KR102036584B1 - 다중목적지향 바이오-무기 하이브리드 구조체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중목적지향 바이오-무기 하이브리드 구조체에 관한 것으로서, 탄소나노튜브를 기반으로 하며, 탄소나노튜브; 및 상기 탄소나노튜브 표면에 결합하고, 각각 상이한 표적분자와 상호작용하는 하나 이상의 펩타이드;를 포함하는 하이브리드 구조체를 제공한다.

Description

다중목적지향 바이오-무기 하이브리드 구조체{A MULTI-TARGET DIRECTED BIO-INORGANIC HYBRID STRUCTURE}

본 발명은 다중목적지향 바이오-무기 하이브리드 구조체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 무기물질을 스캐폴드로 이용하고 상기 스캐폴드의 표면에 이종의 저해제를 부착하여 이종의 목적물질을 타케팅하는 하이브리드 구조체에 관한 것이다.

과거 수년간, 항체, 항체 단편 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 광범위한 종양 특이적 치료용 단백질이 개발되어 있으며, 임상에서 시험되었다. 그러한 치료용 단백질은 소형 분자 약물, 효소, 방사성동위원소, 단백질 독소 및 환자에 대한 특이적 전달을 위한 여타 독소와 같은 치료용 독소의 여러 계열에 컨쥬게이션 되어 있다.

이중, RNA-단백질 복합체는 20년전부터, 새롭고 매력적인 치료 표적으로 인식되었다. 그러나, RNA표적에 대한 약물 개발의 노력에도 그 결실을 얻지 못하고 있다.

어려움의 주된 요인 중의 하나는 RNA와 단백질들이 복합체를 만들기 때문에 하나의 표적만을 억제할 수 있는 단분자 약물로는 치료가 어렵기 때문이다. 한편, 기존의 단일 치료약으로는 치유할 수 없는, 알츠하이머, 당뇨병, 암 및 바이러스성 질활 등의 병리학적으로 연관계 표적들에 동시에 영향을 미치는 다인성 복합 질환 체계를 방지하기 위한 다중목적 지향리간드(multitarget-directed ligands, MTDLs)가 최근에 개발되었다.

MTDLs는 상이한 표적에 작용하는 활성 약물특이분자단(active pharmacophores)의 공유 결합에 의한 하이브리드 리간드이다. 특히, 최근의 연구는 HIV-1 세포 진입과정에 대하여 직접적인 이중표적 지향 이중특이성항체(biospecific antibodies)는 지금까지 가장 강하고 보편적인 HIV-중화항체(neutraling antibodies)로서 보고한다.

한편, 표적화된 약물 전달을 위한 분자 비히클이 문헌[Backer, M.V., 등, bioconjugate Chem. 12 (2002) 462-467]에 보고되었다. WO 2010/118169는 제어되는 혈청 약동학을 지닌 인간 단백질 스캐폴드를 보고한다. 관련 적용에 대한 C-말단 구성원 교차-기준이 있는 펩타이드 및 단백질과 관련된 방법 및 조성물이 WO 2009/105671에 보고되었다. 또한, WO 2002/072141에는 표적화된 리간드가 보고되었다.

본 발명의 목적은, 탄소나노튜브를 스캐폴드로 적용함으로써, 하나의 분자에 여러 약물을 공유결합적으로 연결하여 질병 발생에 연관된 복수의 생체 물질들을 동시에 저해할 수 있는 다중 목적 지향 리간드(multi-target directed ligand, MTDL)을 제공함에 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 탄소나노튜브; 및 상기 탄소나노튜브 표면에 결합하고, 각각 상이한 표적분자와 상호작용하는 하나 이상의 펩타이드;를 포함하는 하이브리드 구조체가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 하이브리드 구조체는 제1 표적분자와 상호작용하는 제1 자기조립 펩타이드; 및 제2 표적분자와 상호작용하는 제2 자기조립 펩타이드;를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 표적분자 및 제2표적분자는 다분자(Multimolecular) 복합체를 형성할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 자기조립 펩타이드 및 제2 자기조립 펩타이드는 상기 다분자 복합체와 동시적으로 상호작용할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 자기조립 펩타이드는 아르기닌 풍부 모티프(ARM, arginine rich motif)를 포함하고, 상기 제2 자기조립 펩타이드는 NES(nuclear export signal)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 자기조립 펩타이드 및 제2 자기조립 펩타이드는 자기조립(self-assembly) 도메인을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 아르기닌 풍부 모티프는 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

[서열번호 1]

TRQARRNRRRRWRR

일 실시예에 있어서, 상기 NES는 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

[서열번호 2]

CLPPLERLTR

일 실시예에 있어서, 상기 자기조립(self-assembly) 도메인은 하기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

[서열번호 4]

KFEFKFEF

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 하이브리드 구조체를 포함하는 다분자 복합체 저해용 조성물이 제공된다.

본 발명은 저해제(inhibitor)에 비하여 훨씬 큰 크기수준을 갖는 무기물질을 뼈대로 도입하여 이를 중심으로 한 자기조립을 통해 하나의 물질에 이종의 저해제를 다수 결합할 수 있는 효과가 있다.

또한, 바이오-무기 하이브리드 구조체는 일반적인 상호작용 비해 훨씬 높은 결합을 발휘하는 다가성 상호작용이 가능하게 될 뿐 아니라 다수의 병원성 생체 물질을 하나의 치료 물질에 결합시킬 수 있는 높은 효율을 발휘할 수 있는 효과가 있다.

