 생활성 펩타이드의 위치 및 분포에 따라 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 기능이 달라질 수 있다.
일예로 구조식 1로 표시되는 올가미 형태의 빌딩 블록의 조합을 통해서는 Rev 단백질과 유사한 구조 및 기능을 수행하는 자가조립 펩타이드 나노구조체를 얻을 수 있고, 구조식 2로 표시되는 올가미 형태의 빌딩 블록을 조합하면 Rev 단백질과 유사한 구조는 아니나, RRE RNA에 대해 높은 선택성을 갖는 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조할 수 있다.
그러므로 이러한 본 발명의 자가조립 펩타이드 나노구조체 원리를 통해 다양한 상호작용을 갖는 자가조립 펩타이드 나노구조체의 제조가 가능함을 알 수 있다.
상술한 자가조립 펩타이드 나노구조체를 이용함으로써 천연 단백질보다 기능적으로 더 우수한 자가조립 펩타이드 나노구조체를 개발하는데 활용할 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료
Fmoc-아미노산과 커플링 시약은 Novabiochem(Germany)로부터 구입하였다. 그리고 Anaspec(U.S.A.). General chemicals는 시그마 알드리치(U.S.A) 및 Merck(Germany)로부터 획득하였다. Dapoxyl　succinimidyl ester은 Thermo Fisher Scientific(U.S.A)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technologies로부터 구입하였다. 효모 tRNA는 Ambion으로부터 구입하였다.
측정방법
1) 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy)
CD 스펙트럼은 펠티어 온도 컨트롤러(Peltier temperature controller)(Applied Photophysics., Ltd.)가 구비된 Chirascan Circular Dichroism spectrometer를 사용하여 기록되었다. 측정하고자 하는 샘플의 CD 스펙트럼은 190-260 nm에서 측정하여 기록되었다.
측정된 αtet(1-4)Rev(제조예 1) 및 αtet(1-6)Rev(제조예 2)의 농도는 20 μM이다. 상기 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록은 PBS(phosphate-buffered saline, 20 mM potassium phosphate, pH 7.0, 150 mM potassium fluoride)에 용해한 것을 사용하였다.
2) 원자력 현미경(Atomic Force Microscopy, AFM )
AFM을 위하여, 대체로 샘플의 1 ㎕를 신선하게 쪼개진 운모 표면에 놓았다. 샘플이 완전히 건조된 후, 아르곤 가스가 공급하여 샘플에 존재하는 잔류염을 DI 정제수와 함께 제거하였다. 상기 샘플의 이미지를 Nanoscope IV instrument (Digital Instruments)를 사용하여 획득하였다. AFM 스캔은 0.8-1.0 V의 범위로 놓고 획득하였으며, 스캐닝의 속도는 1-2 Hz였다.
3) 동적 광산란 (Dynamic Light Scattering, DLS)
αtet(1-4)Rev(실시예 1) 및 αtet(1-6)Rev(실시예 2)의 입자 크기 및 분포를 633 ㎚의 파장으로 작동하는 He-Ne 레이저(max. 4 mW)가 구비된 Malvern Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instrument, UK)를 사용하여 확인하였다. 이때 온도는 25 ℃로 고정하였다.
4) 형광 분광법(Fluorescence Spectroscopy)
안정적인 상태에 대한 형광 분광을 위해 PerkinElmer LS-55 fluorescence spectrophotometer를 사용하였다. 측정하고자 하는 샘플에 존재하는 dapoxyl(데폭실)의 형광을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 340 ㎚에서 측정하였다. 5 ㎚의 비교 통과대역과 함께 자극 및 방사 슬릿은 측정에 사용되었다. 실시예 1로부터 제조된 αtet(1-4)Rev과 실시예 2로부터 제조된 αtet(1-6)Rev의 농도는 둘다 20 μM로 하였다.
5) X-선 소각산란(Small-Angle X-ray Scattering, SAXS )
X-선 소각산란은 실험실(the Pohang Accelerator Laboratory (PAL))의 4C SAXS II beamline(BL)를 이용하였다. Pohang Light Source II 저장 날개의 진공상태 언듈레이터 20(IVU 20:1.4 m length, 20 mm period)으로부터의 빛 소스는 0.675 A °의 파장과 함께 X-레이 빔을 생산하기 위한 Si (111) 더블 크리스탈 모노크로매이터(DCM)와 함께 라듐 및 모노크로마타이즈로 코팅된 수직 집중 도넛형 거울을 이용하여 집중되었다.
샘플을 두께 10 ㎛, 부피 50 ㎕를 갖는 운모창(mica window)의 샘플 세포 용액에 고정하였다. 이때 X-레이 빔 경로(X-ray beam path)의 길이는 0.8 mm이였고, 상기 샘플을 상온에서 30 초의 시간 동안 조사(irradiated)하였다. 산란된 방사선은 샘플로부터 1 m(0.04 Å-1<q<0.50 Å-1)에 위치한 2차원(2D) 전하 결합 소자(charge-coupled detector )(Mar USA, Inc.)를 사용하여 획득하였다. SAXS 데이터는 방사능 손실을 최소화하기 위하여 0.1 분에 걸쳐 5개의 연속적인 프레임 안에서 수집되었다. 각각의 2D SAXS 패턴은 빔 센터로부터 평균되었고, 전송된 X-레이 빔 강도를 정규화(normalized)하였다. 이는 샘플의 뒤에 위치한 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 모니터하였다. 물의 산란을 실험상의 백그라운드(backgroumd)로 사용하였다. SAXS 실험의 데이터로부터 구조적 정보를 획득하기 위해, 쌍-거리 분포 기능 p(r)을 GNOM 소프트웨어와 하기 인디렉트(indrect) 푸리에 변형식(Fourier transform)인 [수학식 1]을 사용하여 얻었다.
