DE69633565T2 - Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren, zur vewendung in der ge ntherapie - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft das Feld der rekombinanten DNA-Technologie, insbesondere das Feld der Gentherapie. Die Erfindung betrifft insbesondere die Gentherapie durch Anwendung von Materialien, welche von Adenoviren, insbesondere humanen rekombinanten Adenoviren, abgeleitet sind. Sie betrifft insbesondere neue, von Viren abgeleitete Vektoren und neue Verpackungszelllinien für auf Adenoviren basierende Vektoren.
  • Gentherapie ist ein kürzlich entwickeltes Konzept, für welches eine große Bandbreite von Anwendungen vorausgesehen wurde und werden kann.
  • In der Gentherapie wird ein Molekül, welches genetische Information trägt, in einige oder alle Zellen eines Wirtes eingeführt, woraus resultiert, dass dem Wirt die genetische Information in einer funktionellen Form hinzugefügt wird.
  • Die hinzugefügte genetische Information kann ein Gen oder das Derivat eines Genes sein, so wie eine cDNA, welche für ein Protein codiert. In diesem Fall bedeutet die funktionelle Form, dass das Protein durch die Maschinerie der Wirtszelle exprimiert werden kann.
  • Die genetische Information kann ebenfalls eine Sequenz von Nucleotiden sein, welche komplementär zu einer Sequenz von Nucleotiden ist, (sei es DNA oder RNA) die in der Wirtszelle vorhanden ist. Die funktionelle Form in diesem Fall bedeutet, dass das hinzugefügte DNA-Molekül (Nucleinsäuremolekül) oder davon in situ hergestellte Kopien fähig sind, Basenpaarungen mit der in der Wirtszelle vorhandenen komplementären Sequenz zu bilden.
  • Anwendungen schließen ein: die Behandlung von genetisch bedingten Erkrankungen durch die Ergänzung eines Proteins oder einer Substanz, welche aufgrund der genetisch bedingten Erkrankung nicht vorhanden ist oder wenigstens in unzureichender Menge im Wirt vorhanden ist, die Behandlung von Tumoren und (anderen) erworbenen Erkrankungen, wie (Auto-)Immunerkrankungen oder Infektionen etc.
  • Wie aus dem Vorangehenden klar geworden sein könnte, gibt es im Grunde drei verschiedene Ansätze in der Gentherapie, einen gerichtet auf die Kompensation eines Mangels vorliegend in einem (zu den Säugetieren gehörigen) Wirt; der zweite gerichtet auf die Entfernung oder Beseitigung von unerwünschten Substanzen (Organismen oder Zellen) und der dritte auf die Anwendung eines rekombinanten Impfstoffes (Tumoren oder fremde Mikroorganismen).
  • Zur Anwendung in der Gentherapie wurden Adenoviren, welche Deletionen aufweisen, als geeignete Träger vorgeschlagen. Adenoviren sind nicht-umhüllte DNA-Viren. Gentransfervektoren abgeleitet von Adenoviren (sogenannte adenovirale Vektoren) haben eine Vielzahl von Eigenschaften, welche sie besonders geeignet für den Gentransfer bei solchen Anwendungen machen. Zum Beispiel ist die Biologie der Adenoviren bis ins Detail charakterisiert, die Adenoviren stehen nicht im Zusammenhang mit schweren Erkrankungen des Menschen, der Virus ist extrem effizient bei der Einschleusung seiner DNA in die Wirtszelle, der Virus kann eine Vielzahl verschiedener Zellen infizieren und hat einen großen Wirtsbereich, der Virus kann vergleichsweise einfach in großen Mengen hergestellt werden und der Virus kann durch Deletionen in der Early-Region 1 (E1) des viralen Genoms replikationsunfähig gemacht werden.
  • Das Adenovirusgenom ist ein lineares Doppelstrang-DNA-Molekül von annähernd 36000 Basenpaaren mit dem 55-kDa-Terminalen-Protein kovalent gebunden an das 5'-Ende jedes Stranges. Die Adenovirus(Ad)-DNA enthält identische Inverted Terminal Repeats (ITR) von ungefähr 100 Basenpaaren, wobei die genaue Länge vom Serotyp abhängt. Die viralen Replikationsursprünge liegen in den ITRs exakt an den Enden des Genoms. Die DNA-Synthese verläuft in zwei Stadien. Zunächst verläuft die Replikation durch Verdrängung des DNA-Stranges, was ein Tochterduplexmolekül und einen verdrängten, parentalen Strang erzeugt. Der verdrängte Strang ist einzelsträngig und kann ein sogenanntes Panhandle-Intermediat bilden, welches die Initiation der Replikation und die Bildung eines Tochterduplexmoleküls erlaubt. Alternativ kann die Replikation von beiden Enden des Genoms simultan ablaufen, was die Notwendigkeit der Bildung einer Panhandle- Struktur erübrigt. Die Replikation wird in 14, angepasst aus (Lechner und Kelly, 1977), zusammengefasst.
  • Während des produktiven Infektionszyklus, werden die viralen Gene in zwei Phasen exprimiert: Die frühe Phase, welches der Zeitraum bis zur viralen DNA-Replikation ist, und die späte Phase, welche mit der Initiation der Replikation der viralen DNA zusammenfällt. Während der frühen Phase werden nur die frühen Genprodukte, codiert durch die Regionen E1, E2, E3 und E4, exprimiert, welche eine Vielzahl von Funktionen ausführen, die die Zelle auf die Synthese der viralen Strukturproteine vorbereiten (Berk, 1986). Während der späten Phase werden, zusätzlich zu den frühen Genprodukten, die späten Genprodukte exprimiert und die DNA- und Proteinsynthese der Wirtszelle werden abgeschaltet. Daraus resultierend wird die Zelle auf die Produktion von viraler DNA und von viralen Strukturproteinen festgelegt (Tooze, 1981).
  • Die E1-Region des Adenovirus ist die erste Region des Adenovirus, die nach der Infektion der Zielzelle exprimiert wird. Diese Region besteht aus zwei transkriptionellen Einheiten, dem E1A- und dem E1B-Gen, welche beide für die onkogene Transformation von primären (embryonalen) Nagerzellkulturen benötigt werden. Die Hauptfunktionen der E1A-Genprodukte sind:
    • 1) bei ruhenden Zellen den Eintritt in den Zellzyklus und die Wiederaufnahme der zellulären DNA-Synthese einzuleiten und
    • 2) das E1B-Gen und die anderen frühen Regionen (E2, E3, E4) transkriptionell zu aktivieren.
  • Transfektion von primären Zellen alleine mit dem E1A-Gen, kann unbegrenzte Proliferation (Immortalisierung) induzieren, resultiert aber nicht in vollständiger Transformation. Die Expression von E1A führt jedoch in den meisten Fällen zur Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose), und nur gelegentlich wird eine Immortalisierung erzielt (Jochemsen et al., 1987). Coexpression des E1B-Gens wird benötigt, um die Induktion der Apoptose zu verhindern und das Eintreten der vollständigen morphologischen Transformation zu ermöglichen. In etablierten, immortalisierten Zelllinien kann die Expression von E1A auf hohem Niveau die vollständige Transformation in Abwesenheit von E1B bewirken (Roberts et al., 1985).
  • Die durch E1B codierten Proteine unterstützen E1A bei der Umlenkung der zellulären Funktionen, um die virale Replikation zu ermöglichen. Die E1B-55kD- und E4-33kD-Proteine, welche einen Komplex bilden, der im wesentlichen im Zellkern lokalisiert ist, wirken durch Inhibition der Synthese der Wirtsproteine und durch die Förderung der Expression der viralen Gene. Ihre Hauptwirkung ist, den selektiven Transport viraler mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma während der gleichzeitig einsetzenden späten Phase der Infektion zu etablieren. Das E1B-21kD-Protein ist wichtig für die korrekte zeitliche Kontrolle des produktiven Infektionszyklus, wodurch der vorzeitige Tod der Wirtszelle, vor dem Abschluss des viralen Lebenszyklus verhindert wird. Mutierte Viren, welche unfähig zur Expression des E1B-21kD-Genproduktes sind, zeigen einen verkürzten Infektionszyklus, welcher von einer exzessiven Degradation der chromosomalen DNA der Wirtszelle begleitet wird (deg-Phänotyp) und einen verstärkten cytopathischen Effekt aufweist (cyt-Phänotyp) (Telling et al., 1994). Die deg- und cyt-Phänotypen werden supprimiert, wenn zusätzlich das E1A-Gen mutiert ist, was zeigt, dass diese Phänotypen Funktionen von E1A sind (White et al., 1988). Weiterhin verzögert das E1B-21kD-Protein die Geschwindigkeit, mit der E1A die anderen viralen Gene anschaltet. Es ist noch nicht bekannt, durch welche Mechanismen das E1B-21kD-Protein diese E1A-abhängigen Funktionen dämpft.
  • Von humanen Adenoviren abgeleitete Vektoren, in welchen wenigstens die E1-Region deletiert worden ist und durch ein interessierendes Gen ersetzt worden ist, wurden in großem Umfang zu gentherapeutischen Experimenten in der präklinischen- und klinischen Phase verwendet.
  • Wie vorangehend festgestellt, besitzen alle gegenwärtig in der Gentherapie verwendeten adenoviralen Vektoren Deletionen in der E1-Region, wo neue genetische Information eingefügt werden kann. Die E1-Deletion macht den rekombinanten Virus replikationsunfähig (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Wir haben gezeigt, dass rekombinante Adenoviren fähig sind, effizient rekombinante Gene in Rattenlebern und Atemwegsepithelien des Rhesusaffen zu übertragen (Bout et al., 1994b; Bout et al., 1994a).
  • Zudem haben wir (Vincent et al., 1996a; Vincent et al., 1996b) und andere (siehe zum Beispiel Haddada et al., 1993) einen sehr effizienten in vivo Adenovirusvermittelten Gentransfer in eine Vielzahl von Tumorzellen in vitro und in solide Tumoren in Tiermodellen (Lungentumoren, Gliome) und in humane Fremd- Transplantate in immundefizienten Mäusen (Lunge) in vivo beobachtet (Übersichtsartikel von Blaese et al., 1995).
  • Im Gegensatz zu zum Beispiel Retroviren, gilt für Adenoviren, a) dass sie nicht ins Genom der Wirtszelle integrieren, b) dass sie fähig sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren und c) fähig sind, rekombinante Gene in vivo effizient zu übertragen (Brody und Crystal, 1994): Diese Eigenschaften machen Adenoviren zu attraktiven Kandidaten für den in vivo Gentransfer von zum Beispiel Suizid- oder Cytokingenen in Tumorzellen.
  • Ein mit der aktuellen Technik rekombinanter Adenoviren verbundenes Problem ist jedoch die Möglichkeit der unerwünschten Erzeugung von replikationsfähigen Adenoviren (RCA) während der Produktion von rekombinanten Adenoviren (Lochmüller et al., 1994; Imler et al., 1996). Dies wird verursacht durch homologe Rekombination zwischen überlappenden Sequenzen aus dem rekombinanten Vektor und den Adenoviruskonstrukten, welche in der komplementierenden Zelllinie, so wie die 293 Zellen (Graham et al., 1977), vorhanden sind. RCA in Chargen, welche für klinische Studien verwendet werden sollen, ist unerwünscht, weil RCA i) in einer unkontrollierten Weise replizieren wird; ii) replikationsunfähige rekombinante Adenoviren komplementieren kann, was zu unkontrollierter Vervielfältigung des rekombinanten Adenovirus führen kann und iii) weil Chargen, welche RCA enthalten, signifikanten Gewebsschaden und damit starke, krankhafte Nebenwirkungen verursachen (Lochmüller et al., 1994). Deshalb sollten Chargen, welche in klinischen Studien verwendet werden sollen, erwiesenermaßen frei von RCA sein (Ostrove, 1994). In einem Aspekt der Erfindung wird dieses Problem bei der Virusproduktion dadurch gelöst, dass wir Verpackungszellen entwickelt haben, welche keine überlappenden Sequenzen mit einem neuen Grundvektor haben und damit geeignet sind für die sichere Produktion von rekombinanten Adenoviren im großen Maßstab. Eines der zusätzlichen Probleme, welches mit der Verwendung rekombinanter Adenoviren verbunden ist, ist die Abwehrreaktion des Wirtes gegen die Behandlung mit Adenoviren.
  • Kurz gefasst: Bei rekombinanten Adenoviren ist die E1-Region deletiert (siehe oben). Die E1-Produkte des Adenovirus lösen die Transkription der anderen frühen Gene (E2, E3, E4) aus, welche als Folge die Expression der späten viralen Gene aktivieren. Deswegen wurde im allgemeinen gedacht, dass die für E1 deletierten Vektoren keine anderen adenoviralen Gene exprimieren würden. Vor kurzem wurde jedoch demonstriert, das einige Zelltypen fähig sind, adenovirale Gene in der Abwesenheit von E1-Sequenzen zu exprimieren. Dies zeigt, dass einige Zelltypen die Maschinerie besitzen, um die Transkription von adenoviralen Genen anzutreiben. Insbesondere wurde gezeigt, dass solche Zellen E2A und späte adenovirale Proteine synthetisieren.
  • In einem gentherapeutischen Zusammenhang bedeutet das, dass der Transfer des therapeutischen rekombinanten Gens in somatische Zellen nicht nur in der Expression des therapeutischen Proteins resultiert, sondern auch in der Synthese von viralen Proteinen resultieren kann. Zellen, welche adenovirale Proteine exprimieren, werden von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt und abgetötet, was somit a) die transduzierten Zellen ausmerzt und b) Entzündungen verursacht (Bout et al., 1994a; Engelhardt et al., 1993; Simon et al., 1993). Da diese nachteilige Reaktion die Gentherapie beeinträchtigt, wurden mehrere Lösungen für dieses Problem vorgeschlagen, so wie a) die Verwendung von immunsuppressiven Wirkstoffen nach der Behandlung; b) Beibehaltung der adenoviralen E3-Region im rekombinanten Vektor (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ) und c) die Verwendung von temperaturempfindlichen (ts) Mutanten des humanen Adenovirus, welche eine Punktmutation in der E2A-Region haben (Patent WO 94/28938).