또한, 작은 화학 분자에 비해 생체 결합 저해에 유리한 펩타이드를 활용함으로써, 더 높은 치료 효과와 생체 적합성을 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바이오-무기 하이브리드 구조체의 개념도를 도시한 것이다.
도 2는 Rev 펩타이드의 도메인 구조를 도시한 것이다.
도 3은 RRE(Rev-response element) RNA의 핵에서 세포질로의 이동(nucleocytoplasmic export)에 대한 RRE: Rev: Crm1 복합상호작용 시스템을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 ARM 펩타이드의 아미노산 서열 및 구조식을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 NES(nuclear export signal) 펩타이드의 아미노산 서열 및 구조식을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 EAK 펩타이드의 아미노산 서열 및 구조식을 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 탄소나노튜브 스캐폴드(1D scaffold)와 평면형 스캐폴드(planar scaffold)의 구조적 이점을 비교하여 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 탄소나노튜브와 결합된 ARM 펩타이드의 양을 전기영동(SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis)분석한 결과를 도시한 것이다(도 7에서의 숫자는 ARM의 농도를 의미한다).
도 9는 본 발명의 탄소나노튜브의 표면에 ARM 펩타이드가 결합된 바이오-무기 하이브리드 구조체의 TEM 이미지를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 ARM 펩타이드(red)와 AMR-탄소나노튜브 하이브리드 구조체(blue)의 원평광이색성 스펙트럼 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 Rev-RRE RNA 복합체 용액의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 도시한 것이다.(도 10에서의 겔의 상부 숫자는 Rev 농도이고, [RRE] = 100 nM이다.)
도 12는 본 발명의 ARM-탄소나노튜브 하이브리드 구조체 농도의 증가에 따른 RRE-Rev 복합체([RRE]=100 nM, [Rev]= 6μM)의 EMSA이다.(도 11에서 겔의 상부 숫자는 ARM-탄소나노튜브 하이브리드 구조체의 농도이다.)
도 13은 본 발명의 로다민 B의 표지된 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)(red)와 로다민 B가 표지되지 않은 단일벽 탄소나노튜브(SWNT)(blue)의 형광방출 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 14는 본 발명의 ARM-탄소나노튜브 하이브리드 구조체의 세포 내 분포 이미지를 도시한 것이다. (SWNT에서의 빨광 형광(로다민 B)(left), ARM 펩타이드에서의 파란 형광(파이렌)(middle), SWNT와 ARM 펩타이드의 공존을 보여주는 병합된 이미지(right))
도 15는 본 발명의 ARM 펩타이드(red)와 ARM-탄소나노튜브 하이브리드 구조체(blue)의 광퇴색후 형광 회복법(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)에 의한 정량분석을 도시한 것이다.
도 16은 본 발명의 ARM 펩타이드(upper panels)와 ARM-탄소나노튜브 하이브리드 구조체(lower panels)의 광퇴색후 형광 회복법의 분석결과를 도시한 것이다.
도 17은 본 발명의 hetero-(A&E)-SPCH의 TEM 이미지를 도시한 것이다.
도 18은 본 발명의 hetero-(A&E)-SPCH에 의한 RRE: Rev 상호작용 저해에 있어서, 공조립비율 의존도의 EMSA를 도시한 것이다.(도 17에서 M은 RNA ladder이다.)
도 19는 본 발명의 lin-NES 조립체(좌측), cyc-ARM 조립체(가운데), lin-NES와 cyc-ARM의 공조립(우측)의 원자간력 현미경(AFM) 이미지를 도시한 것이다.
도 20은 본 발명의 lin-NES(blue), lin-NES와 cyc-NES의 공조립체(green) 및 cyc-ARM(red)의 정규화된 원평광이색성(CD) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 21은 본 발명의 homo-NES-SPCH(blue), hetero-(A&N)-SPCH(green) 및 homo-ARM-SPCH(red)의 정규화된 원평광이색성(CD) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 22는 본 발명의 lin-NES와 cyc-ARM의 공조립체(blue), hetero-(A&N)-SPCH(red)의 형광 방출 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 23은 본 발명의 pDM128 플라스미드의 도식화 이미지를 도시한 것이다.
도 24 및 25는 본 발명에서의 RRE RNA의 핵세포질 수송을 측정한 CAT assay를 도시한 것이다.(도 23, 도 24의 겔 상부의 숫자는 LMB 또는 SPCH의 농도이다.)
도 26은 본 발명에서의 도 23의 CAT assay 데이터의 비중 분석을 도시한 것이다.
도 27은 본 발명에서의 도 24의 CAT assay 데이터의 비중 분석을 도시한 것이다.
도 28은 본 발명에서의 RRE RNA의 핵세포질 수송을 측정한 CAT를 도시한 것이다(상부의 숫자는 LMB와 SPCH의 농도이고, 1&B는 pDM128 & pBluscript KS(+)이고, 1&R은 pDM128 & pSV2-Rec이고, ho-A-S는 homo-ARM-SPCH이고, he-(A&N)-S는 hetero-(A&N)-SPCH이고, he-(E&N)-S는 hetero-(EAK&NESA)-SPCH이다.)

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 탄소나노튜브; 및 상기 탄소나노튜브 표면에 결합하고, 각각 상이한 표적분자와 상호작용하는 하나 이상의 펩타이드;를 포함하는 하이브리드 구조체가 제공된다.

본 발명에서는 MTDLs의 개념을 초분자 바이오-무기 하이브리드 시스템(supramolecular bio-inorganic nanohybrid system) 또는 하이브리드 구조체에 적용하였다.

상기 탄소나노튜브는 게스트 재료(guest materials)의 높은 하중 용량, 생체적합성(biocompatibility), 생체 외 안정성(in vivo stability) 및 세포침투능력으로 인하여 바이오-무기 하이드리드화에 의한 인공 생체거대분자의 스캐폴드로서 각광받고 있다.

상기 탄소나노튜브는 다원자가 방식에 의하여, 표면에 단백질로부터 분리된 활성 단백질 분획물과 같은 생체고분자의 기능적 단위(functional units)를 발현(display)시킬 수 있으므로, 탄소나노튜브 기반 바이오-무기 하이브리드는 병원성 생체분자 상호작용의 강력한 억제제로서 제공될 수 있는 잠재성을 가지고 있다.

또한, 상기 탄소나노튜브의 물리적, 광학적, 전기적 특성은 자연계 생체분자에서 가능하지 않았던 분야에 하이브리드 구조로서 활용 가능한 범위를 확장시킨다.

상기 펩타이드(peptide)는 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 하나 이상의 아미노산으로 구성된 폴리머를 의미한다.

상기 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 구체적으로 지시된 예외사항이 없는 경우 3문자 또는1문자 아미노산 코드를 기초로 할 수 있다. 예컨대, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예컨대, Ala, Lys)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예컨대, D-Ala, D-Lys)를 구체적으로 지시하지 않은 경우라면L-입체형태로 가정할 수 있다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기일 수 있다.

상기 하이브리드 구조체는 탄소나노튜브 표면에 결합되고 각각 상이한 표적분자와 상호작용하는 하나 이상의 펩타이드를 포함하므로, 하나 이상의 표적분자와 동시적으로 상호작용할 수 있다.

상기 “상호작용”은 직접 또는 간접적일 수 있고, 직접 결합을 포함하거나 또는 간접적으로 결합할 수 있으며, 결합은 다른 분자에 의해 매개될 수도 있다.

즉, 상기 “상호작용” 또는 “결합”은 모든 상호작용 형태를 포함하며, 직접 및 간접 결합 모두를 포함할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바이오-무기 하이브리드 구조체의 개념도이다.

