DE69534591T2

DE69534591T2 - Adenovirusfaser mit hinzugefügten liganden

Info

Publication number: DE69534591T2
Application number: DE69534591T
Authority: DE
Inventors: T. David CURIEL; A. Jeffrey ENGLER
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 1994-03-28
Filing date: 1995-03-28
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2015-03-29
Also published as: EP0753068A1; JPH10501684A; US6312699B1; EP0753068B1; WO1995026412A1; US20020076419A1; DE69534591D1; AU2195495A; US6683170B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Modifikation des Adenovirus-Faserproteins und Verfahren zur Verwendung davon, um die Zellanheftung durch das Faserprotein zu verändern.
Allgemein sind Rezeptoren in die Stoffwechselwege der Endocytose eingebunden, entweder konstitutiv oder durch Liganden induziert. Diese Rezeptoren sammeln sich in mit Clathrin ausgekleideten Gruben, gelangen mit Hilfe von mit Clathrin ausgekleideten Vesikeln in die Zelle, passieren ein saures Endosom, in dem die Rezeptoren sortiert werden, und kehren dann entweder an die Zelloberfläche zurück, werden intrazellulär gelagert oder werden in Lysosomen abgebaut. Die Stoffwechselwege zur Internalisierung erfüllen eine Vielzahl von Funktionen wie etwa Nährstoffaufnahme, Entfernung von aktivierten Enzymen, Beseitigung von Makromolekülen, opportunistischen Eintritt von Viren und Toxinen, Dissoziation und Abbau eines Liganden und Regulierung des Rezeptorspiegels. Viele Rezeptoren durchlaufen mehr als einen intrazellulären Stoffwechselweg, abhängig von Zelltyp, Konzentration des Rezeptors, Typ des Liganden, Valenz des Liganden und Konzentration des Liganden. Einen Überblick über molekulare und zelluläre Mechanismen von durch Rezeptor vermittelte Endocytose wird von Brown und Greene, DNA and Cell Biology 1991 10:6, 399-409 gegeben. Eine Reihe von Viren infizieren Zellen über eine Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung. Das Adenovirus ist ein Beispiel für ein Virus, das Rezeptor-vermittelte Endocytose benutzt, um das infektiöse Virus zu internalisieren.
Gentherapie erfordert den Transfer von rekombinanten Nukleinsäure-Konstruktionen in Zellen. Obgleich eine Reihe von verschiedenen Verfahren für den Gentransfer vorgeschlagen worden sind, bleibt eine der aussichtsreichsten die der Verwendung rekombinanter Viren. Die Entwicklung von rekombinanten Adenoviren für diesen Zweck hat, basierend auf den einzigartigen Vorteilen dieses Systems, eine Reihe von Anwendungen gefunden.
Ein Vorteil besteht darin, dass rekombinante Adenoviren isoliert und beschrieben worden sind, die genomische Deletionen enthalten, welche zu einer unzulänglichen Virusreplikation führen, ausgenommen innerhalb von Zelllinien, die die deletierten Funktionen trans-ergänzen. Die Zelllinien, die die für die Produktion von infektiösen Viruspartikeln notwendigen Virusgene enthalten, werden Verpackungs-Zelllinien genannt. Die Konstruktion der Adenoviren mit Replikationsdefekt wird von Berkner et al., 1987 J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., 1986 Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., 1986 J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., 1987 J. Virology 61:1226-1239 (1987), Zhang „Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" Bio Techniques 1993 15:868-872 beschrieben. Der Vorteil der Verwendung dieser Viren als Vektoren liegt darin, dass sie in dem Maß, wie sie sich auf andere Zelltypen ausbreiten können, begrenzt sind, da sie sich in einer ursprünglich infizierten Zelle zwar replizieren können, aber nicht in der Lage sind, neue infektiöse Viruspartikel zu bilden.
Die Fähigkeit des Virus, hohe Expressionsspiegel von therapeutischen Genprodukten zu erreichen und die Kapazität des Virus, sich nicht teilende, ausdifferenzierte Zellen zu infizieren, ist für gentherapeutische Anwendungen, die direkte in vivo-Genübertragung erfordern, genutzt worden. Es ist gezeigt worden, dass rekombinante Adenoviren nach direkter in vivo-Übertragung auf Atemwegsepithel, Leberzellen, Gefäßepithel, ZNS-Parenchym und eine Reihe anderer Gewebearten einen Gentransfer mit hoher Wirksamkeit erreichen, wie von Morsy, 1993 J. Clin. Invest. 92:1580-1586; Kirshenbaum, 1993 J. Clin. Invest. 92:381-387; Roessler, 1993 J. Clin. Invest. 92:1085-1092; Moullier, 1993 Nature Genetics 4:154-159; La Salle, 1993 Science 259:988-990; Gomez-Foix, 1992 J. Biol. Chem. 267:25129-25134; Rich, 1993 Human Gene Therapy 4:461-476; Zabner, 1994 Nature Genetics 6:75-83; Guzman, 1993 Circulation Research 73:1201-1207; Bout, 1994 Human Gene Therapy 5:3-10; Zabner, 1993 Cell 75:207-216; Caillaud, 1993 Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 und Ragot, 1993 J. Gen. Virology 74:501-507 berichtet worden ist.
Während der breit gefächerte Tropismus des Adenovirus die Transduktion einer Reihe von Gewebetypen für bestimmte Anwendungen der Gentherapie erlaubt hat, kann dieser weite Wirtszellenbereich auch zusätzliche Probleme verursachen. Es ist allgemein anerkannt, dass im Zusammenhang mit direkter in vivo-Genübertragung die Fähigkeit, heterologe Gene zu spezifischen zellulären Genen zu steuern, außerordentlich vorteilhaft sein würde, wie im Überblick von Anderson, 1992 Science 256:808-813; McCabe, 1993 Biochemical Medicine and Metabolic Biology 50:241-253 beschrieben. Der weit gestreute Tropismus des Adenovirus könnte möglicherweise jene Strategien unterlaufen, bei denen zellspezifische Übertragung essentiell ist. In dieser Hinsicht ist gezeigt worden, dass systematisch verabreichtes Adenovirus viele Gewebetypen transduziert (Stratford-Perricaudet, 1992 J. Clin. Invest. 90:626-630). Diese nicht spezifische Übertragung könnte möglicherweise zerstörerisch sein, denn es könnte ektopische Expression von transferierten heterologen Genen in nicht geeigneten zellulären Zielen als ein Ergebnis auftreten. Darüber hinaus kann die ubiquitäre Bindung des Virus systemische Verabreichung von verbotenen Dosen des Virus erforderlich machen, um eine spezifische Zielstelle in geeigneter Weise in vivo zu transduzieren.
Zusätzlich zu der Bindung des Virus mit breit gefächertem Tropismus in vivo kann das Unvermögen des Adenovirus, an eine gegebene Zielzelle zu binden, die Nützlichkeit dieses Vektors für einige gentherapeutische Anwendungen aufheben. Zum Beispiel verhindert das Fehlen eines Rezeptors für Adenovirus bei ausdifferenzierten Muskelzellen die Verwendung von Gentransfer-Strategien mit Adenovirus zur Ansteuerung dieses Gewebetyps, wie im Überblick von Ragot, 1993 und Karpati, 1993 Muscle and Nerve 16:1141-1153) beschrieben worden ist. Es würde daher unter bestimmten Umständen nützlich sein, den Tropismus von rekombinantem Adenovirus zu erweitern, um Genübertragung auf bestimmte Zellgruppen zu ermöglichen, bei denen zur Zeit mit diesem Vektorsystem keine Transduktion möglich ist.