  • Diese Strategien zur Umgehung der Immunantwort haben jedoch ihre Limitationen.
  • Die Verwendung von ts-mutierten rekombinanten Adenoviren verringert die Immunantwort in bestimmtem Umfang, war aber weniger effektiv bei der Prävention pathologischer Reaktionen in der Lunge (Engelhardt et al., 1994a).
  • Das E2A-Protein selbst kann eine Immunantwort induzieren und es spielt eine fundamentale Rolle in der Umstellung zur Synthese von späten adenoviralen Proteinen. Deshalb ist es attraktiv, rekombinante Adenoviren herzustellen, welche in der E2-Region mutiert sind, was diese temperaturempfindlich (ts) macht, wie dies in der Patentanmeldung WO 94/28938 beansprucht wurde.
  • Ein wesentlicher Nachteil dieses Systems ist die Tatsache, dass das immunogene Protein, obwohl das E2-Protein bei der nicht-permissiven Temperatur instabil ist, immer noch synthetisiert wird. Zudem muss erwartet werden, dass das instabile Protein, wenn auch in geringem Ausmaß, die späte Genexpression aktiviert.
  • Rekombinante Adenoviren mit der ts125-Mutation wurden untersucht und verlängerte Expression der rekombinanten Gene wurde berichtet (Yang et al., 1994b; Engelhardt et al., 1994a; Engelhardt et al., 1994b; Yang et al., 1995). Es traten jedoch immer noch starke krankhafte Veränderungen in den Lungen von Baumwollratten auf (Engelhardt et al., 1994a), was darauf hindeutet, dass die Verwendung von ts-Mutanten nur in einer teilweisen Verbesserung in der Technik rekombinanter Adenoviren resultiert. Andere (Fang et al., 1996) haben bei der Verwendung rekombinanter ts125-Adenoviren keine verlängerte Genexpression in Mäusen und Hunden beobachtet. Ein zusätzliches Problem, das mit der Verwendung von ts125-mutierten Adenoviren assoziiert ist, ist dass eine hohe Frequenz von Reversionen beobachtet wird. Diese Revertanten sind entweder echte Revertanten oder das Ergebnis von Mutationen an einer zweiten Stelle (Kruijer et al., 1983; Nicolas et al., 1981). Beide Arten von Revertanten haben ein E2A-Protein, welches bei normalen Temperaturen funktioniert, und weisen deshalb eine ähnliche Toxizität wie der Wildtypvirus auf.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung deletieren wir deshalb E2A-codierende Sequenzen aus dem rekombinanten Adenovirusgenom und transfizieren diese E2A-Sequenzen in die (Verpackungs-)Zelllinien, welche die E1-Sequenzen enthalten, um die rekombinanten adenoviralen Vektoren zu komplementieren.
  • Wesentliche Hürden bei diesem Ansatz sind, a) dass E2A auf sehr hohem Niveau exprimiert werden sollte und b) dass das E2A-Protein sehr toxisch für die Zellen ist.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart deshalb in noch einem anderen Aspekt die Verwendung des ts125-mutierten E2A-Gens, welches ein Protein produziert, das nicht fähig ist, bei der nicht-permissiven Temperatur DNA-Sequenzen zu binden. Hohe Spiegel dieses Proteins können in den Zellen aufrechterhalten werden (weil es bei dieser Temperatur nicht toxisch ist), bis der Wechsel zur permissiven Temperatur erfolgt. Dies kann damit kombiniert werden, dass das mutierte E2A-Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors, so wie zum Beispiel dem Tet, Methallothionein, Steroid-induzierbaren Promotor, Retinsäure-β-Rezeptor oder andere induzierbare Systeme, gestellt wird. In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird jedoch die Verwendung eines induzierbaren Promotors zur Kontrolle des Zeitpunktes der Produktion von toxischem Wildtyp-E2A offenbart.
  • Zwei zusätzliche, hervorstechende Vorteile der E2A-deletierten, rekombinanten Adenoviren sind die erhöhte Kapazität, heterologe Sequenzen zu beherbergen, und die permanente Selektion von Zellen, welche das mutierte E2A exprimieren. Dieser zweite Vorteil betrifft die hohe Frequenz von Reversionen der ts125-Mutation: Wenn eine Reversion in einer Zelllinie auftritt, die ts125-E2A enthält, wird dies für die Zelle tödlich sein. Deswegen besteht eine permanente Selektion auf die Zellen, welche das ts125-mutierte E2A-Protein exprimieren. Zusätzlich werden wir, da wir in einem Aspekt der Erfindung einen für E2A deletierten rekombinanten Adenovirus herstellen, nicht das Problem der Reversion in unseren Adenoviren haben.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird, als eine weitere Verbesserung, die Verwendung von nicht-humanen Zelllinien als Verpackungszelllinien offenbart.
  • Für die GMP-Produktion von klinischen Chargen von rekombinanten Viren ist es wünschenswert eine Zelllinie zu verwenden, die verbreitet für die Produktion von anderen biotechnologischen Produkten verwendet wurde. Die meisten dieser Zelllinien, welche zum Beispiel benutzt wurden, um Impfstoffe herzustellen, stammen von Affen. Diese Zellen können nicht direkt für die Produktion von rekombinanten humanen Adenoviren verwendet werden, da humane Adenoviren nicht oder nur in geringem Ausmaß in Zellen, die von Affen stammen, replizieren können. Eine Blockade im Wechsel von der frühen zur späten Phase des lytischen Zyklus der Adenoviren liegt dieser gestörten Replikation zugrunde. Wirtbereichsmutationen im Genom des humanen Adenovirus, welche die Replikation von humanen Viren in Affenzellen erlauben, sind jedoch beschrieben (hr400–404). Diese Mutationen liegen in dem Gen, welches das E2A-Protein codiert (Klessig und Grodzicker, 1979; Klessig et al., 1984; Rice und Klessig, 1985) (Klessig et al., 1984). Außerdem sind mutierte Viren beschrieben worden, welche beide Mutationen, den hr- und den temperatursensitiven ts125-Phänotyp, tragen (Brough et al., 1985; Rice und Klessig, 1985).
  • Wir stellen deshalb Verpackungszelllinien her, die aus Affen stammen (zum Beispiel VERO, CV1) und folgendes enthalten:
    • a. E1-Sequenzen, um die Replikation von E1/E2-defizienten Adenoviren zu ermöglichen, und
    • b. E2A-Sequenzen, welche die hr-Mutation und die ts125-Mutation, bezeichnet als ts400 (Brough et al., 1985; Rice und Klessig 1985), enthalten, um den Zelltod durch E2A-Überexpression zu verhindern, und/oder
    • c. E2A-Sequenzen, welche nur die hr-Mutation, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, enthalten, und/oder
    • d. E2A-Sequenzen, welche die hr-Mutation und die ts125-Mutation (ts400), unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors enthalten.
  • Weiterhin offenbaren wir die Konzeption neuer und verbesserter Kombinationen von (neuen und verbesserten) Verpackungszelllinien und (neuen und verbesserten) rekombinanten adenoviralen Vektoren. Wir stellen zur Verfügung:
    • 1. eine neue Verpackungszelllinie, abgeleitet aus diploiden humanen embryonalen Retinoblasten (HER), welche die Nucleotide (nt.) 80-5788 des Ad5-Genoms enthält. Diese Zelllinie, bezeichnet als 911, hinterlegt unter der Nr. 95062101 bei der ECACC, hat viele Eigenschaften, welche sie den üblicherweise verwendeten 293-Zellen (Fallaux et al., 1996) überlegen machen.
    • 2. Neue Verpackungszelllinien, welche nur E1A-Gene und nicht E1B-Gene exprimieren. Etablierte Zelllinien (und nicht humane diploide Zellen, von denen 293- und 911-Zellen abgeleitet sind) sind fähig E1A auf hohem Niveau zu exprimieren, ohne den apoptotischen Zelltod zu erleiden, wie dies bei humanen diploiden Zellen auftritt, die E1A in Abwesenheit von E1B exprimieren. Solche Zelllinien sind fähig, E1B-defiziente rekombinante Adenoviren in trans zu komplementieren, weil Viren mit einer Mutation des E1B-21kD-Proteins fähig sind, die virale Replikation sogar schneller als Wildtyp-Adenoviren abzuschließen (Telling et al., 1994). Die Konstrukte sind nachstehend detailliert beschrieben und graphisch in den 1–5 dargestellt. Die Konstrukte werden in die verschiedenen etablierten Zelllinien transfiziert und auf die starke Expression von E1A hin selektiert. Dies wird durch die direkte funktionelle Verbindung eines selektierbaren Marker-Gens (zum Beispiel das NEO-Gen) mit dem E1B-Promotor bewerkstelligt. Der E1B-Promotor wird transkriptionell durch das E1A-Genprodukt aktiviert und deswegen resultiert die Resistenz gegen das selektive Agens (zum Beispiel G418 im dem Fall, dass NEO als Selektionsmarker verwendet wird) in der direkten Selektion auf die gewünschte Expression des E1A-Gens.
    • 3. Verpackungskonstrukte, bei denen E1B-21kD mutiert oder deletiert ist, die aber nur das 55kD-Protein exprimieren.
    • 4. Verpackungskonstrukte, zur Verwendung für die Herstellung von komplementierenden Verpackungszelllinien aus diploiden Zellen (nicht ausschließlich vom Menschen abstammend), ohne die Notwendigkeit der Selektion durch Marker-Gene. Diese Zellen sind durch die Expression von E1A immortalisiert. Die Expression von E1B ist jedoch in diesem besonderen Fall essentiell, um die durch E1A-Proteine induzierte Apoptose zu verhindern. Selektion von E1-exprimierenden Zellen wird durch die Selektion auf Fokusbildung (Immortalisierung) erreicht, wie dies für 293-Zellen (Graham et al., 1977) und 911-Zellen (Fallaux et al., 1996) beschrieben wurde. Dies sind E1-transformierte, humane embryonale Nierenzellen (HEK), beziehungsweise humane embryonale Retinoblasten (HER).
    • 5. Nach Transfektion von HER-Zellen mit dem Konstrukt pIG.E1A.E1B (4), konnten sieben unabhängige Zelllinien etabliert werden. Diese Zelllinien wurden als: PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8, und PER.C9 bezeichnet. PER bedeutet PGK-E1-Retinoblasten. Diese Zelllinien exprimieren E1A- und E1B-Proteine, sind stabil (zum Beispiel PER.C6 über mehr als 57 Passagen) und komplementieren E1-defiziente adenovirale Vektoren. Ausbeuten von rekombinanten Adenoviren, welche mit PER-Zellen erhalten wurden, sind ein wenig größer als sie mit 293-Zellen erhalten werden. Eine dieser Zelllinien (PER.C6) wurde bei der ECACC unter der Nummer 96022940 deponiert.
    • 6. Neue adenovirale Vektoren mit erweiterten E1-Deletionen (Deletion von nt. 459-3510). Diesen viralen Vektoren fehlen Sequenzen, welche zu den E1-Sequenzen in den Verpackungszelllinien homolog sind. Diese adenoviralen Vektoren enthalten pIX-Promotorsequenzen und das pIX-Gen, da pIX (über seine natürlichen Promotorsequenzen) nur vom Vektor aus und nicht durch Verpackungszellen exprimiert werden kann (Matsui et al., 1986, Hoeben und Fallaux, persönliche Mitteilung; Imler et al., 1996).
    • 7. E2A-exprimierende Verpackungszelllinien, bevorzugt basierend auf entweder E1A-exprimierenden etablierten Zelllinien oder E1A- und E1B-exprimierenden diploiden Zellen (siehe unter 2–4). E2A-Expression steht entweder unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors oder die E2A-ts125-Mutante wird entweder durch einen induzierbaren oder einen konstitutiven Promotor gesteuert.
    • 8. Rekombinante adenovirale Vektoren, wie vorstehend beschrieben (siehe 6), die aber eine zusätzliche Deletion von E2A-Sequenzen aufweisen.
    • 9. Von Affen abstammende Verpackungszellen für Adenoviren, welche fähig sind E1-defiziente rekombinante Adenoviren in trans zu komplementieren. Diese sind bevorzugt cotransfiziert mit pIG.E1AE1B und pIG.NEO und auf NEO-Resistenz selektiert. Solche Zellen, welche E1A und E1B exprimieren, sind fähig E1-defiziente rekombinante humane Adenoviren in trans zu komplementieren, werden dies aber ineffizient tun, weil bei Zellen, die von Affen abstammen, eine Blockade der Synthese der späten Adenovirusproteine vorliegt (Klessig und Grodzicker, 1979). Um dieses Problem zu überwinden, erzeugen wir rekombinante Adenoviren, welche eine Wirtbereichsmutation im E2A-Gen enthalten, die es humanen Adenoviren erlaubt, in Affenzellen zu replizieren. Solche Viren werden, wie in 12 beschrieben, erzeugt, außer dass DNA von einer hr-Mutante für die homologe Rekombination verwendet wird.
    • 10. Von Affen abstammende Verpackungszellen für Adenoviren, wie unter 9 beschrieben, außer dass diese auch mit E2A-Sequenzen cotransfiziert sein werden, welche die hr-Mutation enthalten. Dies erlaubt die Replikation von humanen Adenoviren, welchen E1 und E2A fehlt (siehe unter 8). In diesen Zelllinien steht E2A entweder unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors oder es wird die tsE2A-Mutante verwendet. Im letzteren Fall wird das E2A-Gen somit sowohl die ts-Mutation als auch die hr-Mutation (abgeleitet von ts400) tragen. Replikationskompetente humane Adenoviren, welche beide Mutationen tragen, wurden beschrieben (Brough et al., 1985, Rice und Klessig, 1985).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt anderweitig verbesserte adenovirale Vektoren, sowie neue Strategien zur Herstellung und Anwendung von solchen Vektoren und ein Verfahren zur intrazellulären Vervielfältigung linearer DNA-Fragmente in Säugerzellen zur Verfügung.