도 1을 참조하면, 상기 하이브리드 구조체는 탄소나노튜브를 기반으로 하며, 상기 탄소나노튜브 표면에 결합된 하나 이상의 자기조립 펩타이드를 포함할 수 있다.

상기 하이브리드 구조체는 제1 표적분자와 상호작용하는 제1 자기조립 펩타이드; 및 제2 표적분자와 상호작용하는 제2 자기조립 펩타이드;를 포함할 수 있으며, 상기 제1 표적분자 및 제2표적분자는 다분자(Multimolecular) 복합체를 형성할 수 있다.

따라서, 상기 제1 자기조립 펩타이드 및 제2 자기조립 펩타이드는 상기 다분자 복합체와 동시적으로 상호작용할 수 있다.

상기 다분자(Multimolecular) 복합체는 예컨대, RNA-단백질 복합체일 수 있으며, 생체 내의 다양한 다분자 복합체 시스템이 의약품 발굴에 있어 표적으로서 연구되고 있다.

그러나, 종래 신약 개발을 위한 연구는 다분자 복합체의 일부 인터페이스 또는 일부 생체 분자만을 표적으로 삼았으므로, 효과적인 저해 활성 또는 치료 효과를 구현하지 못하였다.

본 발명자들은 다중표적 지향 펩타이드-CNT 하이브리드(multi-target directed peptide-CNT hybrids, 이하 'SPCHs'라 함)가 다분자 복합체를 효과적으로 저해할 수 있음을 확인하였으며, 상기 SPCHs는 두 인터페이스(interfaces)를 표적으로 삼을 수 있다.

상기 하이브리드 구조체는 크기 및 복합체 분자 인터페이스에 의하여 특정되는 다분자 복합체를 저해하는데 매우 적합하다.

예컨대, 단일목적지향 SPCHs가 생체 외에서만 RNA와 단백질로 구성된 단일 인터페이스를 저해시키는 반면, 다중목적지향 SPCHs는 생체 외 및 세포 내에서 다분자 RNA-단백질 인터페이스를 저해할 수 있다.

상기 하이브리드 구조체(탄소나노튜브 스캐폴드)는 기존의 1 종의 펩타이드만 이용하였던 종래의 접근방식에 비하여 다분자 복합체에 대하여 효과적이다.

상기 하이브리드 구조체는 하기 이유에서 유용하다.

(1) 각각의 리간드의 활성을 조합하는 것은 강한 상승작용을 일으킬 수 있다. (2) 펩타이드는 저분자 억제제(small molecule inhibitor)로 인하여 약물로 이용할 수 없는 널찍하고(spacious), 얕은(shallow) 인터페이스(interfaces)에 의해 유도되는 생체 상호작용과 관련된 단백질을 타게팅하는데 매우 적합하다. (3) 비공유 하이브리드 구조는 초분자 상호작용에서의 다가성(multivalency)과 적응력(adaptability)의 이점(advantage) 때문에 이종의 표적 생체분자와 종래의 공유 MTDLs보다 효과적으로 상호작용할 수 있다. (4) CNT의 길이는 일반적인 생체거대분자(biomacromolecules)보다 크기 때문에 동시적으로 많은 표적과 상호작용할 수 있다. (5) 광열속성(photothermal properties)과 같은 CNT의 유용한 물리적, 광자(photonic), 전기적 특성은 병원성 생체물질(pathogenic biomaterials)을 효과적으로 무력화할 수 있다.

본 발명에서 널리 알려진 RNA-단백질 상호작용으로서, Rev-response element(RRE) RNA : Rev protein : Crm 1 protein 상호작용 시스템이 다분자 RNA-단백질 상호작용의 모델로서 이용되었다.

HIV-1 Rev protein에서 유도된 짧은 α-나선형의 펩타이드는 특히 RRE에서 고친화성 부위(high affinity site)로 인식되어 있으며, 상기 RNA-단백질 상호작용 시스템은 의약품 발굴에 있어 표적으로 널리 알려져 있다.

상기 Rev는 다중결합 방식으로 RRE를 결속시키고, RRE-Rev 복합체는 Crm1에 의하여 인식될 수 있다.

신약을 개발하기 위한 많은 시도가 있었으나, 이전의 연구는 interaction interface인, RRE : Rev interface 또는 RRE-Rev 복합체 : Crm1 interface만을 표적으로 삼았으므로 임상 전 단계까지 진척되지 못하였다.

본 발명자들은 상기 하이브리드 구조(hydrid structure)의 특성을 관찰하기 위하여 단일 펩타이드를 이용하여 SPCHs(homo-SPCH)를 조립하였다.

생체활성(bioactivity) 및 CNT 결합특성(CNT-binding properties)을 갖는 펩타이드를 준비하기 위하여, Rev의 arginine-rich motif(ARM, 14 amino acid), 세포 내 추적을 위하여 파이렌 형광물질이 부착된 자기조립-CNT 결합 세그먼트 및 링커로 구성된 거대 고리화된 제1 자기조립 펩타이드(marcrocyclic peptide, cyc-ARM)를 합성하였다.

구체적으로, 상기 제1 자기조립 펩타이드는 아르기닌 풍부 모티프(ARM, arginine rich motif)를 포함할 수 있고, 자기조립(self-assembly) 도메인을 포함할 수 있다.

상기 아르기닌 풍부 모티프는 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 자기조립(self-assembly) 도메인은 하기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

[서열번호 1]

TRQARRNRRRRWRR

[서열번호 4]

KFEFKFEF

상기 제1 자기조립 펩타이드는 하기 구조식 1로 표시되는 것으로, 대환고리형 펩타이드인 cyc-ARM 펩타이드(이하, 'cyc-ARM'이라 함)일 수 있다.

[구조식 1]

도 3을 참조하면, 상기 Rev(도 2)는 스플라이싱 되지 않거나(unspliced), Crm 1의 도움을 받아 부분적으로 스플라이싱된(partially spliced) HIV-1 RNA에 대하여 바이러스 복제에서 필수적인 단계인 핵 세포질 내로의 전위(translocation or export)를 가능하게 한다. 상기 Rev는 ARM과 핵외수송신호(nuclear export signal, NES)를 통하여 각각 RNA 및 Crm1과 상호 작용할 수 있다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 상기 ARM은 α-나선형 펩타이드 이고, NES는 불규칙한 입체구조를 가지므로 상기의 펩타이드 서열들은 상이한 구조적 특성을 가진다.