[수학식 1]
Figure 112016067455019-pat00015
상기 식에서,
q는 운동량 변환(momentum transfer)이고(q=(4π/λ) sin θ, 여기서 2θ는 산란 앵글이고, λ는 X-레이의 파장영역),
r은 한쌍의 산란된 요소 간의 거리이며, 주어진 거대분자의 최대 직경(Dmax)은 제로부터 모아진 p(r)에서의 거리로부터 얻을 수 있다.
또한 상기 나선의 반지름(Rg ,p(r))은 하기 [수학식 2]로부터 계산된다.
[수학식 2]
Figure 112016067455019-pat00016
물 안에서의 상기 낮은 해상도(low-resolution)로 측정한 순이론적(ab-initio) 펩타이드의 형태는 DAMMIF 소프트웨어를 사용하여 재구성하였다. 상기 구조적 모델에서의 표면 표현(rendering)은 Discovery Studio 1.6 (Accelrys, Inc.)을 사용하여 획득하였다.
7) 퇴적 속도 분석 초원심분리(Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation )
분석 초원심분리 실험은 ProteomeLab XL-A analytical ultracentrifuge(Beckman Coulter, Inc.)와 에폰(epon)이 채워진 2-섹터 Al과 석영창(quartz windows)이 구비된 An-60Ti 로터를 통한 흡광도 스캔을 통해 수행하였다.
상기 셀의 광학적 광학적 통과 길이는 12 ㎜에 해당하고, 로터 스피드는 50,000 rpm이었다. 기록된 데이터는 프로그램 SEDFIT을 통해 분석하였다.
8) SLIIB RNA와 함께 전기영동 이동성 분석( Electrophoretic mobility shift assay ( EMSA ) with SLIIB RNA)
전기영동 이동성 분석(assay)은 바인딩 버퍼(10 mM HEPES-KOH pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, and 10% glycerol)에서 수행하였다. SPN-RNA 컴플렉스 형성을 위해 15 μM의 샘플 용액 10 ㎕를 30 분 동안 상온에서 동등한 부피의 7.5 μM RNA와 함께 공-배양(co-incubated)하였다. 이후 상기 샘플을 10 % 폴리아크릴아미드(29:1 mono:bis, 0.5 × TBE) 젤에 로딩하였다. 상기 샘플이 로딩된 젤은 1 시간 동안 200 V의 조건에서 로딩하였다. 로딩이 완료된 후, 젤에 존재하는 RNA를 SYBR Green II RNA 젤 염색약(Invitrogen, USA)으로 가시화화였다.
9) SPN /RNA의 구성에 대한 분광광도 평가( Spectrophotometrical evaluation of SPN /RNA composition)
상기 실험방법 8)의 EMSA 겔로부터 흥미로운 밴드를 분리하였다. 그리고 ELUTRAP　시스템(Whatman®)을 사용하여 전기 분해(electro-eluted)하였다. 이후, 상기 샘플 용액에서 π-π stacking 상호작용과 소수성 결합을 방해하기 위하여, 최종 농도가 50%(v/v)인 아세토니트릴 용액으로 30 분 동안 처리하였다. 이를 통해 RNA 염기와 sapoxyl의 UV-흡수 특성을 효과적으로 발휘하도록 할 수 있다.
최종적으로 상기 아세토니트릴 용액으로 처리된 샘플 용액을 340 ㎚에서 측정된 dapoxyl의 몰 흡광 계수와 260 ㎚에서 측정된 SLIIB(438400 M-1㎝-1)을 사용하여 분광학적으로 분석하였다. 전기 분해 용액 안에서 RNA의 흡광도는 아래 수학식 3, 4를 통해 계산하였다.
[수학식 3]
ASPN in sol, 260 nm = Asol, 340 nm × (ASPN , 260 nm / ASPN , 340 nm)
[수학식 4]
ARNA in sol, 260 nm = Asol, 260 nm - ASPN in sol, 260 nm
상기 식에서
Asol 은 전기 분해 용액의 흡광도이고,
ASPN in sol 및 ARNA in sol은 용액 내 SPN 및 RNA의 흡광도이며,
ASPN은 아세토니트릴 용액 내의 SPN의 흡광도이다.
10) 전체 길이 RRE RNA(Full-length RRE RNA)
240-nt RRE sequence (5122-5361)를 포함하는 pDM128 플라스미드는 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭되었다.
이때 포워드 프라이머는 CGAGAGCTCGCTATGTTCCTTGGGTT를 사용하였고, 상기 프라이머는 Sac I 사이트(GAGCTC)를 포함하며, 백워드 프라이머는 CGTGGTACCATCCCTAGGAGCTGTTG를 사용하였으며, 상기 백워드 프라이머는 Kpn I 사이트(GGTACC)를 포함하였다.
제한효소의 절단 효과를 증가시키기 위해, 3개의 염기가 상기 각각의 프라이머 5' 말단에 추가되었다.
236-nt RRE 시퀀스(5126-5361 from pDM128)는 TOYOBO Taq 폴리머레이즈 HS 믹스(DTM-101)를 사용하여 61-62 ℃ 어닐링 온도와 함께 PCR에 의해 pDM128로부터 분리되었고, 결과적으로 254-bp dsDAN를 제조하였다.
상기 PCR 절편은 1.5 %의 아가로스 젤 상에서 전기영동에 의해 정제한 후, Sac I 및 Kpn I을 사용하여 이중 분해(double digested)하였다. 상기 254-bp 절편은 pBluescript II KS(+)의 Sac I - Kpn I 지점(sites)을 연결(ligated)하였다.
이렇게 형질전환된 박테리아를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 아가 플레이트 상에서 배양함으로써, 선별하였다. 상기 RRE 시퀀스는 T7 프로모터 프라이머(promotor primer)를 갖는 시퀀싱(Macrogen, Korea)에 의해 확인할 수 있었다.
상기 복제된 플라스미드(cloned plasmid)인 pBlue-RRE (5-240)는 Acc65 I에 의한 분해(digestion)로 인해 선형으로 되었다.
