DE69634489T2

DE69634489T2 - Adenovirus dodekahedrischer proteinkomplex, dieser enthaltende zusammensetzung und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69634489T2
Application number: DE69634489T
Authority: DE
Inventors: Jadwiga Chroboczek; Pascal Fender
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: DE69634489D1; EP0861329B1; EP0861329A1; US6083720A; JP2000500020A; WO1997018317A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen nativen oder rekombinanten adenoviralen Proteinkomplex, eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den genannten Proteinkomplex sowie dessen Anwendungen für die Behandlung (Medikamente) und Vorbeugung (Vakzine) menschlicher und tierischer Krankheiten. Die genannten Proteinkomplexe sind nämlich geeignet, dass an geeignete Zielzellen Nukleinsäuresequenzen, Proteinen, Peptide oder chemische Substanzen von Interesse verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen Expressionsvektoren für diese Proteinkomplexe.
Adenoviren bilden eine Familie tierischer DNA-Viren, die eingeteilt werden in mehr als 90 Serotypen, die verschiedene Spezies infizieren, und fast 50 verschiedene humane Serotypen umfassen. Der zelluläre Tropismus der Adenoviren hat die Infektion der Respirationswege, des Magen-Darm-Traktes, der Harnwege und der Augen zur Folge.
Diese Viren sind für 3% aller Infektionen beim Menschen, für 10% der kindlichen Pneumonien und für 15% der Magen-Darm-Infektionen bei Kindern verantwortlich.
Das Adenoviruspartikel ist relativ komplex und umfasst mehrere Unterstrukturen; insbesondere der äußere Teil oder das Capsid ist hauptsächlich aus drei Proteinen gebildet: das Hexon, die Pentonbasis und die Faser (siehe 1).
Das Penton, ein nicht kovalenter Komplex, der aus einem trimeren Protein gebildet ist, die Faser und ein pentameres Protein, die Pentonbasis, bilden die Spitzen- bzw. die Scheitelpunkte des viralen Ikosaeders.
Jedes der beiden Proteine, die das Penton bilden, spielen eine grundlegende Rolle bei der Infektion: die Faser erlaubt die Bindung des Virions an einen zellulären Rezeptor; die Pentonbasis erlaubt die Internalisierung des Virions, möglicherweise mit Hilfe der Wechselwirkungen mit zellulären Integrinen (Bindung der Integrine, Rezeptoren der Vitronectine und der Fibronectine, über die Vermittlung durch die Sequenz Arg-Gly-Asp, die auf dem Niveau der Pentonbasis präsentiert wird)(Wickham et al., Cell, 1993, 73, 309–319). Es gibt auch andere Beobachtungen, die vermuten lassen, dass die Pentonbasis eine endosomolytische Aktivität besitzt, die das Entweichen der mit dem Virus internalisierten Moleküle in das Zytoplasma erlauben (Seth et al., Virus Attachment and Entry into Cells, 1986, Ed. R. L. Crowell & K. Lonberg-Holm, 191–195).
Die Bindung der Adenoviren an die Zellen und ihre Aufnahme sind folglich zwei verschiedene Ereignisse, die aber zusammenwirken.
Die Fähigkeit, verschiedene ruhende Zellen zu infizieren, macht das Adenovirus zu einem Vektor der Wahl für die Gentherapie.
Die gegenwärtig angewandten Verfahren basieren auf die wiederholte Verabreichung von rekombinanten Adenoviren, die sich nicht replizieren können, und die das Zielgen tragen (internationale PCT-Patentanmeldungen WO 95/02697 und WO 95/14101, im Namen der Rhone-Poulenc Rorer SA).
Gleichwohl weisen die ausgelobten Behandlungen mit den besagten defizienten Adenoviren mindestens die folgenden Nachteile auf, die ihre Verwendung als Vektor bei der Gentherapie des Menschen hemmen:

– das Risiko der Wiederherstellung der Pathogenizität in trans des rekombinanten Virus beim behandelten Subjet und gleichzeitige Infektion durch ein Wildtyp-Adenovirus;
– Immunreaktionen und entzündliche Reaktionen infolge der wiederholten Verabreichung des rekombinanten Adenovirus, aufgrund der massiven Einführung der viralen Partikel, die fremde Proteine tragen.

Um die genannten Nachteile zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, lediglich das Penton oder die Pentonbasis, unabhängig vom Rest des Genoms des Adenovirus zu verwenden, um den Transfer exogener Gene in die Wirtszellen zu erleichtern (internationale PCT-Patentanmeldung WO 94/17832, im Namen des The Scripps Research Institute). Obwohl dieser präsentierte Ansatz Vorteile bezüglich der rekombinanten Adenoviren hatte, die defizient in ihrer Replikation waren, sind die besagten Strukturen (Penton oder Pentonbasis) empfindlich, insbesondere die Pentonbasis, die durch Proteolyse zerstört werden kann.
Folglich hat sich der Anmelder die Aufgabe gestellt, einen Vektor bereitzustellen, der in der Gentherapie verwendbar ist und den praktischen Bedürfnissen besser entspricht als die bisherigen Vektoren des Standes der Technik; wobei der besagte Vektor weder die Nachteile der rekombinanten Adenoviren aufweist, noch die Empfindlichkeit des Pentons oder der Pentonbasis besitzt, wie dies weiter oben ausgeführt wurde.
Die vorliegende Erfindung hat einen adenoviralen Proteinkomplex zum Gegenstand, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er gebildet ist aus:

– entweder von 12 Pentonen, die jeweils mindestens eine Pentonfaser und eine Pentonbasis aufweisen, unter Ausschluss jedes anderen wesentlichen Bestandteils des Genoms eines Adenovirus', wobei die Fasern und die Basis des Pentons entweder von demselben oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen, wobei die Pentone über die Pentonbasen verbunden sind und eine gegenüber proteolytischen Enzymen beständige Dodekaeder-Struktur bilden, wobei der genannte Komplex ein Molekulargewicht zwischen 4,8 × 10⁶ und 6,6 × 10⁶ aufweist; wobei die besagten Komplexe im Folgenden Faser-Dodekaeder-Komplex oder Penton-Dodekaeder-Komplex benannt werden;
– oder von 12 Pentonbasen unter Ausschluss jedes anderen wesentlichen Bestandteils des Genoms eines Adenovirus', wobei die Pentonbasen entweder von demselben Adenovirus oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen und eine gegenüber proteolytischen Enzymen beständiger Dodekaeder-Struktur bilden, und dass er ein Molekulargewicht zwischen 3,2 × 10⁶ und 4 × 10⁶ aufweist; wobei die besagten Komplexe im Folgenden Basis-Dodekaeder-Komplexe genannt werden

Die besagten Komplexe enthalten folglich keine Elemente des Genoms der besagten Adenoviren. Die genannten nativen oder rekombinanten dodekaedrischen Proteinkomplexe erleichtern den Transfer von fremden Genen, Nukleinsequenzen, Proteinen, Peptiden oder chemischen Verbindungen in die Zielzellen.
Gemäß der Erfindung sind die besagten Adenoviren ausgewählt aus den menschlichen Adenoviren und insbesondere dem Adenovirus Typ 2 (Ad2), Adenovirus Typ 3 (Ad3), Adenovirus Typ 5 (Ad5), Adenovirus Typ 4 (Ad4), Adenovirus Typ 7 (Ad7), Adenovirus Typ 9 (Ad9), Adenovirus Typ 11 (Ad11), Adenovirus Typ 15 (Ad15) oder den Enteroadenoviren (Ad40 und Ad41) und den aviären Adenoviren.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der besagten rekombinanten dodekaedrischen Proteinkomplexe kann wenigstens einer seiner Bestandteile (Basis und/oder Faser) verändert sein, um die Affinität gegenüber einem besonderen Zelltyp zu erhöhen.
Ein solcher Proteinkomplex, der auf diese Weise verändert wurde, stellt aber keine Verschlechterung in seinen Eigenschaften der Bindung an die Zielzelle und der Aufnahme in diese Zelle dar, zum einen Teil im Vergleich zum Wildtyp-Adenovirus und zum anderen Teil im Vergleich zum erfindungsgemäßen Komplex, in welchem die besagten Bestandteile nicht modifiziert wurden.
Beispielsweise kann eine Bindungssequenz an andere Rezeptoren, wie der CD4-Rezeptor, der auf den T-Zellen vorhanden ist, in die Faser mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie eingeführt werden (Verbindung Ligand-Faser).