따라서, 다중목적지향 생체활성 리간드로서 ARM과 NES를 포함하는 다중목적지향 SPCH의 효험(efficacy)을 증명하는데 있어서, RRE : Rev : Crm1 복합체는 적합한 표적물질이 될 수 있다.

도 7을 참조하면, 상기 탄소나노튜브의 1차원 구조는 평면적인 표면을 갖는 2차원 또는 3차원 구조 스캐폴드를 넘어서는 상당한 이점을 제공할 수 있다.

생체분자화물(biomolecular cargos)은 단일벽 탄소튜브(SWNTs)의 좁은직경(~ 1nm)으로 인하여 구조적 방해 없이 탄소나노튜브 스캐폴드에 노출될 수 있다. 단백질로부터 분리된 짧은 생체활성 펩타이드에서, 기능성과 밀접하게 관련된 원래의 입체구조를 유지하는 것이 중요하다.

상기 탄소나노튜브 기능화는 공유(covalent) 또는 비공유(noncovalent) 결합 접근에 의해서 달성될 수 있다. 공유결합 접근에서 기능화된 펩타이드의 방향성 및 밀도의 조정은 용이하지 않다. 이는 반응기(reactive groups)가 SWNT 표면의 무작위적인 지점에 고정되어 있기 때문이다.

대조적으로, 비공유 결합의 접근은 초분자 조절을 통하여 기능화된 펩타이드의 구체적인 분자 상태를 조절할 수 있다. 또한, 비공유 결합 접근은 하이브리드 구조를 준비하고 고정된 화물에서 다른 종류의 비율을 조절하는데 용이하다. 즉, 하이브리드에 고정된 다른 종류 화물의 비율은 용액 상태에서 펩타이드 간의 농도비에 비례할 수 있다.

homo-SPCHs를 준비하기 위하여, 아크 방전법으로 성장된 SWNT에 대하여 염화나트륨 수용액(NaCl, 150mM) 내에서 초음파조(sonication bath)를 이용하여 cyc-ARM으로 기능화 처리하여 탄소나노튜브 표면에 cyc-ARM이 결합된 무기-바이오 하이브리드 구조체(homo-ARM-SPCH)를 준비하였다.

SWNT 측벽에 고정된 cyc-ARM의 최대 가능 용량(maximum possible amount)을 정량화하기 위하여 다양한 cyc-ARM 농도에서 준비된 SPCH용액으로부터 고정되지 않은 펩타이드를 원심분리를 이용하여 분리한 후, 분리된 펩타이드를 겔 전기영동기(gel electrophoresis)에 주입하였다.

도 8을 참조하면, 전기영동 밴드의 농도계 분석(densitometric analysis)를 통하여, 1.4 nmol의 cyc-ARM가 1μg의 SWNTs와 결합할 수 있는 것을 확인하였다. SWNTs의 비표면적과 CNT-결합 세그먼트(CNT-binding segment)의 계산된 표면적을 고려할 때, CNT의 표면적에 대한 펩피드의 피복률(coverage)은 ~ 100%이다. 고정되지 않은 펩타이드가 존재하지 않은 SWNT 표면의 밀집한 피복률이 가능한 조건하에서, 소수성 무기 스캐폴드는 투과전자현미경(TEM) 사진(도 9)에서 확인할 수 있듯이 하이브리드화에 의하여 효과적으로 용해되었고 디번들링(debundled) 되었다.

SWNTs에 고정된 cyc-ARM의 2차 구조는 원평광이색성분광(circular dichroism(CD) spectroscopy)을 이용하여 관찰하였다.

도 10을 참조하면, α-나선형 입체구조의 신호인 222 nm에서 negative minimum은 ARM 펩타이드 스펙트럼(red) 보다 homo-ARM-SPCH CD 스펙트럼(blue)에서 강도가 높았다(more intense). 강화된 헬리시티(helicity)는 무기 스캐폴드-유도 α-나선 안정화에 의하여 유도되었다. 이러한 안정화는 특정한 RRE 인식에 있어 매우 중요하다.

하이브리드 구조를 이용하여 생체 외에서 RRE : Rev 상호작용의 억제제로서 이용가능성을 조사하였다. 안정된 RRE-Rev 복합체를 준비하기 위하여 우선 Rev와 RRE(~350 nt)의 복합체 형성 비율을 결정하였다.

RRE(100nM)와 다양한 농도의 Rev를 HEPES-buffered saline(HBS)에서 혼합한 후 전기 영동상 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 실시하였다.

도 11을 참조하면, 다원자가 방식을 통해 10 내지 12개의 Rev가 RRE RNA에 결합될 수 있으므로, 상기 RRE-Rev 복합체는 임계농도 이상에서 Rev 농도가 증가할수록 점차적으로 넓어지는 전기영동 밴드를 형성한다(lanes 8-14). 넓은 밴드는 다른 수많은 결합 Rev 단백질의 RRE-Rev 복합체로 구성된다.

상기 결과를 토대로, 안정한 RRE-Rev 복합체를 안정하게 유지하는 농도를 경합실험(competition experiment)으로서 이용하였다(RRE, 100nM; Rev, 6μM).

사전 준비된 RRE-Rev 복합체에서 Rev가 homo-ARM-SPCH와 경쟁적으로 교환될 수 있는지 확인하였다.

도 12를 참조하면, homo-ARM-SPCH의 농도가 증가할수록 복합체에 해당하는 밴드가 서서히 사라지며, 이는 경쟁적인 교환반응을 뒷받침된다.

homo-ARM-SPCH는 겔을 통하여 이동할 수 없으므로, 교환반응 결과는 복합체의 밴드 강도가 감소하였다. 복합체가 다중체 Rev 단백질(multimeric Rev protein)과 거대한 RNA(~350 nt)로 구성되었다는 것을 고려할 때 작은 cyc-ARM을 기반으로 하는 하이브리드와의 경쟁은 주목할 만하다.

또한, 넓은 EMSA 밴드의 아래 부분은 보다 적은 수의 Rev 단백질을 포함하는 Rev-RRE 복합체를 의미하는데, 경합실험에서 이 부분이 우선적으로 사라지는 것이 확인되었다. 상기 결과는 적은 수의 Rev 단백질을 포함하는 복합체가 교환 반응에 더 취약하다는 사실과 일치하였다.

또한, 완전한 교환 조건에서 Rev와 homo-ARM-SPCH의 농도는 각각 6 μM과 600pM였다. 상기 결과는 RRE 결합에서 상기 homo-ARM-SPCH의 결합력이 Rev 단백질보다 약 10000배 강함을 시사한다. 상기 homo-ARM-SPCH의 뛰어난 생체 외 저해능력은 homo-ARM-SPCH의 자기조립 하이브리드 형성과 다원자가의 특성으로 인한 것으로 통계적 재결합 기작(statistical rebinding mechanism)에서 기인할 수 있다.