생체외(in vitro) 전사는 Ambion MEGAscript® T7 Kit(AM1333)를 사용하여 수행하였다. 상기 전사된 RNA를 6 % 우레아 PAGE를 통해 정제하고, 에탄올 침전(precipitation)에 따른 Elutrap로 회복하였다. 상기 253-nt 전사된 RNA 시퀀스는 아래와 같다(상기 236-nt RRE RNA 시퀀스는 밑줄과 같음).
[253-nt RNA 시퀀스](밑줄은 236 nt RRE RNA 시퀀스)
5'-GGGCGAAUUGGAGCUCGCUAUGUUCCUUGGGUUCUUGGGAGCAGCAGGAAGCACUAUGGGCGCAGUGUCAUUGACGCUGACGGUACAGGCCAGACAAUUAUUGUCUGGUAUAGUGCAACAGCAGAACAAUUUGCUGAGGGCUAUUGAGGCGCAACAACAUCUGUUGCAACUCACAGUCUGGGGCAUCAAGCAGCUCCAGGCAAGAGUCCUGGCUGUGGAAAGAUACCUAAG GGAUCAACAGCUCCUAGGGAUG-3'
11) 전체 길이 RRE RNA의 EMSA 분석( EMSA with full-length RRE RNA)
EMSAs는 10 mM HEPES-KOH pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10% glycerol, 및 9 ㎍/㎖ yeast tRNA로 구성된 바인딩 버퍼를 통해 수행하였다.
SPN-RNA 컴플렉스 형성을 위해 샘플 용액의 7 ㎕와 100 nM 전체 길이 RRE RNA 용액 3 ㎕를 혼합하였다. 이를 상온에서 1 시간 이상 동안 1.2%아가로스(1 × TBE) 젤 상에 로딩하였다. 상기 샘플이 로딩된 젤을 상온, 150 V의 조건에서 45 분 동안 로딩하였다. 이후, 상기 RNA를 SYBR Green II RNA 젤 염색약을 이용하여 가시화하였다.
제조예 1 : 올가미 형태의 빌딩 블록 제작(α tet (1-4)Rev)
펩타이드는 Tribute 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc.)의 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem)으로 합성하였다.
또한 Cys(Mmt) 및 Lys(Dde)를 제외하고, 표준 아미노산 보호그룹으로 methoxytrityl(Mmt) 및 N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl](Dde)를 각각 채택하였다.
측쇄-말단의 고리화 반응을 위해, 우선 브로모아세트산(bromoacetic acid)을 레진에 고정된 펩타이드의 N-말단에 결합(coupled)하는데, 이를 레진에 첨가하기 전에, 먼저 브로모아세트산(28 ㎎, 200 μmol) 및 디소프로필카르보디이미드(15.5 ㎕, 100 μmol)의 제1 혼합물을 카르복실기의 활성화를 위해 10 분간 NMP에서 배양하였다.
상기 제1 혼합물을 상기 레진에 첨가한 후, 1시간 동안 상온에서 흔들어주면서 반응시켰다. 상기 시스테인(cysteine)으로부터 Mmt의 오르쏘고날(orthogonal) 탈보호(deprotection)를 위해 반응이 완료된 레진을 일정시간(1 분에서 최대 10분까지), DCM(1 % 트리플루오르아세트산(TFA)) 용매로 처리하였다.
분자 내 고리화 반응은 NMP 용액(1 %의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)) 3 ㎖ 하에서 밤새 상온으로 흔들어주면서 수행하였다.
Lys(Dde)로부터 Dde의 탈보호(deprotection)는 DMF(2 %의 하이드라진) 용매로 수행하였다.
이후, 올가미 형태에서 끈(tail) 역할을 수행하는 시그먼트를 결합하기 위하여, 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하였다. depoxyl 형광 라벨링을 위해, 상기 끈 역할의 시그먼트의 류신 잔기를 Lys(Dde)로 치환하고, Dapoxyl®　succinimidyl ester를 탈보호된 라이신 잔기의 오르쏘고날 위치에 결합시켰다. 최종적으로 탈보호하고, 레진으로부터 분리하기 위하여, 상기 레진에 고정된 펩타이드를 cleavage 칵테일[trifluoroacetic acid (TFA)/triisopropylsilane (TIS)/ water](95:2.5:2.5)로 3 시간 동안 처리하고, 이후 터트-부틸 메틸 에테르(tert-buthyl ehter)로 고체화(trituration)하였다. 이러한 과정을 통해 수득된 펩타이드를 역상 HPLC(water-acetonitrile with 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 이때 상기 쳅타이드 분자의 무게는 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass spectrometry(Microflex LRF20, Bruker)로 확인하였다. α-Cyano-4-하이드로신나믹 산(CHCA)은 기질로서 사용되었다. 상기 농도는 340 ㎚에서 dapoxyl(21526 M-1㎝-1)의 몰흡수 계수를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 측정하였다.
이때, 상술한 과정으로 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록은 서열번호 1의 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드, 서열번호 3의 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드 서열, 서열번호 7의 생활성 펩타이드로 이루어진 것으로, 하기 구조식 1로 표시될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112016067455019-pat00017
또한, 실험에 따라 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 밧줄 구조의 꼬리 시그먼트(스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드) 내에 존재하는 라이신의 입실론 아민기(측쇄 아민기)에 형광체인 2,5-diphenyloxazole을 결합시킨 것을 사용하기도 하였다(구조식 3). 상기 형광체는 본 발명의 올가미 형태의 빌딩 블록이 자가조립되는 과정이나, 구조적 측면에 전혀 영향을 미치지 않는다.
상기 형광체 2,5-diphenyloxazole은 환경적 극성 변화에 반응하여 방출 스펙트럼 이동이 나타내는 것을 특징으로 한다.
[구조식 3]
Figure 112016067455019-pat00018

제조예 2 : 올가미 형태의 빌딩 블록 제작(α tet (1-6)Rev)
제조예 2의 올가미 형태의 빌딩 블록은 서열번호 2의 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드, 서열번호 4의 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드 서열, 서열번호 7의 생활성 펩타이드로 이루어진 것을 합성하였다는 점을 제외하고는 상술한 제조예 1과 모두 동일하게 제작되었다.