  • Die sogenannten "minimalen" adenoviralen Vektoren behalten, gemäß der vorliegenden Erfindung, wenigstens einen Teil des viralen Genoms, der benötigt wird, um das Genom in virale Partikel zu verpacken (das Verpackungssignal), sowie wenigsten eine Kopie von wenigstens einem funktionellen Teil oder ein Derivat des Inverted Terminal Repeat (ITR), welches DNA-Sequenzen sind, die von den Enden des linearen Adenovirusgenoms abgeleitet sind. Die Vektoren, gemäß der vorliegenden Erfindung, werden auch ein Transgen, verbunden mit einer Promotor-Sequenz zur Steuerung der Expression des Transgens, enthalten. Die Verpackung des sogenannten minimalen adenoviralen Vektors kann durch Coinfektion mit einem Helfervirus oder alternativ mit einem verpackungsdefizienten replizierenden Helfersystem, wie nachstehend beschrieben, erreicht werden.
  • Von Adenoviren abgeleitete DNA-Fragmente, welche in geeigneten Zelllinien replizieren können und welche als verpackungsdefiziente replizierende Helfersysteme dienen können, werden wie folgt hergestellt. Diese DNA-Fragmente behalten wenigsten einen Teil der transkribierten Region der "späten" Transkriptionseinheit des Adenovirusgenoms und besitzen Deletionen in wenigstens einem Teil der E1-Region und Deletionen in wenigstens einem Teil des Verpackungssignals. Zusätzlich enthalten diese DNA-Fragmente wenigstens eine Kopie eines Inverted Terminal Repeat (ITR). An einem Ende des transfizierten DNA-Moleküls befindet sich ein ITR. Das andere Ende kann einen ITR oder alternativ eine DNA-Sequenz enthalten, welche komplementär zu einem Teil des gleichen Stranges des DNA-Moleküls ist, der nicht gleich mit dem ITR ist. Wenn im letzteren Fall die zwei komplementären Sequenzen durch Basenpaarung aneinander binden, kann die freie 3'-Hydroxylgruppe des Nucleotids am 3'-Ende der Haarnadelstruktur als Primer für die DNA-Synthese durch zelluläre und/oder durch den Adenovirus kodierte DNA-Polymerasen dienen, was in der Umwandlung wenigstens eines Teils des DNA-Moleküls in eine Doppelstrangform resultiert. Die fortgesetzte Initiation der Replikation am ITR wird in einem linearen doppelsträngigen DNA-Molekül resultieren, welches durch zwei ITRs flankiert wird und größer als das ursprünglich transfizierte DNA-Molekül ist (siehe 13). Dieses Molekül kann sich selbst, aufgrund der Wirkung der adenoviralen Proteine, kodiert durch das DNA-Molekül, und der adenoviralen und zellulären Proteine, kodiert durch Gene im Genom der Wirtszelle, in der transfizierten Zelle replizieren. Dieses DNA-Molekül kann, wegen seiner großen Größe (mehr als 39000 Basenpaare) oder wegen der Abwesenheit eines funktionellen Enkapsidierungssignals, nicht enkapsidiert werden. Dieses DNA-Molekül soll als Helfer für die Produktion von defizienten adenoviralen Vektoren in geeigneten Zelllinien dienen.
  • Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren für die Vervielfältigung von linearen DNA-Fragmenten variabler Größe in geeigneten Säugerzellen. Diese DNA-Fragmente enthalten wenigstens eine Kopie des ITR an einem der Enden des Fragments. Das andere Ende kann einen ITR oder alternativ eine DNA-Sequenz enthalten, welche komplementär zu einem Teil des gleichen Stranges des DNA-Moleküls ist, der nicht gleich mit dem ITR ist. Wenn im letzteren Fall die zwei komplementären Sequenzen durch Basenpaarung aneinander binden, kann die freie 3'-Hydroxylgruppe des Nucleotids am 3'-Ende der Haarnadelstruktur als Primer für die DNA-Synthese durch zelluläre und/oder durch den Adenovirus kodierte DNA-Polymerasen dienen, was in der Umwandlung des verdrängten Stranges in eine Doppelstrangform für wenigstens einen Teil des DNA-Moleküls resultiert. Die weitere Initiation der Replikation am ITR wird in einem linearen doppelsträngigen DNA-Molekül resultieren, welches durch zwei ITRs flankiert wird und größer als das ursprünglich transfizierte DNA-Molekül ist. Ein DNA-Molekül, welches ITR-Sequenzen an beiden Enden enthält, kann sich selbst aufgrund der Anwesenheit wenigstens der adenoviralen E2-Proteine (nämlich des DNA-bindenden Proteins (DBP), der Adenovirus-DNA-Polymerase (Ad-pol) und des präterminalen Proteins (pTP)) in den transfizierten Zellen replizieren. Die benötigten Proteine können von adenoviralen Genen auf dem DNA-Molekül selbst exprimiert werden, von adenoviralen E2-Genen, welche in das Wirtszellgenom integriert sind, oder, wie vorstehend beschrieben, von einem replizierenden Helferfragment.
  • Mehrere Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass das Vorliegen von ITR-Sequenzen am Ende von DNA-Molekülen ausreichend ist, um Adenovirus-Minichromosome zu erzeugen, die replizieren können, wenn die für die Replikation benötigten adenoviralen Proteine in trans zur Verfügung gestellt werden, zum Beispiel durch Infektion mit einem Helfervirus (Hu et al., 1992); (Wang und Pearson, 1985); (Hay et al., 1984). Hu et al., (1992) haben das Vorliegen und die Replikation von symmetrischen Adenovirus-Minichromosom-Dimeren nach der Transfektion von Plasmiden, welche ein einzelnes ITR enthalten, beobachtet. Die Autoren waren in der Lage zu demonstrieren, dass diese dimeren Minichromosomen nach einer End-zu-End Ligierung der einzelnen ITR-DNA-Moleküle entstehen. In DNA, die aus defizienten Adenovirus-Typ2-Partikeln extrahiert wurde, wurden durch Anwendung der Elektronenmikroskopie auch dimere Moleküle verschiedener Größe beobachtet (Daniell, 1976). Es wurde vorgeschlagen, dass die unvollständigen Genome durch fehlerhafte Rekombination zwischen verschiedenen Molekülen entstanden sind und dass Variationen der Position der Sequenz, an welcher die fehlerhafte Basenpaarung aufgetreten ist, für die heterogene Beschaffenheit der unvollständigen Genome verantwortlich seien. Auf der Grundlage dieses Mechanismus wurde spekuliert, dass theoretisch defekte Moleküle mit einer Gesamtlänge von bis zu dem Zweifachen des normalen Genoms erzeugt werden könnten. Solche Moleküle könnten duplizierte Sequenzen von beiden Enden des Genoms enthalten. Es wurden jedoch keine in den defizienten Partikeln verpackte DNA-Moleküle gefunden, die größer als der Virus in seiner gesamten Länge gewesen wären (Daniell, 1976). Dies kann durch die Größenbegrenzungen erklärt werden, die für das Verpacken gelten. Zudem wurde beobachtet, dass in den Viruspartikeln DNA-Moleküle mit einem duplizierten linken Ende, gegenüber denen, die das rechte Ende enthielten, vorherrschten (Daniell, 1976). Dies ist vollständig durch das Vorliegen des Verpackungssignals nahe des linken Endes des Genoms zu erklären (Gräble und Hearing, 1990; Gräble und Hearing, 1992; Hearing et al., 1987).
  • Die wesentlichen Probleme, welche mit den aktuellen, von Adenoviren abgeleiteten Vektoren assoziiert sind, sind:
    • A) Die starke Immunogenizität des Viruspartikels
    • B) Die Expression von adenoviralen Genen, die in den adenoviralen Vektoren vorliegen, welche in einer Reaktion der cytotoxischen T-Zellen gegen die transduzierten Zellen resultiert.
    • C) Die geringe Menge von heterologen Sequenzen, die in den aktuellen Vektoren untergebracht werden kann (annähernd bis zu maximal 8000 Basenpaare heterologer DNA).
    • Ad A) Die starke Immunogenizität der Adenoviruspartikel resultiert in einer Immunantwort des Wirts, sogar nach einer einzigen Verabreichung des adenoviralen Vektors. Als Folge der Entwicklung neutralisierender Antikörper, wird eine nachfolgende Verabreichung des Virus weniger wirksam oder sogar vollständig unwirksam sein. Die verlängerte oder anhaltende Expression der transferierten Gene wird jedoch die Zahl der benötigten Verabreichungen reduzieren und so das Problem umgehen.
    • Ad B) Experimente, die von Wilson und Mitarbeitern durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass nach durch Adenoviren vermitteltem Gentransfer in immunkompetente Tiere die Expression des Transgens graduell abnimmt und annähernd 2–4 Wochen nach der Infektion verschwindet (Yang et al., 1994a; Yang et al., 1994b). Dies wird verursacht durch die Entwicklung einer zytotoxischen T-Zell (CTL)-Antwort gegen die transduzierten Zellen. Die CTLs waren gegen adenovirale Proteine gerichtet, welche von den viralen Vektoren exprimiert wurden. In den transduzierten Zellen konnte die Synthese des adenoviralen DNA-bindenden-Proteins (das E2A-Genprodukt), der Penton- und Fiberproteine (späte Genprodukte) etabliert werden. Diese adenoviralen Proteine, kodiert durch den viralen Vektor, wurden trotz der Deletion der E1-Region exprimiert. Dies zeigt, dass die Deletion der E1-Region nicht ausreichend ist, um die Expression der viralen Gene vollkommen zu verhindern (Engelhardt et al., 1994a)
    • Ad C) Untersuchungen von Graham und Mitarbeitern haben gezeigt, dass Adenoviren fähig sind, DNA von bis zu 105% der normalen Größe des Genoms zu verpacken (Bett et al., 1993). Größere Genome neigen dazu, instabil zu sein, was in einem Verlust von DNA-Sequenzen während der Vermehrung des Virus resultiert. Die Kombination von Deletionen in der E1- und E3-Region des viralen Genoms steigert die maximale Größe des Fremdmaterials, das verpackt werden kann, bis auf annähernd 8.3 kb. Zudem scheinen einige Sequenzen der E4-Region verzichtbar für das Wachstum des Virus zu sein (was der maximalen Kapazität zur Verpackung weitere 1,8 kb hinzufügt). Auch die E2A-Region kann aus dem Vektor deletiert werden, wenn das E2A-Genprodukt in der Verpackungszelllinie in trans zur Verfügung gestellt wird, was weitere 1,6 kb hinzufügt. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die maximale Kapazität für fremde DNA signifikant über 12 kb erhöht werden kann.
  • Wir haben eine neue Strategie für die Erzeugung und Produktion von helferfreien Beständen von rekombinanten adenoviralen Vektoren entwickelt, die bis zu 38 kb fremder DNA beherbergen können. Nur zwei funktionelle ITR-Sequenzen und Sequenzen, welche als Verpackungssignal fungieren können, müssen Bestandteil des Vektorgenoms sein. Solche Vektoren werden als minimale Adenovektoren bezeichnet. Die Helferfunktionen für die minimalen Adenovektoren werden in trans durch Verpackungsdefiziente und replikationskompetente DNA-Moleküle zur Verfügung gestellt, welche all die viralen Gene enthalten, welche die benötigten Genprodukte kodieren, mit Ausnahme der Gene, welche im Wirtszellgenom vorhanden sind, oder Genen, die im Vektorgenom liegen.
  • Die Andwendungen der offenbarten Erfindung werden nachstehend umrissen und werden im experimentellen Teil veranschaulicht, was nur für diesen Zweck gedacht ist und nicht dazu verwendet werden sollte, den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie von einem Fachmann verstanden wird, einzuschränken.
  • Verwendung der IG-Verpackungskonstrukte – Diploide Zellen.
  • Die Konstrukte, insbesondere pIG.E1A.E1B, werden verwendet, um diploide humane Zellen, wie humane embryonale Retinoblasten (HER), humane embryonale Nierenzellen (HEK) und humane embryonale Lungenzellen (HEL), zu transfizieren. Transfizierte Zellen werden auf den transformierten Phänotyp (Fokusbildung) hin selektioniert und auf ihre Fähigkeit untersucht, die Vermehrung von E1-deletiertem rekombinantem Adenovirus, wie IG.Ad.MLPI.TK, zu ermöglichen. Solche Zelllinien werden für die Erzeugung und (Großmassstabs-)Produktion von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren verwendet. Solche Zellen, die mit rekombinantem Adenovirus infiziert sind, sind ebenfalls dazu gedacht, in vivo als lokale Produzenten von rekombinantem Adenovirus, zum Beispiel für die Behandlung von soliden Tumoren, verwendet zu werden.
  • 911-Zellen werden für die Titration, Erzeugung und Produktion von rekombinanten adenoviralen Vektoren verwendet (Fallaux et al., 1996).
  • HER-Zellen, welche mit pIG.E1A.E1B transfiziert sind, haben 7 unabhängige Klone ergeben (diese werden als PER-Zellen bezeichnet). Diese Klone werden für die Produktion von E1-deletierten (einschließlich nicht-überlappender adenoviraler Vektoren) oder E1-defizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren verwendet und bilden die Basis für die Einführung von zum Beispiel E2B- oder E2A-Konstrukten (zum Beispiel ts125E2A, siehe unten), E4 etc., welche die Vermehrung von adenoviralen Vektoren erlauben, die Mutationen in zum Beispiel E2A oder E4 aufweisen.
  • Zusätzlich werden diploide Zellen von anderen Spezies, welche permissiv für humane Adenoviren sind, wie die Baumwollratte (Sigmodon hispidus) (Pacini et al., 1984), der Syrische Hamster (Morin et al., 1987) oder der Schimpanse (Levrero et al., 1991), mit diesen Konstrukten immortalisiert. Solche Zellen, infiziert mit rekombinantem Adenovirus, sind auch dazu gedacht, in vivo für die lokale Produktion von rekombinantem Adenovirus, zum Beispiel für die Behandlung von soliden Tumoren, verwendet zu werden.