Als Beispiele für geeignete Liganden kann man die Schleife V3 des gp120 von HIV (Bindung an CD4), das Transferrin (Bindung an den Transferrin-Rezeptor), LDL (Bindung an die LDL-Rezeptoren), deglykolisierte Proteine und Antikörper anführen.
Ein bevorzugter dodekaedrischer Proteinkomplex gemäß der Erfindung besteht aus 12 Pentonbasen, entsprechend von solchen Adenoviren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ad3, Ad4, Ad7, Ad9, Ad11 und Ad15 oder aus 12 Pentonen deren Fasersequenzen irgendeinem der zuvor erwähnten menschlichen, enteralen oder aviären Adenoviren entsprechen und deren Sequenzen der Pentonbasen einem Adenovirus entsprechen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ad3, Ad4, Ad7, Ad9, Ad11 und Ad15, wobei die des Adenovirus vom Typ 3 (Ad3) bevorzugt wird.
Ein anderer erfindungsgemäßer dodekaedrischer Proteinkomplex besteht aus 12 Pentonen, deren Faser-Sequenzen dem Adenovirus vom Typ 2 (Ad2) oder dem Adenovirus vom Typ 5 (AD5) entspricht, und deren Pentonbasen-Sequenzen dem Adenovirus vom Typ 3 (Ad3) entspricht.
Die Verwendung des adenoviralen Proteinkomplexes gemäß der Erfindung anstelle des Adenovirus-Virions hat die Gefahr der zufälligen Infektion mit Adenoviren eliminiert und ist begleitet von sehr viel schwächeren Immunreaktionen und entzündlichen Reaktionen; er ist weiterhin insbesondere stabil und die Anwesenheit von 12 Pentonbasen hat die Geschwindigkeit der Lyse der Endosomen bedeutend verändert (die zytoplasmatische Passage ist viel schneller), im Vergleich zu einer Struktur, die keine Pentone oder Pentonbasen enthält.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des rekombinanten adenoviralen Proteinkomplexes weist dieser außerdem mindestens ein Hexon oder ein anderes virales Protein auf.
Die vorliegende Erfindung hat gleichermaßen eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie im Wesentlichen einen adenoviralen Proteinkomplex gemäß der Erfindung und mindestens eine weitere chemische Substanz enthält.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der besagten Zusammensetzung ist die weitere chemische Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsequenzen, Proteinen, Peptiden und pharmakologisch aktiven chemischen Substanzen.
Dann, wenn die chemische Substanz ein Protein ist, weist dieses immunoprotektive und antigene Eigenschaften auf, und ist insbesondere gut geeignet zur Herstellung eines Vakzins.
Dann, wenn die chemische Substanz eine pharmakologisch aktive chemische Substanz ist, ist diese insbesondere ausgewählt aus Zelltoxinen, Antikrebsmitteln und Anthrazyklinen.
Im letzteren Fall weist die Zusammensetzung gemäß der Erfindung den Vorteil auf, den Mechanismus der Resistenzbildung, die gewöhnlich bei Antikrebsmitteln auftritt, zu vermeiden. Im Ergebnis stellt die Entwicklung einer Resistenz gegen eine Antitumor-Chemotherapie ein großes Hindernis bei der Behandlung von Krebs beim Menschen dar. Diese Resistenz basiert zum großen Teil auf der Induktion der Aktivität einer sehr effektiven extrazellulären Pumpe, die nicht erlaubt, dass die aktive pharmakologische Substanz in das Innere der Zelle transportiert wird. Erstaunlicherweise erlaubt die Zusammensetzung gemäß der Erfindung die Einführung pharmakologisch aktiver Substanzen in die Zelle, wobei der Resistenzmechanismus umgangen wird.
Dann, wenn die chemische Substanz eine Nukleinsequenz ist, ist sie ausgewählt aus Genen, die für ein Polypeptid mit therapeutischer Aktivität codieren, Antisense-Sequenzen und Ribozymen.
Im Fall einer codierenden Sequenz umfasst diese weiterhin einen aktiven Promotor für die Expression des Polypeptids.
Nach einer vorteilhaften Abwandlung dieser Ausführungsform ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus konstitutiven Promotoren und induzierbaren Promotoren.
Die besagte aktive chemische Substanz kann mindestens auf zwei verschiedene Arten an den erfindungsgemäßen adenoviralen Proteinkomplex gebunden sein:

– entweder durch Vermittlung einer vorrübergehenden Verbindung, wie eine ionische oder hydrophobe Bindung, die aufgehoben werden kann und daher die Passage der aktiven Substanz in den Kern erlaubt (Expression eines Gens auf dem Niveau des Kerns)(wobei der Ligand ausgewählt ist aus solchen Substanzen, die eine ionische oder hydrophobe Bindung mit der genannten aktiven Substanz eingehen kann);
– oder durch Vermittlung einer stabilen Verbindung, solche wie eine kovalente Verbindung, beispielsweise eine solche die die aktive Substanz im Zytoplasma zurückhält; ein solcher Verbindungstyp ist insbesondere interessant für die Herstellung von Vakzin-Zusammensetzungen (Verbleiben der aktiven Substanz im Zytoplasma)(wobei der Ligand ausgewählt ist aus Substanzen, die eine kovalente Verbindung mit der genannten aktiven Substanz eingehen können).

Im Ergebnis kann die besagte chemische Substanz, insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, ein Protein oder ein Peptid, an einen geeigneten Liganden (in kovalenter oder nicht-kovalenter Weise) gebunden sein.
Unter den geeigneten Liganden kann man Peptide erwähnen, deren N-terminaler Teil die N-terminale Aminosäuresequenz einer Adenovirus-Faser irgendeines Serotyps enthält (Bindungszone für den Proteinkomplex gemäß der Erfindung) und deren C-terminaler Teil folgende Sequenzen umfasst:

– ein Polylysin (eine Sequenz, die die Bindung der aktiven Substanz erlaubt, insbesondere, wenn es sich um Nukleinsäuren handelt)
– ein Polyarginin
– ein Teil oder die vollständige Sequenz eines Kernproteins (Core-Proteins) irgendeines Adenovirus' (Protein VII, Protein μ des menschlichen Adenovirus' oder homologe Proteine von Adenoviren anderer Tierenspezies),
– ein Cystein, oder
– einen Transferrin/Poly-L-Lysin-Komplex, der an die besagte Nukleinsequenz oder das besagte Protein gebunden ist, um ein Konjugat zu bilden.

Solche Peptide, die bifunktionale Peptide genannt werden, sind über ihren N-terminalen Teil an den erfindungsgemäßen adenoviralen Proteinkomplexes und über ihren C-terminalen Teil an eine zu transferierende Plasmid-DNA gebunden.
Beispielsweise erlaubt das Peptid, enthaltend ein Polylysin an seinem C-terminalen Ende für eine ionische Bindung, oder das Peptid enthaltend ein Cystein an seinem C-terminalen Ende für eine Bindung vom kovalenten Typ, und die Assoziation einer konjugierten Nukleinsäure oder eines Proteins und Transferrin/Poly-L-Lysin, wobei sich das Transferrin auf der Oberfläche der Zielzellen an die Transferrin-Rezeptoren bindet, mit dem erfindungsgemäßen Proteinkomplex, einen besseren Transport der chemischen Substanz aus den Endosomen in das Zytoplasma.
Eine andere Art des Transfers der Nukleinsequenzen oder der Proteine ist möglich, wobei eine Komplexbildungsreaktion Avidin-Biotin bzw. anti-Faser-, anti-Pentonbasis- oder anti-dodekaedrischer Proteinkomplex-Antikörper verwendet wird. Eine solche Zusammensetzung macht Gebrauch von: einem dodekaedrischen Proteinkomplex gemäß der Erfindung, einem Antiköper, der entweder mit der Faser oder mit der Pentonbasis oder mit dem dodekaedrischen Proteinkomplex reagiert, der aber nicht die Funktion des besagten Proteinkomplexes hemmt, einem Vektor enthaltend eine Nukleinsequenz von Interesse, in welchem wenigstens ein Nukleotid biotinyliert ist, ggf. gebunden an eine Markersequenz oder ein biotinyliertes Protein und einem chimären Protein bestehend aus Protein A bebunden an Streptavidin (SA-PA). Weil ein Nukleotid oder das Protein biotinyliert ist, können sie an das chimäre Protein SA-PA binden. In einer solchen Zusammensetzung bindet die biotinylierte DNA oder das biotinylierte Protein an das chimäre Protein SA-PA; der DNA-Komplex, der an das SA-PA gebunden ist, bindet dann über den PA-Anteil an einen Antikörper, der entweder mit einer Faser oder mit einer Pentonbasis oder mit dem dodekaedrischen Proteinkomplex reagiert. Der so gebildete Endkomplex umfasst PA-Antikörper, die an den dodekaedrischen Proteinkomplex immobilisiert sind, und bindet über Vermittlung des Proteinkomplexes an spezifische Rezeptoren der letzteren, die auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert werden.
