DE69637393T2 - Vektoren und methoden zum gentransfer in zellen - Google Patents

Vektoren und methoden zum gentransfer in zellen Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Adenovirus-Kapsidprotein, welches in der Lage ist, einen Zelleintritt eines Vektors zu dirigieren, welcher das Kapsidprotein umfasst, welcher effizienter ist als ein ähnlicher Vektor, der ein Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein aufweist. Ein derartiges chimäres Kapsidprotein ist ein Fiber-, Hexon- oder Penton-Protein. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten Vektor, welcher ein derartiges chimäres adenovirales Kapsidprotein umfasst, und Verfahren zur Konstruktion und Verwendung eines derartigen Vektors.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Adenoviren gehören zur Familie der Adenoviridae, die in zwei Genera eingeteilt ist, namentlich Mastadenovirus und Aviadenovirus. Adenoviren sind unbehüllte regelmäßige Ikosaeder mit einem Durchmesser von ca. 65 bis 80 nm (Horne et al., J. Mol. Biol., 1, 84–86 (1959)). Das adenovirale Kapsid besteht aus 252 Capsomeren, von denen 240 Hexone und 12 Pentone sind (Ginsberg et al., Virology, 28, 782–783 (1966)). Die Hexone und Pentone leiten sich von drei verschiedenen viralen Polypeptiden ab (Maizel et al., Virology, 36, 115–125 (1968); Weber et al., Virology, 76, 709–724 (1977)). Das Hexon umfasst drei identische Polypeptide von jeweils 967 Aminosäuren, namentlich Polypeptid II (Roberts et al., Science, 232, 1148–1151 (1986)). Das Penton enthält eine Pentonbasis, die an das Kapsid gebunden ist, und eine Fiber, welche nicht-kovalent an die Pentonbasis gebunden ist und von derselben hervorragt. Das Fiberprotein umfasst drei identische Polypeptide von jeweils 582 Aminosäuren, namentlich Polypeptid IV. Das Pentonbasis-Protein von Adenovirus Serotyp 2 (Ad2) ist ein ringförmiger Komplex, bestehend aus fünf identischen Proteinuntereinheiten von jeweils 571 Aminosäuren, namentlich Polypeptid III (Boudin et al., Virology, 92, 125–138 (1979)). Ferner sind die die Proteine IX, VI und IIIa in dem adenoviralen Kapsid präsent, und von ihnen wird angenommen, dass sie das virale Kapsid stabilisieren (Stewart et al., Cell, 67, 145–154 (1991); Stewart et al., EMBO J., 12(7), 2589–2599 (1993)).
  • Wenn ein Adenovirus einmal an eine Zelle angeheftet ist, durchläuft es Rezeptor-vermittelte Internalisierung in Clathrin-"coated" endocytische Vesikel der Zelle (Svennson et al., J. Virol., 51, 687–694 (1984); Chardonnet et al., Virology, 40, 462–477 (1970)). In die Zelle eintretende Virionen erfahren eine schrittweise Zerlegung, wobei viele der viralen strukturellen Proteine abgeworfen werden (Greber et al., Cell, 75, 477–486 (1993)). Während des "Uncoating"-Prozesses verursachen die viralen Partikel ein Aufbrechen des Zellendosoms durch einen pH-abhängigen Mechanismus (Fitzgerald et al., Cell, 32, 607–617 (1983)), der noch schlecht verstanden ist. Die viralen Partikel werden dann zu dem Kernporenkomplex der Zelle transportiert (Dales et al., Virology, 56, 465–483 (1973)), wo das virale Genom in den Kern eintritt und somit die Infektion initiiert.
  • Ein Adenovirus verwendet zwei separate Zellrezeptoren, die beide präsent sein müssen, um effiziente Anheftung und Infektion einer Zelle zu erzielen (Wickham et al., Cell, 73, 309–319 (1993)). Als Erstes heftet das Ad2-Fiberprotein das Virus an eine Zelle durch Bindung an einen bisher noch unidentifizierten Rezeptor. Sodann bindet die Pentonbasis an αv-Integrine, die eine Familie von heterodimeren Zelloberflächenrezeptoren sind, welche zelluläre Adhäsion an die extrazellulären Matrixmoleküle sowie andere Moleküle vermitteln (Hynes, Cell, 69, 11–25 (1992)).
  • Das Fiberprotein ist ein Trimer (Devaux et al., J. Molec. Biol., 215, 567–588 (1990)), bestehend aus einem Schwanz, einem Schaft und einem Knob. Die Fiber-Schaftregion setzt sich zusammen aus wiederholten 15-Aminosäuren-Motiven, von denen man annimmt, dass sie zwei alternierende β-Stränge und β-Biegungen bilden (Green et al., EMBO J., 2, 1357–1365 (1983)). Die Gesamtlänge der Fiber-Schaftregion und die Zahl von 15-Aminosäuren-Repeats variieren zwischen adenoviralen Serotypen. So ist zum Beispiel der Ad2-Fiber-Schaft 37 nm lang und enthält 22 Repeats, während die Ad3-Fiber 11 nm lang ist und 6 Repeats enthält. Die Rezeptor-Bindungsdomäne des Fiberproteins ist in der Knob-Region lokalisiert, welche von den letzten 200 Aminosäuren des Proteins codiert wird (Henry et al., J. Virology, 68(8), 5239–5246 (1994)). Die zur Trimerisierung erforderlichen Regionen sind ebenfalls in der Knob-Region des Proteins lokalisiert (Henry et al. (1994), supra). Ein Deletionsmutant, dem die letzten 40 Aminosäuren fehlen, trimerisiert nicht und bindet auch nicht an Pentonbasis (Novelli et al., Virology, 185, 365–376 (1991)). Die Trimerisierung des Fiberproteins ist also notwendig für die Pentonbasis-Bindung. Kernlokalisationssignale, welche das Protein in den Kern dirigieren, um nach seiner Synthese im Cytoplasma virale Partikel zu bilden, sind in der N-terminalen Region des Proteins lokalisiert (Novelli et al. (1991), supra). Die Fiber und das Hexon bilden zusammen die Haupt-Antigendeterminanten des Virus und bestimmen ferner die Serotyp-Spezifität des Virus (Watson et al., J. Gen. Virol., 69, 525–535 (1988)).
  • Rekombinante adenovirale Vektoren sind für den zellgerichteten Transfer eines oder mehrerer rekombinanter Gene in erkrankte Zellen oder Gewebe, die der Behandlung bedürfen, verwendet worden. Derartige Vektoren sind gekennzeichnet durch den Vorteil, dass sie keine Wirtszellproliferation zur Expression von adenoviralen Proteinen verlangen (Horwitz et al., in: Virology, Raven Press, New York, vol. 2, pp. 1679–1721 (1990); und Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Weiter: wenn es sich bei dem Zielgewebe für somatische Gentherapie um die Lunge handelt, bieten diese Vektoren den zusätzlichen Vorteil, dass sie einen normalen Tropismus für das respiratorische Epithel besitzen (Straus, in: Adenoviruses, Plenum Press, New York, pp. 451–496 (1984)).
  • Weitere Vorteile von Adenoviren als potentielle Vektoren für die humane Gentherapie sind folgende: (i) Rekombination wird selten beobachtet bei der Ver wendung derartiger Vektoren; (ii) es gibt keine bekannten Assoziationen von humanen malignen Erkrankungen mit adenoviralen Infektionen trotz allgemeiner humaner Infektion mit Adenoviren; (iii) das adenovirale Genom (welches eine lineare doppelsträngige DNA ist) kann manipuliert werden, um Fremdgene aufzunehmen, die in der Größe variieren; (iv) ein adenoviraler Vektor insertiert seine DNA nicht in das Chromosom einer Zelle, so dass sein Effekt nicht permanent ist und es unwahrscheinlich ist, dass er mit der normalen Funktion der Zelle interferiert; (v) das Adenovirus kann nicht-teilende oder terminal differenzierte Zellen infizieren, z. B. Zellen des Gehirns und der Lunge; und (vi) lebendes Adenovirus, das als eine essentielle Charakteristik die Fähigkeit zur Replikation aufweist, wird als Humanvakzin sicher verwendet (Horwitz et al. (1990), supra; Berkner et al. (1988), supra; Straus et al. (1984), supra; Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986); und Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985); PCT-Patentanmeldung WO 94/17832 ).
  • Ein Nachteil bei der Adenovirus-vermittelten Gentherapie ist, dass signifikante Rückgänge in der Genexpression zwei Wochen nach Verabreichung des Vektors beobachtet werden. Bei vielen therapeutischen Anwendungen verlangt der Expressionsverlust eine Readministration des viralen Vektors. Jedoch werden nach einer Readministration neutralisierende Antikörper gegen sowohl die Fiber- als auch die Hexon-Proteine des viralen Vektors hervorgerufen (Wohlfart, J. Virology, 62, 2321–2328 (1988); Wohlfart et al., J. Virology, 56, 896–903 (1985)). Diese Antikörperantwort gegen das Virus kann eine effektive Readministration des viralen Vektors verhindern.
  • Ein weiterer Nachteil der Verwendung von rekombinantem Adenovirus für die Gentherapie besteht darin, dass gewisse Zellen Adenovirus-vermitteltem Gen-Delivery nicht leicht zugänglich sind. Beispielsweise sind Lymphocyten, denen die αv-Integrin-Adenovirus-Rezeptoren fehlen, in der Aufnahme von Adenoviren beeinträchtigt (Silver et al., Virology, 165, 377–387 (1988); Horvath et al., J. Virology, 62(1), 341–345 (1988)). Dieses Fehlen der Fähigkeit, alle Zellen zu infizieren, hat Forscher veranlasst, nach Wegen zu suchen, um Adenovirus in Zellen einzuführen, die durch Adenovirus nicht infiziert werden können, z. B. wegen des Fehlens von adenoviralen Rezeptoren. Insbesondere kann das Virus an einen DNA-Polylysin-Komplex gekoppelt werden, der einen Liganden (z. B. Transferin) für Säugetierzellen enthält (z. B. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6099–6103 (1992); PCT-Patentanmeldung WO 95/26412 ). Ähnlich kann adenovirales Fiberprotein sterisch blockiert werden mit Antikörpern, und gewebespezifische Antikörper können mit dem viralen Partikel chemisch verknüpft werden (Cotten et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89, 6094–6098 (1992)).
  • Jedoch sind diese Ansätze nachteilig insofern, als sie zusätzliche Schritte verlangen, mit denen große Moleküle, z. B. Polylysin, Rezeptor-Liganden und Antikörper, kovalent an das Virus geknüpft werden (Cotten (1992), supra; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6099–6103 (1992)). Dies erhöht die Größe des resultierenden Vektors sowie seine Herstellungskosten. Ferner sind die zielgesteuerten Partikelkomplexe nicht homogen in ihrer Struktur und ihre Effizienz ist sensitiv für die relativen Verhältnisse der eingesetzten viralen Partikel, Verknüpfungsmoleküle und Targeting-Moleküle. Dieser Ansatz zur Erweiterung des Repertoirs an Zellen, die adenoviral vermittelter Gentherapie zugänglich sind, ist also weniger als optimal.
  • Unlängst ist die Effizienz von Adenovirus-vermitteltem Gentransfer in vivo auch in jene Zellen, für die Adenovirus im Ruf stand, mit hoher Effizienz Zutritt zu erlangen, in Frage gestellt worden (Grubb et al., Nature, 371, 802–806 (1994); Dupuit et al., Human Gene Therapy, 6, 1185–1193 (1995)). Der Fiber-Rezeptor, durch den Adenovirus initial Kontakt mit Zellen herstellt, ist nicht identifiziert, und seine Repräsentation in verschiedenen Geweben ist nicht untersucht. Es wird allgemein angenommen, dass Epithelzellen in der Lunge und im Darm ausreichende Levels des Fiber-Rezeptors produzieren, um ihre optimale Transduktion zu erlauben. Jedoch hat keine Studie diesen Punkt bis heute bestätigt. Tatsächlich deuten Studien darauf hin, dass Adenovirus-Gen-Delivery in differenziertes Lungenepithel weniger effizient ist als Delivery in proliferierende oder in undifferenzierte Zellen (Grubb et al., supra; Dupuit et al., supra).
  • Ähnlich wurde gezeigt, dass Adenovirus eine große Anzahl von Geweben transduziert, einschließlich Lungenepithelzellen (Rosenfeld et al., Cell, 68, 143–155 (1992)), Muskelzellen (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2581–2584 (1992)), Endothelzellen (Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6482–6486 (1992)), Fibroblasten (Anton et al., 3. Virol., 69, 4600–4606 (1995)) und Neuronalzellen (LaSalle et al., Science, 259, 988–990 (1993)). Allerdings hat man in vielen dieser Studien sehr hohe Levels von Viruspartikeln verwendet, um Transduktion zu erzielen, häufig mehr als 100 plaquebildende Einheiten (pfu) pro Zelle und korrespondierend zu einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100. Das Erfordernis eines hohen MOI-Wertes, um Transduktion zu erzielen, ist nachteilig insofern, als jegliche Immunantwort, die mit adenoviraler Infektion assoziiert ist, zwangsläufig verschlimmert würde bei Verwendung hoher Dosen.
  • Es besteht also weiterhin Bedarf an Vektoren, z. B. adenoviralen Vektoren, welche in der Lage sind, Zellen mit einer hohen Effizienz, insbesondere bei niedrigeren MOI-Werten, zu infizieren, und welche Infektiosität für ein erweitertes Wirtszellspektrum demonstrieren. Die vorliegende Erfindung sucht mindestens einige der im Vorstehenden genannten Probleme rekombinanter adenoviraler Gentherapie zu überwinden. Insbesondere liegt ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Vektors (z. B. eines adenoviralen Vektors) mit einem breiten Wirtsspektrum und einer Fähigkeit, mit einer hohen Effizienz, auch bei einem reduzierten MOI-Wert, in Zellen einzutreten, um dadurch die verabreichte Menge an rekombinantem adenoviralem Vektor und jegliche Nebeneffekte/Komplikationen, welche aus einer derartigen Verabreichung resultieren, zu reduzieren. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gentherapie, welches die Verwendung eines homogenen Adenovirus beinhaltet, wobei das virale Partikel auf der Ebene des adenoviralen Genoms modifiziert wird, ohne die Notwendigkeit zusätzlicher chemischer Modifikationen von viralen Partikeln. Diese und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfindungsgemäße Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Detailbeschreibung.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein chimäres adenovirales Kapsidprotein bereit (z. B. ein Fiber-, Hexon- oder Penton-Protein), welches sich von dem wildtypi schen (d. h. nativen) Fiberprotein unterscheidet durch die Einführung einer nicht-nativen Aminosäuresequenz, umfassend ca. 3 bis ca. 30 positiv geladene Aminosäurereste, vorzugsweise am oder in der Nähe des Carboxyl-Terminus. Das resultierende chimäre Adenovirus-Kapsidprotein ist in der Lage, einen Zelleintritt eines Vektors zu dirigieren, welcher das Kapsidprotein umfasst, der effizienter ist als der Zelleintritt eines Vektors, welcher bis auf die Tatsache, dass er ein Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein anstelle des chimären Adenovirus-Kapsidproteins umfasst, identisch ist. Ein direktes Resultat dieser erhöhten Eintrittseffizienz ist, dass das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein dem Adenovirus die Bindung und den Eintritt in zahlreiche Zelltypen erlaubt, in die Adenovirus, welches Wildtyp-Kapsidprotein umfasst, typischerweise nicht oder nur mit einer niedrigen Effizienz eintreten kann. Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen adenoviralen Vektor bereit, der das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein umfasst, und Verfahren zur Konstruktion und Verwendung eines derartigen Vektors.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist ein Balkendiagramm, welches die Bindung (% Input) von Wildtyp-Adenovirus an von verschiedenen Geweben abgeleitete Zellen zeigt.
  • 2A–B zeigen die Anheftung einer Nucleinsäuresequenz am Ende des Wildtyp-Adenovirus-Fiber-Gens (2A), um ein chimäres adenovirales Fiberprotein abzuleiten (2B), welches eine nicht-native Aminosäuresequenz am Carboxy-Terminus umfasst. Wie angegeben, können die Länge des polyA-Schwanzes und folglich die Anzahl von Lysinen in dem resultierenden Protein variieren.
  • 3 ist ein schematisches Diagramm, welches die Konstruktion des chimäres Fiberprotein enthaltenden Adenovirus-Transfervektors pAd BS 59-100 UTV über intermediäre Transfervektoren zeigt. Insbesondere wird pAd NS 83-100 (auch bekannt als p193NS 83-100 oder pNS 83-100) verwendet, um Fiber-minus-(d. h. F–)-pAd NS 83-100 (auch bekannt als p193NS (ΔF) oder pNS (ΔF)) abzuleiten (Pfad A), pAd NS 83 100 (F–) wird verwendet, um pAd NS 83-100 UTV (auch bekannt als p193NS (F5*), p193 (F5*) oder pNS (F5*)) abzuleiten (Pfad B), und pAd NS 83-100 UTV wird verwendet, um pAd BS 59-100 UTV abzuleiten (Pfad C).
  • 4A–D zeigen die Oligonucleotide, welche zur Konstruktion von GV10 UTV verwendet werden, d. h. die Primer SEQ ID NO: 9 (4A), SEQ ID NO: 10 (4B), SEQ ID NO: 11 (4C) und SEQ ID NO: 12 (4D).
  • 5 zeigt ein Western-Blot, welches die Größenzunahme des chimären adenoviralen Fiberproteins (UTV) im Vergleich zum Wildtyp-Fiberprotein (WT) zeigt.
  • 6A–B sind Graphen, welche einen Vergleich der Bindung eines Wildtyp-Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektors (d. h. GV10, offenes Dreieck) und eines chimäres Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektors (d. h. GV10 UTV, gefüllter Kreis) an eine Rezeptor-plus-Zelle (A549, 6A) und an eine Rezeptor-minus-Zelle (HS 68, 6B) zeigen.
  • 7 ist eine Auftragung von UTV gebunden (Counts pro Minute (cpm)) gegen Menge von Kompetitor (μg/ml) zur Inhibition der Bindung von chimärem adenoviralem Fiberprotein an Rezeptor-minus-Zellen (d. h. HS 68-Fibroblasten) durch die löslichen Faktoren Chondroitinsulfat (offener Kreis); Heparin (gefüllter Kreis); Mucin (gefülltes Dreieck) und Lachssperma-DNA (offenes Dreieck).
  • 8 ist eine Auftragung von UTV gebunden (cpm) gegen Enzymverdünnung zur Inhibition der Bindung von chimärem adenoviralem Fiberprotein an Rezeptor-minus-Zellen (d. h. HS 68-Fibroblasten) durch die Enzyme Chondroitinase (offene Kreise, gestrichelte Linien); Heparinase (offene Kreise, durchgezogene Linien) und Sialidase (Dreiecke, durchgezogene Linien).
  • 9 ist ein Balkendiagramm, welches einen Vergleich des Transfers eines lacZ-Reportergens durch einen Wildtyp-Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10) und einen chimäres Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10 UTV) zeigt, wie abgeschätzt durch resultierende Reportergenexpression (d. h. relative Lichteinheiten (RLU)) in verschiedenen Rezeptor-plus- und Rezeptor-minus-Zellen.
  • 10 ist ein Balkendiagramm, welches einen Vergleich des Transfers eines lacZ-Reportergens durch einen Wildtyp-Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10) und einen chimäres Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10 UTV) zeigt, wie abgeschätzt durch resultierende Reporterexpression (d. h. relative Lichteinheiten (RLU)) in der Mauslunge.
  • 11 ist ein Balkendiagramm, welches den Transfer eines Reportergens (d. h. enthalten in pGUS) durch einen Wildtyp-Fiberprotein umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10, gefüllte Balken) und einen chimäre Fiber umfassenden adenoviralen Vektor (d. h. GV10 UTV, offene Balken), potentiell gebunden via Protein/DNA-Interaktion, in 293-Zellen, A549-Zellen und H700 T-Zellen zeigt.
  • 12 ist ein Diagramm, welches weiter das Plasmid p193(F*) (beschrieben als pAd NS 83-100 UTV in 3 und auch bekannt als p193 (F5*) oder pNS (F5*)), das zur Konstruktion von Adenovirus-Fiber-Chimären verwendet wird, und die Sequenz des C-Terminus des mutierten Fiberproteins, welche in dem Plasmid präsent ist (Polyadenylierungsstelle fett hervorgehoben), zeigt.
  • 13 ist ein Diagramm, welches das Plasmid p193NS (F5*) pGS(K7) (auch bekannt als p193 (F5*) pGS(K7) oder pNS (F5*) pK7) zeigt, das zur Konstruktion von Adenovirus-Fiber-Chimären verwendet wird.
  • 14 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pBSS 75-100 pGS(null) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(null)) zeigt.
  • 15 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pBSS 75-100 pGS(RK32) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK)2 oder pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK2)) zeigt.
  • 16 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pBSS 75-100 pGS(RK33) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK)3 oder pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK3)) zeigt.
  • 17 ist ein Diagramm, welches das Plasmid p193NS F5F2K (auch bekannt als p193 F5F2K) zeigt.
  • 18 ist ein Diagramm, welches das Plasmid p193NS F5F2K(RKKK)2 (auch bekannt als p193NS F5F2K(RKKK2), p193NS F5F2K(RK32) oder p193 F5F2K(RKKK2)) zeigt.
  • 19 ist ein Diagramm, welches das Plasmid p193NS F5F2K(RKKK)3 (auch bekannt als p193NS F5F2K(RKKK3), p193 F5F2K(RKKK3) oder p193 F5FK(RK33)) zeigt.
  • 20 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pACT (RKKK)3 (auch bekannt als pACT (RKKK3) oder pACT (RK33)) zeigt.
  • 21 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pACT (RKKK)2 (auch bekannt als pACT (RKKK2) oder pACT (RK32)) zeigt.
  • 22 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pACT Hl1 zeigt.
  • 23 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pACT Hl1(RKKK)2 (auch bekannt als pACT Hl1(RKKK2) oder pACT Hl1(RK32)) zeigt.
  • 24 ist ein Diagramm, welches das Plasmid p193 F5F9sK (auch bekannt als p193 F5F9K-Short) zeigt.
  • 25 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pSPdelta zeigt.
  • 26 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pSP2alpha zeigt. Das "j" bezeichnet zerstörte Ppu10I-Stellen in dem Plasmid.
  • 27 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pSP2alpha2 zeigt. Das "j" bezeichnet zerstörte Ppu10I-Stellen in dem Plasmid.
  • 28 ist eine Auftragung von Tage post Infektion gegen FFU/Zelle für 293-Zellen, infiziert mit Ad5 (offene Kreise), AdZ.F(RGD) (geschlossene Quadrate) oder AdZ.F(pK7) (offene Dreiecke).
  • DETAILBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt u. a. ein rekombinantes Adenovirus bereit, welches ein chimäres Kapsidprotein umfasst, z. B. ein chimäres Fiber-, Penton- und/oder Hexon-Protein. Das chimäre Kapsidprotein umfasst eine nicht-native Aminosäuresequenz zusätzlich zu oder anstelle einer nativen Aminosäuresequenz. Diese nicht-native Aminosäuresequenz erlaubt der chimären Fiber (oder einem Vektor, der die chimäre Fiber umfasst), effizienter an Zellen zu binden und in sie einzutreten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt also ein chimäres Adenovirus-Kapsidprotein bereit, umfassend eine nicht-native Aminosäuresequenz, wobei das Kapsidprotein in der Lage ist, einen Zelleintritt eines Vektors zu dirigieren, welcher das Kapsidprotein umfasst, der effizienter ist als der Zelleintritt eines Vektors, welcher identisch ist bis auf die Tatsache, dass er ein Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein anstelle des chimären Adenovirus-Kapsidproteins umfasst (d. h. in der Abwesenheit des chimären Kapsidproteins und in der Anwesenheit des Wildtyp-Adenovirus-Kapsidproteins).
