PL222496B1 - Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną - Google Patents

Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną

Info

Publication number
PL222496B1
PL222496B1 PL387780A PL38778009A PL222496B1 PL 222496 B1 PL222496 B1 PL 222496B1 PL 387780 A PL387780 A PL 387780A PL 38778009 A PL38778009 A PL 38778009A PL 222496 B1 PL222496 B1 PL 222496B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dodecahedron
molecule
blm
bleomycin
therapeutic substance
Prior art date
Application number
PL387780A
Other languages
English (en)
Other versions
PL387780A1 (pl
Inventor
Ewa Szołajska
Jadwiga Chroboczek
Monika Żochowska
Original Assignee
Inst Biochemii I Biofizyki Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biochemii I Biofizyki Pan filed Critical Inst Biochemii I Biofizyki Pan
Priority to PL387780A priority Critical patent/PL222496B1/pl
Priority to BRPI1016056A priority patent/BRPI1016056A2/pt
Priority to PCT/PL2010/000026 priority patent/WO2010117287A2/en
Priority to EP10726635.5A priority patent/EP2437787B1/en
Priority to JP2012504645A priority patent/JP5841045B2/ja
Priority to US13/263,632 priority patent/US8765666B2/en
Publication of PL387780A1 publication Critical patent/PL387780A1/pl
Priority to JP2015179964A priority patent/JP2016053026A/ja
Publication of PL222496B1 publication Critical patent/PL222496B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/04—Amoebicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną. Wektor ten jest przeznaczony do wprowadzania do specyficznych tkanek ssaczych czynników terapeutycznych, zwłaszcza niskocząsteczkowych leków, szczególnie niskocząsteczkowych leków antynowotworowych do tkanek rakowych. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, stanowiącej dodekahedron adenowirusowy z przyłączoną kowalencyjnie substancją terapeutyczną.

Description

(21) Numer zgłoszenia: 387780 A61K 38/16 (2006.01)
A61K 45/06 (2006.01) C07K 14/075 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 10.04.2009 A61K 47/48 (200601)
A61P 35/00 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
(54) Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną
(73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 11.10.2010 BUP 21/10 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2016 WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku: EWA SZOŁAJSKA, Warszawa, PL JADWIGA CHROBOCZEK, Warszawa, PL MONIKA ŻOCHOWSKA, Warszawa, PL
(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska-Czerwińska
PL 222 496 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna (ang. VLP, virus-like particie), sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorowa cząsteczkę wirusopodobną. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy wektorowej cząsteczki wirusopodobnej stanowiącej dodekahedron adenowirusowy z przyłączoną substancją terapeutyczną, który to wektor jest przeznaczony do wprowadzania czynników terapeutycznych do specyficznych tkanek ssaczych, a zwłaszcza niskocząsteczkowych preparatów, a szczególnie niskocząsteczkowych preparatów antynowotworowych do tkanek rakowych.
Adenowirus jest średniej wielkości bezotoczkowym wirusem DNA infekującym ludzi i zwierzęta. Dwa białka kapsydowe adenovirusa (Ad) są odpowiedzialne za wnikanie cząsteczek wirusowych do komórki na początku infekcji. Są to: białko włókna (ang. fibre protein) odpowiedzialne za przyczepienie się wirusa do powierzchni komórki gospodarza oraz białko podstawy pontonu (ang. penton base protein) biorące udział w internalizacji wirionu. Te dwa białka tworzą niekowalencyjny kompleks zwany pontonem, przedstawiony poniżej.
W wyniku nadprodukcji w systemie bakulowirusa dwóch białek pentonu dochodzi spontanicznie do powstania symetrycznych nano-cząsteczek dodekahedrycznych składających się z 12 pentonów. Równolegle można przy pomocy podobnej procedury uzyskać dodekahedryczne cząsteczki wirusopodobne składające się tylko z 12 pentamerycznych białek podstawy pentonu. Oba rodzaje dodek ahedronów (Dd) zachowują funkcjonalność swoich części składowych wykazując nadzwyczajną zdolność wnikania do komórek (Fender et al. 1997; Fender el al. 2003: Vives et al. 2004).
Dodekahedron rozpoznaje dwa rodzaje receptorów. Z jednej strony, zachowując specyficzność białka podstawy pentonu rozpoznającego integryny αν, wykazuje on powinowactwo do tego rodzaju integryn, których poziom jest podwyższony w nowotworzonych naczyniach doprowadzających krew do tkanki nowotworowej. Jednocześnie dodekahedron ma silne powinowactwo do siarczanów heparyny (Vives i wsp.. 2004), które znajdują się na powierzchni wszystkich komórek epitelialnych.
Adenowirus jest bezotoczkowym wirusem ludzkim i zwierzęcym zawierającym jedną cząsteczkę dwuniciowego DNA i 11-14 kodowanych przez wirusa białek. Kapsyd adenovirusa ma budowę ikozahedronu składającego się z 20 ścian zbudowanych z heksonów i 12 wierzchołków zbudowanych z pentonów. Penton, kompleks dwóch białek, składa się z pentamerycznej podstawy (ang. penton base protein) i trymerycznego białka włókna (ang. fibre protein), jak pokazano na fig. 1. Pentony spełniają podwójną rolę w inicjacji infekcji wirusowej. Infekcja zaczyna się od adsorpcji, podczas której infekujący wirion przyłącza się przy pomocy C-końcowej domeny globularnej białka włókna do receptora pierwszorzędowego na powierzchni komórek wrażliwych Philipson i wsp., 1968). Drugim etapem infekcji wirusowej jest penetracja wirusa. W etapie tym bierze udział białko podstawy pentonu, kiedy to penetracja wirusa następuje w wyniku interakcji motywu RGD tego białka z integrynami komórkowymi αν (Wickham et al., 1993). Białko podstawy jest również zaangażowane w uwolnienie wirusa z endosomów. Uważa się, że kwaśne środowisko endosomów powoduje zmianę strukturalną, polegającą na ujawnieniu się domen hydrofobowych białka podstawy i w konsekwencji ich interakcję z membraną endosomalną, na skutek czego dochodzi do jej pęknięcia (Wohlfart, 1988).
PL 222 496 B1
Niektóre serotypy adenowirusa wytwarzają w trakcie normalnej infekcji dodekahedryczne cząsteczki wirusopodobne złożone z 12 kopii pentonów zawierających dwa białka odpowiedzialne za wniknięcie wirusa, białko włókna i białko podstawy pentonu. Poza dawno opublikowanymi obrazami mikroskopii elektronowej (Valentine and Pereira, 1965), nie wiadomo nic o funkcji, roli lub biogenezie molekularnej tych dodekahedrycznych cząsteczek wirusopodobnych.
Bleomycyna (BLM) jest glikopeptydowym antybiotykiem, stosowanym w leczeniu różnych form nowotworów (Lazo i Sebti, 1999). Antybiotyk ten działa poprzez cięcie DNA w jądrze komórkowym, prowadząc do zahamowania podziałów komórkowych (Sausville i wsp., 1978; Carter i wsp., 1990). Bleomycyna jest wyjątkowo cytotoksyczna, gdy znajduje się w jądrze komórkowym (Poddevin i wsp., 1991). Jednakże działanie antybiotyku jest ograniczone, ponieważ ta hydrofilna cząsteczka słabo przenika przez błony komórkowe, ma tylko nieliczne receptory na tych błonach oraz szybko ulega wewnątrzcytoplazmatycznej proleolizie (Mir i wsp., 1996; Lazo, 1996; Tounekli i wsp. 1993). W związku z tym stosuje się bardzo wysokie dawki leku, wywołujące groźne skutki uboczne w postaci fibroz płucnych. Dotychczas stosowaną metodą ułatwienia wnikania BLM do tkanki nowotworowej jest elektroporacja, dzięki której antynowotworowy efekt bleomycyny może być wzmocniony (Gehl i wsp., 1998; Orłowski i wsp., 1988). Poczynając od 1991 roku przeprowadzano liczne testy kliniczne zastosowania «elektrochemioterapii» z bleomycyną w leczeniu różnych form nowotworów u ludzi (Gothelf i wsp. 2003). Dotyczyło to głównie guzów skóry lub podskórnych, ale również nowotworów głowy i szyi. Bleomycyna była podawana bezpośrednio do nowotworu lub dożylnie przy równoczesnym zastosowaniu szoku elektrycznego. Tego typu terapia pozwala na zatrzymanie wzrostu nowotworu, przy różnym stopniu zmian nekrotycznych w obrębie tkanki nowotworowej. W zależności od lokalizacji n owotworu podczas elektroporacji stosowano częściowe znieczulanie lub całkowitą anastezję, która jest dodatkowym zabiegiem obciążającym.
