ES2215222T3 - Modificacion genetica de celulas cepa de repoblacion hematopoyeticas de primates. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA MODIFICACION GENETICA DE CELULAS CEPAS HEMATOPOIETICAS PLURIPOTENTES DE PRIMATES (P PHSC) POR TRANSDUCCION DE P - PHSC CON UN VIRUS ASOCIADO A LOS ADENOVIRUS (AAV) RECOMBINADO. EL GENOMA DEL AAV RECOMBINADO INCLUYE UNA SECUENCIA DE ADN FLANQUEADA POR LAS REPETICIONES TERMINALES INVERTIDAS (ITR) DEL AAV. LA SECUENCIA DE ADN SUELE INCLUIR NORMALMENTE UNA SECUENCIAS DE REGULACION QUE SON FUNCIONALES EN CELULAS HEMATOPOIETICAS Y UNA SECUENCIA REGULADA POR ESTAS SECUENCIAS DE REGULACION, CODIFICANDO UNA PROTEINA O UN ARN, Y QUE POSEEN UNA PROPIEDAD TERAPEUTICA CUANDO SE INTRODUCEN EN CELULAS HEMATOPOIETICAS. EL GEN DE GLUCOCEREBROSIDASA LISOSOMIAL HUMANO, UN GEN DE GLOBINA QUE PROCEDE DE LA BATERIA DE GENES DE BE - GLOBINA HUMANOS, CODIFICANDO UNA SECUENCIA DE ADN UN ARN O UNA PROTEINA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ANTIVIRAL, EL GEN DE AL 1 - ANTITRIPSINO Y EL GEN I HUMANO DE RESISTENCIA MULTIMEDICAMENTOSA (MDRI), CONSTITUYEN UNOS EJEMPLOS PREFERIDOS DE SECUENCIAS DE ADN. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA TERAPIA GENICA EFICAZ CON CELULAS CEPAS HEMATOPOIETICAS PLURIPOTENTES DE PRIMATES, Y EN PARTICULAR, DE SERES HUMANOS.

Description

Modificación genética de células cepa de repoblación hematopoyéticas de primates.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la terapia génica y más concretamente se refiere a moléculas de ADN derivadas de virus adeno-asociados (AAV) para la modificación genética de células madre hemopoyéticas de primate.

Antecedentes de la invención

La modificación genética de las células madre hemopoyéticas pluripotentes de primates (P-PHSC) ha constituido un objetivo esquivo durante muchos años. Los vectores de retrovirus han sido utilizados en el pasado con un éxito limitado [1]. Aunque la tecnología del vector retroviral aún está mejorando, el progreso en el aumento de la transducción de P-PHSC es lento. Esto se debe al hecho de que la solución no es sencilla y de que las P-PHSC no pueden ser identificadas mediante un rápido método de cultivo in vitro [1]. Aunque el cultivo de células progenitoras hemopoyéticas es posible, los niveles de transducción in vitro de estas células no reflejan la transducción de P-PHSC que in vivo pueden crecer para dar una reconstitución a largo plazo en linajes multi-hemopoyéticos [1,2,3]. Aunque los análisis de cultivos in vitro a largo plazo, tales como, v.g., el denominado análisis LTC-IC, han sido considerados durante mucho tiempo análisis relevantes para P-PHSC, ahora se acepta generalmente que sólo una sub-población muy minoritaria de las células identificadas en los análisis de cultivos in vitro a largo plazo son P-PHSC. Por lo tanto, la modificación genética de las células cultivadas in vitro a largo plazo, incluso la modificación genética muy eficaz, no proporciona información relevante alguna sobre la modificación genética de P-PHSC. Además, aunque se está reuniendo un conocimiento creciente sobre la expresión de los marcadores de la superficie celular de las P-PHSC, las P-PHSC también pueden ser identificadas por su fenotipo. Se sabe que las P-PHSC expresan la molécula CD34 y son negativas para muchos otros marcadores de superficie de las células hemopoyéticas, pero incluso la población de P-OHSC más pura que puede ser caracterizada fenotípicamente en la actualidad contiene solo unas pocas P-PHSC. Debido a esto, la transducción debe ser evaluada mediante estudios in vivo laboriosos y extensos utilizando un marco de transplante de médula ósea en el que las células madre de la médula ósea eran transducidas ex vivo y retro-transplantadas con posterioridad a monos o humanos. La transducción de P-PHSC es verificada por la persistencia a largo plazo de las células hemopoyéticas modificadas genéticamente. En la actualidad el método más eficaz para la transducción de P-PHSC es por medio de vectores retrovirales. Utilizando tales vectores es posible transducir aproximadamente hasta el 0,01-0,1% de las P-PHSC [3,4,5,6,7]. La limitación de la transducción retroviral se debe muy probablemente a una expresión restringida del receptor de retrovirus de P-PHSC combinado con el hecho de que las P-PHSC no están normalmente en el ciclo celular mientras los vectores retrovirales no transducen eficazmente células que no estén en división [8,9,10,11].

Se han ideado numerosos métodos para mejorar la transducción de P-PHSC por vectores retrovirales tales como retrovirus de pseudotipaje utilizando la proteína de la envuelta de VSV (Virus de la Estomatitis Vesicular) o las proteínas de la envuelta de GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus) para dirigir receptores diferentes y posiblemente más abundantemente presentes sobre la membrana celular. Otras estrategias estaban dirigidas a mejorar el número de P-PHSC en ciclo en el transplante. Hasta la fecha no producía una mejora significativa de la transducción de P-PHSC.

En contraste con las P-PHSC, las PHSC murinas son transducidas muy fácilmente por la generación actual de vectores retrovirales. Esta observación realizada en experimentos en los que se utilizan vectores retrovirales muestra que la transferencia génica con éxito en PHSC murinas no es en modo alguno indicativa de una transferencia génica con éxito en P-PHSC. Se puede pensar en numerosas posibles razones diferentes para esta observación. Los autores de la presente invención tienen la hipótesis de que teóricamente no es óptimo utilizar un sistema vector que se ha desarrollado en animales murinos para humanos. Aunque los procedimientos celulares implicados en el ciclo de vida del retrovirus murino se conservan entre mamíferos murinos y primates, es muy posible que la divergencia evolutiva de las especies diera como resultado diferencias estructurales en las proteínas afines que afectan a la eficacia funcional de las proteínas del virus murino en células humanas y así afecten a los procedimientos de transducción. Para evitar estos problemas los autores de la presente invención volvieron a un sistema vector diferente basado en el virus adeno-asociado al virus humano (AAV).

El AAV es un virus humano de la familia de los parvovirus. El genoma de AAV está incluido en una cápsida en forma de una molécula de ADN de hebra sencilla lineal de aproximadamente 5 kb. Tanto la hebra más como la menos son infecciosas y están empaquetadas en viriones [12,13]. La replicación de AAV eficaz no se produce a menos que la célula también sea infectada por adenovirus o herpesvirus. En ausencia del virus coadyuvante, AAV establece una infección latente en la que su genoma es integrado en el ADN cromosómico celular. El genoma de AAV contiene dos grandes marcos de lectura abiertos. La mitad izquierda del genoma codifica proteínas reguladoras denominadas proteínas REP que gobiernan la replicación del ADN de AAV durante una infección lítica. La mitad derecha codifica las proteínas estructurales VP1, VP2 y VP3 que forman juntas la cápsida del virus. La región codificadora de las proteínas está flanqueada por repeticiones terminales invertidas (ITR en sus siglas en inglés) de 145 pb cada una, que parecen contener todas las secuencias que actúan en posición cis requeridas para la replicación del virus, la encapsidación y la integración en el cromosoma huésped [14,15].

En un vector de AAV, el dominio que codifica la proteína completa (\pm4,3 kb) puede ser reemplazado por el gen o los genes de interés, dejando sólo las ITR limítrofes intactas. Tales vectores son empaquetados en viriones suministrando las proteínas de AAV en trans. Esto se puede lograr mediante numerosos métodos diferentes, abarcando uno de ellos una transfección en células infectadas por adenovirus de un plásmido vector que porta una secuencia de interés flanqueada por dos ITR y un plásmido de empaquetamiento que porta los dominios codificadores de la proteína de AAV en trans requerida rep y cap [15,16,17,18,19]. Debido a la estabilidad del virión AAV, la contaminación por adenovirus puede ser aclarada de la preparación de virus mediante inactivación con calor (1 hora, 56ºC). En estudios iniciales, las preparaciones de virus estaban contaminadas con AAV de tipo salvaje, presumiblemente debido a eventos de recombinación entre el vector y el constructo coadyuvante [16,17,18,19]. En la actualidad, se pueden generar provisiones de partida de AAV recombinante libres de AAV de tipo salvaje utilizando constructos de empaquetamiento que no contengan ninguna homología de secuencia con el vector [15].