  • Chimäres Kapsidprotein
  • Ein "Kapsidprotein" gemäß der Erfindung umfasst vorzugsweise ein Fiberprotein (speziell ein adenovirales Fiberprotein), ein Penton-Protein (speziell ein adenovirales Penton-Protein) und ein Hexon-Protein (speziell ein adenovirales Hexon-Protein). Insbesondere umfasst ein Kapsidprotein vorzugsweise ein adenovirales Fiber-, Penton- oder Hexon-Protein. Ein beliebiger der Serotypen von humanem oder nicht-humanem Adenovirus kann als Quelle für das Kapsidprotein-Gen verwendet werden; optimalerweise aber ist das Adenovirus ein Ad2- oder ein Ad5-Adenovirus.
  • Das Kapsidprotein ist "chimär" insofern, als es Aminosäurereste umfasst, welche nicht typischerweise in dem Protein gefunden werden, wie es aus Wildtyp-Adenovirus (d. h. umfassend das native Protein oder Wildtyp-Protein) isoliert wird. Das Kapsidprotein umfasst also eine "nicht-native Aminosäuresequenz". Mit "nicht-native Aminosäuresequenz" ist eine Aminosäuresequenz gemeint, welche nicht in der nativen Fiber eines gegebenen Serotyps von Adenovirus gefunden wird und welche vorzugsweise in das Fiberprotein auf der Genexpressionsebene eingeführt wird (d. h. durch Einführung einer "Nucleinsäuresequenz, welche eine nicht-native Aminosäuresequenz codiert").
  • Eine derartige nicht-native Aminosäuresequenz umfasst eine Aminosäuresequenz (d. h. hat Komponentenreste in einer bestimmten Ordnung), welche dem resultierenden chimären Protein eine Fähigkeit verleiht, an Zellen zu binden und in dieselben einzutreten, mittels einer neuen Zelloberflächen-Bindungsstelle (d. h. einer "UTV-Sequenz" oder Universal-Transfer-Vektor-Sequenz), und/oder sie umfasst eine Sequenz, die inkorporiert wird, um eine bestimmte Konfiguration des resultierenden chimären Proteins zu produzieren oder aufrechtzuerhalten (d. h. eine "Abstandhaltersequenz") zwischen nativer/nicht-nativer, nicht-nativer/nicht-nativer oder einer nativen/nativen Sequenz. Insofern als die nicht-native Aminosäuresequenz in eine oder anstelle einer Aminosäuresequenz insertiert wird und die Manipulation der Aminosäuresequenz des chimären Kapsidproteins vorzugsweise auf der Nucleinsäureebene durchgeführt wird, kann die Aminosäuresequenz, welche sich in dem chimären Kapsidprotein von dem Wildtyp-Kapsidprotein unterscheidet (d. h. die UTV-Sequenz und die Abstandhaltersequenz), vorzugsweise eine vollständig nicht-native Aminosäuresequenz oder eine Mischung von einer nativen und einer nicht-nativen Aminosäure umfassen.
  • Eine "Zelloberflächen-Bindungsstelle" umfasst einen Rezeptor (der vorzugsweise ein Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein oder Proteoglycan ist) sowie ein beliebiges entgegengesetzt geladenes Molekül (d. h. entgegengesetzt geladen mit Bezug auf das chimäre Kapsidprotein, welches vorzugsweise eine nicht-native Aminosäuresequenz umfasst, die positiv geladen ist, wie hierin weiter beschrieben) oder einen anderen Typ von Molekül, mit dem das chimäre Kapsidprotein interagieren kann, um die Zelle zu binden und dadurch den Zelleintritt zu fördern. Beispiele für potentielle Zelloberflächen-Bindungsstellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: negativ geladene Heparin-, Heparinsulfat-, Hyaluronsäure-, Dermatansulfat- und Chondroitinsulfatreste, welche z. B. auf Glycosaminoglycanen vorkommen und welche ferner Sialinsäure, Sulfat und/oder Phosphat enthalten können; Sialinsäurereste, welche auf Mucinen, Glycoproteinen und Gangliosiden vorkommen; Haupthistokompatibilitätskomplex I-(MHC I)-Glycoproteine; die üblichen Kohlenhydrat-Komponenten, die in Membranglycoproteinen vorkommen, einschließlich Mannose, N-Acetylgalactosamin, N-Acetylglucosamin, Fucose, Galactose und derglei chen; und Phosphatreste, z. B. auf Nucleinsäuren. Jedoch sind ein erfindungsgemäßes chimäres Kapsidprotein und Verfahren zu seiner Verwendung nicht auf einen besonderen Mechanismus zellulärer Interaktion (d. h. Interaktion mit einer besonderen Zelloberflächen-Bindungsstelle) beschränkt und sind nicht so auszulegen.
  • Weiterhin ist eine derartige Zelloberflächen-Bindungsstelle "neu" insofern, als sie eine Stelle ist, die zuvor einer Interaktion mit einem adenoviralen Kapsidprotein (d. h. Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein, z. B. Fiberprotein) nicht oder nur auf einem sehr niedrigen Niveau zugänglich war, wie es in der reduzierten Eintrittseffizienz eines Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein enthaltenden Vektors im Vergleich zu einem Vektor, welcher ein erfindungsgemäßes chimäres Adenovirus-Kapsidprotein, z. B. Fiberprotein, umfasst, widergespiegelt wird. Ferner ist die Bindungsstelle neu insofern, als sie auf den meisten, wenn nicht allen Zellen, gleich welchen Ursprungs, präsent ist. Dies steht im Gegensatz zu der zellulären Bindungsstelle, mit welcher Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein mutmaßlich interagiert, welche offenbar nur auf einem Subset von Zellen präsent oder nur auf einem Subset von Zellen zugänglich ist, wie es in der reduzierten Eintrittseffizienz eines Wildtyp-Adenovirus-Fiber enthaltenden Vektors widergespiegelt wird.
  • Die "Eintrittseffizienz" kann durch verschiedene Mittel quantitativ bestimmt werden. Insbesondere kann die Eintrittseffizienz quantitativ bestimmt werden durch Einführen eines chimären Kapsidproteins in einen Vektor, vorzugsweise in einen viralen Vektor, und Überwachen des Zelleintritts (z. B. durch Vektor-vermitteltes Delivery eines Gens, z. B. eines Reportergens, in eine Zelle) als eine Funktion der Multiplizität der Infektion (MOI)). In diesem Fall zeigt ein reduzierter erforderlicher MOI-Wert für den Zelleintritt eines Vektors, der ein chimäres adenovirales Kapsidprotein umfasst, im Vergleich zu einem Vektor, der bis auf die Tatsache, dass er ein Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein anstelle des chimären Adenovirus-Kapsidproteins umfasst, identisch ist, einen "effizienteren" Eintritt an.
  • Ähnlich kann die Eintrittseffizienz quantitativ bestimmt werden mit Bezug auf die Zellbindungsfähigkeit von Vektoren, welche chimäre oder Wildtyp-Kapsid proteine enthalten, oder von den löslichen chimären oder Wildtyp-Kapsidproteinen selbst. In diesem Fall ist eine erhöhte Bindung, welche für den Vektor, der ein chimäres adenovirales Kapsidprotein enthält, oder das chimäre Kapsidprotein selbst gezeigt wird, im Vergleich zu dem identischen Vektor, der statt dessen ein Wildtyp-Kapsidprotein enthält, oder dem Wildtyp-Kapsidprotein selbst, indikativ für eine erhöhte Eintrittseffizienz oder einen "effizienteren" Eintritt.
  • Eine nicht-native Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung ist vorzugsweise in eine oder anstelle einer internen Kapsidproteinsequenz insertiert. Alternativ ist eine nicht-native Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung vorzugsweise am oder in der Nähe des C-Terminus eines Proteins. Insbesondere wenn ein Kapsidprotein gemäß der Erfindung ein Fiberprotein ist, dann ist wünschenswerterweise eine nicht-native Aminosäuresequenz am oder in der Nähe des C-Terminus des Proteins. Wenn ein Kapsidprotein gemäß der Erfindung ein Penton- oder ein Hexon-Protein ist, dann ist vorzugsweise eine nicht-native Aminosäuresequenz innerhalb einer exponierten Schleife des Proteins, z. B. wie in den folgenden Beispielen beschrieben, insbesondere innerhalb einer hypervariablen Region in Schleife 1 und/oder Schleife 2 des Adenovirus-Hexon-Proteins (Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70, 1836–1844 (1996)). Eine nicht-native Aminosäuresequenz ist also wünschenswerterweise in einer Region eines Kapsidproteins, welche in der Lage ist, mit einer Zelle zu interagieren und dieselbe zu binden.
  • Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen in einer erweiterten (oder "spiked") Struktur enthalten, insbesondere in Hexon- und/oder Pentonbasis-Protein, um in verlängerten Hexon- und/oder Pentonbasis-Proteinen zu resultieren, wobei die Aminosäure-Insertion nach außen vorsteht von dem Protein, wie es in einem Virionkapsid präsent ist. Insbesondere können derartige "spiked" Kapsidproteine in ein rekombinantes Adenovirus inkorporiert werden zusammen mit einer "Kurzschaft"-Fiber (hierin weiter beschrieben), wobei der Schaft der Fiber gekürzt worden ist und optional das Knob des Fiberproteins ausgetauscht worden ist gegen ein Knob (einschließlich der Trimerisierungsdomäne) eines adenoviralen Vektors unterschiedlichen Serotyps, von dem der Rest des Fiberproteins abgeleitet wurde.
  • Demgemäß kann das Kurzschaft-Fiberprotein vorzugsweise in ein Adenovirus inkorporiert werden, welches ein chimäres Pentonbasis-Protein aufweist, das eine UTV- oder UTV-artige Sequenz umfasst, oder ein "spiked" chimäres Pentonbasis-Protein aufweist, das ferner optional eine UTV- oder UTV-artige Sequenz inkorporieren kann. Ferner kann das Kurzschaft-Fiberprotein in ein Adenovirus inkorporiert werden, welches ein chimäres Hexon-Protein aufweist, das eine UTV- oder UTV-artige Sequenz umfasst, oder ein "spiked" chimäres Hexon-Protein aufweist, das ferner optional eine UTV- oder UTV-artige Sequenz inkorporieren kann.
  • Optimalerweise ist die nicht-native Aminosäuresequenz durch eine andere nicht-native Aminosäuresequenz, d. h. durch eine intervenierende Abstandhaltersequenz, an das Protein geknüpft. Eine Abstandhaltersequenz ist eine Sequenz, welche zwischen der nativen Proteinsequenz und der nicht-nativen Sequenz, zwischen einer nicht-nativen Sequenz und einer weiteren nicht-nativen Sequenz oder zwischen einer nativen Sequenz und einer weiteren nativen Sequenz interveniert. Eine Abstandhaltersequenz ist vorzugsweise in das Protein inkorporiert, um zu gewährleisten, dass die nicht-native Sequenz, welche die Zelloberflächen-Bindungsstelle umfasst, von der dreidimensionalen Struktur des chimären Proteins (insbesondere der dreidimensionalen Struktur des chimären Proteins, wie es in der Natur existiert, d. h. als Teil eines Kapsids) derart hervorragt, dass sie mit Zellen interagieren und an dieselben binden kann. Wenn eine Abstandhaltersequenz in eine interne Kapsidproteinsequenz insertiert ist oder dieselbe ersetzt, können eine oder mehrere Abstandhaltersequenzen in dem chimären Kapsidprotein präsent sein.
  • Eine intervenierende Abstandhaltersequenz kann eine beliebige geeignete Länge aufweisen, vorzugsweise ca. 3 bis ca. 400 Aminosäuren für eine Abstandhaltersequenz, welche hinzugefügt ist, um ein "spiked" Kapsidprotein abzuleiten (wie in den folgenden Beispielen weiter beschrieben), und vorzugsweise ca. 3 bis ca. 30 Aminosäuren für jegliche andere hierin beschriebene Anwendung. Eine Abstandhaltersequenz kann beliebige Aminosäuren umfas sen. Optimalerweise interferiert die Abstandhaltersequenz nicht mit der Funktion des Kapsidproteins im Allgemeinen und der Funktion der anderen nicht-nativen Aminosäuresequenz (d. h. der UTV- oder UTV-artigen Struktur) im Besonderen.
  • Die nicht-native Aminosäuresequenz, die keine Abstandhaltersequenz ist, d. h. die UTV-Sequenz, kann ebenfalls von beliebiger geeigneter Länge sein, vorzugsweise ca. 3 bis ca. 30 Aminosäuren (wobei jedoch optional die UTV-Sequenz, wie die Abstandhaltersequenz, auch länger sein kann, z. B. bis zu ca. 400 Aminosäuren). Diese Aminosäuren sind vorzugsweise beliebige positiv geladene Reste, welche in der Lage sind, an negativ geladene Reste, die auf der Oberfläche einer eukaryotischen Zelle präsent sind, zu binden, und sie sind optimalerweise in der Lage, an negativ geladene Reste zu binden, welche auf der Oberfläche der meisten (wenn nicht allen) eukaryotischen Zellen präsent sind. Insbesondere umfasst ein derartiger, auf der Oberfläche einer eukaryotischen Zelle präsenter, negativ geladener Rest, an den die UTV-Sequenz bindet, die zuvor erwähnte "Zelloberflächen-Bindungsstelle".
  • Wünschenswerterweise umfasst die nicht-native Aminosäuresequenz Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Lysin, Arginin und Histidin besteht. Alternativ können diese Aminosäuren negativ geladene Reste sein, welche in der Lage sind, an positiv geladene Zelloberflächen-Bindungsstellen, zu binden; z. B. umfasst die nicht-native Aminosäuresequenz wünschenswerterweise Aminosäuren, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Aspartat und Glutamat besteht.
  • Somit umfasst die nicht-native Aminosäuresequenz eines Kapsidproteins vorzugsweise eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus: SEQ ID NO: 1 (d. h. Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys), SEQ ID NO: 2 (d. h. Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg) und SEQ ID NO: 3 (d. h. Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa, worin "Xaa" Lys oder Arg umfasst), wobei 1, 2, 3, 4 oder 5 Reste der Sequenz am C-Terminus derselben deletiert sein können. Wenn das Kapsidprotein ein Fiberprotein ist, umfasst das Protein vorzugsweise eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (d. h. Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys) und SEQ ID NO: 5 (d. h. Ala Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys), wobei 1, 2, 3, 4 oder 5 Reste der Sequenz am C-Terminus derselben deletiert sein können.
  • Ferner können Sequenzen, die an Heparin binden, in die Bindung an einen Heparin-artigen Rezeptor involviert sein (Sawitzky et al., Med. Microbiol. Immunol., 182, 285–92 (1993)). Ähnlich können sogenannte "Heparin-Bindungssequenzen" die Interaktion des Peptids oder Proteins, in dem sie enthalten sind, mit anderen Zelloberflächen-Bindungsstellen vermitteln, z. B. mit Zelloberflächen-Heparinsulfatproteoglycan (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541–9 (1994)). Somit umfasst die nicht-native Aminosäuresequenz (d. h. die UTV-Sequenz) vorzugsweise diese Sequenzen sowie zusätzliche Sequenzen, welche in der Lage sind, einen negativ geladenen Rest zu erkennen, der breit repräsentiert ist auf der Oberfläche von eukaryotischen Zellen.
  • Insbesondere umfasst die nicht-native Aminosäuresequenz vorzugsweise zwei basische Aminosäuren (oft Arg), mit ca. 20 Å Abstand voneinander lokalisiert, in entgegengesetzte Richtungen einer Alphahelix zeigend (Margalit et al., J. Biol. Chem., 268, 19228–31 (1993); Ma et al., J. Lipid Res., 35, 2049–2059 (1994)). Andere basische Aminosäuren sind wünschenswerterweise dispergiert zwischen diesen zwei Resten, einer Seite zugewandt, während nichtpolare Reste der anderen Seite zugewandt sind, so dass eine amphipathische Struktur gebildet wird, welche optimalerweise das Motiv XBBXBX [SEQ ID NO: 49] oder XBBBXXBX [SEQ ID NO: 50] umfasst, worin B eine basische Aminosäure (z. B. Lys, Arg, etc.) ist und worin X eine beliebige andere Aminosäure ist.
  • Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die nicht-native UTV-Aminosäuresequenz umfasst: die Sequenz LIGRKKT [SEQ ID NO: 51], LIGRK [SEQ ID NO: 52] oder LIGRR [SEQ ID NO: 53], welche übliche Heparin-Bindungsmotive sind, die in Fibronectin und Hitzeschockproteinen präsent sind (Hansen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1252, 135–45 (1995)); Insertionen von 7 Resten von entweder Lys oder Arg, oder Mischungen von Lys und Arg (Fromm et al., Arch. Biochem. Biophys., 323, 279–87 (1995)); die übliche basische C-terminale Region von IGFBP-3 und IGFBP-5 von ca. 18 Aminosäuren und welche eine Heparin-Bindungssequenz umfasst (Booth et al., Growth Regul., 5, 1–17 (1995)); entwe der eines oder beide der zwei Hyaluronan-(HA-)Bindungsmotive, welche innerhalb einer 35-Aminosäuren-Region des C-Terminus des HA-Rezeptors RHAMM lokalisiert sind (Yang et al., J. Cell Biochem, 56, 455–68 (1994)); ein synthetisches Peptid (Ala347–Arg361), modelliert nach der Heparin-bindenden Form von Vitronectin von Staphylococcus aureus, umfassend Heparin-bindende Konsensus-Sequenzen (Lang et al., J. Biochem., 116, 457–63 (1994)); eine oder mehrere beliebige von fünf Heparin-Bindungsstellen zwischen Aminosäure 129 und 310 von Glycoprotein gIII von bovinem Herpesvirus 1 oder eine beliebige von vier Heparin-Bindungsstellen zwischen Aminosäuren 90 und 275 von Glycoprotein gIII von Pseudowut-Virus (Lang et al., Virol., 194, 233–43 (1993)); Aminosäuren 134 bis 141 von Glycoprotein gIII von Pseudowut-Virus (Sawitzky et al., Med. Microbiol. Immunol., 182, 285–92 (1993)); Heparin-bindende Regionen korrespondierend zu geladenen Resten an Positionen 279–282 und 292–304 von humaner Lipoproteinlipase (Ma et al., supra)); ein synthetisches 22-Reste-Peptid, N22W, mit einer Sequenz NVSPPRRARVTDATETTITISW [SEQ ID NO: 54], oder Reste TETTITIS [SEQ ID NO: 55] dieses synthetischen Peptids, modelliert nach Fibronectin und Heparin-bindende Eigenschaften zeigend (Ingham et al., Arch. Biochem. Biophys., 314, 242–246 (1994)); das Motiv GVEFVCCP [SEQ ID NO: 56], welches in der Zinkbindungsstelle der Ektodomäne des Alzheimer beta-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) sowie verschiedener anderer APP-artiger Proteine präsent ist und welches die Heparin-Affinität moduliert (Bush et al., J. Biol. Chem., 229, 26618–21 (1994)); 8-Aminosäurereste-Peptide, abgeleitet von der Kreuzregion der Laminin-A-Kette (Tashiro et al., Biochem. J., 302, 73–9 (1994)); synthetische Peptide, basierend auf den Heparin-bindenden Regionen des Serinproteaseinhibitors Antithrombin III, einschließlich Peptide F123-G148 und K121-A134 (Tyler-Cross et al., Protein Sci., 3, 620–7 (1994)); ein 14 K N-terminales Fragment von APP und eine Region nahe dem N-Terminus (d. h. Reste 96–110), welche als Heparin-bindende Regionen vorgeschlagen worden sind (Small et al., J. Neurosci., 14, 2117–27 (1994)); eine Strecke von 21 Aminosäuren des Heparin-bindenden epidermen Wachstumsfaktor-ähnlichen Wachstumsfaktors (HB-EGF), charakterisiert durch einen hohen Gehalt an Lysin- und Argininresten (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541–9 (1994)); eine 17-Aminosäure-Region, umfassend die Heparin-bindende Region von Thrombospondin und korrespondierend zu einem synthetischen hep 1-Peptid (Murphy-Ullrich et al., J. Biol. Chem., 268, 26784–9 (1993)); eine 23-Aminosäuresequenz (Y565-A587) von humanem Willebrand-Faktor, welche Heparin bindet (Tyler-Cross et al., Arch. Biochem. Biophys., 306, 528–33 (1993)); das von Fibronectin abgeleitete Peptid PRARI [SEQ ID NO: 57] (und größere Peptide, welche dieses Motiv umfassen, z. B. WQPPRARI [SEQ ID NO: 58]), das Heparin bindet (Woods et al., Mol. Biol. Cell., 4, 605–613 (1993); die Heparin-bindende Region von Plättchenfaktor 4 (Sato et al., Jpn. J. Cancer Res., 84, 485–8 (1993); und die K18K-Sequenz in dem Fibroblastwachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinase-Transmembranglycoprotein (Kan et al., Science, 259, 1918–21 (1993)).
  • Ferner kann die UTV-Sequenz andere Sequenzen umfassen, welche in den folgenden Beispielen beschrieben sind. Somit ist die UTV-Sequenz vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus [SEQ ID NO: 1], [SEQ ID NO: 2], [SEQ ID NO: 3], [SEQ ID NO: 4], [SEQ ID NO: 5], [SEQ ID NO: 20], [SEQ ID NO: 22], [SEQ ID NO: 24], [SEQ ID NO: 26], [SEQ ID NO: 28], [SEQ ID NO: 30], [SEQ ID NO: 32], [SEQ ID NO: 34], [SEQ ID NO: 36], [SEQ ID NO: 38], [SEQ ID NO: 40], [SEQ ID NO: 42], [SEQ ID NO: 46], [SEQ ID NO: 48], [SEQ ID NO: 49], [SEQ ID NO: 50], [SEQ ID NO: 51], [SEQ ID NO: 52], [SEQ ID NO: 53], [SEQ ID NO: 54], [SEQ ID NO: 55], [SEQ ID NO: 56], [SEQ ID NO: 57], [SEQ ID NO: 58], [SEQ ID NO: 73], [SEQ ID NO: 74], [SEQ ID NO: 76], [SEQ ID NO: 78], [SEQ ID NO: 90] und [SEQ ID NO: 93]. Ferner können diese Sequenzen verwendet werden, wobei 1, 2 oder 3 Reste der Sequenz am C- oder am N-Terminus deletiert sind. Weiter: insofern als eine Abstandhaltersequenz eine beliebige Sequenz von Aminosäuren sein kann, die mit der Funktion des Proteins nicht interferiert, kann erfindungsgemäß eine beliebige der im Vorstehenden erwähnten UTV-Sequenzen ferner Abstandhaltersequenzen umfassen.
  • Es ist ferner bevorzugt, wenn die nicht-native Aminosäuresequenz Aminosäuresequenzen umfasst, welche "Äquivalente" von einer beliebigen der im Vorstehenden erwähnten Sequenzen sind (d. h. welche "UTV-artige Sequenzen" sind). Ein Äquivalent kann eine Sequenz sein, welche dieselbe Funktion ausübt (eventuell mit kleineren Unterschieden in der Effektivität) und dennoch geringfügig differieren kann mit Bezug auf ihre Aminosäuresequenz oder andere strukturelle Merkmale. Insbesondere ist eine äquivalente Sequenz eine Sequenz, welche eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen der Sequenz umfasst. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine Aminosäure, welche mit einer alternativen Aminosäure ähnlicher Ladungsdichte, Hydrophilizität/Hydrophobizität, Größe und/oder Konfiguration substituiert ist (z. B. Val für Ile). Im Vergleich dazu ist eine "nicht-konservative Aminosäuresubstitution" eine Aminosäure, welche mit einer alternativen Aminosäure verschiedener Ladungsdichte, Hydrophilizität/Hydrophobizität, Größe und/oder Konfiguration substituiert ist (z. B. Val für Phe).
