ES2288037T3 - Secuencia de acido nucleico del serotipo 1 de adenovirus asociado, vectores y celulas huesped que las contienen. - Google Patents
Secuencia de acido nucleico del serotipo 1 de adenovirus asociado, vectores y celulas huesped que las contienen. Download PDFInfo
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Abstract
Un virus recombinante que tiene una cápside de AAV-1 que comprende una proteína de AAV-1 seleccionada entre vp1 de AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NeM. 13; vp2 de AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NeM. 15; vp3 de AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NeM. 17, y una molécula heteróloga que comprende una secuencia 5¿ de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, un transgén, y una ITR 3¿ de AAV.
Description
Secuencia de ácido nucleico del serotipo 1 de
adenovirus asociado, vectores y células huésped que las
contienen.
Este trabajo ha sido soportado por el National
Institute of Health, concesión núm. P30 DK47757-06
y PO1 HD32649-04. El gobierno de los Estados Unidos
puede tener algunos derechos en esta invención.
La invención se refiere en general a virus
recombinantes útiles para terapia genética. También se refiere a
composiciones farmacéuticas, a células huésped recombinantes, a
vectores y al uso de virus recombinantes en terapia genética.
Los adenovirus asociados son pequeños virus de
ADN de cadena simple que requieren un virus de ayuda para facilitar
una replicación eficiente [K.L. Berns, Parvoviridae: los virus y
su replicación, p.1007-1041, en F.N. Fields
et al., Virología fundamental, 32 ed., vol. 2
(Lippencott-Raven Publishers, Filadelfia, PA)
(1995)]. El genoma 4.7 kb de AAV está caracterizado por dos
repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos ventanas de lectura
abiertas que codifican las proteínas Rep y las proteínas Cap,
respectivamente. La ventana de lectura Rep codifica cuatro
proteínas de peso molecular 78 kD, 68 kD, 22 kD y 40 kD. Estas
proteínas funcionan especialmente en la regulación de la replicación
del AAV y en la integración del AAV en los cromosomas de la célula
huésped. La ventana de lectura Cap codifica tres proteínas
estructurales de peso molecular 85 kD (VP1), 72 kD (VP2) y 61 kD
(VP3) [Berns, citado anteriormente]. Más del 80% de la totalidad de
proteínas en el virión de AAV, comprenden VP3. Las dos ITRs son los
únicos elementos cis esenciales para la replicación,
empaquetamiento e integración del AAV. Existen dos conformaciones
de ITRs del AAV denominadas "flip" y "flop". Estas
diferencias de conformación se originan a partir del modelo de
replicación de adenovirus asociados que utilizan la ITR para
iniciar y reiniciar la replicación [R.O. Synder et al., J.
Virol 67-6096-6104 (1993); K.I.
Berns, Revistas Microbiológicas, 54: 316-329
(1990)].
Se han encontrado AAVs en muchas especies
animales, incluyendo los primates, los caninos, las aves de corral y
los humanos [F.A. Murphy et al., "Clasificación y
Nomenclatura de Virus: Sexto Informe del Comité Internacional sobre
Taxonomía de Virus", Archivos de Virología,
(Springer-Verlag, Viena) (1995)]. Adicionalmente a
cinco AAVs de primates conocido (AAV-1 a
AAV-5), el AAV-6, otro serotipo
relacionado cercanamente con el AAV-2 y el
AAV-1, ha sido también aislado [E.A. Rutledge et
al., J. Virol. 72: 309-319 (1998)]. Entre
todos los serotipos de AAV conocidos, el AAV-2 es
quizás el serotipo que está mejor caracterizado. Por consiguiente,
las secuencias completas para el AAV-3A,
AAV-4 y AAV-6, han sido también
determinadas [Rutledge, citado anteriormente; J.A. Chorini et
al. J. Virol. 71: 6823-6833 (1997); S.
Muramatsu et al., Virol., 221: 208-217
(1996)]. En general, los AAVs comparten una homología de más del
80% en la secuencia de nucleótido.
Un número de propiedades únicas hacen del AAV un
vector prometedor para la terapia genética humana [Muzyczka,
Tópicos Normales en Microbiología e Inmunología, 158:
97-129 (1992)]. A diferencia con otros vectores
virales, los AAVs no se ha demostrado que estén asociados con
alguna enfermedad humana conocida, y en general no se consideran
patógenos. Un AAV de tipo salvaje es susceptible de integrarse en
los cromosomas del huésped de una manera específica del lugar [R.M.
Kotín et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
2211-2215 (1990) - R.J. Samulski, EMBO J.,
10(12): 3941-3950 (1991)]. Los vectores de
AVV recombinantes pueden integrarse en células cultivadas de tejido,
en el cromosoma 19 si las proteínas rep se suministran en trans [C.
Balague et al., J. Virol, 71: 3299-3306
(1997)]; R.T. Surosky et al., J. Virol, 71:
7951-7959 (1997)]. Los genomas integrados de AAV han
demostrado permitir expresión de gen a largo plazo en un número de
tejidos, incluyendo los músculos y el cerebro [K.J. Fisher,
Nature Med., 3(3): 308-312 (1997);
R.O. Snyder et al., Nature Genetics, 16:
270-276 (1997); X. Xiao et al.,
Experimental Neurology, 144: 113-124 (1997);
Xiao, J. Virol, 70(11): 8098-8108
(1996)].
Se ha demostrado que el AAV-2
está presente en aproximadamente el 80-90% de la
población humana. Los estudios anteriores demostraron que los
anticuerpos neutralizantes para el AAV-2 son
prevalentes [W.P. Parks et al., J. Virol, 2:
716-722 (1970)]. La presencia de tales anticuerpos
puede reducir significativamente la utilidad de los vectores de AAV
basados en AAV-2 a pesar de sus otros méritos. Lo
que se necesita en el estado de la técnica son vectores
caracterizados por las ventajas del AAV-2,
incluyendo las descritas anteriormente, sin las desventajas,
incluyendo la de presencia de anticuerpos neutralizantes.
En un aspecto, la invención proporciona un virus
recombinante que tiene una cápside de AAV-1 que
comprende una proteína de AAV-1 seleccionada entre
vp1 de AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido
de SEQ ID NÚM. 13, una vp2 de AAV-1 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 15, una vp3 de
AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ
ID NÚM. 17, y una molécula heteróloga que comprende una secuencia
de repetición terminal invertida (ITR) de AAV 5, un transgén, y una
ITR de AAV 3.
\newpage
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende un virus recombinante y un
portador farmacéuticamente aceptable.
Todavía en otro aspecto, la invención
proporciona el uso de un virus recombinante para preparar un
medicamento útil para transducir una célula muscular.
Todavía según otro aspecto, la invención
proporciona una célula huésped recombinante transducida con un
virus recombinante de la invención.
Todavía según otro aspecto, la invención
proporciona un vector que codifica funciones auxiliares de
AAV-1, comprendiendo dicha molécula una región de
codificación rep de AAV y una región de codificación cap de AAV, en
la que dicha región de codificación cap comprende al menos un
miembro elegido en el grupo consistente en: a) vp1 que tiene la
secuencia de ácido nucleico de nt 2223 a 4431 de SEQ ID NÚM. 1; b)
vp2 que tiene la secuencia de ácido nucleico de nt 2634 a 4432 de
SEQ ID NÚM. 1; y c) vp3 que tiene la secuencia de ácido nucleico de
nt 2829 a 4432 de SEQ ID NÚM. 1.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de un virión AAV que comprende: a) una cápside que comprende al
menos una proteína de cápside codificada mediante un gen cap de
AAV-1 que tiene al menos el 99% de identidad con el
nt 2223 a 4431 de SEQ ID NÚM. 1; y b) una molécula de ADN que
comprende un transgén bajo el control de secuencias regulatorias
que dirigen su expresión a la preparación de un medicamento para el
suministro de un transgén a una célula huésped.
Las Figuras 1A - 1C ilustran el alineamiento de
nucleótidos de AAV-1 [SEQ ID NÚM. 1],
AAV-2 [SEQ ID NÚM. 18] y AAV-6 [SEQ
ID NÚM. 19]. El alineamiento se hizo con MacVector 6.0. Las
secuencias completas de AAV-1 se muestran en la
línea superior. Los nucleótidos en los AAV-2 y
AAV-6 idénticos a AAV-1, se han
simbolizado mediante *.*, y las separaciones mediante *-*. En esta
Figura se han marcado algunas de las características conservadas
entre AAVs. Obsérvese que las ITRs 3' de AAV-1 y de
AAV-6 se muestran con diferentes orientaciones.
La Figura 2 ilustra la estructura secundaria
predicha de la ITR del AAV-1. Los nucleótidos en el
AAV-2 y en el AAV-6, se muestran
respectivamente en itálica y en negrita.
La Figura 3A ilustra una hipótesis de cómo el
AAV-6 se puso de manifiesto a partir de la
recombinación homóloga entre el AAV-1 y el
AAV-2. Los elementos mayores de
AAV-1 se han indicado de forma gráfica. Una región
que está compartida entre AAV-1,
AAV-2 y AAV-6, ha sido mostrada
dentro de una caja con líneas onduladas.
La Figura 3B es una ilustración detallada de una
región homóloga 71 bp entre AAV-1,
AAV-2 y AAV-6. Los nucleótidos que
difieren entre estos serotipos han sido indicados mediante
flechas.
La Figura 4A es un diagrama de barras que
ilustra niveles de expresión de antitripsina alfa 1 humana
(\alpha1AT) en el suero a continuación del suministro de hAAT a
través de los virus AAV-1 recombinante y
AAV-2 recombinante.
La Figura 4B es un diagrama de barras que
ilustra niveles de expresión de eritropletina (epo) en suero a
continuación del suministro del gen epo a través de virus
AAV-1 recombinante y AAV-2
recombinante.
La Figura 5A es un diagrama de barras que
ilustra niveles de expresión de \alpha1AT en el hígado a
continuación del suministro de aIAT según se describe en el Ejemplo
7.
La Figura 5B es un diagrama de barras que
muestra los niveles de expresión de epo en el hígado a continuación
del suministro de epo según se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 5C es un diagrama de barras que de
muestra los anticuerpos neutralizantes (NAB) dirigidos al
AAV-1 a continuación del suministro de \alpha1AT
o de epo al hígado, según se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 5D es un diagrama de barras
demostrativo de anticuerpos de neutralización (NAB) dirigidos al
AAV-2 a continuación del suministro de \alpha1AT
o de epo al hígado según se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 6A es un diagrama de barras que
ilustra niveles de expresión de \alpha1AT en el músculo a
continuación del suministro de \alpha1AT según se describe en el
Ejemplo 7.
La Figura 6B es un diagrama de barras
demostrativo de los niveles de expresión de epo en el músculo a
continuación del suministro de epo según se describe en el Ejemplo
7.
La Figura 6C es un diagrama de barras
demostrativo de anticuerpos neutralizantes (NAB) dirigidos al
AAV-1 a continuación del suministro de \alpha1AT
o de epo al músculo según se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 6D es un diagrama de barras
demostrativo de anticuerpos neutralizantes (NAB) dirigidos al
AAV-2 a continuación del suministro de \alpha1AT
o de epo al músculo según se describe en el Ejemplo 7.
Según se utiliza a través de esta descripción y
de las reivindicaciones, el término "que comprende" es
inclusivo de otros componentes, elementos, entidades completas,
etapas y similares.
Las secuencias de ácido nucleico del
AAV-1 de la invención incluyen las secuencias de
ADN de SEQ ID NÚM. 1 (Figuras 1A - 1C), consistentes en nucleótidos
4718. Las secuencias de ácido nucleico del AAV-1 de
la invención abarcan además la cadena que es complementaria con SEQ
ID NÚM. 1, así como también las secuencias de ARN y de cADN
correspondientes a SEQ ID NÚM. 1 y su cadena complementaria.
También están incluidas en las secuencias de ácido nucleico de la
invención las variantes naturales y las modificaciones diseñadas de
SEQ ID NÚM. 1 y su cadena complementaria. Tales modificaciones
incluyen, por ejemplo, etiquetas que son conocidas en el estado de
la técnica, la metilación, y la sustitución de uno o más de los
nucleótidos que se producen de forma natural por uno análogo.