In allen Fällen dringt die exogene Nukleinsäuresequenz, das Protein von Interesse oder jede andere chemische Substanz, die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten ist, oder an der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gebunden ist, in die Zelle (Internalisierung) über Vermittlung des erfindungsgemäßen dodekaedrischen Proteinkomplexes ein.
Überraschenderweise erhöht sich die Wechselwirkung Dodekaeder-zellulärer Rezeptor in bedeutender Weise und zugleich die Internalisierung der Zusammensetzung gemäß der Erfindung und die Permeabilität der Endosomen, die wiederum in bedeutender Weise die Passage der exogenen Nukleinsäuren, des Proteins von Interesse oder jede andere chemische Substanz von den Endosomen in das Zytoplasma erhöht, im Vergleich mit der Verwendung einer Zusammensetzung, die nicht ein einziges Penton enthält.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der genannten pharmazeutischen Zusammensetzung enthält diese weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel.
Unter den pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln lassen sich insbesondere die Vehikel nennen, die für die untersuchten Administrationswege angepasst sind, solche wie Wasser, Salze, Dextrose, Glyzerin, Ethanol, pflanzliche Öle, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Benzylalkohol (parenterale Verabreichung oder flüssige Zubereitungen), Liposomen oder andere Polymere (beispielsweise kationische Polymere).
Solche Zusammensetzungen können weiterhin Benetzungsmittel oder Emulgatoren, isotonische Agenzien, Lösungsmittel, Stabilisatoren, Färbemittel, antiseptische Mittel usw. enthalten.
Gemäß der Erfindung ist die genannte aktive chemische Substanz entweder in den erfindungsgemäßen dodekaedrischen Proteinkomplexen eingeschlossen oder mit diesen Komplexen assoziiert; in beiden Fällen kann sie frei sein oder an die genannten Komplexe gebunden sein.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in verschiedenen Formen und über verschiedene Wege verabreicht werden, solche wie Verabreichung über die Lunge (Aerosol), intraperitoneale Verabreichung, parenterale Verabreichung oder Verabreichung über ein chirurgisches Implantat.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung haben eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten als Medikamente in der Humanmedizin und in der Tiermedizin:

– Gentherapie beim Menschen und beim Tier, insbesondere bei solchen Erbkrankheiten, die das Epithel der Atmungsorgane betreffen wie Ephysem oder Mukoviszidose,
– als antivirale Agenzien (Antisens-Sequenzen oder Ribozyme),
– als immunogene Substanzen oder Vakzine,
– als antibakterielle Substanzen, Antitumor-Substanzen usw..

Die vorliegende Erfindung hat im gleicher Weise eine Zusammensetzung zum Gegenstand, die im Wesentlichen einen adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplex, so wie er oben definiert wurde, und eine chemische Substanz enthält, ausgewählt aus Nukleinsequenzen, Proteinen und pharmakologisch aktiven chemischen Substanzen, als Medikament oder als Vakzine.
Die vorliegende Erfindung hat gleichermaßen eine Zusammensetzung zum Gegenstand, umfassend einen adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplex, so wie er oben definiert wurde, und eine chemische Substanz ausgewählt aus Nukleinsequenzen, immunogenen Substanzen, Antikrebssubstanzen zur Verwendung in der Behandlung menschlicher oder tierischer Krankheiten, bei denen Zellen eine Rolle spielen, die die spezifischen Rezeptoren für die Adenovirus-Fasern exprimieren und/oder Zellen, die die Rezeptoren für Integrine, nämlich Integrine α_vβ₃ oder α_vβ₅ exprimieren, solche wie Epithelzellen, Endothelzellen, Blutplättchen, Lymphzellen, Tumorzellen, und wobei der Proteinkomplex eine effektive Menge der genannten aktiven chemischen Substanz in diesen Zellen freisetzt.
Die vorliegende Erfindung hat weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplexe gemäß der Erfindung zum Gegenstand.
Ein solches Verfahren umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte:

(1) getrennte oder gleichzeitige Klonierung des (oder der) Gens (Gene), das bzw. die für die Faser(n) eines Adenovirus codiert bzw. codieren, und des Gens, welches für die Basis des Pentons eines Adenovirus codiert und gegebenenfalls das Gen, welches für das Hexon eines Adenovirus codiert, wobei die Gene entweder von demselben Adenovirus oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen, in wenigstens einen Baculovirus-Vektor, für den Erhalt mehrerer rekombinanter Plasmide, die entweder ein Gen oder zwei Gene enthalten (gleichzeitige Expression von zwei Fasern im Fall, dass ein Adenovirus zwei Fasern pro Penton enthält), oder für den Erhalt eines rekombinanten Plasmids, welches gleichzeitig zwei Gene enthält (oder drei Gene, im Fall der Verwendung eines Adenovirus enthaltend zwei Fasern pro Penton); im letzteren Fall umfasst der verwendete Baculovirus-Vektor eine doppelte oder dreifache Expressionskassette, und im Fall, wobei der erfindungsgemäße Proteinkomplex weiterhin mindestens ein Hexon umfasst, kann der genannte Baculovirus-Vektor eine multiple Expressionskassette umfassen;
(2) Kotransfektion des oder der rekombinanten Plasmids bzw. Plasmide und eines linearisierten Baculovirus-DNA-Fragments in einer Insektenzelle;
(3) Klassieren und Auswählen der rekombinanten Baculovirus-Klone, die getrennt oder gleichzeitig die Faser(n), die Basis des Pentons und gegebenenfalls des Hexons exprimieren;
(4) Reinigen der ausgewählten Klone, die rekombinanten, replizierbaren Baculoviren entsprechen, die ein oder mehrere der von wenigstens einem Adenovirus stammenden Gene enthalten und die die entsprechenden Proteine exprimieren;
(5) Extraktion der durch die rekombinanten Baculoviren exprimierten Proteine; umfassend im Wesentlichen die Lyse der Insektenzellen, die Entfernung der Zelltrümmer und des Zellkerns durch Zentrifugation und Weiterbearbeitung des Überstandes;
(6) Reinigen des erfindungsgemäßen dodekaedrischen Proteinkomplexes durch Anwendung des besagten Überstandes (Proteinextrakt) in einem Saccharosegradienten, dessen Konzentrationsbereich in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht und der Dichte der erhaltenen Dodekaeder variiert, und Rückgewinnung der Fraktionen im Bereich der erhöhten Saccharosekonzentrationen; beispielsweise für die gebildeten Komplexe Ad2 und/oder Ad3 variiert der Saccharosegradient von 15 bis 40%, und man arbeitet mit der Fration weiter, die einer Saccharosekonzentration zwischen 31 und 38% entspricht.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens sind die Insektenzellen des Schrittes (2) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Spodoptera frugiperda-Zellen und Trichoplusia ni-Zellen.
In einer Abwandlung wird die Kotransfektion des Schrittes (2) in Spodoptera frugiperda-Zellen vollzogen und das Verfahren umfasst einen zweiten Schritt (4') zur Transfektion der in Schritt (4) erhaltenen gereinigten Klone von rekombinanten Baculoviren in Trichoplusia ni-Insektenzellen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des genannten Verfahrens enthält der verwendete Baculovirus-Vektor eine Kassette zur zweifachen, dreifachen oder mehrfachen Expression gemäß Schritt (1) und dieser Vektor umfasst zwei oder drei starke Promotoren.
Beispielsweise lässt sich der Transfervektor pAcUW31 (Clontech^®) anführen, der enthält (i) den Polyhedrin-Promotor und den Promotor p10 enthält, wobei der Polyhedrin-Promotor begleitet ist von einer einzigen Klonierungsstelle BamHI und von den Signalsequenzen für die Polyadenylierung aus dem Polyhedrin-Gen, wobei der Promotor p10 begleitet ist von einzelne Klonierungsstellen Bgl II und EcoRI und dem Polyadenylierungssignal von SV40, (ii) den Replikationsursprung M13, (iii) einen Replikationsursprung pUC und (iv) ein Reportergen, wie Luziferase, β-Galaktosidase oder ein Resistenzgen für ein Antibiotikum (beispielsweise Ampizillin).