  • Etablierte Zellen
  • Die Konstrukte, insbesondere pIG.E1A.NEO, können verwendet werden, um etablierte Zelllinien, zum Beispiel A549 (humanes Bronchialkarzinom), KB (orales Karzinom), MRC-5 (humane diploide Lungenzelllinie) oder GLC-Zelllinien (kleinzelliges Bronchialkarzinom) zu transfizieren (de Leij et al., 1985; Postmus et al., 1988) und auf die NEO-Resistenz hin zu selektionieren. Individuelle Kolonien resistenter Zellen werden isoliert und auf ihre Kapazität hin untersucht, die Vermehrung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren, wie IG.Ad.MLPI.TK, zu ermöglichen. Wenn die Vermehrung von E1-deletierten rekombinanten Viren in E1A-enthaltenden Zellen möglich ist, können solche Zellen für die Erzeugung und Produktion von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren verwendet werden. Sie sind auch verwendbar für die Vermehrung von E1A deletierten/E1B beibehaltenden rekombinanten Adenoviren.
  • Etablierte Zellen können auch mit pIG.E1A.E1B und pIG.Neo (oder einem anderen NEO-enthaltenden Expressionsvektor) cotransfiziert werden. Gegen G418 resistente Klone werden auf ihre Fähikeit hin untersucht, die Vermehrung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren, wie IG.Ad.MLPI.TK, zu ermöglichen, und werden verwendet, um E1-deletierte rekombinante Adenoviren zu erzeugen und zu produzieren und werden in vivo zur lokalen Produktion von rekombinanten Viren verwendet, wie für die diploiden Zellen beschrieben (siehe oben).
  • Alle Zelllinien, einschließlich transformierter diploider Zelllinien oder NEO-resistenter etablierter Linien, können als Basis für die Erzeugung von Verpackungszelllinien der "nächsten Generation" verwendet werden, welche die Vermehrung von E1-defizienten rekombinanten Adenoviren ermöglichen, welche Deletionen auch in anderen Genen, so wie E2A und E4, aufweisen. Darüber hinaus werden sie die Basis für die Erzeugung von minimalen adenoviralen Vektoren, wie hier offenbart, zur Verfügung stellen.
  • E2 exprimierende Zelllinien
  • Verpackungszellen, die E2A-Sequenzen exprimieren, werden jetzt und zukünftig zur Erzeugung und Produktion (in großem Maßstab) von E2A-deletierten rekombinanten Adenoviren verwendet.
  • Die neu erzeugten humanen Adenovirus-Verpackungszelllinien oder Zelllinien, die aus Spezies abgeleitet wurden, die permissiv für humane Adenoviren sind (E2A oder ts125E2A; E1A + E2A; E1A + E1B + E2A; E1A + E2A/ts125; E1A + E1B-E2A/ts125) oder nicht-permissive Zelllinien, wie Affenzellen (hrE2A oder hr + ts125E2A; E1A + hrE2A; E1A + E1B + hrE2A; E1A + hrE2A/ts125; E1A + E1B + hrE2A/ts125) werden jetzt und zukünftig zur Erzeugung und (Großmassstabs-)Produktion von E2A-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektoren verwendet. Zusätzlich werden sie in vivo für die lokale Produktion von rekombinantem Virus angewendet werden, wie für die diploiden Zellen beschrieben (siehe oben).
  • Neue adenovirale Vektoren
  • Die neu entwickelten adenoviralen Vektoren, die eine E1-Deletion von nt. 459-3510 enthalten, werden zum Zwecke des Gentransfers verwendet werden. Diese Vektoren sind auch die Basis für die Entwicklung von umfangreicher deletierten adenoviralen Vektoren, welche zum Beispiel für E2A, E2B oder E4 mutiert sind. Solche Vektoren werden zum Beispiel in den vorstehend beschriebenen (siehe 1–3), neu entwickelten Verpackungszelllinien erzeugt werden.
  • Minimales Adenovirus-Verpackungssystem
  • Wir offenbaren adenovirale Verpackungskonstrukte (zur Verwendung für das Verpacken von minimalen adenoviralen Vektoren), welche die folgenden Eigenschaften haben können:
    • a. das Verpackungskonstrukt repliziert
    • b. das Verpackungskonstrukt kann nicht verpackt werden, weil das Verpackungssignal deletiert ist
    • c. das Verpackungskonstrukt enthält eine interne Sequenz, die Haarnadelstrukturen bilden kann (siehe Abschnitt "Experimenteller Teil: vorgeschlagene Haarnadelstruktur", siehe 15)
    • d. wegen der internen Haarnadelstruktur wird das Verpackungskonstrukt dupliziert. Das bedeutet, dass das Verpackungskonstrukt zweimal so lang wird, wie es vor der Transfektion in die Verpackungszelle war (in unserer Probe dupliziert es von 35 kb auf 70 kb). Diese Duplikation verhindert ebenfalls das Verpacken. Beachte, dass dieses duplizierte DNA-Molekül ITRs an beiden Enden aufweist (siehe zum Beispiel 13)
    • e. dieses duplizierte Verpackungsmolekül ist fähig, wie ein "normales Adenovirus-DNA-Molekül" zu replizieren
    • f. die Duplikation des Genoms ist eine Voraussetzung für die Produktion von ausreichenden Mengen von adenoviralen Proteinen, welche für die Verpackung des minimalen adenoviralen Vektors benötigt werden
    • g. Das Verpackungskonstrukt hat keine überlappenden Sequenzen mit dem minimalen Vektor oder zellulären Sequenzen, die zu der Erzeugung von RCA durch homologe Rekombination führen könnten
  • Dieses Verpackungssystem wird zur Produktion von minimalen adenoviralen Vektoren verwendet werden. Die Vorteile von minimalen adenoviralen Vektoren, zum Beispiel zur Anwendung in der Gentherapie oder Impfung, sind weithin bekannt (Beherbergung von bis zu 38 kb; Auslassung aller potentiell toxischen und immunogenen adenoviralen Gene).
  • Adenovirale Vektoren, die Mutationen in essentiellen Genen enthalten (einschließlich minimaler adenoviraler Vektoren), können ebenfalls durch die Verwendung dieses Systems vermehrt werden.
  • Verwendung von intrazellulären E2-exprimierenden Vektoren.
  • Minimale adenovirale Vektoren werden durch Anwendung der Helferfunktionen erzeugt, welche in trans durch die verpackungsdefizienten, replizierenden Helfermoleküle zur Verfügung gestellt werden. Die von Adenoviren abgeleiteten ITR-Sequenzen dienen als Ursprünge der DNA-Replikation in der Anwesenheit wenigstens der E2-Genprodukte. Wenn die E2-Genprodukte von Genen im Vektorgenom (wohlgemerkt, das Gen (die Gene) müssen durch einen E1-unabhängigen Promotor reguliert werden) aus exprimiert werden, kann das Vektorgenom in den Zielzellen replizieren. Dies wird eine signifikant erhöhte Anzahl von Matrizenmolekülen in den Zielzellen bedingen und als Ergebnis eine verstärkte Expression der interessierenden Gene bedingen, welche durch den Vektor kodiert werden. Dies ist von besonderem Interesse für Ansätze der Gentherapie bei Krebs.
  • Anwendungen für die intrazelluläre Amplifikation von linearen DNA-Fragmenten.
  • Ein ähnlicher Ansatz könnte auch verwendet werden, wenn die Amplifikation von linearen DNA-Fragmenten erwünscht ist. DNA-Fragmente von bekannter oder unbekannter Sequenz könnten in Zellen, welche die E2-Genprodukte enthalten, amplifiziert werden, wenn sich wenigstens eine ITR-Sequenz in der Nähe ihres Endes oder an ihrem Ende befindet. Es gibt keine offensichtlichen Beschränkungen für die Größe des Fragments. Selbst Fragmente, die viel größer als das Adenovirusgenom (36 kb) sind, sollten durch Anwendung dieses Ansatzes amplifiziert werden. Es ist somit möglich, große Fragmente in Säugerzellen zu klonieren, ohne entweder als Zwischenschritt eine Klonierung des Fragments über Bakterien (wie E. coli) durchzuführen oder die Polymerasekettenreaktion (P. C. R.) zu verwenden. Im Endstadium einer produktiven Adenovirusinfektion kann eine einzelne Zelle über 100000 Kopien des viralen Genoms enthalten. Im besten Fall können die linearen DNA-Fragmente auf ein ähnliches Niveau amplifiziert werden. Somit sollte man in der Lage sein, mehr als 5 μg des DNA-Fragments pro 10 Millionen Zellen zu extrahieren (bei einem 35 kb Fragment). Dieses System kann verwendet werden, um heterologe Proteine für die Forschung oder für therapeutische Zwecke zu exprimieren (äquivalent zum auf Simian-Virus 40 basierenden COS-Zell-System). Zusätzlich kann dieses System verwendet werden, um Gene in großen DNA-Fragmenten zu identifizieren. Zufällige DNA-Fragmente können (nach Zugabe von ITRs) amplifiziert und während der intrazellulären Amplifikation exprimiert werden. Auswahl der oder Selektion auf die Zellen mit dem gewünschten Phänotyp, kann verwendet werden, um das interessierende Fragment anzureichern und das Gen zu isolieren.
  • Experimenteller Teil
  • Erzeugung von Zelllinien, die fähig sind, E1-defiziente recombinante adenovirale Vektoren in trans zu komplementieren.
  • 1. 911-Zelllinie
  • Wir haben eine Zelllinie erzeugt, die E1-Sequenzen des Adenovirus Typ 5 enthält und fähig ist, E1-deletierte rekombinante Adenoviren in trans zu komplementieren (Fallaux et al., 1996).
  • Diese Zelllinie wurde erhalten durch Transfektion von humanen diploiden embryonalen Retinoblasten (HER) mit pAd5XhoIC, welches nt. 80-5788 des Ad5 enthält. Eine der resultierenden Transformanten erhielt die Bezeichnung 911. Für diese Zelllinie wurde gezeigt, dass sie sehr nützlich für die Vermehrung von E1-defizienten rekombinanten Adenoviren ist. Man fand heraus, dass sie den 293-Zellen überlegen ist. Im Gegensatz zu den 293-Zellen, fehlt den 911-Zellen der vollständig transformierte Phänotyp, was am wahrscheinlichsten der Grund dafür ist, dass diese Linie als adenovirale Verpackungszellline leistungsfähiger ist:
    Plaquetests können schneller durchgeführt werden (4–5 Tage anstatt 8–14 Tage bei 293)
    Einzellige Schichten von 911-Zellen überleben besser unter einer Agar-Überschichtung wie dies für einen Plaquetest notwendig ist
    Stärkere Amplifikation von E1-deletierten Vektoren
  • Zudem wurden 911-Zellen im Gegensatz zu 293-Zellen, die mit gescherter adenoviraler DNA transfiziert wurden, durch Anwendung eines definierten Konstruktes transfiziert. Die Transfektionseffizienzen von 911-Zellen sind vergleichbar mit denen von 293-Zellen.
  • Neue Verpackungskonstrukte.
  • Quelle adenoviraler Sequenzen.
  • Adenovirale Sequenzen werden entweder aus pAd5.SalB, welches nt. 80-9460 des humanen Adenovirus Typ 5 enthält (Bernards et al., 1983) oder aus Wildtyp Ad5-DNA gewonnen.
  • pAdS.SalB wurde mit SalI und XhoI gespalten, das große Fragment wurde religiert und dieser neue Klon wurde mit pAd5.X/S bezeichnet.
  • Das pTN-Konstrukt (hergestellt durch Dr. R. Vogels, IntroGene, Niederlande) wurde als Quelle für den humanen PGK-Promotor und das NEO-Gen verwendet.
  • Der humane PGK-Promotor und das NEOR-Gen.
  • Die Transkription von E1A-Sequenzen in den neuen Verpackungskonstrukten wird durch den humanen PGK-Promotor reguliert (Michelson et al., 1983; Singer-Sam et al., 1984), welcher aus dem Plasmid pTN (Geschenk von R. Vogels), welches pUC119 (Vieira und Messing, 1987) als Rückgrat verwendet, gewonnen wurde. Dieses Plasmid wurde auch als Quelle für das NEO-Gen verwendet, welches mit dem Polyadenylierungssignal aus dem Hepatitis-B-Virus (HBV) verbunden ist.
  • Verbindung des PGK-Promotors mit den E1-Genen (1)
  • Um die Sequenzen von E1 des Ad5 (ITR, Replikationsursprung und Verpackungssignal) durch heterologe Sequenzen zu ersetzen, haben wir E1-Sequenzen von Ad5 (nt. 459 bis 960), durch Anwendung der Primer Ea1 und Ea2 (siehe Tabelle 1) mittels PCR amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit ClaI gespalten und in Bluescript (Stratagene), vorher gespalten mit ClaI und EcoRV, ligiert, woraus das Konstrukt pBS.PCRI resultiert.
  • Der Vektor pTN wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (partiell) und ScaI gespalten und das DNA-Fragment, welches die PGK-Promotorsequenzen enthält, wurde in PBS.PCRI, gespalten mit ScaI und EcoRI, ligiert. Das resultierende Konstrukt PBS.PGK.PCRI enthält den humanen PGK-Promotor funktionell verbunden mit den Ad5-E1-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 916.
  • Konstruktion von pIG.E1A.E1B.X (2)
  • pIG.E1A.E1B.X wurde dadurch hergestellt, dass das ScaI-BspEI-Fragment von pAT-X/S durch das entsprechende Fragment aus PBS.PGK.PCRI (enthält den PGK-Promotor verbunden mit den E1A-Sequenzen) ersetzt wurde.
  • pIG.E1A.E1B.X enthält die für E1A und E1B kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle des PGK-Promotors.
  • Da die Ad5-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 5788 in diesem Konstrukt vorhanden sind, wird auch das pIX-Protein des Adenovirus durch dieses Plasmid kodiert.
  • Konstruktion von pIG.E1A.NEO (3)
  • Um den vollständigen E1B-Promotor einzufügen und diesen Promotor in solcher Weise anzubinden, dass das AUG-Codon des E1B-21kD exakt als AUG-Codon von NEOR fungiert, haben wir den E1B-Promotor durch Anwendung der Primer Ea3 und Ep2 amplifiziert, wobei der Primer Ep2 eine NcoI-Stelle in das PCR-Fragment einführt. Das resultierende PCR-Fragment, bezeichnet als PCRII, wurde mit HpaI und NcoI gespalten und in pAT-X/S ligiert, welches vorher mit HpaI und mit NcoI gespalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pAT-X/S-PCR2 bezeichnet. Das NcoI-StuI-Fragment von pTN, welches das NEO-Gen und einen Teil des Polyadenylierungsignals des Hepatitis-B-Virus (HBV) enthält, wurde in pAT-X/S-PCR2 (gespalten mit NcoI und NruI) kloniert. Das resultierende Konstrukt ist: pAT-PCR2-NEO. Das Polyadenylierungsignal wurde durch den Austausch des ScaI-SalI-Fragmentes von pAT-PCR2-NEO durch das entsprechende Fragment von pTN, vervollständigt (resultierend in pAT.PCR2.NEO.p(A)). Das Scal-XbaI-Fragment von pAT.PCR2.NEO.p(A) wurde durch das entsprechende Fragment von pIG.E1A.E1B-X, welches den PGK-Promotor verbunden mit den E1A-Genen enthält, ersetzt.