Numerosas características distinguen los vectores de AAV de los vectores retrovirales clásicos (ver también la tabla 1). El AAV es un ADN virus lo que significa que el gen de interés, dentro de las limitaciones de AAV, puede ser insertado en forma de un clon genómico [20,21]. Algunos genes, muy notablemente el gen de la \beta-globina humana, requieren la presencia de intrones para una expresión eficaz del gen [22]. Los clones genómicos de genes no pueden ser fácilmente incorporados en los vectores retrovirales, ya que estos empalmarán los intrones durante la fase de ARN de su ciclo vital [23].

En células diana humanas, el AAV de tipo salvaje se integra preferentemente en una región discreta (19q13.3-qter) del cromosoma 19 [24,25,26]. Esta actividad podría corresponder con la expresión del gen rep en la célula diana, puesto que se encontró que las proteínas rep grandes se unen al sitio de integración humano in vitro [27]. Los vectores de AAV se integran con una elevada eficacia en el ADN cromosómico del huésped, sin embargo, hasta aquí no comparten la especificidad del sitio de integración de wtAAV [20]. La integración de sitio específico sería de gran importancia puesto que reduce los riesgos de transformación de la célula diana a través de la mutagénesis insercional. El AAV de tipo salvaje no está asociado hasta aquí con la enfermedad en humanos. Se está acumulando la evidencia de que la infección por AAV de una célula, de hecho, forma una barrera extra frente a su transformación maligna (revisado en [28]). En contraste con los vectores retrovirales en los que, debido a la señal de empaquetamiento prolongada, partes de la región gag necesitan estar presentes en el vector, el dominio que codifica la proteína completa de AAV puede ser suprimido y reemplazado por las secuencias de interés evitando así totalmente cualquier problema de inmunogenicidad asociado con la expresión de la proteína viral en células diana transducidas. Una desventaja de los vectores de AAV es que derivan de un virus humano. Así, los pacientes tratados con un vector de AAV podrían quedar expuestos a wtAAV que en presencia de un virus coadyuvante tal como un adenovirus o un virus herpes simplex puede facilitar la replicación del virus y las proteínas de empaquetamiento en posición trans y de ese modo inducir la propagación del virus AAV recombinante al medio. Esta es una característica no compartida por los vectores retrovirales derivados de MuLV actualmente utilizados; los MuLV de tipo salvaje normalmente no causan infecciones en humanos. No obstante, el riesgo de propagación de AAV recombinante al medio no debe ser sobreestimado puesto que requiere la presencia de wtAAV y un virus coadyuvante. Esta es una situación que no se produce frecuentemente. Además, durante el procedimiento de integración de los vectores de AAV, a menudo las ITR experimentan alguna forma de recombinación que conduce a la pérdida de función [15]. Tales pro-virus no pueden ser rescatados y por tanto proporcionan un nivel de seguridad adicional de estos vectores.

Los primeros vectores de AAV fueron elaborados remplazando parte de la región codificadora de AAV o bien con el gen de la Cloramfenicol Acetiltransferasa (CAT) o bien con el de neo^{R} [16,17]. Todos estos vectores conservaban una región codificadora o bien de rep funcional o bien de cap funcional. El virus recombinante era generado mediante transfección simultánea con un plásmido que contenía un genoma de AAV completo. El virus AAV-CAT recombinante confería actividad Cloramfenicol Acetiltransferasa a células 293 [16] mientras el virus neo^{R} recombinante confería resistencia contra G418 a células Human Detroit 6, células KB y células L de ratón [17].

En la actualidad, se elaboran vectores de AAV que están totalmente desprovistos de secuencias codificadoras de la proteína de AAV. Típicamente, el virus se elabora a partir de estos vectores por complementación con un plásmido que porta la región codificadora de la proteína de AAV pero no las secuencias ITR [15].

La tecnología del vector de AAV está en desarrollo para numerosos fines terapéuticos y tejidos diana diferentes. El sistema más desarrollado hasta ahora es quizás la transferencia génica mediada por el vector a células de pulmón [29,30]. Los vectores de AAV que portan el gen neo^{R} o el gen CAT fueron transferidos y expresados eficazmente en células epiteliales de las vías respiratorias [29]. Un vector de AAV que portaba las secuencias 486-4629 del gen Regulador de la conductancia Transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) fusionado a un oligonucleótido sintético que proporcionaba el sitio de inicio de la traducción, era capaz de complementar la Fibrosis quística (CF) in vitro [31]. Además, se informó sobre la transferencia y la expresión génicas estables tras la infección de células de pólipos nasales CF primarias y después liberación in vivo del vector AAV-CFTR a un lóbulo de pulmón de conejo [30]. In vivo, el ADN vector pudo ser detectado en el 50% de los núcleos a los 3 meses de la administración. Aunque la prevalencia del vector disminuía tras este momento puntual todavía \pm5% de los núcleos eran positivos a los seis meses [30]. La presencia del vector se correspondía con la expresión de ARN y la proteína recombinante que eran detectables todavía transcurridos seis meses [30].

La transferencia génica mediada por el vector de AAV en células hemopoyéticas murinas fue demostrada mediante el otorgamiento de resistencia a G418 a unidades formadoras de colonias in vitro murinas (CFU) tras la infección con un vector de AAV recombinante que portaba el gen neo^{R} [32,33]. La presencia del vector en la progenie de CFU-GM (unidades formadoras de colonias-Granulocitos Macrófagos) y BFU-E (unidades formadoras de descarga-Eritrocito) fue verificada por medio de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). La eficacia de la transferencia génica variaba entre el 0,5% y el 15% [33]. También se ha informado sobre la liberación génica eficaz (hasta el 80%) en células progenitoras hemopoyéticas y CD34^{+} humanas con vectores AAV-neo^{R} [34,35,36,37]. Estos estudios demostraron que los vectores de rAAV eran capaces de liberar su ADN en el núcleo de las células progenitoras hemopoyéticas que pueden ser cultivadas in vitro. Aunque la liberación del ADN vector en el núcleo de las células demuestra la presencia de un receptor del virus funcional sobre la superficie de las células diana, la liberación de rAAV en el núcleo de las células no está directamente relacionada con la integración de ese ADN en el genoma de la célula huésped (discutido más tarde y presentado en la tabla 2). El ADN del virus adenoasociado recombinante presente en forma de episoma en las células es conocido por abstenerse de la integración en el genoma de la célula huésped en células de cultivos de tejidos que no están en división [38]. La integración de rAAV en células CD34^{+} y en colonias en desarrollo in vitro (CFU-C) fue demostrada en 1.996 por Fischer-Adams y col. [59]. La transducción estable de P-PHSC no ha sido ilustrada ni sugerida en ninguno de estos documentos de la técnica anterior, sin embargo. Ninguno de los estudios anteriormente mencionados describe la liberación e integración de rAAV para P-PHSC, el único tipo celular hemopoyético relevante para una persistencia a largo plazo de las células transducidas in vivo.

Los autores de la presente invención están desarrollando la transferencia génica rAAV en P-PHSC para el tratamiento de la \beta-talasemia y la anemia falciforme. Ambas enfermedades afectan gravemente la función de los eritrocitos en estos pacientes. Los eritrocitos \beta-talasémicos contienen cadenas de \beta-globina insuficientes mientras en la anemia falciforme se elaboran cadenas de \beta-globina mutantes (para una revisión ver [39]). Ambas enfermedades afectan gravemente la función de los eritrocitos que puede ser aliviada por una expresión del gen de la \gamma-globina persistente en el paciente adulto en cuyo caso se forma hemoglobina fetal [40]. Ambas enfermedades heredadas tienen una naturaleza recesiva lo que indica que una copia intacta funcional del gen de la \beta-globina adulta es suficiente para mejorar el fenotipo.

Las anomalías de la globina fueron descartadas como dianas para los intentos de terapia génica en los primeros días de la investigación de la terapia génica. Esto se debió en gran parte a los patrones de expresión extremadamente complicados de los genes de tipo globina [41]. La síntesis de globina está muy regulada durante el desarrollo y confinada a las células de linaje eritroide. Además, la expresión de las cadenas de tipo \alpha- y \beta-globina está regulada de manera que se mantienen en una proporción 1 a 1 en la célula. Semejante control cuidadoso de la expresión génica no se obtiene fácilmente. Los vectores de expresión que portan el gen de la \beta-globina humana con su promotor y elementos intensificadores locales pueden dirigir la expresión del ARN de la globina específico de eritroides [42]. No obstante, típicamente, los niveles son menores del 1% del ARN de la globina endógena.