  • Nucleinsäure codierend für ein chimäres Kapsidprotein
  • Wie bereits angegeben, wird die nicht-native Aminosäuresequenz vorzugsweise auf der DNA-Ebene eingeführt. Demgemäß stellt die Erfindung vorzugsweise ferner eine isolierte und gereinigte Nucleinsäure bereit, welche ein erfindungsgemäßes Kapsidprotein codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz, welche die nicht-native Aminosäuresequenz codiert, eine Sequenz SEQ ID NO: 6 (d. h. GGA TCC AA) umfasst, die vor der Polyadenylierungsstelle lokalisiert ist. Ähnlich stellt die Erfindung vorzugsweise eine isolierte und gereinigte Nucleinsäure bereit, welche eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 7 (d. h. GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT) und SEQ ID NO: 8 (d. h. GCC GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA), [SEQ ID NO: 19], [SEQ ID NO: 21], [SEQ ID NO: 23], [SEQ ID NO: 25], [SEQ ID NO: 27], [SEQ ID NO: 29], [SEQ ID NO: 31], [SEQ ID NO: 33], [SEQ ID NO: 35], [SEQ ID NO: 37], [SEQ ID NO: 39], [SEQ ID NO: 41], [SEQ ID NO: 45], [SEQ ID NO: 47], [SEQ ID NO: 72], [SEQ ID NO: 75], [SEQ ID NO: 77] und [SEQ ID NO: 89]. Die Erfindung stellt ferner konservativ modifizierte Varianten dieser Nucleinsäuren bereit.
  • Eine "konservativ modifizierte Variante" ist eine Variation der Nucleinsäuresequenz, die in einer konservativen Aminosäuresubstitution resultiert. Im Vergleich dazu ist eine "nicht-konservativ modifizierte Variante" eine Variation der Nucleinsäuresequenz, die in einer nicht-konservativen Aminosäuresubstitution resultiert. Die Mittel zur Herstellung derartiger Modifikationen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, sie sind in den folgenden Beispielen beschrieben und können ferner mittels kommerziell erhältlicher Kits und Vektoren erreicht werden (z. B. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). Ferner sind die Mittel zum Abschätzen derartiger Substitutionen (z. B. hinsichtlich des Effekts auf die Fähigkeit, Zellen zu binden und in diese einzutreten) in den hierin vorgestellten Beispielen beschrieben.
  • Die Mittel zur Herstellung eines derartigen chimären Kapsidproteins, insbesondere die Mittel zum Einführen der Sequenz auf der DNA-Ebene, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt; sie sind in 2 für ein repräsentatives chimäres Protein illustriert und in den folgenden Beispielen beschrieben. Kurz gefasst umfasst das Verfahren die Einführung einer Sequenz (vorzugsweise der Sequenz SEQ ID NO: 6 oder einer konservativ modifizierten Variante derselben) in die Sequenz des Kapsidproteins. Bei einer bevorzugten Ausführungsform, welche in den folgenden Beispielen beschrieben wird, wird die Einführung vor jeglichem Stop-Codon oder Polyadenylierungssignal durchgeführt, um eine Frameshift-Mutation in dem resultierenden Protein zu induzieren, derart, dass das chimäre Protein zusätzliche Aminosäuren inkorporiert.
  • Allgemein kann dies erreicht werden durch Klonieren der Fiber-Sequenz in ein Plasmid oder einen anderen Vektor für leichte Manipulation der Sequenz. Sodann werden die Sequenz flankierende Restriktionsstellen, an denen die Frameshift-Mutation eingeführt werden soll, identifiziert. Ein doppelsträngiges synthetisches Oligonucleotid wird aus überlappenden synthetischen einzelsträngigen Sense- und Antisense-Oligonucleotiden erzeugt (z. B. aus dem Sense- und Antisense-Oligonucleotid TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C [SEQ ID NO: 9] bzw. AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA [SEQ ID NO: 10], wie in 4 illustriert), derart, dass das doppelsträngige Oligonucleotid die Restriktionsstellen, welche die Zielsequenz flankieren, inkorporiert. Das Plasmid oder der andere Vektor wird mit den Restriktionsenzymen gespalten, und die Oligonucleotid-Sequenz mit kompatiblen kohäsiven Enden wird in das Plasmid oder den anderen Vektor ligiert, um die Wildtyp-DNA zu ersetzen. Andere Mittel zur ortsgerichteten in-vitro-Mutagenese, wie sie z. B. dem Fachmann bekannt sind und (insbesondere durch PCR) z. B. mit Hilfe kommerziell erhältlicher Kits erreicht werden können, können Verwen dung finden, um die mutierte Sequenz in die Kapsidprotein-Codierungssequenz einzuführen.
  • Ist die Sequenz einmal in das chimäre Kapsidprotein eingeführt, so kann das die Sequenz codierende Nucleinsäurefragment isoliert werden, z. B. durch PCR-Amplifizierung mittels 5'- und 3'-Primer. Mit Bezug auf ein chimäres Fiberprotein z. B. kann das Fragment durch PCR mittels des Primer TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA [SEQ ID NO: 11] und des Primer CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA [SEQ ID NO: 12] isoliert werden, wie in 4 illustriert. Die Verwendung dieser Primer auf diese Art und Weise resultiert in einem amplifizierten, chimäre Fiber enthaltenden Fragment, welches von Restriktionsstellen flankiert ist (d. h. in diesem Fall Ndel- und BamHI-Stellen), die zum günstigen Subklonieren des Fragments verwendet werden können. Es können auch andere Mittel zum Generieren eines chimären Kapsidproteins verwendet werden.
  • Somit kann die Frameshift-Mutation in einen beliebigen Teil der Kapsidprotein-Codierungssequenz eingeführt werden. Mit Bezug auf die SEQ ID NO: 6 z. B. kann diese Sequenz platziert werden in der Region des Kapsidprotein-Gens codierend für den C-Terminus des Proteins (d. h. sie kann unmittelbar vor dem TAA-Stop-Codon hinzugefügt werden), oder sie kann früher in der Codierungsregion platziert werden, z. B. zwischen Codons codierend für Ala (d. h. A) und Gin (d. h. Q), um die zuvor erwähnte Codierungssequenz SEQ ID NO: 8 zu produzieren, welche ein chimäres Protein codiert, das die Sequenz SEQ ID NO: 5 umfasst. Ähnlich kann dieser Ansatz verwendet werden, um einen Frameshift noch früher in der Codierungssequenz einzuführen, z. B. durch Insertion entweder in eine oder anstelle einer internen (d. h. nativen) Kapsidproteinsequenz.
  • Ferner kann das doppelsträngige Oligonucleotid auch eine weitere Restriktionsstelle inkorporieren, welche ebenfalls beim Manipulieren der Sequenz verwendet werden kann. Beispielsweise umfasst die in den Vektor eingeführte Sequenz SEQ ID NO: 6 eine modifizierte BamHI-Stelle, d. h. die Stelle ist insofern "modifiziert", als sie zusätzliche Nucleotide auf der palindromen Erkennungssequenz hinzufügt. Diese Sequenz kann ferner so synthetisiert werden, dass sie eine beliebige andere, für DNA-Manipulationen günstige Restriktionsstelle umfasst. Wenn sie in die Kapsidprotein-Codierungssequenz eingeführt wird, führt die Sequenz nicht nur eine Frameshift-Mutation ein, sondern sie kann auch verwendet werden, um andere Codierungssequenzen in das Kapsidprotein-Gen einzuführen. Insbesondere können die auf diese Weise eingeführten Codierungssequenzen Codons für Lysin, Arginin und Histidin umfassen oder Codons für Aspartat und Glutamat, entweder für sich allein oder in einer beliebigen Kombination. Ferner kann ein neuer Translations-Stop-Codon diesen Codons für die Aminosäuren folgen, so dass ein chimäres Protein produziert werden kann, das nur eine gegebene Anzahl von zusätzlichen Aminosäuren in der nicht-nativen Aminosäuresequenz inkorporiert. Die Codons für die Aminosäuren und der Translations-Stop-Codon können eingeführt werden in die Frameshift-Mutation-induzierende neue Restriktionsstelle, welche in das Kapsidprotein inkorporiert wird, durch Synthetisieren von Oligonucleotiden, welche diese Sequenzen umfassen, die von der Restriktionsstelle flankiert sind, wie früher beschrieben (welche z. B. 5'- und 3'-BamHI-Stellen umfassen), oder durch andere Mittel, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
  • Die Größe der zum Ersetzen der nativen Rezeptor-Bindungssequenz verwendeten DNA kann eingeschränkt sein, z. B. durch gehinderte Faltung der Fiber oder unrichtigen Zusammenbau des Pentonbasis/Fiber-Komplexes. DNA, welche die zuvor erwähnten Aminosäuresequenzen (z. B. Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat und dergleichen) codiert, wird bevorzugt verwendet zur Insertion in die Fiber-Gen-Sequenz, bei der die native Rezeptor-Bindungssequenz deletiert oder sonstwie mutiert worden ist. Ferner werden andere DNA-Sequenzen, z. B. solche, welche Aminosäuren zur Inkorporation in Abstandhaltersequenzen codieren, vorzugsweise verwendet, um die native Kapsidprotein-Codierungssequenz zu ersetzen.
  • Vektor umfassend ein chimäres Kapsidprotein
  • Ein "Vektor" gemäß der Erfindung ist ein Vehikel für den Gentransfer, wie dieser Terminus vom Fachmann verstanden wird. Vier Typen von Vektoren, welche von der Erfindung umfasst sind, sind: Plasmide, Phagen, Viren und Liposome. Plasmide, Phagen und Viren können in ihrer Nucleinsäureform in eine Zelle transferiert werden, und Liposome können zum Transferieren von Nucleinsäuren verwendet werden. Somit werden die Vektoren, welche zum Gentransfer verwendet werden können, hierin allgemein als "Transfervektoren" bezeichnet.
  • Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßer Vektor ein Virus, speziell ein Virus, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus unbehüllten Viren, d. h. unbehüllten RNA- oder DNA-Viren, besteht. Ferner kann ein Virus ausgewählt sein aus der Gruppe, welche aus behüllten Viren besteht, d. h. behüllten RNA- oder DNA-Viren. Derartige Viren umfassen vorzugsweise ein Kapsidprotein. Wünschenswerterweise ist das virale Kapsidprotein ein Protein, welches von dem Kapsid nach außen vorsteht, derart, dass es mit Zellen interagieren kann. Im Falle von behüllten RNA- oder DNA-Viren ist das Kapsidprotein vorzugsweise tatsächlich ein Lipid-Hüllglycoprotein (d. h. ein sogenanntes "Spike" oder Peplomer).
  • Insbesondere ist ein Vektor vorzugsweise ein unbehülltes Virus (d. h. entweder ein RNA- oder ein DNA-Virus) aus der Familie Hepadnaviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae oder Picornaviridae. Ein bevorzugtes unbehülltes Virus gemäß der Erfindung ist ein Virus der Familie Hepadnaviridae, speziell des Genus Hepadnavirus. Ein Virus der Familie Parvoviridae ist wünschenswerterweise vom Genus Parvovirus (z. B. Parvoviren von Säugetieren und Vögeln) oder Dependovirus (z. B. Adeno-assoziierte Viren (AAVs)). Ein Virus der Familie Papovaviridae entstammt vorzugsweise der Subfamilie Papillomavirinae (z. B. die Papillomaviren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf humane Papillomaviren (HPV) 1–48) oder der Subfamilie Polyomavirinae (z. B. die Polyomaviren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf JC-, SV40- und BK-Virus). Ein Virus der Familie Adenoviridae ist wünschenswerterweise vom Genus Mastadenovirus (z. B. Säuger-Adenoviren) oder Aviadenovirus (z. B. Vogel-Adenoviren). Ein Virus der Familie Picornaviridae ist vorzugsweise ein Hepatitis-A-Virus (HAV), ein Hepatitis-B-Virus (HBV) oder ein Nicht-A- oder Nicht-B-Hepatitis-Virus.
  • Ähnlich kann ein Vektor ein behülltes Virus aus der Familie Herpesviridae oder Retroviridae sein, oder er kann ein Sindbis-Virus sein. Ein bevorzugtes be hülltes Virus gemäß der Erfindung ist ein Virus der Familie Herpesviridae, speziell der Subfamilie oder des Genus Alphaherpesvirinae (z. B. die Herpes-simplex-artigen Viren), Simplexvirus (z. B. Herpex-simplex-artige Viren), Varicellavirus (z. B. Varicella- und Pseudowut-artige Viren), Betaherpesvirinae (z. B. die Cytomegaloviren), Cytomegalovirus (z. B. die humanen Cytomegaloviren), Gammaherpesvirinae (z. B. die Lymphocyten-assoziierten Viren) und Lymphocryptovirus (z. B. EB-artige Viren).
  • Ein weiteres bevorzugtes behülltes Virus ist ein RNA-Virus aus der Familie Retroviridae (d. h. vorzugsweise ein Retrovirus), insbesondere ein Virus des Genus oder der Subfamilie Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae und Lentivirus. Ein RNA-Virus aus der Subfamilie Oncovirinae ist wünschenswerterweise ein humanes T-Iymphotropes Virus Typ 1 oder 2 (d. h. HTLV-1 oder HTLV-2) oder bovines Leukämie-Virus (BLV), ein aviäres Leukose-Sarkom-Virus (z. B. Rous-Sarkom-Virus (RSV), aviäres Myeloblastose-Virus (AMV), aviäres Erythroblastose-Virus (AEV), Rous-assoziiertes Virus (RAV)-1 bis 50, RAV-0), ein C-Typ-Virus von Säugetieren (z. B. Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MuLV), Harvey-Maus-Sarkom-Virus (HaMSV), Abelson-Maus-Leukämie-Virus (A-MuLV), AKR-MuLV, felines Leukämie-Virus (FeLV), Simian-Sarkom-Virus, Reticuloendotheliose-Virus (REV), Milznekrose-Virus (SNV)), ein B-Typ-Virus (z. B. Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)) oder ein D-Typ-Virus (z. B. Mason-Pfizer-Affen-Virus (MPMV), "SAIDS"-Viren). Ein RNA-Virus der Subfamilie Lentivirus ist wünschenswerterweise ein humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 oder 2 (d. h. HIV-1 oder HIV-2, wobei HIV-1 früher Lymphadenopathie-assoziiertes Virus 3 (HTLV-III) und "Acquired-Immune-Deficiency-Syndrome-(AIDS)-related-Virus" (ARV) genannt wurde), oder ein anderes, zu HIV-1 oder HIV-2 verwandtes Virus, welches identifiziert und mit AIDS- oder AIDS-artiger Erkrankung assoziiert ist. Das Akronym "HIV" oder die Ausdrücke "AIDS-Virus" oder "humanes Immundefizienz-Virus" werden hierin in dem Sinne verwendet, dass sie sich generisch auf diese HIV-Viren und HIV-verwandte und -assoziierte Viren beziehen. Ferner ist ein RNA-Virus der Subfamilie Lentivirus vorzugsweise ein Visna/Maedi-Virus (das z. B. Schafe infiziert), ein felines Immundefizienz-Virus (FIV), bovines Lentivirus, Simian-Immunode fizienz-Virus (SIV), ein equines infektiöses Anämie-Virus (EIAV) oder ein caprines Arthritis-Encephalitis-Virus (CAEV).
  • Ein besonders bevorzugter Vektor gemäß der Erfindung ist ein adenoviraler Vektor (d. h. ein viraler Vektor aus der Familie Adenoviridae, optimalerweise vom Genus Mastadenovirus). Wünschenswerterweise ist ein derartiger Vektor ein Ad2- oder Ad5-Vektor, wobei jedoch auch adenovirale Vektoren anderen Serotyps verwendet werden können. Der zum Gentransfer verwendete adenovirale Vektor kann wildtypisch (d. h. replikationskompetent) sein. Alternativ kann der adenovirale Vektor genetisches Material umfassen mit mindestens einer Modifikation darin, welche das Virus replikationsdefizient machen kann. Die Modifikation des adenoviralen Genoms kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf: Hinzufügung eines DNA-Segments, "Rearrangement" eines DNA-Segmentes, Deletion eines DNA-Segments, Austausch eines DNA-Segments oder Einführung einer DNA-Läsion. Ein DNA-Segment kann so klein sein wie ein Nucleotid und so groß wie 36 Kilobasenpaare (d. h. die ungefähre Größe des adenoviralen Genoms) oder, alternativ, gleich der maximalen Menge, welche in ein adenovirales Virion verpackt werden kann (d. h. ca. 38 kb). Bevorzugte Modifikationen des adenoviralen Genoms umfassen Modifikationen in der E1-, E2-, E3- oder E4-Region. Ähnlich kann ein adenoviraler Vektor ein Cointegrat sein, d. h. eine Ligation von adenoviralen Sequenzen mit anderen Sequenzen, z. B. anderen Virus- oder Plasmidsequenzen.
  • Mit Bezug auf einen viralen Vektor (z. B. insbesondere einen replikationsdefizienten adenoviralen Vektor) kann ein derartiger Vektor entweder vollständige Kapside (d. h. umfassend ein virales Genom, z. B. ein adenovirales Genom) oder leere Kapside (d. h. worin ein virales Genom fehlt oder degradiert ist, z. B. durch physikalische oder chemische Mittel) umfassen. Nach den gleichen Grundsätzen – da Verfahren zum Transferieren von Viren, Plasmiden und Phagen in Form ihrer Nucleinsäuresequenzen (d. h. RNA oder DNA) zur Verfügung stehen – kann ähnlicherweise ein Vektor (d. h. ein Transfervektor) RNA oder DNA in der Abwesenheit jeglichen assoziierten Proteins wie Kapsidprotein und in der Abwesenheit jeglichen Hülllipids umfassen. Ähnlich – da Liposome Zelleintritt durch Fusion mit Zellmembranen bewirken – kann ein Transfervektor Liposome umfassen (wie sie z. B. kommerziell erhältlich sind, z. B. von Life Technologies, Bethesda, MD), wobei konstitutive Nucleinsäuren das Kapsidprotein codieren. Während also erfindungsgemäß ein Vektor ein chimäres adenovirales Kapsidprotein "umfasst", "codiert" ein Transfervektor ein chimäres adenovirales Kapsidprotein; insbesondere Liposom-Transfervektoren "codieren" in dem Sinne, dass sie Nucleinsäuren enthalten, welche tatsächlich das Protein codieren.
  • Ein erfindungsgemäßer Vektor kann zusätzliche Sequenzen und Mutationen umfassen, z. B. einige innerhalb des Kapsidproteins selbst. Beispielsweise umfasst ein erfindungsgemäßer Vektor ferner vorzugsweise eine Nucleinsäure, welche ein Passagiergen umfasst.
  • Eine "Nucleinsäure" ist ein Polynucleotid (DNA oder RNA). Ein "Gen" ist eine Nucleinsäuresequenz, welche für ein Protein oder ein naszierendes RNA-Molekül codiert. Ein "Passagiergen" ist ein Gen, welches in einem Vektor (z. B. einem Transfervektor) gemäß der Erfindung nicht typischerweise präsent ist und in diesen subkloniert ist und welches nach Einführung in eine Wirtszelle von einer erkennbaren Änderung in der intrazellulären Umgebung begleitet ist (z. B. von einem erhöhten Level von Desoxyribonucleinsäure (DNA), Ribonucleinsäure (RNA), Peptid oder Protein oder von einer veränderten Produktions- oder Degradationsrate derselben). Ein "Genprodukt" ist entweder ein bisher untranslatiertes RNA-Molekül, transkribiert aus einem gegebenen Gen oder einer Codierungssequenz (z. B. mRNA oder Antisense-RNA), oder die Polypeptidkette (d. h. Protein oder Peptid), translatiert aus dem von dem gegebenen Gen oder der Codierungssequenz transkribierten mRNA-Molekül. Während ein Gen Codierungssequenzen plus jegliche nicht-codierende Sequenzen umfasst, umfasst eine "Codierungssequenz" keine nicht-codierende (d. h. regulatorische) DNA. Ein Gen oder eine Codierungssequenz ist "rekombinant", wenn die Basensequenz entlang dem Molekül verändert worden ist gegenüber der Sequenz, in der das Gen oder die Codierungssequenz typischerweise in der Natur gefunden wird, oder wenn die Basensequenz nicht typischerweise in der Natur gefunden wird. Gemäß vorliegender Erfindung kann ein Gen oder eine Codierungssequenz ganz oder teilweise synthetisch hergestellt sein, genomische oder komplementäre DNA-(cDNA-)Sequenzen umfassen und in der Form von entweder DNA oder RNA bereitgestellt sein.
  • Nicht-codierende Sequenzen oder regulatorische Sequenzen umfassen Promotor-Sequenzen. Ein "Promotor" ist eine DNA-Sequenz, welche die Bindung von RNA-Polymerase dirigiert und dadurch RNA-Synthese fördert. "Enhancer" sind cis-agierende Elemente von DNA, welche die Transkription benachbarter Gene stimulieren oder inhibieren. Ein Enhancer, der die Transkription inhibiert, wird auch "Silencer" genannt. Enhancer unterscheiden sich von DNA-Bindungsstellen für sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine, welche nur in dem Promotor gefunden werden (auch "Promotor-Elemente" genannt), insofern, als Enhancer in beiden Ausrichtungen funktionieren können und über Distanzen von bis zu einigen Kilobasenpaaren, auch von einer Position stromabwärts einer transkribierten Region aus. Erfindungsgemäß ist eine Codierungssequenz "operativ verknüpft" mit einem Promotor (z. B. wenn sowohl die Codierungssequenz als auch der Promotor ein Passagiergen konstituieren), wenn der Promotor in der Lage ist, Transkription dieser Codierungssequenz zu dirigieren.
  • Demgemäß kann ein "therapeutisches Gen" ein beliebiges Gen sein und ist wünschenswerterweise entweder ein therapeutisches Gen oder ein Reporter-Gen. Vorzugsweise ist ein Passagiergen in der Lage, in einer Zelle exprimiert zu werden, in die der Vektor internalisiert worden ist. Beispielsweise kann das Passagiergen ein Reportergen umfassen oder eine Nucleinsäuresequenz, welche ein Protein, das in irgendeiner Weise in einer Zelle detektiert werden kann. Das Passagiergen kann ferner ein therapeutisches Gen umfassen, z. B. ein therapeutisches Gen, das seinen Effekt auf RNA- oder Proteinebene ausübt. Beispielsweise kann ein Protein, welches von einem transferierten therapeutischen Gen codiert wird, bei der Behandlung einer Erbkrankheit eingesetzt werden, so z. B. die Cystische-Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator-cDNA für die Behandlung der cystischen Fibrose. Das von dem therapeutischen Gen codierte Protein kann seinen therapeutischen Effekt dadurch ausüben, dass es in Zelltötung resultiert. So kann z. B. die Expression des Gens selbst zu Zelltötung führen, wie z. B. bei der Expression des Diphterietoxin-A-Gens, oder die Expression des Gens kann Zellen selektiv sensitiv machen für die Abtötungswirkung gewisser Arzneimittel; so macht z. B. die Expression des HSV-Thymidinkinase-Gens Zellen sensitiv für antivirale Verbindungen, einschließlich Acyclovir, Gancyclovir und FIAU (1-(2-Desoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosil)-5-iodouracil).