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird das genannte linearisierte DNA-Fragment des Baculovirus aus Schritt (2) aus einem Vektor enthalten, das drei Restriktionsschnittstellen Bsu36I und das lacZ-Gen anstelle der Sequenz enthält, das für das Polyhedrin codiert, beispielsweise der virale DNA-Vektor BacPAK6^® (Clontech), wobei der Vektor vor der Kotransfektion des Schrittes (2) mit dem Restriktionsenzym Bsu36I gespalten wurde.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist die Spodoptera frugiperda-Insektenzelle des Schrittes (2) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sf21-Zellen und Sf9-Zellen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Aufreinigung der Klone aus Schritt (4) unter Durchführung von mindenstens zwei aufeinanderfolgenden Subklonierungen realisiert.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden als Insektenzellen Trichoplusia ni aus Schritt (5) die Zellen BTI-TN-5B1-4 (High Five^® von Invitorgenen) verwendet.
In einer Variante umfasst die Transfektion in Schritt (4') die Kotransfektion des rekombinanten Baculovirus enthaltend die beiden Gene (oder die drei Gene in dem Fall, dass ein Adenovirus zwei Fasern pro Penton enthält) hervorgegangen aus dem zuvor genannten Adenovirus ggf. gebunden an die rekombinanten Baculoviren, die ein einziges von zwei Genen aus dem Adenovirus enthält.
Gemäß der Erfindung kann die Transfektion mittels verschiedener Verfahren je nach dem verwendeten Vektor erfolgen: Kalziumphosphatverfahren, DEAE-Dextran-Verfahren, Verfahren des stabilen Transfers, Elektroporation, Methode mit Liposomen.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführung des Verfahrens umfasst der Schritt (5) der Extraktion der exprimierten Proteinzusammensetzung, die über den ausgewählten rekombinanten Baculovirus exprimiert wurden, den Erhalt eines zellulären Extraktes durch die Lyse der Trichoplusia ni-Zellen durch mehrerer Zyklen des Gefrierens und Auftauens, in einem 10 μM Tris-Puffer pH8, die Entfernung der Zelltrümmer und des Zellkerns, die in diesem zellulären Extrakt vorhanden sind, durch Zentrifugation für einige Minuten bei 7.000 bis 10.000 g und die Weiterverarbeitung des Überstandes.
Gemäß einer noch weiteren vorteilhaften Ausführungsform des genannten Verfahrens umfasst der Schritt (6) der Aufreinigung des Proteinkomplexes gemäß der Erfindung eine Zentrifugation bei 121.000 g an der Spitze des Reagenzglases und bei 275.000 g am Boden des Reagenzglases für 17 bis 19 Stunden bei Kühlung (4°C).
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird der in Schritt (6) aufgereinigte dodekaedrische Proteinkomplex einer Aufkonzentration unterworfen.
In einer Variante umfasst Schritt (2) die Isolierung rekombinanter DNA (rekombinates Plasmid), das in einem Bakterium erhalten wurde und die Transfektion der Insektenzellen mit der genannten rekombinanten DNA, gemäß einem Verfahren von GIBCO-BRL, genannt Bac-to-Bac^® Baculovirus expression system.
Die nativen Dodekaeder werden vorteilhafterweise durch Extraktion der Proteine erhalten, die in den mit einem Adenovirus infizierten Zellen (siehe Schritt (5) wie oben beschrieben) exprimiert wurden und Aufreinigung des dodekaedrischen Proteinkomplexes auf einem Saccharosegradienten unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführt, zur Herstellung der rekombinanten Dodekaeder.
Zusätzlich zu den vorgenannten Maßnahmen schließt die Erfindung weitere Maßnahmen ein, die in der folgenden Beschreibung betont werden, die sich auf die Durchführungsbeispiele des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beziehen, die in den beigefügten Zeichnungen erläutert werden, wobei:
1 eine schematische Ansicht eines Adenovirus' repräsentiert;
die 2A und 2B die Ergebnisse zeigen, die von Zellen erhalten wurden, die die Faser und die Pentonbasis aus Ad3 stammend (Ad3-Dodekaeder) exprimieren und zwei SDS-PAGE-Gelelektrophoresegele zeigen, die von den Fraktionen des Saccharosegradienten erhalten wurden: 2A zeigt das Ergebnis des Proteintransfers (Western blot oder Immunoblot); 2B zeigt das Ergebnis nach Anfärbung mit Coomassie-Blue;
die 3 und 4 stellen die Rolle der Pentonbasis im Dodekaeder dar;
die 5 und 6 zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen des Faser-Dodekaeders bzw. des Basis-Dodekaeders von Ad3, negativ gefärbt mit 1%igem Natriumsilicotungstat; die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden ausgehend von einer Materialprobe erstellt, die nach Zentrifugation auf dem Saccharosegradienten aus dem Konzentrationsbereich von 31 bis 38% Saccharose, und anschließendem Mischen, Dialyse und Aufkonzentrierung erhalten wurden;
die 7 repräsentiert einen chimären Dodekaeder;
die 8 und 9 stellen die Internalisierung des erfindungsgemäßen dodekaedrischen Proteinkomplexes in HeLa-Zellen dar;
die 10 stellt die Internalisierung eines Basis-Dodekaeders und eines Faser-Dodekaeders dar: die Zeichen
(offenes Quadrat) stellen die Internalisierung der Faser-Dodekaeder bzw.
(geschlossenes Quadrat) die Internalisierung der Basis-Dodekaeder dar; diese Figur zeigt in der Abszisse die Menge der viralen Partikel/Zelle (= MOI oder Multiplicity of Infection) und auf der Ordinate die Einheiten der Fluoreszenz (willkürliche Einheiten der Fluoreszenz);
die 11 stellt die Transfektion eines Plasmides enthaltend ein Gen codierend für die Luziferase in Anwesenheit eines Penton-Dodekaeders oder eines Basis-Dodekaeders dar, verglichen mit der Transfektion mit einem rekombinanten Adenovirus mit dem gleichen Gen; auf der Abszisse ist die Menge der viralen Partikel/Zelle (= MOI oder Multiplicity of Infection) und auf der Ordinate die relative Menge der Lichtemmission (= RLU oder Relative Light Unit) aufgetragen;
die 12A und 12B zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen der Komplexe DNA/Peptid/Penton-Dodekaeder (A) bzw. DNA/Peptid/Basis-Dodekaeder (B), die mit 1%iger Natriumsilicotungstat negativ gefärbt wurden;
die 13 zeigt die Wechselwirkung des bifunktionalen Peptides mit einem erfindungsgemäßen dodekaedrischen Proteinkomplex und einer Plasmid-DNA; diese Figur zeigt ein Gel einer Gelelektrophorese.
Beispiel 1: Klonierung, Expression und Aufreinigung des dodekaedrischen Adenovirus vom Typ 3.
1. Amplifikation der Gene für die Fasern und der Pentonbasis über PCR.
Unter Verwendung der PCR ist es möglich, Nukleotidsequenzen codierend für nützliche Polypeptide herzustellen, die in einen geeigneten Vektor eingefügt werden können und zur Transformation einer spezifischen Zelle und zu ihrer Expression in der letzteren verwendet werden kann.
Das Verfahren zur Herstellung von Genen, die die Pentonbasis und die Faser des dodekaedrischen Adenovirus gemäß der Erfindung exprimieren, hängt von der Auswahl der Oligonukleotide als Primer in der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ab.
Die Sequenz der Gene der Pentonbasis und der Faser von Ad3 wurde in Cuzange et al., Gene, 1994, 146, 257–259 bzw. von Signas et al., J. Virol., 1985, 53, 672–678 beschrieben.
Die Primer, die am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende verwendet wurden, um das Gen kodierend für die Pentonbasis zu amplifizieren sind:
Die Primer, die am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende verwendet wurden, um das Gen kodierend für die Faser zu amplifizieren sind:
Die unterstrichenen Klonierungsstellen stellen die von BamHI, BamHI, EcoRI, EcoRI dar. Das Start-Codon ATG ist fett gedruckt dargestellt und das Stop-Codon TAA (oder TTA im komplementären Strang) ist kursiv gedruckt.