También están incluidas en la invención las
secuencias de ácido nucleico que son idénticas en al menos el 99% u
homólogas a SEQ ID NÚM. 1. El término "identidad de secuencia en
tanto por ciento" o "idéntico" en el contexto de la
secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos de las dos
secuencias que son iguales cuando se alinean respecto a la máxima
correspondencia. La longitud de comparación de identidad de
secuencia puede extenderse a la longitud completa de la secuencia,
o a un fragmento de al menos alrededor de nueve nucleótidos,
habitualmente al menos alrededor de 20 - 24 nucleótidos, al menos
alrededor de 28 - 32 nucleótidos, y preferentemente al menos
alrededor de 36 o más nucleótidos. Existe un número de algoritmos
diferentes conocidos en la técnica que pueden ser usados para medir
identidad de secuencia de nucleótido. Por ejemplo, las secuencias de
nucleótido pueden ser comparadas utilizando Fasta, un programa en
GCG Versión 6.1. Fasta proporciona identidad de alineamientos y de
secuencia en tanto por ciento de las regiones de mejor solapamiento
entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, 1980,
incorporada aquí como referencia). Por ejemplo, el porcentaje de
identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser
determinado con la utilización de Fasta con sus parámetros por
defecto (un tamaño de palabra de 6 y un factor NOPAM para la matriz
de registro) según se proporciona en CGC Versión 6.1, incorporado
aquí como referencia.
El término "homología sustancial" o
"similitud sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico
o a un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea
óptimamente con inserciones o supresiones nucleótidas apropiadas
con otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria), existe
identidad de secuencia nucleótida en al menos el 99% de la
secuencia.
También incluidos en la invención están los
fragmentos de SEQ ID NÚM. 1, su cadena complementaria, el cADN y el
ARN complementarios con los mismos. Los fragmentos adecuados son al
menos de 15 nucleótidos de longitud, y abarcan fragmentos
funcionales que son de interés biológico. Algunos de esos
fragmentos pueden ser identificados mediante referencia a las
Figuras 1A - 1C. Ejemplos de fragmentos funcionales particularmente
deseables incluyen las secuencias de repetición terminal invertida
(ITR) de AAV-1 de la invención. Al contrario que en
las ITRs 145 nt de AAV-2, AAV-3 y
AAV-4, se ha encontrado que las ITRs de
AAV-1 consisten en solamente 143 nucleótidos,
caracterizados incluso ventajosamente por la estructura de
horquilla en forma de T que se cree que es la responsable de la
capacidad de las ITRs del AAV-2 para dirigir la
integración específica del lugar. El AAV-1 es único
entre otros serotipos AAV, dado que las ITRs 5' y 3' son idénticas.
Las secuencias de ITR de longitud completa 5', se proporcionan en
los nucleótidos 1 - 143 de SEQ ID NÚM. 1 (Figura 1A), y las
secuencias ITR de longitud completa 3' se proporcionan en nt 4576 -
4718 de SEQ ID NÚM. (Figura 1C). Un experto en la materia podrá
utilizar fácilmente menos secuencias ITR 5' y/o 3' de longitud
completa para diversos propósitos, y puede construir ITRs
modificadas utilizando técnicas convencionales, por ejemplo como se
describe para las ITRs del AAV-2 en Samulski et
al., Cell 33: 135 - 143 (1983).
Otro fragmento funcional deseable del genoma del
AAV-1 es el promotor P5 del AAV-1
que tiene secuencias únicas entre los promotores P5 de AAV,
mientras que mantiene elementos y funciones reguladoras críticas.
Este promotor se localiza dentro de nt 236 - 299 de SEQ ID NÚM. 1
(Figura 1A). Otros ejemplos de fragmentos funcionales de interés
incluyen las secuencias en la unión del rep/cap, por ejemplo, las
secuencias extensoras nt 2306 - 2223, así como también fragmentos
más grandes que abarcan esta unión que puede comprender 50
nucleótidos a cualquier lado de esta unión. Todavía otros ejemplos
de fragmentos funcionales incluyen las secuencias que codifican las
proteínas rep. La rep 78 se localiza en la región de nt 334 - 2306
de la SEQ ID NÚM. 1; la rep 68 se localiza en la región de nt 334 -
2272, y contiene un extensor de intrón nt 1924 - 2220 de SEQ ID NÚM.
1. La rep 52 se localiza en la región de nt 1007 - 2304 de SEQ ID
NÚM. 1; la rep 40 se localiza en la región de nt 1007 - 2272, y
contiene un extensor de intrón nt 1924 - 2246 de SEQ ID NÚM. 1.
También de interés son las secuencias que codifican las proteínas
de cápside, VP1 [nt 2223 - 4431 de SEQ ID NÚM. 1], VP2 [nt 2634 -
4432 de SEQ ID NÚM. 1] y VP3 [nt 2829 de SEQ ID NÚM. 1]. Otros
fragmentos de interés pueden incluir las secuencias P19 de
AAV-1, las secuencias P40 de AAV-1,
el sitio de enlace rep, y el sitio resoluto terminal (TRS).
La invención proporciona además las proteínas y
los fragmentos de las mismas que son codificados por los ácidos
nucleicos del AAV-1 según la invención. Las
proteínas particularmente deseables incluyen las proteínas rep y
cap, que son codificadas por las secuencias de nucleótido que se
han identificado en lo que antecede. Estas proteínas incluyen rep
78 [SEQ ID NÚM. 5], rep 68 [SEQ ID Núm. 7], rep 52 [SEQ ID NÚM. 9],
rep 40 [SEQ ID NÚM. 11], vp1 [SEQ ID NÚM. 13], vp2 [SEQ ID NÚM.
16], y vp3 [SEQ ID NÚM. 17], y fragmentos funcionales de las
mismas, y aunque que se ha encontrado que las secuencias de las
proteínas rep y cap están cercanamente relacionadas con las del
AAV-6, existen diferencias en las secuencias de
aminoácido (véase la Tabla 1 que sigue), así como también
diferencias en el reconocimiento de estas proteínas por parte del
sistema inmune. Sin embargo, un experto en la materia puede
seleccionar fácilmente otras proteínas adecuadas o fragmentos de
proteínas de interés biológico. Adecuadamente, tales fragmentos son
de al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, se pueden
utilizar fácilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Tales
fragmentos pueden ser producidos recombinantemente o mediante otros
medios adecuados, por ejemplo mediante síntesis química.
Las secuencias, las proteínas y los fragmentos
de la invención pueden ser producidos con los medios adecuados,
incluyendo producción de recombinación, síntesis química, u otros
medios sintéticos. Tales métodos de producción están dentro del
conocimiento de los expertos en la materia, y no constituyen
limitación para la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona vectores que utilizan las secuencias de
AAV-1 de la invención, incluyendo fragmentos de las
mismas, para el suministro de secuencias de gen heterólogas o de
otro ácido nucleico, a una célula objetivo. Adecuadamente, estas
secuencias heterólogas (es decir, un transgén) codifican una
proteína o producto genético que es susceptible de ser expresado en
la célula objetivo. Un transgén de este tipo puede ser construido
en forma de "mini-gen". Tal
"mini-gen" incluye secuencias heterólogas de
gen y los otros elementos reguladores necesarios para transcribir
el gen y expresar el producto de gen en la célula huésped. De ese
modo, las secuencias de gen están enlazadas operativamente con los
componentes reguladores de una manera que permite su transcripción.
Tales componentes incluyen elementos reguladores convencionales
necesarios para activar la expresión del transgén en una célula que
contiene el vector viral. El mini-gen puede contener
también un promotor seleccionado que esté enlazado al transgén y
localizado, con otros elementos reguladores, dentro de las
secuencias virales seleccionadas del vector recombinante.
La selección del promotor es un asunto rutinario
y no constituye limitación alguna para la presente invención. Los
promotores útiles pueden ser promotores constitutivos o promotores
regulados (inducibles), que permitan el control del período de
tiempo y de la cantidad del transgén que ha de ser expresado. Por
ejemplo, los promotores deseables incluyen el promotor/
incrementador anterior inmediato del ciclomegalovirus (CMV) [véase,
por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521 - 530]
(1985), el promotor/ incrementador del virus de sarcoma de Rous
LTR, y el promotor \beta-actin citoplásmico de
pollo [T.A. Kost et al., Nucl. Acids Res.,
11(23): 8287 (1983)]. Otros promotores deseables son también
el promotor de albúmina y el promotor P5 de AAV. Opcionalmente, el
promotor seleccionado se utiliza en conjunción con un incrementador
heterólogo, por ejemplo, se puede utilizar el promotor de
\beta-actin en conjunción con el incrementador
CMV. Todavía otros promotores e incrementadores adecuados o
deseables, pueden ser seleccionados por los expertos en la
materia.
El mini-gen puede contener
también, deseablemente, secuencias de ácido nucleico heterólogas
respecto a las secuencias de vector viral que incluyen secuencias
que proporcionan señales requeridas para una poliadenilación
eficiente del transcriptor (poli-A o pA), e intrones
con sitios de aceptadores y donantes de enlace funcional. Una
secuencia de poli-A común que se emplea en los
ejemplos de vectores de esta invención, es la derivada del
papovavirus SV-40. La secuencia de
poli-A se inserta generalmente en el
mini-gen, corriente abajo de las secuencias de
transgén y corriente arriba de las secuencias de vector viral. Una
secuencia de intrón común se deriva también del
SV-40, y se menciona como secuencia de intrón T de
SV40. Un mini-gen de la presente invención puede
contener también dicho intrón, localizado deseablemente entre la
secuencia de promotor/ incrementador y el transgén. La selección de
estos y de otros elementos de vector común, es convencional [véase,
por ejemplo, Sambrook et al., "Clonación Molecular. Manual
de Laboratorio", 24 edic., Cold Spring Harbor Laboratory, New
York, (1989), y las referencias que se citan en el mismo], y muchas
de tales secuencias se encuentran disponibles en fuentes
comerciales e industriales, así como también en Genebank.
La selección del transgén no es una limitación
de la presente invención. Se pueden seleccionar fácilmente
transgenes adecuados entre los genes informadores deseables, los
genes terapéuticos, y opcionalmente, los genes que codifican
polipéptidos inmunogénicos. Ejemplos de genes informadores
adecuados incluyen la \beta-galactosidasa
(\beta-gal), un gen de fosfatasa alcalina, y
proteína fluorescente verde (GFP). Ejemplos de genes terapéuticos
incluyen citoquinas, factores de crecimiento, y factores de
diferenciación, entre otros. El transgén puede ser seleccionado
fácilmente por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, el
documento WO 98/09657, que identifica otros transgenes
adecua-
dos.
dos.
Adecuadamente, los vectores de la invención
contienen, en valor mínimo, casetes que consisten en fragmentos de
las secuencias y proteínas del AAV-1. En una
realización, un vector de la invención comprende un transgén
seleccionado, que está flanqueado por una ITR 5' y una ITR 3', al
menos una de las cuales es una ITR de AAV-1 de la
invención. Adecuadamente, los vectores de la invención pueden
contener un promotor P5 de AAV-1 de la invención. En
otra realización, un plásmido o vector de la invención contiene
secuencias rep de AAV-1. Todavía en otra
realización, un plásmido o vector de la invención contiene al menos
una de las proteínas cap de AAV-1 de la invención.
Más adecuadamente, estos vectores derivados de AAV-1
están ensamblados en vectores virales, según se describe aquí.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un vector viral de AAV-1 recombinante producido con
la utilización de las proteínas de cápside de AAV-1
de la invención. Los viriones de rAAV-1
empaquetados de la invención pueden contener, adicionalmente a un
mini-gen seleccionado, otras secuencias de
AAV-1, o pueden contener secuencias de otros
serotipos de AAV.
Los métodos de generación de viriones de rAAV
son bien conocidos, y la selección de un método adecuado no
constituye ninguna limitación de la presente invención. Véase, por
ejemplo, K. Fischer et al., J. Virol., 70: 520 - 532
(1993), y la Patente US núm. 5.478.745. En un método adecuado, se
dota a una célula huésped seleccionada con la secuencia de AAV que
codifica una proteína rep, con el gen que codifica la proteína cap
de AAV, y con las secuencias para el empaquetamiento y el posterior
suministro. Deseablemente, el método utiliza las secuencias que
codifican las proteínas rep y/o cap de AAV-1 de la
invención.
En una realización, los genes rep/cap y las
secuencias para el suministro, son proporcionados mediante
co-transfección de vectores que portan estos genes
y secuencias. En una realización normalmente preferida, un plásmido
cis (vector), un plásmido trans (vector) que contiene los genes rep
y cap, y un plásmido que contiene los genes auxiliares de
adenovirus, son co-transfectados a una línea celular
adecuada, por ejemplo, la 293. Alternativamente, una o más de estas
funciones pueden ser proporcionadas en trans por medio de vectores
separados, o pueden ser encontradas en una línea celular de
empaquetamiento diseñada adecuadamente.