W opisach FR 2747681 (opubl. 1997-10-24) oraz FR 2741087 (opubl. 1997-05-16) przedstawiono białkowy kompleks - dodekahedron adenowirusowy składający się z białka podstawy pentonu i opcjonalnie zawierający białko włókna. Białkowy kompleks adenowirusowy (A) zawiera: (a) 12 pentonów (P), z których każdy zawiera co najmniej po jednej podstawie pentonu (Pb - ang. pentan base) i jednym białku włókna (F - ang. fiber), przy czym pentony są powiązane poprzez Pbazy tak, że tworzą strukturę dodekahedryczną odporną na proteolizę o masie cząsteczkowej wynoszącej 4,8-6,6 MD, lub (b) 12 Pb tworzy dodekahedron jak powyżej, jednak masa cząsteczkowa wynosi 3,2 do 4 MD. (A) nie zawiera innych składników adenowirusa, a F i Pb są z tego samego lub różnych serotypów adenowirusów (Ad).
W opisach patentowych US 6083720 (opubl. 2000-07-04). EP0861329 (opubl. 2000-07-04), WO 9718317 (opubl. 2006-02-16) zastrzeżono dodekahedron adenowirusowy, który jest białkowym kompleksem, kompozycję zawierającą ten kompleks oraz jej zastosowanie. Natywny lub rekombinowany białkowy kompleks adenowirusowy stosowany jest w leczeniu i profilaktyce chorób ludzkich i zwierzęcych. Przedstawiony w rozwiązaniu kompleks zawiera 12 pentonów, przy czym każdy zawiera co najmniej jedno białko włókna i białko podstawy pentonu bez dodatkowych elementów adenowirusa, przy czym wspomniane białko włókna pochodzi z jednego lub więcej serotypów adenowirusów, a białka podstawy pentonu są połączone między sobą i tworzą oporną na proteolizę stabilną strukturę dodekahedryczną.
W zgłoszeniu patentowym CA 2619278 (opubl. 2007-02-02) przedstawiono sposób enkapsulacji substancji terapeutycznych. Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej nanocząsteczki oraz ich zastosowania do enkapsulacji substancji terapeutycznie aktywnych poprzez nanocząsteczki o specyficznej powłoce. Cząsteczki są formowane chemicznie w taki sposób by umożliwić wysoką absorbację wewnątrzkomórkową. Enkapsulacja wymaga bezpośredniego wiązania pomiędzy nanocząsteczką, a substancją terapeutycznie aktywną. Kompozycja farmaceutyczna składa się z nanocząsteczek charakteryzujących się wysokim powinowactwem względem zdegenerowanych komórek oraz zawiera co najmniej jedną substancję terapeutyczną wybraną z grupy zawierającej m.in. bleomycynę.
Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych polepszonym sposobom dostarczania czynników terapeutycznych do organizmu istnieje ciągła potrzeba nowych skutecznych rozwiązań terapeutycznych, które można uzyskać z wykorzystaniem dodekahedronu adenowirusowego.
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie warunków pozwalających na użycie dodekahedrycznej wektorowej cząsteczki wirusopodobnej do celów terapeutycznych, jak również przygotowanie koniugatu tego wektora z małą cząsteczką terapeutyczną dla użycia w terapii ludzkiej. Dodekahedron jest potencjalnie wektorem specyficznym dla komórek nowotworowych. Wektor ten posiada aktywność endosomolityczną adenowirusów dzięki czemu przenika łatwo do cytozolu komórkowego. Dodatkowo Dd wykazuje wysokie powinowactwo do integryn αν. Integryny te rozpoznają motyw RGD (arginina4
PL 222 496 B1 glicyna-kwas asparaginowy). Dodekahedron adenowirusowy posiadający 60 motywów RGD jest zapewne najbardziej specyficznym ligandem integryn αν. Ponieważ wiadomo, że poziom integryn αν jest podwyższony w endotelium guzów złośliwych. Zgłaszający ocenił, że Dd może wybiórczo dostarczać czynniki terapeutyczne do wnętrza komórek endotelialnych, z których są zbudowane nowopowstające naczynia krwionośne nowotworów. Dlatego też Zgłaszający postanowił wykorzystać te cząsteczki wirusopodobne do przenoszenia niskocząsteczkowych czynników terapeutycznych, oczekując, że zastosowanie ukierunkowanego na to terapeutycznego koniugatu z Dd pozwoli na zwiększenie biodostępności i ograniczenie efektów ubocznych działania leków niskocząsteczkowych. zwłaszcza czynników antyproliferacyjnych, zwłaszcza glikopeptydów, w tym antybiotyków antynowotworowych takich jak bleomycyna.
Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z opracowaniem wynalazku umożliwiającego przenoszenie niskocząsteczkowych czynników terapeutycznych, przy zwiększeniu biodostępności i ograniczeniu efektów ubocznych działania leków niskocząsteczkowych, zostało osiągnięte w niniejszym wynalazku.
W swoich pracach Zgłaszający uzyskali dodekahedrony zrekombinowane (rDd) i wykazali, że dodekahedrony wnikają do komórek wydajniej niż adenowirus serotypu 3 (Ad3) z którego pochodzą. Transdukują one 100% komórek w hodowli komórkowej, przy czym są w stanie transdukować również komórki niepermisywne dla Ad3. Następuje to w wyniku wyłonienia się nowej funkcji Dd, a mianowicie interakcji z powszechnie występującymi składnikami błon biologicznych jakimi są proteoglikany siarczanu heparyny (HS), które nie są rozpoznawane przez adenowirusa typu 3, z którego pochodzi Dd (Vives i wsp., 2004). HS oddziaływuje z pozytywnie naładowanymi fragmentami białkowymi i wydaje się że tego typu fragmenty wyłaniają się w Dd z powodu zbliżenia białek podstawy pentonu. Tak więc penetracja dodekahedronu następuje nie tylko za pośrednictwem receptorów wirusa, ale również przy pomocy bardzo rozpowszechnionych siarczanów heparyny.
Rekombinowaną cząsteczkę dodekahedryczną rDd, otrzymuje się z wysoką wydajnością w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa. Wydajność nadprodukcji jest porównywalna z tą, którą otrzymuje się w najwydajniejszych układach bakteryjnych i wynosi 10 mg rDd ze 100 ml hodowli k omórkowej. Dotychczas rDd oczyszczano jedynie przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy. Etap ten umożliwia wyeliminowanie białek komórkowych, ale nie kwasów nukleinowych, najprawdopodobniej przyłączonych do powierzchni VLP.
Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna, charakteryzująca się tym, że stanowi koniugat zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego składającego się z pentonów adenowirusa lub białek podstawy pentonu adenowirusa, z przyłączoną kowalencyjnie niskocząsteczkową substancją terapeutyczną, przy czym substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie preparat antynowotworowy, przy czym dodekahedron adenowirusowy pochodzi z wirusa ssaka, i że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie z rodziny bleomycyn, przedstawiony wzorem I,
PL 222 496 B1 i, że niskocząsteczkowa substancja terapeutyczna jest przyłączona do zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego metodą cross-linku, do grup aminowych lub do reszt cysteinowych dodekahedronu lub też na N-końcu lub C-końcu białka podstawy pentonu w dodekahedronie.
Korzystnie, gdy czynnik antyproliferacyjny stanowi bleomycyna A5, przedstawiona wzorem II,
Korzystnie, gdy czynnik antyproliferacyjny stanowi glikopeptyd, korzystnie z rodziny bleomycyn.
Korzystnie, gdy niskocząsteczkowa substancja terapeutyczna jest przyłączona do zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego metodą cross-linku z zastosowaniem karbodiimidu (EDC).