Recientemente, se descubrieron secuencias de 50-60 kb aguas arriba del gen de la \beta-globina que dirigen la expresión del gen de la \beta-globina dependiente del número de copias, específico de los tejidos, de alto nivel e independiente de la posición [43]. Esta región, denominada Región de Control del Locus (LCR en sus siglas en inglés), se caracteriza por cuatro fuertes sitios hipersensibles a la ADNasaI específicos de eritroides (HS1-4) [44]. El mapeo fino de las secuencias activas de LCR identificaba cuatro fragmentos de \pm400 pb de longitud que coincidían cada uno con un sitio HS. Walsh y col. incorporaron un gen de la \gamma-globina marcado y el fragmento núcleo de HS2 junto con el gen neo^{R} en un vector de AAV [20]. Las reservas infectadas y seleccionadas con G418 y los clones de las células K562 producían el ARN de la \gamma-globina marcado en un 50-85% en comparación con el nivel normal expresado por un gen de \gamma-globina endógeno [20,45]. Una desventaja de este vector es que el gen de la \gamma-globina y el promotor utilizado en estos estudios son específicos para la expresión en tejido eritroide fetal y por tanto no resultan ideales para su uso como agente terapéutico en humanos adultos. La incorporación de los sitios \beta-LCR 1, 2, 3 y 4 en un vector que contiene el gen de la \beta-globina humana específico de adultos daba como resultado una expresión muy regulada en células MEL (eritroleucemia murina), la mejor línea celular marcadora in vitro para la expresión de eritroides regulada en tejidos adultos [46]. La presente invención describe el uso de este vector y vectores similares en la transducción de
P-PHSC.

El término "partículas infecciosas" se utiliza aquí para hacer referencia a partículas AAV que pueden liberar su ADN empaquetado en el núcleo de las células y replicar en presencia de adenovirus y wtAAV.

El término "partículas transductoras" se utiliza aquí para hacer referencia a partículas de AAV que pueden liberar su ADN empaquetado en el núcleo de células diana en las que el ADN empaquetado es liberado e integrado en el ADN cromosómico de las células diana.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona un procedimiento in vitro de modificación genética de células madre hemopoyéticas pluripotentes de primates (P-PHSC), que comprende introducir una molécula de ácido nucleico basada en un virus adenosasociado (AAV), en particular un AAV recombinante que deriva de AAV humano, en P-PHSC, preferiblemente mediante transducción. El genoma del AAV recombinante comprende una secuencia de ADN flanqueada por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, o análogos funcionales o fragmentos de los mismos. Normal y preferiblemente, pero no necesariamente, dicha secuencia de ADN será una secuencia de ADN no de AAV, en particular una secuencia de ADN terapéutica.

Según una realización preferida de la invención, la secuencia de ADN comprende secuencias reguladoras funcionales en células hemopoyéticas (en particular células madre hemopoyéticas) y, bajo el control de dichas secuencias reguladoras, una secuencia que codifica una proteína o ARN con una propiedad terapéutica cuando se introduce en células hemopoyéticas (madre). Los ejemplos preferidos de la secuencia de ADN comprenden la secuencia codificadora de genes tales como el gen de la glucocerebrosidasa lisosomal humana (E.C.3.2.1.45), un gen de globina de la agrupación de los genes de la \beta-globina humana, una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína con actividad anti-viral, el gen de la \alpha1-antitripsina y el gen I de resistencia a múltiples fármacos humano (MDRI).

En una realización particularmente preferida, la secuencia de ADN comprende el gen de la \beta-globina humana que incluye al menos uno de sus intrones o análogos funcionales del mismo, bajo el control transcripcional de una parte funcional del promotor de la \beta-globina o análogos funcionales del mismo, y que está conectado operablemente a sitios hipersensibles a la ADNasaI específica de eritroides de su Región de Control del Locus (LCR), más concretamente los elementos \beta-LCR HS4, HS3 y HS2 o análogos funcionales del mismo.

La secuencia de ADN también puede comprender un gen marcador seleccionable útil en células madre hemopoyéticas, tales como un gen neo^{R}, bajo el control transcripcional de un promotor de la timidina quinasa (tk) del virus herpes simplex (HSV) o análogos funcionales del mismo o un promotor de una Gran Repetición Terminal (LTR en sus siglas en inglés) \DeltaMo+PyF101.

Las P-PHSC pueden ser obtenidas de médula ósea de primate, sangre de médula o sangre periférica, y preferiblemente de humano. Las P-PHSC pueden ser expuestas in vitro a compuestos estimuladores de la proliferación, tales como interleuquina 3 o un análogo o fragmento funcional de la misma.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que los vectores derivados de virus adeno-asociados transducen eficazmente células madre hemopoyéticas pluripotentes de primate. No se ha informado que los virus adeno-asociados transduzcan células madre hemopoyéticas pluripotentes de primates y no se ha demostrado que los vectores derivados de AAV transduzcan células hemopoyéticas con capacidad repobladora in vivo. Además, es sorprendente que el vector se integre con elevada eficacia en P-PHSC incluso aunque la mayor parte de las P-PHSC no se estén dividiendo activamente en el momento de la infección. Esto resulta sorprendente puesto que se ha establecido que la integración de rAAV en células en división se produce 200 veces más eficazmente en células en división en oposición a las que no están en división [38]. Asimismo, se informó que las células primarias son transducidas mucho menos eficazmente por rAAV que las líneas celulares inmortalizadas [47]. Además, se informó que el orf 6 de la región E4 de adenovirus estimula la transducción mediante AAV recombinante [48]. En un marco de terapia génica no es deseable tener adenovirus funcionalmente activos debido a los problemas de toxicidad causados por el virus directamente o al sistema inmune del paciente. En el Keystone Symposium on Molecular and Cellular Biology, Taos, Nuevo Méjico, 4-10 de Febrero de 1.996, el Profesor A. Nienhuis presentó una publicación que establecía que habían transducido células CD34+ de mono rhesus y con posterioridad habían transplantado autólogamente las células infectadas [49]. El análisis de las células de la sangre periférica que circulaban en la sangre con una reacción en cadena de la polimerasa específica para rAAV reveló que las células que portaban el rAAV sólo se detectaban hasta 7 días después del transplante [49], es decir, las P-PHSC no eran transducidas por rAAV en su experimento. Con todo, la presente invención demuestra que un vector derivado de virus adeno-asociados puede ser utilizado para liberar ADN exógeno eficazmente en células del sistema hemopoyético con una capacidad de repoblación a
largo plazo.

La percepción actual de la integración de AAV en el cromosoma huésped celular es que el complejo de pre-integración es estable en las células. Aunque la integración se produce más eficazmente en las células en división, el complejo de pre-integración es estable en las células que no están en división y se integra cuando se hace que la célula experimente el ciclo celular [38,60]. Las células madre hemopoyéticas derivadas de primate y las células progenitoras comprometidas tras el transplante autólogo en un recipiente irradiado son impulsadas al ciclo para repoblar el sistema hemopoyético destruido. Por esta razón se cree generalmente que las células hemopoyéticas no necesitan ser impulsadas in vitro. Por esta razón los protocolos para transducir células progenitoras hemopoyéticas con rAAV no implican cultivar las células en presencia de factores de crecimiento hemopoyéticos. Aunque este razonamiento es muy plausible con la información actual, los autores de la presente invención idearon experimentos para investigar el efecto del cultivo in vitro de células madre hemopoyéticas y la estimulación in vitro con factores de crecimiento hemo-
poyéticos.

Según se utiliza aquí, el término "vector de AAV recombinante" representa una secuencia de ADN flanqueada en cada extremo por un AAV-ITR o equivalente funcional o parte del mismo. El vector de AAV recombinante puede ser utilizado directamente o puede ser empaquetado en un complejo antes de su uso. Según se utiliza aquí, el término "complejo" se define como una combinación de dos o más componentes físicamente conectados entre sí a través de interacciones hidrófobas, hidrófilas o electrostáticas o enlaces covalentes, por medio de los cuales al menos un componente del complejo es una molécula de AAV recombinante. Otros componentes del complejo pueden comprender, pero no están limitados a, un o una combinación de liposomas, producto precipitado de fosfato de calcio, polilisina, Adenovirus, proteínas de Adenovirus, Rep78, Rep68, cápsidas de AAV o proteínas de cápsidas de AAV VP1, VP2 o VP3. En una realización preferida el complejo consta del vector AAV recombinante y proteínas de la cápsida de AAV. Este complejo puede estar, sin estar limitado, en forma de un virión intacto o una partícula donde el vector AAV recombinante está empaquetado dentro de una cápsida de AAV o análogos funcionales del mismo.

Según se utiliza aquí, el término "análogos funcionales" hace referencia a la misma actividad en clase, pero no en cantidad o grado, es decir, no cuantitativamente.