  • Das resultierende Konstrukt wurde als pIG.E1A.NEO bezeichnet und enthält somit E1-Sequenzen aus Ad5 (nt. 459 bis nt. 1713) unter der Kontrolle des humanen PGK-Promotors.
  • Konstruktion von pIG.E1A.E1B (4)
  • pIG.E1A.E1B wurde durch Amplifikation der Sequenzen, welche die N-terminalen Aminosäuren von E1B-55kD kodieren, durch Anwendung der Primer Eb1 und Eb2 (führt eine XhoI-Stelle ein) hergestellt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BglII gespalten und in das BglII/NruI-Fragment von pAT-X/S kloniert, wodurch pAT-PCR3 erhalten wurde.
  • pIG.E1A.E1B wurde hergestellt durch die Einführung der HBV-Poly(A)-Sequenzen aus pIG.E1A.NEO stromabwärts von den E1B-Sequenzen von pAT-PCR3 durch Austausch des XbaI-SalI-Fragmentes von pIG.E1A.NEO mit dem XbaI-XhoI-Fragment von pAT.PCR3.
  • pIG.E1A.E1B enthält nt. 459 bis nt. 3510 des Ad5, welche die E1A- und E1B-Proteine kodieren. Die E1B-Sequenzen werden am Splice-Akzeptor bei nt. 3511 begrenzt. In diesem Konstrukt sind keine pIX-Sequenzen vorhanden.
  • Konstruktion von pIG.NEO (5)
  • pIG.NEO wurde durch die Klonierung des HpaI-ScaI-Fragmentes von pIG.E1A.NEO, welches das NEO-Gen unter der Kontrolle des Ad.5-E1B-Promotors enthält, in pBS gespalten mit EcoRV und ScaI, hergestellt.
  • Dieses Konstrukt ist von Nutzen, wenn etablierte Zellen mit E1A.E1B-Konstrukten transfiziert werden und eine NEO-Selektion benötigt wird. Da die NEO-Expression vom E1B-Promotor gesteuert wird, kann davon ausgegangen werden, dass NEO-resistente Zellen E1A coexprimieren, was auch vorteilhaft ist, um ein hohes Expressionsniveau von E1A während der Langzeitkultur der Zellen zu erhalten.
  • Überprüfung der Konstrukte
  • Die Vollständigkeit der Konstrukte pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B wurde durch Restriktionsenzymkartierung untersucht; weiterhin wurden Teile der Konstrukte, die durch PCR-Analyse erhalten wurden, durch Sequenzanalyse bestätigt. In der Nucleotidsequenz wurden keine Änderungen gefunden.
  • Die Konstrukte wurden in primäre BRK-Zellen (Baby-Rat-Kidney-Zellen) transfiziert und daraufhin getestet, ob sie die Fähigkeit besitzen, diese Zellen zu immortalisieren (pIG.E1A.NEO) oder vollständig zu transformieren (pAd5.XhoIC, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B).
  • Nieren von 6 Tage alten WAG-Rij-Ratten wurden entnommen, homogenisiert und trypsiniert. Subkonfluente Schalen (Durchmesser 5 cm) der BRK-Zellkulturen wurden transfiziert mit 1 oder 5 μg von pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B, pIG.E1A.E1B.X, pAd5XhoIC oder mit pIG.E1A.NEO zusammen mit PDC26 (Van der Elsen et al., 1983), welches das Ad5.E1B-Gen unter der Kontrolle des SV40-Early-Promotors enthält. Drei Wochen nach der Transfektion, wenn Fokusse sichtbar waren, wurden die Schalen fixiert, einer Giemsa-Färbung unterzogen und die Fokusse gezählt.
  • Eine Übersicht der erzeugten adenoviralen Verpackungskonstrukte und ihrer Fähigkeit BRK-Zellen zu transformieren wird in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konstrukte pIG.E1A.E1B und pIG.E1A.E1B.X fähig sind, BRK-Zellen in dosisabhängiger Form zu transformieren. Die Effizienz der Transformation ist für beide Konstrukte ähnlich und ist vergleichbar zu der, die für das Konstrukt gefunden wurde, welches verwendet wurde, um die 911-Zellen herzustellen, nämlich pAd5.XhoIC.
  • Wie erwartet, war pIG.E1A.NEO kaum fähig BRK-Zellen zu immortalisieren. Die Cotransfektion eines E1B-exprimierenden Konstruktes (PDC26) resultierte jedoch in einer signifikanten Erhöhung der Zahl der Transformanten (18 gegenüber 1), was zeigt, dass das durch pIG.E1A.NEO kodierte E1A funktionell ist.
  • Wir schließen deshalb, dass die neu erzeugten Verpackungskonstrukte zur Herstellung neuer Verpackungslinien für Adenoviren geeignet sind.
  • Herstellung von Zelllinien mit neuen Verpackungskonstrukten – Zelllinien und Zellkultur
  • Humane A549-Bronchialkarzinomzellen (Shapiro et al., 1978), humane embryonale Retinoblasten (HER), Ad5-E1-transformierte, humane embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen) (293; Graham et al., 1977) und Ad5-tranformierte HER-Zellen (911; Fallaux et al., 1996) und PER-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika in einer 5% CO2 Atmosphäre bei 37°C, gezüchtet. Zellkulturmedien, Reagenzien und Seren wurden bei Gibco Laboratories (Grand Island, NY) erworben. Plastikwaren für die Zellkultur wurden von Greiner (Nürtingen, Deutschland) und Corning (Corning, NY) erworben.
  • Viren und Virustechniken
  • Die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, IG.Ad.MLP.nls.lacZ, IG.Ad.MLP.luc, IG.Ad.MPL.TK und IG.Ad.CMV.TK wird detailliert in der Patentanmeldung EP 0707071 beschrieben.
  • Der rekombinante adenovirale Vektor IG.Ad.MLP.nls.lacZ enthält das lacZ-Gen aus E. coli, welches die β-Galactosidase unter der Kontrolle des Ad2-Major-Late-Promotors (MLP) enthält. IG.Ad.MLP.luc enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen reguliert durch den Ad2-MLP. Die adenoviralen Vektoren IG.Ad.MLP.TK und IG.Ad.CMV.TK enthalten das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen) des Herpes-Simplex-Virus unter der Kontrolle des Ad2-MLP beziehungsweise des Zytomegalie-Virus-Enhancers/Promotors (CMV-Enhancer/Promotor).
  • Transfektionen
  • Alle Transfektionen wurden mit durch Calcium-Phosphat-Präzipitation präzipitierter DNA (Graham und Van der Eb, 1973), durch Anwendung des GIBCO Calcium Phosphate Transfection System (GIBCO BRL Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA) gemäß dem Versuchsprotokoll des Herstellers, durchgeführt.
  • Westernblot
  • Subkonfluente Zellkulturen von exponentiell wachsenden 293-, 911- und Ad5-E1-transformierten A549- und PER-Zellen wurden mit PBS gewaschen und in Fos-RIPA-Puffer (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 01% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1% NA-DOC, 0,5 mM Phenyl-methyl-sulphonyl-fluorid (PMSF), 0,5 mM Trypsininhibitor, 50 mM NaF und 1 mM Natriumvanadat) abgeschabt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Lysate durch Zentrifugation geklärt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Proteinbestimmungskit von Biorad gemessen und 25 μg des zellulären Gesamtproteins wurden auf ein 12,5% SDS-PAA-Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose transferiert (1 h bei 300 mA). Vorgefärbte Standardproben (Sigma, USA) wurden parallel mitlaufen gelassen. Die Filter wurden mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA) in TBST (10 mM Tris, pH 8, 15 mM NaCl und 0,05% Tween-20) für 1 Stunde geblockt. Die Primärantikörper waren der murine monoklonale Anti-Ad5-E1B-55-kD-Antikörper A1C6 (Zantema et al., unveröffentlicht) und der monoklonale Anti-Ad5-E1B-221-kD-Antikörper C1G11 aus der Ratte (Zantema et al., 1985). Der Zweitantikörper war ein mit Meerrettichperoxidase markierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Promega). Signale wurden durch verstärkte Chemolumineszenz visualisiert (Amersham Corp, UK).
  • Southernblot-Analysen
  • Hochmolekulare DNA wurde isoliert und 10 μg wurden vollständig gespalten und auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt. Ein Southernblot-Transfer auf eine Hybond N+-Membran (Amersham, UK) wurde mit 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl Transferlösung (Church und Gilbert, 1984) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde mit einem 2463-nt. SspI-HindIII-Fragment aus pAd5.SalB (Bernards et al., 1983) durchgeführt. Dieses Fragment besteht aus dem 342–2805 bp-Abschnitt von Ad5. Das Fragment wurde mit α-32P-dCTP durch Anwendung von Zufallshexanucleotidprimern und der Klenow-DNA-Polymerase radioaktiv markiert. Die Southernblots wurden auf einem Kodak XAR-5 Film bei –80°C exponiert und auf einen Phospho-Imager-Schirm, welcher mittels der Molecular Dynamics Software von B&L-Systems analysiert wurde.
  • A549
  • Ad5-E1-transformierte A549 humane Bronchialkarzinomzelllinien wurden durch die Transfektion mit pIG.E1A.NEO und die Selektion auf G418-Resistenz erzeugt. Einunddreißig G418-resistente Klone wurden etabliert. Die Cotransfektion von pIG.E1A.E1B mit pIG.NEO ergab sieben G418-resistente Zelllinien.
  • PER
  • Ad5-E1-transformierte, humane embryonale Retinazellen (HER-Zellen) wurden durch die Transfektion von primären HER-Zellen mit dem Plasmid pIG.E1A.E1B erzeugt. Transformierte Zelllinien wurden aus gut abgegrenzten Fokussen etabliert. Wir waren in der Lage sieben klonale Zelllinien zu etablieren, welche wir als PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 und PER.C9 bezeichneten.
  • Einer dieser PER-Klone, nämlich PER.C6, wurde bei der ECACC unter der Nummer 96022940 hinterlegt.
  • Expression der Ad5-E1A- und E1B-Gene in transformierten A549- und PER-Zellen
  • Die Expression der Ad5-E1A- und der 55-kD- und 21-kD-E1B-Proteine in den etablierten A549- und PER-Zellen wurde mittels Westernblot untersucht, wobei monoklonale Antikörper (mAb) verwendet wurden. Der mAb M73 erkennt die E1A-Produkte, während die mAb AIC6 und C1G11 gegen das 55-kD- beziehungsweise das 21-kD-E1B-Protein gerichtet sind.
  • Die Antikörper erkannten keine Proteine in Extrakten von den parentalen A549- oder den primären HER-Zellen (Daten nicht gezeigt). Keiner der A549-Klone, die durch Cotransfektion von pIG.NEO und pIG.E1A.E1B erzeugt wurden, exprimierte nachweisbare Mengen von E1A- oder E1B-Proteinen (nicht gezeigt). Einige der A549-Klone, die durch Transfektion mit pIG.E1A.NEO erzeugt wurden, exprimierten die Ad5-E1A-Proteine (7). Die Mengen waren aber viel geringer als die, welche in Proteinlysaten von 293-Zellen nachgewiesen wurden. Die E1A-Mengen im Fließgleichgewicht, welche in Proteinextrakten von PER-Zellen nachgewiesen wurden, waren viel größer als die, welche in Extrakten von aus A549-Zellen abgeleiteten Zellen nachgewiesen wurden. Alle PER-Zelllinien exprimierten ähnliche Mengen von E1A-Proteinen (7). Die Expression der E1B-Proteine, insbesondere im Fall von E1B-55kD, war variabler. Verglichen mit 911- und 293-Zellen, exprimierte die Mehrzahl der PER-Klone große Mengen von E1B-55kD und 21kD. Die E1B-21kD-Menge im Fließgleichgewicht war bei PER.C3 am größten. Keiner der PER-Klone büßte die Expression der Ad5-E1-Gene bei fortgesetzter Passage der Zellen ein (nicht gezeigt). Wir fanden heraus, dass das Niveau der E1-Expression in PER-Zellen über mindestens 100 Verdopplungen der Population stabil blieb. Wir beschlossen, die PER-Klone detaillierter zu charakterisieren.
  • Southern-Analyse der PER-Klone
  • Um die Anordnung der Ad5-E1 kodierenden Sequenzen in den PER-Klonen zu untersuchen, führten wir Southern-Analysen durch. Zelluläre DNA wurde aus allen PER-Klonen und aus 293- und 911-Zellen extrahiert. Die DNA wurde mit HindIII gespalten, welches einmal in der Ad5-E1-Region spaltet. Southern-Hybridisierung auf mit HindIII gespaltener DNA, durch Anwendung einer radioaktiv markierten Ad5-E1-spezifischen Sonde, offenbarte das Vorliegen von mehreren integrierten Kopien von pIG.E1A.E1B im Genom der PER-Klone. Die 8 zeigt das Verteilungsmuster der E1-Sequenzen in der hochmolekularen DNA der verschiedenen PER-Zelllinien. Die Kopien konzentrieren sich in einer einzelnen Bande, was nahe legt, dass sie als Tandem-Repeats integriert sind. Im Fall von PER.C3, C5, C6 und C9 fanden wir zusätzliche hybridisierende Banden von geringem Molekulargewicht, welche das Vorliegen von verkürzten Kopien von pIG.E1A.E1B zeigen. Die Zahl der Kopien wurde durch Anwendung eines Phospho-Imager bestimmt. Wir schätzten, dass PER.C1, C3, C4, C5, C6, C8 und C9 jeweils 2, 88, 5, 4, 5, 5, beziehungsweise 3 Kopien der Ad5-E1 kodierenden Region enthalten und das 911- und 293-Zellen 1 beziehungsweise 4 Kopien der Ad5-E1-Sequenzen enthalten.