Korzystnie, gdy w koniugacie dodekahedronu z bleomycyną (Dd-BLM) monomer białka podstawy pentonu przenosi między 0 a 2 cząsteczki BLM ze znaczącą przewagą monomerów zawierających jedną cząsteczkę BLM.
Korzystnie, gdy jedna cząsteczka Dd zawierająca 60 monomerów białka podstawy przenosi co najmniej 30 reszt BLM.
Korzystnie, gdy przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną stanowią leki labilne, wybrane z grupy obejmującej leki antynowotworowe, korzystnie bleomycyna, leki przeciwko chorobom neurodegeneracyjnym, korzystnie 3,4-dihydroksyfenylo-1-alanina (L-DOPA), leki przeciwko gruźlicy i pasożytom wewnątrzkomórkowym, korzystnie izoniazyd, leki przeciwko astmie, korzystnie salbutamol, dożylne leki usypiające, korzystnie tiopental, leki zwalczające organizmy chorobotwórcze, korzystnie leki zwalczające toksoplazmozę, amebiozy, leiszmaniozy, trypanozomozy i riketsjozy.
Korzystnie, gdy w koniugacie dodekahedronu adenowirusa z niskocząsteczkową substancją terapeutyczną, substancja terapeutyczna jest w stanie wolnym niestabilna przy przechowywaniu, w surowicy ssaczej czy też w obecności wewnątrzkomórkowych enzymów eukariotycznych.
Korzystnie, gdy koniugat dodekahedronu adenowirusa z niskocząsteczkową substancją terapeutyczną zapewnia zwiększoną biodostępność substancji terapeutycznych, zwłaszcza substancji terapeutycznych zwalczających organizmy chorobotwórcze.
Korzystnie, gdy koniugat dodekahedronu adenowirusa z niskocząsteczkową substancją terapeutyczną zapewnia zwiększoną biodostępność substancji terapeutycznych, zwłaszcza substancji terapeutycznych wykazujących groźne działanie uboczne.
Korzystnie, gdy efektywne cytotoksycznie stężenie BLM dostarczane z Dd jest co najmniej 50 razy niższe niż w przypadku wolnej bleomycyny.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, charakteryzujący się tym, że zrekombinowana cząsteczka dodekahedronu adenowirusa pochodzi z wirusa ssaczego, i że produkuje się ją w komórkach owadzich, po czym oczyszcza z zast osowaniem kolumny jonowymiennej, uzyskując frakcję czystych rDd, a następnie do tak wytworzonej
PL 222 496 B1 cząsteczki zrekombinowanego dodekahedronu adenowirusa składającego się z pentonów lub białek podstawy pentonu przyłącza się kowalencyjnie metodą cross-linku chemicznego niskocząsteczkową substancję terapeutyczną, przy czym substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie z rodziny bleomycyn, przedstawiony wzorem I
O
i że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się metodą cross-linku chemicznego, przy czym niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się do grup aminowych lub do reszt cysteinowych dodekahedronu, lub leż na N-końcu lub C-końcu białka podstawy pentonu w dodekahedronie.
Korzystnie, gdy czynnik antyproliferacyjny stanowi bleomycyna A5, przedstawiona wzorem II,
PL 222 496 B1
Korzystnie, gdy przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie glikopeptyd, z rodziny bleomycyn.
Korzystnie, gdy przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się metodą cross-linku chemicznego z zastosowaniem karbodiimidu (EDC).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera koniugat zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirus owego określonej powyżej.
Korzystnie, gdy koniugat Dd-BLM hamuje namnażanie się komórek rakowych.
Korzystnie, gdy efektywne cytotoksycznie stężenie BLM dostarczane z Dd co najmniej 50 razy niższe niż w przypadku wolnej bleomycyny.
Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie i stoty wynalazku, gdzie:
Figura 1 przedstawia schemat adenowirusa, pentonu i dwóch dodekahedronów (Dd).
Figura 2 przedstawia stabilność Dd analizowaną przy pomocy techniki rozproszenia światła (DLS). Stabilność termiczna Dd w zależności od pH i siły jonowej. Dd w 150 mM NaCl badano metodą DLS przy różnych pH, przy temperaturze wzrastającej o 2°C co 2 min w zakresie od 12 do 65°C. (B) Analiza elektroforetyczna Dd i pentametrycznych baz (Pb) w buforze CAPS pH 9 w buforze węglanowym pH 10. Niektóre próby zostały poddane zmianom temperatury imitującym warunki DLS (oznaczone DLS). (C) Analiza DLS przeprowadzona na próbkach Dd znajdujących się w PBS, w warunkach różnej siły jonowej. Podane są średnie wartości otrzymane z 3 odczytów aparatu.
Figura 3 przedstawia stabilność Dd podczas liofilizacji, w komórkach HeLa oraz w surowicy ludzkiej. (A) Oczyszczone Dd były dializowane przez noc w temperaturze 4°C do wody lub 150 mM roztworu siarczanu amonu w wodzie. Do prób oznaczonych „krioprotektant +” dodawano mannitol (0,4%) i sacharozę (0,4%). Próbki Dd z amrażano w -80°C lub suszono przy pomocy speed-vacu, lub liofilizowano. Wysuszone próby zawieszano w wyjściowej objętości wody. Próby wirowano przez 30 min przy 13000 rpm, a stan białek w supernatancie analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. (B) Stabilność Dd w hodowli komórek Hela. Próbki oczys zczonego Dd (2 pg/100 pl) zostały nałożone na porcje 2x104 komórek. Po określonych czasach penetracji otrzymano lizaty komórkowe, które rozdzielano w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (lewy panel) albo w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących (dwa pr awe panele). W obu przypadkach prowadzono analizę metodą Western b lot, stosując przeciwciała anty-Dd. Kontrolne próby Dd zawierały 30 ng białka, a próba pentametrycznych baz (Pb) - 10 ng białka. (C) Stabilność Dd w surowicy ludzkiej. Próbki Dd (porcje 5 pg) zatężone przez ultrafiltrację w Microcon (Millipore), zostały poddane inkubacji w surowicy ludzkiej (SL) przy temperaturze 4°C przez 2 godz. (ścieżka 4) lub przy 37°C przez 15 min albo 2 godz. (odpowiednio ścieżki 5 i 6). Próby rozdzielano w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących a następnie analizowano metodą Western blot z użyciem przeciwciała rozpoznającego Dd. Górna część przedstawia w ybarwiony kumasyną żel z białkami pozostałymi po transferze, a dolna - wywołany Western blot. Ścieżki 1 i 7 odpowiadają próbkom Dd bez surowicy, odpowiednio nie traktowanym oraz inkubowanym przez 2 godz. przy 37°C. Ścieżki 2 i 3 odpowiadają surowicy ludzkiej inkubowanej przez godz., odpowiednio przy 4 i 37°C.
Figura 4 przedstawia cytotoksyczność bleomycyny dostarczonej przez Dd. Bleomycyna z ostała przyłączona chemicznie do Dd (lak jak opisano w przykładzie IV). (A) Charakterystyka koniugatu Dd-BLM przy użyciu spektrometrii masowej. (B) Analiza koniugatu Dd-BLM metodą dynamicznego rozproszenia światła. (C) Test cytotoksyczności MTT. Komórki HeLa traktowano: wolną BLM (0,13 pM). Dd (1 pg) i Dd-BLM (1 pg dostarczający 0,08 pM BLM), tak jak opisano w przykładzie IV.
Figura 5 przedstawia efekt działania preparatu Dd-BLM na komórki HeLa. (A) Komórki traktowane przez określony czas Dd lub Dd-BLM (próba 1 pg) analizowano w mikroskopie konfokalnym stosując przeciwciało rozpoznające Dd (czerwony sygnał, na czarno-białych zdjęciach widoczny jako biały/szary). Jądra komórkowe wybarwiono roztworem DAPl. Najniższy rząd prze dstawia komórki po 50 godz. traktowania, bez w ybarwionych jąder. Podziałka odpowiada 20 pm (B). Komórki traktowane Dd, wolną bleomycyną lub Dd-BLM po określonym czasie analizowano w mikroskopie konfokalnym stosując przeciwciała; an ty-y-H2AX (czerwony sygnał w jadrach k omórkowych, widoczny jako szary na czarno-białych zdjęciach) oraz anty-tubulina (zielony sygnał w cytoplazmie, na czarno-białych zdjęciach biały/szary). Podziałka odpowiada 10 pm.