Cuando el AAV recombinante está empaquetado en partículas de AAV, el tamaño de la secuencia de ADN estará limitado por las restricciones de tamaño para empaquetar en las partículas de AAV que, en el estado actual de la tecnología, es de aproximadamente 5 kb. El fragmento de ADN no contiene preferiblemente secuencias funcionalmente análogas al sitio de resolución terminal de AAV-ITR ya que éste podría interferir en la estabilidad del vector recombinante. La secuencia de ADN puede ser cualquier secuencia con propiedades terapéuticas cuando se introduzca en las células madre hemopoyéticas, pero la secuencia de ADN codifica preferiblemente una o más proteínas o ARN con propiedades terapéuticas cuando son expresados en células hemopoyéticas. Son ejemplos no limitantes de tales secuencias el gen de la \beta-globina humana conectado operablemente a secuencias que actúan en posición cis para la expresión fisiológica específica en eritroides, el gen de la glucocerebrosidasa lisosomal humana (E.C.3.2.1.45), el gen de la \alpha1-antitripsina, una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína con actividad antiviral o el gen I de resistencia a múltiples fármacos (MDRI). Las secuencias de AAV-ITR pueden ser obtenidas a partir de los serotipos 1, 2, 3, 4 ó 5 de AAV. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias de ITR mutantes o recombinantes, que conservan las propiedades esenciales del prototipo AAV-ITR, cuyos ejemplos se describen en Lefebvre y col. [50].

El empaquetamiento de rAAV en viriones de AAV se puede lograr utilizando una variedad de métodos diferentes. Todos los métodos se basan en llevar las proteínas necesarias y el ADN que contiene el rAAV al medio que soporta la replicación y el empaquetamiento de rAAV. Un método cuenta con la transfección de células humanas infectadas con adenovirus 5 con un plásmido que porta el ADN de rAAV junto con un plásmido que contiene casetes de expresión para los genes rep y cap de AAV. Tras el cultivo continuado de las células manipuladas, el rAAV se replica y se empaqueta. Al cabo de tres días las células son cosechadas y los viriones recombinantes acumulados son liberados de las células [15-19]. Una variación del sistema de empaquetamiento descrito antes es el uso de células de empaquetamiento que portan todas o parte de las secuencias relevantes integradas establemente en su genoma (es decir, el vector AAV recombinante, el gen rep, el gen cap, y los dominios codificadores de la proteína relevante del virus coadyuvante). Cuando se utilizan células empaquetadoras solamente parciales las funciones empaquetadoras que se pierden deben ser facilitadas externamente por medio de transfecciones de plásmidos que portan las funciones o la infección del virus. Las funciones del virus coadyuvante son necesarias para un empaquetamiento eficaz del AAV recombinante. Para la mayoría de las aplicaciones el virus coadyuvante está inactivado, o separado físicamente de los viriones de AAV recombinante antes de utilizar los viriones de AAV recombinante para la transducción de células [15,19]. Los vectores de AAV recombinante pueden ser empaquetados añadiendo el ADN de AAV recombinante a extractos de proteínas o mezclas de extractos de proteínas de células que expresaban todas o parte de las proteínas relevantes para la replicación y el empaquetamiento de AAV recombinante. Cuando se utilizan extractos de proteínas de células que expresan sólo alguna de las proteínas relevantes para el empaquetamiento de AAV recombinante, las proteínas que se pierden pueden ser facilitadas externamente en forma purificada.

El gen rep puede derivar de serotipos AAV 1-5, o análogos funcionales de los mismos obtenidos o bien a través de mutaciones no esenciales en los genes rep o bien a través del aislamiento de genes con capacidades similares tales como el homólogo del gen rep AAV-2 del Herpesvirus Humano 6 [58].

El gen cap puede derivar de los serotipos 1-5 de AAV, o análogos funcionales de los mismos obtenidos a través de mutaciones no esenciales en los genes cap. Alternativamente, las secuencias del gen cap pueden ser alteradas por medio de la sustitución o la adición de secuencias que rinden las especificidades de las células diana nuevas o alteradas por el virión producido.

Los viriones de AAV recombinante producidos mediante los métodos descritos antes pueden ser purificados y concentrados utilizando mecanismos de separación biológica, física o química tales como, pero no limitados a, purificación por afinidad con anticuerpos, centrifugación en gradiente de densidad o cromatografía de intercambio iónico. Alternativamente, los viriones producidos pueden ser utilizados en una forma no purificada.

Según se utiliza aquí, las células madre hemopoyéticas pluripotentes de primates (P-PHSC) son definidas funcionalmente como células de primates con la capacidad de formar y mantener un sistema hemopoyético completo, oscilando de células T maduras, células B, macrófagos o eritrocitos a P-PHSC nuevas. Las P-PHSC despliegan su capacidad en primates no manipulados o tras su transplante autólogo. Las fuentes de P-PHSC son la médula ósea, la sangre periférica o sangre de cordón. Las P-PHSC pueden ser recogidas de primates no manipulados o de primates tratados con compuestos tales como, pero no limitados a, fármacos citostáticos o factores de crecimiento hemopoyéticos para activar, reclutar o potenciar de otro modo las P-PHSC.

La transducción de P-PHSC se realiza preferiblemente ex vivo, tras la cosecha de las P-PHSC a partir de una fuente adecuada, y después de la transducción las células transducidas son transplantadas autólogamente. En una realización preferida de la invención, las P-PHSC son cultivadas durante su transducción ex vivo, donde es más preferido que durante este cultivo las P-PHSC sean estimuladas con al menos un factor de crecimiento hemopoyético, tal como v.g., la interleuquina 3. Alternativamente la transducción de P-PHSC se realiza in vivo cuando se han desarrollado métodos adecuados para dirigir el vector AAV recombinante in vivo a P-PHSC.

Breve descripción de las tablas y los dibujos

Tabla 1 Propiedades clave de vectores de virus Adeno-asociados y vectores de retrovirus anfotróficos.

Tabla 2 Caracterización de preparaciones de AAV recombinante útiles para la transducción de PHSC de primate.

Tabla 3 Transducción de PHSC de primate: condiciones de cultivo e infección.

IP = Partículas Infecciosas (tituladas en RCA);

TP = Partículas Transductoras (tituladas en células MEL).

Tabla 4 Transducción de PHSC de primate: Datos hemopoyéticos.

Fig. 1A Vectores de AAV recombinante útiles para la transducción de PHSC de primate.

ITR = Repetición terminal invertida de virus adeno-asociado.

LCR = Secuencias núcleo de sitios hipersensibles 4, 3 y 2 de la región de control del locus de la \beta-globina.

-103 = fragmento promotor del gen de la \beta-globina humana que se extiende -103 aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción.

-265 = fragmento promotor del gen de la \beta-globina humana que se extiende -265 aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción.

\beta-globina = gen de la \beta-globina humana con el intrón 2 modificado (ver texto y ref. 21).

Tkprom = Promotor del gen de la Timidina quinasa de Virus Herpes Simplex (fragmento NarI-BglII de aprox. 500 pb).

NEO = Fragmento BglII-SmaI del transposón Tn5 de E. coli.

pA = Señal de poliadenilación del gen de la Timidina quinasa de Virus Herpes Simplex (fragmento SmaI-NarL de aprox. 500 pb).

\beta* -globina = gen de la \beta-globina humana con 3 mutaciones puntuales en la región 5' no traducida que generan dos sitios para enzimas de restricción (ver fig. 1B).

\DeltaMo+PyF101 = un fragmento de la gran repetición terminal del virus de la Leucemia murina de Moloney en el que el intensificador de Moloney es reemplazado por un intensificador de un virus de polioma mutante que era seleccionado para crecer en células de carcinoma embrionario [2,51,52,53].

Fig. 1B Secuencia de nucleótidos de la región 5' no traducida (UTR) del gen de la \beta-globina humana normal (\beta) y marcada (\beta*).

Fig. 2 Detección de AAV recombinante en células de sangre periférica de mono rhesus. Las células de la sangre fueron recogidas como se describe en el texto. Las células mononucleares de sangre periférica (WBC) fueron separadas de los granulocitos (Gran) y se llevó a cabo una PCR anidada específica para neo sobre el ADN de ambos tipos de células. El ADN de la PCR anidada fue analizado sobre geles de agarosa y comparado con muestras de control positivas y negativas. La sensibilidad de la PCR anidada era tal que aproximadamente un vector de rAAV podía ser detectado en un fondo de 10^{5} células negativas. (+) indica la presencia de una banda específica de neo y (-) la ausencia de una banda específica de neo en el gel de agarosa.

Fig. 3 Representación gráfica de datos de la PCR específica de neo directa y anidada de monos BB94 y A94 (Fig. 3a) y monos 9128 en 9170 (Fig. 3b). Los datos de los dos últimos monos mostrados en la figura 2 también están incluidos en la figura 3. Como aclaración, los resultados de la PCR negativa no fueron incluidos en los gráficos. Los círculos cerrados (PBMC) y los cuadrados cerrados (Granulocitos) indican los momentos puntuales tras el transplante en los cuales se detectó el vector. Las flechas de la figura 3b indican los momentos puntuales en los que se administró docetaxel (Taxótero).

Fig. 4 Detección de secuencias específicas de neo en células hemopoyéticas de BB94 rh a los 16 meses del transplante. BM (médula ósea), PBMC (células mononucleares de sangre periférica), Gran (granulocitos).