Rekombinante Adenoviren erreichen Gentransduktion in der selben Weise, wie das Wildtyp-Adenovirus oder Adenovirus mit Replikationsdefekt durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren, worauf das Virus durch Rezeptor-vermittelte Endocytose internalisiert wird, wie von Chardonnet und Dales, 1970 Virology 40:462-477; Brown und Burlingham, 1973 J. Virology 12:386-396; Svensson und Persson, 1985 J. Virology 55:442-449; Seth, et al., 1984 J. Virol. 51:650-655; Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 1984 4:1528-1533; Varga et al., 1991 J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., 1993 Cell 73:309-319 berichtet worden ist. Das Adenovirus bindet über den Knaufabschnitt des Faserproteins, das aus dem Virusmantel hervorragt, an den Rezeptor. Das Faserprotein ist tatsächlich ein homotrimeres Protein, das vom Fasergen innerhalb des adenoviralen Genoms codiert wird. Kapselproteine des Adenovirus, die die Hexon-, Penton-Base und Faserproteine umschließen, werden zu einem späten Zeitpunkt der Infektion im Cytoplasma synthetisiert und zum Zusammenbau in Viruspartikel zum Kern transportiert.
Die Faser spielt eine wesentliche Rolle bei der Infektion durch Adenovirus, indem sie das Virus an einen spezifischen Rezeptor an der Zelloberfläche anheftet. Die Faser besteht aus drei Domänen: einem N-terminalen Schwanz, der mit der Penton-Base in Wechselwirkung tritt, einem Schaft, der aus 22 Wiederholungen eines aus 15 Aminosäuren bestehenden Segmentes zusammengesetzt ist, welches β-Faltblatt und β-Schleifen bildet, und einem Knauf am C-Terminus, der das für den Typ spezifische Antigen beinhaltet und für die Bindung an den Zelloberflächenrezeptor verantwortlich ist. Das Faserprotein ist auch für den Transport von viralen Nukleinsäuren in den Kern verantwortlich. Das Gen, das das Faserprotein vom Adenovirus-Serotyp 2 codiert, ist in menschlichen Zellen exprimiert worden und unter Verwendung eines rekombinanten Vacciniavirus-Vektors wurde gezeigt, dass es richtig in Trimere zusammengesetzt, glycosyliert und zum Kern transportiert wurde, wie von Hong und Engler, 1991 Virology 185, 758-767 berichtet wurde.
Die Modifikation der Genübertragung auf spezifische Zelltypen, die durch rekombinantes Adenovirus vermittelt wird, würde einen großen Nutzen für eine Reihe gentherapeutischer Anwendungen haben.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Mittel zu liefern, durch welche das Adenovirus gesteuert werden kann, um spezifische Zelltypen zu infizieren.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Mittel zu liefern, durch welche Adenovirus-Proteine verwendet werden können, um Nukleinsäure- oder Proteinübertragung auf eine spezifische Zelle oder den Kern einer spezifischen Zelle zu vermitteln.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Faserprotein des Adenovirus ist genetisch verändert worden, indem am Carboxylende ein Peptidlinker, der ein Zufallsknäuel bildet, angehängt wurde, welcher verwendet werden kann, einen nicht-Adenovirus-Liganden anzufügen, der die Bindungsspezifität des Faserproteins ändert. Beispiele für Liganden umschließen Peptide, die selektiv durch eine Zielzelle gebunden werden, so dass das veränderte Faserprotein durch vom Rezeptor vermittelte Endocytose internalisiert wird, sowie Peptide, die als ein universelles Kopplungsmittel agieren können, zum Beispiel Biotin oder Streptavidin. Der Linker wurde so entworfen, dass er die normale Trimerisierung des Faserproteins nicht beeinflusst, um sterische Hinderung der Bindung des Faserproteins an eine Zielzelle zu vermeiden und um als eine Stelle zur Einführung einer neuen Peptidsequenz zu dienen. Das veränderte Faserprotein wird durch gentechnische Veränderung der Nukleotidsequenz hergestellt, die das Faserprotein codiert, wobei eine neue Sequenz an der den Carboxylschwanz codierenden Region, die den Linker und den Liganden codiert, angefügt wird. Der N-Terminus des Faserproteins wird in der bevorzugten Ausführungsform nicht verändert, obgleich es in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein kann, durch Deletion von auf den Zellkern gerichteten Signalen die Aufnahme des Faserproteins in den Zellkern zu verhindern.
Das veränderte Faserprotein kann als Teil eines rekombinanten Adenovirus zur gentherapeutischen Verwendung eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Schema eines Plasmids pUC2Fm zur Mutagenese des Adenovirus 2 – Fasergens. Spaltstellen für RestriktionsendoNukleasen sind mit ihren Standardabkürzungen dargestellt. Das Fragment der Ad2-Virus-DNA, das das Fasergen codiert, die Nukleotide 30965 bis 33093, wurde durch Ligierung mit glatten Enden in die SmaI-Spaltstelle der pUC119-DNA inseriert, was zu Verlust der DraI-Spaltstelle führte.
2 ist ein Schema des Plasmids pS3-2F, beschrieben von Falkner und Moss (1988), zur Expression von Fasermutanten des Vacciniavirus. Das Fasergen oder Mutanten des Fasergens wurden in die HpaI-Spaltstelle des Plasmids cloniert. Mit „tk" gekennzeichnete Kästen sind DNA-Segmente des Thymidinkinase-Gens von Vaccinia, die Rekombination des Plasmids in das Thymidinkinase-Gen des Vacciniavirus erlauben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Änderung der normalen Bindung des Adenovirus-Faserproteins ist eine Strategie zur Modifikation des normalen Tropismus von rekombinanten Adenoviren. Die vielseitigste und kostengünstigste Strategie zur Modifikation der normalen Adenovirus-Bindung ist, den Knaufabschnitt des Faserproteins gentechnisch zu verändern. Da das Faserprotein ein komplexes Glycoprotein ist, das Anordnung in Trimeren erfordert, würde man bei nicht geeigneter gentechnischer Modifikation des Proteins eine Beeinflussung der Proteinstruktur-Funktion erwarten, die für das reife, trimere Faserprotein erforderlich ist. Die gentechnische Modifikation des Faserproteins wird durch die Verfügbarkeit von Verfahren zur Herstellung von glycosyliertem Protein und Untersuchung der Trimerisierung wesentlich erleichtert. Zusätzlich erleichtert die Entwicklung eines einfach veränderten Abschnittes des Gens, das den Knaufabschnitt des Proteins codiert, analog zu einer Clonierungsstelle in einem Plasmid-Vektor, zukünftige Modifikationen des Knaufproteins wesentlich.
Die gentechnische Modifikation der Adenovirus-Bindung ist ein komplexer Prozess, der erfolgreiches Durchlaufen mehrerer Schritte erfordert.
Der erste Schritt war die Entwicklung eines Verfahrens, um normal glycosyliertes Faserprotein getrennt von dem intakten Adenovirus in Mengen herzustellen, die ausreichend für eine funktionelle Analyse waren. Dieser Schritt ist notwendig, weil das einzelne Gen empfänglicher für die hierin beschriebenen gentechnischen Modifikationen ist und, was wichtig ist, weil Modifikation der ursprünglichen Bindung des Adenovirus die normale Bildung des neuen Virus in Zelllinien beeinflussen kann, die von der normalen Adenovirus-Rezeptor-Bindung abhängig sind. Ein rekombinanter Vacciniavirus-Vektor wurde erfolgreich verwendet, um diesen ersten Schritt zu vollenden. Es zeigte sich, dass dieses System nicht nur zur Herstellung von isoliertem Faserprotein führte, sondern auch Protein erzeugte, welches normal glycosyliert war.