  • Transfektionseffizienz
  • Rekombinante Adenovektoren werden durch Cotransfektion von Adapter-Plasmiden und dem großen ClaI-Fragment von Ad5 in 293-Zellen erzeugt (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ). Die DNA des rekombinanten Virus wird durch homologe Rekombination zwischen den homologen viralen Sequenzen, welche in dem Plasmid und der DNA des Adenovirus vorliegen, gebildet. Die Effizienz dieser Methode, so wie die von alternativen Strategien, hängt in hohem Maße von der Transfizierbarkeit der Helferzellen ab. Deshalb haben wir die Transfektionseffizienzen einiger PER-Klone mit 911-Zellen, durch Anwendung des die β-Galaktosidase kodierenden lacZ-Gens aus E. coli als Reporter, verglichen (9).
  • Produktion von rekombinanten Adenoviren
  • Ausbeuten von rekombinanten Adenoviren, welche nach Inokulation von 293-911-, PER.C3-, PER.C5-, und PER.C6-Zellen mit verschiedenen adenoviralen Vektoren erhalten wurden, werden in Tabelle II gezeigt.
  • Die Ergebnisse legen nahe, dass die Ausbeuten, welche mit PER-Zellen erhalten werden, wenigstens genauso groß wie jene sind, die mit den existierenden Zelllinien erhalten wurden.
  • Zudem waren die Ausbeuten des neuen adenoviralen Vektors IG.Ad.MLPI.TK mit allen untersuchten Zelllinien ähnlich oder größer, als die Ausbeuten, die mit anderen viralen Vektoren erhalten wurden.
  • Erzeugung von neuen adenoviralen Vektoren (10).
  • Die verwendeten adenoviralen Vektoren (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ) weisen eine Deletion der E1-Sequenzen von 459 bis nt. 3328 auf.
  • Da das Konstrukt pIG.E1A.E1B die Ad5-Sequenzen 459 bis nt. 3510 enthält, gibt es eine Sequenzüberlappung von 183 nt. zwischen den E1B-Sequenzen im Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B und rekombinanten Adenoviren, wie zum Beispiel IG.Ad.MLP.TK. Die überlappenden Sequenzen wurden aus den neuen adenoviralen Vektoren deletiert. Zusätzlich wurden nicht-kodierende Sequenzen, welche aus lacZ abgeleitet sind und in den ursprünglichen Konstrukten vorhanden sind, ebenfalls deletiert. Dies wurde durch Amplifikation der SV40-Poly(A)-Sequenzen aus pMLP.TK mittels PCR durch Verwendung der Primer SV40-1 (führt eine BamHI-Stelle ein) und SV40-2 (führt eine BglII-Stelle ein) erreicht (siehe 10). Zusätzlich wurden Ad5-Sequenzen, welche in diesem Konstrukt vorhanden sind, von nt. 2496 (Ad5, führt eine BglII-Stelle ein) bis zu nt. 2779 (Ad5-2) amplifiziert. Beide PCR-Fragmente wurden mit BglII gespalten und ligiert. Das Ligierungsprodukt wurde mittels PCR durch Verwendung der Primer SV40-1 und Ad5-2 amplifiziert. Das gewonnene PCR-Produkt wurde mit BamHI und AfIII gespalten und in pMLP.TK, welches vorher mit den gleichen Enzymen gespalten wurde, ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pMLPI.TK, enthält eine Deletion in den adenoviralen E1-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 3510.
  • Verpackungssystem
  • Die Kombination des neuen Verpackungskonstruktes pIG.E1A.E1B und des rekombinanten Adenovirus pMLPI.TK, welche keine Sequenzüberlappung aufweisen, werden in 11 dargestellt. In dieser Figur wird auch die ursprüngliche Situation, in der die Sequenzüberlappung angezeigt wird, dargestellt.
  • Die Abwesenheit von überlappenden Sequenzen zwischen pIG.E1A.E1B und pMLPI.TK (11a) schließt die Möglichkeit einer homologen Rekombination zwischen Verpackungskonstrukt und rekombinantem Virus aus und ist deshalb eine wesentliche Verbesserung für die Produktion von rekombinanten Adenoviren im Vergleich zur ursprünglichen Situation.
  • In 11b ist die Situation für pIG.E1A.NEO und IG.Ad.MLPI.TK dargestellt. Von pIG.E1A.NEO ist zu erwarten, dass es, wenn es in etablierte Zelllinien transfiziert wird, ausreichend ist, um die Vermehrung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren zu ermöglichen. Diese Kombination hat keine Sequenzüberlappung, was die Erzeugung von RCA durch homologe Rekombination verhindert. Zusätzlich erlaubt dieses praktische Verpackungssystem die Vermehrung von rekombinanten Adenoviren, bei welchen nur die E1A-Sequenzen, aber nicht die E1B-Sequenzen deletiert sind. Rekombinante Adenoviren, die E1B in der Abwesenheit von E1A exprimieren, sind attraktiv, da das E1B-Protein, insbesondere E1B-19kD, fähig ist, infizierte humane Zelle vor der Lyse durch Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) zu bewahren (Gooding et al., 1991).
  • Erzeugung rekombinanter, von pMLPI.TK abgeleiteter Adenoviren.
  • Rekombinante Adenoviren wurden durch Cotransfektion von 293-Zellen mit durch SalI linearisierter pMLPI.TK-DNA und mit ClaI linearisierter Ad5-wt-DNA erzeugt. Das Verfahren ist schematisch in 12 dargestellt. Entwurf einer Strategie zur Erzeugung von Verpackungssystemen für minimale adenovirale Vektoren Namenskonvention für die verwendeten Plasmide:
    p Plasmid
    I ITR (adenoviraler Inverted Terminal Repeat)
    C Zytomegalie-Virus-Enhancer/Promotor-Kombination
    L Leuchtkäfer-Luciferase kodierende Sequenz
    hac, haw potentielle Haarnadel-Struktur, welche nach Spaltung mit der Restriktionsnuclease Asp718, sowohl in der korrekten als auch in der umgekehrten Orientierung gebildet werden kann (Figur 15).
  • Zum Beispiel: pICLhaw ist ein Plasmid, welches den adenoviralen ITR, gefolgt vom CMV-regulierten Luciferase-Gen und der Asp718-Haarnadel in der umgekehrten (nicht funktionellen) Orientierung enthält.
  • 1.1 Veranschaulichung der Fähigkeit einer synthetischen DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Haarnadelstruktur zu bilden, als Primer für die Synthese des Gegenstranges zur Erzeugung von doppelsträngigen DNA-Molekülen in Zellen, welche adenovirale Gene enthalten und exprimieren, zu dienen.
  • Die Plasmide pICLhac, pICLhaw, pICLI und pICL wurden durch Anwendung von Standardverfahren erzeugt. Die schematische Darstellung dieser Plasmide wird in den 16–19 gezeigt.
  • Das Plasmid pICL ist aus den folgenden Plasmiden abgeleitet:
    nt. 1–457 pMLP10 (Levrero et al., 1991)
    nt. 458–1218 pCMVβ (Clontech, EMBL Bank Nr. U02451)
    nt. 1219–3016 pMLP.luc (IntroGene, unveröffentlicht)
    nt. 3017–5620 pBLCAT5 (Stein und Whelan, 1989)
  • Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
    Das tet-Gen des Plasmids pMLP10 wurde durch Deletion des BamHI-SalI-Fragmentes inaktiviert, um pMLP10ΔSB zu erzeugen. Unter der Verwendung des Primersatzes PCR/MLP1 und PCR/MLP3 wurde ein 210 bp Fragment, welches den Ad5-ITR enthält, flankiert durch eine synthetische SalI-Restriktionsschnittstelle durch Verwendung einer pMLP10-DNA als Matrize amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Enzymen EcoRI und SgrAI gespalten, um ein 196 bp Fragment zu erzeugen.
  • Das Plasmid pMLP10ΔSB wurde mit EcoRI und SgrAI gespalten, um den ITR zu entfernen. Dieses Fragment wurde durch das mit EcoRI und SgrAI behandelte PCR-Fragment ersetzt, um pMLP/SAL zu erzeugen. Das Plasmid pCMV-Luc wurde mit PvulI vollständig gespalten und rezirkularisiert, um das von SV40 abgeleitete Polyadenylierungssignal und Ad5-Sequenzen, mit Ausnahme des linken Terminus von Ad5, zu entfernen. Im resultierenden Plasmid pCMV-lucΔAd, wurde der Ad5-ITR durch den durch die Sal-Stelle flankierten ITR aus dem Plasmid pMLP/SAL durch Austausch der XmnI-SaclI-Fragmente ersetzt. Das resultierende Plasmid war pCMV-lucΔAd/SAL, woraus der linke Terminus von Ad5 und das CMV-regulierte Luciferasegen als ein SalI-SmaI-Fragment isoliert und in das mit SalI und HpaI gespaltene Plasmid pBLCATS eingefügt wurden, um das Plasmid pICL zu bilden. Das Plasmid pICL ist in 19 dargestellt. Seine Sequenz ist in 20 dargestellt. Das Plasmid pICL enthält folgende Bestandteile
    nt. 1–457 Linker Terminus von Ad5 (Sequenz 1–457 des humanen Adenovirus Typ 5)
    nt. 458–969 Humaner Zytomegalie-Virus-Enhancer und Immediate-Early-Promotor (Boshart et al., 1985) (aus dem Plasmid pCMVβ, Clontech, Palo Alto, USA)
    nt. 970–1204 19S-Exon des SV40 und verkürztes 16/19S-Intron (aus dem Plasmid pCMVβ)
    nt. 1218–2987 Leuchtkäfer-Luciferase-Gen (aus pMLP.luc)
    nt. 3018–3131 Tandem-Polyadenylierungssignal aus dem späten Transkript von SV40 (abgeleitet aus dem Plasmid pBLCAT5)
    nt. 3132–5620 pUC12-Rückgrat (abgeleitet aus dem Plasmid pBLCAT5)
    nt. 4337–5191 β-Lactamase-Gen (Amp-Resistenz-Gen, umgekehrte Orientierung)
  • Das Plasmid pICLhac und pICLhaw
  • Die Plasmide pICLhac und pICLhaw wurden aus dem Plasmid pICL durch Spaltung des letzteren Plasmids mit dem Restriktionsenzym Asp718 abgeleitet. Das linearisierte Plasmid wurde mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um die 5'-Phosphatgruppen zu entfernen. Die teilweise komplementären synthetischen einzelsträngigen Oligonucleotide Hp/asp1 und Hp/asp2 wurden durch Basenpaarung aneinander gebunden und an ihren 5'-Enden durch Anwendung von T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert.
  • Die phosphorylierten doppelsträngigen Oligomere wurden mit dem dephosphorylierten pICL-Fragment gemischt und ligiert. Klone, welche eine einzelne Kopie des synthetischen Oligonucleotides, eingefügt in das Plasmid, enthielten, wurden isoliert und durch Anwendung von Restriktionsenzymspaltungen charakterisiert. Das Einfügen des Oligonucleotides in die Asp718-Stelle wird an einer Verbindungsstelle wieder eine Asp718-Erkennungsstelle erzeugen, wohingegen an der anderen Verbindungsstelle die Erkennungsstelle zerstört werden wird. Die Orientierung und die Vollständigkeit des eingefügten Oligonucleotids wurde in ausgewählten Klonen durch Sequenzanalyse überprüft. Ein Klon, welcher das Oligonucleotid in der korrekten Orientierung (mit der Asp718-Stelle nahe der 3205-EcoRI-Stelle) enthielt, wurde als pICLhac bezeichnet. Ein Klon mit dem Oligonucleotid in umgekehrter Orientierung (mit der Asp718-Stelle nahe dem aus SV40 abgeleiteten Poly-Signal) wurde als pICLhaw bezeichnet. Die Plasmide pICLhac und pICLhaw sind in den 16 und 17 dargestellt.
  • Das Plasmid pICLI wurde aus dem Plasmid pICL durch Einfügen des SalI-SgrAI-Fragmentes aus pICL, welches den Ad5-ITR enthält, in die Asp718-Stelle von pICL erzeugt. Das 194 bp SalI-SgrAI-Fragment wurde aus pICL isoliert und die kohesiven Enden wurden durch Anwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus E. coli und dNTP's zu glatten Enden umgewandelt. Die kohesiven Enden von Asp718 wurden durch Behandlung mit Mungbean-Nuclease zu glatten Enden umgewandelt. Durch Ligierung wurden Klone erzeugt, die den ITR in der Asp718-Stelle des Plasmids pICL enthalten. Ein Klon, welcher das ITR-Fragment in der richtigen Orientierung enthielt, wurde als pICLI bezeichnet (18).