Fig. 5 Detección de secuencias de globina específicas del vector en células de sangre periférica de mono rhesus (muestras de 2 meses (A94) y 6 meses (BB94) después del transplante). Con esta PCR los dos vectores IG-CFT e IG-CFT* son discriminados puesto que el tamaño de los fragmentos de IG-CFT* es de aproximadamente 150 pb más largo que el fragmento específico para IG-CFT.

Ejemplo 1 Ligadura de vectores de AAV recombinante que contienen el gen de la \beta-globina humana y /o el gen neo^{R}

Con el fin de determinar si el AAV recombinante podía transducir P-PHSC era necesario generar los vectores apropiados. Los autores de la presente invención generaron tres vectores de AAV recombinante diferentes, que se representan esquemáticamente en la figura 1A. La ligadura del vector IG-CFT que contenía un gen de la \beta-globina humana junto con secuencias de la región de control del locus de la \beta-globina y el gen neo^{R} se describen en [21]. I G-CFT* difiere de IG-IFT en el tamaño del promotor de la \beta-globina humana y en la presencia de tres mutaciones puntuales en la región 5' no traducida (UTR) del gen de la \beta-globina humana. En IG-CFT* el promotor que dirige la expresión de la \beta-globina se extiende 265 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción en lugar de los 103 pb de IG-CFT. En IG-CFT* las tres mutaciones puntuales de la UTR 5' del gen de la \beta-globina humana creaban dos nuevos sitios de restricción, uno para XbaI y uno para HindIII, ver también la figura 1B.

IG-\DeltaMoNeo (representado en la fig. 1A) contiene el esqueleto de rAAV (fragmento XbaI) de pSub201 [15], el fragmento del promotor NheI-Smai de la LTR \DeltaMo+PyF101 [53], el fragmento BglII-SmaI del gen neo^{R} derivado de Tn^{5} seguido de la señal de poli-adenilación SmaI-NarI del gen de la Timidina Kinasa (TK) del Virus Herpes Simplex (HSV) [54]. Los elementos fueron conectados entre sí utilizando el poliligador de pBluescript SK^{+} (Stratagene).

Ejemplo 2 Producción de AAV recombinante de IG-CFT, IG-CFT* e IG-\DeltaMoNeo

La línea celular 293 [55], que es una línea celular de riñón embriónico humano transformada con ADN Ad5, la línea celular A549, que es una línea celular de carcinoma bronquial humano, y la línea celular C88 [56], que es una línea celular de eritroleucemia murina (MEL), fueron mantenidas en DMEM (GIBCO-BRL) conteniendo Suero de Ternera Fetal (FCS) al 10%, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. Se produjo AAV recombinante transfectando un plásmido empaquetador de rAAV y un plásmido vector en células 293 tolerantes confluentes en aproximadamente un 90%. Las células se volvieron tolerantes para la replicación de AAV transfectándolas con un plásmido susceptible de expresar todos los genes tempranos relevantes de adenovirus pero no los genes tardíos o infectándolas con adenovirus ts 149 con una multiplicidad de infección de 20. El plásmido empaquetador era o bien pAAV/Ad [15] o bien pIM45, que contiene las secuencias 146 a 4493 de wtAAV2 en el poliligador de pBluescript. La proporción de ADN del vector plasmídico con respecto al ADN del plásmido empaquetador era de 1:10 para ajustarse al hecho de que el vector de AAV recombinante tras la expresión a partir del plásmido replica mientras el plásmido empaquetador no replica. Para las provisiones de partida de virus brutas las células fueron cosechadas en su propio medio de cultivo después de dos o tres días y sometidas a tres ciclos de congelación-descongelación. El último se realizó congelando y descongelando intermitentemente en nitrógeno líquido y en un baño de agua a 37ºC. Los desechos celulares fueron sedimentados con posterioridad (10 minutos, 200 g) y el sobrenadante fue incubado a 56ºC durante 1 hora para inactivar el adenovirus residual. Las soluciones de partida de AAV recombinante de elevado título concentradas fueron preparadas cosechando las células en su propio medio de cultivo, y lavando en PBS (max. 10^{7} células/ml). El virus fue liberado de las células mediante 3 ciclos de congelación-descongelación y/o 30 pulsos de sonicación de 1 segundo en hielo para evitar el calentamiento. El desecho celular fue centrifugado y el sobrenadante se llevó a una densidad de 1,4 añadiendo CsCl sólido. Tras la centrifugación (50.000 rpm, 20ºC, utilizando un rotor vti TI65.1 en una ultracentrífuga Beckman) las fracciones fueron recogidas y el rAAV fue determinado. Las fracciones que contenían rAAV fueron reunidas y adicionalmente concentradas en un concentrador centricon (Amicon) según las especificaciones del fabricante. Tras la concentración, el medio que contenía el virus se cambió mediante dos lavados sucesivos en el concentrador centricon utilizando el medio de cultivo Optimem (GIBCO-BRL).

Ejemplo 3 Caracterización de las preparaciones de rAAV

Para determinar el efecto de los diferentes métodos de preparación de virus y las diferentes etapas de tratamiento sobre la calidad de los diferentes lotes de rAAV los autores de la presente invención los caracterizaron en cuanto a 5 parámetros: 1) la capacidad para liberar el ADN deseado al núcleo de la célula diana por medio de un análisis del centro de replicación (RCA) descrito más abajo, 2) la capacidad para transducir establemente células y expresar el gen neo^{R} por medio de una dilución limitante de células MEL seguido de selección con G418, 3) el título de AAV de tipo salvaje de los lotes mediante RCA sin añadir wtAAV, 4) la cantidad de adenovirus competente para la replicación en cada preparación, y 5) la concentración de CsCl en las preparaciones de rAAV que eran purificadas utilizando gradientes de CsCl (ver la Tabla 2).

Análisis del centro de replicación

El análisis del centro de replicación (RCA) saca ventaja del hecho de que en una infección lítica de AAV se producen hasta 10^{6} genomas de AAV dentro de una célula. Esta cantidad de ADN es suficiente para la detección radiactiva de las células infectadas. Para completar esto, se sembraron células 293 en una placa de 96 pocillos de fondo plano de manera que casi alcanzaran la confluencia al día siguiente. Para una titulación del AAV recombinante las células fueron infectadas con diluciones de solución de partida de virus recombinante, adenovirus ts 149 (M.O.I. 20) y wtAAV-2 (M.O.I. 2). Para una titulación del AAV de tipo salvaje las células fueron infectadas con diluciones de solución de partida de virus recombinante y adenovirus ts 149 (M.O.I.20). Las células fueron incubadas con posterioridad a 39ºC. Al día siguiente al cabo de 24 horas el medio fue reemplazado por PBS enfriado con hielo que contenía EDTA 5 mM. Después de 5 a 20 minutos sobre hielo se realizó una única suspensión celular mediante pipeteo riguroso. Las células fueron diluidas en 5 ml de PBS y aspiradas en círculos de filtro de N^{+} hybond (tamaño de poro 0,22 \muM) de 3,6 cm de diámetro. Los filtros fueron incubados durante 5 minutos en solución de desnaturalización (NaOH 0,4 M; NaCl 0,6 M) y 5 minutos en tampón de renaturalización (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 1 M, pH 7). Los filtros fueron lavados y almacenados en 5xSSPE hasta la hibridación. Los filtros fueron hibridados con una sonda específica para AAV recombinante para la determinación del título de AAV recombinante e hibridados con una sonda específica para AAV de tipo salvaje para la determinación del título de AAV de tipo salvaje.

Transducción de células MEL

Se sembraron 1,5 x 10^{5} células MEL en 2 ml de medio de cultivo por pocillo (placas de 24 pocillos, Falcon) y se añadió la dilución apropiada de virus rAAV. Las células se recogieron al día siguiente y se volvieron a sembrar en 30 ml de medio de cultivo en un matraz de 75 cm^{2} (Falcon). Al cabo de tres días el medio se remplazó por medio de selección centrifugando las células (200 g, rt) y resuspendiendo las células en medio de nueva aportación conteniendo 1 mg/ml (peso seco) de G418 (Gibco). El medio fue reemplazado cada tres o cuatro días. Al cabo de catorce días se puntuaron los cultivos. Cuando las células habían crecido hasta la confluencia, los cultivos eran puntuados como positivos puesto que la dilución de virus específico contenía rAAV susceptible de transducir establemente las células MEL. Las diluciones de virus específicos se puntuaban como negativas cuando al cabo de catorce días no se había alcanzado la confluencia.

El adenovirus fue determinado mediante diluciones seriadas de la solución de partida de virus AAV sobre células A459 (carcinoma bronquial humano). Las diluciones fueron puntuadas como positivas cuando el efecto citopático era visible al cabo de 6 días. Las soluciones de partida de Adenovirus 5 de tipo salvaje con un título conocido fueron utilizadas como controles positivos. Las concentraciones de CsCl en las preparaciones de AAV fueron determinadas mediante fotometría a la llama.