Nach der Entwicklung von Verfahren zur Herstellung des isolierten, normal glycosylierten Faserproteins bestand der nächste Schritt in der Entwicklung von Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit des isolierten Faserproteins, sich in der homotrimeren Form anzuordnen, wie sie bei dem intakten Adenovirus gefunden wird. Dies wurde durch die Entwicklung von monoclonalen Antikörpern erreicht, die für die monomeren oder trimeren Formen des Faserproteins spezifisch waren. Western-Blot-Analyse des Wildtyps und ursprünglicher Proteine, die den geeigneten Antikörpern ausgesetzt wurden, zeigten die Anwesenheit oder das Fehlen der Trimerisierung in den veränderten Faserproteinen. Dies konnte auch mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), basierend auf den Unterschieden im Molekulargewicht zwischen dem Faserprotein-Monomer und -Trimer, durchgeführt werden.
Der dritte Schritt war die Herstellung eines spezifischen Linkers, der drei Ziele vereinbaren sollte:

(a) Funktion als eine Stelle zur Einführung von mehreren Peptid codierenden Sequenzen;
(b) Präsentation der neuen Peptid-Codierungssequenzen in der Weise, dass sterische Hinderung des strukturellen Faserproteins am Knaufabschnitt des Faserproteins vermieden wird; und
(c) keine Beeinflussung der normalen Trimerisierung des Proteins.

Wie nachstehend im Einzelnen beschrieben, wurden diese Ziele durch den Entwurf einer Nukleotidsequenz erreicht, die ein Zufallsknäuel-Peptid codiert, der es jedem beliebigen Liganden ermöglicht, sich jenseits des Endes des Trimer-Komplexes der Faser zu erstrecken. Diese Nukleotidsequenz umfasst auch eine einzelne Stelle für eine RestriktionsendoNuklease zur späteren Einfügung von zusätzlichen Peptidsequenzen, die entweder zur direkten Modifikation der Bindung entworfen wurden oder als Anheftungsstellen für größere Proteine dienten, die nicht direkt in des Faserprotein integriert werden konnten, ohne die Trimerisierung zu stören. Schließlich wurde die Kenntnis der Stellen des Faserproteins, die verändert werden konnten, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, verwendet, um die Stelle zur Insertion des Linkers am Carboxy-Ende des Proteins auszuwählen.
Der vierte Schritt ist die Insertion von Peptid-Codierungssequenzen innerhalb des Linkerpeptides am Carboxyl-Ende des Faserproteins. Die anfänglich ausgewählten Sequenzen umschließen Peptide, die als universelle Stellen zum Anfügen von größeren Proteinen dienen, wie etwa das weithin verfügbare Biotin oder Avidinkonjugierte Protein, und Peptide, die durch Rezeptor-vermittelte Endocytose bei Bindung an der Zelloberfläche internalisiert werden, wie etwa Angiotensin II und Bombesin. Beide Peptidklassen können verwendet werden, um das Adenovirus auf spezifische, nicht adenovirale Rezeptoren neu auszurichten, wonach das Virus durch Rezeptor-vermittelte Endocytose internalisiert wird.
Der letzte Schritt ist die Rückführung des veränderten Faserproteins in ein rekombinantes Adenovirus-Genom und die Herstellung des veränderten Adenovirus, um Eigenschaften der Rezeptorbindung zu untersuchen. Standardtechniken werden verwendet, um das (die) veränderte(n) Fasergen(e) wieder einzufügen und das neue rekombinante Virus herzustellen. Die Rezeptorbindung des veränderten Faserproteins wird anhand von Zelllinien untersucht, deren adenovirale Rezeptor-Bindungseigenschaften bekannt sind.
Die nachstehende genaue Beschreibung und Beispiele zeigen, wie diese Schritte durchgeführt worden sind und das entstandene veränderte Adenovirus-Faserprotein und das Adenovirus, das das veränderte Faserprotein enthält, hergestellt wurden. Wie erwähnt, können unter Verwendung der beschriebenen Techniken und Materialien eine Reihe von Variationen innerhalb jedes einzelnen Schrittes durchgeführt werden, die andere veränderte Faserproteine ergeben können.
Verfahren zur Herstellung des normal glycosylierten Faserproteins, getrennt vom intakten Adenovirus.
Expressionssysteme. Der rekombinante Vacciniavirus-Vektor pTKgpt-3S, beschrieben von Falkner, 1988 J. Virology 62:1849-1854, kann verwendet werden, um das Faserprotein isoliert vom Rest des Adenovirus herzustellen. Dieser Vektor liefert eine herkömmliche Clonierungsstelle für das Faserprotein und umschließt das gpt-Gen von E. coli als eine selektierbare Markierung für das rekombinante Vacciniavirus, das das Adenovirus-Fasergen enthält. Andere rekombinante Vacciniavirus-Vektoren, die verwendet werden können, sind beschrieben worden; zum Beispiel wurde das Faserprotein auch in rekombinanten Vacciniaviren exprimiert, indem der von Fuerst et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126 beschriebene Zwei-Virus-Bakteriophage T7-RNA-Polymerase-Ansatz verwendet wurde. Andere eukaryontische Expressionsvektoren wie etwa rekombinante Retroviren können ebenso verwendet werden, um normal glycosyliertes Faserprotein in ausreichenden Mengen zur funktionellen Untersuchung der Trimerisierung herzustellen.
Auswahl von Faserprotein-Genen des Adenovirus. In den spezifischen, hier beschriebenen Beispielen wurden die Fasergene der menschlichen Adenovirus-Typen 2 und 5 gentechnisch verändert und untersucht. Diese wurden ausgewählt, weil diese beiden Adenovirus-Typen jene sind, die am häufigsten in gentherapeutischen Verabreichungen verwendet werden. Die Fasergensequenzen sind jedoch auch für andere Adenoviren des Menschen beschrieben worden, einschließlich des Typs 3, berichtet von Signäs et al., 1986 Gene 50:173-484, des Typs 4, berichtet von Gruber et al., 1993 Virology 196:603-611, des Typs 7, berichtet von Mullis et al., 1988 Virology 167:545-553, 11 (Mei und Wadell, 1993 Virology 194:453-462), 40 (Kidd et al., 1989 Virology 172:134-144; 1993 Virology 192:73-84) und 41 (Kidd et al., 1990 Virology 179:139-150), deren Lehren spezifisch hierin eingeschlossen sind, und die hierin beschriebenen Verfahren konnten auch für die Modifikation dieser Fasergene der anderen Serotypen verwendet werden.
Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit des isolierten Faserproteins, sich in der homotrimeren Struktur anzuordnen.
Monoclonale Antikörper. Das von Vaccinia hergestellte Faserprotein kann direkt auf Trimerisierung untersucht werden, indem die Western-Blot-Analyse in Verbindung mit monoclonalen Antikörpern verwendet wird, die in der Lage sind, zwischen monomeren und trimeren Formen des Proteins zu unterscheiden. Zwei solche monoclonale Antikörper sind von Hong und Engler, 1991 Virology 185:758-767 beschrieben worden:

1. Antikörper 4D2.5 erkennt das Amino-Ende sowohl der monomeren als auch der trimeren Formen der Ad2-, Ad5- und Ad7-Faser, sowohl auf Western-Blots als auch durch indirekte Immunfluoreszenz.