이때 제조된 제조예 2의 올가미 형태의 빌딩 블록은 하기 구조식 2로 표시될 수 있다.
[구조식 2]
Figure 112016067455019-pat00019
또한, 실험에 따라 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 밧줄 구조의 꼬리 시그먼트(스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드) 내에 존재하는 라이신의 입실론 아민기(측쇄 아민기)에 형광체인 2,5-diphenyloxazole을 결합시킨 것을 사용하기도 하였다(구조식 3). 상기 형광체는 본 발명의 올가미 형태의 빌딩 블록이 자가조립되는 과정이나, 구조적 측면에 전혀 영향을 미치지 않는다.
상기 형광체 2,5-diphenyloxazole은 환경적 극성 변화에 반응하여 방출 스펙트럼 이동이 나타내는 것을 특징으로 한다.
[구조식 4]
Figure 112016067455019-pat00020

실시예 1 : 자가조립 펩타이드 나노구조체의 제조.
또한 본 발명자들은 단백질 모델로서 HIV-1(human immunodeficiency virus type-1)에 속하는 Rev를 이용하였다. 이러한 Rev는 인트론 포함 바이럴 mRNA에 대한 핵 수송과 연관되어 있다.
상기 제조예 1로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록 20 μM을 PBS(phosphate-buffered saline, 20 mM potassium phosphate, pH 7.0, 150 mM potassium fluoride)에 용해하여 자가조립화시켜 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조하였다.
실시예 2 : 자가조립 펩타이드 나노구조체의 제조.
Rev 모방성의 구조적 요청을 충분히 만족하는 배열을 확인하기 위해 또 다른 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조하기 위해, 제조예 2로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록(αtet(1-6)Rev)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 모두 동일하게 자가조립 펩타이드 나노구조체를 제조하였다.
실험예 1 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석
본 발명에 있어서, 생활성 펩타이드가 나노구조체 표면에서 3차원적으로 분포되어 있도록 하기 위해서는, 이의 바탕이 되는 올가미 형태의 빌딩 블록이 제조되어야 하는데, 본 발명에 따른 제조예 1, 2로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록의 구조 및 이의 안정성을 분석하였다.
도 3a는 PBS 버퍼액 또는 순수물 존재 하에서 제조예 1로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록(αtet(1-4)Rev)의 CD 스펙트럼이고, 도 3b는 PBS 버퍼액 또는 순수물 존재 하에서 제조예 2로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록(αtet(1-6)Rev)의 CD 스펙트럼이다.
도 3a, b에서 적색 그래프는 순수물 존재하에서 측정한 것이고, 청색 그래프는 PBS 버퍼액 존재하에서 측정한 것이다.
이때, 원이색성(Circular Dichroism; CD) 분광학(Spectroscopy) 분석은 측정방법 1)에 따라 수행하였다.
도 3a, b를 참조하면, 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록은 모두 PBS 버퍼액 하에서는 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되어, 유지되고 있는 것을 확인하였다. 이는 CD 스펙트럼에서 알파-헬릭스 이차 구조를 의미하는 208 ㎚와 222 ㎚에서 음성 밴드가 진하게 관찰된 것을 통해 알 수 있다.
반면 순수 물 존재 하에서는 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상술한 밴드가 관찰되지 않았다. 즉 알파-헬릭스 이차 구조는 펩타이드 내부의 전기적 및 소수성 상호작용과 관련이 있다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록에서의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되기 위해서는 적당한 pH와 이온성 강도가 요구되는 것을 알 수 있다. 왜냐하면 비극성 잔기 사이의 소수성 상호작용은 강해지고, 극성 잔기는 충분히 이온화되기 때문이다.
실험예 2 : X-선 소각산란(Small-Angle X-ray Scattering, SAXS ) 분석
SAXS 분석을 통해 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 전반적인 구조(크기 및 형태)를 조사하고자 한다.
도 4a는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(청색) 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(적색)의 SAXS 프로파일이고, 도 4b는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(청색) 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체(적색)의 SAXS 분석으로 측정한 pair-distribution를 나타낸 그래프이다.
이때, X-선 소각산란(Small-Angle X-ray Scattering, SAXS) 분석은 측정방법 5)에 따라 수행하고, 결과값을 분석하였다.
도 4a를 참조하면, 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 거의 동일한 크기와 모양을 가진 것으로 확인되었다.
상기 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 나선의 반지름(Rg ,p(r))이 16.39 Å이고, 최대 직경(Dmax)은 52 Å인 것으로 확인되었다.
도 5는 도 4의 SAXS 분석 결과로부터 얻어진 수치들로부터, 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 형태를 재구성하여 나타낸 도면이다.
도 5를 참조하면 본 발명에 따른 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 형태를 확인할 수 있는데, 상기 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 위치한 생활성 펩타이드가 서로 일정한 각도와 거리를 갖도록 형성되어 있음을 확인하였다.
실험예 3 : 동적 광산란 (Dynamic Light Scattering, DLS) 분석
본 발명에 따른 실시예 1 및 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 유체역학적 반경(hydrodynamic radii; RH)을 분석하기 위하여, 측정방법 3)에 따른 DLS 분석으로 수행하였다.
도 6a는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체를 DLS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 6b는 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체를 DLS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a, b에 나타난 바와 같이 실시예 1 및 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 RH는 평균 2.5 ㎚인 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4 : 퇴적 속도 분석 초원심분리(Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation) 분석
실시예 1 및 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 사량체(tetrameric) 구조에 대해 조사하기 위해, 퇴적 속도 분석 초원심분리(Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation) 분석을 이용하였다.