En la Tabla 2 se da un resumen de la caracterización. La concentración de partículas infecciosas (IP), es decir, la capacidad para liberar ADN de rAAV en el núcleo de las células diana determinada en RCA variaba considerablemente entre los diferentes lotes. Asimismo la concentración de partículas transductoras (TP) y la cantidad de contaminación de AAV de tipo salvaje variaban considerablemente. Tres lotes tenían una razón de IP con respecto a TP de 10^{4}, el lote bruto de 248 tenía una razón muy inferior de 200.

Ejemplo 4 Transducción y transplante autólogo de médula ósea de mono rhesus Cuidado del animal y transplante

Los animales utilizados para el transplante eran monos rhesus de 3-5 kg (Macaca mulatta), criados en el Biomedical Primate Research Centre (BPRC), Rijswijk, Holanda. Tres semanas antes del transplante los animales fueron transferidos a una unidad de flujo laminar y descontaminados selectivamente en el tracto digestivo mediante tratamiento con metronidazol (40 mg/kg/día) durante 5 días, seguido de la administración oral diaria de ciprofloxacina (6,5 mg/kg/día), polimixina B (10 mg/kg/día) y nistatina (40 kU/mono/día). A94 y BB94 recibieron una administración de ivermectina 200 \mug/kg de tratamiento anti-helmíntico aproximadamente dos semanas antes del transplante. Los monos fueron mantenidos en enfermerías con barreras y tratamiento antimicrobiano hasta que el recuento de leucocitos excedía de un valor de 1 x 10^{9}/litro. El día antes del transplante los monos recibían una irradiación con rayos X a todo el cuerpo de 5 Gy. Para este fin, los animales fueron colocados en una jaula de policarbonato cilíndrica que giraba 6 rpm sobre su eje vertical durante la irradiación desde dos haces opuestos (parámetros físicos: 300 kV, 7 mA, velocidad de la dosis 0,26 Gy/minuto, distancia media del foco a la piel 0,80 m). Los injertos de médula ósea fueron infundidos en una vena periférica a un volumen de 7,5 ml de NaCl al 0,9%. Los cuidados de mantenimiento después del transplante incluían transfusiones sanguíneas de trombocitos irradiados con 15 Gray cuando los recuentos de trombocitos eran inferiores a 40 x 10^{9}/litro, fluido subcutáneo tras indicación y transfusiones de eritrocitos cuando los niveles de hematocrito caían por debajo de 0,2 l/l. A los monos 9128 se les administraba diariamente Baytrill s.c. durante 2 semanas, 9 meses después del transplante, como tratamiento de una infección por Salmonella. Los monos BB94 y A94 fueron tratados para una sepsis de Streptococci y recibían cefamandolnafaat, 50 mg/kg/día y tobramicina, 3 mg/kg/día. A94 fue tratado adicionalmente para una sepsis de Streptococci con amoxilina, 9 mg/kg/día, ácido clavulánico, 2,5 mg/kg/día y ceftriaxona, 50 mg/kg/día y con Amfotericina B, 8 mg/kg/día para una infección por levadura. La descontaminación selectiva fue detenida unos días después de la repoblación hemopoyética de los monos. El tratamiento de sepsis se detuvo 4 días después de que la temperatura corporal volviera a la normalidad y se encontrara que los cultivos de suero eran estériles. Se administró tratamiento con Docetaxel (Taxotere®) a los monos rh9128 y rh9170 en los momentos indicados (fig. 3) a una dosis de 50 mg/m^{2}. En los monos rh9128 se administraron 4 dosis de docetaxel alrededor de 14 meses después del transplante de 10 mg/m^{2}. La cantidad apropiada de docetaxel fue diluida en 50 ml de PBS-Glucosa (NPBI, Holanda) y administrada mediante inyección IV a una velocidad de 1 ml/minuto.

Tratamiento de la médula ósea y transducción

Se obtuvieron 40 ml de producto aspirado de médula ósea punzando ambas diáfisis femorales bajo anestesia total. Las células de médula ósea fueron recogidas en solución salina alcalina de Hank conteniendo heparina a 100 unidades por ml y desoxirribonucleasa I y sometidas a centrifugación en Ficoll-Hypaque (Sigma). La selección de CD34+ se realizó utilizando una columna CE-PRATE LC a pequeña escala (CellPro, Bothell, WA). Se incubaron de 5 x 10^{4} a 50 x 10^{4} células a 4ºC durante 30 minutos en 0,1 ml de PBS y suero bovino fetal (BSA) al 1% con 5 ml de anticuerpo anti-CD34 conjugado con ficoeritrina (563.F) o anticuerpo anti-CD34 no conjugado (566). Las células incubadas con el anticuerpo 566 fueron lavadas (PBS, 0,1*BSA) y adicionalmente incubadas con IgG anti-ratón de conejo conjugada con PerCP (Becton-Dickinson, Cat. núm. 340272). Tras el lavado, las células fueron proporcionadas a un citómetro de flujo FACSort (Becton-Dickinson). Las células fueron analizadas con el programa de soporte lógico Lysis II. El porcentaje de células CD34+ fue calculado como la proporción de células CD34+ con respecto al número total de células y multiplicado por 100. Para los monos rhesus 9128 y 9170 las células enriquecidas con CD34+ fueron tratadas inmediatamente para la transducción. Para los monos rhesus A94 y BB94 las células enriquecidas con CD34+ fueron divididas en dos fracciones iguales y almacenadas en nitrógeno líquido.

La transducción de las células CD34+ se realizó como se describe más abajo. En la Tabla 3 se da un resumen de las condiciones del experimento.

Monos rhesus 9128 y 9170: Cuatro días antes del transplante las células enriquecidas en CD34+ fueron divididas en dos fracciones iguales y cultivadas a una densidad de 10^{6} células por ml en medio BMC de baja densidad suplementado con interleuquina 3 de mono rhesus recombinante (RhIL-3; Burger y col., 1.990) como se describe en [57]. El día 2 y el día 3 se expuso una fracción de células CD34+ cultivadas a la preparación de rAAV bruto de IG-CFT y la otra fracción fue expuesta a la preparación de rAAV bruto de IG-\DeltaMoNeo añadiendo un volumen igual de preparación de virus al medio de las células CD34+ cultivadas. Al cabo de tres a cinco horas las células fueron recogidas por centrifugación (7 minutos, 200 g) y resuspendidas en medio BMC de baja densidad suplementado con RhIL-3 de nueva aportación en el mismo volumen que cuando el cultivo fue iniciado. El día cuatro las células fueron recogidas por centrifugación (7 minutos, 200 g) y resuspendidas en un volumen igual de NaCl al 0,9% y transplantadas por separado en monos rhesus autólogos mediante inyección IV.

Monos rhesus A94 y BB94: Cuatro días antes del transplante una fracción de células enriquecidas con CD34+ congelada fue descongelada y lavada con posterioridad con solución Salina Equilibrada de Hanks. Las células vivas fueron recogidas mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (Sigma) y cultivadas a una densidad de 10^{6} células por ml en medio de Eagle modificado de Iscove (IMDM, Gibco-BRL) suplementado con Suero de Ternera Fetal (FCS, 10%) e interleuquina 3 de mono rhesus recombinante (RhIL-3; Burger y col., 1.990). El día 2 y 3 las células fueron recogidas por centrifugación (7 minutos, 200 g) y resuspendidas en 10 a 200 \mul de IMDM+FCS al 10% y RhIL-3 y expuestas con posterioridad a una preparación de rAAV purificado de IG-CFT (Mono A94) o IG-CFT* (Mono BB94). Al cabo de dos horas las células fueron lavadas con IMDM+FCS al 10% y sembradas de nuevo en IMDM+FCS al 10% y RhIL-3. El día cuatro las células fueron recogidas por centrifugación y suspendidas en NaCl al 0,9%. También el día cuatro la otra fracción de células CD34+ fue descongelada y lavada con solución Salina Equilibrada de Hanks. La células vivas fueron recogidas mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (Sigma), resuspendidas en 10 a 200\mul de IMDM + FCS al 10% y RhIL-3 y con posterioridad expuestas a preparación de rAAV purificado de IG-CFT (Mono BB94) o IG-CFT* (Mono A94). Al cabo de dos horas las células fueron recogidas por centrifugación y suspendidas en NaCl al 0,9%. Tras la recolección en NaCl (0,9%) las células fueron transplantadas por separado a monos rhesus irradiados autólogos mediante inyección IV.

Evaluación de parámetros

Observación diaria de signos químicos. Examen físico completo y determinación del peso corporal semanal. El análisis químico de la sangre se llevó a cabo antes y después de la irradiación con rayos X. La hematología se realizó semanalmente. Las muestras de médula ósea fueron pinchadas de las diáfisis femorales con anestesia total. Las muestras de sangre con heparina fueron tomadas semanalmente para el análisis por PCR. Se aislaron PBMC y granulocitos de muestras de sangre periférica como se ha descrito previamente mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (Van Beusechem y col., 1.992). Las células T y B circulantes fueron purificadas a partir PBMC clasificando las células CD2 y CD20 positivas, respectivamente. Los anticuerpos CD2 (clon S 5.2; Becton-Dickinson, California) o CD20 (clon L27; Becton-Dikinson, California) fueron incubados con PBMC según los protocolos del fabricante. Las células marcadas fueron separadas utilizando la columna MACS® y cuentas anti-FITC (Miltenyi, Alemania) según el protocolo del fabricante. Los análisis repetidos de las células clasificadas sobre FACS® (Becton-Dickinson, USA) mostraban que las células clasificadas eran poblaciones puras en más del 95%.