2. Antikörper 2A6.36 erkennt nur vollständig ausgebildete Fasertrimere von Ad2 und Ad5, indem er ein Epitop zwischen den Aminosäuren 17 und 60 des Proteins erkennt.

Andere Antikörper können, wie von Hong und Engler beschrieben, unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden.
Mit der Verwendung dieser Antikörper kann man Information über die Struktur der Faser oder der Fasermutanten sowohl durch die Western-Blot-Analyse als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erhalten.
SDS-PAGE. Dies konnte auch unter Verwendung von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), basierend auf den Unterschieden der Molekulargewichte zwischen dem Monomer und dem Trimer des Faserproteins, erreicht werden.
Wie erwähnt, ist es bei der Verwendung dieser Verfahren und Antikörper wesentlich, dass die Peptidsequenzen, die an das Ende des offenen Leserahmens des Fasergens angefügt werden, nicht die Sekundärstruktur der Faserproteinmoleküle stören; d.h., sie müssen immer noch Trimere bilden.
Entwurf und Herstellung eines spezifischen Peptidlinkers.
Das Linker-Peptid. Der Abschnitt mit dem Carboxyl-Ende des Faserproteins ist in der Weise verändert, dass er einen Zufallsknäuel-Linker, der die Trimerisierung nicht beeinflusst, einschließt. Eine Peptidsequenz aus zwölf Aminosäuren:
PASASASASPGS (Seq. ID No. 1)
konnte an den C-Terminus angefügt werden, ohne die Bildung des Trimers, die Bindung an die Zelle und den Transport in den Zellkern zu unterbrechen. Wie von Hong und Engler (1991) berichtet, konnte ein Peptidsequenz aus sechs Aminosäuren:
PKRARP (Seq. ID No.3)
an den C-Terminus angefügt werden, ohne die Trimerisierung zu beeinflussen. Die Insertion einer Peptidsequenz aus 27 Aminosäuren:
RIVNLLHVMFQSVYFSIAENFKSFFIQ (Seq. ID No. 4),
welche kein Zufallsknäuel bildete, an der selben Stelle verhinderte die Trimerisierung. Dem zufolge bestehen die allgemeinen Anforderungen für einen Linker darin, dass er die Trimerisierung nicht beeinflussen darf und ein Zufallsknäuel bilden sollte.
Daher liefert die Erfindung in einem ersten Aspekt ein rekombinantes Adenovirus, das einen Peptidlinker aus zwölf Aminosäuren umfasst, der an das Carboxyl-Ende des Faserproteins des Adenovirus angeheftet ist, wobei der Linker bei der Expression in einer Säugerzelle ein Zufallsknäuel bildet und das Faserprotein ein Trimer bildet.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung einer Zelle, das den Schritt der Verabreichung eines Adenovirus an die Zelle umfasst, welches einen Peptidlinker aus zwölf Aminosäuren, angefügt an das Carboxyl-Ende des Faserproteins des Adenovirus, umfasst, wobei der Linker bei der Expression in einer Säugerzelle ein Zufallsknäuel und das Faserprotein ein Trimer bilden.
In noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen, die im Adenovirus exprimiert werden, bestehend aus den Schritten:
Expression dieser Proteine in einem Adenovirus, das einen Peptidlinker aus sechs bis zwölf Aminosäuren umfasst, die an das Carboxyl-Ende des Faserproteins des Adenovirus angefügt sind, wobei der Linker ein Zufallsknäuel und das Faserprotein ein Trimer bilden,
Anheften eines Liganden an jenen Peptidlinker,
Bindung des Adenovirus, welches jenen Liganden trägt, an ein Protein oder eine Nukleinsäure, die an jenen Liganden bindet, wodurch jenes Adenovirus gereinigt wird und
Reinigung jener Proteine von jenem gereinigten Adenovirus.
In noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung darüber hinaus ein gentechnisch verändertes adenovirales Faserprotein, das ein Adenovirus zu einer interessierenden Zelle bringt, umfassend:
ein adenovirales Faserprotein, das am Carboxyl-Ende durch das Anfügen eines Peptidlinkers mit sechs bis zwölf Aminosäuren verändert ist, wobei dieser Linker ein Zufallsknäuel bildet und an einen Liganden gekoppelt ist, der Bindungsspezifität für eine interessierende Zelle aufweist, und wobei dieses Faserprotein ein Trimer bildet, wenn es in einer Zelle exprimiert wird.
Während jede Proteinsequenz, die die beschriebene Anzahl an Aminosäuren aufweist und ein Zufallsknäuel bildet, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnte, wurde eine Modellsequenz:
PASASASASPGS (Seq. ID No. 1)
in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet. Andere Peptid-Codierungssequenzen können auf der Basis von Programmen zur Vorhersage von Proteinstrukturen wie etwa PEPPLOT von der Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin ausgewählt werden. Die Modellsequenz wurde unter Verwendung von PEPPLOT ausgewählt, welches vorhersagte, dass sich wiederholende AS-Motive Zufallsknäuels bilden werden. Das sich wiederholende AS-Motiv sollte auch weder hydrophob, hydrophil noch elektrisch geladen sein, um sicherzustellen, dass diese Proteinsequenz die maximale Flexibilität liefern wird. An jedem Ende der Sequenz wurde ein Prolin eingefügt, um einen Knick in der Proteinsequenz zu bekommen, so dass die Domäne des Zufallsknäuels sowohl von den Fasersequenzen als auch von den nachfolgend angefügten Liganden getrennt sein würde.
Stelle zum Anfügen des Linkers. Die spezifische Stelle zum Anfügen des Oligonukleotids, das das Zufallsknäuel codiert, wurde auf Grund von ausgedehnten Versuchen bestimmt. Wie in Beispiel 2 im Einzelnen beschrieben, wird der Linker am Carboxyl-Ende des Faserproteins eingefügt.
Insertion von Peptid codierenden Sequenzen innerhalb des Linkerpeptids.
Insertion in den Linker. Eine beliebige Anzahl von Proteinliganden kann am Ende oder innerhalb des Peptidlinkers inseriert werden. Diese werden angefügt, indem eine Nukleinsäuresequenz, die den Liganden codiert, in eine geeignete Restriktionsstelle innerhalb oder am Ende der Sequenz, die den Linker codiert, inseriert wird.
Liganden. Der Linker wird an einen Proteinliganden gekoppelt, der für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sein kann oder als ein universellerer Koppler dient. Beispiele für spezifische Liganden umschließen jedes Molekül, das an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor bindet, der nicht der natürliche Rezeptor für das Faserprotein des Adenovirus ist, zum Beispiel ein Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)-Peptid, und Antikörper und Antikörper-Fragmente. Beispiele für universelle Koppler umschließen Biotin und Avidin bindende Proteine, die verwendet werden können, um andere Proteine an das Faserprotein zu „koppeln", die selbständig an eine angezielte Zelle binden können oder nicht binden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform dienen die Sequenzen des Liganden-Proteins als eine Anheftungsstelle für Avidin- oder Biotin-gebundene Proteine. Peptidsequenzen, die kritisch für die Biotin-Avidin (Streptavidin) -Bindung sind, sind von Saggio und Laufer, Biochem. J. 1993 293:613-616, Alon 1993 Eur. J. Immunol. 23:893-898, und Hiller, et al., 1991 Biochem. J. 278:573-585 beschrieben worden. Eine käuflich zu erwerbende Nukleinsäure, die ein Streptavidin bindendes Peptid (Strept-tag^TM) codiert, wird von Biometra, Göttingen, Deutschland, verkauft.