Un ejemplo de plásmido cis contendrá, en el
orden de 5' a 3', la ITR 5 de AAV, el transgén seleccionado, y la
ITR 3' de AAV. En una realización deseable, al menos una de las
ITRs de AAV es una ITR 143 nt de AAV. Sin embargo, las ITRs de
serotipos de AAV pueden ser seleccionadas fácilmente. De forma
adecuada, se utilizan ITRs de longitud completa. Sin embargo, un
experto en la material puede preparar fácilmente ITRs de AAV
modificadas utilizando técnicas convencionales. De manera similar,
los métodos para construcción de tales plásmidos son bien conocidos
por los expertos en la materia.
Un trans plásmido para su uso en la producción
de la partícula virión del rAAV-1, puede ser
preparado de acuerdo con técnicas conocidas. En una realización
deseada, el plásmido contiene las proteínas rep y cap de
AAV-1, o fragmentos funcionales del mismo.
Alternativamente, las secuencias seleccionadas pueden ser de otro
serotipo de AAV seleccionado.
Los plásmidos cis y trans pueden ser a
continuación co-transfectados con un virus auxiliar
de tipo salvaje (por ejemplo, Ad2, Ad5 o un virus de herpes), o más
deseablemente, con una replicación - adenovirus imperfecto, en una
célula huésped seleccionada. Alternativamente, estos plásmidos cis
y trans pueden ser co-transfectados en una célula
huésped seleccionada junto con un plásmido transfectado que
proporcione las funciones auxiliares necesarias. La selección de
una célula huésped adecuada está muy al alcance de los expertos en
la materia, e incluye las células de los mamíferos tales como las
células 293, y las células HeLa, entre otras.
Alternativamente, el plásmido cis y,
opcionalmente el plásmido trans, pueden ser transfectados en una
línea celular de empaquetamiento que proporcione el resto de las
funciones auxiliares necesarias para la producción de un rAAV que
contenga las secuencias de AAV-1 deseadas de la
invención. Un ejemplo de línea celular de empaquetamiento, en la
que se desea una cápside de AAV-2, es la
B-50, la cual expresa de forma estable los genes
rep y cap de AAV-2 bajo el control de un promotor
P5 homólogo. Esta línea celular está caracterizada por la
integración en el cromosoma celular de múltiples copias (al menos 5
copias) de casetes de gen P5-rep-cap
en forma concatómera. Esta línea celular B-50 fue
depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia 20110. 2209, el 18 de Septiembre de
1997, bajo el Núm. de Acceso CRL. 12401 conforme a las provisiones
del Tratado de Budapest. Sin embargo, la presente invención no está
limitada a la selección de la línea celular de empaquetamiento.
Ejemplos de vectores de transducción basados en
proteínas de cápside de AAV-1, han sido probados
tanto in vivo como in vitro, según se describe con
mayor detalle en el Ejemplo 4. En estos estudios, se demostró que
el vector AAV recombinante con un virión de AAV-1
puede transducir tanto hígado de ratón como músculo. Estos, y otros
vectores de terapia genética a base de AAV-1 que
pueden ser generados por los expertos en la materia, son
beneficiosos para el suministro de gen a las células huésped y a
los pacientes de terapia genética seleccionados, puesto que los
anticuerpos de neutralización de AAV-1 presentes en
una gran parte de la población humana muestran patrones diferentes
respecto a otros serotipos de AAV y por lo tanto no neutralizan los
viriones de AAV-1. Un experto en la materia puede
preparar fácilmente otros vectores virales de rAAV que contengan
proteínas de cápside de AAV-1 aquí proporcionadas
con la utilización de una diversidad de técnicas conocidas por los
expertos en la materia. Se pueden preparar, de forma similar, otros
vectores virales de rAAV que contengan secuencias de
AAV-1 y cápsides de AAV de otro serotipo.
Un experto en la materia comprenderá fácilmente
que las secuencias de AAV-1 de la invención pueden
ser adaptados fácilmente para su uso en estos y en otros sistemas
de vector viral para suministro genético in vitro, ex
vivo o in vivo. Particularmente adecuadas para su uso en
tales sistemas de vector viral son las secuencias ITR de
AAV-1, la rep de AAV-1, la cap de
AAV-1, y las secuencias de promotor P5 de
AAV-1.
Por ejemplo, en una realización deseable, las
secuencias ITR de AAV-1 de la invención pueden ser
usadas en un casete de expresión que incluya la ITR 5' de
AAV-1, una secuencia de ADN de
no-AAV que sea de interés (por ejemplo, un
mini-gen), y la ITR 3', y que carezca de rep/cap
funcional. Tal casete conteniendo una ITR de AAV-1,
puede estar localizado en un plásmido para su posterior
transfección en una célula huésped deseada, tal como el plásmido
cis que se ha descrito en lo que antecede. Este casete de expresión
puede estar además provisto de una cápside de AAV de un serotipo
seleccionado para permitir la infección de una célula, o ser
transfectado establemente en una célula huésped deseada para el
empaquetamiento de viriones de rAAV. Tal casete de expresión puede
ser adaptado fácilmente para su uso en otros sistemas virales,
incluyendo sistemas de adenovirus y sistemas de lentivirus. Los
métodos de producción de vectores Ad/AAV son bien conocidos por los
expertos en la materia. Un método deseable se encuentra descrito en
el documento PCT/US 95/14018. Sin embargo, la presente invención no
se limita a ningún método particular.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en las novedosas secuencias de promotor P5 de AAV-1
que se localizan en la región de extensión nt 236 - 299 de SEQ ID
NÚM. 1. El promotor es útil en una diversidad de vectores virales
para activar la expresión de un transgén deseado.
De forma similar, un experto en la materia puede
seleccionar fácilmente otros fragmentos del genoma de
AAV-1 de la invención para su uso en una diversidad
de sistemas de vector. Tales sistemas de vector pueden incluir, por
ejemplo, lentivirus, poxvirus, veccinia virus, y sistemas
adenovirales, entre otros. La selección de estos sistemas de vector
no es una limitación de la presente invención.
Todavía de acuerdo con otro aspecto, la presente
invención proporciona células huésped que pueden ser transfectadas
transitoriamente con secuencias de ácido nucleico de
AAV-1 de la invención para permitir la expresión de
un transgén deseado o la producción de una partícula de rAAV. Por
ejemplo, una célula huésped seleccionada puede ser transfectada con
secuencias de promotor P5 de AAV-1 y/o con
secuencias 5' ITR de AAV-1 utilizando técnicas
convencionales. La provisión de funciones auxiliares de AAV a las
líneas celulares transfectadas de la invención da como resultado un
empaquetamiento del rAAV como partículas de rAAV infecciosas. Tales
líneas celulares pueden ser producidas de acuerdo con técnicas
conocidas [véase, por ejemplo, la Patente U.S. núm. 5.658.785],
haciendo uso de las secuencias de AAV-1 de la
invención.
Alternativamente, las células huésped de la
invención pueden ser transfectadas de forma estable con un casete
de expresión de rAAV de la invención, y con copias de genes rep y
cap de AAV-1. Las líneas celulares paternas
incluyen las líneas celulares de mamíferos, y puede ser deseable
seleccionar células huésped entre células de mamíferos no símicos.
Ejemplos de líneas celulares paternas adecuadas incluyen, sin
limitación, células HeLa [ATCC CCL 2], A549 [ATCC Acceso Núm. CCL
185], KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72], y
WI-38 [CCL 75]. Estas líneas celulares están todas
disponibles en la American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 2209 USA. Otras
líneas celulares paternas adecuadas pueden ser obtenidas a partir
de otras fuentes y pueden ser utilizadas para construir líneas
celulares estables que contengan P5 y/o secuencias rep y cap de AAV
según la invención.
Los vectores recombinantes generados según se ha
descrito en lo que antecede, son útiles para el suministro del ADN
de interés a las células.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para el suministro de un transgén a un
huésped, que incluye transfectar o infectar una célula huésped
seleccionada con un vector viral recombinante generado con las
secuencias de AAV-1 (o fragmentos funcionales del
mismo) de la invención. Los métodos para el suministro son bien
conocidos por los expertos en la materia, y no constituyen ninguna
limitación de la presente invención.
En una realización deseable, la invención
proporciona un procedimiento para el suministro mediato de AAV, de
un transgén a un huésped. Este procedimiento incluye transfectar o
infectar una célula huésped seleccionada con un vector viral
recombinante que contenga un transgén seleccionado bajo el control
de secuencias que dirigen la expresión del mismo, y proteínas de
cápside de AAV-1.
Opcionalmente, se puede someter a ensayo una
muestra del huésped durante la presencia de anticuerpos respecto a
un serotipo de AAV seleccionado. Los expertos en la materia son
conocedores de una diversidad de formatos de ensayo para detectar
anticuerpos neutralizantes. La selección de tal ensayo no
constituye una limitación de la presente invención. Véase, por
ejemplo, Fischer et al., Nature Med., 3(3):
306 - 312 (Marzo de 1997), y W.C. Manning et al., Human
Gene Therapy, 9:477 - 485 (1 de Marzo de 1998). Los resultados
de este ensayo pueden ser utilizados para determinar que el vector
de AAV que contenga proteínas de cápside de un serotipo particular,
es el preferido para el suministro, por ejemplo, en virtud de la
ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para ese
serotipo de cápside.
En otro aspecto de este procedimiento, el
suministro de vector de proteínas de cápside de
AAV-1 puede preceder o seguir al suministro de un
gen a través de un vector con una proteína de cápside de AAV de
serotipo diferente. De ese modo, el suministro de gen a través de
vectores rAAV, puede ser utilizado para repetir el suministro de gen
a una célula huésped seleccionada. Deseablemente, los vectores de
rAAV administrados posteriormente llevan el mismo transgén que el
primer vector de rAAV, pero los vectores administrados
posteriormente contienen proteínas de cápside de serotipos que
difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene
proteínas de cápside de AAV-2, los vectores
administrados con posterioridad pueden tener proteínas de cápside
seleccionadas entre los otros serotipos, incluyendo
AAV-1, AAV-3A,
AAV-3B, AAV-4 y
AAV-6.
De ese modo, un vector viral recombinante
derivado de rAAV-1 de la invención, proporciona un
vehículo eficaz de transferencia de gen que puede suministrar un
transgén seleccionado a una célula huésped seleccionada in
vivo o ex vivo incluso aunque el organismo tenga
anticuerpos neutralizantes respecto a uno o más serotipos AAV. Estas
composiciones son particularmente muy adecuadas para el suministro
de genes con fines terapéuticos. Sin embargo, las composiciones de
la invención pueden ser también útiles en inmunización. Además, las
composiciones de la invención pueden ser utilizadas también en la
producción de un producto genético deseado in vitro.
Los vectores recombinantes descritos en lo que
antecede, pueden ser suministrados a células - huésped de acuerdo
con métodos publicados. Un vector viral de AAV que lleve el
transgén seleccionado, puede ser administrado a un paciente, con
preferencia suspendido en una solución biológicamente compatible o
en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un
vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Otras soluciones
de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que los expertos en la
materia conocen bien que constituyen portadores farmacéuticamente
aceptables, pueden ser empleadas a los efectos mencionados.
Los vectores virales son administrados en
cantidades suficientes para transfectar las células y proporcionar
niveles suficientes de transferencia y expresión de gen, para
proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos
indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que
pueden ser determinados por los expertos en técnicas médicas. Las
vías de administración convencionales y farmacéuticamente
aceptables incluyen, aunque sin limitación, el suministro directo
al hígado, la vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intradérmica, y otras vías paternas de administración.
Las vías de administración pueden ser combinadas, si se desea.
Las dosificaciones del vector viral dependerán
principalmente de factores tales como la condición que ha de ser
tratada, la edad, el peso y las condiciones de salud del paciente,
y pueden variar por tanto entre pacientes. Por ejemplo, una
dosificación humana terapéuticamente efectiva del vector viral está
comprendida en general en la gama de entre aproximadamente 1 ml y
aproximadamente 100 ml de una solución que contenga concentraciones
de entre aproximadamente 1 x 10^{9} hasta 1 x 10^{16} genomas
de vector viral. Una dosificación humana preferida puede ser desde
aproximadamente 1 x 10^{13} hasta 1 x 10^{16} genomas de AAV.
