JP2022512621A - Ａａｖ産生タンパク質をコードする操作された核酸コンストラクト - Google Patents

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Abstract

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の製造における使用のための方法およびシステムについて説明する。特定の実施形態において、当該製造プロセスおよびシステムは、ウイルス産生細胞としてスポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞（例えばＳｆ９またはＳｆ２１など）を使用する。特定の実施形態において、当該製造プロセスおよびシステムは、ＡＡＶ粒子の製造においてバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用する。特定の実施形態において、当該製造プロセスおよびシステムはＡＡＶカプシドタンパク質、例えばＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３などをコードする操作された核酸コンストラクトを使用する。特定の実施形態において、当該製造プロセスおよびシステムは、ＡＡＶ複製タンパク質、例えばＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２などをコードする操作された核酸コンストラクトを使用する。

Description

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の産生において使用するための方法およびシステムを記載する。特定の実施形態において、製造プロセスおよびシステムは、ウイルス産生細胞としてスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９またはＳｆ２１など）を使用する。特定の実施形態において、この製造プロセスおよびシステムは、ＡＡＶ粒子の産生においてバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用する。特定の実施形態において、この製造プロセスおよびシステムは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３などのＡＡＶカプシドタンパク質をコードする操作された核酸コンストラクトを使用する。特定の実施形態において、この製造プロセスおよびシステムは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２などのＡＡＶ複製タンパク質をコードする操作された核酸コンストラクトを使用する。
ＡＡＶは、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために最も広く研究されかつ利用されているウイルスベクターの１つとして出現した。（例えば、その内容は、参照によりその全体を本願明細書に援用する、非特許文献１および非特許文献２を参照。）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療用遺伝子送達の有望な候補であり、臨床試験で安全かつ有効であることが証明されている。この目的のために改良されたＡＡＶ粒子の設計および産生は、活発な研究分野である。
ＡＡＶ分野での開発の出現により、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ粒子など）および対応する遺伝子治療産生材料（バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）など）を製造するための改善されたシステムおよび方法の必要性が残っている。
トラスチンら（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５（１１）：３２５１－３２６０（１９８５） グリムら（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（１５）：２４４５－２４５０（１９９９）
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの製造の際のＶＰカプシドタンパク質の量および／または比率の制御における使用のための操作された核酸コンストラクトを提示する。本開示は、操作された核酸コンストラクトを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造するためのウイルス産生システムおよびウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞など）について説明する。本開示は、本開示のウイルス産生細胞を製造する方法、ならびに本開示の、操作された核酸コンストラクト、ウイルス産生システム、およびウイルス産生細胞を使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法について説明する。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなど、の製造における使用のための核酸コンストラクトについて説明する。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＡＡＶ発現コンストラクトである。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域を含む。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、操作された核酸コンストラクトである。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、当該第１のＶＰコード領域と当該第２のＶＰコード領域とを含む第１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、当該第１のＶＰコード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と当該第２のＶＰコード領域を含む第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、当該第１のＶＰコード領域を含む第１のヌクレオチド配列と、当該第２のＶＰコード領域を含む第２のヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、当該第１のＶＰコード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、当該第２のヌクレオチド配列は、当該第２のＶＰコード領域を含む第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。特定の実施形態において、当該第１のオープンリーディングフレームは、当該第２のオープンリーディングフレームとは異なる。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域と；ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域とを含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み；当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含み；当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含み；当該第２のＶＰコード領域は、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、開始コドンを含む１つ以上の開始コドン領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、停止コドンを含む１つ以上の停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、１つ以上の開始コドン領域および１つ以上の停止コドン領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、発現制御配列を含む１つ以上の発現制御領域を含む。特定の実施形態において、当該発現制御領域は、１つ以上のプロモータ配列を含む。特定の実施形態において、当該発現制御領域は、バキュロウイルス主要後期プロモータ、昆虫ウイルスプロモータ、非昆虫ウイルスプロモータ、脊椎動物ウイルスプロモータ、核遺伝子プロモータ、ウイルスおよび非ウイルスエレメントを含む１つ以上の種に由来するキメラプロモータ、合成プロモータ、およびそのバリエーションまたは誘導体からなる群から選択される１つ以上のプロモータ配列を含む。特定の実施形態において、当該発現制御領域は、Ｃｔｘプロモータ、ｐｏｌｈ昆虫転写プロモータ、ΔＩＥ－１昆虫転写プロモータ、ｐ１０昆虫特異的プロモータ、Δｐ１０昆虫特異的プロモータ（ｐ１０のバリエーションまたは誘導体）、ＣＭＶ哺乳動物転写プロモータ、およびそのバリエーションまたは誘導体からなる群から選択される１つ以上のプロモータ配列を含む。特定の実施形態において、当該発現制御領域は、１つ以上の低発現プロモータ配列を含む。特定の実施形態において、当該発現制御領域は、１つ以上の増強発現プロモータ配列を含む。
特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域は、ＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域は、ＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域のＡＡＶ血清型は、当該第２のＶＰコード領域のＡＡＶ血清型と同じである。特定の実施形態において、当該第１のＶＰコード領域のＡＡＶ血清型は、当該第２のＶＰコード領域のＡＡＶ血清型とは異なる。特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、昆虫細胞に対して最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に対して最適化されたコドンである。
特定の実施形態において、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞に対して最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞に対して最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、最適化されたコドンであり得る。特定の実施形態において、ＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞に対して最適化されたコドンであり得る。
特定の実施形態において、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して１００％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化コドンであり得る。特定の実施形態において、当該コドン最適化ＶＰ１ヌクレオチド配列と参照ＶＰ１ヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満；８３％未満に、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、および４０％未満である。