비공유 상호작용은 가역적이기 때문에, 세포 내에서 초분자 펩타이드-CNT 하이브리드(SPCHs)는 불안정하다. 이러한 기초적인 의문점의 중요성에도 불구하고, 현재의 수준에서는 비공유 펩타이드-CNT 하이브리드의 세포 내 안정성은 특정되지 않았다.

상기 안정성을 검증하고자 초분자 하이브리드 구조의 세포 내 거동을 관찰하였다. 파이렌(pyrene) 표지된 cyc- ARM으로부터 무기 스캐폴드를 구별하기 위하여 SWNT에 로다민 B(rhodamine B)으로 표지하였다.

도 13은 로다민 B가 표지된 단일벽 탄소나노튜브(red)와 로다민 B가 표지되지 않은 단일벽 탄소나노튜브(blue)의 형광방출 스펙트럼을 도시한 것이다.

도 13을 참조하면, HBTU(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramathyluronium hexalfluorophosphate))를 이용한 아마이드 결합 형성을 통하여 에틸렌 디아민(ethylene diamine)과 로다민 B는 SWNT 표면에 컨쥬게이트 되었다. 형광 SWNT는 펩타이드, cyc-ARM으로 비공유 결합에 의하여 기능화되었다.

도 14를 참조하면, 공초점 레이저 주사 현미경(confaocal microscopy)을 이용하여, 하이브리드를 4시간 배양한 후 펩타이드(좌측 이미지; 청색 형광) 및 SWNT(가운데 이미지; 적색 형광)이 세포핵(nucleus) 및 세포핵 내의 인(nucleolus)를 포함한 전체 세포에 대하여 넓게 분포되어 있음이 확인되었다. 적색 및 청색 형광의 공동국소화(colocalization)는 cyc-ARM이 세포 내 환경에서 SWNT로부터 분리되지 않았음을 의미한다(좌측 이미지).

세포 내 환경에서 SWNTs의 펩타이드 비공유성 부동화의 안정도를 입증하기 위하여 펩타이드 단독(cyc-ARM alone) 또는 homo-ARM-SPCH를 처리한 세포를 광퇴색한 후 형광 회복법(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)을 통해 분석하였다. FRAP은 광퇴색 영역에서 형광 회복에 필요한 시간을 측정함으로써 물질의 크기 관여 세포 내 이동도를 다루기 위한 기법이다.

도 15 및 도 16을 참조하면, homo-ARM-SPCH의 형광 회복은 cyc-ARM의 형광 회복보다 더뎠다. 회복률은 분자량에 반비례하므로 상기 결과는 cyc-ARM의 효과적인 분자량은 SWNT와 결합에 의하여 증가될 수 있음을 시사한다. 즉, 비공유성 하이브리드 구조는 세포 안에 온전히 유지될 수 있다.

동종의 리간드를 포함하는 SPCH에 대한 연구자료를 이용하여, 다른 종류의 펩타이드(hetero-SPCH)를 포함하는 SWNT 하이브리드 구조를 연구하였다. SWNT에서 cyc-ARM와 공조립할 수 있는 거대고리화 펩타이드(macrocuclic peptide)인 cyc-EAK를 합성하였다.

상기 cyc-EAK는 하기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 하기 서열번호 3-1의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다.

[서열번호 3]

AEAAAKEAAAKA

[서열번호 3-1]

KKFEFKFEF

구체적으로, 상기 cyc-EAK는 하기 구조식 3으로 표시될 수 있다.

[구조식 3]

상기 cyc-ARM의 Rec α-나선 세그먼트는 cyc-EAK의 α-나선형 펩타이드 모델(H-AEAAAKEAAAKA-OH)에 의하여 치환될 수 있다.

본 발명에서 상기 cyc-EAK는 α-나선형 펩타이드 모델로 이용되었다. 상기 펩타이드는 이온이 존재하는 조건에서 자기조립하는 특성을 가지므로, cyc-ARM과 cyc-EAK를 순수한 물에 용해하여 균일하게 혼합된 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물의 일부를 SWNT에 결합(binding)시킨 후 이온을 투입시켰다.

도 17을 참조하면, SWNT 결합 후 별개의 나노 결과물인 hetero-A&E-SPCH를 산출하는 이온 힘 유도 SWNT 기능화(ionic force-mediated SWNT functionalization)가 일어났다.

다양한 cyc-ARM/cyc-EAK 비율의 hetero-A&E-SPCH 용액을 준비하고, 생체 외 RRE : Rev 상호작용 저해 능력을 실험하였다.

도 18을 참조하면, EMSA에 의한 경쟁실험(competition experiments)에서 cyc-ARM 분율이 낮을수록 hetero-A&E-SPCH의 저해능이 감소하였다.

상기 결과는 무기 SWNT 표면에서 공조립된 펩타이드의 상대적 비율은 용액에서의 펩타이드 비율에 의하여 직접적으로 보여진다. 도 12와 유사하게, 복합체 밴드의 아래 부분의 밴드는 경쟁실험(competition experiments)에서 우선적으로 사라졌다.

하이브리드화 방법이 다른 구조적 특성을 갖는 펩타이드에도 적용될 수 있는지 확인하고자, Rev NES와 SWNT 결합 시퀀스(SWNT binding sequence)를 포함하는 선형의 제2 자기조립 펩타이드(lin-NES)를 합성하였고, 파이렌(pyrene)과 형광공명에너지전지(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 쌍을 이루는 플루오레세인(fluorescein)을 lin-NES에 라벨링 하였다.

상기 제2 자기조립 펩타이드는 NES(nuclear export signal)를 포함할 수 있으며, 자기조립(self-assembly) 도메인을 포함할 수 있다.

상기 NES는 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 자기조립(self-assembly) 도메인은 하기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

[서열번호 2]

CLPPLERLTR

[서열번호 4]

KFEFKFEF

상기 제2 자기조립 펩타이드는 하기 구조식 2로 표시될 수 있으며, 선형 NES 펩타이드(이하, 'lin-NES'라 함.)일 수 있다.

[구조식 2]

도 19를 참조하면, SWNT가 부존재하는 조건에서 lin-NES 펩타이드 조립체(좌측 이미지)와 cyc-ARM 펩타이드 조립체(가운데 이미지)의 모폴러지(morphology)는 각각 섬유상(fibrillary)과 구형(spherical)이었다. cyc-ARM과 lin-NES가 공조립한 바이오-무기 하이브리드 구조체(hetero-(A&N)-SPCH)의 경우(우측 이미지)에는 불규칙한 집합체가 나타났다.