PL 222 496 B1
Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.
Zgłaszający podjęli prace własne dotyczące dodekahedronu adenowirusa. Prace te dot yczyły nadprodukcji, oczyszczania i charakterystyki dodekahedronów, jak również ich zastosowania dla wewnątrzkomórkowego dostarczenia niskocząsteczkowych leków poprzez koniugację chemiczną z wektorem. Prace te obejmowały:
- Otrzymanie wysokiej jakości preparatów oczyszczonych do homogenności dodekah edronów. Otrzymane preparaty są pozbawione białek, kwasów nukleinowych, oraz prot eaz pochodzących z komórek, w których odbywa się nadprodukcja Dd.
- Zbadanie warunków stabilności wektora. Wykazano, że takie czynniki jak p H, siła jonowa i temperatura wpływają na integralność Dd. Opracowano graniczne warunki pozw alające na przechowywanie, przesyłanie oraz użycie preparatów Dd w różnych waru nkach klimatycznych , również tropikalnych.
- Skonstruowanie koniugatu dodekahedronu (Dd) z niskocząsteczkowym terapeutykiem, zwłaszcza takim jak bleomycyna (BLM). przez kowalencyjne przyłączenie terapeutyku do wektora dodekahedrycznego.
- Zastosowanie koniugatu Dd-BLM w hodowlach tkankowych i wykazanie wielokrotnego podwyższenia biodostępności koniugatu w stosunku do wolnej bleomycyny.
Okazało się, że opracowana według wynalazku wektorowa cząsteczka wirusopodobna p ozwala na uzyskanie lepszego przenikania hydrofilnych antyproliferacyjnych czynników terap eutycznych. zwłaszcza glikopeptydów, takich jak antybiotyki antynowotworowe, a zwłaszcza takie jak bleomycyna, przez błony komórkowe. Okazało się także, że użycie Dd do dostarczania czy nników terapeutycznych oznacza najpewniej jednocześnie specyficzne ukierunkowanie tych czynników do nowopowstających naczyń krwionośnych odżywiających guzy nowotworowe. Wiadomo, że motyw RGD oddziałuje z αν integrynami, których poziom jest podwyższony wyłącznie w k omórkach endotelialnych, będących składnikami nowopowstających naczyń doprowadzających krew do tkanki nowotworowej (Chen. 2006). Motyw ten znajduj e się w białku podstawy pentonu, z którego jest zbudowany Dd, tak więc Dd zawierający 60 motywów RGD, jest bardzo specyficznym ligandem dla αν integryn, a jednocześnie posiada wysoką zdolność penetracji komórek dzięki swojej aktywności endosomolitycznej oraz powinowactwu do siarczanów heparynowych.
P r z y k ł a d y
Wykorzystanie Dd jako wektora dla dostarczenia niskocząst eczkowego czynnika terapeutycznego, antybiotyku bleomycyny (BLM)
Zbadano efekt biologiczny (cytotoksyczny) preparatu Dd-BLM na ludzkich komórkach nowotworowych w hodowli in vitro. Okazało się, że reakcja chemicznego cross-linku wektora z BLM nie obniżyła jego zdolności do penetracji komórek. Zachowana została również cy totoksyczna aktywność antybiotyku. Mianowicie, Dd-BLM wnikając do ludzkich komórek HeLa w hodowli in vitro degraduje DNA jądrowe, podobnie jak wolna bleomycyna. Wykazano, że skuteczne cytotoksyc znie stężenie antybiotyku dostarczanego z Dd jest ok. 100-krotnie niższe od stosowanego w przypadku wolnej BLM. Ponad 60% ludzkich komórek nowotworowych (HeLa) w hodowli in vitro zostało zabitych po podaniu koniugatu Dd-BLM, co wykazano stosując test cytotoksyczności MTT (fig. 3C). Efekt cytotoksyczny nie był obserwowany ani w przypadku podania dodekahedronu ani wolnej bleomycyny, w dawkach równoważnych do tych niesionych przez koniuga t Dd-BLM.
Dd-BLM wydajnie przenika przez błonę komórkową, używając receptorów zarówno rozp oznawanych przez Dd jak i przez BLM. W cytoplazmie ludzkich komórek H wektor najprawdopodobniej ulega stopniowej proteolizie, w wyniku której uwalniane są peptydy z przyłączoną bleomycyną, które to peptydy-BLM wnikają do jądra; będącego miejscem działania antybiotyku, w tym przypadku bleomycyny.
Wiadomo, że cytotoksyczne działanie BLM jest spowodowane powstawaniem uszkodzeń w DNA. Jedną z modyfikacji chiromatyny w odpowiedzi na dwuniciowe pęknięcia DNA, jest fosforylacja C-końcowego rejonu histonu H2AX w komórkach wyższych eukariontów. Jako sondy do wykrywania uszkodzeń DNA użyto specyficznego przeciwciała, rozpoznającego ufos forylowaną fomę histonu H2AX. Dd-BLM wnikając do ludzkich komórek nowotworowych w hodowli in vitro powoduje uszkodzenia w jądrowym DNA, podobnie jak wolna bleomycyna. W sposobie według wynalazku Dd jako białko rekombinowane (rDd) jest uzyskiwany z nadzwyczaj dużą wydajnością w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa. Produkcja wynosi 10 mg rDd ze 100 ml zawiesiny komórek. Jest to wydajność nadprodukcji porównywalna z tą, którą otrzymuje się w najba rPL 222 496 B1 dziej wydajnych układach bakteryjnych (Song et al. 2008). Dotychczas rDd oczyszczano jedynie przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy. Etap ten umożliwia wyeliminowanie nisko - i średniocząsteczkowych białek komórkowych, ale nie kwasów nukleinowych, najprawdopodobniej przyłączonych do powierzchni rDd. Planowane zastosowanie terapeutyczne rDd wymagało przygot owania lepiej oczyszczonego i bardziej homogennego preparatu, co osiągnięto stosując 2-etapowy proces oczyszczania białka. Po wstępnym oczyszczen iu rDd w gradiencie sacharozy zastosowano chromatografię jonowymienną. Otrzymano frakcję czystych rDd (powyżej 95% cz ystości), co stwierdzono analizując preparaty metodami elektroforezy na żelach poliakrylamidowych oraz przy pomocy mikroskopii elektronowej.
Przeprowadzone badania biochemiczne oraz biofizyczne (mikroskopia elektronowa, elektroforeza na żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących i na żelach poliakrylamidowych w warunkach denaturujących, pomiary z zastosowaniem metody dynamicznego rozpraszania światła (DLS)) wykazały, że rDd jest trwały do 40°C w szerokim zakresie pH, a do około 50°C w pH 7-8, przy fizjologicznym stężeniu NaCl (150 mM). Odkryto, że warunki wysokiej siły jonowej znacząco stabilizują jego strukturę, gdyż w tedy rDd nie ulega denaturacji aż do temperatury 60°C (fig. 2). Cząsteczka wektora zachowuje integralność podczas dializ y, po zamrożeniu i rozmrożeniu, przy suszeniu w speed-vacu oraz w czasie liofilizacji w obecności krioprolektanta (fig. 3A). Wysoka stabilność wektora ułatwia zarówno pracę z rDd, jak i jego przechowywanie. Ponadto stwierdzono, że rDd utrzymuje integralność w warunkach imitujących jego zastosowanie in vivo, a mianowicie jest stabilny w surowicy ludzkiej w temperaturze 37°C przez co najmniej 2 godziny (fig. 3B). Wyniki te pozwalają na zastosowanie rDd jako wektora przy różnorodnych aplikacjac h w różnych warunkach klimatycznych.
Opisane powyżej właściwości D d, zdaniem zgłaszającego, implikują możliwość wykorzyst ania tej nanocząsteczki, jako wektora dostarczając ego czynniki terapeutyczne do tkanek ludzkich. Pierwszy przykład dotyczy antybiotyku przeciwnowotworowego, jakim jest bleomycyna.