Die Sequenzen der Fasern und der Pentonbasis von Ad2 und von Ad5 wurden insbesondere in Chroboczek J. et al., Virology, 1987, 161, 549–554 und in Virology, 1992, 186, 280–285; Neuman R. et al., Gene 1988, 69, 153–157 beschrieben.
Die Amplifikation über PCR wurde mit den DNA-Extrakten durchgeführt, die ausgehend von einem Virus durch Vermehrung in HeLa-Zellen, wie in Horwitz beschrieben („Adenoviridae and their replication", in Virology, Fields and Knipe, Eds. Raven Press, New York, 1990), erhalten wurden.
Der PCR-Puffer enthielt zum Beispiel: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 200 μM ATP, 200 μM dTTP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP und 2,5 Einheiten Thermus aquaticus DNA-Polymerase pro 100 μl Puffer. Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: nach Denaturierung für 2 min bei 94°C umfasste die PCR 25 Zyklen für 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 1 min bei 72°C.
2. Klonierung der PCR-Produkte in den Zwischenvektor PCR-Script^TM.
Der Klonierungsvektor PCR-Script^TM (Stratagene, Katalog Nr. 211190, 1994) stellt eine sehr gute Ligierungseffizienz von DNA zur Klonierung von PCR-Produkten bereit.
Die Produkte der PCR-Amplifikation wurden über Gelelektrophorese (1% Agarose in TAE-Puffer) aufgetrennt; die entsprechenden Banden wurden abgetrennt und DNA wurde nach dem GENECLEAN II^® Verfahren (Bio101, Inc.) extrahiert. Die DNA-Fragmente enthaltend die Gene kodierend für die Pentonbasis und die Faser wurden jeweils getrennt in den zuvor genannten Vektor pCR-Script^TM gemäß der Beschreibung des Herstellers kloniert.
Die Klone wurden anschließend nach dem in Sambrock et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, zweite Ausgabe) im Kapitel betreffend die Minipreparation von Plasmid-DNA beschriebenen Verfahren behandelt. Unter diesen Bedingungen wurde die Anwesenheit der Gene bestätigt, die für die Faser und die Pentonbasis des Adenovirus kodieren, indem die Länge der nach Spaltung mit BamHI und EcoRI erhaltenen Fragmente im Agarosegel mit Standardprodukten verglichen wurden.
Die positiven Klone wurden vermehrt, die Plasmid-DNA wurde isoliert und die Gene für die Faser und die Pentonbasis wurden nach Spaltung mit den gleichen Restriktionsenzymen (BamHI und EcoRI) erhalten, gemäß den gentechnischen Methoden, die gewöhnlich in der molekularbiologischen Klonierung angewandt werden (Sambrock et al., wie zuvor erwähnt).
3. Klonierung der Gene für die Faser und die Pentonbasis in einen Expressionsvektor
Der Doppel-Expressionsvektor pAcUW31^® (Clontech) wurde zur Expression des Dodekaeders verwendet. Zuerst wurde das Gen für die Pentonbasis in die BamHI-Klonierungsstelle des Vektors stromaufwärts des Polyhedrinpromotors eingefügt. Die Klonierung wurde durch Hybridisierung mit einer nicht-radioaktiven Sonde überprüft, die der Pentonbasis entspricht und die an Fluorescein gebundenes dUTP enthielt, entsprechend dem Verfahren für den ECL^®-Kit. Die Orientierung des Inserts bezüglich des Promotors wurde in den positiven Klonen durch Restriktionsanalyse bestimmt.
In einem zweiten Schritt, wurde das für die Faser kodierende Gen in die EcoRI-Schnittstelle des zuvor genannten Vektors stromabwärts vom Promotor des p10-Gens eingefügt. Die Klonierung und die Orientierung des Inserts wurde wie oben beschrieben bestätigt.
Die Sequenzen der Gene, die für die Basis und für die Faser kodieren, wurden im erhaltenen Plasmid bestätigt. Es wurde keine Mutation entdeckt. In gleicher Weise, wurden die Vektoren, die entweder nur das für die Faser kodierende Gen oder nur das für die Pentonbasis kodierende Gen tragen, wie oben beschrieben präpariert und analysiert.
Die Expressions-Plasmide die entweder die beiden Gene, oder eines der beiden Gene von Interesse tragen, wurden wie in Hanahan (J. Mol. Biol. 1983, 166, 557–580) beschrieben in den E.coli-Stamm TG-1 transformiert und die Aufreinigung des Plasmides im großen Maßstab wurde unter Verwendung der dem Fachmann in der Gentechnik wohl bekannten Verfahren (Sambrook et al. wie oben erwähnt) durchgeführt.
In gleicher Weise, falls notwendig (im Falle der Verwendung eines Adenovirus enthaltend zwei Fasern), kann ein Vektor mit dreifacher Expression, wie in A. J. Belyaev und T. Roy (N.A.R., 1993, 21, 1219–1223) beschrieben, verwendet werden.
4. Transfektion in Insektenzellen
Die rekombinanten Plasmide (100 ng) wurden (getrennt) mit einem linearisierten Baculovirus (Clontech: virale BacPAK6^®-DNA gespalten mit Bsu36I) in Gegenwart von Lipofectin^® (GIBCO) in Spodoptera frugiperda-Zellen (Sf21) und in Trichoplusia ni-Zellen (High-Five^®) gemäß dem von Kitts et al. (N.A.R., 1990, 18, 19, 5667–5672) beschriebenen Verfahren kotransformiert. Das Verfahren erlaubt es, eine Transformationseffizienz von über 80% zu erzielen. Es wurden jeweils einige Klone für jeden Fall ausgewählt und die Expression wurde mittels der Western blot-Technik detektiert, die mit einem aus Kaninchen gewonnenen polyklonalen Antikörper durchgeführt wurde, die spezifisch gegen die Antigene der Faser bzw. der Pentonbasis gerichtet sind.
5. Aufreinigung der positiven Klone
Die Isolate der rekombinanten Baculoviren wurden drei Vermehrungszyklen (über Plaques) unterworfen, gefolgt von einer Titration nach dem Verfahren von King und Possee (The baculovirus expression system, A laboratory guide, L. A. King und R. D. Possee, Editoren Chapman & Hall, 1992). Die Expression der beiden Proteine wurde überprüft mittels Western blot, wie dieser oben beschrieben wurde.
6. Aufreinigung der Proteine
Die Kinetik der Expression des Dodekaeders wurde in zwei Zelltypen für 5 Tage in anhaftenden Zellen verfolgt, die bei 27°C in einem TC 100-Medium (GIBCO) enthaltend 5% fötales Kälberserum (Sf21- oder Sf9-Zellen) oder in einem TC 100-Medium (GIBCO) enthaltend 10% fötales Kälberserum (High Five^®-Zellen) kultiviert wurden. Bei der Messung wurde gefunden, dass die Ausbeute der Proteinexpression in den High-Five^®-Zellen am besten war, und so wurde die Expression der Proteine in großem Maßstab ausschließlich in diesen Zellen durchgeführt.
Die Versuche zur Erhöhung der Expression über die Kotransfektion der Insektenzellen mit einem Baculovirus, der die zwei Gene trägt, und unterschiedliche Mengen eines Baculovirus das kein einziges Gen trägt, zeigten keine signifikanten Unterschiede.
Drei Tage nach der Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus (Multiplikation der Infektion: 5), wurden die High Five^®-Zellen in einem 10 mM Tris-Puffer pH 8, enthaltend Protease-Inhibitioren, aufgenommen.
Die Lyse der Zellen wurde mittels drei Gefrier-/Auftau-Zyklen im gleichen Tris-Puffer durchgeführt. Der Lyse-Extrakt wurde von Feststoffen (Zelltrümmer und Zellkern) mit Hilfe einer Zentrifugation über 5 min bei 7000–10.000 g abgetrennt, und danach auf einen Saccharose-Gradienten von 15 bis 40% (11 ml) in einem Gradienten-Puffer enthaltend 10% Glycerin, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 und 2 mM EDTA aufgebracht.
Nach 18 Stunden Zentrifugation bei 4°C in einem Beckman SW41-Rotor bei 121.000 g am oberen Ende des Reagensglases und bei 275.000 g am Boden des Reagensglases wurde die auf diese Weise behandelte Probe fraktionsweise (800 μl) beginnend vom oberen Teil des Gradienten weiter verarbeitet.