  • Erzeugung des Adenovirus Ad-CMV-hcTK. Der rekombinante Adenovirus wurde entsprechen dem Verfahren, welches in der Patentanmeldung EP 0707071 beschrieben ist, konstruiert. Zwei Komponenten werden benötigt, um einen rekombinanten Adenovirus zu erzeugen. Als erstes ein Adapter-Plasmid, welches den linken Terminus des Adenovirusgenoms, der den ITR und das Verpackungssignal enthält, eine Expressionskassette mit dem interessierenden Gen und einen Teil des Adenovirusgenoms, welcher zur homologen Rekombination verwendet werden kann, enthält. Zusätzlich wird Adenovirus-DNA für die Rekombination mit dem vorstehend genannten Adapter-Plasmid benötigt. Im Fall von Ad-CMV-hcTK wurde das Plasmid PCMV.TK als Grundlage verwendet. Dieses Plasmid enthält nt. 1–455 des Genoms von Adenovirus Typ 5, nt. 456–1204 abgeleitet aus pCMVβ (Clontech, das PstI-StuI-Fragment, welches den CMV-Enhancer-Promotor und das 16S/19S-Intron des Simian-Virus 40 enthält), das Thymidinkinase-Gen des Herpes-Simplex-Virus (beschrieben in der Patentanmeldung EP 0707071 ), das von SV40 abgeleitete Polyadenylierungssignal (nt. 2533–2668 der SV40-Sequenz), gefolgt von dem BglII-ScaI-Fragment von Ad5 (nt. 3328–6092 der Ad5-Sequenz). Diese Fragmente liegen in einem von pMLP10 abgeleiteten Rückgrat (Levrero et al., 1991). Um das Plasmid pAD-CMVhc-TK herzustellen, wurde das Plasmid pCMV.TK mit ClaI gespalten (die einmal vorkommende ClaI-Stelle liegt genau stromaufwärts des offenen Leserasters von TK) und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Um eine Haarnadel-Struktur zu erzeugen, wurden die synthetischen Oligonucleotide HP/cla2 und HP/cla2 durch Basenpaarung aneinander gebunden und an ihren 5'OH-Gruppen mit T4-Polynucleotidkinase und ATP phosphoryliert. Das doppelsträgige Oligonucleotid wurde mit dem linearisierten Vektorfragment ligiert und verwendet, um den E. coli-Stamm "Sure" zu transformieren. Das Einfügen des Oligonucleotids in die ClaI-Stelle wird die ClaI-Erkennungsstellen zerstören. Das Oligonucleotid enthält eine neue ClaI-Stelle in der Nähe eines seiner Termini. In ausgewählten Klonen, wurde die Orientierung und die Vollständigkeit des eingefügten Oligonucleotids durch Sequenz-Analyse überprüft. Ein Klon, welcher das Oligonucleotid in der richtigen Orientierung enthielt (die ClaI-Stelle auf der Seite des ITR), wurde als pAd-CMV-hcTK bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit durch ClaI gespaltener DNA des Wildtyp-Adenovirus Typ 5 in 911-Zellen cotransfiziert. Ein rekombinanter Adenovirus, in welchem die CMV-hcTK-Expressionskassette die E1-Sequenzen ersetzt, wurde isoliert und durch Anwendung von Standardverfahren vermehrt.
  • Um zu untersuchen, ob die Haarnadel-Struktur als Primer für die Synthese des Gegenstranges auf dem verdrängten Strang, nach Beginn der Replikation am ITR, verwendet werden kann, wurde das Plasmid pICLhac in 911-Zellen (mit der adenoviralen E1-Region transformierte, humane embryonale Retinoblasten) eingeführt. Das Plasmid pICLhaw dient als eine Kontrolle, die das Oligonucleotidpaar HP/asp 1 und 2 in der umgekehrten Orientierung enthält, ist aber im Weiteren vollständig identisch mit dem Plasmid pICLhac. In diese Untersuchungen wurden auch die Plasmide pICLI und pICL eingeschlossen. Im Plasmid pICLI wird die Haarnadel-Struktur durch einen adenoviralen ITR ersetzt. Das Plasmid pICL enthält weder eine Haarnadel-Struktur noch eine ITR-Sequenz. Diese Plasmide dienen als Kontrollen, um die Effizienz der Replikation durch Wirkung der terminalen Haarnadel-Struktur zu bestimmen. Um die viralen Produkte, außer den E1-Proteinen (diese werden von den 911-Zellen produziert), welche für die DNA-Replikation benötigt werden, bereitzustellen, werden die Kulturen nach der Transfektion mit dem Virus IG.Ad.MLPI.TK infiziert. Mehrere Parameter werden untersucht, um die korrekte Replikation der transfizierten DNA-Moleküle zu zeigen. Erstens wird DNA, welche aus Zellkulturen extrahiert wurde, die mit den vorgenannten Plasmiden transfiziert und mit dem IG.Ad.MLPI.TK-Virus infiziert wurden, mittels Southernblot auf die Anwesenheit der erwarteten Replikationsintermediate, sowie die Anwesenheit duplizierter Genome, untersucht. Weiterhin wird Virus aus den transfizierten und mit IG.Ad.MLPI.TK infizierten Zellpopulationen isoliert, der in der Lage ist, ein Luciferase-Markergen in für Luciferase negative Zellen zu transferieren und zu exprimieren.
  • Plasmid-DNA der Plasmide pICLhac, pICLhaw, pICLI und pICL wurden mit der Restriktionsendonuclease SalI gespalten und mit Mungbean-Nuclease behandelt, um den 4 Nucleotide langen einzelsträngigen Überhang des resultierenden DNA- Fragments zu entfernen. In dieser Weise wird ein natürlicher adenoviraler 5'ITR-Terminus auf dem DNA-Fragment erzeugt. Anschließend wurden sowohl pICLhacals auch pICLhaw-Plasmide mit der Restriktionsendonuclease Asp718 gespalten, um einen Terminus zu schaffen, der fähig ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden. Die gespaltenen Plasmide werden durch Anwendung des standardmäßigen Calcium-Phosphat-Copräzipitationsverfahrens in 911-Zellen eingeführt. Für jedes Plasmid vier Zellkulturschalen. Während der Transfektion werden für jedes Plasmid zwei der Kulturen mit dem IG.Ad.MLPI.TK-Virus infiziert, wobei 5 infektiöse IG.Ad.MLPI.TK-Viruspartikel pro Zelle verwendet werden. Zwanzig Stunden nach der Transfektion und vierzig Stunden nach der Transfektion werden eine mit Ad.tk-Virus infizierte und eine nicht-infizierte Kultur verwendet, um niedermolekulare DNA durch Anwendung des von Hirt entwickelten Verfahrens zu isolieren. Proben der isolierten DNA werden für eine Southern-Analyse verwendet. Nach Spaltung der Proben mit der Restriktionsendonuclease EcoRI wird durch Verwendung des Luciferase-Gens als Sonde nur in den Proben von mit Adenoviren infizierten und mit dem Plasmid pICLhac transfizierten Zellen ein hybridisierendes Fragment von annähernd 2,6 kb nachgewiesen. Die Größe dieses Fragments stimmt mit der erwarteten Duplizierung des Luciferase-Markergens überein. Dies stützt die Schlussfolgerung, dass die eingefügte Haarnadel-Struktur in der Lage ist, als Primer für die Synthese des Gegenstranges zu dienen. Das hybridisierende Fragment fehlt, wenn der IG.Ad.MLPI.TK Virus weggelassen wird oder wenn das Haarnadel-Struktur-Oligonucleotid in der umgekehrten Orientierung eingefügt worden ist. Die Restriktionsendonuclease DpnI erkennt die Tetranucleotid-Sequenz 5'-GATC-3', spaltet aber nur methylierte DNA (das heißt, nur (Plasmid-)DNA, die aus E. coli gewonnen und dort vermehrt worden ist, nicht DNA, die in Säugerzellen repliziert worden ist). Die Restriktionsendonuclease Mbol erkennt die gleichen Sequenzen, sie spaltet aber nur unmehtylierte DNA (das heißt, in Säugerzellen vermehrte DNA). DNA-Proben, welche von den transfizierten Zellen isoliert wurden, werden mit Mbol und DpnI umgesetzt und durch Southernblot analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur in den Zellen, welche mit den pICLhac- oder den pICLI-Plasmiden transfiziert wurden, große, DpnI-resistente Fragmente vorhanden sind, die in mit Mbol behandelten Proben fehlen. Diese Daten zeigen, dass nur nach Transfektion der Plasmide pICLI und pICLhac Replikation und Duplikation der Fragmente vorkommen.
  • Diese Daten zeigen, dass in mit Adenoviren infizierten Zellen lineare DNA-Fragmente, welche an einem Terminus einen aus Adenoviren abgeleiteten Inverted Terminal Repeat (ITR) aufweisen und am anderen Terminus eine Nucleotidsequenz, die sich mit anderen Sequenzen auf dem gleichen Strang durch Basenpaarung verbinden kann, wenn sie in einzelsträgiger Form vorliegen, dabei eine Haarnadel-Struktur erzeugen und zu Strukturen umgewandelt werden, welche Sequenzen mit einem Inverted Terminal Repeat an beiden Enden aufweisen. Das resultierende DNA-Molekül wird mittels des selben Mechanismus replizieren wie Wildtyp-Adenovirusgenome.
  • 1.2 Veranschaulichung, dass die DNA-Moleküle, welche folgendes enthalten: ein Luciferase-Markergen, eine einzelne Kopie des ITR, ein Verpackungssignal und eine synthetische DNA-Sequenz, welche in der Lage ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden, ausreichend sind, um DNA-Moleküle zu bilden, die in Virionen verpackt werden können.
  • Um zu zeigen, dass die obengenannten DNA-Moleküle, welche zwei Kopien des CMV-luc-Markergens enthalten, in Virionen verpackt werden können, wird Virus von den zwei verbleibenden Kulturen über drei Zyklen eines Einfrier-Auftau-Aufbruchverfahrens geerntet und verwendet, um murine Fibroblasten zu infizieren. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion werden die infizierten Zellen auf Luciferaseaktivität untersucht. Um auszuschließen, dass die Luciferaseaktivität durch den Transfer von freier DNA, anstatt durch die Viruspartikel, bewirkt worden ist, werden die Virusbestände mit DNasel behandelt, um DNA-Kontaminationen zu entfernen. Weiterhin werden, als zusätzliche Kontrolle, Proben der Virusbestände für 60 Minuten bei 56°C gehalten. Die Hitzebehandlung wird die kontaminierende DNA nicht beeinflussen, wird aber die Viren inaktivieren. Signifikante Luciferaseaktivität wird in den Zellen nur nach Infektion mit den Virusbeständen, die aus mit IG.Ad.MLPI.TK infizierten und mit pICLhac- oder pICLI-Plasmiden transfizierten Zellen gewonnen wurden, gefunden. Weder in den nicht-infizierten Zellen, noch in den infizierten Zellen, die mit pICLhaw oder pICL transfiziert wurden, konnte signifikante Luciferaseaktivität gezeigt werden. Hitzeinaktivierung, aber nicht Behandlung mit DNasel, beseitigt die Luciferaseexpression vollständig, was zeigt, dass Adenoviruspartikel und nicht freie (kontaminierende) DNA-Fragmente für den Transfer des Luciferase-Reportergens verantwortlich sind.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass diese kleinen viralen Genome in Adenoviruspartikel verpackt werden können und legen nahe, dass der ITR und das Verpackungssignal ausreichend für die Verpackung linearer DNA-Fragmente in Adenoviruspartikel sind. Diese Adenoviruspartikel können für effizienten Gentransfer verwendet werden. Wenn sie in Zellen eingeführt werden, die wenigstens einen Teil der Adenovirusgene (nämlich E1, E2, E4 und L und VA) enthalten und exprimieren, haben rekombinante DNA-Moleküle bestehend wenigstens aus einem ITR, wenigstens aus einem Teil des Verpackungssignals sowie aus einer synthetischen DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden, die intrinsische Fähigkeit, selbstständig rekombinante Genome zu bilden, welche in Virionen verpackt werden können. Solche Genome und Vektor-Systeme können für den Gentransfer verwendet werden.
  • 1.3 Veranschaulichung, dass DNA-Moleküle, welche folgendes enthalten: die Nucleotide 3510–35953 (nämlich 9,7–100 Kartierungseinheiten) des Genoms des Adenovirus Typ 5 (somit fehlen ihnen die die E1-Proteine kodierenden Regionen, der rechtsseitige ITR und die Verpackungssequenzen) und eine terminale DNA-Sequenz, welche zu einem Teil des gleichen Stranges des DNA-Moleküls, außer dem ITR, komplementär ist, wenn dieser in einer einzelsträngigen Form vorliegt und diese als Ergebnis in der Lage ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden, in 911-Zellen replizieren können.
  • Um ein replizierendes DNA-Molekül zu entwickeln, welches die Adenovirusprodukte zur Verfügung stellen kann, die benötigt werden, um es dem vorangehend genannten ICLhac-Vektor-Genom und ähnlichen minimalen Adenovektoren zu erlauben, durch Helferzellen in Adenoviurspartikel verpackt zu werden, wurde der adenovirale Ad-CMV-hcTK-Vektor entwickelt. Zwischen der CMV-Enhancer/Promotor-Region und dem Thymidinkinase-Gen wird das durch Basenpaarung verbundene Oligonucleotidpaar HP/cla 1 und 2 eingefügt. Der Vektor Ad-CMV-hcTK kann in 911-Zellen mittels Standardverfahren vermehrt und produziert werden. Dieser Vektor wir ausschließlich als Quelle für DNA zur Verwendung für Transfektionen gezüchtet und vermehrt. DNA des Adenovirus Ad-CMV-hcTK wird aus Viruspartikeln isoliert, die durch Verwendung von CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation nach Standardverfahren aufgereinigt wurden. Die Virus-DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease ClaI gespalten. Die gespaltene DNA wird auf einem 0,7% Agarosegel nach der Größe aufgetrennt und das große Fragment wird isoliert und für weitere Experimente verwendet. Kulturen von 911-Zellen werden mit dem großen ClaI-Fragment der Ad-CMV-hc-TK-DNA durch Anwendung des standardmäßigen Calcium-Phosphat-Copräzipitations-Verfahrens transfiziert. In vielem ähnlich den vorherigen Experimenten mit dem Plasmid pICLhac, wird AD-CMV-hc am rechtsseitigen ITR beginnend replizieren. Sobald der 1-Strang verdrängt ist, kann eine Haarnadel-Struktur am linksseitigen Terminus des Fragments gebildet werden. Dies ermöglicht es der DNA-Polymerase, die Kette zur rechten Seite zu verlängern. Der Vorgang wird fortlaufen, bis der verdrängte Strang vollständig zu seiner doppelsträngigen Form umgewandelt ist. Schließlich wird der rechtsseitige ITR wieder gebildet und an dieser Stelle wird die normale Initiation und Elongation der adenoviralen Replikation erfolgen. Beachte, dass die Polymerase durch die Haarnadel-Struktur lesen wird, wobei das Molekül dupliziert wird. Das Ausgangs-DNA-Molekül von 33250 bp, das auf einer Seite eine adenovirale ITR-Sequenz aufwies und auf der anderen Seite eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden, ist jetzt in einer Weise dupliziert worden, so dass beide Enden eine ITR-Sequenz enthalten. Das resultierende DNA-Molekül wird aus einer palindromischen Struktur von annähernd 66500 bp bestehen.