Zgłaszający stwierdził, że przez użycie Dd nastąpiło zwiększenie biodostępności antybiot yku, co pozwoli na stosowanie obniżonych dawek i w konsekwencji ograniczenie efektów u bocznych jego działania. Po etapie badań prowadzonyc h w hodowli tkankowej będą prowadzone b adania na modelu rakowym myszy. Jeżeli preparat Dd-BLM zastosowany w układzie modelowym takim jak myszy z wszczepionym ludzkim guzem mózgu okaże się co najmniej równie skuteczny jak stosowane dotychczas dostarczenie BLM przez elektrochemioterapię, pozwoli to na zaprop onowanie wykorzystania koniugatu Dd-BLM w ludzkiej terapii antynowotworowej. Tak więc, w ter apii antynowotworowej użycie bleomycyny mogłoby być ograniczone do podania preparatu Dd BLM, bez konieczności stosowania szoku elektrycznego związanego z różnymi niedogodności ami, często wymagającego pełnej anestezji.
P r z y k ł a d I
Sposób wytwarzania dodekahedronu adenowirusowego
Planowane zastosowanie terapeutyczne rDd wymagało przygotowania oczyszczonego i homogennego preparatu, co osiągnięto dodając drugi etap oczyszczania białka do wcześniej znanego protokołu; po wstępnym oczyszczeniu rDd w gradienci e sacharozy zastosowano niskociśnieniową chromatografię jonowymienną dzięki czemu otrzymano frakcję czystych rDd.
Dla uzyskania ekspresji Dd użyto zrekombinowanego bakulowirusa zawierającego gen białka podstawy pentonu adenowirusa ludzkiego serotypu 3 (Ad3) (Fender i wsp., 1997). Amplifikacja zrekombinowanego bakulowirusa niosącego gen białka podstawy została wykonana w jednowa rstwowej hodowli komórek Spodopleru frugiperda (Sf21). Komórki hodowano w medium TC100 zawierającym 5% embrionalną surowicę cielęcą (FES) (Invitrogen). Zrekombinowany Dd nadprodukowano w komórkach Trichoplusia ni (zwanych również High Five. HF), hodowanych w zawiesinie w medium Express Five SFM (lnvitrogen) w obecności gentamycyny (50 mg/l) i amfoterycyny B (0,25 mg/l). Komórki Trichoplusia ni infekowano zrekombinowanym bakulowirusem przy MOI (z ang. multiplicity of infection) równym 4 jednostkom zakaźnym na jedną komórkę. Po 48 godz. od momentu infekcji komórki zostały zebrane i lizowane przez trzykrotne zamrażanie i rozmraż anie. Supernatant otrzymany po sklarowaniu lizatu wirowano w gradiencie 15-40% sacharozy (Fender i wsp., 1997). Preparat VLPs, odzyskiwany w 30-40% sacharozie, był zanieczyszczony komórkowymi białkami i kwasami nukleinowymi. Końcowe oczyszczenie Dd zostało osiągnięte przez chromatografię na kolumnie jonowymiennej, w wyniku czego dodekahedrony otrzymywano jako homogenną frakcję. Stan oligomeryczny cząsteczek oraz stopień czystości otrzymanego
PL 222 496 B1 preparatu analizowano w natywnych żelach agarozowych, przy zastosowaniu mikroskopii elektronowej i w denaturujących żelach poliakrylamidowych.
P r z y k ł a d II
Badania trwałości i stabilności dod ekahedronu adenowirusowego
Przetestowano stabilność i rozpuszczalność oczyszczonych cząsteczek Dd. W tym celu oczyszczone rDd były dializowane do różnych buforów (z 3 zmianami każdego) i następnie ink ubowane w 30 albo 37°C. Po inkubacji próby wirowano, a stan białek w supe rnatancie analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Dd pozostaje w formie rozpuszczalnej w 4 °C przy pH od 4.0 do 10,9. w obecności 150 mM NaCl. W nieobecności NaCl Dd nie utrzymuje się w ro ztworze, znikając z supernatantu podczas wirowania. Tak więc NaCl w stężeniu fizjologicznym chroni Dd przed denaturacją.
W celu zbadania odporności Dd na denaturację cieplną użyto techniki dynamicznego rozproszenia światła (DLS), która pozwala na monitorowanie denaturacji lub rozpadu białka. Próbki białka (0,2 mg/ml) były dializowane do odpowiednich buforów i przefiltrowane przez sączki o porach wielkości 0,45 pm w celu usunięcia ewentualnych pyłów. Próbki umieszczano w kuwecie (45 pl, Greiner, Frickenhausen, Niemcy) i przy pomocy aparatu ZS Natio Zetasizer (MaKeni, Worcestershire. GB) prowadzono zautomatyzowane pomiary wielkości cząsteczek. Temperatura rosła o 2°C co 2 min w zakresie od 12 do 65°C. Dane zostały ocenione z zastosowaniem metody kumulacyjnej.
W zakresie pH 4-9 wielkość cząsteczki dodekahedrycznej była stała do 40 °C (fig. 2A). Powyżej tej temperatury wielkość cząsteczki zwiększała się wykładniczo wraz z ze wzrostem temperatury, co wskazuje na denaturację. Denaturacja /agregacja Dd rozpoczyna się w pH 4-5 przy temperaturze niższej o około 10°C niż w pH 7-8. W pH 9 (bufor CAPS) i 10 (bufor węglanowy) następują niewielkie zmiany wielkości cząsteczek. Analiza białek w natywnych żelach agarozowych wykazała, że przy pH 10 Dd dysocjuje do wolnych pentamerycznych baz, a w pH 9 (bufor CAPS) białko znika, najprawdopodobniej w wyniku agregacji (fig. 2B). Należy zauważyć, że CAPS jest organicznym buforem, który oddziałując z powierzchniowymi fragmentami hydrofobowymi, może wywołać agregację. Dodanie 750 mM NaCl do PBS powoduje podwyższenie temperatury topnienia Tm Dd, co wskazuje na stabilizację struktury (fig. 2C). Ale najbardziej znaczący wzrost wartości Tm został spowodowany przez dodanie siarczanu amonu, wywołując pozytywne przes unięcie o około 12°C (fig. 2C).
Przeprowadzone badania wykazały, że cząsteczka wektora/Dd zachowuje integralność podczas dializy, zamrażania i rozmrażania oraz suszenia w speed-vacu w obecności 150 mM siarczanu amonu. Dla zachowania struktury Dd podczas liofilizacji niezbędna jest obecność kri oprotektanta (fig. 3A). Trwałość wektora w kulturze komórkowej została przetestowana w komórkach HeLa, w różnych okresach po podaniu Dd. Oczyszczony Dd (4 pg/100 pl, 10,8 nM) został podany komórkom HeLa znajdującym się na płytkach 24-dołkowych (2x104 komórek/dołek), w medium bez FBS. Komórki inkubowano w inkubatorze przy 37 °C. Trzy godziny po podaniu Dd, do medium dodano FBS do 10% stężenia końcowego. Komórki zbierano we wskazanych okr esach (Fig. 33) i lizowano w buforze hypotonicznym. Próbki odpowiadające połowie komórek analizowano w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE), a drugą połowę w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących, po czym w obu przypadkach prowadzono analizę metodą Western blot, stosując przeciwciała anty-Dd.
Ilość wewnątrzkomórkowego Dd wzrastała do 32 godz. po transdukcji równolegle zachodziła częściowa proteoliza Dd, w wyniku której po 4 dniach w komórkach pozostała tylko część białka bazy (fig. 3B, lewy panel). Analiza w natywnym żelu agarozowym wykazała, że 96 godz. po pen etracji większość wewnątrzkomórkowego wektora migrowała pomiędzy Dd i pentamerycznymi b azami (Pb), sugerując że zaszło usunięcie zewnętrznych pętli Dd, przy zachowaniu integralności cząsteczki (fig. 3B, prawy panel).