Unter diesen Bedingungen wurde der Dodekaeder in den Fraktionen enthaltend 31 bis 38% Saccharose weiter verarbeitet. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gegen einen Gradienten-Puffer ohne Saccharose und Glycerin dialysiert.
Der Dodekaeder wurde mit Hilfe einer Zentrifugation auf Centritrep^® (Amicon) aufkonzentriert.
Die 2A und 2B stellen die Ergebnisse dar, die nach der Aufreinigung des Dodekaeders erhalten wurden: sie wurden erhalten aus Aliquots von jeder Fraktion, die wie oben beschrieben vom Saccharose-Gradienten erhalten wurden, unter Wärmezufuhr in Anwesenheit von 1% SDS denaturiert und einer Elektrophorese auf zwei SDS-Polyacrylamide-Gelen (10%) unterworfen wurden; die Proteine von einem der Gele wurden über einen Proteintransfer analysiert, gefolgt von einer Reaktion mit Antikörpern, die spezifisch gegen Faser bzw. Pentonbasis gerichtet sind (Western blot)(2A); die Proteine des zweiten Gels wurden über Färbung mit Coomassie Brilliant Blue detektiert und analysiert. Die Fraktionen, die vom oberen Ende des Reagenzglases stammen, enthielten die Pentonbasis und die freien Fasern und die Fraktionen, die von den dem Bereich stammen, der einer Saccharosekonzentration von 31 bis 38% entspricht, enthielten die dodekaedrischen Proteinkomplexe gemäß der Erfindung.
Die 5 repräsentiert eine elektronenmikroskopische Aufnahme der negativ gefärbten Faser-Dodekaeder von Ad3; die Figur darüber stellt ein Feld dar, das eine gewisse Anzahl von Dodekaedern in verschiedenen Ausrichtungen enthält, wobei die 2, 3 und 5 die Dodekaeder auf einer Filmunterlage gemäß ihrer verschiedenen Symmetrieachsen zeigen (Ordnung 2, Ordnung 3 bzw. Ordnung 5); in der Figur, die die Symmetrie der Ordnung 5 zeigt, sind zehn Fasern sichtbar, wobei sich die 11. und 12. Faser wahrscheinlich in Ebene befindet, die vertikalen zu der Papierebene steht.
Die 6 repräsentiert eine elektronenmikroskopische Aufnahme der negativ gefärbten Faser-Dodekaeder von Ad3; die Figur darüber stellt ein Feld dar, das eine gewisse Anzahl von Dodekaedern in verschiedenen Ausrichtungen enthält, wobei die 2, 3 und 5 die Dodekaeder auf einer Filmunterlage gemäß ihrer verschiedenen Symmetrieachsen zeigen (Ordnung 2, Ordnung 3 bzw. Ordnung 5).
Die Fraktionen, die die sphärischen Partikel enthalten, bestehen aus Pentonen (5), die über ihre Basen zur Bildung von Dodekaedern assoziiert sind.
In den 5 und 6, sind die verschiedenen Symmetrieachsen der Ordnung 2, der Ordnung 3 und der Ordnung 5 leicht zu erkennen.
Der Durchmesser des Dodekaeders mit den Fasern (zwischen den Spitzen zweier sich gegenüberliegender Fasern) beträgt 49 nm, der Durchmesser des Basisteils (von dem Teil oberhalb der Basis bis zur Teil oberhalb der gegenüberliegenden Basis) beträgt 27,8 nm (der Durchmesser ist fast identisch zu dem Durchmesser des Dodekaeders ohne Fasern (27,5 nm)). Die Pentone des dissoziierten Dodekaeders, die man ebenfalls auffinden kann, zeigen eine Höhe von 21,4 +/– 1 nm (n = 24), gemessen von dem Teil unterhalb der Basis bis zum Ende der Spitze der Faser.
Das Innere des Dodekaeders wird durch einen Hohlraum gebildet, der ein Innenvolumen von ungefähr 350 nm³ besitzt.
7. Die Rolle der Pentonbasis für die Bildung des Dodekaeders
Die ausgehend von den Pentonbasen und den Fasern gebildeten Dodekaeder, können nicht nur über ein Koexpressionsverfahren ausgehend von einem Baculovirus mit zwei Genen, sondern in gleicher Weise ausgehend von einer Koinfektion mit zwei Baculoviren, von denen jedes ein Gen trägt, in den Insektenzellen gebildet werden (3A, B).
Das ist der Ansatz, der gewählt wurde, um die Rolle der Pentonbasis bei der Bildung der Dodekaeder zu studieren.
Wenn eine Basis des Ad2 mit einer Faser des Ad2 oder einer Faser des Ad3 verwendet wird, dann enthalten die aus den Saccharosefraktionen mit höherer Dichte gewonnenen Proteine nicht-strukturierte Aggregate aus Pentonen (4D) oder aus der Basis (4E).
Die Pentone des chimären Adenovirus können in-vitro durch Inkubation der aufgereinigten Fasern und Pentonbasen gebildet werden, die aus verschiedenen Serotypen stammen.
Ausgehend von einem solchen Verfahren, hat man Dodekaeder erhalten, die ausschließlich aus Basen bestehen. Nach der Inkubation eines Dodekaeders, der ausschließlich aus Basen von Ad3 gebildet ist, mit nativen Fasern von Ad2 (isoliert aus mit Ad2 infizierten Zellen), erhält man Dodekaeder, die heterologe Fasern inseriert enthalten (4 und 7).
Diese Erfahrungen bezüglich der Studien der Adenoviren Ad2 und Ad3 zeigen, dass die Bildung eines Dodekaeders von der Anwesenheit der Basis von Ad3 und nicht von der Basis von Ad2 abhängt.
Wenn daher lediglich die Pentonbasis von Ad3 im Baculovirus-System exprimiert wird, dann findet man es fast ausschließlich in der Form eines Dodekaeders wieder (3C).
Die Bildung des chimären Dodekaeders, wenn die Fasern von Ad2 in einen zuvor gebildeten Dodekaeder aus Basen inseriert wurden, bestätigen die vorherigen Ergebnisse betreffend die Bildung der chimären Pentone.
Die 3 und 4, stellen die Rolle der Pentonbasis in der Bildung des Dodekaeders dar. Die Analyse über den Wesern blot von verschiedenen Fraktionen aus dem Saccharosedichtegradienten wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt: 3A: Koexpression der Basis und der Faser von Ad3 ausgehend von einem Baculovirus; 3B: Koexpression der Basis und der Faser von Ad3 ausgehend von einer Koinfektion mit zwei Baculoviren, wobei jedes Virus eines der Gene trägt; 3C: Expression der Basis von Ad3; 4D: Expression der Basis von Ad2 und der Faser von Ad3, ausgehend von einer Koinfektion mit zwei Baculoviren, wobei jedes Virus ein Gen trägt; 4E: Expression der Basis von Ad2; 4F: Bildung eines Dodekaeders in-vitro durch Inkubation eines Basis-Dodekaeders (Ad3), zuvor gebildet in vivo, mit nativen Fasern von Ad2.
Beispiel 2: Intrazelluläre Akkumulation von Dodekaedern
Die 8 und 9 sind Fotos, die die Internalisierung des Dodekaeders in HeLa-Zellen darstellen.
Um die Fotos anzufertigen, wurden Portionen von 5 × 10⁴ HeLa-Zellen in einem DMEM-Medium enthaltend 10% fötales Rinderserum auf Lamellen (Durchmesser: 1,2 cm) kultiviert. Jede Lamelle wurde 2 Stunden bei 4°C mit 1 mg Dodekaeder in 50 ml PBS-Puffer mit 3% BSA inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und bei 37°C in einem PBS-Puffer mit 3% BSA für 0 bis 45 min inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und mittels einer Behandlung mit Methanol für 5 min bei –20°C permeabilisiert. Dann wurden die Lamellen für eine Stunde bei 37°C mit einem Antikörper inkubiert, der gegen die Faser gerichtet ist (1:200, 50 μl in PBS-Puffer mit 3% BSA pro Lamelle), zweimal mit PBS gewaschen, danach für 30 min mit einem Antikörper inkubiert, der mit Fluorescein konjugiert ist (1:250, 50 μl in PBS-Puffer mit 3% BSA pro Lamelle). Nach einem letzten Waschschritt mit PBS, wurden die Lamellen auf einen Objekträger aufgebracht und mit einem Tropfen 50 mg/ml 1,4-Diazabicyclo[2,2,2]oktan (Sigma) in 50% Glycerin und 50% PBS versetzt. Die Beobachtungen wurden mit einem konfokalen Mikroskop MRC600 (Bio-Rad) durchgeführt.