Análisis de las células formadoras de Colonias (CFU-C)

Se cultivaron en placa células hemopoyéticas Rh9128 y Rh9170 por duplicado a 5 x 10^{3}/ml (seleccionadas para CD34^{+}) o 1 x 10^{5}/ml (post-Ficoll) en 1 ml de medio con metilcelulosa como se describe en [57] suplementado con 30 ng/ml de rhIL-3 y 25 ng/ml de GM-CSF. Las células hemopoyéticas RhA94 y BB94 fueron sembradas para la formación de colonias en medio con metilcelulosa conteniendo 50 ng/ml de SCF, 10 ng/ml de GM-CSF, 10 ng/ml de IL-3 y 3 U/ml de Epo (MethoCult GF H4434, StemCell Technologies Inc. Vancouver, Canadá).

Reacción en cadena de la polimerasa

Para la lisis celular, se incubaron los sedimentos (10^{7} células/ml) en tampón de lisis con detergente no iónico (NP40 al 0,5%, Tween 20 al 0,5%, Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, gelatina al 0,01%, MgCl_{2} 2,5 mM) conteniendo proteinasa K (60 mg/ml) a 56ºC durante 1 hora. Los productos lisados fueron calentados después a 95ºC durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. Se realizaron dos detecciones mediante PCR diferentes. Una era una PCR específica de neo^{R} anidada y otra era una PCR específica de \beta-globina. Primero se describirá el protocolo para la PCR específica de neo^{R}. La primera amplificación se llevó a cabo sobre productos lisados de 10 \mul en un volumen total de 50 \mul con 2 U de polimerasa SuperTaq (HT Biotechnology, Cambridge, Inglaterra) en una mezcla de reacción (concentración final: 200 mM de cada uno de 2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato, 2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato, 2'-desoxitimidina-5'-trifosfato (Pharmacia, Roosendaal, Holanda), 0,2 \muM de cada uno de 5'-neo-1 y el cebador antisentido 3'-neo-2 y el tampón de reacción suministrado por el fabricante (HT Biotechnology, Cambridge, Inglaterra). La amplificación anidada se realizó sobre 5 \mul de la primera reacción en un volumen total de 50 \mul con 2 U de polimerasa SuperTaq (HT Biotechnology, Cambridge, Inglaterra) en una mezcla de reacción (concentración final: 200 mM de cada uno de 2'-desoxiadenosina-5'- trifosfato, 2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato, 2'-desoxitimidina-5'-trifosfato (Pharmacia, Roosendaal, Holanda), 0,2 \muM de cada uno de 5'-neo-2 y el cebador antisentido 3'-neo-1 y el tampón de reacción suministrado por el fabricante (HT Biotechnology, Cambridge, Inglaterra). Los cebadores fueron elegidos para amplificar selectivamente el gen neo^{R}.

Las secuencias del cebador son:

5' neo-1: 5'-GGGGTACCGCCGCCGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGC-3'

5' neo-2: 5'-TTCTCCGGCCGCTTGGGTGG-3'

3' neo-1: 5'-GGCAGGAGCAAGGTGAGATG-3'

3' neo-2: 5'-CCATGATGGATACTTTCTCG-3'

Las condiciones de la amplificación fueron las mismas para la primera amplificación y la anidada y se realizaron en un aparato para temperaturas cíclicas TRIO Thermocycler (Biometra, Góttingen, Alemania). Las condiciones elegidas fueron: 95ºC durante 5 minutos, después 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido de una prolongación a 72ºC durante 10 minutos. Se separaron de cinco a diez microlitros de la reacción anidada en un gel de agarosa al 2% (Pronarose, Hispanagar, Burgos, España). En cada análisis se incluía titulaciones de una línea celular de leucemia eritroide murina C88-C1, conteniendo una integración de provirus sencilla de IG-CFT [21] y/o una titulación de una reserva de células MEL seleccionadas con G418 infectadas con IG-CFT*. Por razones prácticas los autores de la presente invención desarrollaron un método de PCR alternativo para detectar el casete neo en vectores de rAAV IG-CFT, IG-CFT* e IG-\DeltaMo+Neo. Las secuencias de los cebadores eran las siguientes: NEO-1S: 5'-TAGCGTTGGCTACCCGTGAT-3', y NEO-4AS: 5'-TGCCGTCATAGCGC-GGGTT-3'. Las mezclas de reacción fueron preparadas como se ha descrito antes y la temperatura de reacción era de 95ºC durante 3 minutos seguido de 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. La terminación de los 30 ciclos estaba seguida de una prolongación de 5 minutos a 72ºC. Se hicieron pasar de cinco a diez microlitros de la reacción de la PCR sobre un gel de agarosa al 2%, se transfirieron y se hibridaron con una sonda específica de 157 pb aislada de un producto digerido con BstBI-SmaI de IG-CFT.

La PCR específica para la \beta-globina se llevó a cabo esencialmente de la misma manera que la primera reacción de la PCR específica para neo^{R}. Pero en lugar de los cebadores neo^{R}, se añadieron los cebadores enumerados más abajo para la porción 3' del fragmento HS-2 y el intrón I de la \beta-globina. Las secuencias de los cebadores son:

HS-2-S3

\hskip0,5cm

5'-GGAATTATTCGGATCTATCGAT-3'

IVS-1A-A

\;

\;

5'-TCCTTAAACCTGTCTTGTAACC-3'

Las temperaturas para el ciclo eran: 95ºC durante 3 minutos y después 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos. Tras los 30 ciclos, se realizó una prolongación a 72ºC durante 5 minutos. Las muestras se hicieron pasar sobre geles de agarosa al 2%, que fueron transferidos e hibridados con una sonda específica del promotor de la \beta-globina NcoI-ClaI utilizando mecanismos normalizados.

Datos hemopoyéticos del transplante de monos rhesus con BMC transducidas con rAAV

La supervivencia y la selección del procedimiento de purificación y transducción de las células de médula ósea de mono rhesus CD34+ se controlaron determinando el número de CFU-C presentes en diferentes fases del procedimiento. La selección CD34 para Rh9128 y Rh9170 dio como resultado un enriquecimiento de 13-19 veces resp de CFU-C. Para A94 y BB94 el enriquecimiento para CFU-C era una resp de 37-92 veces (tabla 4). El número de CFU-C no variaba en más de un factor de 2 durante el cultivo o tras la transducción, con la excepción del mono BB94 donde el descenso en el número de CFU-C era considerable tras el cultivo y la infección con IG-CFT. Esto era debido a una toxicidad directa del lote de IG-CFT purificado con CsCl, como se determina mediante una titulación del lote sobre sangre de cordón humana tras hacer pasar la médula ósea por Ficoll que daba como resultado una toxicidad dependiente del factor de dilución sobre las CFU-C (no mostrada). Puesto que se sabe que el CsCl es una sustancia muy tóxica se determinó la concentración de CsCl en las dos preparaciones de rAAV purificadas con CsCl. Ambas contenían cantidades considerables de CsCl, suficientes para justificar la toxicidad observada (tabla 2). Debido a la toxicidad observada sobre las CFU-C en este experimento los dos injertos que recibían Rh BB94 tenían un tamaño muy diferente. Mientras el injerto cultivado era todavía considerable, el tamaño del injerto para el protocolo de transducción corto era muy pequeño (tabla 4). Sin embargo, puesto que las células madre no están medidas en un análisis de CFU-C y son por supuesto más resistentes a una gran variedad de fármacos y agentes es posible que muchas de ellas sobrevivan a la elevada concentración de CsCl.

Detección de células de sangre periférica transducidas con rAAV

Para determinar si las células injertadas habían sido transducidas por los vectores de rAAV recombinante, se recogieron aproximadamente 3 ml de sangre cada semana de cada mono. Los granulocitos y las células mononucleares fueron purificados como se describe en [57] y el ADN fue liberado y analizado mediante PCR en cuanto a la presencia de secuencias de rAAV. Se realizaron dos reacciones de PCR diferentes. Sobre las muestras de los cuatro monos, se realizaron las reacciones de PCR específicas para el gen neo^{R}. El gen neo^{R} está presente en todos los vectores, de modo que esta PCR detecta todos los genomas de AAV recombinante presentes en las células. Sobre las muestras de los monos rh-A94 y rh-BB94 también se llevó a cabo una PCR específica para la \beta-globina. En esta PCR se utiliza la diferencia de tamaños en el promotor de la \beta-globina de IG-CFT e IG-CFT* vectores. Estos vectores fueron utilizados para transducir las P-PHSC por medio de dos protocolos diferentes. El efecto de los dos protocolos diferentes puede ser leído mediante la prevalencia de uno de los dos vectores en células de sangre periférica de los monos.