La dosificación será ajustada para equilibrar el beneficio
terapéutico frente a cualesquiera efectos colaterales y tales
dosificaciones pueden variar dependiendo de la aplicación
terapéutica en la que se emplee el vector recombinante. Los niveles
de expresión del transgén pueden ser monitorizados para determinar
la frecuencia de la dosificación que dé como resultado vectores
virales, con preferencia vectores AAV que contengan el
mini-gen. Opcionalmente, regímenes de dosificación
similares a los descritos con fines terapéuticos, pueden ser
utilizados a efectos de inmunización utilizando las composiciones
de la invención. Para producción in vitro, se puede obtener
una proteína deseada a partir de un cultivo deseado a continuación
de la transfección de células huésped con un rAAV que contenga el
gen que codifica la proteína deseada, y cultivando el cultivo
celular bajo condiciones que permitan la expresión. La proteína
expresada puede ser purificada a continuación y aislada, según se
desee. Las técnicas adecuadas para transfección, cultivo celular,
purificación y aislamiento, son bien conocidas por los expertos en
la materia.
Los ejemplos que siguen ilustran varios aspectos
y realizaciones de la invención.
La forma de ADN replicada de
AAV-1 fue extraída a partir de células 293 que
fueron infectadas. por el AAV-1 y por el tipo 5 de
adenovirus de tipo salvaje.
Se suministraron células 293 libres de AAV y
células 84-31 mediante el laboratorio de
aplicaciones humanas de la Universidad de Pennsylvania. Estas
células fueron cultivadas en Medio Eagle Modificado de Dulbecco con
un 10% de suero bovino fetal (Hyclone), penicilina (100 unidades) y
estreptomicina a 37ºC en un ambiente húmedo alimentado con un 5% de
CO_{2}. La línea de células 84-31 expresa
constitutivamente genes de adenovirus E1a, E1b, E4/ORF6, y ha sido
descrita previamente [K.J. Fisher, J. Virol., 70: 520 - 532
(1996)]. La cepa de cultivo fue adquirida en American Type Culture
Collection (ATOC, Manassas, VA). Los virus AAV fueron propagados en
células 293 con Ad5 de tipo salvaje como virus auxiliar.
Los virus AAV recombinantes fueron generados por
transfección utilizando un procedimiento libre de adenovirus. De
forma resumida, el plásmido cis (con la ITR de AAV), el plásmido
trans (con el gen rep y el gen cap de AAV), y el plásmido auxiliar
(pF\Delta13, con regiones esenciales del genoma de adenovirus),
fueron co-transfectados simultáneamente en células
293, en una relación de 1:1:2 mediante precipitación de fosfato de
calcio. El plásmido auxiliar pF\Delta13 tiene una supresión de 8
kb en la región E28 de adenovirus, y tiene supresiones en la mayor
parte de los genes extinguidos. Este plásmido auxiliar fue generado
por supresión del fragmento Rsrll del pFG140 (Microbix, Canadá).
Típicamente, 50 \mug de ADN (cis:trans:pF\Delta13 en relaciones
de 1:1:2, respectivamente), fueron transfectados en un disco de
cultivo de tejido de 15 cm. Las células fueron cultivadas durante
96 horas post-transfección, sonicadas y tratadas con
desoxicolato de sodio al 0,5% (37ºC durante 10 minutos). Los lisatos
celulares fueron sometidos a continuación a dos rondas de un
gradiente de CsCl. Las fracciones de pico que contenían vector AAV,
fueron recogidas, estancadas y dializadas frente a PBS con
anterioridad a ser inyectadas en animales. Para hacer el virus rAAV
con el virión de AAV-1, se utilizó el pAV1H o el
p5E18 (2/1) como plásmido trans para proporcionar la función rep y
cap.
Para la generación de rAAV en base al
AAV-2, se utilizó el p5E18 como plásmido trans
puesto que mejoró considerablemente la producción de rAAV. Este
plásmido, el p5E18 (2/2), expresa Rep y Cap del
AAV-2, y contiene un promotor P5 recolocado en una
posición 3' respecto al gen Cap, minimizando con ello la expresión
de Rep 78 y de Rep 68. La estrategia fue descrita inicialmente por
Li et al., J. Virol., 71: 5236 - 5243 (1997). El PSE
18(2/2) fue formado de la manera siguiente. El vector trans
pMMMTV descrito previamente (es decir, el promotor de virus de
tumor mamario de ratón sustituido por el promotor P5 en el vector
basado en AAV-2), fue elaborado con SmaI y
CiaI, rellenado con enzima Klenow, y a continuación
recirculado con ligasa de ADN. La formación resultante fue
elaborada con Xbal, rellenada y ligada al segmento
BamHI-XbaI de extremo romo del
pCR-p5 construido de la siguiente manera. El
promotor P5 de AAV, fue amplificado mediante PCR y el fragmento
amplificado fue clonado posteriormente en pCR2.1 (Invitrogen) para
producir pCR-P5. El plásmido auxiliar pAV1H fue
formado clonando el fragmento BfaI de pAAV-2
en pBluescript II-SK(+) en los sitios BoorV y
SmaI. El fragmento 3.0-kb XbaI -
KpnI del p5E18(2/2), el fragmento
2.3-kb XbaI - KpnI del
pAV-1H, y el fragmento 1.7-kb KpnI
del p5E18(2/2) fueron incorporados en un plásmido
P5E18(2/1) separado, que contiene AAV-2 Rep,
AAV-1 Cap, y el promotor P5 de AAV-2
localizado en 3' respecto al gen Cap. El plásmido p5E18(2/1)
produjo cantidades entre 10 y 20 veces mayores que el vector pAV1H
(es decir, 10^{12} genomas/ 50 placas de 15 cm^{2}).
La extracción de ADN se realizó según se ha
descrito en la técnica con una modificación menor [R.J. Samulski
et al., Cell, 33: 135 - 143 (1983)]. En particular, se
utilizó solución Hirst sin SDS en vez de usar solución Hirt
original que contiene SDS. La cantidad de SDS presente en la
solución Hirst original fue añadida después de que las células
habían sido completamente suspendidas. Para formar el clon
infeccioso de AAV-1, el ADN Hirt de las células 293
infectadas del AAV-1, se reparó con enzima Klenow
(New England Biolabs), para asegurar que los extremos eran romos.
El ADN Hirt del AAV-1 tratado, fue elaborado a
continuación con BamHI y clonado en tres vectores,
respectivamente. El BamHI interno fue clonado en pBlueScript
II-SK+ cortado con BamHI + EcoRV para
obtener pAV1-BL y pAV-BR,
respectivamente. Las secuencias de AAV en estos tres plásmidos
fueron ensambladas posteriormente en el mismo vector para obtener
el clon pAAV-1 infeccioso del
AAV-1. El plásmido auxiliar para la generación de
virus AAV-1 recombinante, fue formado mediante
clonación del fragmente Bfa I de pAAV-1 en
pBlueScript II-SK+ en el sitio EcoRV.
El análisis del ADN Hirt reveló tres bandas, un
dímero a 9.4 kb, un monómero a 4.7 kb, y ADN de cadena simple a 1.7
kb, que se correlacionan con diferentes formas de replicación del
AAV-1. La banda de monómero fue extirpada del gel y
elaborada a continuación con BamHI. Esto dio como resultado
tres fragmentos de 1.1 kb, 0.8 kb y 2.8 kb. Este patrón es conforme
con la descripción de Bantel-schaal y zur Hausen,
Virol., 134(1): 52 - 63 (1984). Los fragmentos de
BamHI 1.1 kb y 2.8 kb fueron clonados en
pBlueScript-KS(+) en el sitio BamHI y EcoRV.
El fragmento interno 0.8 kb fue clonado en el sitio BamHI de
pBlueScript-KS(+).
Estos tres fragmentos fueron
sub-clonados después con la misma construcción para
obtener un plásmido (pAAV-1) que contenía la
secuencia de AAV-1 completa. El
AAV-1 fue probado a continuación respecto a su
capacidad de rescate a partir del esqueleto de plásmido y del virus
infeccioso de empaquetamiento. El pAAV-1 fue
transfectado a continuación en células 293 y suministrado con tipo
adenovirus como auxiliar en MOI 10. El virus sobrenadante fue
utilizado para reinfectar células 293.
Para análisis de mancha Southern, el ADN Hirt
fue elaborado con DpnI para extraer el plásmido de soporte
de bacterias, y se probó con el fragmento BamHI interno del
AAV-1. La membrana fue lavada a continuación en
condiciones de alta severidad, que incluían: dos veces durante 30
minutos con 2X SSC, 0,1% SDS a 65ºC, y dos veces durante 30 minutos
con 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65ºC. La membrana fue analizada a
continuación tanto mediante imagen de fósforo como con
auto-radiografía de rayos X. Los resultados
confirmaron que el pAAV-1 es, en efecto, un clon
infeccioso del serotipo 1 de AAV.
El genoma completo del AAV-1 fue
determinado a continuación mediante secuenciamiento automático y se
encontró que tenía 4718 nucleótidos de longitud (Figuras 1A - 1C).
Para el secuenciamiento, se utilizó un secuenciador automático ABI
373 para determinar las secuencias para todos los plásmidos y
fragmentos PCR relacionados con este estudio con la utilización de
la química del color FS. Todas las secuencias fueron confirmadas
mediante secuenciamiento tanto de más como de menos cadenas. Estas
secuencias fueron también confirmadas por secuenciamiento de dos
clones independientes de pAV-BM,
pAV-BL y pAV-BR Puesto que la forma
replicada del ADN de AAV-1 sirvió como plantilla
para la determinación de secuencia, estas secuencias fueron también
confirmadas por secuenciamiento de una serie de productos PCR
utilizando cepas de cultivo de AAV-1 originales como
plantilla.
Se encontró que la longitud del
AAV-1 estaba dentro de la gama de otros serotipos:
AAV-3 (4726 nucleótidos), AAV-4
(4774 nucleótidos), AAV-2 (4681 nucleótidos), y
AAV-6 (4683 nucleótidos).
El genoma de AAV-1 mostró
similitudes con otros serotipos de adenovirus asociados. Sobre
todo, comparte una identidad de más del 80% con otros virus AAV
conocidos según se ha determinado mediante el programa de ordenador
Magalign que hace uso de regulaciones por defecto [DNASTAR,
Madison, WI). Las características clave en el AAV-2
pueden ser encontradas también en el AAV-1. En
primer lugar, el AAV-1 tiene el mismo tipo de
repetición terminal invertida que es capaz de formar estructuras de
horquilla en forma de T, a pesar de las diferencias en el nivel de
nucleótido (Figuras 2 y 3). Las secuencias de las ITRs de la
derecha y de las ITRs de la izquierda, son idénticas. La secuencia
TR de AAV está subdividida en A, A', B, B', C, C', D y D' (Bern,
citado anteriormente).
Estas secuencias ITR de AAV son también
virtualmente las mismas que las encontradas en la ITR derecha del
AAV-6, existiendo una diferencia de un nucleótido
en cada una de las secuencias A y A', y el último nucleótido de la
secuencia D. En segundo lugar, el motivo de enlace rep del
AAV-2 [GCTCGCTCGCTCGCTG (SEQ ID NÚM. 20)], se
conserva bien. Tal motivo puede ser encontrado también en la región
de pre-integración de AAV-2 del
cromosoma 19 humano. Finalmente, regiones de codificación
estructural y no estructural, y elementos reguladores similares a
los de otros serotipos de AAV, existen también en el genoma de
AAV-1.
Aunque las características globales de las
repeticiones terminales de AAV están muy conservadas, la longitud
total de la repetición terminal de AAV muestra divergencia. La
repetición terminal del AAV-1 consiste en 143
nucleótidos mientras que las de los AAV-2,
AAV-3 y AAV-4 son de alrededor de
145 ó 146 nucleótidos. La región de bucle de la ITR de
AAV-1 se asemeja más cercanamente que la de la
AAV-4 debido a que utiliza también TCT en vez del
TTT encontrado en el AAV-2 y en el
AAV-3. La posibilidad de error de secuenciamiento
fue eliminada con la utilización de digestión de enzima de
restricción, puesto que estos tres nucleótidos son parte del sitio
Saci (gagctc; nt 69-74 de SEQ ID NÚM. 1). La región
promotora p5 del AAV-1 muestra más variaciones en
las secuencias de nucleótido con otros serotipos de AAV. Sin
embargo, mantiene aún los elementos reguladores críticos. Las dos
copias de los sitios YY 1 [véanse las Figuras 1A - 1C] parecen estar
reservadas en todos los serotipos AAV conocidos, que se ha
demostrado que están involucrados en la regulación de la expresión
de gen del AAV. En el AAV-4, existen 56 nucleótidos
adicionales insertados entre YY1 y el sitio
E-box/USF, mientras que en el AAV-1
existen 26 nucleótidos adicionales insertados con anterioridad en
el sitio E-box/USF. El promotor p19, el promotor
p40 y el poliA, pueden ser también identificados a partir del
genoma de AAV-1 por analogía con serotipos AAV
conocidos, que también son considerablemente conservados.