Diese Sequenzen sind besonders nützlich bei der bequemen Anheftung von Proteinen, die für die Neuausrichtung der Adenovirus-Bindung nützlich sind und monoclonale Antikörper und spezifische Liganden für Zelloberflächenrezeptoren umschließen könnten, die zu groß sind, um sie bequem über gentechnische Veränderung des Faserproteins und Linkers inserieren zu können. Es ist ebenfalls möglich, Markierungsproteine an diesen Stellen anzuheften, mit denen Verteilung und Metabolismus des Adenovirus, das intakten Organismen verabreicht worden ist, überwacht werden können. Die Bindungsstellen könnten auch verwendet werden, um das Adenovirus oder Bestandteile des Adenovirus aus komplexen Proteingemischen zu isolieren.
Andere Oligopeptidsequenzen mit Peptid bindenden Domänen könnten ebenfalls verwendet werden, wie etwa die Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)-Sequenz, die an Vitronectin bindet, beschrieben von Cherny, et al., 1993 J. Biol. Chem. 268 (13):9725-9729, das RGDS nachahmende Peptid in Streptavidin, Arginin-Tyrosin-Asparaginsäure-Serin (RYDS), beschrieben von Alon, et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23:893-898 oder andere, die bestimmt wurden, wie von Kay, et al., 1993 Gene 128:59-65 beschrieben worden ist.
Andere Beispiele für Liganden, die mit dem Faserprotein verbunden werden können, schließen jene ein, die bei Bindung an den verwandten Rezeptor durch Rezeptorvermittelte Endocytose internalisiert werden. Der Grund ist, dass das Virus zusammen mit dem Liganden internalisiert wird. Beispiele für Peptide, die durch Rezeptor-vermittelte Endocytose nach Bindung eines Zelloberflächenrezeptors internalisiert werden, sind die Peptide Angiotensin II und Gastrin freisetzendes Peptid, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden.
Es können jedoch auch andere Liganden, die nicht durch Rezeptor-vermittelte Endocytose internalisiert werden, verwendet werden, um Adenovirus-vermittelten Gentransfer zu spezifischen Zelltypen zu erreichen. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass Lektine verwendet werden können, um das Adenovirus auf Zelltypen mit hoher Konzentration des entsprechenden Rezeptors hin zu steuern, Batra, 1993, obwohl die Lektine bei Bindung an die Zelloberfläche selbst nicht internalisiert werden.
Expression des veränderten Faserproteins. Nach gentechnischer Modifikation des Faserproteins zur Herstellung eines veränderten Faserproteins einschließlich eines Linkers oder eines Linker-Liganden wird das veränderte Faserprotein auf Trimer-Bildung, wie vorstehend beschrieben, und auf Bindung an den Zielzelltyp durchmustert. Durchmusterung auf Trimer-Bildung kann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung eines Vaccinia-Expressionssystems oder verpackt mit rekombinantem Adenovirus erfolgen. In der bevorzugten Ausführungsform wird das veränderte Faserprotein in Säugerzellen exprimiert. Expression der Faser unter Verwendung eines rekombinanten Baculovirus in Insektenzellen ist nicht bevorzugt, da Daten im Vorfeld nahe legen, dass die Faser, die in Insektenzellen synthetisiert wurde, unterglycosyliert war. Die kann auch bei Hefe der Fall sein.
Bindung des veränderten Faserproteins kann unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden, zum Beispiel durch Radiomarkierung des Virus, Anfügen des Virus an Zellen, Inkubation, Auswaschen von nicht gebundenem Virus und Messen der an Zellen gebundenen Radioaktivität oder Infizieren der Zellen mit rekombinantem Virus einschließlich des veränderten Faserproteins, indem ein bekannter Virustiter und dann ein cytopathischer Test verwendet werden, um auf Lysis zu durchmustern (nur Zellen, an die das Virus bindet, können infiziert werden; Infektion mit Adenovirus führt zum Zelltod).
Verpackung in rekombinanten Adenovirus. Das veränderte Faserproteingen wird unter Verwendung von Standardtechniken mit rekombinantem Adenovirus verpackt. Allgemein werden Adenovirus-Gene, die nicht das Gen für das Faserprotein sind, mit dem Gen vermischt, welches das veränderte Faserprotein codiert, und zusammen in Zellen transduziert. Es gibt viele Verfahren zur Transduktion von Zellen mit viralem Material, welche Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel Gene transfer and expression: a laboratory manual Kriegler M. 242 S. (W.H. Freeman, NY 1991) und Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1994, Ausubel F.M., et al., Abschnitt „Introduction of DNA into Mammalian Cells" S. 9.0.1-9.17.2 (John Wiley & Sons). In einem bevorzugten Beispiel für einen Transduktions-Enhancer werden kationische Lipide, welche gewöhnlich veränderte Phospholipide sind, um eine positive Ladung zu erhalten, zur Transduktion des Ersten und Zweiten verwendet. Eine Reihe von Lipidverbindungen, deren Wirksamkeit für die Transduktion von Nukleinsäuren gezeigt worden ist, zum Beispiel das kationische Lipid N-[1-(2, 3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP), kann verwendet werden. Die Ausgangslösung, die von Boehringer Mannheim käuflich zu erwerben ist, wird dreifach mit HEPES gepufferter Kochsalzlösung verdünnt und wird mit DNA zu 50 ng/μl vermischt. Das typische Mischungsverhältnis von Lipid zu DNA (Gewicht:Gewicht) beträgt 6:1, jedoch können andere Mischungsverhältnisse bessere Ergebnisse erzielen, wie durch empirische Versuche bestimmt werden konnte. Nachdem der DNA und dem Lipid über 10 Minuten gestattet worden war, sich zu verbinden, wurden die Lipid-DNA-Komplexe den Zielzellen verabreicht. Die genauen Bedingungen für die gemeinsame Transduktion können von Fachleuten auf dem Gebiet mit Hilfe der hier gelieferten Lehren leicht erstellt werden.
Das verpackte rekombinante Adenovirus-Genom, welches das das veränderte Faserprotein codierende Gen enthält, wird dann auf die Rezeptorbindungseigenschaften und Nützlichkeit für die Gentherapie untersucht, wie vorstehend beschrieben. Obgleich jedes beliebige System, einschließlich sowohl des Vacciniavirus-Expressionssystems als auch des rekombinanten Adenovirus, zur Durchmusterung auf die Bindungseigenschaften des veränderten Faserproteins verwendet werden kann, wird bevorzugt, das rekombinante Adenovirus zur Gentherapie zu verwenden.