Stabilność Dd podczas inkubacji w ludzkiej surowicy
Próbki Dd (porcje 5 pg) zatężone przez ultrafiltrację w Microcon (Millipore), zostały poddane inkubacji w ludzkiej surowicy (SL) przy temperaturze 4 °C przez 2 godz. i przy 37°C przez 15 min albo 2 godz. Dd zachowuje integralność w warunkach imitujących potencjalne zastosowanie in vivo, a mianowicie jest stabilny w świeżo przygotowanej surowicy ludzkiej w 37°C przez co najmniej dwie godziny (fig. 3C).
PL 222 496 B1
Przedstawione wyniki wskazują na to, że Dd może być dogodnie magazynowany i trans portowany oraz może zostać użyty w celach terapeutycznych w różnorodnych warunkach klim atycznych.
P r z y k ł a d III
Sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego z bleomycyną
Chlorowodorek Bleomycyny A5 (Hangzhou Xiangyuan Co., Ltd., China) przyłączano chemicznie do uprzednio oczyszczonych cząsteczek rDd w trakcie dwustopniowej proc edury koniugacji z zastosowaniem karbodiimidu (EDC) i estru kwasu bursztynowego (s-NHS) (Pierce, Rockford IL, USA). Dodekahedrony w stężeniu 27 nM aktywowano w buforze 0,1 M MES pH 6,0, zawierającym 0,5 M NaCI, w obecności 0,31 mM EDC i 5 mM s-NHS. Koniugację z bleomycyną (23 mM) prowadzono przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, z łagodnym mieszaniem. Reakcję zakończono przez dodanie hydroksyloaminy w stężeniu końcowym 10 mM. Uż yte odczynniki chemiczne oraz niezwiązana bleomycyną były eliminowane w trakcie 24-godzinnej dializy, z czterema zmianami 20 mM buforu Tris, pH 7,5, zawierającego 150 mM NaCI i 5% glicerol.
Ilość bleomycyny przyłączonej do Dd ustalono za pomocą techniki spektrometrii masowe j. Analiza została wykonana przy użyciu spektrometru masowego Perseptive Biosystems (Frami ngham, MA), z zastosowaniem pulsacyjnego lasera azotowego o długości fali 337 nm. Próbki z ostały skoncentrowane na ZipTipC4 (Millipore) i wyekstrahowane, nasyconym roztworem kwasu sinapinic, przygotowanego w 80% mieszaninie wodnego acetonitrylu (obj./obj.) zawierającej 0,3% kwas trifluorooctowy, jak opisano w instrukcji producenta. Mieszanina eluacyjna została przeni esiona na płytę stalową i suszona powietrzem. Kalibracja aparatu została wykonana z użyciem albuminy wołowej (Biosystems) o masie cząsteczkowej 66431 Da.
W koniugacie Dd-BLM, monomer białka podstawy pentonu (z którego składa się Dd) niesie między 0 a dwiema cząsteczkami BLM (masa molekularna BLM wynosi 1400), ze znaczącą przewagą monomerów zawierających jedną cząsteczkę BLM (fig. 4A). Te dane wskazują, że jedna cząsteczka Dd (która zawiera 60 monomerów białka podstawy) niesie przeciętnie 60 reszt BLM. Badania z użyciem metody dynamicznego rozproszenia światła DLS wykazały, że temperatura topnienia koniugatu Dd-BLM jest bardzo zbliżona do T m dla wyjściowego dodekahedronu, co sugeruje, że reakcja cross-linku nie zmieniła biofizycznych właściwości wektora.
P r z y k ł a d IV
Badania biologiczne cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego z bleomycyną
Ludzkie komórki rakowe HeLa były traktowane koniugatem Dd-BLM otrzymanym według wynalazku. Podobnie jak wolna bleomycyna, koniugat Dd-BLM spowodował zahamowanie narastania komórek rakowych. Co najważniejsze, efekt ywne cytotoksycznie stężenie BLM dostarczane z Dd było 100 razy niższe niż w przypadku wolnej bleomycyny.
Cytotoksyczne działanie Dd-BLM oceniono ilościowo in vitro z zastosowaniem testu MTT (MTT, 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl) 2,5-bromek difenyltetrazoliny). W teście tym wykorzystuje się zdolność żywych komórek do redukcji rozpuszczalnej żółtej soli tetrazolinowej (MT T) do niebieskich kryształów formazanu. Komórki HeLa hodowane na 96-dołkowych płytkach (104 komórek/dołek) inkubowano przez 3 godz. w 37 °C w 100 pl medium EMEM zawierającego a) różne ilości Dd (1 pg odpowiada 2,7 nM), b) Dd-BLM (1 pg odpowiada 2,7 nM Dd i 0,08 pM BLM) albo c) wolnej bleomycyny (odpowiednio 0,13, 1 i 8 pM). Po 3 godzinach dodano FBS do końcowego stężenia 10%. Po różnych okresach inkubacji w 37°C usunięto medium inkubacyjne i do każdej studzienki dodano 100 pl EMEM zawierającego 0,5 mg/m l MTT (Sigma). Pliki zostały poddane inkubacji zgodnie z instrukcjami producenta, pomiary gęstości optycznej wykonywano przy użyciu czynnika HTi (Biotek, VT Winooski, USA). Liczba żywych komórek została obliczona zgodnie z przepisem (Mosmann, 1983).
Ponad 60% ludzkich komórek w hodowli in vitro ulega zabiciu po podaniu Dd-BLM. Efekt cytotoksyczny nie był obserwowany w przypadku podania wolnej bleomycyny w dawce odpowiadającej ilości antybiotyku zawartego w użytym preparacie. Preparaty Dd-BLM zawierające około 0,08 pM BLM wykazały silne działanie cytotoksyczne, podczas gdy podana w tej samej ilości BLM w wolnej formie nie wywierała żadnego efektu cytostatycznego (fig. 3). Porównywalna śmiertelność komórek obserwowano dopiero po podaniu 8 pM roztworu wolnej BLM (wyniki nie pokazane).
Następny etap obejmował badanie mikroskopowe ludzkich komórek nowotworowych po ddanych działaniu Dd-BLM. W celu przygotowania preparatów do mikroskopu konfokalnego ko12
PL 222 496 B1 mórki HeLa (5 x 104) wysiewano na specjalne szkiełka (ang. coverslips). Następnego dnia na komórki nakładano odpowiednie ilości samego Dd, koniugatu Dd-BLM lub wolnej bleomycyny, wszystkie próby znajdujące się w medium EMEM bez surowicy. Po 3 godz. inkubacji dodano FBS do 10% stężenia końcowego. Po zakończeniu inkubacji komórki przemywano zimnym PBS, a następnie utrwalano i permeabilizowano przez 10 min w 100% zimnym alkoholu metylowym. Jak przygotowane preparaty inkubowano przez 1 godzinę z przeciwciałami (Ab): poliklonalnym Ab rozpoznającym Dd, monoklonalnym Ab rozpoznającym turbulinę (Sigma, St Louis MO, USA) i poliklonalnym Ab anty-y-H2AX (Calbiochem, Darmstadt, Germany). Po przemyciu komórek przy pomocy PBS aplikowano przeciwciała Il-rzędowe sprzężone z barwnikami; cze rwonym - Texas Red (Jackson, ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA, USA) i zielonym - FITC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA). W celu wyznakowania jąder komórkowych używano roztworu DAPI (Applichem).
Ponieważ nie ma dostępnego przeciwciała rozpoznającego bleomycyny, które się nadaw ałoby do wykorzystania w mikroskopii konfokaln ej, do wykrywania obecności koniugatu Dd-BLM użyto Ab anty-Dd. Stwierdzono, że Dd jak również preparat Dd z przyłączoną kowalencyjnie BLM wnikają do 100% komórek w hodowli in vitro , o czym świadczy czerwony sygnał pochodzący od przeciwciała anty-Dd w cytoplazmie komórek obserwowanych po upływie 1 godziny od podania preparatów (fig. 5A, 1 godz., Dd i Dd-BLM). W 50 godzin po podaniu wolnego Dd, ilość wektora (widocznego jedynie w cytoplazmie) znacząco zmalała w porównaniu z krótszymi czasami inkubacji (czerwony sygnał, fig. 4A), co wskazuje na proteolizę i eliminację wektora z komórek. Koni ugat Dd-BLM indukuje pojawienie się powiększonych komórek, co jest widoczne w 30 godz. po podaniu koniugatu, a jest wyraźniej zaznaczone w późniejszym czasie. W 50 godz. po aplikacji Dd-BLM sygnał pochodzący od Dd jest obecny w całej komórce, co wskazuje na znisz czenie integralności błony jądrowej, jeden z objawów śmierci komórkowej.