De ese modo, el análisis de repeticiones
terminales de AAV de diversos serotipos mostró que la secuencia A y
la A' están muy conservadas. Una de las razones puede ser el motivo
de enlace Rep (GCTC)_{3}GCTG [SEQ ID NÚM. 20]. Estas
secuencias parecen ser esenciales para la replicación del ADN del
AAV y la integración específica del sitio. La misma secuencia ha
demostrado también ser conservada en un genoma de mono [Samulski,
comunicación personal]. Los 8 primeros nucleótidos de la secuencia
D son también idénticos en todos los serotipos de AAV conocidos.
Esto está de acuerdo con la observación del grupo Srivastava de que
solamente los 10 primeros nucleótidos son esenciales para el
empaquetamiento del AAV [X.S. Wang et al., J. Virol.,
71: 3077 - 3082 (1997); X.S. Wang et al., J. Virol,
71: 1140 - 1146 (1997)]. La función del resto de las secuencias D
sigue siendo todavía poco clara. Las mismas pueden ser relacionadas
en alguna medida con sus especificidades de tejido. La variación de
nucleótido en las secuencias B y C puede sugerir también que la
estructura secundaria de las ITRs es más crítica para su función
biológica, lo que ha sido demostrado en muchas publicaciones
previas.
Las secuencias de nucleótido del
AAV-1, obtenidas según se ha descrito en lo que
antecede, fueron comparadas con secuencias de AAV conocidas,
incluyendo la AAV-2, AAV-4 y
AAV-6, utilizando ADN Star Megalign. Esta
comparación puso de manifiesto una extensión de 71 nucleótidos
idénticos compartidos por AAV-1,
AAV-2 y AAV-6. Véanse las Figuras
1A - 1C.
Esta comparación sugirió además que el
AAV-6 es un híbrido formado por recombinación
homóloga de AAV-1 y de AAV-2. Véanse
las Figuras 3A y 3B. Estos nucleótidos dividen el genoma
AAV-6 en dos regiones. La mitad 5' del
AAV-6 de 522 nucleótidos, es idéntica a la del
AAV-2 salvo en 2 posiciones. La mitad 3' del
AAV-6, incluye la mayor parte del gen rep, el gen
cap completo y la ITR 3' es idéntica en un 98% al
AAV-1.
Biológicamente, tal recombinación puede permitir
que el AAV-1 adquiera la capacidad de transmitirse
a través de la población humana. También es interesante observar
que las ITRs del AAV-6 comprenden una ITR de
AAV-1 y una ITR de AAV-2. El modelo
de replicación de parvovirus defectuoso puede conservar esta
disposición especial. Los estudios sobre la integración del AAV han
mostrado que una mayoría de los integrantes de AAV portan
supresiones en al menos una de las repeticiones terminales. Se ha
demostrado que estas supresiones son susceptibles de ser reparadas
mediante conversión de gen utilizando la otra repetición terminal
intacta como plantilla. Por lo tanto, sería difícil mantener el
AAV-6 como una población homogénea cuando se rescata
una copia integrada de AAV-6 de las células huésped
con infección de virus auxiliar. El AAV-6 con dos
ITRs de AAV-2 idénticas o con dos ITRs de
AAV-1 idénticas, serían las variantes dominantes. El
AAV-6 con dos ITRs de AAV-1 ha sido
observado por el grupo de Russell [Rutledge, citado en lo que
antecede (1998)]. No existe, sin embargo, ningún informe sobre un
AAV-6 con dos ITRs de AAV-2. La
adquisición de promotor P5 de AAV-2 mediante
AAV-6, puede haber explicado que el
AAV-6 haya sido aislado con origen humano, mientras
que el AAV-1 con el mismo virión no lo ha sido. La
regulación de promotor P5 entre diferentes especies de AAV, puede
ser diferente in vivo. Esta observación sugiere que las
proteínas de cápside del AAV no fueron los únicos determinantes
para la especificidad del tejido.
Aunque está claro que el AAV-6
es un híbrido de AAV-1 y AAV-2, el
AAV-6 ha mostrado ya divergencia con cualquiera de
los AAV-1 y AAV-2. Existen dos
diferencias de nucleótido entre el AAV-6 y el
AAV-2 en sus primeros 450 nucleótidos. Existe
alrededor del 1% de diferencias entre el AAV-6 y el
AAV-1 en cuanto a niveles de nucleótido desde los
nucleótidos 522 hasta el extremo 3'. También existe una región
absolutamente divergente (nucleótido 4486 - 4593) entre el
AAV-6 y el AAV-1 (Figuras 1A - 1C).
Esta región no codifica ninguna proteína conocida para los AAVs.
Estas diferencias en cuanto a secuencias de nucleótidos pueden
sugerir que el AAV-6 y el AAV-1 han
experimentado alguna evolución desde que la recombinación tuvo
lugar. Otra posible explicación consiste en que existen otras
variantes de AAV-1 que no han sido todavía
identificadas. Así, no existe ninguna evidencia para descartar
ninguna posibilidad. Se desconoce aún si otros híbridos
(AAV-2 a AAV-4, etc) han existido en
la naturaleza.
La región de codificación del
AAV-1 fue deducida por comparación con otros
serotipos AAV conocidos. La Tabla 1 ilustra las diferencias de la
región de codificación entre el AAV-1 y el
AAV-6. Los residuos de aminoácido se deducen de
acuerdo con AAV-2.
Con referencia a la posición de aminoácido del
AAV-1, la Tabla 1 relaciona los aminoácidos de
AAV-1 que han sido cambiados con los
correspondientes del AAV-6. Los aminoácidos del
AAV-1 se muestran a la izquierda de la flecha. Se
puede hacer referencia a SEQ ID NÚM. 5 de la secuencia de
aminoácido del rep 78 de AAV-1 y a SEQ ID NÚM. 13
para la secuencia de aminoácido VP1 de AAV-1.
Ha sido sorprendente observar que la secuencia
de la región de codificación del AAV-1 es casi
idéntica a la del AAV-6 desde la posición 452 hasta
el final de la región de codificación (99%). Los primeros 508
nucleótidos del AAV-6 se ha demostrado que son
idénticos a los del AAV-2 [Rutledge, citado
anteriormente (1998)]. Puesto que los componentes del genoma de
AAV-6 parecían ser promotor de la ITR izquierda
de AAV-2 - p5 de AAV-2 -
región de codificación de AAV-1 - ITR
derecha de AAV-1, se concluyó que el
AAV-6 es un hibrido que se produce de forma natural
entre el AAV-1 y el AAV-2.
Los vectores de transferencia de gen
recombinante basados en AAV-1 fueron construidos
mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1. Para producir un
virus recombinante híbrido con el virión AAV-1 y la
ITR de AAV-2, se utilizó el plásmido trans de
AAV-1 (pAV1H) y el plásmido
cis-lacZ de AAV-2 (con la ITR del
AAV-2). Se utilizó la ITR del AAV-2
en este vector en vista de su conocida capacidad para dirigir la
integración específica del sitio. También se construyó para su uso
en este experimento el vector de AAV-1 que porta el
gen marcador de proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control
del promotor anterior inmediato de CMV utilizando pAV1H como
plásmido trans.
Células 84-31(que
expresan adenovirus E1a, E1b) que expresan establemente E4/ORFS,
fueron infectadas con rAAV-1 GFP o
rAAV-lacZ. Se detectaron altos niveles de expresión
de GFP y de lacZ en las células 84-31 cultivadas.
Esto sugirió que el vector basado en rAAV-1 era muy
similar a los vectores basados en AAV-2 en cuanto a
capacidad de infectar y a niveles de expresión.
Se comprobó el rendimiento de vectores basados
en AAV-1 in vivo. El fragmento EcoRI de
paT85 (ATCC) que contiene el fragmento de cADN de
\alpha1-antitripsina (\alpha1AT), fue truncado y
clonado en PCR (Promega) en un sitio Smal par obtener
PCR-\alpha1AT. El promotor CMV fue clonado en
PCR-\alpha1AT en el sitio XbaI. El casete de
expresión de Alb-\alpha1AT fue retirado mediante
XhoI y CiaI y clonado en PAV1H en el sitio XbaI. El plásmido de
vector fue utilizado para generar el virus
AAV-1-CMV-\alpha1AT
utilizado en el experimento que se describe a continuación.
Para blindar anticuerpos humanos frente al AAV,
el virus AAV purificado fue disuelto con solución amortiguadora
Ripa (10 mM Tris pH 8,2, 1% Triton X-100, 1% SDS,
0,15% M NaCl) y se separó en gel SDS-PAGE al 10%.
El suero humano inactivado con calor, fue utilizado a una dilución
de 1 a 1000 en este ensayo. Los virus rAAV-1
CMV-\alpha1AT fueron inyectados en ratones
Rag-1 mediante inyección en la vena del rabo a
distintas dosificaciones. Se midió la concentración de
\alpha1-antitripsina humana en el suero de ratón
utilizando ELISA. El anticuerpo de recubrimiento es
\alpha1-antitripsina humana
anti-humana de conejo (Sigma). La
\alpha1-antitripsina anti-humana
de cabra (Sigma) fue utilizada como anticuerpos de detección
primaria. La sensibilidad de este ensayo va desde alrededor de 0,3
ng/m1 hasta 30 ng/ml. La expresión de la
\alpha-antitripsina humana en la sangre del ratón
pudo ser detectada a un nivel muy alentador. Este resultado se
muestra en la Tabla 2.
Los virus rAAV-1
CMV-lacZ fueron también inyectados en el músculo de
ratones C57BL6 y se obtuvieron resultados similares. En conjunto,
estos resultados sugirieron que el vector basado en
AAV-1 podría ser apropiado para el suministro de
genes tanto al hígado como al músculo.
Ensayos simples y cuantitativos en cuanto a
anticuerpos de neutralización (NAB) respecto a
AAV-1 y AAV-2, fueron desarrollados
con vectores recombinantes. Se protegieron un total de 33 monos
Rhesus y 77 sujetos humanos normales.
Monos rhesus jóvenes capturados salvajes fueron
adquiridos en Covance (Atice, Tex) y LABS de Virginia (Yemassee,
SC) y mantenidos en cuarentena total. Los monos pesaban
aproximadamente entre 3 y 4 kg. Los primates no humanos utilizados
en el programa de investigación del Instituto para Terapia Genética
Humana, han sido criados a propósito en los Estados Unidos
procedentes de colonias cerradas libres de patógenos específicos.
Todos los proveedores son comerciantes de clase A del Departamento
de Agricultura de los Estados Unidos. Los macacos rhesus no están,
por lo tanto, infectados con patógenos símicos importantes,
incluyendo agentes de la tuberculosis, lentivirus símicos
importantes (virus de inmunodeficiencia símico y retrovirus
símico), y herpevirus cercopitecine. Los animales están también
libres de parásitos externos e internos. El excelente estado de
salud de estos animales mejorados, minimizaron el potencial de
variables extrañas. Para este estudio, el suero se obtuvo de los
monos con anterioridad a la iniciación de cualquier protocolo.
Se analizaron los títulos NAB evaluando la
capacidad del anticuerpo de suero para inhibir la transducción de
virus informador que expresa proteína fluorescente verde (GFP)
(AAV1-GFP o AAV2-GFP) en células
84-31. Diversas diluciones de anticuerpos incubadas
con virus informador durante 1 hora a 37ºC fueron añadidas a
cultivos de células confluentes al 90%. Las células fueron
incubadas durante 48 horas y la expresión de proteína fluorescente
verde fue medida mediante FluoroImaging (Molecular Dynamics). Los
títulos NBA fueron calculados como la dilución más alta a la que el
50% de las células se mancharon de verde.
El análisis de NBA en monos rhesus demostró que
el 61% de los animales probados dieron positivo respecto al
AAV-1; una minoría (el 24%) tuvo NAB en el
AAV-2. Alrededor de una tercera parte de los
animales tenía anticuerpos respecto al AAV-1 pero no
al AAV-2 (es decir, fueron
mono-específicos para el AAV-1),
mientras que ninguno de los animales dio positivo en cuanto a
AAV-2 sin reaccionar con el AAV-1.