  • Ferner kann das therapeutische Gen seinen Effekt auf der RNA-Ebene ausüben, z. B. durch Codieren einer "Antisense-Message" oder eines Ribozyms, eines Proteins, das das Spleißen oder die 3'-Prozessierung (z. B. Polyadenylierung) beeinflusst, oder es kann ein Protein codieren, welches durch Beeinflussung des Expressionslevels eines anderen Gens innerhalb der Zelle wirkt (d. h. wobei Genexpression breit, als alle Schritte von der Transkriptionsinitiation bis zur Produktion eines prozessierten Proteins umfassend betrachtet wird), eventuell u. a. durch Vermittlung einer veränderten mRNA-Akkumulationsrate, einer Veränderung des mRNA-Transports und/oder einer Veränderung in der posttranskriptionalen Regulation. Demgemäß ist es beabsichtigt, dass die Verwendung des Ausdrucks "therapeutisches Gen" diese und jegliche andere Ausführungsformen dessen umfasst, was allgemeiner als Gentherapie bezeichnet wird und dem Fachmann bekannt ist. Ähnlich kann das rekombinante Adenovirus zur Gentherapie oder zum Studium der Expressionseffekte des Gens in einer gegebenen Zelle oder einem Gewebe in vitro oder in vivo verwendet werden.
  • Das rekombinante Adenovirus, welches ein chimäres Kapsidprotein, z. B. ein Fiberprotein, umfasst, und das rekombinante Adenovirus, welches zusätzlich ein Passagiergen oder Gene, die in einer bestimmten Zelle exprimiert werden können, umfasst, kann mittels eines Transfervektors, vorzugsweise eines viralen oder plasmidischen Transfervektors gemäß vorliegender Erfindung generiert werden. Ein derartiger Transfervektor umfasst vorzugsweise eine chimäre adenovirale Kapsidprotein-Gensequenz, wie früher beschrieben. Die chimäre Kapsidprotein-Gensequenz umfasst eine nicht-native Sequenz anstelle der nativen Sequenz, welche deletiert worden ist, oder zusätzlich zu der nativen Sequenz.
  • Eine rekombinante chimäre Kapsidprotein-Gensequenz (z. B. eine Fiber-Gensequenz) kann von einem adenoviralen Transfervektor in Baculovirus oder einen geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektor überführt werden zur Expression und Evaluierung von Rezeptor- oder Proteinspezifität und -avidität, Trimerisierungspotential, Pentonbasis-Bindung und anderen biochemischen Charakteristika.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ferner rekombinante baculovirale und prokaryotische und eukaryotische Expressionsvektoren bereit, umfassend eine chimäre adenovirale Kapsidprotein-Gensequenz (vorzugsweise eine Fiber-Gensequenz), welche ebenfalls "Transfervektoren" sind, wie hierin definiert. Die chimäre Kapsidprotein-Gensequenz (z. B. Fiber-Gensequenz) umfasst eine nicht-native Sequenz zusätzlich zu oder anstelle einer nativen Aminosäuresequenz, und dies erlaubt dem resultierenden chimären Kapsidprotein (z. B. Fiberprotein), an eine Bindungsstelle zu binden, welche von einer Bindungsstelle, die von der nativen Sequenz gebunden wird, verschieden ist. Durch Überführen des chimären Gens von einem adenoviralen Vektor in Baculovirus oder einen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektor ist eine hohe Proteinexpression erzielbar (wobei die chimäre Fiber ca. 5–50% des Gesamtproteins ausmacht).
  • Ferner kann ein erfindungsgemäßer Vektor entweder innerhalb, an Stelle oder außerhalb der Codierungssequenz eines Kapsidproteins zusätzliche Sequenzen umfassen, welche die Trimerisierungsfähigkeit eines Kapsidproteins, z. B. eines Fiberproteins, beeinflussen, oder er kann eine Protease-Erkennungssequenz umfassen. Eine Sequenz, welche die Fähigkeit zur Trimerisierung beeinflusst, umfasst eine oder mehrere Sequenzen, welche Trimerisierung eines chimären Kapsidproteins erlauben, welches ein Fiberprotein ist. Eine Sequenz, welche eine Protease-Erkennungssequenz umfasst, ist eine Sequenz, die durch eine Protease gespalten werden kann, wodurch die Entfernung des chimären Kapsidproteins (oder eines Teils desselben) und Anheftung des rekombinanten Adenovirus an eine Zelle mittels eines anderen Kapsidproteins bewirkt wird. Bei Verwendung mit einem Kapsidprotein, welches ein Fiberprotein ist, beeinflusst die Protease-Erkennungsstelle die Fiber-Trimerisierung oder Rezeptor-Spezifität des Fiberproteins vorzugsweise nicht. Beispielsweise wird bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorzugsweise das Fiberprotein oder ein Teil desselben mittels einer Protease-Erkennungssequenz deletiert, und sodann wird die neue Zelloberflächen-Bindungsstelle entweder in die Pentonbasis oder in das Hexon-Kapsidprotein inkorporiert, vorzugsweise unter Verwendung einer Abstandhaltersequenz wie früher beschrieben.
  • Mit Bezug auf die Produktion von erfindungsgemäßen Vektoren und Transfervektoren werden Transfervektoren mittels molekularer und genetischer Standardtechniken konstruiert, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Vektoren (z. B. Virionen oder Viruspartikel), werden mittels viraler Vektoren produziert. Beispielsweise kann ein viraler Vektor, welcher ein erfindungsgemäßes chimäres Kapsidprotein umfasst, konstruiert werden, indem einer Zelle, welche keine E4-komplementierenden Sequenzen umfasst, folgendes bereitgestellt wird: (1) ein linearer Vektor, umfassend die chimäre Fiber und das Wildtyp-E4-Gen, und (2) ein linearer Vektor, der E4– ist, wie in 3 illustriert. Wie in den folgenden Beispielen beschrieben, resultiert diese Methodik in Rekombination zwischen den Sequenzen, so dass ein Vektor generiert wird, der einen Teil des initialen E4–-Vektors und einen Teil des E4+-Vektors umfasst, insbesondere die Region, welche die chimären Fiber-Sequenzen umfasst.
  • Ähnlich werden die Fiber-Chimäre enthaltenden Partikel in Standardzelllinien produziert, z. B. solchen, wie sie derzeit für adenovirale Vektoren verwendet werden. Nach Produktion und Reinigung werden die Partikel, in denen Fiber zu deletieren ist, fiberlos gemacht durch Verdau der Partikel mit einer sequenzspezifischen Protease, welche die Fiberproteine spaltet und sie von den viralen Partikeln trennt, um fiberlose Partikel zu generieren. Beispielsweise erkennt und spaltet Thrombin bekannte Aminosäuresequenzen, welche in den Vektor inkorporiert werden können (Stenflo et al., J. Biol. Chem., 257, 12280–12290 (1982)). Ähnlich können Deletionsmutanten, denen das Fiber-Gen fehlt, zur Vektorkonstruktion verwendet werden, z. B. H2dl802, H2dl807 und H2dl1021 (Falgout et al., J. Virol., 62, 622–625 (1988)). Es wurde gezeigt, dass diese fiberlosen Partikel stabil und in der Lage sind, Zellen zu binden und zu infizieren (Falgout et al., supra). Diese resultierenden Partikel können dann auf spezifische Gewebe zielgesteuert werden über die Pentonbasis oder ein anderes Kapsidprotein, wobei ein derartiges anderes Kapsidprotein vorzugsweise eine oder mehrere nicht-native Aminosäuresequenzen gemäß der Erfindung umfasst.
  • Alternativ kann rekombinantes Adenovirus, umfassend chimäres Fiberprotein, welches weitere Modifikationen aufweist, produziert werden durch die Entfernung der nativen Knob-Region des Fiberproteins, welche Rezeptor-Bindungs- und Trimerisierungsdomänen umfasst, und ihren Austausch gegen eine nicht-native Trimerisierungsdomäne (Peteranderl et al., Biochemistry, 31, 12272–12276 (1992)) und eine nicht-native Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung. Ein rekombinantes Adenovirus, umfassend ein chimäres Fiberprotein, kann ferner produziert werden durch Punktmutation in der Knob-Region und die Isolierung von Klonen, welche zur Trimerisierung befähigt sind. In jedem Falle und auch mit Bezug auf die Entfernung und den Austausch der nativen Rezeptor-spezifischen Bindungssequenz wie oben beschrieben, können neue Protein-Bindungsdomänen an den C-Terminus des Fiberproteins oder in exponierte Schleifen des Fiberproteins hinzugefügt werden durch Insertieren einer oder mehrerer Kopien der die nicht-native Aminosäuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz in der geeigneten Position. Vorzugsweise ist ein derartiges Fiberprotein in der Lage zu trimerisieren, so dass es an Pentonbasis-Protein binden kann.
  • Das oben beschriebene Verfahren zur Generierung von chimärem Fiberprotein kann auch verwendet werden, um andere chimäre Kapsidproteine herzustellen, z. B. chimäres Hexon- oder Pentonprotein.
  • Illustrative Verwendungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein chimäres Protein bereit, welches in der Lage ist, mit hoher Effizienz an Zellen zu binden und Zelleintritt zu vermitteln, sowie Vektoren und Transfervektoren, welche dasselbe umfassen. Das chimäre Kapsidprotein selbst hat multiple Verwendungen, z. B. als ein Werkzeug für in-vitro-Studien von Adenovirus-Bindung an Zellen (z. B. durch Scatchard-Analyse, wie früher von Wickham et al. (1993), supra, gezeigt), zum Blockieren von Adenovirus-Bindung an Rezeptoren in vitro (z. B. mit Hilfe von Antikörpern, Peptiden und Enzymen, wie in den Beispielen beschrieben) und zum Schutz gegen adenovirale Infektion in vivo durch Kompetition um die Bindung an die Bindungsstelle, durch die Adenovirus Zelleintritt bewirkt.
  • Ein Vektor, welcher ein chimäres Kapsidprotein umfasst, kann ferner zur Stammgenerierung und als ein Mittel zur Herstellung neuer Vektoren verwendet werden. Beispielsweise kann die nicht-native Aminosäuresequenz an Nucleinsäuren binden und sie kann intrazellulär eingeführt werden als ein Mittel zur Generierung neuer Vektoren via Rekombination. Ähnlich kann ein Vektor in der Gentherapie verwendet werden. Beispielsweise kann ein Vektor gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden zur Behandlung einer Anzahl von Erkrankungen durch Delivery von korrektiver DNA, d. h. DNA, die eine Funktion codiert, welche entweder fehlt oder beeinträchtigt ist, oder eines diskreten "Killing"-Agens, z. B. DNA, die ein Cytotoxin codiert, welches z. B. nur intrazellulär aktiv ist, in Zielzellen. Erkrankungen, die Kandidaten für eine derartige Behandlung sind, umfassen beispielsweise Krebs, z. B. Melanom, Gliom oder Lungenkrebs; genetische Störungen, z. B. cystische Fibrose, Hämophilie oder Muskeldystrophie; pathogene Infektionen, z. B. HIV, Tuberkulose oder Hepatitis; Herzerkrankungen, z. B. die Verhinderung von Restenose nach Angioplastie oder die Förderung von Angiogenese zur Reperfusion von nekrotischem Gewebe; und Autoimmunkrankheiten, z. B. Crohn'sche Krankheit, Kolitis oder rheumatoide Arthritis.
  • Insbesondere kann Gentherapie durchgeführt werden bei der Behandlung von Krankheiten, Störungen oder Zuständen, welche mit verschiedenen Geweben assoziiert sind, denen hohe Levels des Rezeptors, an den Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein bindet, offenbar fehlen und für die somit derzeitige adenoviral vermittelte Ansätze der Gentherapie weniger als optimal sind (z. B. für Delivery in Monocyten/Makrophagen, Fibroblasten, Neuronal-, Glattmuskel- und Epithelzellen). Gewebe, welche diese Zellen umfassen (und damit assoziierte Erkrankungen, Störungen und Zustände), umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Endothel (z. B. Angiogenese, Restenose, Inflammation und Tumore); Neuronalgewebe (z. B. Tumore und Alzheimer-Krankheit); Epithel (z. B. Erkrankungen der Haut, der Kornea, des Intestinums und der Lunge); hämatopoetische Zellen (z. B. HIV (HIV-1, HIV-2), Krebs und Anämien); glatte Muskeln (z. B. Restenose) und Fibroblasten (z. B. Inflammation).
  • Ferner kann anstelle des Transferierens eines therapeutischen Gens statt dessen ein Reportergen oder irgendein Typ von Markergen mittels der erfindungs gemäßen Vektoren (insbesondere der adenoviralen Vektoren) transferiert werden. Markergene und Reportergene können z. B. Verwendung finden in Zelldifferenzierungs- und Zellschicksalstudien sowie potentiell für diagnostische Zwecke. Ferner können ein Standard-Reportergen, z. B. ein β-Galactosidase-Reportergen, ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) codierendes Gen oder ein β-Glucuronidase-Gen in vivo verwendet werden, z. B. als ein Mittel zum Assay in einem lebenden Wirt oder z. B. als ein Mittel zur zielgerichteten Zellablation (siehe z. B. Minden et al., Biotechniques, 20, 122–129 (1996); Youvan, Science, 268, 264 (1995); US-Patent Nr. 5 432 081 ; Deonarain et al., Br. J. Cancer, 70, 786–794 (1994)).
  • Ähnlich kann es wünschenswert sein, ein Gen zu transferieren, um einen Wirt im Wesentlichen als ein Mittel zur in vivo-Produktion eines bestimmten Proteins zu benutzen. Nach diesen Grundsätzen sind transgene Tiere verwendet worden, z. B. für die Produktion von rekombinanten Polypeptiden in der Milch von transgenen bovinen Spezies (z. B. Internationale PCT-Anmeldung WO 93/25567 ). Andere "nicht-therapeutische" Gründe für den Gentransfer umfassen das Studium von menschlichen Erkrankungen mittels eines Tiermodells (z. B. die Verwendung von transgenen Mäusen und anderen transgenen Tieren, einschließlich p53-Tumor-Suppressor-Gen-Knockouts für tumorigene Studien, die Verwendung eines transgenen Modells für gestörte Glucose-Toleranz und menschliche Alzheimer-Amyloid-Precursor-Proteinmodelle für das Studium des Glucosemetabolismus bzw. der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit etc.).
  • Diese im Vorstehenden erwähnten illustrativen Verwendungen sind keinesfalls erschöpfend, und es ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung derartige weitere Verwendungen mit umfasst, die sich aus der Offenbarung ableiten, aber nicht explizit hierin angegeben sind. Ähnlich ergeben sich zahlreiche Vorteile in Zusammenhang mit der Verwendung der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung.
  • Beispielsweise ist die Verwendung eines Universal-Targeting-Vektors gemäß der Erfindung vorteilhaft aus folgenden Gründen: (1) der Vektor kann potentiell für alle Zellen und Gewebe verwendet werden; (2) es wird nur ein Vektor zur Verwendung in allen Zelllinien benötigt, es besteht keine Notwendigkeit, einen unabhängigen Vektor zu co-transfizieren; (3) der Vektor ist in der Lage, Gen-Delivery mit einer Effizienz zu bewirken, die gegenüber derjenigen, die für Wildtyp-Fiberprotein umfassende Vektoren beobachtet wird, gesteigert ist; (4) der Vektor, anders als frühere Vektoren, steuert nicht gezielt spezifische Zellen an, sondern erhöht vielmehr die Transduktionseffizienz in einer Weise, die global zu sein scheint; (5) der Vektor ist in der Lage, Gentransfer zu vermitteln, wenn er in einer reduzierten Dosis (d. h. Multiplizität der Infektion (MOI)) verwendet wird, verglichen mit dem Wildtyp-Fiberprotein umfassenden Vektor, und mindert so wahrscheinlich die dosierungsbezogenen Nachteile, welche mit derzeit verfügbaren adenoviralen Vektoren einhergehen; und (6) der Vektor kann propagiert und aufrechterhalten werden mittels derzeit verfügbarer Zelllinien.
  • Die Fähigkeit eines Universal-Targeting-Vektors, z. B. eines Universal-Targeting-Adenovirus-Vektors, potentiell an alle oder die meisten Gewebe zu binden und in dieselben einzutreten, bietet mehrere Vorteile. Diese Vorteile umfassen gesteigerte Effizienz des Gen-Delivery in multiple Gewebe, die Verfügbarkeit eines einzigen Vektors, der in der Lage ist, Gene in alle Gewebe zu liefern, und vereinfachte Produktion notwendiger Komponenten für das Gen-Delivery. Ferner umfasst ein derartiger Universal-Targeting-Vektor ein Potential, exogene DNA in Zellen zu liefern, indem der Vektor die DNA "huckepack" nimmt mittels einer Protein/DNA-Interaktion.
  • Weitere potentielle Vorteile eines derartigen Universal-Targeting-Vektors umfassen eine beträchtlich (z. B. 10- bis 100fach) gesteigerte Effizienz des Delivery in Zellen, welche niedrige Levels des Fiber-Rezeptors, an den Wildtyp-Fiberprotein bindet, exprimieren, sowie gesteigerte Effizienz in Zellen oder Gewebe, welche den Fiber-Rezeptor exprimieren, an den Wildtyp-Fiber bindet. Ferner sollte die reduzierte Dosis, bei der die Vektoren verwendet werden, in einer Reduzierung Adenovirus-assoziierter Inflammation, der humoralen Antwort auf Adenovirus und der cytotoxischen T-Lymphocyten-Antwort auf Adenovirus resultieren.
  • Ferner ist der Vektor vorteilhaft insofern, als er durch konventionelle Mittel isoliert und gereinigt werden kann. Da Änderungen in dem Vektor auf der Genom-Ebene durchgeführt werden, sind keine beschwerlichen und teuren Modifikationen nach der Produktion erforderlich, wie sie mit anderen Vektoren verbunden sind (siehe z. B. Cotten et al., supra; Wagner et al., supra). Ähnlich sind keine speziellen Rezeptor-exprimierenden Zelllinien erforderlich. Ein UTV-Vektor kann zu ähnlichen Titern propagiert werden wie ein Wildtyp-Vektor, dem die Fiber-Modifikation fehlt.
  • Mittel zur Verabreichung
  • Die Vektoren und Transfervektoren gemäß vorliegender Erfindung können verwendet werden, um entweder in vitro oder in vivo mit Zellen in Kontakt gebracht zu werden. Erfindungsgemäß umfasst "Inkontaktbringen" beliebige Mittel, mit denen ein Vektor intrazellulär eingeführt wird; das Verfahren ist nicht von besonderen Mitteln zur Einführung abhängig und ist nicht so auszulegen. Mittel zur Einführung sind dem Fachmann wohlbekannt und sind ferner beispielhaft hierin erläutert.
  • Demgemäß kann die Einführung z. B. entweder in vitro (z. B. in einem ex vivo-Verfahren der Gentherapie oder in Gewebekulturstudien) oder in vivo durch Elektroporation, Transformation, Transduktion, Konjugation oder "Triparental Mating", (Co-)Transfektion, (Co-)Infektion, Membranfusion mit kationischen Lipiden, Hochgeschwindigkeitsbombardement mit DNA-umhüllten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitat, direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen und dergleichen bewirkt werden. Ähnlich können die Vektoren mittels kationischer Lipide, z. B. Liposome, eingeführt werden. Solche Liposome sind kommerziell erhältlich (z. B. Lipofectin®, LipofectamineTM und dergleichen von Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Ferner können Liposome mit erhöhter Transferkapazität und/oder reduzierter Toxizität in vivo (siehe z. B. die PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/21259 ) für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Ferner stehen andere Methoden zur Verfügung und sind dem Fachmann bekannt.
  • Erfindungsgemäß umfasst ein "Wirt" (und damit eine "Zelle" von einem Wirt) einen beliebigen Wirt, in den ein erfindungsgemäßer Vektor eingeführt werden kann, und umfasst somit ein Tier, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Amphibien, Vögel, Fische, Insekten, Reptilien oder Säugetiere. Optimalerweise ist ein Wirt ein Säugetier, z. B. ein Rodent, Primat (z. B. Schimpanse, lang-, kurz-, ungeschwänzte Affen, Gorilla, Orang-Utan oder Gibbon), Feline, Canine, Ungulat (z. B. Ruminant oder Schwein) sowie insbesondere ein Mensch.
  • Insofern als ein Universal-Targeting-Vektor offenbar in alle Zellen eintritt, kann eine Zelle eine beliebige Zelle sein, in die ein derartiger Vektor eintreten kann. Insbesondere kann ein Universal-Targeting-Vektor verwendet werden für Gentransfer in eine Zelle, welche niedrige oder nicht-detektierbare Levels von Fiber-Rezeptor exprimiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf endotheliale, glatte Muskel-, neuronale, hämatopoetische oder fibroblastische Zellen.
  • Für den Fachmann wird erkennbar sein, dass geeignete Verfahren zur Verabreichung eines Vektors (insbesondere eines adenoviralen Vektors) gemäß vorliegender Erfindung an ein Tier zum Zwecke der Gentherapie (siehe z. B. Rosenfeld et al., Science, 252, 431–434 (1991); Jaffe et al., Clin. Res., 39(2), 302A (1991); Rosenfeld et al., Clin. Res., 39(2), 311A (1991); Berkner, BioTechniques, 6, 616–629 (1988)), Chemotherapie und Impfung zur Verfügung stehen und dass man zwar mehr als eine Route zur Verabreichung verwenden kann, dass aber eine bestimmte Route eine unmittelbarere und effektivere Reaktion bereitstellen kann als eine andere Route. Pharmazeutisch zulässige Exzipienten sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und sind leicht verfügbar. Die Wahl des Exzipienten wird zum Teil bestimmt durch das jeweilige Verfahren, welches zur Verabreichung des rekombinanten Vektors verwendet wird. Dementsprechend gibt es eine breite Vielfalt an geeigneten Formulierungen zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Verfahren und Exzipienten sind rein exemplarisch und in keiner Weise limitierend.
  • Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können bestehen aus: (a) flüssigen Lösungen, z. B. aus einer wirksamen Menge der Verbindung, gelöst in Verdünnungsmitteln wie Wasser, Kochsalzlösung oder Orangensaft; (b) Kapseln, Sachets oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge der Aktivsubstanz als Feststoffe oder Granulen enthalten; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (d) geeignete Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfassen: Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Cellulose, Acacia, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talkum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Exzipienten, Farbmittel, Verdünnungsmittel, Pufferagenzien, Feuchthaltemittel, Konservierungsmittel, Geschmackstoffe und pharmakologisch kompatible Exzipienten. Pastillenformen können die Aktivsubstanz in einem Geschmackstoff umfassen, üblicherweise Saccharose und Acacia oder Tragant, sowie Pastillen, welche die Aktivsubstanz in einer inerten Grundlage umfassen, z. B. Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Acacia, Emulsionen, Gele und dergleichen, welche neben der Aktivsubstanz solche Exzipienten enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Ein Vektor oder Transfervektor gemäß vorliegender Erfindung kann – für sich allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten – zu Aerosol-Formulierungen verarbeitet werden, welche durch Inhalation zu verabreichen sind. Diese Aerosol-Formulierungen können in zulässige Drucktreibmittel eingebracht werden, z. B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen. Sie können ferner als Arzneimittel für drucklose Zubereitungen, z. B. in Nebulisatoren oder Zerstäubern, formuliert werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nichtwässrige isotonische, sterile Injektionslösungen, welche Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen, welche die Formulierung auf Isotonie mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers einstellen, enthalten können, sowie wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, welche Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einzeldosis- oder Mehrdosenbehältnissen, z. B. Ampullen und Vials, dargeboten werden und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, wobei nur die Zugabe des sterilen flüssigen Exzipienten wie Wasser für Injektionen unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Extemporane Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulen und Tabletten der früher beschriebenen Art hergestellt werden.