Wiadomo, że cytotoksyczne działanie BLM jest spowodowane powstawaniem uszkodzeń w DNA (Mir wsp., 1996). Jedną z modyfikacji chromatyny w komórkach wyższych eukariotów w odpowiedzi na dwuniciowe pęknięcia DNA, jest fosforylacja C-końcowego rejonu histonu H2AX (Kinner i wsp., 2008). Jako sondy do wykrywania uszkodzeń DNA, użyliśmy specyficznego prz eciwciała, rozpoznającego ufosforylowaną formę histonu (anty-y-H2AX; Calbiochem, Darmstadt, Germany). W kontrolnych komórkach HeLa, oraz w komórkach traktowanych samym dodekahedronem nie wykazano uszkodzeń DNA, o czym świadczy brak czerwonego sygnału pochodzącego od przeciwciała anty-y-H2AX (fig. 5B, rzędy HeLa i Dd). W odróżnieniu od tego, koniugat Dd-BLM wnikając do komórek powoduje uszkodzenia w jądrowym DNA, o czym świadczy obecność sygnału pochodzącego od specyficznego przeciwciała. Podobny efekt ma podanie wolnej bleomycyny (fig. 5B, rząd BLM). Efekt działania koniugatu zawierającego 0,08 pM BLM jest silniejszy niż uszkodzenia wywołane przez wolną B L.M w stężeniu 8 pM, a więc 100-krotnie wyższym (fig. 5B, rzędy Dd-BLM i BLM).
PL 222 496 B1
Literatura
Carter B.J., de Vroom E., Long H.C., van der Marel G.A., van Boom J.H., Hecht S.M. (1990) Sitespecific cleavage of RNA by Fe(II) bleomycin. Proc NatI Acad Sci USA. 87: 9373-7.
Chen X. Multimodality imaging of tumor integrin alphavbeta3 expression. Mini Rev Med Chem. 2006 Feb; 6(2): 227-34.
Fender P., Ruigrok R.W., Gout E., Buffet S., Chroboczek J. (1997) Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat. 15 (1), 52-56.
Fender P., Schoehn G., Foucaud-Gamen J., Gout E., Garcel A., Drouet B., Chroboczek J. (2003) Adenovirus dodecahedron allows large multimeric protein transduction in human cells. J. Virol. 77 (8): 4960-4964.
Gehl J., Sorensen T.H., Nielsen K. (1999) In vivo electroportion of sceletal muscle: treshold, efficacy and relation to electric field distribution. Biochim. Biophys Acta 1428: 233-240.
Gothelf A., Mir M. and Gehl J. (2003) Electrochemotherapy: results of cancer treatment using enhanced delivery of bleomycin by electroporation. Canser Treatment Reviews 29: 371-387.
Kinner A, Wu W. Staudt C. lliakis G (2008) Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res 36: 5678-5694.
Lazo J.S. (1996) Bleomycin. In Chabner B.A. (ed.). Cancer Chemotherapy and Biotherapy. Lippincott-Raven Publishers. p379-393.
Lazo J.S., Sebti S.M. (1997) Bleomycin. Cancer Chemother Biol. Response Modif. 17:40-5.
Mir L.M., Tounekti O., Orłowski S. (1996) Bleomycin: revival of an old drug. Gen. Phannacol. 27: 745-748.
Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65: 55-63.
Orlowski S., Beiehradek Jr J., Paoletti C. (1988) Triansient electropermablisation of cells in culture. Increase of the cytotoxicity of anticancer drugs. Biochem Pharmacol. 37: 4727-4733.
Philipson L., Lonberg-Holm K., and Pettersson U. (1968) Virus-receptor interaction in an adenovirus system. J Virol. 2: 1064-75.
Poddevin B., Orlowski S., Belehradek Jr J. (1991) Very high cytotoxicity of bleomycin introduced into the cytosol of cells in culture. Biochem. Pharmacol. 42 (suppl): 67-75.
Vives R.R., Lortat-Jacob H., Chroboczek J., Fender P. (2004) Heparan sulfate proteoglycan mediates the selective attachment and internalization of serotype 3 human adenovirus dodecahedron. Virology 321: 332-40.
Sausville E.A., Stein R.W., Peisach J.. Horwitz S.B. (1978) Properties and products of the degradation of DNA by bleomycin and iron(Il). Biochemistry 17: 2746-54.
Song L, Nakaar V, Kavita U. Price A, Huleatt J, et al. (2008) Efficacious recombinant influenza vaccines produced by high yield bacterial expression: a solution to global pandemic and seasonal needs. PLoS ONE 3: e2257.
Tounekti O., Pron G., Beiehradek Ir. J. (1993) Bleomycin, an apoptosis-mimetic drug that induces two types of cell deathdepending on the number of molecules internalized. Cancer Res, 53; 5462-5469.
Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. (1993) Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovinis internalization but not virus attachment. Cell 73 (2): 309-319.
Wohlfart C. (1988) J. Virol. 62. 2321-232.
Valentine, R. C. & Pereira, H. G, (1965). Antigens and structure of the adenovirus., J. molec. Biol. 13.13.
PL 222 496 B1

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, znamienna tym, że stanowi koniugat zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego składającego się z pentonów adenowirusa lub białek podstawy pentonu adenowirusa, z przyłączoną kowalencyjnie niskocząsteczkową substancją terapeutyczną, przy czym substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie preparat antynowotworowy, przy czym dodekahedron adenowirusowy pochodzi z wirusa ssaka, i że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie z rodziny bleomycyn, przedstawiony wzorem I.
    i, że niskocząsteczkowa substancja terapeutyczna jest przyłączona do zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego metodą cross-linku, do grup aminowych lub do reszt cysteinowych dodekahedronu lub też na N-końcu lub C-końcu białka podstawy pentonu w dodekahedronie.
  2. 2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik antyproliferacyjny stanowi bleom ycyna A5, przedstawiona wzorem II,
    PL 222 496 B1
  3. 3. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik antyproliferacyjny stanowi glikopeptyd, korzystnie z rodziny bleomycyn.
  4. 4. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że niskocząsteczkowa substancja terapeutyczna jest przyłączona do zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego metodą cross-linku z zastosowaniem karbodiimidu (EDC).
  5. 5. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że w koniugacie dodekahedronu z bleomycyną (Dd-BLM) monomer białka podstawy pentonu przenosi między 0 a 2 cząsteczki BLM ze znaczącą przewagą monomerów zawierających jedną cząsteczkę BLM.
  6. 6. Cząsteczka według zastrz. 5, znamienna tym, że jedna cząsteczka Dd zawierająca 60 monomerów białka podstawy przenosi co najmniej 30 reszt BLM.
  7. 7. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że w koniugacie dodekahedronu adenowirusa z niskocząsteczkową substancją terapeutyczną, substancja terapeutyczna jest w stanie wolnym niestabilna przy przechowywaniu, w surowicy ssaczej czy też w obecności wewnątrzkomórkowych enzymów eukariotycznych.
  8. 8. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że koniugat dodekahedronu adenowirusa z niskocząsteczkową substancją terapeutyczną zapewnia zwiększoną biodostępność substancji terapeutycznych, zwłaszcza substancji terapeutycznych zwalczających organizmy chorobotwórcze.
  9. 9. Cząsteczka według zastrz. 1, znamiennna tym, że efektywne cytotoksycznie stężenie BLM dostarczane z Dd jest co najmniej 50 razy niższe niż w przypadku wolnej bleomycyny.