도 20을 참조하면, α-나선의 안정화가 cyc-ARM, lin-NES 및 이들의 공조립체에서는 관찰되지 않았다.

도 21을 참조하면, 도 20과 대조적으로 상기 공조립체에 의하여 조립된 hetero-SPCH 또는 hetero-(A&N)-SPCH의 CD spectra는 높은 수준의 헬릭스 안정화(helix stabilization)를 나타냈다.

즉, SWNT의 하이브리드화는 SWNT가 부존재하는 조립체에서 기대할 수 없는 펩타이드의 헬리시티(helicity)를 증가시킬 수 있다.

도 22을 참조하면, hetero-(A&N)-SPCH는 FRET 분석에서 공조립된 펩타이드보다 높은 에너지 전이효율을 나타내었다.

즉, 공조립된 불규칙한 집합체(blue)보다 cyc-ARM과 lin-NES가 CNT의 측벽(red)에서 보다 효과적으로 혼합될 수 있다. 따라서, 다양한 아미노산 조성, 2차 구조 및 배열 형태(configuration)을 갖는 생체활성 펩타이드는 비공유 하이브리드화 방법을 통하여 hetero-SPCH에 안정적으로 위치할 수 있다.

마지막으로, hetero-SPCH의 다중표적(목적)결합과 저해 능력을 확인하였다. Rev에 의해 유도된 RRE 방출의 저해를 평가하기 위하여, RRE 발현 pDM128 플라스미드(plasmid)(도 23)에 기초한 핵세포질 방출 assay를 수행하였다.

도 24를 참조하면, 클로람페니콜아세틸전달효소(chloramphenicol acetyltransferase, CAT) assay에 나타난 바와 같이(lane 3), HeLa 세포에서 pSV2-Rev(Rev 발현 플라스미드)의 pDM128의 동시전이(co-transfection)는 효과적인 RRE RNA의 핵세포질 방출을 가능하게 한다. 반면, 세포가 음성조절 플라스미드(negative control plasmid) pBluescript KS(+)에 의하여 동시전이 되었을 때에 미약한 CAT 활성이 관찰되었다(lane 2).

또한, RRE: Rev: Crm1 상호작용에 의해 유도된 핵세포질 방출이 펩타이드-CNT 하이브리드에 의하여 저해될 수 있는지를 확인하기 위하여 hetero-(A&N)-SPCH로 세포를 처리하였다.

도 24 내지 도 27을 참조하면, 바이오-무기 하이드브리드 억제제가 농도 의존적으로 CAT 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

도 28을 참조하면, 하나의 상호작용만 표적으로 하는 SPCHs는 같은 농도가 주어졌을 때, CAT 활성을 감소시킬 수 없다. 이는 다분자 RNA-단백질 복합체의 효과적인 저해를 위하여 상호작용은 동시에 통제되어야 한다는 것을 의미한다.

핵으로부터 HIV-1 Rev-유도 pre-mRNA 방출에 있어서, 잘 알려진 소분자 억제제인 leptomycin B(LMB)와 비교하면, hetero-(A&N)-SPCH는 RNA-단백질 복합체의 억제제로서 대략 150배의 더 나은 결과를 보여준다. RRE 방출을 완전히 억제함에 있어, 100nM의 LMB가 요구되는 반면, SPCH는 0.66nM이 요구되었다.

상기 SPCH의 뛰어난 억제 능력은 두 개의 다른 표적을 향하는 펩타이드 리간드의 동시 다중 전시(simultaneous multivalent display)와 이러한 비공유 조립체의 적응 가능한 특성 때문이다. 상기 적응 특성으로 인해 조립체는 표적 인터페이스에서 특정한 3D 환경에 따라 리간드 유닛의 방향과 간격을 조정하는데 이용될 수 있다.

상기 결과들은 hetero-SPCH의 이러한 형태는 다종의 병원성 생체분자들 사이의 상호작용을 포함하는 질병에 대한 효과적인 치료체로서 잠재성을 가지고 있는 것을 입증한다.

본 발명자들은 다가성 MTDLs를 이용하여 다종 생체분자 상호작용을 조절하는 새로운 전략을 설계하였다. 소분자 억제제를 대신하여, 신약개발분야에서 촉망받는 재료인 펩타이드를 일반적인 생체분자의 크기보다 긴 길이를 갖는 CNT 스캐폴드에 전시(displayed)하였다.

상기 하이브리드 구조체는 비공유 상호작용에 의한 단순한 방법을 통하여 준비되었고, 세포 내에서 우수한 안정성을 보여주었다. 펩타이드 리간드의 다중 전시로, SPCH는 다중표적 지향 assay에서 뛰어난 표적 억제 능력을 보여주었다.

약물의 효험은 투여 후에 감소된 영역에서 낮은 축적 속도에 의해 제한되기 때문에, 단일 약물의 높은 치료 활성은 신약개발에 있어서 중요하다. 즉, 다가성 초분자 구조의 우수한 효과는 MTDL 기반 치료에서 새로운 통찰을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 하이브리드 구조체를 포함하는 다분자 복합체 저해용 조성물이 제공된다.

상기 조성물은 크기 및 다중타겟특성으로 인해 종래 약물로서 저해할 수 없었던 다분자 복합체를 효과적으로 저해할 수 있다.

상기 조성물은 총 중량에 대비 상기 하이브리드 구조체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 화합물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다. 상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예

조직 배양과 세포 내 실험

펩타이드/CNT 하이브리드(SPCH) 구조의 세포 내 전달을 현미경 관찰하기 위하여, HeLa 세포(1 × 10⁴)를 10 % FBS(fetal bovine serum)과 1 % pen/strep이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)내에 8-well Lab-Tek Ⅱ 챔버 커버글래스 시스템(Nunc)에 분주하고 5 % CO2와 37 ℃에서 배양하였다.

배양된 세포를 DPBS(Dulbecco's phophate-buffered saline)으로 세척한 후, 하드브리드 구조로 4시간 동안 처리하였다. 이후, 샘플 용액을 제거하고, 1 시간동안 세포를 더 배양하였다.

배양된 세포를 공초첨 현미경(LSM 710, Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 시각화하였다. FRAP 분석을 위하여, 세포의 작은 영역에 파이렌 형광을 광표백하고, 대략 2 초당 1 이미지의 간격으로 300초 동안 관찰하였다.

EMSA with full-length RRE RNA

EMSAs는 10 mM HEPES-KOH(pH 7.5), 100 mM KCl, 1 mM MgCl2 및 10 % 글리세롤의 조성을 갖는 binding beffer에서 수행하였다. 복합체 형성을 위하여, 7 μL의 샘플 용액을 3 μL의 100 nM full-length RRE RNA 용액과 혼합하였다.

반응물은 1 시간 이상 상온에서 배양되었고, 1.2 % 아가로오스(1 × TBE) 겔에 옮겼다. 약 45분 동안 150 V, 상온에서 전기영동을 실시하고, RNA를 SYBR Green Ⅱ RNA gel staining 시약으로 스테이닝(staining)하여 시각화하였다.

클로람페니콜아세틸전달효소 ( chloramphenicol acetyltransferase , CAT) assay

HeLa 세포를 10 % FBS와 1 % pen/strep이 첨가된 DMEM에서 5 % CO2, 37 ℃조건에서 배양하였다. 배양된 세포(4 × 10⁴)를 48-well 플레이트에 분주한 후, 5 % CO2, 37 ℃조건에서 밤새 배양하였다. DPBS로 세척한 후, 0.7 μL의 jetPEI DNA 형질주입 시약으로 복합화된 플라스미드(total 250 ng; pDM128, pBluescript Ⅱ KS (+), pSV2-Rev)를 각 well에 첨가하였다.

6 시간의 형질주입 후, 세포를 DPBS로 세척하고, DMEM/FBS에서 42 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 DPBS로 세척하고, 10분 동안 37 ℃에서 배양한 후 200 μL의 cell lysis beffer(Promega, USA)를 추가하였다.

세포들을 회수하고, 4℃에서 10분 동안 최고속도(16,110 g)로 원심분리하였다. 상층액을 수집한 후 10분 동안 65 ℃에서 배양하고, tabletop centrifuge에서 최고속도(16,110xg)로 원심분리한 후 다시 추가하였다.

샘플을 BCA assay(BCA protein assay kit; Pierce, USA)를 이용하여 측정된 단백질 농도로 정상화 하였다. 샘플을 반응 혼합물[1M Tris-Cl, pH 7.8, 3.5 mg/mL acetyl-CoA, and 1 μL of 14C-radiolabeled chloramphenicol(PerkinElmer)]과 혼합하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

이후, 1 mL의 에틸 아세테이트를 첨가하였고, 혼합물을 10분 동안 볼텍싱(vortexed)하였다. 혼합물을 5 분 동안 22,000 g에서 원심분리하였고, 800 μL의 상층 유기상을 수집하고 기화에 의하여 100 μL이하로 농축하였다.

생성물을 얇은막 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC; 95 % chloroform, 5% methanol)을 이용하여 분리하였고, TLC 시트를 인광영상판(phosphor-imaging plate)에 12 시간 동안 노출시켰다. 상기 이미지를 Typhoon FLA-700 PhosphorImager(GE Healthcare Life Sciences, USA)에 의하여 시각화한 후, Multigauge software를 이용하여 처리하였다.

실험방법

펩타이드의 합성

Tribute peptide synthesizer(Protein Technologies, USA)을 이용하여 Fmoc 프로토콜을 통해 Rink Amide MBHA resin LL(Novabiochem)에서 펩타이드를 합성하였다. 일반적인 방법에 의하여 Cys(Mnt)와 Lys(Dde)를 제외한 아미노산을 보호하였으며, 각각 산 반응성(acid-labile) methoxytrityl(Mnt)와 N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl](Dde) groups을 이용하였다.

side chain-to-tail 고리화 반응 동안, 브로모아세트산(bromoacetic acid)이 수지-결합 펩타이드의 N-말단 부분과 첫 번째로 결합하였다.

수지에 첨가되기 전에, carboxyl activation을 위하여 NMP(n-methyl-2-pyrrolidinone)에서 브로모아세트산(28 mg, 200 μmol)과 N, N'-diisopropylcarbodiimide(15,5 μL, 100 μmol)의 혼합물을 10분 동안 배양하였다.

수지에 상기 혼합물을 첨가한 후, 상온에서 진탕(shaking)하면서 10분 동안 배양하였다. 시스테인으로부터 Mnt 그룹의 직교 탈보호(orthogonal deprotection)를 위하여, 수지는 DCM(dichloromethane)내 1 % TFA(trifluoroacetic acid)로 수 시간(1 min × ~7)동안 처리하였다.

분자 내 고리화 반응은 상온 진탕조건에서 NMP 내 3 μL의 1% DIPEA(diisopropylethylamine)에서 진행되었다. Lys(Dde)로부터의 Dde의 탈보호는 DMF(dimethylformamide)의 2% 히드라진(hydrazine)에서 진행되었다.

이후, 발형광단(fluorophore)의 결합은 표준 Fmoc 프로토콜에 따라 진행되었다. Dapoxyl 발형광단 라벨링을 하기 위하여, tail 세그먼트의 류신(leucine) 잔기는 Lys(Dde)로 치환되었고, Dapoxyl^TM succinimidyl ester은 직교 탈보호된 라이진 잔기와 컨쥬게이션되었다.

수지로부터 최종 탈보호 및 분리를 위하여, 수지-결합 펩타이드를 삼불화아세트산(TFA)/삼이소프로필실렌(TIS)/물이 95:2.5:2.5의 비율로 혼합된 보호기 제거 혼합 용액(cleavage cocktail)을 3 시간동안 처리하였으며, tert-부틸 메틸 에스터로 배산(trituration)되었다.

펩타이드는 역상 HPLC(water/acetonitrile with 0.1% TFA)에 의해서 정제되었다. 분자량은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-filght) 질량 분석기(Microflex LRF20, Brunker)에 의해서 측정되었다.

CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic)가 매트릭스로 이용되었다. 펩타이드의 농도는 350 nm에서의 파이렌(pyrene)(8790 cm-1)의 몰흡광계수와, 495 nm에서의 플루오레세인(fluorescein)(428 cm-1)의 몰흡광계수를 이용하여 water/acetonitrile(1:1)에서 분광광도법에 의해서 측정되었다.

측정예

(1) 원평광이색성 분광(CD) 측정

Peltier 온도 조절계가 구비된 ChriscanTM Circular Dichroism spectrometer(Applied Photophysics, USA)를 이용하여 원평광이색성 분광(Circular Dichroism)을 측정하였다.

펩타이드의 CD 스펙트라는 경로길이 1 mm의 큐벳(cuvette)을 이용하여 190 내지 260 nm에서 기록되었다.

(2) 원자간력 현미경(AFM) 분석

원자간력 현미경 분석을 위하여, 약 1μL의 시료를 갓 분리된 운모(mica)에 침전시켰다. 시료를 완전히 건조 후, 아르곤 가스의 스팀 하에서 증류수(distilled water) 잔여의 염을 제거하였다.

이미지는 Nanoscope Ⅳ instrument(Digital Instruments)를 이용하여 tapping 모드에서 얻었다. AFM 스캔은 0.8 내지 1 V 범위의 설정값에서 얻었으며, 스캔속도는 1 내지 2 Hz였다.

(3) 투과전자현미경(TEM) 분석

1 ㎕의 시료를 탄소 코팅한 구리격자 상에서 완전히 건조시켰다. 이어, 염 결정(slat crystals)을 제거하기 위하여, 1 ㎕의 물을 1분 동안 첨가한 후, 여과지를 이용하여 제거하였다.

JEOL-JEM 2010 기기를 사용하여 120 kV에서 시편을 관찰하였다. 이어, 2 ㎕의 2 %(w/v) 우라닐 아세테이트를 1분 동안 첨가한 후, 과량의 용액을 여과지를 이용하여 제거하였다.

(4) 형광분석(Leakage Experiment)

정상상태 형광 스펙트라는 1 cm 경로길이 석영 규벳에서 PerkinElmer LS-55 형광 분광광도계를 이용하여 기록되었다.

파이렌(pyrene)과 로다민 B(rhodamine B)로부터의 형광을 측정하기 위하여, 시료를 각각 340 nm와 550 nm에서 여기시켰다. 5 nm의 통과대역(bandpass)를 갖는 여기-방출 슬릿이 측정을 위하여 이용되었다.

(5) Full-length RRE RNA: Plasmids construction and in vitro transcription

240-nt RRE 시퀀스(5122-5361)을 포함하는 pDM128 플라스미드는 PCR(polymerase chain reaction)에 의하여 증폭되었다. forward primer는 Sac Ⅰ site(GAGCTC)를 포함하는 CGAGAGCTCGCTATGTTCCTTGGGTT였다.

backwatd primer는 Kpn Ⅰ site(GGTACC)를 포함하는 CGTGGTACCATCCCTAGGAGCTGTTG였다. 제한효소의 분열 효율을 증가시키기 위하여 세가지 염기가 각 프라이머의 5' 말단에 첨가되었다.

236-nt RRE 시퀀스(5126-5361 from pDM128)가 61 내지 62 ℃의 열처리 온도에서 TOYOBO Taq polymerase HS mix(DTM-101)을 이용한 PCR에 의하여 pDM128로부터 분리되었다. 이는 245-bp dsDNA를 야기한다.

PCR 단편은 1.5% 아가로오스 겔에서의 전기영동에 의해 정제되었고, Sac Ⅰ과 Kpn Ⅰ으로 이중절단되었다. 254-bp 단편은 pBluescript Ⅱ KS(+)의 Sac Ⅰ-Kpn Ⅰ sites에 ligation 하였다. 형질전환된 박테리아를 50 μg/mL 암피실린(ampicillin)을 포함하는 한천평판(agar plate)에서 배양하였다.

RRE 시퀀스는 T7 프로모터 프라이머의 시퀀싱(Macrogen, Korea)에 의하여 확인하였다. 복제 플라스미드 pBlue-RRE (5-240)은 Acc65 Ⅰ 절단에 의하여 5' 돌출을 산출하는 선형화(linearized)되었다.

in vitro 전사(transcription)는 Ambion MEGAscript^TM T7 Kit(AM1333)을 이용하여 수행되었다. 전사 RNA는 6% 우레아 PAGE에 의해 정제되었고, Elutrap에 의해 회수되어 에탄올 침전되었다. 253-nt 전사 RNA 시퀀스는 다음과 같다(밑줄은 236-nt RRE RNA 시퀀스이다).

5'-GGGCGAAUUGGAGCUCGCUAUGUUCCUUGGGUUCUUGGGAGCAGCAGGAAGCACUAUGGGCGCAGUGUCAUUGACGCUGACGGUACAGGCCAGACAAUUAUUGUCUGGUAUAGUGCAACAGCAGAACAAUUUGCUGAGGGCUAUUGAGGCGCAACAACAUCUGUUGCAACUCACAGUCUGGGGCAUCAAGCAGCUCCAGGCAAGAGUCCUGGCUGUGGAAAGAUACCUAAGGGAUCAACAGCUCCUAGGGAUG-3'

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 탄소나노튜브;
   제1 표적분자와 상호작용하는 제1 자기조립 펩타이드; 및
   제2 표적분자와 상호작용하는 제2 자기조립 펩타이드를 포함하는 하이브리드 구조체로서,
   상기 제1 자기조립 펩타이드는 하기 구조식 1로 표시되고,
   상기 제2 자기조립 펩타이드는 하기 구조식 2로 표시되는 것인 하이브리드 구조체.
   [구조체 1]
   

   

   
   [구조체 2]
   

   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 제1 표적분자 및 제2 표적분자는 RNA-단백질 복합체(RNA-protein complex)를 형성하는 하이브리드 구조체.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제1 자기조립 펩타이드 및 제2 자기조립 펩타이드는 상기 RNA-단백질 복합체(RNA-protein complex)와 동시적으로 상호작용하는 하이브리드 구조체.
5. 제4항에 있어서,
   상기 제1 자기조립 펩타이드는 아르기닌 풍부 모티프(ARM, arginine rich motif)를 포함하고, 상기 제2 자기조립 펩타이드는 NES(nuclear export signal)를 포함하는 하이브리드 구조체.
6. 제4항에 있어서,
   상기 제1 자기조립 펩타이드 및 제2 자기조립 펩타이드는 자기조립(self-assembly) 도메인을 포함하는 하이브리드 구조체.
7. 제5항에 있어서,
   상기 아르기닌 풍부 모티프는 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 하이브리드 구조체.
   [서열번호 1]
   TRQARRNRRRRWRR
8. 제5항에 있어서,
   상기 NES는 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 하이브리드 구조체.
   [서열번호 2]
   CLPPLERLTR
9. 제6항에 있어서,
   상기 자기조립(self-assembly) 도메인은 하기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 하이브리드 구조체.
   [서열번호 4]
   KFEFKFEF
10. 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 하이브리드 구조체를 포함하는 항바이러스용 조성물로서,
    상기 바이러스는 인간면역결핍바이러스인 것인 조성물.

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