Estos datos apoyan la hipótesis de que el AAV-1 es
endémico en los monos rhesus. La presencia de verdaderas
infecciones de AAV-2 en este grupo de primates no
humanos, es menos clara, puesto que no se pudo determinar actividad
neutralizante cruzada de respuesta del AAV-1 frente
al AAV-2. Es interesante que exista una relación
lineal entre el NAB de AAV-2 y el NAB de
AAV-1 en animales que tenían ambos.
Para estos ensayos de anticuerpos de
neutralización, se incubaron muestras de suero humano a 56ºC
durante 30 minutos para desactivar el complemento, y se diluyeron
en DMEM. El virus (rAAV o rAd, con lacZ o con GFP), fue mezclado a
continuación con cada dilución de suero (20X, 400X, 2000X, 4000X,
etc), y se incubó durante 1 hora a 37ºC con anterioridad a ser
aplicado a cultivos confluentes al 90% de células
84-31 (para AAV) o células Hela (para adenovirus) en
placas de 98 cavidades. Después de 80 minutos de incubación en las
condiciones de cultivo, se añadieron 100 \mul de medio adicional
que contenía el 20% de FCS, para hacer que el medio de cultivo
final tuviera el 10% FCS.
El resultado se ha resumido en la Tabla 3.
Los anticuerpos de neutralización humana frente
a estos tres virus, pareció no estar relacionada puesto que la
existencia de anticuerpos de neutralización frente al AAV no es una
indicación para los anticuerpos contra el adenovirus. Sin embargo,
el AAV requiere adenovirus como virus auxiliar; en la mayor parte
de los casos, los anticuerpos neutralizantes frente el AAV están
correlacionados con la existencia de anticuerpos neutralizantes
respecto al adenovirus. Entre las 77 muestras de suero humano
protegidas, el 41% de las muestras pudo neutralizar la capacidad
infecciosa del adenovirus recombinante basado en Ad5. Otras 15/77
(19%) de las muestras de suero pudieron neutralizar la transducción
del rAAV-1 mientras que 20/77 (el 20%) de las
muestras inhiben la transducción de rAAV-2 en 1 a 80
diluciones o más. Todas las muestras de suero positivas en cuanto a
anticuerpos de neutralización para el AAV-1, son
también positivas para el AAV-2. Sin embargo,
existen cinco (el 6%) muestras positivas de rAAV-2
que fallaron en cuanto a neutralizar el rAAV-1. En
muestras que son positivas para anticuerpos de neutralización, el
título de anticuerpos varió también en las positivas. Los
resultados para la protección del suero humano en cuanto a
anticuerpos contra los AAVs llevaron a la conclusión de que el
AAV-1 presenta el mismo epítome que el
AAV-2 para interactuar con receptores celulares,
puesto que los sueros humanos neutralizantes del
AAV-1 pueden reducir también la capacidad
infecciosa del AAV-2. Sin embargo, el perfil de
anticuerpos neutralizantes para estos AAVs no es idéntico,
existiendo receptores específicos adicionales para cada serotipo de
AAV.
Los vectores AAV-1 recombinantes
de la invención y los vectores AAV-2 recombinantes
[que contienen el gen que codifica la
\alpha1-antitripsina humana (\alpha1AT) o murina
eritropoletina (Epo) a partir de un promotor de
\beta-actin incrementado de citomegalovirus (CB)],
fueron evaluados por comparación directa con copias equivalentes de
vectores AAV-2 que contenían los mismos genes
vectoriales.
Los virus recombinantes con cápside de
AAV-1, fueron construidos utilizando las técnicas
del Ejemplo 1. Para hacer el rAAV con viriones de
AAV-1, se utilizó el pAV1H o el p5E18 (2/1) como
plásmido trans para proporcionar las funciones Rep y Cap. Para la
generación del rAAV en base al AAV-2, se utilizó p5E
18(2/2) como plásmido trans, debido a que con ello se
mejoraba considerablemente la producción de rAAV. [Los experimentos
iniciales indicaron comportamientos similares in vivo de los
vectores AAV-1 producidos con pAV1H y p5E 19 (2/1).
Todos los estudios posteriores utilizaron vectores
AAV-1 derivados del p5E 18(2/1) debido a que
ello incrementaba la producción].
Cepas equivalentes de los vectores
AAV-1 y AAV-2 fueron inyectadas
intramuscularmente (5 x 10^{10} genomas) o en el hígado a través
de circulación portal (1 x 10^{11} genomas) en ratones
inmunodeficientes, y los animales (cuatro grupos) fueron analizados
en el día 30 en cuanto a expresión de transgén. Véanse las Figuras
4A y 4B.
Los vectores AAV-2 produjeron
constantemente entre 10 y 50 veces más eritropoletina de suero, o
\alpha1-antitripsina, cuando se inyectaron en el
hígado, en comparación con el músculo. (Sin embargo, los genes
suministrados por el AAV-1 lograron niveles de
expresión aceptables en el hígado). Este resultado fue muy diferente
del correspondiente a los vectores AAV-1, con los
que la expresión muscular fue equivalente a, o mayor que, la
expresión del hígado. De hecho, el AAV-1 mejoró al
AAV-2 en el músculo cuando se administraron títulos
equivalentes basados en genomas.
Los ratones C57BL/6 (machos de 6 - 8 semanas de
edad, Jackson Laboratories), fueron analizados en cuanto a
transferencia genética mediata de AAV al hígado a continuación de
la inyección intra-esplénica vectorial (es decir,
con objetivo en el hígado). Un total de 10^{11} equivalentes de
genoma o vector rAAV-1 o AAV-2,
fueron inyectados en la circulación 100 \mul de solución salina
amortiguada. El primer vector contenía, o bien cápside de
AAV-1 o bien cápside de AAV-2, y
expresó \alpha1AT bajo el control del promotor de
\beta-actin de pollo (CB). El día 28 se
analizaron los sueros en cuanto a anticuerpos frente al
AAV-1 o al AAV-2, y se comprobaron
los niveles de suero \alpha1AT. Los animales fueron inyectados
con una formación de AAV-1 o de
AAV-2 que expresa eritropoletina (Epo, también bajo
el control del promotor CB). Un mes más tarde se analizaron los
sueros respecto al nivel de suero de Epo. Se analizaron los grupos
que siguen (Figuras 5A -5D).
En el Grupo 1, el vector 1 fue
AAV-2 que expresa \alpha1AT y el vector 2 fue
AAV-2 que expresa Epo. Los animales generaron
anticuerpos contra el AAV-2 a continuación de la
administración del primer vector, lo que evitó la administración
del vector basado en AAV-2. No hubo evidencia de
neutralización cruzada del anticuerpo con el
AAV-1.
En el Grupo 2, el vector 1 fue
AAV-1 que expresa \alpha1AT, mientras que el
vector 2 fue AAV-1 que expresa Epo. La
administración del primer vector dio como resultado una expresión
significativa de \alpha1AT en un mes, asociada a anticuerpos de
neutralización para el AAV-1. Los animales no
fueron readministrados con éxito con la formación de
AAV-1 que expresa Epo.
En el Grupo 3, se midió la efectividad de un
vector AAV-2 que expresa Epo, inyectado en un
animal sin afectación. Los animales fueron inyectados con PBS e
inyectados con vector AAV-2 Epo el día 28, y se
analizaron en cuanto a expresión Epo un mes más tarde. Se evaluaron
los anticuerpos neutralizantes el día 28 sin que se esperara ver
nada desde que recibieron el PBS con la primera inyección de
vector. Esto demuestra que en los animales sin afectación el
AAV-2 es muy eficiente en cuanto a transferencia
del gen Epo como demostró el alto nivel de suero Epo un mes más
tarde.
El Grupo 4 fue un experimento similar al del
Grupo 3 en el que los animales recibieron originalmente PBS para el
vector 1, y después el AAV-1 que expresó formación
Epo 28 días después. En el momento de la inyección del vector, no
existían obviamente anticuerpos respecto al AAV-1
ni al AAV-2. El vector a base de
AAV-1 fue capaz de generar una expresión
significativa de Epo cuando se midió un mes más tarde.
El Grupo 5 es un experimento de cruzamiento en
el que el vector inicial es AAV-2 que expresa
\alpha1AT, seguido de la formación de AAV-1 que
expresa Epo. Los animales, según se esperaba, fueron infectados
eficazmente con el vector AAV-2 que expresa
\alpha1AT como se muestra mediante los altos niveles de la
proteína en la sangre a los 28 días. Esto iba asociado a una
cantidad significativa de anticuerpos neutralizantes respecto al
AAV-2. De manera importante, los animales fueron
administrados sucesivamente con AAV-1 a continuación
del vector AAV-2 como se demuestra en virtud de la
presencia de Epo en el suero a los 28 días después de la
administración del segundo vector. En el momento de la
administración del vector, existía un alto nivel de anticuerpos de
neutralización de AAV-2, y una reacción de
cruzamiento muy baja respecto al AAV-1. El nivel de
Epo disminuyó ligeramente, debido probablemente a la pequeña
cantidad de reactividad cruzada. El Grupo 6 fue el experimento
opuesto al de cruzamiento, en el que el vector inicial estaba
basado en AAV-1, mientras que el segundo
experimento estuvo basado en AAV-2. El vector
AAV-1 condujo a expresión de gen significativa de
\alpha1AT, lo que también dio como resultado un alto nivel de
anticuerpos de neutralización de AAV-1. Los
animales fueron administrados muy eficientemente con
AAV-2 a continuación del vector
AAV-1 inicial, como evidenció el alto nivel de
Epo.
Un experimento sustancialmente idéntico se
realizó en el músculo, en el que se inyectaron 5 x 10^{10}
genomas en la parte anterior de la tibia de ratones C57BL6 como
modelo respecto a la terapia genética dirigida al músculo. Los
resultados se han ilustrado en las Figuras 6A - 6D, y son
esencialmente los mismos que para el hígado.
En resumen, este experimento demuestra la
utilidad de usar un vector AAV-1 en pacientes que
tienen anticuerpos preexistentes frente al AAV-2, o
que habían recibido inicialmente un vector AAV-2 y
necesitan una readministración.
Este ejemplo ilustra la construcción de vectores
AAV recombinantes que contienen las ITRs de AAV-1
de la invención.
Un plásmido cis de AAV-1 se
construye como sigue. Un fragmento 160 bp Xho-NruI
de AAV-1, que contiene la ITR 5' del
AAV-1, se obtiene a partir de
pAV1-BL. El pAV1-BL ha sido generado
según se describe en el Ejemplo 1. El fragmento
Xho-NruI se clona después en un segundo plásmido
pAV1-BL en el sitio XbaI, para dotar al plásmido con
dos ITRs de AAV-1. El transgén deseado se clona a
continuación en el pAV-1BL modificado en el sitio
NruI y BamHI, que se localiza entre las secuencias ITR del
AAV-1. El plásmido cis de AAV-1
resultante contiene ITRs de AAV-1 que flanquean al
transgén y carece de rep y cap funcionales de
AAV-1.
El AAV recombinante se produce mediante
transfección simultánea de tres plásmidos en células 293. Éstos
incluyen el plásmido cis de AAV-1 descrito en lo
que antecede; un plásmido trans que proporciona funciones rep/cap
de AAV y carece de ITRs de AAV; y un plásmido que proporciona
funciones auxiliares de adenovirus. Las funciones rep y/o cap
pueden ser proporcionadas en serotipo trans mediante
AAV-1 o en otro serotipo AAV, dependiendo del perfil
de inmunidad que se pretenda para el receptor. Alternativamente,
las funciones rep y cap pueden ser proporcionadas en serotipo cis
por el AAV-1 o en otro serotipo, dependiendo de
nuevo del perfil de inmunidad del paciente.
En una contrafección típica, 50 \mug de ADN
(cis:trans:auxiliar en una relación de 1:1:2, respectivamente), son
transfectados en un disco de cultivo de tejido de 15 cm. Las células
son cultivadas durante 96 horas post-transfección,
sonicadas y tratadas con desoxicolato de sodio al 0,5% (37ºC
durante 10 minutos). Los lisados celulares son sometidos después a
2-3 rondas de ultra-centrifugación
en un gradiente de cesio. Se recogen fracciones de pico que
contienen rAAV, se acumulan y se dializan frente al PBS. Una
producción típica es del orden de 1 x 10^{3} genomas / 10^{9}
células.