이때, 퇴적 속도 분석 초원심분리(Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation) 분석은 측정방법 7)에 따라 수행하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
이론상 Mr(tetrameric) 실험적으로 측정된 Mr
실시예 1 23347 24600
실시예 2 23347 24800
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 올가미 형태의 빌딩 블록들 간의 자가조립에 의한 이중 나선(coiled-coil) 결합을 통해 사량체의 자가조립 펩타이드 나노구조체를 형성하고 있음을 보여주고 있다.
실험예 5 : 형광 분광법(Fluorescence Spectroscopy) 분석
도 7은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이고, 도 8은 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
이때, 상기 도 7, 8에서 청색 그래프는 순수 물에 용해한 것을 측정한 것이고, 적색 그래프는 PBS 버퍼액에 용해한 것을 측정한 것이다.
실시예 1, 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드는 각각 제조예 1, 2로부터 제조된 올가미 형태의 빌딩 블록을 사용하여 제조한 것으로, 상기 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록에 형광체인 Dapoxyl이 결합되어 있다.
상기 Dapoxyl 형광체(fluorescent probe))는 환경에 대해 매우 민감하다.
따라서 상기 형광체의 형광 특성을 이용하여, 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 자가조립 여부를 분석하고자 하였다.
도 7 및 8에 나타난 바와 같이 실시예 1, 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체를 순수 물(청색 그래프)에 용해시킨 경우, 상기 두 자가조립 펩타이드 나노구조체는 서로 다른 경향을 갖는 형광 방출 스펙트럼이 관찰되었다. 이는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체가 서로 다른 분자 상태로 존재하고 있음을 의미하는 것이다.
반면 도 7, 8에서는 PBS 버퍼액에 용해시킨 경우(적색 그래프), 상기 실시예 1, 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 스펙트럼이 장파장 영역으로 모이고 있음이 관찰되었다. 이는 상기 실시예 1, 2 로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체가 순수 물에 용해될 경우 서로 동일한 분자 상태로 존재한다는 것을 의미한다.
앞선 실험 방법을 통해서는 실시예 1 및 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체가 서로 동일 또는 유사한 구조임이 관찰되었으나, 도 7, 8을 통해 상기 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드는 서로 다른 상태를 가지고 있음을 관찰하였고, 이러한 상대적인 미묘한 차이들은 상기 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체가 완전히 동일한 구조가 아닌 유사한 구조라는 것을 알려주고 있다.
실험예 6 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석
실험예 5에서 확인된 바, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 자기조림화 구조 간의 미묘한 차이를 보다 명확히 확인하기 위하여 CD 분석을 통해 얻은 두 스펙트럼을 비교하였다.
도 9는 PBS 버퍼액 존재 하에서 실시예 1 및 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 CD 스펙트럼이다.
상기 도 9에서 적색 그래프는 실시에 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 CD 스펙트럼이고, 청색 그래프는 실시에 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 CD 스펙트럼이다.
도 9에 나타난 바와 같이, PBS 버퍼액에 용해한 실시예 1, 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 CD 스펙트럼을 비교한 결과, 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체 보다 222 ㎚에서 1.5 배 더 강한 음성 타원율(nagative ellipticity)이 관찰되었다.
본 발명에 따른 자가조립 펩타이드 나노구조체는 단위체인 올가미 형태의 빌딩 블록 적어도 하나 이상이 결합되어 형성되는 것으로, 구체적으로 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서도 스캐폴드 펩타이드 간에 소수성 상호작용으로 인해 서로 연결되어 형성된다. 이때, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 상기 스캐폴드 펩타이드는 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 중심(core)에 위치하고, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에서 생활성 펩타이드는 상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 위치하게 된다.
이러한 구조적 측면에서 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체에서의 core 부분의 구조의 나선형 정도는 동일하다고 여겼기 때문에, 상술한 음성 타원율의 차이를 ARM 모이어티(moiety)의 나선형의 차이로 인해 발생한 것이라 여겼다.
한편, 상기 ARM 모이어티는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체에서 보다 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체에서 더 향상된 나선형 정도(helical)를 갖는다.
왜냐하면 많은 단백질 상호작용은 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드들에 의해 유발되며, 이러한 대부분의 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드들은 단백질로부터 분리되면 알파-헬릭스 이차 구조를 형성하지 못하고 비구조화되기(unstructure) 때문에, 단백질 이차 구조를 안정적으로 유지하도록 하기 위한 다양한 연구들이 이루어지고 있는 실정이다.
실험예 7 : 제조예 1 및 2의 올가미 형태의 빌딩 블록의 MALDI - TOF MS 스펙트럼 분석 결과.
도 10a는 제조예 1의 올가미 형태의 빌딩 블록의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이고, 도 10b는 제조예 2의 올가미 형태의 빌딩 블록의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.
도 10을 통해 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록이 제대로 제조되었음을 확인할 수 있다.
실험예 8 : 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체에 대한 올리고뉴클레오티드의 영향
도 12a는 HBS 존재 하에서, SLIIB RNA를 첨가하였 때(적색)와 첨가하지 않았을 때(청색)에 대한 실시예 1로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이고, 도 12b는 HBS 존재 하에서, SLIIB RNA를 첨가하였 때(적색)와 첨가하지 않았을 때(청색)에 대한 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다.
도 12에 나타난 바와 같이, 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 SLIIB RNA와 같은 올리고뉴클레오티드의 첨가에 의해서, 구조가 전혀 변화되지 않을 뿐만 아니라, 제조예 1, 2의 올가미 형태의 빌딩 블록으로부터 자가조립 펩타이드 나노구조체로의 자가조립 과정에 전혀 영향을 미치지 않고 있음을 알 수 있다.
실험예 9 : SLIIB RNA와 함께 전기영동 이동성 분석( Electrophoretic mobility shift assay ( EMSA ) with SLIIB RNA) 분석
앞선 실험예들을 통해 실시예 1 및 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체에서의 구조적 정보를 얻을 수 있었다. 이에 본 실험예에서는 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 표적 물질에 대한 활성을 분석할 것이다.
이때 표적물질로는 HIV-1의 RRE(Rev response element, RRE, ~ 350 nt) RNA를 사용하였다.