  • Ferner kann ein Vektor oder Transfervektor gemäß vorliegender Erfindung zu Suppositorien verarbeitet werden durch Mischen mit einer Vielfalt von Grundlagen, z. B. mit emulgierenden Grundlagen oder wasserlöslichen Grundlagen.
  • Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schaumpräparate oder Sprayformulierungen dargeboten werden, welche neben der Aktivsubstanz solche Träger enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet als geeignet bekannt sind.
  • Die einem Tier, insbesondere einem Menschen verabreichte Dosis im Kontext der vorliegenden Erfindung variiert je nach dem interessierenden Gen, der verwendeten Zusammensetzung, der Verabreichungsmethode und dem jeweils behandelten Ort und Organismus. Die Dosis sollte jedoch ausreichend sein, um eine therapeutische Antwort zu bewirken.
  • Wie bereits angegeben, kann ein Vektor oder ein Transfervektor gemäß vorliegender Erfindung auch in vitro Verwendung finden. Ein derartiger Vektor kann als Forschungswerkzeug beim Studium der adenoviralen Anheftung und Infektion von Zellen und in einem Verfahren zum Assay von Bindungsstelle-Ligand-Interaktion verwendet werden. Ähnlich kann das rekombinante Kapsidprotein, welches eine nicht-native Aminosäuresequenz zusätzlich zu oder an Stelle einer nativen Rezeptor-Bindungssequenz umfasst, z. B. in Rezeptor-Ligand-Assays und als Adhäsionsprotein in vitro oder in vivo verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sind selbstverständlich nicht so auszulegen, dass sie den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt eine Untersuchung der Levels von Adenovirus-Rezeptor in verschiedenen Zellen, wie bestimmt durch die Fähigkeit von Wildtyp-Adenovirus, an die Zellen zu binden.
  • Für diese Experimente wurde die Fähigkeit von Wildtyp-Fiber umfassendem Adenovirus, an von verschiedenen Geweben abgeleitete Gewebe zu binden, abgeschätzt. Adenovirus-Partikel eines Ad5-Stammes wurden mit [3H]-Thymi din markiert, wie früher beschrieben (siehe z. B. Wickham et al., Cell, 73, 309–319 (1993)). Subsättigende Levels von Thymidin-markiertem Adenovirus wurden zu 200 μl von 106 Zellen hinzugefügt, welche ca. 30 bis 60 Minuten mit oder ohne 20 μg/ml löslichen Fiberproteins vorinkubiert worden waren. Die Zellen wurden mit dem Virus für 1 Stunde bei 4°C inkubiert und dann dreimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die verbleibenden zellassoziierten Counts wurden in einem Szintillationszähler gemessen. Die spezifische Bindung wurde gemessen durch Subtrahieren der zellassoziierten Counts (d. h. Counts pro Minute (cpm)) in der Anwesenheit von Fiber von den zellassoziierten Counts in der Abwesenheit von Fiber. Die Bindung in der Anwesenheit von Fiber betrug nie mehr als 2% des gesamten Input von radioaktiven Viruspartikeln. Die Resultate wurden als Mittelwerte von Triplikatmessungen erhalten.
  • Wie in 1 illustriert, exprimierte eine beträchtliche Anzahl der von verschiedenen Geweben abgeleiteten Zellen wenig oder keinen Fiber-Rezeptor, wie durch eine relative Unfähigkeit von Wildtyp-Adenovirus, an diese Zellen zu binden, gezeigt. Zellen epithelialen Ursprungs (d. h. "Rezeptor-plus"-Zellen, einschließlich Chang-, HeLa- und A549-Zellen), banden hohe Levels von Adenovirus. Im Vergleich dazu zeigten nicht-epitheliale Zellen (d. h. "Rezeptor-minus"-Zellen, wie Monocyten/Makrophagen, Fibroblasten, neuronale, glatte Muskel- und epitheliale Zellen) Reduzierungen in der Virusbindung um das ca. 10fache oder mehr, verglichen mit epithelartigen Zellen.
  • Diese Resultate bestätigen die bislang unerkannte relative Unfähigkeit von Adenovirus, an Rezeptor-minus-Nicht-Epithelzellen zu binden und folglich in dieselben einzutreten, verglichen mit Rezeptor-plus-Epithelzellen. Vermutlich ist diese Unfähigkeit zurückzuführen auf die geringe Repräsentation von Rezeptoren für Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein auf diesen Zellen.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines adenoviralen Vektors, umfassend ein chimäres Kapsidprotein, insbesondere ein chimäres adenovirales Fiberprotein.
  • Um die Transduktionslimitation zu überwinden, die durch die Anwesenheit von nur einer begrenzten Zahl an Fiber-Rezeptoren auf klinisch relevanten Geweben, wie nicht-epithelialem Gewebe, auferlegt wird, wurde ein modifizierter Adenovirus-Vektor konstruiert, wie in den 2A und 2B gezeigt, um einen Vektor abzuleiten, der hierin als "Universal-Transfer-Vektor" oder UTV bezeichnet wird. Insbesondere wurde eine Frameshift-Mutation in einem Gen erzeugt, welches ein adenovirales Kapsidprotein codiert, in diesem Fall in dem Fiber-Gen. Bei Wildtyp-Adenovirus enthält das unmodifizierte Fiber-Gen ein geschachteltes ("nested") translationales Stop-Signal (TAA) und transkriptionales Polyadenylierungssignal (AATAAA). Das Polyadenylierungssignal dirigiert die Hinzufügung eines polyA-Schwanzes an das 3'-Ende des Transkripts. Der polyA-Schwanz umfasst typischerweise von ca. 20 bis ca. 200 Nucleotide. Nach Transkription und Verlassen des Kerns dirigiert das TAA-Stop-Signal die Terminierung der Translation durch das Ribosom.
  • Im Vergleich dazu fehlt dem modifizierten Fiber-Gen eines UTV-Vektors ein "in-frame" translationales "Stop"-Signal. Nach normaler Transkription und Hinzufügung der polyA-Extension an die mRNA in der Abwesenheit des Stop-Codon setzt das Ribosom die Translation des Transkripts in die polyA-Region fort. Insofern als der Codon AAA für die Aminosäure Lysin codiert, enthält das resultierende chimäre Fiber-Gen-Translationsprodukt, welches durch einen UTV produziert wird, eine Hinzufügung von einem String von Polylysinresten am C-Terminus, d. h. Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys [SEQ ID NO: 1]. Es ist möglich, dass ein zellulärer Prozess wirkt, um die Länge des Polylysin-String zu begrenzen, weil die Polylysinreste typischerweise ca. 3 bis ca. 30 Reste in dem chimären Fiberprotein umfassen. Aber wie auch immer: die Polylysin-Protein-Modifikation sowie weitere hierin beschriebene Modifikationen erlauben dem UTV ein effizientes Anheften an Zellen, denen hohe Levels des Rezeptors für Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein fehlen (d. h. Rezeptor-minus-Zellen).
  • Mit Bezug auf die Vektorkonstruktion und -charakterisierung wurden molekulare und genetische Standardtechniken durchgeführt, z. B. die Generierung von Stämmen, Plasmiden und Viren, Gelelektrophorese, DNA-Manipulationen, einschließlich Plasmidisolierung, DNA-Klonierung und -Sequenzierung, Western-Blot-Assays und dergleichen, wie sie dem Fachmann bekannt sind und im Detail in Standard-Laborhandbüchern beschrieben sind (z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1992); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987)). Restriktionsenzyme und andere Enzyme, welche für molekulare Manipulationen eingesetzt wurden, wurden von kommerziellen Quellen bezogen (z. B. Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Indiana; New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) und gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Für Experimente verwendete Zellen (z. B. Zellen der transformierten humanen embryonalen Nierenzelllinie 293 (d. h. CRL 1573-Zellen) und andere, von American Type Culture Collection gelieferte Zellen) wurden kultiviert und aufrechterhalten mittels steriler Standard-Kulturreagenzien, -medien und -techniken, wie früher beschrieben (Erzerum et al., Nucleic Acids Research, 21, 1607–1612 (1993)).
  • Demgemäß wurde die Frameshift-Mutation des Fiber-Stop-Codon erzeugt durch Einführen einer modifizierten BamHI-Stelle (d. h. GGATCCAA [SEQ ID NO: 6]) in einen adenoviralen Transfervektor. Durchgeführt wurde dies, wie in 3 illustriert, ausgehend von dem Transferplasmid pAd NS 83-100 (welches auch als p193NS 83-100 oder pNS 83-100 bekannt ist). pAd NS 83-100 wurde konstruiert durch Klonieren des Ad5-NdeI-SalI-Fragments, welches die Karteneinheiten-Region 83-100 des Ad5-Genoms überspannt, die das Fiber-Gen enthält, in das Plasmid pNEB193 (New England Biolabs, Beverly, MA).
  • Das NdeI-MunI-Fragment von pAd NS 83-100 wurde durch ein synthetisches Oligonucleotid ersetzt, umfassend eine BamHI-Stelle, die von einer 5'-NdeI-Stelle und einer 3'-MunI-Stelle flankiert war, um Klonierung zu erleichtern. Das doppelsträngige synthetische Oligonucleotid-Fragment wurde erzeugt aus überlappenden synthetischen einzelsträngigen Sense- und Antisense-Oligonucleotiden, d. h. dem Sense-Primer TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C [SEQ ID NO: 9] und dem Antisense-Primer AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA [SEQ ID NO: 10], wie in den 4A bzw. 4B illustriert. Die Enden der überlappenden Oligomere wurden so erzeugt, dass Überhänge entstehen, die kompatibel sind für ein direktes Klonieren in die NdeI- und MunI-Stellen.
  • Dem resultierenden Transferplasmid pAd NS 83-100 (F–) (welches auch als p193NS (ΔF) oder pNS (ΔF) bekannt ist), fehlen bis auf die ersten 50 Basenpaare alle Basenpaare der Codierungssequenz für das Fiber-Gen (d. h. das Plasmid ist "Fiber-minus"). Der Vektor enthält ferner die gesamte adenovirale E4-Codierungssequenz. Das Plasmid behält das AATAAA-Polyadenylierungssignal bei, welches in dem synthetischen NdeI/MunI-Oligonucleotid enthalten ist, und inkorporiert ferner die neue BamHI-Restriktionsstelle.
  • Das mutierte Fiber-Gen wurde in das Fiber-minus-pAd NS 83-100-Plasmid inkorporiert mittels synthetischer Sense- und Antisense-Oligonucleotid-Primer, um das Fiber-Gen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren und dabei gleichzeitig eine modifizierte BamHI-Stelle auf den letzten Codon des Fiber-Gens folgend zu inkorporieren, um das mutante Fiber-Gen zu erzeugen. Diese inkorporierte modifizierte BamHI-Stelle dient ferner zum Codieren für die Aminosäuren Glycin und Serin, resultierend in einer chimären Nucleinsäuresequenz von GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT [SEQ ID NO: 7]. Das modifizierte Fiber-Gen codiert also für eine Extension zu dem resultierenden chimären Fiberprotein von Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys [SEQ ID NO: 4], wobei die Länge des Polylysin-String variieren kann. Die synthetischen Oligonucleotide, welche zur Fiber-Amplifizierung verwendet wurden, waren der Primer TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA [SEQ ID NO: 11] und der Primer CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA [SEQ ID NO: 12], wie in 4C bzw. 4D illustriert.
  • Das amplifizierte Genprodukt wurde dann mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI geschnitten und in die NdeI/BamHI-Stellen des Fiber-minus-Plasmids pAd NS 83-100 kloniert, um den Transfervektor pAd NS 83-100 UTV zu erzeugen (der auch bekannt ist als p193NS (F5*), p193 (F5*) oder pNS (F5*)). Die gesamte NdeI-SalI-Adenovirus-Sequenz von pAd NS 83-100 UTV wurde in das Fiber-minus-Plasmid pAd BS 59-100 kloniert, um pAd BS 59-100 UTV zu erzeugen (auch als p193NS (F5*), p193 (F5*) oder pNS (F5*) bekannt).
  • Der UTV-Adenovirus-Vektor wurde erzeugt durch homologe Rekombination in 293-Zellen. Namentlich wurde der E4+ pAd BS 59-100 UTV-Transfervektor mit SalI linearisiert und in 293-Zellen transfiziert, welche zuvor mit dem Adenovirus-Vektor A2F infiziert worden waren. Der A2F-Vektor war von einem GV10-Vektor abgeleitet. Der Ad5-basierte Vektor G10 enthält das lacZ-Gen unter der Kontrolle des Rous-Sarcoma-Virus-Promotors (d. h. er umfasst RSV lacZ). Die Insertion des Reportergens in GV10 wird innerhalb der E1-Region durchgeführt (d. h. der Vektor ist E1–). Der GV10-Vektor enthält ferner eine Deletion der E3-Region, ist aber E4+. Im Vergleich mit GV10 (d. h. RSV lacZ E1– E3– E4+) umfasst A2F ferner eine Deletion der essentiellen E4-Adenovirus-Gene, ist aber E3+ (d. h. RSV lacZ E1– E3+ E4–).
  • Die 293-Zellen enthalten eine E1-komplementierende Sequenz, enthalten aber keine E4-komplementierende Sequenz. Das Fehlen einer E4-komplementierenden Sequenz verhindert Replikation des E4– A2F-Vektors in der 293-Zelllinie. Bei gleichzeitiger Einführung von A2F-Virus und pAd BS 59-100 UTV in 293-Zellen findet jedoch eine homologe Rekombination zwischen dem UTV-Transfervektor und dem A2F-Adenovirus-Genom statt, so dass ein E3+ E4+-Adenovirus-Genom produziert wird, umfassend ein chimäres Fiberprotein, welches zur Replikation in 293-Zellen befähigt ist. Dieser besondere resultierende UTV-Vektor erhielt die Bezeichnung GV10 UTV.
  • Der GV10 UTV-Vektor wurde mittels Standard-Plaque-Isolierungstechniken mit 293-Zellen isoliert. Nach drei aufeinanderfolgenden Plaque-Reinigungsrunden enthielt der GV10 UTV-Vektor die Fiber-Mutation und war frei von jeglicher Kontamination durch den E4– A2F-Vektor. Die Anwesenheit der chimären Fiber-Sequenzen in dem GV10 UTV-Vektor wurde bestätigt durch Sequenzieren der Fiber-mRNA mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), welche die Anwesenheit eines Polyadenin-Schwanzes in der chimären Fiber-mRNA validierte.
  • Ähnlich wurde die Produktion eines chimären Fiberproteins durch den Vektor mittels Western Blot bestätigt. Dazu wurden 293-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 entweder mit GV10, umfassend Wildtyp Adenovirus-Fiberprotein, oder mit GV10 UTV, umfassend chimäres Fiberprotein, infiziert. Zwei Tage post Infektion wurden die Zellen gewaschen und dann in PBS mit tels dreier Gefrier-Tau-Zyklen lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt und auf ein 10% Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gel geladen. Nach Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose transferiert und durch Chemilumineszenz mittels eines polyklonalen Antikörpers zu Fiber detektiert. Der Western Blot ist in 5 gezeigt. Wie aus dieser Figur ersichtlich, zeigt die Migration der Proteine an, dass die chimäre UTV-Fiber ca. 1,5 bis ca. 2,0 kDa größer ist als das unmodifizierte 62 kDa-WT-Fiberprotein.
  • Diese Resultate bestätigen, dass das hierin identifizierte Verfahren verwendet werden kann, um Modifikationen in das Fiberprotein einzuführen, um ein chimäres Fiberprotein zu produzieren. Ähnliche Techniken können verwendet werden, um Modifikationen in die Hexon- oder Penton-Proteine einzuführen oder um ähnliche Modifikationen einzuführen (z. B. die Hinzufügung eines String von Aminosäuren, umfassend Arginin, Lysin und/oder Histidin oder umfassend Aspartat und/oder Glutamat, oder die Hinzufügung einer beliebigen dieser Sequenzen in eine Codierungsregion der Kapsidproteine).
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel beschreibt die Zellbindung eines adenoviralen Vektors, umfassend ein chimäres Kapsidprotein, z. B. ein chimäres Fiberprotein, im Vergleich zu einem Wildtyp-Adenovirus-Vektor, entweder in der Anwesenheit oder in der Abwesenheit von hinzugefügtem löslichem Wildtyp-Fiberprotein.
  • Für diese Experimente wurden die in Beispiel 1 identifizierten Zellen verwendet, an die Adenovirus entweder mit hoher Effizienz bindet (d. h. Rezeptor-plus-Zellen) oder mit niedriger Effizienz bindet (d. h. Rezeptor-minus-Zellen). Die Epithelzelllinie A549 wurde als repräsentativ für Rezeptor-plus-Zellen verwendet, und die Fibroblastzellline HS 68 wurde als repräsentativ für Rezeptor-minus-Zellen verwendet. Konfluente Monolayer von entweder A549- oder HS 68-Zellen wurden bei 4°C mit Konzentrationen an löslichem Fiberprotein im Bereich von 0 bis ca. 10 μg/ml vorinkubiert. Der GV10 UTV-Vektor, umfassend chimäres Fiberprotein (UTV), oder der GV10-Vektor, umfassend Wildtyp-Fiberprotein (WT), wurde mit tritiiertem Thymidin markiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Circa 20 000 cpm von [3H]-Thymidin-markiertem GV10 UTV- oder GV10-Vektor wurden sodann mit den Zellen für ca. 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit kaltem PBS gewaschen, und der zellassoziierte cpm-Wert wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Resultate wurden als Mittelwerte von Duplikatmessungen erhalten und sind in den 6A und 6B für die A549- bzw. die HS 68-Zelllinie präsentiert.
  • Wie aus den 6A–B ersichtlich, war der GV10 UTV-Vektor, welcher chimäres Fiberprotein umfasst, in der Lage, sowohl Rezeptor-plus-Zellen (6A) als auch Rezeptor-minus-Zellen (6B) mit hoher Effizienz zu binden. Im Vergleich dazu war der GV10-Vektor, welcher Wildtyp-Fiber umfasst, effektiver in der Bindung an Rezeptor-plus-Zellen. Insbesondere band radiomarkierter GV10 UTV ca. 2- bis 2,5fach besser als GV10 an Zellen, welche detektierbare Levels von Fiber-Rezeptor exprimieren (d. h. A549-Alveolarepithelzellen). Während die gesamte Bindung des GV10-Vektors durch kompetierendes rekombinantes Fiberprotein inhibiert war, waren nur ca. 40% des GV10 UTV-Vektors durch die Hinzufügung von kompetierender Fiber inhibiert. Es wurde keine detektierbare Bindung des Wildtyp-Adenovirus-Fiber umfassenden GV10-Vektors an HS 68-Zellen (humane Vorhaut-Fibroblasten), denen Fiber-Rezeptor fehlt, beobachtet. Im Vergleich dazu band der GV10 UTV-Vektor effizient an HS 68-Zellen und die Hinzufügung von kompetierendem Fiberprotein hatte keinen Effekt auf die Bindung.
  • Diese Resultate bestätigen, dass die Bindung des GV10 UTV-Vektors, der ein chimäres Kapsidprotein (d. h. ein chimäres Fiberprotein) umfasst, nicht über den Wildtyp-Adenovirus-Fiber-Rezeptor stattfindet, sondern über einen bislang unerkannten Fiber-Rezeptor. Ferner bestätigen die Ergebnisse, dass die Inkorporation eines chimären Kapsidproteins, z. B. eines chimären Fiberproteins, in einen adenoviralen Vektor in einem verbesserten adenoviralen Vektor resultiert. Namentlich erlaubt die von dem GV10 UTV-Vektor umfasste Modifikation, die zuvor erwähnte relative Unfähigkeit von Wildtyp-Adenovirus, an Rezeptor-minus-Zellen, insbesondere an nicht-epitheliale Zellen, zu binden, zu überwinden und erlaubt dem modifizierten Vektor ferner, an Rezeptor-plus-Zellen mit einer gesteigerten Effizienz zu binden.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel beschreibt eine Untersuchung der Fähigkeit von verschiedenen löslichen Faktoren und Inhibitoren dieser löslichen Faktoren, die Bindung von Adenovirus, welches chimäres Fiberprotein umfasst, an Rezeptor-minus-HS 68-Fibroblastzellen zu blockieren.
  • Für diese Experimente wurde die Inhibition der GV10 UTV-Bindung durch verschiedene negativ geladene Moleküle, einschließlich Lachssperma-DNA, Mucin, Chondroitinsulfat und Heparin, abgeschätzt. Chondroitinsulfat und Heparin sind negativ geladene Moleküle, welche ihre Ladung von Sulfatgruppen erhalten. Mucin ist durch die Anwesenheit von Sialinsäureresten negativ geladen, und DNA ist durch ihre Inkorporation von Phosphatresten negativ geladen. Circa 20 000 cpm UTV in 250 μl Bindungspuffer (d. h. Dulbeccos Modified Eagle Medium (D-MEM)) wurden bei Raumtemperatur für ca. 30 Minuten mit Konzentrationen von negativ geladenen Molekülen im Bereich von ca. 1 × 10–3 bis ca. 1 × 104 μg/ml inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mischungen auf Eis gekühlt und dann zu vorgekühlten, in 24-Well-Platten plattierten HS 68-Zellen gegeben. Die Zellen wurden für ca. 1 Stunde inkubiert, und dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Der zellassoziierte cpm-Wert wurde mittels Szintillationszählung bestimmt und als Mittelwert von Duplikatmessungen angegeben.
  • 7 zeigt, dass, während die Anwesenheit von kompetierendem Wildtyp-Fiberprotein keinen Effekt auf die Bindung eines GV10 UTV-Vektors (d. h. umfassend chimäre Fiber) an HS 68-Zellen hatte, negativ geladene kompetierende Moleküle in der Lage waren, GV10 UTV-Bindung zu blockieren. Alle vier Moleküle waren in der Lage, GV10 UTV-Bindung an HS 68-Zellen zu inhibieren, jedoch waren Heparin und DNA am effektivsten. Diese Moleküle haben keinen signifikanten Effekt auf die Bindung eines GV10-Vektors (d. h. umfassend Wildtyp-Fiber) an Zellen, welche hohe Levels von Fiber-Rezeptor exprimieren (d. h. A549-Zellen; Daten nicht gezeigt).
  • Diese Resultate bestätigen, dass negativ geladene Moleküle in der Lage sind, die durch chimäres Fiberprotein vermittelte Bindung des GV10 UTV-Vektors an Zellen zu blockieren. Diese Inhibition ist vermutlich zurückzuführen auf die Bindung der negativ geladenen Moleküle an die positiv geladenen Polylysin-Reste, welche auf der GV10 UTV-Fiber präsent sind. Demgemäß wurde der Einfluss von Enzymen, welche diese negativ geladenen Moleküle spalten, auf die Zellbindung des GV10 UTV-Vektors abgeschätzt.
  • HS 68-Zellen wurden in 24-Well-Platten plattiert und mit den Verdünnungen von Heparinase (Sigma, St. Louis, MO), Chondroitinase (Sigma) und Sialidase (Boehringer Mannheim, Inc.) im Bereich von ca. 0,0001 bis 1 für 45 Minuten bei 37°C vorinkubiert, gefolgt von 15 Minuten bei 4°C. Während Chondroitinase Chondroitinsulfat spaltet, spaltet Heparinase Heparin und Heparinsulfat und Sialidase spaltet Sialinsäure. Die initialen Ausgangskonzentration für Verdünnungen waren folgende: Heparinase, 25 U/ml (U = 0,1 μmol/Stunde, pH = 7,5, 25°C); Chondroitinase, 2,5 U/ml (U = 1,0 μmol/Minute, pH = 8,0, 37°C) und Sialidase 0,25 U/ml (U = 1,0 μmol/Minute, pH = 5,5, 37°C). Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und wurden dann mit 20 000 cpm markierten GV10 UTV-Vektors für ca. 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Sodann wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen, und die zellassoziierten cpm-Werte wurden mittels Szintillationszählung bestimmt. Die Resultate wurden als Mittelwerte von Duplikatmessungen angegeben.