Die 8 und 9 zeigen, dass nach der Inkubation bei 4°C, es eine Bindung der dodekaedrischen Proteinkomplexe an die oben genannten Zellen gibt, und bei 37°C eine Internalisierung dieser Komplexe.
Bei 4°C befindet sich der Dodekaeder an der Oberfläche der Zellen (sichtbar nach Färbung mit einem anti-Faser Antikörper); wenn die HeLa-Zellen bei 37°C transferiert werden, zeigen die 8 und 9 die Entwicklung der Internalisierung des Dodekaeders als Funktion der Zeit: bis 5 min ist das Bild sehr ähnlich (keine Internalisierung); nach 10 bis 15 min (8) der Inkubation, beobachtet man einen massiven Transfer des Dodekaeders in die Nähe der Kernmembran. Eine längere Inkubation (20 bis 45 min, 9) zeigt ein viel diffuseres Signal, was die zytoplasmatische Entleerung des Dodekaeders zeigt. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn der Dodekaeder mit einem anti-Basis Serum nachgewiesen wird.
Ein ähnliches Experiment wurde mit einem Dodekaeder durchgeführt, der nur aus Basen von Ad3 besteht. Mit Hilfe einer konfokalen Elektronenmikroskopie wurde keine Bindung oder Internalisierung beobachtet, wenn man bezüglich der Molarität vergleichbare Werte zu denen des vorherigen Experimentes verwendet. Unterdessen, wenn höhere Mengen an Basis-Dodekaedern verwendet werden, wird eine Internalisierung beobachtet. Eine 10 bis 20-fache Menge an Basis-Dodekaedern sind notwendig um einen Grad der Internalisierung zu erreichen, der äquivalent ist zu dem, der bei Verwendung von Faser-Dodekaedern erhalten wird. 10 stellt die Ergebnisse dar, die nach einer Stunde der Internalisierung erhalten wurden. Ähnliche Ergebnisse werden nach 30 min Internalisierung erhalten.
Diese Experimente zeigen, dass die Abwesenheit der Fasern durch erhebliche Mengen an Basis-Dodekaedern kompensiert werden kann; unterdessen verleiht die Anwesenheit der Fasern dem Dodekaeder eine überlegene Effektivität während des Zeitpunkts des Eintretens in die Zellen.
Diese Ergebnisse können erklären, dass bei der Messung hinsichtlich des Adenovirus vom Serotyp 2 (Ad2), die Bindungsaffinität der Fasern 30-fach höher ist als die der Pentonbasis (K_ds von 1,7 bzw. 55 nM).
Bei der Temperatur, bei der die Bindung und die Internalisierung des Virus erfolgt, hat man gezeigt, dass der Dodekaeder Ad3 sich an die HeLa-Zellen bindet und, dass nach 10 bis 20 min, bei der Temperatur die an den Eintritt des Virus angepasst ist, der Dodekaeder sich im Zytoplasma wiederfindet, an der zytoplasmatischen Seite der Oberfläche der Kernmembran. Die Gesamtkinetik scheint ähnlich derjenigen der ersten Schritte einer viralen Infektion zu sein, wenn nach 20 min nach der Bindung, ungefähr 50% des anfänglich inokulierten Virus (Ad5) sich and der Peripherie des Kerns befindet.
In dem Fall des Eintritts des Dodekaeders Ad3 in die Zelle, wird die Integrität des Dodekaeders und seiner Bestandteile nicht beeinträchtigt, weder während der ersten 20 min noch viel später (8 und 9).
Beispiel 3: Transfektion menschlicher Zellen mit dem Luziferase-Gen unter Verwendung des Dodekaeders Ad3 mit oder ohne Faser und eines bifunktionalen Peptides: Vergleich der Transfektions-Effizienz des erfindungsgemäßen adenoviralen Proteinkomplexes, mit der eines rekombinanten Adenovirus oder Liposoms (DOTAP).
Herstellung des Peptids
Das synthetisierte bifunktionale Peptid trägt 20 Aminosäurereste entsprechend dem N-Terminus der Faser von Ad3 und 20 Lysinresten des C-terminalen Endes, was ein Polykation ergibt das die Eigenschaft hat sich an ein Polyanion wie DNA zu binden. Die Sequenz des Polypeptides I: AKRARLSTSFNPVYPYEDES(K)₂₀ (SEQ ID NO: 5).
Andere bifunktionale Peptide können wie folgt konstruiert werden: beispielsweise tragen sie das N-terminale Ende irgendeiner Adenovirus-Faser, und verlängern sich in Richtung des C-terminalen Endes entweder (1) über ein Polyarginin oder (2) über einen Teil oder die vollständige Sequenz eines Core-Proteins irgendeines Adenovirus, wie Protein VII, Protein μ der Adenoviren des Menschen, oder homologe Core-Proteine, die in Adenoviren anderer Tierspezies gefunden werden.
Die vier folgenden Peptide wurden gleichermaßen synthetisiert:
In den Polypeptiden II und III, entspricht das C-terminale Fragment, in etwa 30 Aminosäurereste, der vollständigen Sequenz von Protein VII des aviären Adenovirus vom Serotyp 1 (FAV1 oder CELO) und der unterstrichene Teil entspricht einem mehr oder weniger langen Fragment der Faser von Ad3.
In den Polypeptiden IV und V, entspricht der C-terminale Teil in etwa der Sequenz des Proteins μ des Adenovirus vom Menschen beziehungsweise des Proteins μ vom aviären Ad1 CELO.
Alle diese bifunktionalen Peptide können getrennt oder als Mischung für die DNA-Transfektion verwendet werden.
Herstellung eines Plasmids enthaltend eine zu transportierende DNA (aktive Substanz
Das Plasmid, das für das Reportergen Luziferase (pGL3-Kontrollvektor)(Promega) codiert wird in E.coli JM109 hergestellt und über Qiagen aufgereinigt.
Verfahren
Mischung 1: Die dodekaedrischen Proben mit oder ohne Faser werden in einem DMEM-Medium mit 5 μg des bifunktionalen Peptides für 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert, dann werden 1,5 μg des Plasmids pGL3, das das Luziferasegen trägt, hinzugefügt.
Mischung 2: weiterhin wird eine Mischung von DOTAP (Boehringer) und 1,5 μg des Plasmids pGL3 gemäß den Angaben des Herstellers zubereitet, in einem Verhältnis DOTAP/DNA von 4.
Portionen von 10⁵ HeLa-Zellen pro Vertiefung werden, in einer Platte enthaltend 24 Vertiefungen, gleichzeitig mit den oben beschriebenen Mischungen und mit dem rekombinanten Adenovirus Ad5luc für eine Stunde bei 37°C transfiziert.
Die Lumineszenz-Emission wird nach 48 Stunden in Zelllysaten mit Hilfe des Kits von Promega gemessen.
Die 11 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
Beispiel 4: Nachweis der Wechselwirkung des bifunktionalen Peptides mit dem erfindungsgemäßen adenoviralen Proteinkomplex und der zu transportierenden Plasmid-DNA
Die DNA/Peptid/Penton-Dodekaeder-Komplexe und DNA/Peptid/Basis-Dodekaeder-Komplexe werden wie bei den Transfektionsversuchen beschrieben (siehe Beispiel 3) ohne Zugabe von Medium präpariert; die elektronenmikroskopischen Aufnahmen dieser Komplexe werden in den 12A und 12B dargestellt und zeigen die DNA in einer kompakten Form mit dem Penton-Dedekaeder (A) und dem Basis-Dodekaeder (B). Parallel dazu werden zunehmende Mengen des Basis-Dodekaeders mit 200 ng Peptid für 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert; 250 ng Plasmid-DNA werden hinzugefügt und 5 min später, werden die Proben auf ein 1%iges Agarosegel enthaltend TBE-Puffer aufgetragen. Die Proben werden für 1 Stunde einer Elektrophorese bei 50 Volt unterworfen.