Addition von Genen zur Gentherapie. „Gentherapie" bezeichnet die Behandlung von pathologischen Bedingungen durch die Zugabe von exogenen Nukleinsäuren zu geeigneten Zellen innerhalb des Organismus. Nukleinsäuren müssen in der Weise den Zellen zugefügt oder in diese transduziert werden, dass sie innerhalb der Zelle funktionsfähig bleiben. Für die meisten Gentherapiestrategien werden die neuen Nukleinsäuren so entworfen, dass sie als neue Gene funktionieren, d.h. neue Boten-RNA codieren, welche wiederum neues Protein codiert. Wie ursprünglich konzipiert, wurde Gentherapie gegen monogenetische Fehlfunktionen wie Adenosin-Desaminase-Defekt und cystische Fibrose eingesetzt. Es ist deutlich klar geworden, dass Gentherapie auch bei polygenetischen, somatischen Fehlfunktionen wie Krebserkrankungen hilfreich sein kann. Nukleinsäuren, die für die Gentherapie von Nutzen sein können, umschließen jene, die Proteine codieren, welche zur Identifikation von Zellen verwendet werden, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind, jene, die Proteine codieren, deren Aufgabe es ist, Zellen, die das virale Genom enthalten, zu töten oder die therapeutische Proteine codieren, welche dazu dienen, einen pathophysiologischen Zustand innerhalb des Körpers zu behandeln.
Die Sequenzen, die viele dieser Proteine codieren, sind bekannt und in der Literatur veröffentlicht. Repräsentative Markierungsgene umschließen jene, die in den nachstehenden Beispielen genau beschrieben sind, einschließlich eines Enzyms wie etwa β-Galactosidase und Proteine, die Resistenz gegen oder Empfindlichkeit auf Antibiotika übertragen. Andere Beispiele umschließen sowohl Proteine, die abnormale Proteine verstärken oder unterdrücken, als auch jene, die toxisch oder zerstörerisch für abnormale Zellen innerhalb des Körpers sind. Ein Beispiel für Letztere ist das Thymidin-Kinase-Gen des Herpes simplex-Virus. Die Zugabe von Ganciclovir zu Zellen, die dieses Gen exprimieren, führt zum Tod der Zelle. Noch andere sind jene, die bei dem zu behandelnden Patienten defekt sind oder fehlen, zum Beispiel kann das Transmembran-Regulatorgen bei cystischer Fibrose („CFTR") Zellen zugegeben werden, die mutiertes CFTR beinhalten, was Korrektur des durch das mutierte CFTR-Gen verursachten Ionentransportdefektes zur Folge hat. Beispiele für andere Gene, die zur Zeit auf die Verwendung in der Gentherapie untersucht werden, umschließen Adenosin-Desaminase, Insulin, Koagulationsfaktoren wie etwa Faktor VIII und Glycogen abbauende Enzyme.
Obwohl die Sequenzen, die in das rekombinante Virus inkorporiert werden, typischerweise Nukleinsäuren, die Proteine codieren, sein werden, können auch die Sequenzen selbst biologisch aktiv sein. Viele Beispiele für solche Sequenzen sind bekannt, zum Beispiel Antisense und Ribozym. Soweit es nicht ausdrücklich anders erwähnt ist, codieren die Gene therapeutische Moleküle einschließlich biologisch aktiver Nukleinsäuren, Nukleinsäuren, die biologisch aktive Proteine codieren, und Nukleinsäuren, die Proteine codieren, die für die Herstellung von biologisch aktiven Molekülen von Interesse, ob es sich um Proteine oder andere Molekültypen handelt, verantwortlich sind.
Zum Beispiel könnte für die Verwendung in der Gentherapie beim Menschen eine der viralen Nukleinsäurekonstruktionen so verändert werden, dass sie ein „Suizid-Gen" enthalten, so dass die Virus produzierenden Zellen wie gewünscht eliminiert werden können. Als ein spezifisches Beispiel könnte das virale Genom die Codierungssequenz für die Thymidin-Kinase des Herpes-simplex-Virus einschließen. Es ist gut dokumentiert, dass Zellen, die das virale Thymidin-Kinase-Genprodukt exprimieren, durch Behandlung mit dem antiviralen Agens Ganciclovir eliminiert werden können (Moolten 1986, Cancer Research 46:5276). Auf diese Weise würden die Virus produzierenden Zellen durch systemische Verabreichung von durch die FDA zugelassenem Ganciclovir eliminiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden nicht limitierenden Beispiele weiter erläutert. Die Lehren der hierin beschriebenen Referenzen sind ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen, soweit sie die Durchführbarkeit des beanspruchten Gegenstandes betreffen.
Beispiel 1: Herstellung von nutzbaren Mengen von glycosylierten Wildtyp- und mutierten Faserproteinen.
a. Präparation von Ad2- und Ad5- Fasergenen für Clonierung und Mutagenese.
Adenovirus-DNA wurde von Adenovirus-Vironen gereinigt, die durch CsCl-Bandierung von Zelllysaten von infizierten HeLa-Zellen gereinigt worden waren. Die DNA wurde durch Behandlung mit 0,5% SDS und 1 mg/ml Proteinase K über 1 Stunde bei 37°C mit anschließender Phenol-Extraktion von den gereinigten Virionen freigesetzt. Ein DraI-SmaI-RestriktionsendoNuklease-Spaltprodukt (welches die Ad2-Nukleotide 30965 bis 33093 enthielt, erhältlich bei der Genbank der National Library of Medicine, National Institutes of Health, File ADRCG.viral) wurde auf einem Agarose-Gel gereinigt, durch Elektrophorese auf DEAE-Membran extrahiert und in den Vektor pUC119 an der SmaI-Restriktionsspaltstelle in den Polylinker cloniert. Einzelstrang-DNA, die das Fasergen enthielt, wurde hergestellt, indem Bakterien, die dieses Plasmid enthielten, mit einem M13-Helferphagen (K07, Stratagene San Diego, CA) infiziert wurden und die erhaltene Phagen-DNA nach den Angaben des Herstellers isoliert wurde. Stellengerichtete Mutagenese (Zoller und Smith, 1983) mit dem Oligonukleotid
GGCGCGTTTCATGGTACCTGCAACAA 3' (Seq. ID No. 2)
wurde verwendet, um eine Spaltstelle für die KpnI-RestriktionsendoNuklease am Nukleotid 31024 zu schaffen, so dass das entstandene Fragment durch Spaltung mit KpnI (oder seinem Isoschizomer Asp718) durch Spaltung an der neu geschaffenen KpnI-Stelle zu Beginn des offenen Leserahmens des Fasergens und an einer KpnI-Spaltstelle im Polylinker von pUC119 hinter dem 5'-Ende des Fasergens entfernt werden konnte. Die richtige Mutante wurde durch DNA-Sequenzierung der Plasmid-DNA und durch die Restriktionsendonuklease-Spaltungsmuster nach Spaltung mit KpnI oder mit Asp718, welche ein 2075 Basenpaare großes Fragment ergab, das auf einem Agarose-Gel identifiziert werden konnte, verifiziert.
b. Präparation von mutierten Fasergenen:
Einer der Vorteile der Clonierung der Ad2- und der Ad5-Fasergene in pUC119 besteht darin, dass die stellengerichtete Mutagenese, beschrieben von Zoller und Smith, 1983, „Oligonukleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" in Methods in Enzymology, R. Wu, L. Grossman und K. Moldave, Hrsg., Bd. 100, S. 468-500 (Academic Press, New York), leicht durchgeführt werden kann, indem Einzelstrang-DNA verwendet wird, die, wie vorstehend beschrieben, zur Schaffung der Spaltstelle für die KpnI-RestriktionsendoNuklease am Nukleotid 31024 hergestellt wird, wie es zur Schaffung einer Vielzahl von Mutanten mit sich unterscheidenden Faser-Phänotypen durchgeführt worden ist.