  • Wie in 8 illustriert, bestätigt die Vorbehandlung von HS 68-Zellen mit Enzymen, welche negativ geladene Moleküle von der Zelloberfläche entfernen, dass der GV10 UTV-Vektor, der das chimäre Fiberprotein umfasst, mit negativ geladenen Stellen auf der Zelloberfläche interagiert. Insbesondere waren sowohl Heparinase als auch Sialidase in der Lage, die GV10 UTV-Bindung zu reduzieren, wobei jedoch Heparinase effektiver war als Sialidase auf HS 68-Zellen.
  • Diese Resultate bestätigen also, dass ein Vektor, der chimäres Fiberprotein umfasst (z. B. ein GV10 UTV-Vektor), anders als Wildtyp-Adenovirus, in einer neuartigen Art und Weise mit negativ geladenen Molekülen auf der Zelloberfläche interagiert, um Zelleintritt zu bewirken. Diese Resultate demonstrieren ferner, dass ein Vektor, der negativ geladene Reste (z. B. Aspartat und Glutamat) anstelle von positiv geladenen Molekülen (z. B. Lysin) umfasst, ähnlich verwendet werden kann, um via positiv geladene Moleküle, die auf der Zelloberfläche präsent sind, an Zellen zu binden und Zelleintritt zu bewirken.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel evaluiert Gen-Delivery in verschiedene Zelltypen, vermittelt durch einen chimäres Kapsidprotein, z. B. chimäres Fiberprotein, umfassenden adenoviralen Vektor (z. B. GV10 UTV), verglichen mit Gen-Delivery, vermittelt durch Wildtyp-Kapsidprotein, z. B. Fiberprotein, umfassendes Adenovirus (z. B. GV10).
  • Für diese Experimente wurden die relativen Levels von lacZ-Gen-Delivery durch einen das Wildtyp-Fiberprotein enthaltenden Vektor (d. h. GV10) im Vergleich zu einem chimäres Fiberprotein enthaltenden Vektor (d. h. GV10 UTV) in epithelartigen Zellen (d. h. HeLa-, A549-, HepG2- und H700 T-Zellen), glatten Muskelzellen (d. h. HA SMC- und HI SMC-Zellen), Endothelzellen (d. h. HUVEC- und CPAE-Zellen), Fibroblastzellen (d. h. HS 68- und MRC-5-Zellen), Glioblastomzellen (d. h. U118-Zellen) und Monocyten/Makrophagen (d. h. THP-1-Zellen) verglichen. Circa 2 × 105-Zellen wurden einen Tag vor Transduktion durch Adenovirus in 24-Multiwell-Platten inokuliert. Jedes Well wurde dann bei einem MOI-Wert von 1 mit GV10 (d. h. umfassend Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein) oder mit GV10 UTV (d. h. umfassend chimäre adenovirale Fiber) in einem 250 μl-Volumen für ca. 1 Stunden infiziert. Die Wells wurden dann gewaschen und für zwei Tage inkubiert; danach wurde die lacZ-Aktivität der Zelllysate bestimmt. Die Resultate wurden als Mittelwerte von Duplikatmessungen angegeben.
  • Wie in 9 illustriert, bestätigt die Verwendung des GV10 UTV-Vektors zum Transferieren eines Reportergens in ein Panel von Zelllinien, dass die Anwesenheit des chimären Fiberproteins (UTV) das lacZ-Gen-Delivery in Zellen, welche geringe oder nicht-detektierbare Levels von Fiber-Rezeptor exprimieren (d. h. Rezeptor-minus-Zellen), ca. 5 bis ca. 300fach erhöht, verglichen mit Wildtyp-Vektor (GV10). In Zellen, welche hohe Levels des Fiber-Rezeptors exprimieren (d. h. Rezeptor-plus-Zellen), resultiert die Inkorporation des chimären Fiberproteins in den GV10 UTV-Vektor in einer bis zu ca. dreifachen Erhöhung des Gen-Delivery.
  • Diese Reduzierung in der Expression, die bei Transduktion von Rezeptor-minus-Nicht-Epithelzellen im Vergleich zu Rezeptor-plus-Epithelzellen durch Wildtyp-Fiberprotein umfassendes Adenovirus (d. h. GV10), beobachtet wird, korreliert direkt mit der relativen Fähigkeit des Vektors, an diese verschiedenen Zelltypen zu binden, wie in Beispiel 3 berichtet. Diese Resultate stützen die Ansicht, dass die geringe Expression von Rezeptoren für Wildtyp-Adenovirus-Fiberprotein ein signifikanter limitierender Faktor für ihre effiziente Transduktion durch derzeitige Adenovirus-Vektoren ist.
  • Ähnlich wurde die Fähigkeit des chimären Kapsidproteins (d. h. des chimären Fiberproteins), den Gentransfer in vivo zu vermehren, abgeschätzt. Drei BALB/c-Mäuse wurden intranasal okuliert mit ca. 1 × 108 pfu von GV10 in 50 μl einer Kochsalzlösung, umfassend 10 mM MgCl2 und 10 mM Tris (pH 7,8). Weitere drei Mäuse erhielten die gleiche Dosis von GV10 UTV, und zwei Mäuse erhielten die Kochsalzlösung allein. Die Tiere wurden zwei Tage nach Verabreichung geopfert, und die lacZ-Aktivität der Lungen wurde bestimmt. Die Lungen wurden für die Analyse präpariert durch Schnellgefrieren der Lunge in Flüssigstickstoff, Zerkleinern des Gewebes mit Mörser und Pistill und Lysieren des zerkleinerten Gewebes in 1,0 ml lacZ-Reporter-Lysepuffer (Promega Corp., Madison, WI). Ein fluorimetrischer Assay wurde verwendet, um die lacZ-Aktivität zu überwachen, und die Resultate der Experimente wurden angegeben als die mittlere Aktivität, gemessen von jeder Tiergruppe.
  • Die Resultate dieser Experimente sind in 10 illustriert. Wie aus dieser Figur ersichtlich, resultierte der Gentransfer in vivo, vermittelt durch den chimäres Fiberprotein umfassenden GV10 UTV-Vektor (UTV), im Vergleich zu demjenigen eines Wildtyp-Fiberprotein umfassenden Vektors (GV10) im Mittel in einem 8fach höheren Delivery in die Mauslunge.
  • Diese Resultate bestätigen also, dass Inkorporation eines chimären Kapsidproteins (in diesem Fall eines chimären Fiberproteins) in einen adenoviralen Vektor die Effizienz des Vektor-vermittelten Gen-Delivery sowohl in vitro als auch in vivo beträchtlich steigert, verglichen mit einem Adenovirus-Vektor, der Wildtyp-Fiberprotein umfasst. Ferner stützen die Resultate die Schlussfolgerung, dass eine niedrige Fiber-Rezeptor-Expression ein signifikanter Faktor ist, der zu dem beobachteten suboptimalen Delivery in die Lunge und andere Gewebe beiträgt. Ferner bestätigen die Resultate die Überlegenheit des GV10 UTV-Vektors sowie anderer ähnlicher UTV-Vektoren gegenüber anderen derzeit erhältlichen adenoviralen Vektoren für Gentransfer (z. B. für Delivery des CFTR-Gens) in die Lunge und andere Gewebe.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel evaluiert die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Vektors, der ein chimäres Kapsidprotein umfasst (z. B. ein chimäres Fiberprotein), mit Passagier-DNA über eine Protein/DNA-Interaktion zu interagieren und dadurch die DNA "huckepack" in die Zelle mitzunehmen.
  • Für diese Experimente wurden ein Wildtyp-Fiber umfassender adenoviraler Vektor (d. h. GV10) und ein chimäre Fiber umfassender adenoviraler Vektor (d. h. GV10 UTV) verwendet, um Gentransfer in Rezeptor-plus-Epithelzellen (d. h. 293-, A549- und H700 T-Zellen) abzuschätzen. In Kontrollexperimenten wurden die Zellen mit den Vektoren transduziert, wie früher beschrieben. Im experimentellen Zustand wurden die Vektoren mit dem Plasmid pGUS inkubiert, welches ein β-Glucuronidase-Reportergen umfasst, derart, dass das chimäre adenovirale Fiberprotein in der Lage war, mit der Plasmid-DNA zu komplexieren. Im Einzelnen wurden ca. 5 × 107 aktive Partikel (d. h. Fluoreszenz-Fokuseinheiten (ffu)) von GV10 oder GV10 UTV für 1 Stunde mit ca. 2,5 μg pGUS-Plasmid-DNA inkubiert. Die Mischung wurde sodann zu ca. 2 × 105 der angegebenen Zellen in 250 μl DMEM mit 10% fötalem Rinderserum hinzugefügt. Sodann wurden sowohl die β-Glucuronidase- als auch die β-Galactosidase-Aktivität mittels eines fluorimetrischen Assay 10 Tage post Transduktion abgeschätzt. Die β-Glucuronidase-Expression in Zellen wurde ähnlich dem β-Galactosidase-Assay auf lacZ-Expression überwacht durch Überwachung der Blaufärbung, wenn β-Glucuronidase eine Reaktion mit dem Substrat X-glu katalysiert.
  • Die Resultate dieser Experimente sind in 11 illustriert. Vergleichbare Levels von lacZ-Expression wurden erhalten, wenn entweder ein GV10-Vektor (d. h. umfassend Wildtyp-Fiberprotein) oder ein GV10 UTV-Vektor (d. h. umfassend chimäres Fiberprotein) verwendet wurde, um das Reportergen in cis in Epithelzellen zu transferieren. Im Vergleich dazu war der Wildtyp-Vektor in der Lage, das Plasmid pGUS nur bei einem relativ niedrigen Level in alle Epithelzellen intrazellulär zu transferieren, wie abgeschätzt durch β-Glucuronidase-Genexpression. Dieser Gentransfer auf basalem Level wurde wahrscheinlich mittels Rezeptor-vermittelter Aufnahme (RME) von "Bystander"-Molekülen erzielt, wie früher beschrieben (PCT Patentanmeldung WO 95/21259 ). Unter Verwendung eines GV10 UTV-Vektors aber, der ein chimäres Fiberprotein umfasst, wurde der Transfer des pGUS-Plasmids beträchtlich gesteigert. Im Falle des Gentransfers in 293-Zellen überschritt die pGUS-Plasmid-dirigierte β-Glucuronidase-Expression die nach GV10 UTV-Vektor-vermitteltem Transfer eines cis-verknüpften Reportergens beobachtete Expression.
  • Diese Resultate bestätigen, dass ein Vektor, umfassend ein erfindungsgemäßes chimäres Kapsidprotein, z. B. ein chimäres Fiberprotein, gesteigerten Transfer einer Nucleinsäure demonstriert, welche nicht in cis mit dem Vektor lokalisiert ist. Offenbar wird dieser verstärkte Gentransfer bewirkt durch das Auftreten einer Protein/DNA-Interaktion zwischen den negativ geladenen Resten auf der chimären Fiber (z. B. den Resten des Polylysin-String), resultierend in Bindung der Nucleinsäure an den Vektor; jedoch sind auch andere Mittel zum Verstärken möglich.
  • Beispiel 7
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion weiterer Plasmide, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen im C-Terminus des Fiberproteins enthalten.
  • Das in Beispiel 2 beschriebene Transferplasmid p193(F*) (12; auch bekannt als p193NS (F5*), pNS (F5*) und pAd NS 83-100 UTV) wurde als Ausgangspunkt für die Konstruktion dieser weiteren Plasmide, welche chimäre Adenovirus-Fiberproteine enthalten, verwendet. Wie in 12 gezeigt enthält p193 (F5*) ein mutiertes Fiber-Gen mit einer BamHI-Stelle zwischen dem letzten Fiberprotein-Codon und dem leserasterverschobenen ("frameshifted") Fiberprotein-Stop-Codon. Die weiteren mutanten Transferplasmide, konstruiert wie hierin beschrieben, enthalten Sequenzen im Fiber-C-Terminus, die einen Glycin/Serin-Aminosäure-Repeat-Linker, eine Targeting-Sequenz und einen Stop-Codon codieren. Diese Plasmide wurden hergestellt durch Klonieren von synthetischen Oligonucleotiden in die BamHI-Stelle von p193(F5*), um das Transferplasmid p193NS (F5*) pGS(K7) (auch als p193 (F5*) pGS(K7) oder pNS (F5*) pK7 bekannt) zu erzeugen, welches in 13 gezeigt ist.
  • Somit ist die Sequenz des Wildtyp-Ad5-Fiber-Gens:
    Figure 00530001
    worin "TAA" ein Terminations-Codon ist und worin die Polyadenylierungssequenz fett hervorgehoben ist. Der C-Terminus des mutierten Fiber-Gens, das in p193(F5*) präsent ist, ist:
    Figure 00530002
    worin die unterstrichene Sequenz die in das Fiberprotein eingeführte mutierte BamHI-Stelle bezeichnet und worin die Polyadenylierungssequenz fett hervorgehoben ist. Im Vergleich dazu ist die Aminosäuresequenz des C-Terminus des Fiber-Gens, das in p193NS (F5*) pGS(K7) präsent ist:
    Figure 00530003
    worin die unterstrichene Sequenz die in das Fiberprotein eingeführte mutierte BamHI-Stelle bezeichnet und worin die fett hervorgehobene Sequenz den am C-Terminus hinzugefügten Polylysin-String bezeichnet. Diese Aminosäuresequenz wird codiert durch die Nucleinsäuresequenz: GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAG TAA [SEQ ID NO: 21], worin "TAA" ein Terminations-Codon ist.
  • Die überlappenden synthetischen Oligonucleotide, welche zur Herstellung des Transferplasmids p193NS (F5*) pGS(K7) verwendet wurden, waren: pK7s (Sense), GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAA TAA G [SEQ ID NO: 61]; pK7s (Antisense), GA TCC TTA CTT CTT CTT TTT CTT CTT TTT AGA GCC ACT CCC TGA ACC TGA TCC T [SEQ ID NO: 62]. Die Sense- und Antisense-Oligonucleotide wurden in äquimolaren Verhältnissen gemischt und in die BamHI-Stelle von p193NS (F5*) kloniert, um p193NS (F5*) pGS(pK7) zu erzeugen. Die Verifikation des korrekt orien tierten Inserts in p193NS (F5*) GS(pK7) wurde durchgeführt durch PCR mittels des pK7s-Sense-Primer und des Stromabwärts-Antisense-Oligonucleotid-Primer A5a32938, CAGGTTGAATACTAGGGTTCT [SEQ ID NO: 63]. Ferner wurde verifiziert, dass das Plasmid das korrekt orientierte Insert enthielt, durch Sequenzierung der DNA-Sequenz in der Region des Inserts mittels des A5a32938-Primer.
  • Das Transferplasmid p193NS (F5*) wurde für die Konstruktion weiterer mutanter Transferplasmide verwendet, welche zusätzlich eine UTV- oder UTV-artige Zell-Targeting-Sequenz im C-Terminus des Fiberproteins enthalten. Diese Plasmide umfassen p193NS (F5*) pGS(null) (auch bekannt als p193 (F5*) pGS(null) oder p193 (F5*) pGS), pBSS 75-100 pGS(null), pBSS 75-100 pGS(RK32), pBSS 75-100 pGS(RK33) und pBSS 75-100 pGS(tat).
  • Zur Konstruktion von p193NS (F5*) pGS(null) wurden die komplementären überlappenden Oligonucleotide pGSs, GATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAAA [SEQ ID NO: 64], und pGSs, GATCTTTAACTAGTCGAGCCACTGCCAGATCCTGAACCG [SEQ ID NO: 65], konstruiert für direkte Ligation in das BamHI-verdaute p193NS (F5*)-Plasmid. Die Verifikation des korrekt orientierten Klons wurde durch PCR mittels des pGSs-Primer und des Stromabwärts-Antisense-Oligonucleotid-Primer A5a32938 durchgeführt. Ferner wurde verifiziert, dass das Plasmid das korrekt orientierte Insert enthielt, durch Sequenzierung der DNA-Sequenz in der Region des Inserts mittels des A5a32938-Primer.
  • Der in 14 gezeigte Vektor pBSS 75-100 pGS(null) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(null)) wurde konstruiert durch Austausch des NheI-SalI-Fragments von pBSS 75-100 gegen das korrespondierende Fragment von p193NS (F5*) pGS(null). Die SpeI-Stelle, die nicht innerhalb des Fiber-Chimärengens liegt, wurde dann eliminiert durch partielle Restriktion des Plasmids mit SpeI, Auffüllen mit Klenow-Fragment und dann Religieren des Vektors. Der resultierende Vektor umfasst die relevante Nucleinsäuresequenz: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAA [SEQ ID NO: 23] (worin "TAA" ein Terminations-Codon ist), welche für die Aminosäure sequenz Ala Gln Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser [SEQ ID NO: 24] codiert.
  • Die Inserte von den Plasmiden pBSS 75-100 pGS(RK32) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK)2 oder pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK2)), pBSS 75-100 pGS(RK33) (auch bekannt als pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK)3 oder pBSS 75-100 ΔE3 pGS(RKKK3)) und pBSS 75-100 pGS(tat) wurden konstruiert für direkte Ligation in das SpeI-verdaute pBSS 75-100 pGS(null)-Plasmid. Zur Konstruktion von pBSS 75-100 pGS(RK32), wie in 15 gezeigt, wurden die komplementären überlappenden Oligonucleotide RK32s, CTAGAAAGAAGAAACGCAAAAAGAAGA [SEQ ID NO: 66], und RK32s, CTAGTCTTCTTTTTGCGTTTCTTCTTT [SEQ ID NO: 67], verwendet. Der resultierende Vektor umfasst die relevante Nucleinsäuresequenz:
    GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAACGCAAAAAGAAGACTAGTTAA [SEQ ID NO: 25] (worin "TAA" ein Terminations-Codon ist), welche für die Aminosäuresequenz Ala Gln Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser [SEQ ID NO: 26] codiert.
  • Zur Konstruktion von pBSS 75-100 pGS(RK33), wie in 16 gezeigt, wurden die komplementären überlappenden Oligonucleotide RK33s, CTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGA [SEQ ID NO: 68], und RK33s, CTAGTCTTCTTCTTTCTTTTTTTTTTGCGCTTCTTCTTCTTT [SEQ ID NO: 69], verwendet. Der resultierende Vektor umfasst die relevante Nucleinsäuresequenz:
    GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGACTAGTTAA [SEQ ID NO: 27] (worin "TAA" ein Terminations-Codon ist), welche für die Aminosäuresequenz Ala Gln Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser [SEQ ID NO: 28] codiert.
  • Zur Konstruktion von pBSS 75-100 pGS(tat) wurden die komplementären überlappenden Oligonucleotide TATs, CT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA T [SEQ ID NO: 70], und TATa, CT AGA TGC CCG TCT TCG TTG CCT GCG CTT TTT TCT CCC ATA A [SEQ ID NO: 71], verwendet.
  • Der resultierende Vektor umfasst die relevante Nucleinsäuresequenz: ACT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA TCT AGT [SEQ ID NO: 72], welche für die Aminosäuresequenz Thr Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg GLn Arg Arg Arg Ala Ser Ser [SEQ ID NO: 73] codiert.
  • Die Verifikation des korrekt orientierten Klons wurde durch PCR mittels der Sense-Primer (RK32s, RK33s oder TATs) für jedes der drei respektiven Plasmide und mittels des Stromabwärts-Antisense-Oligonucleotid-Primer A5a32938 durchgeführt. Ferner wurde verifiziert, dass jedes der Plasmide das korrekt orientierte Insert enthielt, durch Sequenzierung der DNA-Sequenz in der Region des Inserts mittels des A5a32938-Primer.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, die UTV-Domänen in der Fiber-Schleife enthalten.
  • Plasmide, welche eine UTV-Sequenz (und/oder eine Abstandhaltersequenz) in einer exponierten Schleife des Fiberproteins enthalten, werden konstruiert durch Inkorporation einer beliebigen der im Vorstehenden genannten Sequenzen (sowie jeglicher weiterer UTV-artiger Sequenzen) in das Fiberprotein. Erzielt wird dies mittels des Plasmid-Transfervektors p193NS (F5*), um den weiteren Transfervektor p193NS F5F2K (auch p193 F5F2K genannt) zu konstruieren, wie in 17 gezeigt. Das Plasmid p193NS F5F2K enthält eine singuläre SpeI-Restriktionsstelle innerhalb des Ad2-Fiber-Gens, codierend für eine exponierte Schleife in dem Protein. Namentlich umfasst das in p193NS F5F2K präsente Fiber-Gen die Fiber-Sequenz:
    Figure 00560001
    worin die unterstrichene Sequenz die neue SpeI-Stelle bezeichnet, die in das Fiber-Gen eingeführt wird.
  • Dieser Vektor wurde dann verwendet, um Targeting-Sequenzen in die SpeI-Stelle zu klonieren. Insbesondere wurde eine Nucleinsäuresequenz, welche die Strecke von 8 basischen Aminosäuren RKKKRKKK (Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys [SEQ ID NO: 74]), umfassend die Heparin-Bindungsdomäne, codiert, in die SpeI-Stelle von p193 F5F2K mittels überlappender Sense- und Antisense-Oligonucleotide kloniert.
  • Namentlich umfasst die (RKKK)2-Sequenz zum Teil die Sequenz:
  • Figure 00570001
  • Das 27-mere Sense-Oligonucleotid RK32s und das 27-mere Antisense-Oligonucleotid RK32s, welche in Beispiel 7 beschrieben sind, wurden verwendet zum Klonieren der PolyGS(RKKK)2-Sequenz, umfassend das Peptidmotiv RKKKRKKK [SEQ ID NO: 74]. Das p193NS F5F2K(RKKK)2-Plasmid wurde konstruiert durch Klonieren der DNA-Sequenz, welche die Bindungsdomäne codiert, in die SpeI-Stelle von p193NS F5FK2. Die überlappenden Sense- und Antisense-Oligonucleotide, welche die Bindungsdomäne codieren, wurden zunächst "annealt" und dann direkt in die SpeI-Restriktionsstelle ligiert, um in dem Plasmid p193NS F5F2K(RKKK)2 zu resultieren, welches in 18 gezeigt ist. Dieses Plasmid ist auch bekannt als p193NS F5F2K(RKKK2), p193NS F5F2K(RK32) oder p193 F5F2K(RKKK2). Der relevante Bereich der modifizierten Schleife des Fiber-Knob, welcher in p193NS F5F2K(RKKK)2 präsent ist, ist:
  • Figure 00570002
  • Ferner können eine (RKKK)3-Sequenz oder andere Variationen dieser Sequenz in p193NS F5F2K insertiert werden. Diese Sequenz umfasst zum Teil:
  • Figure 00580001
  • Die Sequenz kann insertiert werden unter Verwendung des 39-meren Sense-Oligonucleotids (RKKK)3(s) (d. h. umfassend die Sequenz CT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG A [SEQ ID NO: 79]) und des 39-meren Antisense-Oligonucleotids (RKKK)3(a) (d. h. umfassend die Sequenz CT AGT CTT CTT CTT TCT TTT TTT TTT GCG CTT CTT CTT T [SEQ ID NO: 80]). Das resultierende Plasmid p193NS F5F2K(RKKK)3 ist in 19 gezeigt. Dieses Plasmid ist auch bekannt als p193NS F5F2K(RKKK3), p193 F5F2K(RKKK3) oder p193 F5FK(RK33). Der relevante Bereich der modifizierten Schleife des Fiber-Knob, welcher in p193 F5F2K(RKKK)3 präsent ist, ist:
  • Figure 00580002
  • Beispiel 9
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, welche chimäre Pentonbasis-Proteine, umfassend UTV- oder UTV-artige Sequenzen, enthalten.