Utilizando este método, se preparó una
construcción de virus recombinante que contiene las ITRs de
AAV-1 que flanquean al transgén, con una cápside de
AAV-1. Otra construcción de virus recombinante que
contiene las ITRs del AAV-1 flanqueando al transgén,
se prepara con una cápside de AAV-2.
<110> Wilson, James M.
\hskip1cm Xiao, Weldong
\hskip1cm The Trustees of the University of
Pennsylvania
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ácido Nucleico de Serotipo I de
Adenovirus Asociado
\hskip1cm Secuencias, Vectores y Células
Huésped que los Contienen
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GNVPN.031PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/107,114
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-11-05
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentin Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4718
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (335) ... (2206)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2223) ... (4430)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 736
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1872
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1869)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1638)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1197)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(966)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (943)..(944)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> minor splice site
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2208)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 736
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1800
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1797)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 599
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1602)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm63
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> AAV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> aav-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> aav-6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> rep binding motif
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgctcgc tcgctg
\hfill16
Claims (23)
1. Un virus recombinante que tiene una cápside
de AAV-1 que comprende una proteína de
AAV-1 seleccionada entre vp1 de
AAV-1 que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID
NÚM. 13; vp2 de AAV-1 que tiene la secuencia de
aminoácido de SEQ ID NÚM. 15; vp3 de AAV-1 que
tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 17, y una molécula
heteróloga que comprende una secuencia 5' de repetición terminal
invertida (ITR) de AAV, un transgén, y una ITR 3' de AAV.
2. El virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la proteína vp1 de
AAV-1 está codificada por un ácido nucleico que
tiene al menos un 99% de identidad con los nucleótidos 2223 a 4431
de SEQ ID NÚM. 1.
3. El virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína vp2
de AAV-1 está codificada por un ácido nucleico que
tiene al menos el 99% de identidad con los nucleótidos 2634 a 4431
de SEQ ID NÚM. 1.
4. El virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína vp3
de AAV-1 está codificada por un ácido nucleico que
tiene al menos el 99% de identidad con los nucleótidos 2829 a 4431
de SEQ ID NÚM. 1.
5. El virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la ITR 5' y la
ITR 3' del AAV son el serotipo 2 de AAV.
6. El virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza
por un promotor regulable que dirige la expresión del transgén.
7. El virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho transgén
codificado es alfa-1-antitripsina o
eritropoletina.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
virus recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente
aceptable.
9. Uso de un virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para preparar un
medicamento útil para transducir una célula muscular.
10. Uso de un virus recombinante de acuerdo con
la reivindicación 9, en el que dicha medicamento se formula para su
administración intramuscular.
11. Uso de un virus recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un
medicamento útil para transducir una célula de hígado.
12. Uso de un virus recombinante de acuerdo con
la reivindicación 11, en el que dicho medicamento se formula para
su administración intravenosa.
13. Una célula huésped recombinante que
comprende el virus recombinante de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
14. Una célula huésped recombinante transformada
con una secuencia de ácido nucleico que expresa una o más proteínas
rep de AAV-1 seleccionadas entre rep 78 que tiene
la secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 5; rep 68 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 7; rep 52 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 9, y rep 40 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 11.
15. Una célula huésped recombinante transformada
con una secuencia de ácido nucleico que expresa una o más proteínas
cap de AAV-1 seleccionadas entre vp1 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 13; vp2 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 15, y vp3 que tiene la
secuencia de aminoácido de SEQ ID NÚM. 17.
16. Una célula huésped recombinante de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende una
secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de
AAV-1 seleccionada en el grupo consistente en:
(a) una ITR 5' que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 1 a 143 de SEQ ID NÚM. 1;
(b) una ITR 3' que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 4576 a 4718 de SEQ ID NÚM. 1, y
(c) una secuencia de ácido nucleico
complementaria con (a) o (b).
17. La célula huésped recombinante de acuerdo
con la reivindicación 16, en la que dicho vector comprende además
una ITR 3' de AAV-1 y una ITR 5' de
AAV-1.
18. La célula huésped recombinante de acuerdo
con la reivindicación 16 ó 17, en la que dicho vector comprende
además secuencias de adenovirus.
19. Un vector que codifica funciones auxiliares
de AAV-1, comprendiendo dicha molécula una región
de codificación rep de AAV y una región de codificación cap de AAV,
en el que dicha región de codificación cap comprende al menos un
miembro seleccionado en el grupo consistente en:
(a) vp1 que tiene la secuencia de ácido nucleico
de nt 2223 a 4431 de SEQ ID NÚM.
(b) vp2 que tiene la secuencia de ácido nucleico
de nt 2634 a 4432 de SEQ ID NÚM. 1, y
(c) vp3 que tiene la secuencia de ácido nucleico
de nt 2829 a 4432 de SEQ ID NÚM. 1.
20. Un vector que codifica funciones auxiliares
de AAV-1, comprendiendo dicha molécula una región
de codificación rep de AAV-1 y una región de
codificación cap de AAV, en el que dicha región de codificación rep
comprende una región de codificación rep de AAV que comprende al
menos un miembro seleccionado en el grupo consistente en:
(a) rep 78 que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 335 a 2304 de SEQ ID NÚM. 1;
(b) rep 68 que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 335 a 2272 de SEQ ID NÚM. 1, o el cADN
correspondiente a la misma;
(c) rep52 que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 1007 a 2304 de SEQ ID NÚM. 1, y
(d) rep 40 que tiene la secuencia de ácido
nucleico de nt 1007 a 2272 de SEQ ID NÚM. 1, o el cADN
correspondiente a la misma.
21. Una célula huésped transducida con un vector
recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a
20.
22. Una célula huésped de acuerdo con las
reivindicaciones 13 a 17 ó 21, transducida establemente con un
promotor P5 de AAV-1 que tiene la secuencia de nt
236 a 299 de SEQ ID NÚM. 1.
23. Uso de un virión de AAV, que comprende:
(a) una cápside que comprende al menos una
proteína de cápside codificada por un gen cap de
AAV-1 que tiene al menos el 99% de identidad con
los nucleótidos 2223 a 4431 de SEQ ID NÚM. 1, y
(b) una molécula de ADN que comprende un
transgén bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su
expresión para la preparación de un medicamento para el suministro
de un transgén a una célula huésped.
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|---|---|---|---|---|
| US6924128B2 (en) | 1994-12-06 | 2005-08-02 | Targeted Genetics Corporation | Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors |
| AU4645697A (en) | 1996-09-11 | 1998-04-02 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Aav4 vector and uses thereof |
| US6989264B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-01-24 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| ATE402254T1 (de) | 1998-05-28 | 2008-08-15 | Us Gov Health & Human Serv | Aav5 vektoren und deren verwendung |
| US6759237B1 (en) | 1998-11-05 | 2004-07-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same |
| ES2340230T3 (es) | 1998-11-10 | 2010-05-31 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Vectores viricos y sus procedimientos de preparacion y administracion. |
| US6627617B1 (en) | 1999-10-01 | 2003-09-30 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Temperature-sensitive regulation of viral vector production |
| DE10120265A1 (de) * | 2001-04-25 | 2002-11-14 | Deutsches Krebsforsch | AAV-Helferplasmide zur Helfervirus-freien Verpackung und Pseudotypisierung von AAV-Vektoren |
| NZ578982A (en) | 2001-11-13 | 2011-03-31 | Univ Pennsylvania | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
| AU2008202344B2 (en) * | 2001-11-13 | 2011-08-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
| CN112029800A (zh) * | 2001-11-13 | 2020-12-04 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法 |
| JP4769417B2 (ja) * | 2001-12-17 | 2011-09-07 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型９の配列、それを含むベクターおよびその使用 |
| ES2975413T3 (es) | 2001-12-17 | 2024-07-05 | Univ Pennsylvania | Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas |
| MXPA04008890A (es) | 2002-03-15 | 2005-10-18 | Wyeth Corp | Mutantes de la proteina p4 de haemophilus influenzae no tipicable con actividad enzimatica reducida. |
| US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
| US8927269B2 (en) | 2003-05-19 | 2015-01-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Avian adenoassociated virus and uses thereof |
| ES2648241T3 (es) | 2003-09-30 | 2017-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos |
| US8137960B2 (en) | 2003-12-04 | 2012-03-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Bovine adeno-associated viral (BAAV) vector and uses thereof |
| WO2006078279A2 (en) | 2004-04-28 | 2006-07-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations |
| EP1742657B1 (en) | 2004-04-28 | 2013-11-06 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost |
| NZ555830A (en) | 2004-12-15 | 2009-01-31 | Univ North Carolina | Chimeric vectors |
| US8999678B2 (en) | 2005-04-07 | 2015-04-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of increasing the function of an AAV vector |
| US8283151B2 (en) | 2005-04-29 | 2012-10-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (AAV) serotypes |
| WO2008016391A2 (en) * | 2006-01-31 | 2008-02-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same |
| US9198984B2 (en) | 2006-04-28 | 2015-12-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable production method for AAV |
| US8221738B2 (en) | 2008-02-19 | 2012-07-17 | Celladon Corporation | Method for enhanced uptake of viral vectors in the myocardium |
| EP2396343B1 (en) | 2009-02-11 | 2017-05-17 | The University of North Carolina At Chapel Hill | Modified virus vectors and methods of making and using the same |
| CN102448501A (zh) | 2009-03-27 | 2012-05-09 | 西马生物医学计划公司 | 治疗肝硬化和肝纤维化的方法和组合物 |
| BR112012010755A2 (pt) | 2009-11-05 | 2015-09-22 | Proyecto Biomedicina Cima Sl | constructo de gene que permite a expressão hepato-específica induzível de um polinucleotídeo de interesse em resposta a um agente indutor, vetor, genoma viral recombinante, vírion, método in vitro para a expressão de um polinucleotídeo de interesse em uma célula de origem hepática, composição farmacêutica e operador-promotor bi-direcional induzível adequado para a expressão hepato-específica induzível de dois polinucleotídeos de interesse por um agente indutor |
| EP2524037B1 (en) | 2010-01-12 | 2018-05-16 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors |
| US9309534B2 (en) | 2010-07-12 | 2016-04-12 | Universidad Autonoma De Barcelona | Gene therapy composition for use in diabetes treatment |
| JP5704361B2 (ja) * | 2010-10-27 | 2015-04-22 | 学校法人自治医科大学 | 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン |
| EP4234571A3 (en) | 2011-02-10 | 2023-09-27 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same |
| RS62795B1 (sr) | 2011-04-22 | 2022-02-28 | Univ California | Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu |
| EP2692868A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-05 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue |
| PL2900686T3 (pl) | 2012-09-28 | 2021-01-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Wektory aav ukierunkowane na oligodendrocyty |
| AU2014227766B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-04 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors |
| WO2014143932A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Synthetic adeno-associated virus inverted terminal repeats |