하나의 RRE RNA 상에, 핵형성 지점인 SLIIB(stem-loop IIB, ~30 nt)에 10-12 Rev 단백질이 초기 협력적으로 결합하는데, 상기 SLIIB는 Rev 결합을 위해 가장 친화성이 높은 부위이다.
자가조립 펩타이드 나노구조체의 일가(monovalent) 상호작용을 관찰하기 위해서, 실시예 1 및 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체 각각을 도 11에 도시한 돌연변이형 SLIIB RNA(b)(G46-C74 to C46-G74) 또는 야생형 SLIIB RNA(a)와 함께 HEPES-buffered saline(HBS; 10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCL, 1 mM MgCl2, 10 % 글리세롤)에서 배양하였다. 이후 각각의 샘플을 SLIIB RNA와 함께 전기영동 이동성 분석(Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with SLIIB RNA)(실험방법 8))으로 분석하였다.
이러한 배양을 통해 실시예 1, 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체가 SLIIB에 대한 선택성을 확인할 수 있다.
도 13은 실시예 1, 실시예 2로부터 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체가 SLIIB를 인식하는지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 돌연변이형 SLIIB RNA 또는 야생형 SLIIB RNA를 배양한 후, 이들에 대한 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 결과 이미지이다.
도 13에서 M은 RNA ladder를 의미하고, wt는 야생형 SLIIB RNA를 의미하며, mt는 돌연변이형 SLIIB RNA를 의미한다.
도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 서로 다른 SLIIB 결합 행동 양상을 갖고 있다는 것을 확인하였다.
우선, 도 13의 레인 4, 5, 6 및 7에 나타난 바와 같이 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체보다 SLIIB에 대해 현저히 향상된 특이성(specificity)을 갖고 있음을 알 수 있다.
ARM의 나선 정도(helicity)에 Rev의 표적 특이성(target specificity)이 의존적이라는 점을 고려하였을 때, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 매우 우수한 선택성(selectivity)은 ARM 모이어티(moiety)에서 알파-헬릭스 이차 구조가 매우 높은 안정성을 갖고 있다는데 기인하고 있음을 알 수 있다.
그러나 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 경우, EMSA 결과 매우 낮은 전기영동 유동성(레인 4번과 5번 상에서 관찰되는 밴드)을 갖는 상대적으로 매우 큰 분자 무게의 응집체(complex)가 형성됨이 관찰되었다.
이러한 응집체(complex)는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체에서는 관찰되지 않았다.
실험예 10 : 원자력 현미경(Atomic Force Microscopy, AFM ) 분석
실험예 9에서 관찰된 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체 및 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체에 대해 조사하였다.
이러한 실시예 1 또는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체는 SPN/RNA 또는 SPN-RNA로 표기하였다.
도 14는 실험예 9에서 관찰된 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체(좌측) 및 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체(우측)를 측정한 AFM 이미지이다.
도 14에 나타난 바와 같이 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체의 경우에는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA와의 응집체에 비해 상대적으로 작으면서도 꽤 긴 상태이고 상대적으로 넓게 분산된 입자를 형성하고 있음을 확인하였다.
실험예 11 : 실험예 9의 레인 4번 밴드의 Ferguson 플롯 분석
실험예 9에서 관찰된 레인 4번 상의 밴드에서의 구성을 보다 명확히 이해하기 위해, 상기 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 야생형 SLIIB RNA를 함께 배양한 시료에 대한 실험예 9의 EMSA 레인 4번 밴드를 Ferguson 젤 분석(Ferguson gel analysis)로 분석하였다.
도 15는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA의 응집체(complex)의 분자 무게를 측정하기 위해, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 야생형 SLIIB RNA를 함께 배양한 시료에 대한 실험예 9의 EMSA 레인 4번 밴드를 Ferguson gel 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 15a는 단백질 표준시료와 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA의 응집체(complex)에 대한 겔 농도에 따른 Ferguson 플롯으로, 단백질 표준시료는 Fisher Scientific에서 구입하였고, 흑색은 20 kDa, 적색은 66kDa, 녹색은 146 kDa, 황색은 242 kDa, 청색은 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA의 응집체(complex)이다.
도 15b는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 SLIIB RNA의 응집체(complex)의 분자무게를 평가하기 위해, 단백질 표준시료에 대한 분자 무게 플롯에 따른 Ferguson 플롯에서의 회귀선(regression line)의 기울기를 나타낸 그래프이다.
도 15에 나타난 바와 같이, 겔 농도에 따른 모빌리티(mobility)의 Ferguson 플롯은 폴리아크릴아미드 농도에 따라 non-denaturing 겔 상에서 단백질 표준 시료의 전기영동 행동 양상을 비교함으로써, 단백질-올리고뉴클레오타이드 응집체(complex)의 분자 무제를 간접적으로 확인할 수 있도록 한다.
이러한 분석 결과는 천천히 이동하는 응집체(complex)의 무게와 4 개의 SLIIB가 결합된 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체가 일치하고 있음을 보여주었다. 또한 이는 자가조립 펩타이드 나노구조체에서의 결합 부위의 포화도와도 일치하였다.
상기 1: 4 분자 비율은 EMSA 밴드로부터 전기적으로 분리한 샘플을 UV 흡광도 분석을 통해 확인할 수 있다.
실험예 12 : 실험예 결과들을 통해 실시예 1, 2 자가조립 펩타이드 나노구조체의 구조 예측.
상술한 결과들을 통해, 실시예 1, 2 자가조립 펩타이드 나노구조체의 구체적인 구조를 예측하여 도 16a, b에 나타내었다.
도 16a는 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 3차원 입체 구조를 나타낸 도면이고, 도 16b는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 3차원 입체 구조를 나타낸 도면이다.
도 16을 통해, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 존재하는 생활성 펩타이드가 타이트하게 고정되어 있는데 반해, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 외면에 존재하는 생활성 펩타이드가 덜 응축되어 있기 때문에, 사량체 올리고가 상호작용을 위해 가장 적합한 구조임을 확인하였다.