  • Das Transferplasmid pACT (ΔRGD) (auch als Plasmid pAT in US-Patent Nr. 5 559 099 beschrieben) wurde zum Teil abgeleitet durch Manipulieren eines Plasmids, enthaltend das singuläre BamHI/PmeI-Fragment (13259–21561) des Ad5-Genoms, und enthält u. a. ein Pentonbasis-Protein, umfassend eine Deletion von 8 Aminosäuren, welche die αv-Integrin-Bindungsdomäne konstituieren, und eine Substitution der deletierten Region für Aminosäuren, welche eine singuläre SpeI-Stelle konstituieren, für die günstige Insertion von exogenen Sequenzen.
  • Zur Konstruktion des Plasmids pACT (RKKK)3 (auch bekannt als pACT (RKKK3) oder pACT (RK33)), wie in 20 gezeigt, wurden die komplementären überlappenden Oligonucleotide RK33s und RK33a direkt in ein SpeI-verdautes pACT(ΔRGD)-Plasmid ligiert. Die Verifikation des korrekt orientierten Klons wurde durch PCR mittels des RK33a-Primer für das Plasmid und des Stromaufwärts-Sense-Oligonucleotid-Primer A5s15002 durchgeführt. Ferner wurde verifiziert, dass das Plasmid das korrekt orientierte Insert enthielt, durch Sequenzierung der DNA-Sequenz in der Region des Inserts mittels des A5s15002-Primer. Der relevante Bereich der UTV-Domäne, der in dem chimären Pentonbasis-Protein in pACT (RKKK)3 resultieren wird, ist:
  • Figure 00590001
  • Ähnlich kann das in 21 gezeigte Plasmid pACT (RK32) (welches auch pACT (RKKK2) oder pACT (RKKK)2 genannt werden kann) mittels der überlappenden Primer RK32s und RK32a konstruiert werden. Der relevante Bereich der UTV-Domäne, der in dem chimären Pentonbasis-Protein in pACT (RKKK)2 präsent ist, ist:
  • Figure 00590002
  • Beispiel 10
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen in dem Adenovirus-Hexon-Protein enthalten, insbesondere solche Plasmide, welche diese Sequenzen in einer exponierten Schleife des Adenovirus-Hexon-Proteins enthalten.
  • Diese Plasmide können konstruiert werden mittels eines anderen Transferplasmids, Plasmid pACT Hl1, welches in 22 gezeigt ist. Das Plasmid pACT Hl1 selbst ist abgeleitet von dem Plasmid pACT (umfassend 13259–21561 des Ad5-Genoms), welches den größeren Teil der Hexon-Protein-Codierungssequenz (korrespondierend zu ca. 18842–21700) enthält. Insbesondere kann pACT Hl1 konstruiert werden durch Inkorporation einer XbaI-Stelle in die Schleife-1-Region des Ad5-Hexon-Proteins. Ähnliche Techniken können verwendet werden, um eine XbaI-Stelle oder eine beliebige andere günstige Restriktionsstelle entweder in die Schleife-1- oder in die Schleife-2-Region oder in eine andere exponierte Schleife des Hexon-Proteins zu inkorporieren. Sense- und Antisense-Primer können verwendet werden, um die Schleife-1-Region aus Ad5-DNA durch PCR zu amplifizieren und gleichzeitig eine Mutation einzuführen, welche in einer singulären mutierten XbaI-Stelle in der Schleife-1-Region resultiert.
  • Insbesondere können der Sense Primer GGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCA [SEQ ID NO: 81], der die natürlich vorkommende singuläre Restriktionsstelle ApaI enthält, welche in pACT vorkommt, und der Antisense-Primer ATCTTCACTGTACAATACCACTTTAGGAGTCAAGTTATCACCTCTAGATGCGGTCGCCT [SEQ ID NO: 82], der die singuläre Restriktionsstelle BsrGI enthält, verwendet werden. Das PCR-Produkt, welches die XbaI-Stelle enthält, kann dann mit BsrGI und ApaI geschnitten und in pACT zurückkloniert werden, um das ApaI-BsrGI-Fragment zu ersetzen. Das resultierende Plasmid pACT Hl1 enthält eine singuläre XbaI-Stelle für die Insertion von UTV-Sequenzen in Schleife 1 des Hexons. Die Anwesenheit der XbaI-Stelle in dem pACT Hl1-Klon kann verifiziert werden durch Restriktionsverdau mittels XbaI, wodurch das Plasmid linearisiert werden sollte.
  • Teil der unmutierten Hexon-Schleife-1-Aminosäuresequenz umfasst die Sequenz TEATGNGDNL [SEQ ID NO: 83]. Im Vergleich dazu umfasst die mutierte Hexon-Schleife-1-Aminosäuresequenz, welche auf die Wildtyp-TEA-Reste in pACT Hl1 folgt (22), die Sequenz TASRGDNL [SEQ ID NO: 40] (d. h. codiert durch die Nucleinsäuresequenz ACCGCATCTAGAGGTGATAACTTG [SEQ ID NO: 39]).
  • Die XbaI-Stelle von pACT Hl1 kann dann als eine singuläre Stelle verwendet werden, in die Universal-Targeting-Sequenzen, wie z. B. RKKKRKKK [SEQ ID NO: 74], z. B. mittels der überlappenden Oligonucleotide RK32s und RK32a kloniert werden können. Das besondere Plasmid, welches aus derartigen Manipulationen resultiert, d. h. pACT Hl1 (RKKK)2 (oder pACT Hl1 (RK32) oder pACT Hl1 (RKKK2)) ist in 23 gezeigt. Dieses Plasmid umfasst die Sequenz:
  • Figure 00610001
  • Ferner können andere UTV- oder UTV-artige Sequenzen in die Schleife-1-Region des Hexon-Proteins und/oder in die Schleife-2-Region des Hexon-Proteins kloniert werden. Beispielsweise kann ein ähnlicher Ansatz verwendet werden, um die Sequenz zu mutieren, welche die Hexon-Schleife 2 codiert, um ein Plasmid pACT Hl2 (nicht gezeigt) herzustellen, welches eine singuläre Restriktionsstelle (z. B. eine XbaI-Stelle) enthält, in die weitere UTV-Sequenzen kloniert werden können.
  • Ferner kann das Plasmid pACT Hl1 (RKKK)3 (oder pACT Hl1 (RKKK3) oder pACT Hl1 (RK33)) konstruiert werden mittels der komplementären überlappenden Oligonucleotide RK33s und RK33a und direktes Ligieren des PCR-Produktes in das XbaI-verdaute pACT Hl1-Plasmid. Die Verifikation des korrekt orientierten Klons kann durch PCR mittels des RK32-Sense-Primer für das Plasmid und eines geeigneten Stromabwärts-Antisense-Oligonucleotid-Primer durchgeführt werden. Ferner kann verifiziert werden, dass das Plasmid das korrekt orientierte Insert enthält, durch Sequenzierung der DNA-Sequenz in der Region des Inserts mittels des Stromabwärts-Antisense-Primer. Ähnliche Ansätze können verwendet werden zur Konstruktion von analogen Transfervektoren, insbesondere der analogen Transfervektoren pACT Hl2 (RKKK)2 und pACT Hl2 (RKKK)3.
  • Beispiel 11
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Plasmids, welches ein Kurzschaft-Fiberprotein aufweist. Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Konstruktion des Plasmids p193 F5F9sK.
  • Das Plasmid p193 F5F9sK (auch bekannt als p193 F5F9K-Short) ist in 24 gezeigt. Dieser Vektor codiert ein chimäres Fiberprotein, wobei ca. zwei Drittel des Ad5-Fiber-Schaftes deletiert sind und der Ad5-Fiber-Knob durch den Ad9-Fiber-Knob ersetzt ist.
  • Das Plasmid p193F5F9K-short wurde aus p193NS (F*) konstruiert. Die Oligonucleotid-Primer GGACTAGTAG CATTTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC [SEQ ID NO: 84] und CCGGATCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG [SEQ ID NO: 85] wurden verwendet, um die Ad9-Sequenz, die das letzte Schaft-Repeat und das Knob codiert, aus dem Fiber-Gen zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde mittels Standard-Techniken gereinigt und mit den Restriktionsenzymen NheI und BamHI verdaut, wodurch Klonieren des PCR-Produktes in die NheI/BamHI-Region des p193NS(F5*)-Transferplasmids gestattet wurde. Das resultierende Kurzschaft-Fiberprotein kann bei der Konstruktion von adenoviralen Vektoren verwendet werden, wie unten beschrieben. Ferner können eine oder mehrere beliebige der zuvor erwähnten UTV- oder UTV-artigen Sequenzen in die Kurzschaft-Fiber inkorporiert werden, und die resultierende Fiber kann für Zell-Delivery eingesetzt werden.
  • Beispiel 12
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen in einer erweiterten Struktur enthalten, insbesondere in Hexon- und/oder Pentonbasis-Protein, um in verlängerten Hexon- und/oder Pentonbasis-Proteinen zu resultieren, welche demgemäß besser in der Lage sind, mit Zellen in Kontakt zu treten und am Zell-Targeting teilzunehmen. Die resultierenden chimären Proteine sind "spiked" in dem Sinne, dass sie eine Insertion von einer nicht-nativen Aminosäuresequenz umfassen, die aus der Virusoberfläche herausragt.
  • Die Primer 1alpha(s), GGGCTGCAGGCGGCCGCAGAAGCTGAAGAGGCAGCCACACGGGCTGAGGAGAA [SEQ ID NO: 86], und 1alpha(a), GGGGTGCACACAGCTTCGGCCTTAGCGTTAGCCTGTTTCTTCTGAGGCTTCTCGACCT [SEQ ID NO: 87], können verwendet werden zum Amplifizieren der Region des Penton-Gens codierend für die 32-Aminosäuren-α-Helix-Domäne, welche der RGD-Sequenz folgt. Diese 32-Aminosäuren-Sequenz umfasst die Sequenz ATRAEEDRAEAEAAAEAAAPAAQPEVEKPQKK [SEQ ID NO: 88]. Die eingesetzten Primer können ferner eine zusätzliche α-helikale Sequenz an beiden Enden codieren, derart, dass z. B. die finale amplifizierte DNA-Sequenz die folgende Sequenz codiert:
    Figure 00630001
    wobei die fett hervorgehobene Sequenz zu der von den Primer codierten Nicht-Penton-Sequenz korrespondiert und wobei die unterstrichene Sequenz die Aminosäuren repräsentiert, die von den zwei kompatiblen Restriktionsstellen SfcI und ApaLI codiert werden. Diese Aminosäuren bewahren auch die In tegrität einer Alphahelix, gemäß Standard-Computerprogrammen, welche dazu entworfen sind, eine α-Helix-Struktur vorherzusagen.
  • Das PCR-Produkt, welches diese Aminosäuren codiert, kann sowohl mit SfcI als auch mit ApaLI geschnitten, religiert und dann mit beiden Enzymen nachgeschnitten werden. Bei der Ligation von gleichartigen Schnittstellen bleibt die Schnittstelle für das Nachschneiden erhalten; bei der Ligation der kompatiblen, aber ungleichartigen Schnittstellen dagegen wird die Schnittstelle zerstört. Demnach werden beim Nachschneiden des ligierten Produktes multiple Fragmente produziert, die Vielfache der Originalgröße des PCR-Produktes sind. Es wird komplett nachgeschnittene Fragmente (ca. 150 bp), Fragmente von ca. 300 bp (bei denen eine Schnittstelle zerstört ist) und Fragmente von ca. 450 bp (mit zwei zerstörten Schnittstellen) usw. geben. Das Verfahren erlaubt es demnach, die Originalsequenz, welche 50 Aminosäuren codiert (1alpha), zu verdoppeln (2alpha), zu verdreifachen (3alpha) usw., um große, ununterbrochene α-helikale Regionen in ein Protein zu klonieren, um ein größeres "Spike" oder eine Extension des Proteins zu erzeugen.
  • Beispielsweise kann das 2alpha-Doppelprodukt (d. h. 2alpha2) in die erste Ppu10I-Stelle des Plasmids pSPdelta (in 25 gezeigt) kloniert werden, um das Plasmid pSP2alpha (in 26 gezeigt) zu erzeugen. Das Plasmid pSPdelta wird aus dem Basisplasmid pUC19 oder einem beliebigen anderen geeigneten Klonierungsplasmid konstruiert. Das pSPdelta-Transferplasmid kann verwendet werden, um weitere Modifikationen des Penton- oder Hexon-Proteins herzustellen, die es erlauben, die UTV-Sequenz (oder eine beliebige andere Targeting-Sequenzen) aus der Virionoberfläche emporzuheben. Dieses Emporheben der Targeting-Sequenz zu einer "spiked" Struktur (z. B. zu einer Art "Turm") wird die sterische Hinderung der Penton- und Hexon-Interaktion mit der Zelloberfläche durch das Fiberprotein minimieren und größeren Zugang der chimären Penton- und Hexon-Proteine für Interaktion mit der Zelloberfläche erlauben.
  • Das Plasmid pSPdelta enthält eine singuläre SpeI-Klonierungsstelle für die Inkorporation von UTV-Sequenzen. Die SpeI-Klonierungsstelle ist auf beiden Seiten von Ppu10I-Klonierungsstellen flankiert, welche die Inkorporation von DNA-Sequenzen erlauben, die Aminosäuren codieren, welche die UTV-Sequenz von der Virionoberfläche weg emporheben. Das pSPdelta-Plasmid wurde konstruiert, indem in die singuläre XbaI-Stelle von pUC19 überlappende Oligonucleotide kloniert wurden, die dazu entworfen sind, direkt in die XbaI-Stelle zu insertieren. Insbesondere ist das Sense-Oligonucleotid:
    CTAGAGCAGCTATGCATGAAGGGACTAGTGGAGAGATGCATGCAGCCT [SEQ ID NO: 91]. Das komplementäre Antisense-Oligonucleotid ist:
    CTAGAGGCTGCATGCATCTCTCCACTAGTCCCTTCATGCATAGCTGCT [SEQ ID NO: 92]. Die Oligonucleotide werden in äquimolaren Verhältnissen gemischt und in die XbaI-Stelle von pUC19 kloniert. Die Anwesenheit des korrekten Inserts kann bestätigt werden durch Sequenzierung über die Region des Inserts und durch Schneiden des Plasmids mit Ppu10I. Die XbaI-Stellen beiderseits des Inserts erlauben das günstige Entfernen dieses Abschnitts in späteren Klonen.
  • Weil zwei Ppu10I-Stellen in pSPdelta vorhanden sind, kann das Plasmid partiell restringiert sein nach Verdau mit Ppu10I, so dass es nur an einer einzigen Stelle geschnitten ist. Ligation des PCR-Produktes, das die ApaLI- und die SfcI-Stelle umfasst, in die kompatible Ppu10I-Stelle wird die erste Ppu10I-Stelle in dem Plasmid zerstören und wird ferner die ApaLI- und die SfcI-Stelle zerstören. Diese zerstörten Stellen sind in 26 (die das pSP2alpha2-Plasmid zeigt) durch ein "j" repräsentiert. Ein zweites Doppelprodukt kann dann in die verbliebene Ppu10I-Stelle des pSP2alpha-Plasmids kloniert werden, um das in 27 gezeigte Plasmid pSP2alpha2 zu produzieren, welches eine SpeI-Stelle zum Insertionsklonieren einer UTV-Sequenz oder einer ähnlichen Targeting-Sequenz enthält. Die Computeranalyse der Sekundärstruktur des antizipierten 2alpha2-Proteins bestätigt, dass es eine vollkommene α-Helix sein wird, ausgenommen in der Region der SpeI-Klonierungsstelle.
  • Während also pSPdelta die Sequenz:
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    umfasst, umfasst pSP2alpha die Sequenz:
    Figure 00660002
    und pSP2alpha2 umfasst die Sequenz:
  • Figure 00660003
  • Figure 00670001
  • Targeting-Sequenzen, wie UTV- oder UTV-artige Sequenzen, können in die SpeI-Stelle des Plasmids pSP2alpha2 kloniert werden. Insbesondere können die überlappenden Oligonucleotide RK32s und RK32a in die SpeI-Stelle kloniert werden, um pSP2alpha2 (RKKK)2 (oder pSP2alpha2 (RK32) oder pSPSalpha2 (RKKK2)) zu erzeugen. Das Plasmid pSP2alpha2 (RKKK)3 (oder pSP2alpha2 (RK33) oder pSPSalpha2 (RKKK3)) kann ähnlich konstruiert werden. Alternativ kann die gesamte 2alpha2-α-Helix-Domäne aus dem Plasmid entfernt werden durch Restriktion mit XbaI und in die kompatible SpeI-Stelle von pACT (ΔRGD) kloniert werden, um pACT 2alpha2 (RKKK)2 zu erzeugen (welches auch pACT 2alpha2 (RKKK2) oder pACT 2alpha2 (RK32) genannt werden kann). Ähnliche Techniken können verwendet werden, um pACT 2alpha2 (RKKK)3 zu produzieren (welches auch pACT 2alpha2 (RKKK3) oder pACT 2alpha2 (RK33) genannt werden kann).
  • Ähnlich können chimäre Hexon-Proteine, welche "spiked" sind (d. h. Sequenzen umfassen, welche in ihrer Extension resultieren), konstruiert werden durch Klonieren der 2alpha2-α-Helix-Domäne in die XbaI-Stelle von pACT Hl1, um pACT Hl1 2alpha2 (RKKK)2 zu erzeugen (welches auch pACT Hl1 2alpha2 (RKKK2) oder pACT Hl1 2alpha2 (RK32) genannt werden kann). Ähnliche Techniken können verwendet werden, um pACT Hl2 2alpha2 (RKKK)2 zu produzieren (welches auch pACT Hl2 2alpha2 (RKKK2) oder pACT Hl2 2alpha2 (RK32) genannt werden kann).
  • Beispiel 13
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion weiterer adenoviraler Vektoren zusätzlich zu den früher beschriebenen, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen in dem adenoviralen Fiberprotein enthalten.
  • Die Konstruktion von Adenovirus-Vektoren, welche UTV-Modifikationen in der Fiber enthalten, ist auf mehrfachen Wegen für den Fachmann möglich. Ein Verfahren zum Erzeugen der UTV-Fiber-Vektoren aus oben beschriebenen Plasmiden besteht darin, zunächst die Plasmid-DNA mit SalI zu linearisieren und dann diese DNA in eine 293-Verpackungszelllinie zu transfizieren, die kurz vor Transfektion mit einem E4-deletierten Adenovirus infiziert worden war. E4- deletierte Adenovirus-Vektoren sind nicht in der Lage, in Zelllinien wie die 293-Zelllinie, die nur die Adenovirus-E1-Regionen in trans bereitstellen, zu replizieren. Rekombination der Plasmide, welche das modifizierte Fiber-Gen und die E4-Regionen enthalten, mit der E4-deletierten DNA resultiert in einem replikationskompetenten, E4-enthaltenden Vektor, der das modifizierte Fiber-Gen trägt.
  • Demgemäß wurden die Plasmide p193NS (F5*) pGS(K7), pBSS 75-100 pGS(null), pBSS 75-100 pGS(RKKK)2, pBSS 75-100 pGS(RKKK)3, pBSS 75-100 pGS(tat), p193NS F5F2K(RK32) und p193 F5F9sK jeweils mit SalI linearisiert und in 293-Zellen transfiziert, die 1 Stunde zuvor entweder mit dem E4-deletierten Adenovirus-Vektor GV11A.Z (der das LacZ-Gen unter der Kontrolle eines Cytomegalovirus-(CMV-)Promotors trägt, oder mit GV11A.S (der ein Sekretorisches-Alkalisches-Phosphatase-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors trägt) infiziert worden waren. Die resultierenden Adenovirus-Vektoren AdZ.F(pK7), AdZ.F(pGS), AdZ.F(RKKK)2 (auch bekannt als AdZ.F(RKKK2) oder AdZ.F(RK32)), AdZ.F(RKKK)3 (auch bekannt als AdZ.F(RKKK3) oder AdZ.F(RK33)), AdZ.F(tat), AdZ.F5F2K(RKKK)2 (auch bekannt als AdZ.F5F2K(RKKK2) oder AdZ.F5F2K(RK32)) und AdZ.F5F9sK (auch bekannt als AdZ.F5F9K-Short) wurden erhalten und durch zwei aufeinanderfolgende Plaquebildungsrunden auf 293-Zellen gereinigt.
  • Es wurde verifiziert, dass alle Vektoren die korrekte Sequenz enthielten, durch PCR über die Region des Inserts und durch Restriktionsanalyse von viraler DNA, gewonnen von Vektor-infizierten 293-Zellen durch Hirt-Extraktion. Ferner kann eine Western-Analyse (wie früher beschrieben) verwendet werden, um die Proteingröße zu untersuchen, falls gewünscht. Die Western-Analyse von Fiberprotein aus Vektorpartikeln und/oder Vektor-infizierten Zelllysaten, elektrophoretisiert auf einem Polyacrylamid-Gel, sollte eine korrespondierende Verschiebung in der Mobilität des Fiberproteins im Vergleich zu unmodifiziertem Fiberprotein zeigen, die konsistent ist mit der Anwesenheit von zusätzlichen Aminosäuresequenzen. Beispielsweise verifizierte die Western-Analyse von AdZ.F(pK7)-Partikeln, dass deren Fiberprotein im Vergleich zu demjenigen des unmodifizierte Fiber umfassenden AdZ-Vektors nach oben verschoben ist, konsistent mit der Anwesenheit von zusätzlichen Aminosäuren in dem AdZ.F(pK7)-Fiberprotein.
  • Andere hierin gezeigte Plasmidkarten können in ähnlicher Weise zu adenoviralen Vektoren gemacht werden unter Anwendung der gleichen Vorgehensweise wie oben dargelegt (oder mit kleineren Variationen derselben).
  • Beispiel 14
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen in dem adenoviralen Pentonbasis-Protein enthalten.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines adenoviralen Vektors, der ein chimäres Pentonbasis-Protein umfasst, ist z. B. von Wickham et al., J. Virol., 70, 6831–6838 (1996) beschrieben worden. Ein oben beschriebener, das chimäre Pentonbasis-Protein enthaltender pACT-Vektor (z. B. die Transferplasmide pACT 2alpha2 (RKKK)2, pACT Hl2 2alpha2 (RKKK)2 und pACT (ΔRGD)) kann z. B. mit BamHI verdaut werden, um das Plasmid zu linearisieren. Ad5-DNA kann mit der Restriktionsendonuclease XmnI verdaut werden, welche Wildtyp-Ad5 an Positionen 14561 und 15710 innerhalb des Ad5-Genoms schneidet. Die zwei größeren Fragmente werden von dem kleineren 1 kb-Stück weg gereinigt, dann zusammen mit dem linearisierten Plasmid in die geeignete Zelllinie (z. B. in eine 293-Zelllinie) transfiziert, um rekombinantes Virus zu produzieren.
  • Auf diese Weise produzierte adenovirale Vektoren werden von potentiell kontaminierenden unmodifizierten Vektoren gereinigt durch zwei aufeinanderfolgende Plaquereinigungsrunden auf 293-Zellen. Sodann wird verifiziert, dass die resultierenden Vektoren die korrekte Sequenz in der Pentonbasis-Region enthalten, durch Restriktionsanalyse von viraler DNA, erhalten nach Hirt-Extraktion von Vektor-infizierten 293-Zellen. Ferner kann Sequenzierung von PCR-Produkten, generiert durch Amplifizieren der Region des Inserts aus der viralen DNA, verwendet werden, um die Anwesenheit des Inserts zu verifizieren. Die Western-Analyse der chimären Pentonbasis, elektrophoretisiert auf einem Polyacrylamid-Gel, sollte eine korrespondierende Verschiebung in der Mobilität der Pentonbasis im Vergleich zu unmodifizierter Pentonbasis zeigen, die konsistent ist mit der Anwesenheit von zusätzlichen Aminosäuresequenzen in dem chimären Protein.