| EP3008191A2 (en) | 2013-06-13 | 2016-04-20 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Messenger rna based viral production |
| EP4039813A1 (en) * | 2013-07-12 | 2022-08-10 | The Children's Hospital of Philadelphia | Aav vector and assay for anti-aav (adeno-associated virus) neutralizing antibodies |
| US20160354489A1 (en) | 2013-09-26 | 2016-12-08 | Universitat Autònome de Barcelona | Gene therapy compositions for use in the prevention and/or treatment of non-alcoholic fatty liver disease |
| GB201403684D0 (en) | 2014-03-03 | 2014-04-16 | King S College London | Vector |
| PL3116900T3 (pl) | 2014-03-09 | 2021-03-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Kompozycje użyteczne w leczeniu niedoboru transkarbamylazy ornitynowej (otc) |
| US9458464B2 (en) | 2014-06-23 | 2016-10-04 | The Johns Hopkins University | Treatment of neuropathic pain |
| EP3194430A1 (en) | 2014-09-16 | 2017-07-26 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases |
| RU2727015C2 (ru) | 2014-11-21 | 2020-07-17 | Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Векторы aav, нацеленные на центральную нервную систему |
| ES2900973T3 (es) | 2015-01-07 | 2022-03-21 | UNIV AUTòNOMA DE BARCELONA | Constructo genético de vector individual que comprende genes de insulina y glucoquinasa |
| WO2016115382A1 (en) | 2015-01-14 | 2016-07-21 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for targeted gene transfer |
| KR102554850B1 (ko) | 2015-02-06 | 2023-07-13 | 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 | 최적화된 인간 응고 인자 viii 유전자 발현 카세트 및 그의 용도 |
| WO2017058892A2 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for antibody-evading virus vectors |
| RU2021102893A (ru) | 2015-11-05 | 2021-03-03 | Бамбу Терапьютикс, Инк. | Модифицированные гены атаксии фридрейха и векторы для генной терапии |
| ES2934848T3 (es) | 2015-12-11 | 2023-02-27 | Univ Pennsylvania | Método de purificación escalable para AAV8 |
| WO2017100704A1 (en) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aavrh10 |
| US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
| US11098286B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
| BR112018011881A2 (pt) | 2015-12-14 | 2018-12-04 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | proteínas capsidiais modificadas para liberação aumentada de vetores de parvovírus |
| FI3411484T3 (fi) | 2016-02-05 | 2023-11-15 | Univ Emory | Yksisäikeisen tai itsekomplementaarisen adenoassosioidun viruksen 9 injektio serebrospinaaliseen fluidiin |
| CN108697774A (zh) | 2016-02-22 | 2018-10-23 | 北卡罗来纳大学教堂山分校 | 治疗mps i-相关失明的aav-idua载体 |
| EP3449250B1 (en) | 2016-04-28 | 2020-11-04 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods and compositions for resolving components of a virus preparation |
| EP3448874A4 (en) * | 2016-04-29 | 2020-04-22 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE |
| EP3448875A4 (en) * | 2016-04-29 | 2020-04-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE |
| EP4049683A1 (en) | 2016-04-29 | 2022-08-31 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Evasion of neutralizing antibodies by a recombinant adeno-associated virus |
| US11299751B2 (en) | 2016-04-29 | 2022-04-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| WO2017192750A1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Oregon Health & Science University | Recombinant adeno-associated viral vectors |
| FI3445773T3 (fi) | 2016-05-13 | 2023-03-30 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Adenoassosioituneen viruksen kapsidimuunnoksia ja niiden käyttömenetelmiä |
| JP2019517274A (ja) | 2016-06-13 | 2019-06-24 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ | 最適化されたｃｌｎ１遺伝子および発現カセットおよびそれらの使用 |
| CA2971303A1 (en) | 2016-06-21 | 2017-12-21 | Bamboo Therapeutics, Inc. | Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use |
| JP2019521688A (ja) | 2016-07-26 | 2019-08-08 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | 眼におけるベクター介在の免疫寛容 |
| EP3528785A4 (en) | 2016-10-19 | 2020-12-02 | Adverum Biotechnologies, Inc. | MODIFIED AAV CASPIDS AND USES THEREOF |
| WO2018083606A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-11 | Novartis Ag | Methods and compositions for enhancing gene editing |
| EP3570895A1 (en) | 2017-01-17 | 2019-11-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods of expressing a polynucleotide of interest in the cone photoreceptors |
| US20210130413A1 (en) * | 2017-02-28 | 2021-05-06 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Modified aav capsids and uses thereof |
| AU2018234695B2 (en) | 2017-03-15 | 2024-10-03 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same |
| EP3388520A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical composition for reducing the expression of nkcc1 in a subject in need thereof |
| CN110945018A (zh) | 2017-07-27 | 2020-03-31 | 诺华股份有限公司 | 抗脱落酶的trem2变体 |
| RU2770922C2 (ru) | 2017-09-20 | 2022-04-25 | 4Д Молекьюлар Терапьютикс Инк. | Капсиды вариантов аденоассоциированных вирусов и методы их применения |
| US11668719B2 (en) | 2017-09-20 | 2023-06-06 | The Trustees Of Indiana University | Methods for resolving lipoproteins with mass spectrometry |
| WO2019077159A1 (en) | 2017-10-20 | 2019-04-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | METHODS OF EXPRESSING POLYNUCLEOTIDE OF INTEREST IN CONE PHOTORECCEPTORS OF A SUBJECT COMPRISING SUB-RETINAL ADMINISTRATION OF A THERAPEUTICALLY EFFECTIVE AMOUNT OF A RECOMBINANT AAV9 DERIVATIVE VECTOR |
| EP3707265A4 (en) | 2017-11-07 | 2021-09-01 | The University of North Carolina at Chapel Hill | OPTIMIZED AGA GENES AND OPTIMIZED EXPRESSION CASSETTES AND THEIR USE |
| US11766489B2 (en) | 2017-11-27 | 2023-09-26 | 4D Molecular Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis |
| WO2019140233A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | The Trustees Of Indiana University | Electrostatic linear ion trap design for charge detection mass spectrometry |
| KR20200123201A (ko) | 2018-02-21 | 2020-10-28 | 알시온 라이프사이언스 인크. | 유체 전달 시스템 및 방법 |
| MX2020010466A (es) | 2018-04-03 | 2021-01-08 | Vectores de virus que evitan anticuerpos. | |
| EP3773743A1 (en) | 2018-04-03 | 2021-02-17 | Stridebio, Inc. | Virus vectors for targeting ophthalmic tissues |
| BR112020020266A2 (pt) | 2018-04-03 | 2021-01-19 | Stridebio, Inc. | Vetores de vírus com evasão de anticorpos |
| AR126019A1 (es) | 2018-05-30 | 2023-09-06 | Novartis Ag | Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación |
| AU2019281714B2 (en) | 2018-06-04 | 2024-05-02 | The Trustees Of Indiana University | Charge detection mass spectrometry with real time analysis and signal optimization |
| WO2019236143A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | The Trustees Of Indiana University | Apparatus and method for calibrating or resetting a charge detector |
| EP4391015A3 (en) | 2018-06-04 | 2024-10-09 | The Trustees of Indiana University | Ion trap array for high throughput charge detection mass spectrometry |
| WO2019236139A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | The Trustees Of Indiana University | Interface for transporting ions from an atmospheric pressure environment to a low pressure environment |
| CN112673452B (zh) | 2018-06-04 | 2024-08-23 | 印地安纳大学理事会 | 用于在静电线性离子阱中捕获离子的设备和方法 |
| US20210246467A1 (en) | 2018-06-12 | 2021-08-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Synthetic liver-tropic adeno-associated virus capsids and uses thereof |
| EP3807404A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production |
| IL313246A (en) | 2018-06-28 | 2024-08-01 | Univ North Carolina Chapel Hill | CLN5 optimized genes and expression cassettes and their use |
| US20210355454A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-11-18 | Voyager Therapeutics, Inc. | Systems and methods for producing gene therapy formulations |
| EP3833767A4 (en) | 2018-08-10 | 2022-05-04 | The University of North Carolina at Chapel Hill | OPTIMIZED CLN7 GENES AND EXPRESSION CASSETTES AND THEIR USE |
| JP2021536289A (ja) | 2018-08-27 | 2021-12-27 | アルキオーネ・ライフサイエンシズ・インコーポレイテッドAlcyone Lifesciences, Inc. | 流体送達システムおよび方法 |
| US20210348242A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-11-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles |
| JP2022512621A (ja) | 2018-10-05 | 2022-02-07 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ａａｖ産生タンパク質をコードする操作された核酸コンストラクト |
| CA3116701A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system |
| UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
| CN113574632B (zh) | 2018-11-20 | 2024-07-30 | 印地安纳大学理事会 | 用于单粒子质谱分析的轨道阱 |
| CA3118567A1 (en) | 2018-12-03 | 2020-06-11 | The Trustees Of Indiana University | Apparatus and method for simultaneously analyzing multiple ions with an electrostatic linear ion trap |
| BR112021016501A2 (pt) | 2019-02-25 | 2021-10-26 | Novartis Ag | Composições e métodos para tratar distrofia cristalina de bietti |
| WO2020174369A2 (en) | 2019-02-25 | 2020-09-03 | Novartis Ag | Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy |
| KR20220011616A (ko) | 2019-03-21 | 2022-01-28 | 스트라이드바이오 인코포레이티드 | 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 |
| SG11202110607WA (en) | 2019-04-01 | 2021-10-28 | Tenaya Therapeutics Inc | Adeno-associated virus with engineered capsid |
| CA3136872A1 (en) | 2019-04-23 | 2020-10-29 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | New adeno-associated virus (aav) variants and uses thereof for gene therapy |
| EP3959741A1 (en) | 2019-04-23 | 2022-03-02 | The Trustees of Indiana University | Identification of sample subspecies based on particle charge behavior under structural change-inducing sample conditions |
| JP2022529662A (ja) | 2019-04-26 | 2022-06-23 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | 二重グリカン結合ａａｖ２．５ベクターのための方法および組成物 |
| TW202106700A (zh) | 2019-04-26 | 2021-02-16 | 美商聖加莫治療股份有限公司 | Aav 工程化 |
| WO2020242984A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified viral particles and uses thereof |
| WO2020261178A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | Pfizer Inc. | Methods of treating duchenne muscular dystrophy using aav mini-dystrophin gene therapy |
| TW202124446A (zh) | 2019-09-18 | 2021-07-01 | 瑞士商諾華公司 | 與ｅｎｔｐｄ２抗體之組合療法 |
| EP4031578A1 (en) | 2019-09-18 | 2022-07-27 | Novartis AG | Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies |
| AU2020356396A1 (en) | 2019-09-25 | 2022-04-14 | The Trustees Of Indiana University | Apparatus and method for pulsed mode charge detection mass spectrometry |
| GB201913974D0 (en) | 2019-09-27 | 2019-11-13 | King S College London | Vector |
| AU2020367532A1 (en) | 2019-10-17 | 2022-05-12 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick disease type C |
| WO2021170784A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Gene therapy for maple syrup urine disease |
| EP4121168A1 (en) | 2020-03-20 | 2023-01-25 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Gene therapy for cockayne syndrome |
| EP4100532A4 (en) | 2020-03-23 | 2024-03-27 | The University of North Carolina at Chapel Hill | AAV-NAGLU VECTORS FOR THE TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSIS IIIB |
| JP2023537070A (ja) | 2020-08-07 | 2023-08-30 | アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド | 小胞を標的とするタンパク質及びその使用 |
| KR20230068444A (ko) | 2020-08-19 | 2023-05-17 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 레트 증후군의 치료를 위한 아데노 관련 바이러스 벡터 |
| CA3196036A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for dual glycan binding aav2.5 vector |
| WO2022093769A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for dual glycan binding aav2.5 vector |
| MX2023005218A (es) | 2020-11-03 | 2023-05-16 | Pfizer | Metodos de purificacion de vectores de aav mediante cromatografia de intercambio anionico. |
| US20240052322A1 (en) | 2020-12-15 | 2024-02-15 | Pfizer Inc. | HILIC UPLC-MS Method For Separating and Analyzing Intact Adeno-Associated Virus Capsid Proteins |
| AU2021404944A1 (en) | 2020-12-23 | 2023-07-06 | Pfizer Inc. | Methods for purification of aav vectors by affinity chromatography |
| TW202242124A (zh) | 2021-01-14 | 2022-11-01 | 美商史崔德生物公司 | 靶向ｔ細胞之ａａｖ載體 |
| AU2022214429A1 (en) | 2021-02-01 | 2023-09-14 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
| US20240307553A1 (en) | 2021-04-01 | 2024-09-19 | Pfizer Inc. | Pharmaceutical compositions containing adeno-associated viral vector |
| CA3216491A1 (en) | 2021-04-16 | 2022-10-20 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Rational polyploid aav virions that cross the blood brain barrier and elicit reduced humoral response |
| EP4329820A1 (en) | 2021-04-26 | 2024-03-06 | Alexion Pharma International Operations Limited | Adeno-associated viral vector capsids with improved tissue tropism |
| KR20240014477A (ko) | 2021-05-28 | 2024-02-01 | 상하이 레제네리드 테라피즈 컴퍼니 리미티드 | 변이체 캡시드를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 이의 응용 |
| EP4359547A1 (en) | 2021-06-22 | 2024-05-01 | Pfizer Inc. | Production of adeno-associated virus vector in insect cells |
| US20240318157A1 (en) | 2021-07-01 | 2024-09-26 | Amicus Therapeutics, Inc. | Neurotensin Variants And Tagged Proteins Comprising Neurotensin Or Sortilin Propeptide |
| JP2024523707A (ja) | 2021-07-08 | 2024-06-28 | テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 遺伝子治療のための最適化された発現カセット |
| JP2024530050A (ja) | 2021-08-11 | 2024-08-14 | キングス・カレッジ・ロンドン | 中枢神経系に影響を及ぼす障害の改善された治療のための組成物及び方法 |
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