Die DNA wird mit Ethidiumbromid angefärbt, gefolgt von einer Sichtbarmachung unter UV-Licht. Alle Proben enthielten Plasmid-DNA. Spur 1 entspricht der Probe nur enthaltend Plasmid-DNA; Spur 2 entspricht der Probe enthaltend die Mischung aus Plasmid-DNA und Dedekaeder-Basis (kein Peptid); die Spuren 3 bis 7 enthalten die Proben mit Plasmid-DNA, das bifunktionale Peptid und 1, 10, 100, 500 bzw. 1000 ng Basis-Dodekaeder; die Spuren 8 bis 12 enthalten die Proben mit Plasmid-DNA, das bifunktionale Peptid und 1, 10, 100, 500 bzw. 1000 ng Penton-Dodekaeder.
Diese Figur zeigt gut, dass die Peptide sich an den Dodekaeder und an die Plasmid-DNA binden und die Struktur verändern: Die Plasmid-DNA wird kompakt und die Wanderung im Gel wird geringer: dies wird gezeigt durch die Anwesenheit einer Zwischenbande (siehe Pfeil) oder das Fehlen einer Wanderung im Gel (siehe Spuren 6 und 7).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Adenoviraler Proteinkomplex, dadurch gekennzeichnet, dass er gebildet ist: – entweder von 12 Pentonen, die jeweils eine Pentonfaser und eine Pentonbasis aufweisen, unter Ausschluss jedes anderen wesentlichen Bestandteils des Genoms eines Adenovirus, wobei die Faser(n) und die Basis des Pentons entweder von demselben Adenovirus oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen, wobei die Pentone über die Pentonbasen verbunden sind und eine gegenüber proteolytischen Enzymen beständige Dodekaederstruktur bilden, wobei der genannte Komplex ein Molekulargewicht zwischen 4,8 × 10⁶ und 6,6 × 10⁶ aufweist; – oder von 12 Pentonbasen, unter Ausschluss jedes anderen wesentlichen Bestandteils des Genoms eines Adenovirus, wobei die Pentonbasen entweder von demselben Adenovirus oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen und eine gegenüber proteolytischen Enzymen beständige Dodekaederstruktur bilden, und dass er ein Molekulargewicht zwischen 3,2 × 10⁶ und 4 × 10⁶ aufweist.
Adenoviraler Proteinkomplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenoviren ausgewählt sind aus den menschlichen Adenoviren und insbesondere dem Adenovirus Typ 2 (Ad2), Adenovirus Typ 3 (Ad3), Adenovirus Typ 5 (Ad5), Adenovirus Typ 4 (Ad4), Adenovirus Typ 7 (Ad7), Adenovirus Typ 9 (Ad9), Adenovirus Typ 11 (Ad11), Adenovirus Typ 15 (Ad15) oder den Enteroadenoviren (Ad40 und Ad41) und den aviären Adenoviren.
Adenoviraler Proteinkomplex nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer seiner Bestandteile (Basis und/oder Faser) verändert sein kann, um die Affinität gegenüber einem besonderen Zelltyp zu erhöhen.
Adenoviraler Proteinkomplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem ein Hexon oder ein anderes virales Protein aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen adenoviralen Proteinkomplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 sowie eine weitere chemische Substanz enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsequenzen, Proteinen, Peptiden und pharmakologisch aktiven chemischen Substanzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass dann, wenn die chemische Substanz ein Protein ist, es vorzugsweise immunoprotektive und antigene Eigenschaften aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass dann, wenn die chemische Substanz eine Nukleinsequenz ist, sie ausgewählt ist aus Genen, die für ein Polypeptid mit therapeutischer Aktivität codieren, Antisense-Sequenzen und Ribozymen.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass wenn sie eine codierende Sequenz enthält, sie außerdem einen aktiven Promotor für die Expression des Polypeptids aufweist, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus konstitutiven Promotoren und induzierbaren Promotoren.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5, 6, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die chemische Substanz eine Nukleinsäuresequenz oder ein Protein ist, sie mit einem Liganden assoziiert sein kann, welcher ausgewählt ist aus den Peptiden, deren N-terminaler Teil die N-terminate Aminosäure-Sequenz einer Adenovirus-Faser irgendeines Serotyps enthält und deren C-terminaler Teil insbesondere ein Polylysin, ein Polyarginin oder einen Teil oder die vollständige Sequenz eines Kernproteins irgendeines Adenovirus, ein Cystein oder einen Transferrin/Poly-L-Lysin-Komplex enthält.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel enthält.
Zusammensetzung mit einem adenoviralen Proteinkomplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 und einer chemischen Substanz, welche ausgewählt ist aus den Nukleotidsequenzen, Proteinen und pharmakologisch aktiven chemischen Substanzen, nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 11, als Medikament.
Zusammensetzung mit einem adenoviralen Proteinkomplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 und einer chemischen Substanz, welche ausgewählt ist aus den Proteinen nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, als Impfpräparat.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 11, die einen adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplex und eine chemische Substanz ausgewählt aus Nukleotidsequenzen, immunogenen Substanzen und pharmakologisch aktiven chemischen Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebs-Substanzen enthält, für ihre Verwendung bei der Behandlung menschlicher oder tierischer Krankheiten, die Zellen implizieren, welche spezifische Rezeptoren der Adenovirus-Fasern exprimieren und/oder Zellen, welche die Rezeptoren der Integrine, insbesondere der Integrine α_vβ₃ oder α_vβ₅ exprimieren, wie Epithelzellen, Endothelzellen, Blutplättchen, lymphoide Zellen und Krebszellen, und die eine wirksame Menge der aktiven chemischen Substanz an die genannten Zellen freisetzt.
Verfahren zur Zubereitung eines adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplexes nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, das es die folgenden Schritte umfasst: (1) getrennte oder gleichzeitige Klonierung des (oder der) Gens (Gene), das bzw. die für die Faser(n) eines Adenovirus codiert bzw. codieren, und des Gens, welches für die Basis des Pentons eines Adenovirus codiert, wobei die Gene entweder von demselben Adenovirus oder von unterschiedlichen Adenoviren stammen, in wenigstens einen Baculovirus-Vektor, für den Erhalt mehrerer rekombinanter Plasmide, die entweder ein Gen oder zwei Gene enthalten, oder für den Erhalt eines rekombinanten Plasmids, welches gleichzeitig zwei oder drei Gene enthält; (2) Kotransfektion des oder der rekombinanten Plasmids bzw. Plasmide und eines linearisierten Baculovirus-DNA-Fragments in einer Insektenzelle; (3) Klassieren und Auswählen der rekombinanten Baculovirus-Klone, die getrennt oder gleichzeitig die Faser(n) und die Basis des Pentons exprimieren; (4) Reinigen der ausgewählten Klone, die rekombinanten, replizierbaren Baculoviren entsprechen, die ein oder mehrere der von wenigstens einem Adenovirus stammenden Gene enthalten und die die entsprechenden Proteine exprimieren; (5) Extraktion der durch die rekombinanten Baculoviren exprimierten Proteine; und (6) Reinigen des dodekaedrischen Proteinkomplexes durch Anwendung des in (5) erhaltenen Extrakts auf einem Saccharosegradienten, dessen Konzentrationsbereich in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht und der Dichte der erhaltenen Dodekaeder variiert, und Rückgewinnung der Fraktionen im Bereich der erhöhten Saccharosekonzentrationen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Baculovirus-Vektor eine Kassette zur zweifachen, dreifachen oder mehrfachen Expression enthält.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Insektenzellen des Schrittes (2) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Spodoptera frugiperda-Zellen und Trichoplusia ni-Zellen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kotransfektion des Schrittes (2) in Spodoptera frugiperda-Zellen vollzogen wird und dass das Verfahren einen zweiten Schritt (4') zur Transfekti on der in Schritt (4) erhaltenen gereinigten Klone von rekombinanten Baculoviren in Trichoplusia ni-Insektenzellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Spodoptera frugiperda-Insektenzelle des Schrittes (2) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sf21-Zellen und Sf9-Zellen.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektion des Schrittes (4') die Kotransfektion von rekombinanten Baculoviren umfasst, welche die aus vorgenannten Adenoviren stammenden zwei Gene enthalten und eventuell mit rekombinanten Baculoviren assoziiert sind, welche ein einziges der beiden aus Adenoviren stammenden Gene enthalten.
Verfahren zur Zubereitung eines adenoviralen dodekaedrischen Proteinkomplexes, stammend aus einem Adenovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – einen Schritt (1) gemäß Patentanspruch 15, – einen Schritt (2) zur Isolierung der rekombinanten Plasmide und zur Transfektion von Insektenzellen mit den rekombinanten Plasmiden, und – Schritte (3) bis (6) gemäß Patentanspruch 15.