  • Beispiel 15
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen in dem Hexon-Protein enthalten.
  • Zur Konstruktion des Virus AdZ.H(RKKK)2 wurden ein linker und ein rechter Vektorarm hergestellt, welche DNA-Sequenzen enthalten, die überlappen und beiderseits der PmeI-BamHI-pACT Hl1(RK32)-Sequenz rekombinieren, um ein intaktes AdZ.H(RK32)-Genom zu erzeugen. Zur Konstruktion des linken Arms wird gereinigte Ad5-DNA mit AgeI restriktionsverdaut, welches Ad5 an Positionen 14499, 15283, 19017, 23063, 23656, 23411 und 31102 schneidet. Das 0-14499-Fragment kann dann als der linke Arm verwendet und von den anderen Fragmenten durch Gelelektrophorese gereinigt werden. Der rechte Arm kann hergestellt werden durch Verdau von Ad5-DNA mit DrdI. DrdI schneidet Ad5 an Positionen 5458, 7039, 14004, 15593, 17257 und 21023. Das 21023–35938 bp-Fragment kann dann als der rechte Arm verwendet und von den anderen Fragmenten durch Gelelektrophorese gereinigt werden. Diese zwei Fragmente werden dann mit dem PmeI/BamHI-Fragment aus pACT Hl1(RK32) in 293-Zellen transfiziert. PmeI schneidet an Position 13258 in Ad5 und BamHI schneidet an Position 21562 in Ad5. Ähnliche Techniken können verwendet werden, um AdZ.H(RKKK)3 zu produzieren.
  • Beispiel 16
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Vektoren, welche ein Kurzschaft-Fiberprotein enthalten.
  • Das hierin beschriebene Verfahren zur Konstruktion eines Adenovirus aus dem Transferplasmid p193 F5F9Kshort kann ähnlich verwendet werden für die Konstruktion anderer adenoviraler Vektoren aus anderen Kurzschaft-Fibern. Namentlich wurde das Transferplasmid p193 F5F9Kshort, welches die essentielle E4-Region von Adenovirus enthält, mit SalI geschnitten und in 293-Zellen transfiziert, welche eine Stunde zuvor mit dem adenoviralen Vektor AdSE.E4Gus infiziert worden waren. AdSE.E4Gus fehlt die E4-Region des adenoviralen Genoms und kann in 293-Zellen in der Abwesenheit einer Komplementation für die E4-Gene nicht replizieren. Also erst, wenn die AdSE.E4Gus-DNA mit der p193 F5F9K short-Plasmid-DNA rekombiniert, um die E4-Gene zu erhalten, ist der Vektor fähig, in 293-Zellen zu replizieren. Während dieses Rekombinationsereignisses nimmt der neu gebildete Vektor auch die mutierten Fiberprotein-Codierungssequenzen auf, die von den Plasmiden codiert werden. Lebensfähiges rekombinantes E4+-Adenovirus, welches die F5F9Kshort-Fiber-Chimäre enthält, wurde dann durch Plaquebildung der transfizierten Zelllysate 5 Tage nach Transfektion isoliert. Der resultierende Vektor AdSE.F5F9Kshort wurde mittels virologischer Standardtechniken, umfassend zwei aufeinanderfolgende Plaquebildungsrunden auf 293-Zellen, isoliert und gereinigt. Durch PCR und Restriktionsanalyse von viraler DNA wurde verifiziert, dass der Vektor das korrekte Insert enthielt. Oligonucleotid-Primer, die auf beiden Seiten des Fiber-Gens "primen", bestätigten, dass das PCR-Produkt die korrekte Größe zeigte für dasjenige, welches von einem verkürzten chimären Fiber-Gen codiert wird. Die Restriktionsanalyse der Vektor-DNA zeigte, dass der neue Vektor die korrekten Restriktionsstellen enthielt, die singulär sind für das Ad9-Fiber-Knob.
  • Beispiel 17
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, welche Kurzschaft-Fiberproteine und chimäre Pentonbasis-Proteine enthalten, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen inkorporieren.
  • Für diese Konstruktion kann virale AdS.F9sK-DNA mit XmnI verdaut werden, wie oben beschrieben. Das Plasmid pACT Hl1(RK32) wird dann mit den Restriktionsenzymen PmeI und Bam HI geschnitten. Die restriktionsverdauten viralen und plasmidischen DNAs werden gereinigt und in 293-Zellen transfiziert. Die resultierenden Vektoren werden durch zwei aufeinanderfolgende Plaquereinigungsrunden auf 293-Zellen isoliert, und durch Restriktionsanalyse von viraler DNA, erhalten aus Vektor-infizierten 293-Zellen durch Hirt-Extrak tion, wird verifiziert, dass die Vektoren die korrekte Sequenz in der Pentonbasis-Region enthalten.
  • Ferner kann Sequenzierung von PCR-Produkten, generiert durch Amplifizieren der Region des Inserts aus der viralen DNA, verwendet werden, um die Anwesenheit des Inserts zu verifizieren. Die Western-Analyse des chimären Pentonbasis-Proteins auf einem Polyacrylamid-Gel sollte eine korrespondierende Verschiebung in der Mobilität der chimären Pentonbasis im Vergleich zu unmodifizierter Pentonbasis zeigen, die konsistent ist mit der Anwesenheit von zusätzlichen nicht-nativen Aminosäuresequenzen (und der Abwesenheit von nativen Aminosäuresequenzen).
  • Andere Plasmide, für die Karten hierin vorgestellt werden und die nicht zu einem adenoviralen Vektor gemacht wurden, können zu einem solchen gemacht werden unter Anwendung der gleichen oder einer leicht modifizierten Version der oben dargelegten Vorgehensweise. Insbesondere kann das Kurzschaft-Fiberprotein in ein Adenovirus inkorporiert werden, welches ein "spiked" chimäres Pentonbasis-Protein aufweist, das ferner optional eine UTV- oder UTV-artige Sequenz inkorporieren kann.
  • Beispiel 18
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, welche Kurzschaft-Fiberproteine und chimäre Hexon-Proteine enthalten, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen inkorporieren.
  • Virale DNA kann aus einem Kurzschaft-Vektor, wie z. B. AdZ.F9sK, isoliert und mit den oben beschriebenen Restriktionsenzymen geschnitten werden, um Vektoren herzustellen, welche UTV enthaltende chimäre Hexon-Proteine umfassen. Alle übrigen Schritte sind identisch zu den z. B. in Beispiel 17 beschriebenen. Der resultierende Vektor sollte das Kurzschaft-Fiberprotein und das chimäre Hexon-Protein, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen inkorporieren, enthalten. Ferner kann dieser Ansatz mit einer Vielfalt von Transferplasmiden verwendet werden, welche verschiedene chimäre Hexon-Proteine umfassen. Insbesondere kann das Kurzschaft-Fiberprotein in ein Adenovirus in korporiert werden, welches ein "spiked" chimäres Hexon-Protein aufweist, das ferner optional eine UTV- oder UTV-artige Sequenz inkorporieren kann.
  • Beispiel 19
  • Dieses Beispiel beschreibt eine Evaluierung von erfindungsgemäßen Vektoren, insbesondere adenoviralen Vektoren, die UTV- oder UTV-artige Sequenzen umfassen.
  • Um beispielsweise zu bestätigen, dass die Hinzufügung von UTV- oder UTV-artigen Sequenzen keinen Effekt auf den Virus-Zusammenbau hat, kann die Virus-Wachstumskinetik der Vektoren abgeschätzt werden. Als repräsentativ für ein eine UTV-Sequenz enthaltendes Plasmid wurde das Wachstumsverhalten von pAd.F(pK7) überwacht und verglichen mit demjenigen von Wildtyp-Adenovirus (Ad5) sowie dem adenoviralen Vektor AdZ.F(RGD), der eine Insertion eines RGD-Peptidmotivs enthält, welches in der Sequenz SACDCRGDCFCGTS [SEQ ID NO: 93] präsent ist. Für diese Studien wurden 293-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion von 5 aktiven Viruspartikeln pro Zelle entweder mit Ad5, AdZ.F(RGD) oder AdZ.F(pK7) infiziert, und die Anzahl der pro Zelle produzierten infektiösen Partikel (Fluoreszenz-Fokuseinheiten (ffu)) wurde bestimmt nach Ernte der Zellen am Tag 1, 2 und 3 post Infektion. Die Titer von AdZ.F(RGD) oder AdZ.F(pK7) waren etwas niedriger, aber nicht dramatisch verschieden von dem Titer von Ad5. Wie aus 28 ersichtlich, betrugen die Peak-Titer von AdZ.F(RGD) und AdZ.F(pK7) 80% bzw. 56% desjenigen von Ad5. Diese Resultate bestätigen, dass die Wachstumskinetik der zwei Vektoren nicht wesentlich beeinträchtigt wird durch die Hinzufügung von Sequenzen, insbesondere einer UTV- oder UTV-artigen Sequenz, an das Ende des Fiberproteins. Die Resultate deuten ferner darauf hin, dass weitere Vektoren, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen umfassen, kein anormales Wachstumsverhalten zeigen werden.
  • Ferner können Vektoren, welche UTV- oder UTV-artige Sequenzen enthalten, daraufhin evaluiert werden, ob ihre Fähigkeit zur Zellbindung oder zum Gen-Delivery inhibiert wird durch negativ geladene Moleküle (z. B. Heparin, Heparinsulfat, Chondroitansulfat etc.), lösliche adenovirale Kapsidproteine oder durch Vorbehandlung der Zellen mit Agenzien (z. B. Chondroitinase, Hepari nase, Sialidase etc.), welche derartige negativ geladene Reste spalten (siehe z. B. Wickham et al., Nature Biotechnology, 14, 1570–1573 (1996) sowie die vorausgehenden Beispiele). Lösliches Fiberprotein wird den größeren Teil der Bindung eines UTV-Vektors an eine Zelle nicht inhibieren (Wickham et al. (1996), supra). Diese Resultate deuten darauf hin, dass die Inkorporation von UTV- oder UTV-artigen Sequenzen in Penton, Hexon oder Fiber die Fähigkeit eines das chimäre Kapsidprotein enthaltenden rekombinanten Adenovirus, Gen-Delivery zu bewirken, nicht beeinträchtigen wird.
  • Ferner können Infektionsstudien in vivo oder in-vitro-Transfektionen, durchgeführt in der Anwesenheit von Vollblut, verwendet werden, um zu bestätigen, dass die UTV-Vektoren gemäß vorliegender Erfindung nicht limitiert sind für systemisches Delivery infolge Sättigung der Polykationen auf den rekombinanten Adenoviren mit Polyanionen im Blut. In dem Falle, dass eine derartige Bindung die Fähigkeit eines bestimmten Virus zur Zielzelltransduktion behindert, kann das Virus in einer höheren Dosis verabreicht werden, wobei vorzugsweise Vorkehrungen getroffen werden, um jegliche Immunantwort in Assoziation mit einer derartigen höheren Dosis zu reduzieren (z. B. Verabreichung eines anderen Serotyps des adenoviralen Vektors oder Techniken, wie sie in der Internationalen PCT-Anmeldung WO 96/12406 ; Mastrangeli et al., Human Gene Therapy, 7, 79–87 (1996) beschrieben sind).
  • SEQUENZLISTE
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Claims (23)

  1. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein, umfassend eine nicht-native Aminosäuresequenz, welche in eine oder anstelle einer internen Kapsidproteinsequenz insertiert ist, wobei (a) die nicht-native Aminosäuresequenz ca. 3 bis ca. 30 positiv geladene Aminosäurereste umfasst, (b) das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an ein breiteres Spektrum eukariotischer Zellen effizient bindet als ein Wildtyp-Adenovirus-Kapsidprotein und (c) das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein nicht selektiv für einen spezifischen Typ eukariotischer Zellen ist.
  2. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 1, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an eine Epithelzelle, eine glatte Muskelzelle, eine Endothelzelle, eine Fibroblastenzelle, eine Glioblastomzelle und einen Monozyt effizient bindet.
  3. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an die Mehrheit aller eukariotischen Zellen effizient bindet.
  4. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an HA-SMC-Zellen, HuVec-Zellen, CPAE-Zellen, HS-68-Zellen, MRC-5-Zellen, U118-Zellen und THP-1-Zellen effizienter bindet als ein Wildtyp-Fiberprotein vom Serotyp 5.
  5. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein im Wesentlichen an alle eukariotischen Zeilen effizient bindet.
  6. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an einen Rest, der an der Oberfläche der Mehrheit aller eukariotischen Zellen vorhanden ist, effizient bindet.
  7. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 6, wobei der Rest ein negativ geladener Rest ist.
  8. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 6, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein an mindestens einen Zelloberflächen-Rest bindet, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heparin, Heparinsulfat, Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Sialinsäure, Keratinsulfat und Chondroitinsulfat.
  9. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 8, wobei der Rest Heparinsulfat ist.
  10. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Rest im Wesentlichen auf allen eukariotischen Zellen vorhanden ist.
  11. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die positiv geladenen Aminosäurereste ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Arginin und Histidin.
  12. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei sich die nicht-native Aminosäuresequenz in einer exponierten Schleife des Proteins befindet.
  13. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die nicht-native Aminosäuresequenz eine Abstandhaltersequenz umfasst.
  14. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die nicht-native Sequenz eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 90 und SEQ ID NO: 93.
  15. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach Anspruch 14, wobei die nicht-native Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 umfasst, und wobei die nicht-native Aminosäuresequenz ca. 3 bis ca. 30 Lysinreste umfasst.
  16. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein ein Fiberprotein ist.
  17. Chimäres Adenovirus-Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das chimäre Adenovirus-Kapsidprotein ein Hexon- oder Pentonprotein ist.
  18. Vektor, umfassend oder kodierend das Kapsidprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
  19. Vektor nach Anspruch 18, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus unbehüllten Viren.
  20. Vektor nach Anspruch 19, wobei der Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
  21. Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Vektor ein Passagiergen umfasst.
  22. Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 21.
  23. Verfahren zum genetischen Modifizieren einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zeile mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 21.
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Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6465253B1 (en) * 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
WO2001028569A1 (en) * 1999-10-15 2001-04-26 Canji, Inc. Targeted vectors
WO2001036620A2 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Genzyme Corporation Vectors and transgenies with regulatory elements for gene delivery to the liver
US6867022B1 (en) * 2000-01-21 2005-03-15 Regents Of The University Of Michigan Replication deficient adenovirus vectors and methods of making and using them
EP1296720A2 (de) 2000-04-14 2003-04-02 The Uab Research Foundation Poliovirus replikons die für therapeutische wirkstoffe kodieren und deren verwendung
US20020164333A1 (en) * 2000-07-10 2002-11-07 The Scripps Research Institute Bifunctional molecules and vectors complexed therewith for targeted gene delivery
US20030040498A1 (en) * 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
US20060275262A1 (en) * 2001-07-26 2006-12-07 Mathis James M Conditionally replicating viruses and methods for cancer virotherapy
AU2003210661A1 (en) * 2002-01-24 2003-09-02 Novartis Ag Fiber shaft modifications for efficient targeting
US20040166091A1 (en) * 2003-02-24 2004-08-26 Genvec, Inc. Materials and methods for treating disorders of the ear
JP4754480B2 (ja) * 2003-06-20 2011-08-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア キメラアデノウイルスの作成法およびそのようなキメラアデノウイルスの使用
US7291498B2 (en) * 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
EP1649028B1 (de) * 2003-07-25 2012-08-22 Genvec, Inc. Adenoviralevektoren-basierte impfstoffe
ES2340038T3 (es) * 2003-11-14 2010-05-28 Genvec, Inc. Composicion farmaceutica para tratar cancer de pancreas localmente avanzado (cpla) no extirpable.
WO2005080556A2 (en) * 2004-02-23 2005-09-01 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
CA2563396A1 (en) 2004-04-12 2005-11-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health And Human Services Method of using adenoviral vectors to induce an immune response
US7359285B2 (en) * 2005-08-23 2008-04-15 Bbn Technologies Corp. Systems and methods for determining shooter locations with weak muzzle detection
CA2589602A1 (en) * 2004-09-01 2006-04-13 Genvec, Inc. Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
DE602006003420D1 (de) * 2005-04-11 2008-12-11 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
AU2006284756B2 (en) * 2005-08-31 2012-06-07 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
US8450055B2 (en) * 2005-08-31 2013-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
US9651543B2 (en) 2005-08-31 2017-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
EP1951297A2 (de) * 2005-11-10 2008-08-06 GenVec, Inc. Adenoviraler vektorbasierter impfstoff für die maul- und klauen-seuche
EP1971690B1 (de) 2005-12-28 2018-10-17 Translational Therapeutics, Inc. Auf translationaler fehlfunktion beruhende therapeutika
JP2009531324A (ja) 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
CA2675022A1 (en) * 2007-01-09 2008-07-17 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
EP2197491A4 (de) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California Hochaffine anti-prostata-stammzell-antigen-(psca-) antikörper gegen krebs und zum nachweis von krebs
US20090202492A1 (en) * 2008-01-25 2009-08-13 University Of South Florida Adenovirus vaccine utilizing ikk as adjuvant
DK2350268T3 (en) * 2008-11-03 2015-03-23 Crucell Holland Bv PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS
US9605844B2 (en) * 2009-09-01 2017-03-28 Cree, Inc. Lighting device with heat dissipation elements
DK2488636T3 (da) 2009-10-15 2014-06-23 Crucell Holland Bv Fremgangsmåde til oprensning af adenoviruspartikler fra kulturer med høj celledensitet
KR101805938B1 (ko) 2009-10-15 2018-01-10 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
US20120219583A1 (en) 2009-10-16 2012-08-30 Los Alamos National Security, Llc Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
CA2779632C (en) 2009-11-09 2019-08-20 Jason Gall Simian adenovirus and methods of use
CN102762721B (zh) 2010-02-15 2015-03-11 克鲁塞尔荷兰公司 用于生产Ad26腺病毒载体的方法
KR20180108886A (ko) 2010-03-23 2018-10-04 인트렉손 코포레이션 치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
EP2618838A1 (de) 2010-09-20 2013-07-31 Crucell Holland B.V. Therapeutische impfung gegen aktive tuberkulose
BR112013004582A2 (pt) 2010-09-27 2016-09-06 Crucell Holland Bv método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno de um parasita que causa a malária
WO2012083297A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Genvec, Inc. Adenoviral vectors with modified hexon regions
WO2012088041A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based dengue fever vaccine
SG10201600912SA (en) 2011-03-04 2016-03-30 Intrexon Corp Vectors conditionally expressing protein
WO2013074501A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
EA034284B1 (ru) 2012-03-12 2020-01-24 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Частицы рекомбинантного трансгенсодержащего аденовируса с 5'-концевыми нуклеотидами ctatctat
NZ630753A (en) 2012-03-22 2016-12-23 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
US9790519B2 (en) 2012-05-29 2017-10-17 Genvec, Inc. Modified serotype 28 adenoviral vectors
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
RS58436B1 (sr) 2013-04-25 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilizovani rastvorljivi pre-fuzioni rsv f polipeptidi
KR102313153B1 (ko) 2013-06-17 2021-10-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
JP6013654B2 (ja) 2013-09-19 2016-10-25 クルセル ホランド ベー ヴェー 改良されたアデノウイルス製剤
TWI710635B (zh) 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
BR112017009177A2 (pt) 2014-11-04 2018-12-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. vacinas terapêuticas contra hpv16
HUE051897T2 (hu) 2015-03-18 2021-03-29 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vizsgálatok rekombináns expressziós rendszerekre
PL3283634T3 (pl) 2015-04-14 2019-10-31 Janssen Vaccines & Prevention Bv Rekombinowany adenowirus eksprymujący dwa transgeny z dwukierunkowym promotorem
PL3319633T3 (pl) 2015-07-07 2021-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Szczepionka przeciwko rsv
BR112017028449A2 (pt) 2015-07-07 2018-09-04 Janssen Vaccines & Prevention Bv polipeptídeos rsv f pré-fusão solúveis estabilizados
MY195389A (en) 2015-08-20 2023-01-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic HPV18 Vaccines
BR112018006488B1 (pt) 2015-10-06 2024-03-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Métodos para prevenir a degradação induzida por plástico de biológicos
CN117384961A (zh) 2016-02-23 2024-01-12 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
KR20220041966A (ko) 2016-04-05 2022-04-01 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 용해성 융합-전 rsv f 단백질
MA43762A (fr) 2016-04-05 2021-04-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccin contre le rsv
WO2017192418A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
AU2017264562B2 (en) 2016-05-12 2023-03-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
EA039124B1 (ru) 2016-05-30 2021-12-08 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные f-белки rsv до слияния
MX2018015540A (es) 2016-06-20 2019-04-11 Janssen Vaccines & Prevention Bv Promotor bidireccional potente y equilibrado.
US10744196B2 (en) 2016-07-14 2020-08-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HPV vaccines
WO2018064523A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
BR112020004143A2 (pt) 2017-09-15 2020-09-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. método para a indução segura de imunidade contra vírus sincicial respiratório (rsv)
KR20200077559A (ko) 2017-10-31 2020-06-30 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
AU2018359492B2 (en) 2017-10-31 2023-12-14 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
CA3077630A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
JP7366014B2 (ja) 2017-10-31 2023-10-20 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
PT3743106T (pt) 2018-01-23 2022-08-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vacinas contra o vírus da influenza e suas utilizações
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020172509A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. Oncolytic adenoviral vector and methods of use
MX2021012991A (es) 2019-04-25 2021-12-10 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antigenos de gripe recombinantes.
KR20220008816A (ko) 2019-05-15 2022-01-21 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 기반 백신을 사용한 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방적 치료
AU2020275455A1 (en) 2019-05-15 2021-12-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
EP4025247A1 (de) 2019-09-05 2022-07-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenzavirusimpfstoffe und verwendungen davon
AU2020358474A1 (en) 2019-10-03 2022-04-07 Batavia Biosciences B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
CA3154115A1 (en) 2019-10-08 2021-04-15 Yunan ZHENG Proteins containing multiple, different unnatural amino acids and methods of making and using such proteins
AU2020385683A1 (en) 2019-11-18 2022-06-30 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
EP4135757A1 (de) 2020-04-13 2023-02-22 Janssen Biotech, Inc. Psma- und steap1-impfstoffe und ihre verwendungen
EP4176087A1 (de) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Verfahren zur bestimmung des ansprechens auf eine prostatakrebsbehandlung
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
EP4338727A1 (de) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus-formulierungen

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
US5674722A (en) * 1987-12-11 1997-10-07 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
US5672344A (en) * 1987-12-30 1997-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Viral-mediated gene transfer system
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB2246779B (en) * 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5661133B1 (en) * 1991-11-12 1999-06-01 Univ Michigan Collateral blood vessel formation in cardiac muscle by injecting a dna sequence encoding an angiogenic protein
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
AU6133394A (en) * 1993-02-09 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
US5543328A (en) * 1993-08-13 1996-08-06 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having modified fiber proteins
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US6312699B1 (en) * 1994-03-28 2001-11-06 Uab Research Foundation Ligands added to adenovirus fiber
EP0759087B1 (de) * 1994-05-13 2001-03-28 Chiron Corporation Verfahren und zusammensetzungen als vehikel zur zielgerichtete einbringen von genen
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same

Also Published As

Publication number Publication date
DE69637393D1 (de) 2008-02-14
US5965541A (en) 1999-10-12

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