c. Expression von Wildtyp- und mutierten Fasergenen:
Ein Vacciniavirus-Expressionssystem ist verwendet worden, um veränderte Faserproteine des Wildtyps zu exprimieren (Hong und Engler, 1991). Die Fasergene der Adenovirus-Serotypen 2 (31030 bis 32778) und 5 wurden von dem Plasmid pUC119 durch Spaltung mit Asp718 entfernt (Vieira und Messing, 1987 „Production of single-stranded plasmid DNA". In Methods in Enzymology, R. Wu und L. Grossman, Hrsg., 1987, Bd. 153, S. 3-11 (Academic Press, San Diego); um glatte DNA-Enden zum Clonieren zu erhalten, wurde die DNA mit einem Gemisch aus den vier Desoxyribonukleotid-Triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli über 15 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt. Jedes DNA-Fragment wurde dann in die Spaltstelle der HpaI-Restrictionsendonuklease in einen Expressionsvektor ligiert (pTKgpt-3S; Falkner und Moss, 1988, J. Virology 62:1849-1854). Bei Insertion in diese Stelle des Plasmids befindet sich die Expression des Fasergens unter der Kontrolle des p11-Promotors, eines Promotors, der zu einem späten Zeitpunkt der Infektion am aktivsten transkribiert wird. Ein Vorteil dieses Vektors besteht darin, dass er die Insertion der Fasergen-Sequenzen durch Rekombination in das Thymidin-Kinase-Gen des Wildtyp-Vacciniavirus gestattete; ein zweiter Vorteil besteht in der Fähigkeit der Verwendung der positiven Selektion mit dem gpt-Gen von E. coli, um rekombinante Viren, die das Fasergen enthalten, anzureichern.
Plaques, die nach zwei Runden der Plaque-Reinigung übrig blieben, wurden vermehrt und durch Infektion von HeLa-Zellen auf die Herstellung von Faserprotein untersucht; Lysate aus diesen infizierten Zellen wurden auf die Expression von Faserprotein auf einem Western-Blot untersucht, der mit einem monoclonalen Antikörper, der Faser-Monomere und -Trimere erkannte, entwickelt wurde.
Alternativ konnten sie unter Verwendung von SDS-PAGE auf die Anwesenheit von Monomeren oder Trimeren durchmustert werden, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, da Monomere mit einem Molekulargewicht von 62.000 Dalton und Trimere mit einem Molekulargewicht von 180.000 Dalton wandern.
Mehrere rekombinante Vacciniaviren, die große Mengen des Faserproteins exprimierten, wurden durch dieses Vorgehen gewonnen. Das Protein, das von diesen rekombinanten Viren hergestellt wurde, stimmte mit jenem überein, das aus der Infektion mit Adenovirus erhalten wurde, beurteilt nach den nachstehenden Kriterien:

1. Reaktivität auf monoclonale und polyclonale Antikörper, die Fasermonomere und -trimere erkennen (sowohl auf Western-Blots als auch durch Immunfällung).
2. Post-translationale Anheftung von O-verbundenem N-Acetylglucosamin an das Protein (gemessen durch Reaktivität auf einen für Kohlenhydrat spezifischen Antikörper [RL-2; Holt et al. „1987 J. Cell Biol. 104:1157-1164; Mullis et al., 1990 J. Virol. 64:5317-5323, welcher durch Dr. Larry Gerace, Univ. of California in San Diego weite Verbreitung erfuhr] und zur Markierung mit Galactosyltransferase und UDP-[¹⁴C]-Galactose vom Rind).
3. Reaktivität auf einem Western-Blot, entwickelt mit einem monoclonalen Antikörper [wie etwa 2A6], der nur korrekt gefaltete Ad2- und Ad5-Fasertrimere erkennt.
4. Stabilität des Proteins, zum Beispiel gemessen mit Puls-Chase-Experimenten.

Proben von Faser- oder mutierten Faserproteinen, die zusätzliche sechs (PKRARP) (Seq. ID No. 3) oder 27
RIVNLLHVMFQSVYFSIAENFKSFFIQ (Seq. ID No. 4)
Aminosäuren enthielten, wurden auf 8% SDS-Polyacrylamid-Gele gegeben. Die Proben wurden entweder vor dem Auftrag in 2% SDS bei 100 °C über 3 Minuten gekocht (reduziert) oder bei Zimmertemperatur in Pufferlösung belassen, die 0,1% SDS enthielt (nicht reduziert). Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose überführt, und die Blots wurden mit einem Antikörper entwickelt, der für Fasermonomere und -trimere spezifisch war.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Fasermutanten mit der Insertion der sechs Aminosäuren Trimere bildeten; die Fasermutanten mit der Insertion der 27 Aminosäuren taten das nicht.
Indirekte Immunfluoreszenz wurde ebenfalls verwendet, um die Bildung von Trimeren nachzuweisen. Hela-Zellen, die mit dem rekombinanten Vacciniavirus infiziert waren, das das Fasergen mit der Insertion der 27 Aminosäuren am C-Terminus enthielt, wurden 24 Stunden nach der Infektion fixiert und die Anwesenheit von Fasermonomeren und -trimeren wurde mit monoclonalen Antikörpern nachgewiesen, die für diese Formen spezifisch waren. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Immunfluoreszenz mit monoclonalen Antikörpern, die entweder Monomere oder Trimere erkennen, besteht, es aber keine Immunfluoreszenz mit monoclonalen Antikörpern gibt, die nur Trimere des Faserproteins erkennen.
Beispiel 2: Herstellung von funktionalem Faserprotein, das einen Linker am Carboxyl-Ende enthält und weiterhin funktionale Faserprotein-Trimere bildet.
Verfahren:
Das Fasergen vom Adenovirus Typ 5 wurde durch stellengerichtete Mutagenese mutiert, um 30 zusätzliche Nukleotide an das Ende des offenen Leserahmens der Faser anzufügen. Ein Oligonukleotid
(oligo 6796 5'
CAAACGATTC TTATTAGGAT CCAGGGGCGG AAGCAGATGC
GGAGGCTGAT GGTTCTTGGG CAATGTAT 3') (Seq. ID No. 5)
wurde zur stellengerichteten Mutagenese des Ad5-Fasergens verwendet, das in pUC119 cloniert war. Dieses Oligonukleotid wurde entworfen, um die Nukleotide, die das Peptid
PASASASASPGS (Seq. ID No. 1)
codieren, an das Ende des offenen Leserahmens des Fasergens anzufügen. Dieses hinzugefügte Segment umfasste eine Spaltstelle für BamHI-RestriktionsendoNuklease am 3'-Ende; diese wurde anschließend zu Insertion neuer Liganden verwendet, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Insertion dieses zusätzlichen DNA-Segments wurde durch DNA-Sequenzierung der Plasmid-DNA bestätigt.
Das mutierte DNA-Segment wurde aus dem Plasmid durch Spaltung mit Asp718 entfernt, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli glatt gemacht (wie vorstehend beschrieben) und es wurden in die HpaI-Spaltstelle in das Vektorplasmid pTKgpt-3S cloniert. Rekombinante Vacciniaviren, die dieses mutierte Faserprotein exprimierten, wurden isoliert und unter Verwendung von HeLa-Zellen plaque-gereinigt. Die durch sie exprimierten Faserproteine wurden charakterisiert und, wie vorstehend beschrieben, mit dem Protein des Wildtyps verglichen.