  • Diese Struktur kann in niedermolekularer DNA, welche aus den transfizierten Zellen extrahiert worden ist, durch Anwendung einer Southern-Analyse nachgewiesen werden. Der palindromische Charakter des DNA-Fragments kann durch Spaltung der niedermolekularen DNA mit geeigneten Restriktionsendonucleasen und Durchführung eines Southernblot mit dem HSV-TK-Gen als Sonde, gezeigt werden. Dieses Molekül kann sich selbst in den transfizierten Zellen durch Wirkung der adenoviralen Genprodukte, welche in den Zellen vorhanden sind, replizieren. Teilweise werden die Adenovirusgene von Matrizen, die in das Genom der Zielzellen integriert sind (nämlich die E1-Genprodukte), exprimiert. Die anderen Gene liegen im replizierenden DNA-Fragment selbst. Beachte jedoch, dass dieses lineare DNA-Fragment nicht in Virionen verpackt werden kann. Es fehlen ihm nicht nur alle DNA-Sequenzen, die für die Verpackung benötigt werden, sondern auch seine Größe ist viel zu groß, um verpackt zu werden.
  • 1.4 Veranschaulichung, dass DNA-Moleküle, welche folgendes enthalten: die Nucleotide 3503–35953 (nämlich 9,7–100 Kartierungseinheiten) des Genoms des Adenovirus Typ 5 (somit fehlen ihnen die die E1-Proteine kodierenden Regionen, der rechtsseitige ITR und die Verpackungssequenzen) und eine terminate DNA-Sequenz, welche zu einem Teil des gleichen Stranges des DNA-Moleküls, außer dem ITR, komplementär ist und als Ergebnis in der Lage ist, eine Haarnadel-Struktur zu bilden, in 911-Zellen replizieren können und zur Verpackung der aus pICLI und pICLhac abgeleiteten DNA-Fragmente benötigte Helferfunktionen zur Verfügung stellen können.
  • Die nächste Folge von Experimenten zielt darauf ab zu zeigen, dass die DNA-Moleküle, beschrieben im Abschnitt 1.3, dazu verwendet werden könnten, die minimalen Adenovektoren, beschrieben in den Abschnitten 1.1 und 1.2, zu verpacken.
  • In den Experimenten wird das große Fragment, welches nach der Spaltung von Ad-CMV-hcTK-DNA mit der Endonuclease ClaI isoliert wurde, in 911-Zellen eingeführt (übereinstimmend mit den Experimenten, beschrieben in Abschnitt 1.3). Damit zusammen wird das Plasmid pICLhac, behandelt mit der Endonuclease SalI, Mungbean-Nuclease und Endonuclease Asp718 oder als Kontrolle das vergleichbar behandelte Plasmid PICLhaw eingeführt. Nach 48 Stunden wird Virus durch Anwendung eines Einfrier-Auftau-Aufbruchverfahrens aus der transfizierten Zellpopulation isoliert. Die Viruspräparation wird mit DNasel behandelt, um kontaminierende freie DNA zu entfernen. Der Virus wird anschließend verwendet, um Rat2-Fibroblasten zu infizieren. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion werden die Zellen auf Luciferaseaktivität untersucht. Nur in den Zellen, die mit Virus infiziert wurden, der von Zellen isoliert wurde, die mit dem pICLhac-Plasmid transfiziert wurden und nicht mit dem pICLhaw-Plasmid, kann signifikante Luciferaseaktivität gezeigt werden. Hitzeinaktivierung des Virus vor der Infektion hebt die Luciferaseaktivität vollständig auf, was zeigt, dass das Luciferase-Gen durch ein virales Partikel transferiert wird. Infektion von 911-Zellen mit dem Virusbestand ergab keine Zell-pathologischen Effekte, was zeigt, dass das pICLhac ohne infektiöse Helferviren, welche auf 911-Zellen vermehrt werden können, produziert wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass das vorgeschlagene Verfahren verwendet werden kann, um Bestände von minimalen adenoviralen Vektoren zu produzieren, welche vollständig frei von infektiösen Helferviren sind, welche fähig sind, selbstständig auf adenoviral transformierten humanen Zellen oder nicht-adenoviral transformierten humanen Zellen zu replizieren.
  • Neben dem System, welches in dieser Anmeldung beschrieben wird, wurde ein anderer Ansatz zur Erzeugung von minimalen adenoviralen Vektoren in WO 94/12649 offenbart. Das Verfahren, welches in WO 94/12649 beschrieben wird, nutzt die Funktion des Proteins IX zur Verpackung von minimalen adenoviralen Vektoren (Pseudoadenovirale Vektoren (PAV) in der Terminologie von WO 94/12649). PAVs werden durch Klonierung eines Expressionsplasmids mit dem interessierenden Gen zwischen dem linksseitigen (die für die Verpackung benötigten Sequenzen einschließend) und dem rechtsseitigen adenoviralen ITR produziert. Der PAV wird in der Anwesenheit eines Helfervirus vermehrt. Die Verpackung des PAV ist im Vergleich zum Helfervirus bevorzugt, weil der Helfervirus teilweise verpackungsdefizient ist. (Entweder durch die Wirkung von Mutationen im Verpackungssignal oder durch die Wirkung seiner Größe (Virusgenome größer als 37,5 kb werden ineffizient verpackt)). Zusätzlich schlagen die Autoren vor, dass in der Abwesenheit des Protein IX Gens der PAV bevorzugt verpackt werden wird. Es scheint jedoch keiner der beiden Mechanismen ausreichend restriktiv zu sein, um nur das Verpacken von PAVs/minimalen Vektoren zuzulassen. Die vorgeschlagenen Mutationen im Verpackungssignal reduzieren das Verpacken, bieten aber keine absolute Blockade, da die gleiche Verpackungsaktivität benötigt wird, um den Helfervirus zu vermehren. Auch wird weder eine Steigerung der Größe des Helfervirus, noch eine Mutation des Protein IX Gens sicher stellen, dass ausschließlich PAV verpackt wird. Somit ist es unwahrscheinlich, dass das in WO 94/12649 beschriebene Verfahren nützlich für die Produktion von helferfreien Beständen von minimalen adenoviralen Vektoren/PAVs sein wird.
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  • Tabelle I
  • Primer, die zur PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten verwendet werden, die zur rzeugung von Konstrukten verwendet werden, die in dieser Patentanmeldung beschrieben werden.
  • Figure 00520001
  • PCR-Primergruppen, die verwendet werden sollen, um die SalI und Asp718-Stellen zu erzeugen, die neben die ITR-Sequenzen gestellt sind.
  • Figure 00520002
  • Ein synthetisches Oligonucleotidpaar, das verwendet wird, um eine synthetische Haarnadel zu erzeugen, erzeugt eine Asp718-Stelle an einem der Enden erneut, wenn sie an der Asp718-Stelle eingefügt wird:
  • Figure 00530001
  • Ein synthetisches Oligonucleotidpaar, das verwendet wird, um eine synthetische Haarnadel zu erzeugen, enthält die ClaI-Erkennungsstelle, die zur Haarnadelbildung verwendet werden soll.
  • Figure 00530002
  • Figure 00540001

Claims (38)

  1. Verpackungssystem, umfassend: ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das auf einem Adenovirus beruht oder davon abgeleitet ist, wobei das Nucleinsäuremolekül ein funktionelles Enkapsidierungssignal und wenigstens einen funktionellen Inverted Terminal Repeat oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon aufweist; und eine Verpackungszelle, wobei die rekombinante Nucleinsäure und die Verpackungszelle zusammen alle Elemente umfassen, die notwendig sind, um ein rekombinantes adenovirales Partikel, das das rekombinante Nucleinsäuremolekül umfasst, zu erzeugen, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül keine überlappenden Sequenzen aufweist, die eine homologe Rekombination, die zu einem replikationskompetenten Virus in der Verpackungszelle führt, ermöglichen würden.
  2. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül in linearer Form vorliegt und einen Inverted Terminal Repeat an beiden Termini oder in deren Nähe umfasst.
  3. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül in linearer und im Wesentlichen einzelsträngiger Form vorliegt und am 3'-Terminus eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einem stromaufwärts gelegenen Teil desselben Strangs des Nucleinsäuremoleküls ist, wobei die Sequenz in der Lage ist, eine Basenpaarung mit diesem Teil in ei ner solchen Weise einzugehen, dass sie als Startstelle für eine Nucleinsäure-Polymerase dienen kann.
  4. Verpackungssystem, das ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül umfasst, welches aus der Einwirkung einer Nucleinsäure-Polymerase auf ein Nucleinsäuremolekül resultiert, welches von einem Verpackungssystem gemäß Anspruch 3 umfasst ist.
  5. Verpackungssystem gemäß Anspruch 4, wobei das Nucleinsäuremolekül einen Inverted Terminal Repeat an beiden Termini aufweist.
  6. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle ein Nucleinsäuremolekül mit einer Wirtsbereichmutation umfasst.
  7. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das eine mutierte E2-Region umfasst, die wenigstens eines seiner Produkte temperaturempfindlich macht.
  8. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das eine E2-Region unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors umfasst.
  9. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle mit einer oder mehreren Verpackungsnucleinsäuremolekülen versehen ist, die der Zelle die Fähigkeit verleihen, adenovirale Genprodukte, die wenigstens von der E1A-Region abgeleitet sind, zu exprimieren.
  10. Verpackungssystem gemäß Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren Verpackungsnucleinsäuremoleküle der Zelle weiterhin die Fähigkeit verleihen, adenovirale Genprodukte, die von der E2A-Region abgeleitet sind, zu exprimieren.
  11. Verpackungssystem gemäß Anspruch 10, wobei sich das rekombinante Nucleinsäuremolekül, das die E2A-Region codiert, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors befindet.
  12. Verpackungssystem gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül, das die E2A-Region codiert, so mutiert ist, dass wenigstens eines seiner Produkte temperaturempfindlich ist.
  13. Verpackungssystem gemäß Anspruch 9, wobei die Verpackungszelle nicht die Fähigkeit hat, E1B-Produkte zu exprimieren.
  14. Verpackungssystem gemäß Anspruch 13, wobei die genetische Information, die E1B-Produkte codiert, nicht vorhanden ist.
  15. Verpackungssystem gemäß Anspruch 9, wobei die Verpackungszelle weiterhin die Region umfasst, die für E1B codiert.
  16. Verpackungssystem gemäß Anspruch 9, wobei die Verpackungszelle weiterhin ein Marker-Gen umfasst.
  17. Verpackungssystem gemäß Anspruch 16, wobei sich das Marker-Gen unter der Kontrolle des E1B-induzierbaren Promotors befindet.
  18. Verpackungszelle, die ein DNA-Fragment eines Adenovirus beherbergt, wobei das Fragment aus den Nucleotiden 80–5788 des Genoms des humanen Adenovirus 5 besteht.
  19. Verpackungszelle, die ein DNA-Fragment eines Adenovirus beherbergt, wobei das Fragment aus den Nucleotiden 459–1713 des Genoms des humanen Adenovirus 5 besteht.
  20. Verpackungszelle, die ein DNA-Fragment eines Adenovirus beherbergt, wobei das Fragment aus den Nucleotiden 459–3510 des Genoms des humanen Adenovirus 5 besteht.
  21. Verpackungssystem gemäß Anspruch 9, wobei die Verpackungszelle nicht die Fähigkeit hat, das 21-kD-E1B-Produkt zu exprimieren.
  22. Verpackungssystem gemäß Anspruch 21, wobei sich die genetische Information, die das 21-kD-E1B-Produkt codiert, nicht in der Verpackungszelle befindet.
  23. Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 9–17, 21 oder 22, wobei die Verpackungszelle eine diploide Zeile ist.
  24. Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 9–17 oder 21–23, wobei die Verpackungszelle nichthumanen Ursprungs ist.
  25. Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 9–17 oder 21–24, wobei die Verpackungszelle von einem Affen stammt.
  26. Zelle gemäß Anspruch 18, die bei der ECACC unter der Nr. 95062101 hinterlegt ist.
  27. Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 1–17 oder 21–25, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül ist.
  28. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül wenigstens eine Deletion der Nucleotide 459-3510 der E1-Region aufweist.
  29. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül wenigstens eine Deletion der Nucleotide 459–1713 der E1-Region aufweist.
  30. Charge von rekombinanten Adenoviruspartikeln, die durch ein Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 1–17, 21–25 oder 27–29 erzeugt wurden, wobei die Charge frei von replikationskompetenten Partikeln ist.
  31. Zelle, die ein Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 1–17, 21–25 oder 27–29 umfasst.
  32. Verpackungssystem gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionelle E2A- und E2B-Gene oder funktionelle Fragmente oder Derivate davon unter der Kontrolle eines E1A-unabhängigen Promotors umfasst.
  33. Verpackungssystem gemäß Anspruch 25, wobei die Verpackungszelle eine wirtsbereichmutierte E2A-Region eines Adenovirus umfasst.
  34. Zeile gemäß Anspruch 20, die bei der ECACC unter der Nr. 96022940 hinterlegt ist.
  35. Verpackungszelle zum Verpacken von Nucleinsäuremolekülen, die von Adenovirus abgeleitet sind, wobei die Verpackungszelle mit einem oder mehreren Verpackungsnucleinsäuremolekülen versehen ist, wobei die Nucleinsäuremoleküle der Zeile die Fähigkeit verleihen, adenovirale Genprodukte zu exprimieren, die wenigstens sowohl von der E1A- als auch von der E2A-Region abgeleitet sind, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül, das die E2A-Region codiert, so mutiert ist, dass wenigstens eines seiner Produkte temperaturempfindlich ist.
  36. Verpackungssystem gemäß Anspruch 1, wobei das Genom der Verpackungszelle Nucleinsäure umfasst, die adenovirale E1A- und E1B-Proteine codiert, aber keine pIX-Sequenzen aufweist.
  37. Verpackungssystem gemäß Anspruch 36, wobei die Verpackungszelle eine PER.C6-Zelle ist, die bei der ECACC unter der Nr. 96022940 hinterlegt ist.
  38. Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie in ihrem Genom Nucleinsäure umfasst, die adenovirale E1A- und E1B-Proteine codiert, aber keine pIX-Sequenzen aufweist.
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