  10. 10. Sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, znamienny tym, że zrekombinowana cząsteczka dodekahedronu adenowirusa pochodzi z wirusa ssaczego, i że produkuje się ją w komórkach owadzich, po czym oczyszcza z zastosowaniem kolumny jonowymiennej, uzyskując frakcję czystych rDd, a następnie do tak wytworzonej cząsteczki zrekombinowanego dodekahedronu adenowirusa składającego się z pentonów lub białek podstawy pentonu przyłącza się kowalencyjnie metodą cross-linku chemicznego niskocząsteczkową substancję terapeutyczną, przy czym substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie z rodziny bleomycyn, przedstawiony wzorem I, i, że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się metodą cross-linku chemicznego, przy czym niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się do grup aminowych lub do reszt cysteinowych dodekahedronu, lub też na N-końcu lub C-końcu białka podstawy pentonu w dodekahedronie.
    PL 222 496 B1
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że czynnik antyproliferacyjny stanowi bleom ycyna A5, przedstawiona wzorem II.
  12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną stanowi czynnik antyproliferacyjny, korzystnie glikopeptyd, z rodziny bleomycyn.
  13. 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że przyłączoną niskocząsteczkową substancję terapeutyczną przyłącza się metodą cross-linku chemicznego z zastosowaniem karbodiimidu (EDC).
  14. 14. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera koniugat zrekombinowanej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego określonej zastrzeżeniami 1 do 9.
  15. 15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że koniugat Dd-BLM hamuje namnażanie się komórek rakowych.
  16. 16. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że efektywne cytotoksycznie stężenie BLM dostarczane z Dd co najmniej 50 razy niższe niż w przypadku wolnej bleomycyny.
PL387780A 2009-04-10 2009-04-10 Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną PL222496B1 (pl)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL387780A PL222496B1 (pl) 2009-04-10 2009-04-10 Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną
BRPI1016056A BRPI1016056A2 (pt) 2009-04-10 2010-04-09 vetor de partícula similar á virus para distribuição de agentes farmacêuticos, um processo para a produção deste, seus usos e uma composição farmacêutica
PCT/PL2010/000026 WO2010117287A2 (en) 2009-04-10 2010-04-09 A virus-like particle vector for delivery of pharmaceutical agents, a process for the manufacture thereof, its uses and a pharmaceutical composition.
EP10726635.5A EP2437787B1 (en) 2009-04-10 2010-04-09 A virus-like particle vector for delivery of pharmaceutical agents, a process for the manufacture thereof, its uses and a pharmaceutical composition.
JP2012504645A JP5841045B2 (ja) 2009-04-10 2010-04-09 医薬品送達用のウイルス様粒子ベクター、その製造方法、使用、及び医薬組成物
US13/263,632 US8765666B2 (en) 2009-04-10 2010-04-09 Adenovirus dodecahedron particles for delivery of pharmaceutical agents
JP2015179964A JP2016053026A (ja) 2009-04-10 2015-09-11 医薬品送達用のウイルス様粒子ベクター、その製造方法、使用、及び医薬組成物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL387780A PL222496B1 (pl) 2009-04-10 2009-04-10 Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL387780A1 PL387780A1 (pl) 2010-10-11
PL222496B1 true PL222496B1 (pl) 2016-08-31

Family

ID=42752950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL387780A PL222496B1 (pl) 2009-04-10 2009-04-10 Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8765666B2 (pl)
EP (1) EP2437787B1 (pl)
JP (2) JP5841045B2 (pl)
BR (1) BRPI1016056A2 (pl)
PL (1) PL222496B1 (pl)
WO (1) WO2010117287A2 (pl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014212722A (ja) * 2013-04-24 2014-11-17 学校法人加計学園 八面体構造を有するｂ型肝炎ウイルス様粒子結晶
WO2017106822A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 The Penn State Research Foundation Paramyxovirus virus-like particles as protein delivery vehicles
CN109415739A (zh) * 2016-03-31 2019-03-01 欧洲分子生物学实验室 腺病毒外壳蛋白衍生递送载体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083720A (en) * 1995-11-13 2000-07-04 Chroboczek; Jadwiga Dodecahedral adenoviral protein complex, composition containing same and uses thereof
FR2747681B1 (fr) * 1996-04-18 1998-06-19 Commissariat Energie Atomique Complexe proteique dodecaedrique adenoviral, composition le contenant et ses applications
FR2741087B1 (fr) * 1995-11-13 1998-01-09 Commissariat Energie Atomique Complexe proteique dodecaedrique adenoviral, procede de preparation, composition le contenant et ses applications
PL375598A1 (pl) * 2002-07-18 2005-12-12 Cytos Biotechnology Ag Koniugaty haten-nośnik i ich zastosowania
RU2325202C2 (ru) * 2002-07-19 2008-05-27 Цитос Байотекнолоджи Аг Конъюгаты грелин-носитель
JP4746877B2 (ja) * 2002-11-01 2011-08-10 ジェノミディア株式会社 不活性化されたセンダイウイルスエンベロープを有効成分とする抗癌剤
WO2005094878A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Genomidea Inc. 抗腫瘍作用を有する組成物
WO2007016864A1 (fr) * 2005-08-08 2007-02-15 Xun Hu Utilisation de fructus schisandrae et d'extraits de cette substance dans le but de prevenir et d'attenuer les effets toxiques et secondaires de medicaments anti-neoplasiques
DE102005039579B4 (de) 2005-08-19 2022-06-30 Magforce Ag Verfahren zur Einschleusung von therapeutischen Substanzen in Zellen
CA2623287A1 (en) * 2005-09-28 2007-04-12 Cytos Biotechnology Ag Interleukin-1 conjugates and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010117287A2 (en) 2010-10-14
US8765666B2 (en) 2014-07-01
JP5841045B2 (ja) 2016-01-06
US20120141425A1 (en) 2012-06-07
JP2012523411A (ja) 2012-10-04
EP2437787A2 (en) 2012-04-11
BRPI1016056A2 (pt) 2016-05-10
WO2010117287A3 (en) 2011-06-30
PL387780A1 (pl) 2010-10-11
JP2016053026A (ja) 2016-04-14
EP2437787B1 (en) 2019-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10688194B2 (en) Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
McCarthy et al. Development and characterization of self-assembling nanoparticles using a bio-inspired amphipathic peptide for gene delivery
Bolhassani Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer
Zeng et al. Self-assembled ternary complexes of plasmid DNA, low molecular weight polyethylenimine and targeting peptide for nonviral gene delivery into neurons
WO2021155733A1 (zh) 多肽、其制备方法和用途
Zochowska et al. Adenovirus dodecahedron, as a drug delivery vector
JP2010537632A (ja) 組織及び細胞への核酸、タンパク質、薬物、及びアデノウイルスの送達を向上させるための細胞透過性ペプチドの製造及び使用方法、組成物並びにキット
CN105793428B (zh) 噬菌体
Serna et al. Rational engineering of single-chain polypeptides into protein-only, BBB-targeted nanoparticles
Ma et al. Enhanced Peptide delivery into cells by using the synergistic effects of a cell-penetrating Peptide and a chemical drug to alter cell permeability
WO2020140600A1 (zh) 跨屏障靶向病灶的递药系统、载体系统及宿主细胞系统
Khairkhah et al. Application of cell penetrating peptides as a promising drug carrier to combat viral infections
Liu et al. Overcoming the cellular barriers and beyond: Recent progress on cell penetrating peptide modified nanomedicine in combating physiological and pathological barriers
Yamada et al. Development of a nanoparticle that releases nucleic acids in response to a mitochondrial environment
Yang et al. Polyethylenimine coating to produce serum-resistant baculoviral vectors for in vivo gene delivery
Mukalel et al. Excipients for the lyoprotection of MAPKAP kinase 2 inhibitory peptide nano-polyplexes
PL222496B1 (pl) Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną
JP2012523411A5 (pl)
KR20190034171A (ko) 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물
PL222497B1 (pl) Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej
Hejtmánková et al. Cell-penetrating peptides in the intracellular delivery of viral nanoparticles
KR20150143639A (ko) 폴리플렉스
KR20020063567A (ko) 분자 물질의 모듈 운반 시스템 및 그의 제조 방법 및 용도
Okada Targeted siRNA therapy using cytoplasm-responsive nanocarriers and cell-penetrating peptides
US20140369987A1 (en) Dermaseptin b2 used as an inhibitor of the growth of a tumor