실험예 13 : 전체 길이 RRE RNA의 EMSA 분석( EMSA with full-length RRE RNA)
도 17은 HIV-1 Rev 단백질(대조군), 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체, 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체 각각의 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 μM)에 전체길이 RRE RNA 및 yeast tRNA를 함께 배양한 후, 이를 실험방법 11)에 따라 EMSA 분석한 결과이다.
도 17의 분석을 통해 실시예 1, 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체와 전체길이 RRE RNA와의 결합 양상을 조사하였다.
HBS 용액에서 yeast tRNA는 비특이적 경쟁자로, Rev 단백질과 함께 동시에 배양(co-incubated)하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 매우 안정적인 알파-헬릭스 구조를 갖는 생활성 펩타이드를 갖고 있는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체보다 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체가 RRE RNA에 대해 매우 높은 친화력을 가지고 있음을 알 수 있다.
이는 실시예 2의 자가조립 펩타이드 나노구조체보다 생활성 펩타이드의 쌍의 위치 및 분포가 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체에서 더욱 Rev 단백질과 유사하게 위치하고 있어, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체 구조가 RRE RNA와 결합하는데 더 적합한 구조를 형성하고 있기 때문이다.
결과적으로, 올가미 형태의 빌딩 블록에서의 스캐폴드 펩타이드와 생활성 펩타이드의 접합 위치에 따라 표적 결합 특이성과 올리고가 상호작용이 달라지고 있음을 확인하였다.
이렇게 구조가 제어되어 Rev 단백질과 유사구조로 제조된 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 순수 Rev 단백질보다 더 효율적으로 RRE RNA와 상호작용하는 것으로 관찰되었다.
이는 인공적으로 제조된 자가조립 펩타이드 나노구조체가 천연 단백질보다 활성이 우수하다는 것으로, 종래의 인공 나노구조체에서는 전혀 기대하지 못했던 이질적이면서 현저히 향상된 효과라 할 수 있다.
다시 말해, 본 발명에 따른 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 올가미 형태의 빌딩 블록이 도 18에 나타낸 바와 같이, 역평행하면서 동형 구조를 가지고 있어, 생활성 펩타이드가 다양한 방향으로 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에 노출되는 구조이다. 따라서, 실시예 1의 자가조립 펩타이드 나노구조체는 Rev 단백질과 비교하였을 때, RRE RNA와 상호작용할 기회를 더 가지게 되고, 천연 단백질인 Rev 단백질보다 현저히 우수한 효과를 나타내게 되는 것이다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
<110> yonsei university <120> lariat-type building block, manufacturing method thereof, self-assembly peptide nanostructure comprising thereof, manufacturing method thereof <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HELIX <400> 1 Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys Leu Arg Ser Gly Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HELIX <400> 2 Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln Glu Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Lys 1 5 10 15 Leu Arg Ser Gly Ala 20 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HELIX <400> 3 Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Glu Asp Lys Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HELIX <400> 4 Gly Asn Ala Asp Glu Leu Tyr 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> humanimmunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Leu Leu Phe Arg Lys Ile Arg Arg Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> humanimmunodeficiency virus type 1 <400> 6 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> humanimmunodeficiency virus type 1 <400> 7 Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 1 5 10

Claims (16)

  1. 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 스캐폴드 펩타이드; 및 상기 스캐폴드 펩타이드 상에 양 말단이 결합되어 있는 생활성 펩타이드;를 포함하는 올가미 형태의 빌딩 블록에 관한 것으로,
    상기 스캐폴드 펩타이드는 상기 생활성 펩타이드와 결합하여 고리형 구조를 형성하고, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 제1 펩타이드;와
    상기 스캐폴드 펩타이드에서 상기 생활성 펩타이드와 고리형 구조를 형성하지 못하고 상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 외부로 돌출되는, 서열번호 3 또는 4로 표시되는 선형의 제2 펩타이드;로 이루어져 있고,
    상기 생활성 펩타이드는 HIV-1의 Rev로부터 유래된 10 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드와 상기 생활성 펩타이드의 고리형 구조는 다음과 같은 결합을 통해 형성된 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록.
    ⅰ) 상기 생활성 펩타이드 N 말단과 상기 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드 C 말단이 링커를 통해 결합되고(제1 결합),
    ⅱ) 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드의 N 말단에 존재하는 라이신 잔기와 상기 생활성 펩타이드의 C 말단이 결합되며(제2 결합),
    이때 상기 생활성 펩타이드는 상기 스캐폴드 펩타이드 제1 펩타이드의 라이신 잔기의 측쇄 아민기(ε-amino group) 또는 주쇄 아민기(α-amino group)에 결합되는 것을 특징으로 한다.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록.
    [서열번호 5]
    Arg Leu Leu Phe Arg Lys Ile Arg Arg Leu Lys Arg
    [서열번호 6]
    Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg
    [서열번호 7]
    Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg
  10. 제2항에 있어서,
    상기 링커는 화학식 1, 화학식 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이거나, 글리신 1 내지 5개가 연속으로 결합되어 있는 아미노산 서열, 글리신-세린, 글리신-세린-글리신-세린, 글리신-글리신-세린 및 글리신-글리신-글리신-세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열이거나, 상기 어느 하나의 화합물과 상기 어느 하나의 아미노산 서열의 조합 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록.