Los resultados de la PCR de neo se representan en las figuras 2 y 3. Todos los monos eran negativos para rAAV antes del transplante y se volvían positivos para rAAV después del transplante. La presencia del vector variaba de semana en semana. Algunas muestras eran positivas para el vector, otras eran negativas, indicando que la frecuencia de células transducidas estaba por regla general cerca del límite de detección de la reacción de PCR que se había determinado que era de 1 copia en 10^{5} células enucleadas para la PCR específica de neo. El mono BB94 era positivo en todas las muestras inmediatamente después de transplante y la regeneración del sistema hemopoyético, indicando una transducción más eficaz de los progenitores tempranos durante la manipulación ex vivo de las células.

En los monos BB94 y 9128 las células que contenían el vector podían ser detectadas durante al menos más de un año después del transplante. Las muestras de médula ósea tomadas de estos animales a los 2 y 6 meses (9128) o 14 meses (BB94) del transplante también contenían las células transducidas con el vector. En BB94 el vector era detectado en PBMC, granulocitos, médula ósea y poblaciones purificadas de células B y T (fig. 4). Este resultado demostraba la transducción de células madre que habían repoblado tanto el linaje mieloide (granulocitos) como el linaje linfoide (células T y B). Los granulocitos, las células T y las células B todavía eran positivas a PCR más de 15 meses después del transplante, indicando la transducción de células con dilatada capacidad de auto-renovación. La transducción de células de primate con (1) una extrema estabilidad a largo plazo in vivo tras el transplante, y (2) la capacidad de repoblación de múltiples linajes bastante después del transplante, proporciona una fuerte evidencia para la transducción de P-PHSC.

El mono rhesus 9128 recibía tratamientos con taxótero, un fármaco citostático, para la ablación de las células madre maduras en circulación induciendo un re-crecimiento periódico a partir de las células hemopoyéticas inmaduras que residen en la médula ósea. Las células transducidas con AAV recombinante fueron detectadas en las células circulantes después de una serie de tratamientos con taxótero, a lo largo de un período de 14 meses después del transplante. La persistencia de las células transducidas en las células de la sangre periférica y la resistencia al tratamiento con taxótero proporcionan una evidencia convincente de la transducción de P-PHSC.

Determinación del protocolo de transducción más eficaz

El experimento con monos BB94 y A94 fue diseñado para cuantificar el éxito de dos protocolos de transducción diferentes. Para cada mono el transplante era repartido en dos fracciones iguales y cada fracción fue transducida de una manera diferente. Para ser capaz de discriminar qué protocolo daba como resultado una transducción mejor se utilizó un vector diferente para cada transducción. Los autores de la presente invención compararon la eficacia de la transducción de P-PHSC cultivadas versus la de P-PHSC no cultivadas. Para la transducción de P-PHSC de mono BB94 los autores de la presente invención utilizaron el virus IG-CFT purificado para las P-PHSC no cultivadas y el virus IG-CFT* purificado para las P-PHSC cultivadas. Para excluir un posible papel de las diferencias de calidad entre los lotes de virus los autores de la presente invención cambiaron los dos lotes de virus para los protocolos de transducción para el mono A94; utilizaron IG-CFT para sus P-PHSC cultivadas e Ig-CFT* para sus P-PHSC no cultivadas. Tras el transplante y la repoblación del sistema hemopoyético de los monos los autores de la presente invención realizaron la PCR específica de la \beta-globina para determinar qué procedimiento de transducción daba como resultado la frecuencia más alta de células circulantes con el gen modificado. Para ambos monos los autores de la presente invención pudieron detectar sólo el virus utilizado para transducir las P-PHSC cultivadas, es decir, IG-CFT* para monos BB94 e IG-CFT para monos A94 (Fig. 5). Así, la estimulación in vitro de P-PHSC produce una transducción más eficaz con vectores de AAV recombinante. Este resultado no era el esperado. Generalmente se acepta que el cultivo de P-PHSC promueve la pérdida progresiva del potencial de injerto de las P-PHSC presumiblemente debido a la diferenciación. Por tanto, si ambos procedimientos produjeran una eficacia de transducción de P-PHSC similar los autores de la presente invención esperarían que la progenie de las P-PHSC no cultivadas predominara entre las células de la sangre circulantes debido a las ventajas del injerto. Puesto que los autores de la presente invención observaron lo contrario, la eficacia de la transducción estable de las P-PHSC cultivadas debe ser significativamente superior que la de las P-PHSC no cultivadas. Se sabe que los vectores de AAV se integran con mayor eficacia en las células que están en ciclo que en las células que no están en ciclo (38). Sin embargo, en las células que no están en ciclo el vector permanece en el núcleo y conserva su capacidad para integrarse cuando se desencadena el ciclo de la célula (60). Una vez transplantadas, las P-PHSC comienzan a dividirse y repoblar el sistema hemopoyético sometido a ablación. Considerando la enorme cantidad de células que se necesita producir en un corto tiempo se presume que las P-PHSC comienzan a dividirse en un par de días una vez dentro del organismo. Por lo tanto, no se espera una diferencia de capacidad de transducción de las células cultivadas versus las cultivadas cuando sólo la replicación de las células diana es el factor intensificador. Los autores de la presente invención deducen que el cultivo y la exposición a factores de crecimiento hemopoyéticos tales como IL-3 podrían potenciar de otras maneras la transducción con AAV recombinante. Una posible explicación es la sobre-regulación o la activación de receptores para el virus sobre la superficie de las P-PHSC. Otra es la inducción de proteínas dentro de las P-PHSC que intensifican el transporte nuclear y/o otras etapas limitantes de la velocidad para la transducción estable.

Publicaciones

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims (18)

1. Un procedimiento in vitro de modificación genética de células madre hempoyéticas plutipotentes de primates (P-PHSC), que comprende introducir un vector de virus adeno-asociado recombinante (AAV) en P-PHSC y donde dichas P-PHSC son expuestas in vitro a interleuquina 3.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el AAV recombinante deriva de AAV humano.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el vector AAV recombinante comprende una secuencia de ADN flanqueada por las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, donde dicha secuencia de ADN comprende secuencias reguladoras que son funcionales en células hemopoyéticas y, bajo el control de dichas secuencias reguladoras, una secuencia que codifica una proteína o ARN con una propiedad terapéutica cuando se introduce en células hemopoyéticas.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, donde dicha secuencia de ADN comprende la secuencia codificadora de un gen seleccionado del grupo formado por el gen de la glucocerebrosidasa lisosomal humana (E.C.3.2.1.45), un gen de globina de la agrupación de genes de la \beta-globina humana, una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína con actividad anti-viral, el gen de la \alpha1-antitripsina y el gen de la resistencia a múltiples fármacos humano I (MDRI).

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde dicha secuencia de ADN comprende el gen de la \beta-globina humana incluyendo al menos un intrón o un análogo funcional del mismo.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde dicha secuencia de ADN comprende el gen de la \beta-globina humana conectado operablemente a sitios hipersensibles a la ADNasa I específica de eritroides (HS) de su Región de Control del Locus (LCR) o un análogo funcional del mismo.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde dichos sitios hipersensibles a la ADNasa I específica de eritroides del LCR de la \beta-globina comprende los elementos de \beta-LCR HS4, HS3 y HS2, o análogos funcionales de los mismos.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, donde dicha secuencia de ADN comprende el gen de la \beta-globina humana bajo el control transcripcional de una parte funcional del promotor de la \beta-globina o un análogo funcional del mismo.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, donde dicha secuencia de ADN comprende un gen marcador seleccionable útil en las células madre hemopoyéticas.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde dicho gen marcador seleccionable es un gel neo^{R} bajo el control transcripcional de un promotor de la timidina quinasa (TK) del virus herpes simplex (HSV) o un análogo funcional del mismo.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, donde dicho gen marcador seleccionable es un gen neo^{R} bajo el control transcripcional de un promotor de una Gran Repetición Terminal (LTR) \DeltaMo+PyF101 o un análogo funcional del mismo.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde dicho vector AAV recombinante es parte de un complejo cuando se pone en contacto con dichas P-PHSC.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, donde dicho vector AAV recombinante está asociado con proteínas de la cápsida de AAV.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, donde dicho vector AAV recombinante es empaquetado en una cápsida de AAV.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, donde dicho vector AAV recombinante es introducido en dichas P-PHSC mediante transducción con el vector AAV recombinante empaquetado en una cápsida de AAV o un análogo funcional del mismo.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dichas P-PHSC se originan a partir de médula ósea, sangre de cordón o sangre periférica de primate.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dichas P-PHSC se originan a partir de un humano.