Ergebnisse. Die erzeugten mutierten Proteine schienen nicht zu unterscheiden zu sein, basierend auf

1. scheinbarem Molekulargewicht auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelen und
2. Fähigkeit, auf Western-Blots durch monoclonale Antikörper erkannt zu werden, die Fasermonomere erkennen (4D2) und die richtig gefaltete Trimere erkennen (2A6).

Beispiel 3: Einführung von neuen Liganden-Spezifitäten in den Faserknauf.
Verfahren: Kurze DNA-Segmente, die neue Liganden-Spezifitäten umfassten, wurden aus synthetischen DNA-Oligonukleotiden konstruiert. Die für die Untersuchung ausgewählten Liganden-Spezifitäten waren eine Streptavidin-Imitation (Seq. ID No. 6 Aminosäure; Seq. ID No. 7 Nukleotid), eine Biotin-Imitation (Seq. ID No. 8 Aminosäure; Seq. ID No. 9 Nukleotid), Angiotensin 2 (Seq. ID No. 10 Aminosäure; Seq. ID No. 11 Nukleotid) und Bombesin (Gastrin freisetzendes Peptid) (Seq. ID No. 12 Aminosäure; Seq. ID No. 13 Nukleotid).
Diese Oligonukleotide wurden mit kohäsiven BamHI-Enden entworfen, die in die BamHI-Spaltstelle, welche in Beispiel 2 entwickelt worden war, cloniert werden konnten. Die spezifische Aminosäuresequenz, die in Beispiel 2 an die Faser angefügt worden war, wurde entworfen, um den neuen Liganden vom Körper des Faserproteins entfernt zu halten, was seine Zugänglichkeit zum neuen Rezeptormolekül erhöhte. Das erhaltene veränderte Faserprotein beinhaltete einen Linker und einen Liganden und bildete immer noch ein Trimer.
Dieses Beispiel zeigt, dass nicht virale Liganden an das Carboxyl-Ende des Faserproteins über einen Peptidlinker durch Expression einer gentechnisch veränderten Nukleinsequenz, die das Faserprotein, den Linker und den Liganden codiert, angefügt werden können.

Claims

Rekombinantes Adenovirus, umfassend einen Peptidlinker mit zwölf Aminosäuren, der an das Carboxylende des Faserproteins des Adenovirus angefügt ist, wobei bei Expression in einer Säugerzelle der Linker ein Zufallsknäuel und das Faserprotein ein Trimer bildet.
Rekombinantes Adenovirus nach Anspruch 1, wobei das Faserprotein außerdem einen an den Linker gekoppelten Liganden umfasst.
Rekombinantes Adenovirus nach Anspruch 2, wobei der Ligand aus der Gruppe, bestehend aus einem Liganden, der spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor bindet, und Kopplungsliganden, die zum Koppeln anderer Proteine oder Nukleinsäuremoleküle verwendet werden können, ausgewählt ist.
Rekombinantes Adenovirus nach Anspruch 3, wobei der Kopplungsligand aus der Gruppe, bestehend aus Avidinbindungsproteinen, Biotinbindungsproteinen, von Avidin gebundenen Proteinen, von Biotin gebundenen Proteinen und Antikörperproteinen und Fragmenten davon, ausgewählt ist.
Rekombinantes Adenovirus nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das den Liganden umfassende Faserprotein spezifisch an einen Zielzelltyp bindet.
Rekombinantes Adenovirus nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das den Liganden umfassende Faserprotein nicht an einen spezifischen Zielzelltyp bindet.
Rekombinantes Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Linkerpeptid PASASASASPGS ist.
Rekombinantes Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der außerdem Gene umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus Markerproteinen codierenden Genen, Genen zur Gentherapie und Genen, die in mit dem Adenovirus infizierten Zellen einen Zelltod hervorrufen, ausgewählt sind.
In-Vitro-Verfahren zur gentechnischen Veränderung einer Zelle, welches den Schritt des Verabreichens eines Adenovirus an eine Zelle umfasst, wobei das Adenovirus einen Peptidlinker mit zwölf Aminosäuren umfasst, der an das Carboxylende des Faserproteins des Adenovirus angefügt ist, wobei bei Expression in einer Säugerzelle der Linker ein Zufallsknäuel und das Faserprotein ein Trimer bildet.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Faserprotein außerdem einen an den Linker gekoppelten Liganden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Ligand aus der Gruppe, bestehend aus Liganden, die spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor binden, und Liganden, die zur Kopplung anderer Proteine oder Nukleinsäuremoleküle verwendet werden können, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Kopplungsligand aus der Gruppe, bestehend aus Avidinbindungsproteinen, Biotinbindungsproteinen, von Avidin gebundenen Proteinen, von Biotin gebundenen Proteinen und Antikörperproteinen und Fragmenten davon, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Adenovirus außerdem Gene umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus Markerproteinen codierenden Genen, Genen zur Gentherapie und Genen, die in mit dem Adenovirus infizierten Zellen einen Zelltod hervorrufen, ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, das außerdem das Verabreichen von Proteinen oder Nukleinsäuren, die an die Kopplungsliganden binden, zusammen mit dem Virus umfasst.
Verfahren zur Reinigung von in Adenoviren exprimierten Proteinen, umfassend die Schritte: Exprimieren der Proteine in einem Adenovirus, das einen Peptidlinker mit sechs bis zwölf Aminosäuren umfasst, die an das Carboxylende des Faserproteins des Adenovirus angefügt sind, wobei der Linker ein Zufallsknäuel und das Faserprotein ein Trimer bildet, Anfügen eines Liganden an den Peptidlinker, Binden des den Liganden aufweisenden Adenovirus an ein Protein oder eine Nukleinsäure, das/die an den Liganden bindet, wodurch das Adenovirus gereinigt wird, und Reinigen der Proteine aus dem gereinigten Adenovirus.
Genetisch verändertes adenovirales Faserprotein, das ein Adenovirus auf eine interessierende Zelle richtet, umfassend ein adenovirales Faserprotein, das am Carboxylende durch Anfügung eines Peptidlinkers mit sechs bis zwölf Aminosäuren modifiziert ist, wobei der Linker ein Zufallsknäuel bildet und mit einem Liganden gekoppelt ist, der eine Bindungsspezifität für eine interessierende Zelle aufweist, und wobei das Faserprotein bei Expression in einer Zelle ein Trimer bildet.
Genetisch verändertes adenovirales Faserprotein nach Anspruch 16, wobei der Ligand spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor bindet.
Genetisch verändertes adenovirales Faserprotein nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei der Peptidlinker die in Seq. ID No: 1 oder 3 gezeigte Sequenz aufweist.
Genetisch verändertes adenovirales Faserprotein nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das adenovirale Faserprotein aus der Gruppe, bestehend aus humanem Adenovirus-Typ-2-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-3-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-4-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-5-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-7-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-11-Faserprotein, humanem Adenovirus-Typ-40-Faserprotein und humanem Adenovirus-Typ-41-Faserprotein, ausgewählt ist.
Genetisch verändertes adenovirales Faserprotein, das ein Adenovirus auf eine interessierende Zelle richtet, umfassend ein am Carboxylende durch Anfügung eines Peptidlinkers mit der Aminosäuresequenz PASASASASPGS modifiziertes, adenovirales Faserprotein, wobei der Linker an einen Liganden gekoppelt ist, der eine Bindungsspezifität für eine interessierende Zelle aufweist, und wobei das Protein bei Expression in einer Zelle ein Trimer bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Peptidlinker PASASASASPGS ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Peptidlinker PASASASASPGS oder PKRARP ist.