    [화학식 1]
    Figure 112016067455019-pat00021

    [화학식 2]
    Figure 112016067455019-pat00022
  11. Ⅰ) 레진으로부터, 스캐폴드 펩타이드의 제1 펩타이드; 상기 제1 펩타이드에 결합되어 있는 생활성 펩타이드; 및 상기 생활성 펩타이드의 N 말단에 결합되어 있는 링커;를 포함하는 선형의 펩타이드를 합성하는 단계;
    상기 제1 펩타이드는 N 말단이 라이신 잔기인 것을 특징으로 하고,
    Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계에서 합성된 선형의 펩타이드를 고리화하여 고리형 펩타이드를 제조하는 단계; 및
    Ⅲ) 상기 고리형 펩타이드에서의 상기 라이신 잔기의 주쇄 아민기(α-amino group) 또는 측쇄 아민기(ε-amino group)에 상기 스캐폴드 펩타이드의 제2 펩타이드를 결합하는 단계;를 포함하고,
    상기 제1 펩타이드는 N 말단에 라이신 잔기가 위치하는 서열번호 1 또는 2로 표시되고, 제2 펩타이드는 서열번호 3 또는 4로 표시되며, 생활성 펩타이드는 HIV-1의 Rev로부터 유래된 10 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계는 고체상 기반의 펩타이드 합성 기술(solid-phase peptide synthesis technique)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 올가미 형태의 빌딩 블록의 제조방법.
  13. 제1항에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록을 적어도 하나 이상 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체로,
    상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 중심은 상기 복수 개의 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 스캐폴드 펩타이드가 위치하고,
    상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면은 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 위치하며,
    상기 스캐폴드 펩타이드는 서로 소수성 상호작용을 통해 이중 나선 또는 삼중 나선 또는 사중 나선으로 연결되며,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록은 서로 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 자가조립 펩타이드 나노구조체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 펩타이드들로 구성되어 있다면,
    상기 자가조립 펩타이드 나노구조체의 외면에서, 상기 생활성 펩타이드가 서로 2 내지 10 ㎚ 거리에 위치하고, 100 내지 150 ° 각도를 갖도록 기울어져 있는 것을 특징으로 하는 자가조립 펩타이드 나노구조체:
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제1 펩타이드는 서열번호 1이고,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제2 펩타이드는 서열번호 3이며,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7중에서 선택되는 어느 하나이다.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록이 하기 펩타이드들로 구성되어 있는 것이라면, 상기 올가미 형태의 빌딩 블록에 존재하는 생활성 펩타이드가 알파-헬릭스 이차 구조를 안정적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 자가조립 펩타이드 나노구조체:
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제1 펩타이드는 서열번호 2이고,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 제2 펩타이드는 서열번호 4이며,
    상기 올가미 형태의 빌딩 블록의 생활성 펩타이드는 서열번호 5 내지 7중에서 선택되는 어느 하나이다.
  16. Ⅰ) 자가조립 펩타이드 나노구조체의 기능과 구조를 설계하는 단계;
    Ⅱ) 상기 Ⅰ)의 설계에 따라 제1항에 따른 올가미 형태의 빌딩 블록 중에서 적어도 하나 이상을 선택하여 조합하는 단계; 및
    Ⅲ) 상기 조합된 올가미 형태의 빌딩 블록들을 자가조립되도록 반응시키는 단계;를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체의 제조방법.
KR1020160088181A 2016-07-12 2016-07-12 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법 KR101881102B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160088181A KR101881102B1 (ko) 2016-07-12 2016-07-12 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160088181A KR101881102B1 (ko) 2016-07-12 2016-07-12 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180007219A KR20180007219A (ko) 2018-01-22
KR101881102B1 true KR101881102B1 (ko) 2018-07-23

Family

ID=61094705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160088181A KR101881102B1 (ko) 2016-07-12 2016-07-12 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101881102B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102113101B1 (ko) * 2018-06-20 2020-05-20 연세대학교 산학협력단 온도 감응성 펩타이드 구조체 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100772491B1 (ko) 2005-10-31 2007-11-01 고려대학교 산학협력단 ＤｎａＫ와 고친화력을 가지는 모티브를 포함하는 주형단백질과 탐침 단백질이 융합된 단백질 나노입자

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180007219A (ko) 2018-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1991560B1 (en) Peptide having cell membrane penetrating activity
US20040265300A1 (en) Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC)
KR20010085743A (ko) 지질 매트릭스 보조 화학결합 및 막 폴리펩티드의 합성
JP2002527358A5 (ko)
Vermeer et al. Vectofusin-1, a potent peptidic enhancer of viral gene transfer forms pH-dependent α-helical nanofibrils, concentrating viral particles
JPWO2005010031A1 (ja) チタン、銀、シリコンに結合能を有するペプチド
EP2764018B1 (en) Self-assembling polypeptide polyhedra
US20180148479A1 (en) Multitarget-directed bio-inorganic hybrid structure
CN110551195B (zh) 一种α-突触核蛋白聚集诱导发光体系及其构建与应用
JP5306995B2 (ja) 標的物質の検出方法、並びに、これに用いるタグ、ｄｎａ、ベクター、プローブ及び検出キット
US8679749B2 (en) Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
KR101881102B1 (ko) 올가미 형태의 빌딩 블록, 이의 제조방법, 이를 포함하는 자가조립 펩타이드 나노구조체 및 이의 제조방법
Tanaka et al. Characteristics of a de novo designed protein
TW201309720A (zh) 胜肽庫
WO2005044845A2 (en) Protein binding miniature proteins
KR20190138648A (ko) 생체거대분자의 정제를 위한 초분자 고친화성 단백질-결합 시스템
EP1988161B1 (en) Method of changing fluorescence wavelength of fluoroprotein
CN116731113A (zh) 针对sort1的多肽化合物及其药物偶联物
KR101586277B1 (ko) 형태변화를 이용한 자기조립 펩타이드 나노구조체, 이를 포함하는 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법
CN108440671B (zh) 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽
KR102461620B1 (ko) 약물 송달계용 엔도사이토시스 증강제
Beutel et al. Bind&Bite: Covalently stabilized heterodimeric coiled-coil peptides for the site-selective, cysteine-free chemical modification of proteins
KR102520959B1 (ko) 형광세기가 향상된 슈도모나스 푸티다 유래 플라빈 모노뉴클레오타이드 결합 단백질 변이체들
KR102036584B1 (ko) 다중목적지향 바이오-무기 하이브리드 구조체
WO2023008515A1 (ja) 抗原結合分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant