JP5841045B2 - 医薬品送達用のウイルス様粒子ベクター、その製造方法、使用、及び医薬組成物 - Google Patents
医薬品送達用のウイルス様粒子ベクター、その製造方法、使用、及び医薬組成物 Download PDFInfo
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Description
しかしながら、この粒子は親水性で、細胞膜の透過能力が低く、細胞膜上の受容体が少なく、きわめて急速に細胞質内でのタンパク質分解をこうむるため、この抗生物質の活性は限定される(Mir et al.,1996;Lazo,1996;Tounekti et al.,1993)。そのため、非常に大量の抗生物質が投与され、それが肺線維症という重篤な副作用を引き起こす。これまで、癌組織へのBLMの侵入を促すには電気穿孔法が使用されており、これによってブレオマイシンの抗癌効果が上昇した(Gehl et al.,1998;Orlowski et al.,1988)。ヒトの癌
治療においては、1991年からブレオマイシン電気化学療法を使用して臨床試験が始まっている(Gothelf et al.,2003)。これは主として皮膚又は皮下の腫瘍に適用されたが、頭部及び頸部の腫瘍にも適用された。ブレオマイシンは腫瘍に対し、直接に、又は静脈を通して、電気ショックと同時に投与された。こうした療法により、癌組織内に多様なレベルの壊死性変化を誘起して腫瘍の成長を止めることが可能になる。
腫瘍の位置に応じ、電気穿孔中に、さらにストレスの加わる処置である全身麻酔又は局所麻酔が使用された。
型に由来し、上記ペントン基部タンパク質は相互に結合し、タンパク質分解に対して抵抗性を有する安定した十二面体構造を形成する。
−均質性を得るために精製した十二面体の高品質試料の調製。できあがった試料は、Dd過剰発現の発生した細胞由来のタンパク質、核酸及びタンパク質分解酵素を欠く。
−ベクターの安定性条件の試験。pH、イオン強度及び温度などの要因がDdの結合性に影響することが判明した。様々な条件でのDd試料の保管、輸送及び使用のための境界条件を規定し、熱帯条件下での使用が可能であることを示唆した。
−遊離ペントン基部タンパク質からのDd再形成条件の試験。低分子量治療薬の被包の可能性に備え、試験管内で十二面体ベクターの遊離した構成要素から十二面体ベクターを得るための生物理学的条件を作成した。
−治療薬と上記十二面体ベクターとの共有結合による十二面体(Dd)と低分子量治療薬、特にブレオマイシン(BLM)などとの複合体の構築。
−組織培養物中でのDd−BLM複合体の使用と、遊離ブレオマイシンに対しての複合体のバイオアベイラビリティの顕著な向上の実証。
多数の抗生物質のコピーを担持するDd−BLM試料の生物学的(細胞傷害性)作用を、試験管内で培養されたヒトの癌細胞で試験した。当該ベクターとBLMとの間の化学的結合反応は、細胞侵入能力を低下させなかったと見られる。さらに、当該抗生物質の細胞傷害活性は保持された。すなわちDd−BLMは、遊離ブレオマイシン同様、試験管内で培養中のヒトHeLa細胞内へ侵入する際に細胞核のDNAを分解した。Ddによって送達される抗生物質の細胞傷害効果を生じる濃度は、遊離BLMで使用される濃度より約100倍低いことが証明された。試験管内培養中の60%超のヒト癌細胞(HeLa)はDd−BLM複合体の投与後に破壊され、このことはMTT細胞傷害性試験を用いて証明された(図4C)。細胞傷害効果は、十二面体、又はDd−BLM複合体に担持した量と同等用量の遊離ブレオマイシンの投与の場合には、いずれも観察されなかった。
アデノウイルス十二面体の作成方法
rDdの治療への使用が計画されているため、より精製度が高く、より均質な産物の調製が必要とされ、このニーズは、従前の手順に第2のタンパク質精製段階を追加することよって達成される。すなわち、ショ糖勾配法による1回目のrDd精製の後、低圧イオン交換クロマトグラフ法が用いられ、これによって純粋なrDd画分が産出された。
アデノウイルス十二面体の寿命及び安定性の試験
精製されたDd粒子の安定性及び溶解性を試験した。このために、精製rDdを様々な緩衝液で透析し(それぞれ3回交換)、その後、30℃又は37℃でインキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離し、上澄み中のタンパク質をアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。Ddは、NaCl 150mMの存在下で、4℃、pH4.0〜10.9において溶解状態を維持した。NaClがない場合、Ddは溶液中に残らず、遠心分離中に上澄み中から消失する。したがって、生理的濃度のNaClはDdを変性から保護する。
マイクロコン(ミリポア社)を用いた限外濾過によって濃縮されたDd試料(1試料あたり5μg)を、4℃で2時間、及び37℃で15分間又は2時間、ヒト血清(SL)中でインキュベートした。Ddは、生体内での使用を模した条件で結合性を保持した。すなわち、Ddは、新鮮なヒト血清中で、37℃で少なくとも2時間安定している(図3C)。
十二面体の構成要素(五量体基部)からの十二面体再形成
遊離五量体基部(Pb)の均質な画分は、イオン交換カラムでの精製中に得られた。精製されたrPbを、750mMのリン酸アンモニウムを含むpH6.6又はpH7.5のリン酸緩衝液50mMによって透析し、緩衝液を数回交換した。透析終了後、試料を遠心分離し、上澄み中のオリゴマー状態のタンパク質を、アガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。4℃又は37℃での4日間の透析中におけるイオン強度が高い条件下で、五量体基部からの十二面体の結合が発生する。低分子量化合物存在下での十二面体の構成要素からの試験管内再形成によって、ウイルス様粒子内に被包された治療用物質を含むベクターの入手が可能である。
ブレオマイシンのベクターとなるアデノウイルス十二面体粒子の調製方法
カルボジイミド(EDC)と琥珀酸エステル(s−NHS)(ピアース社、米国イリノイ州ロックフォード)を用いた2段階の結合手順によって、ブレオマイシンA5塩酸塩(杭州シャンユエン社、中国)をすでに精製されていたrDd粒子に化学的に結合させた。濃度27nMの十二面体を、0.31mMのEDCと5mMのs−NHSの存在下で、0.5MのNaClを含む0.1M、pH6.0のMES緩衝液中で活性化した。ブレオマイシン(23mM)との結合は、室温で2時間、静かに撹拌しながら実施された。最終濃度10mMとなるようにヒドロキシルアミンを添加することによって、反応を終了させた。使用した試薬と非結合ブレオマイシンは、24時間の透析中に、150mMのNaClと5%のグリセロールを含む20mM、pH7.5のトリス緩衝液を4回交換することにより排除された。
ブレオマイシンを伴うアデノウイルス十二面体粒子の生物学的検定法
HeLaヒト癌細胞を、本発明によって調製したDd−BLM複合体によって処理した。遊離ブレオマイシンと同様、Dd−BLM複合体は癌細胞の増殖を抑制に導いた。最も重要なのは、Ddによって送達される細胞傷害作用を生じるBLMの濃度は遊離ブレオマイシンの場合より100倍低かったことである。
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9.
Claims (13)
- 多価のウイルス様粒子ベクターであって、共有結合された低分子量治療用物質の少なくとも2コピーを伴い、アデノウイルスのペントン又はアデノウイルスのペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子を構成し、前記治療用物質が増殖抑制剤であって、糖ペプチドの、抗癌剤である、化学式IIのブレオマイシンA5
アデノウイルス十二面体が哺乳類である人のウイルスに由来し、
前記粒子は、十二面体−ブレオマイシン(Dd−BLM)複合体を含有し、
Ddと共に送達されるBLMの細胞傷害効果を生じさせる濃度が、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも50倍低いことを特徴とするウイルス様粒子ベクター。 - 低分子量治療用物質が、多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子に、カルボジイミド(EDC)を用いたホモもしくはヘテロの二官能基化合物との架橋によって多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子へ共有結合されるか、前記十二面体のアミン基又はシステイン残基へ共有結合されるか、及び、前記十二面体内のペントン基部タンパク質のN末端又はC末端において共有結合されるか、のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、請求項1に記載のウイルス様粒子ベクター。
- 前記粒子が十二面体−ブレオマイシン(Dd−BLM)複合体を含み、ペントン基部タンパク質モノマーが0〜2個のBLM粒子を担持し、60個の基部タンパク質モノマーを含む1個のDd分子が少なくとも30個のBLM残基を担持する、請求項2に記載のウイルス様粒子ベクター。
- 共有結合される低分子量治療用物質が、抗癌剤のブレオマイシンである、請求項1に記載のウイルス様粒子ベクター。
- アデノウイルス十二面体が、保管時に又は哺乳類の血清中あるいは真核生物の細胞内酵素の存在下で不安定な低分子量治療用物質を担持する、請求項1に記載のウイルス様粒子ベクター。
- 低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体との結合が、非結合形態の治療用物質に対し、前記治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものである、請求項1に記載のウイルス様粒子ベクター。
- 低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体との結合が、副作用に寄与する治療用物質を含む非結合形態の治療用物質に対し、前記治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることを特徴とする、請求項1に記載のウイルス様粒子ベクター。
- ウイルス様粒子ベクターの製造方法であって、哺乳類である人のウイルスに由来する遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子が昆虫細胞内で産生され、続いてショ糖濃度勾配中で超遠心分離し、続いてイオン交換カラムを用いて精製して、低分子量治療用物質の少なくとも2コピーが化学的架橋によって共有結合されたペントン又はペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体を含む、純粋な遺伝子組み換え十二面体粒子(rDd)画分を入手する工程を含み、
前記治療用物質は増殖抑制剤であり、
前記粒子が十二面体−ブレオマイシン(Dd−BLM)複合体を含み、
Ddと共に送達されるBLMの細胞傷害効果を生じさせる濃度が、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも50倍低いことを特徴とする、ウイルス様粒子ベクターの製造方法。 - 結合される低分子量治療用物質が、カルボジイミド(EDC)を用いてホモもしくはヘテロの二官能基化合物との化学的架橋によってベクターに結合される、請求項8に記載の方法。
- 低分子量治療用物質が、前記十二面体のアミン基又はシステイン残基、又は前記十二面体内のペントン基部タンパク質のN末端又はC末端の少なくとも一つに結合される、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のウイルス様粒子ベクターの使用であって、治療薬を組織内に送達するために、低分子量治療用物質である抗癌剤を、人を除く哺乳類の癌組織に送達するための、ウイルス様粒子ベクターの使用。
- 医薬組成物であって、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子である、ウイルス様粒子ベクターを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 前記組成物が、癌細胞の増殖を抑制するDd−BLM複合体を含有することを特徴とする、請求項12に記載の医薬組成物。
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