特定の実施形態において、ＶＰ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して１００％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化コドンであり得る。特定の実施形態において、当該コドン最適化ＶＰ１ヌクレオチド配列と参照ＶＰ１ヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満；８３％未満に、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、および４０％未満である。
特定の実施形態において、ＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して１００％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化コドンであり得る。特定の実施形態において、当該コドン最適化ＶＰ１ヌクレオチド配列と参照ＶＰ１ヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満；８３％未満に、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、および４０％未満である。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、（ｉ）第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列、およびＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列、およびＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、（ｉ）：第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列、およびＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列、およびＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域を含む。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域のヌクレオチド配列は、最適化されたコドンである。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域のヌクレオチド配列は、昆虫細胞、より詳細にはスポドプテラ・フルギペルダ細胞に対して最適化されたコドンである。特定の実施形態において、当該第２のＶＰコード領域のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して１００％未満、９０％未満、または８０％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、（ｉ）第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列と、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列と、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、（ｉ）第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域、および第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域、および第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、第１の開始コドンはＡＴＧであるか、第２の開始コドンはＡＴＧであるか、または第１および第２の開始コドンの両方は、ＡＴＧである。
特定の実施形態において、発現制御領域は、約または正確に１：１：１０；約または正確に２：２：１０；約または正確に３：３：１０；約または正確に４：４：１０；約または正確に５：５：１０；約または正確に１～２：１～２：１０；約または正確に１～３：１～３：１０；約または正確に１～４：１～４：１０；約または正確に１～５：１～５：１０；約または正確に２～３：２～３：１０；約または正確に２～４：２～４：１０；約または正確に２～５：２～５：１０；約または正確に３～４：３～４：１０；約または正確に３～５：３～５：１０；および約または正確に４～５：４～５：１０からなる群から選択されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を生じるように最適化される。
本開示は、本開示の核酸コンストラクトを含むウイルス産生システムについて説明する。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトを含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含む。
特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、（ｉ）第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列と、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列と、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域を含むＡＡＶ発現コンストラクトを含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、（ｉ）：第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含む第１のヌクレオチド配列、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域、および第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域；ならびに（ｉｉ）第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む第２のヌクレオチド配列、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域、および第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域を含むＡＡＶ発現コンストラクトを含む。
特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、本開示のＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含むウイルス産生細胞を含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。
本開示は、本開示のウイルス産生細胞を製造する方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示の１つ以上の発現コンストラクトを提供する工程と；本開示のペイロードコンストラクトを提供する工程と；当該１つ以上の発現コンストラクトおよび当該ペイロードコンストラクトをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程とを含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、ＡＡＶウイルス産生細胞である。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示の１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトを提供する工程と；本開示のＡＡＶペイロードコンストラクトを提供する工程と；当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトおよび当該ＡＡＶペイロードコンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程とを含む。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示のウイルス産生システムを提供する工程と；当該ウイルス産生システムをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程とを含む。
本開示は、本開示のＡＡＶウイルス産生細胞においてＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質を発現させる方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：１つ以上のＶＰコード領域を含む本開示の１つ以上の発現コンストラクトを提供する工程と；当該１つ以上の発現コンストラクトをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程と；当該ウイルス産生細胞の細胞機構がＶＰコード領域を対応するＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質へとプロセシングすることを可能にする条件に、当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程とを含む。特定の実施形態において、当該方法は、以下：１つ以上のＶＰコード領域を含む本開示のウイルス産生システムを提供する工程と；当該ウイルス産生システムをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程と；当該ウイルス産生細胞の細胞機構がＶＰコード領域を対応するＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質へとプロセシングすることを可能にする条件に、当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程とを含む。
本開示は、本開示の核酸コンストラクトを使用してＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：１つ以上のＶＰコード領域を含む本開示の１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトを提供する工程と；ＡＡＶペイロードを含む本開示のＡＡＶペイロードコンストラクトを提供する工程と；当該１つ以上の発現コンストラクトおよび当該ペイロードコンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程と；当該ウイルス産生細胞の細胞機構がＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子へとプロセシングすることを可能にする条件に、当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程と；当該ＡＡＶウイルス産生細胞から当該ｒＡＡＶ粒子を収集する工程とを含む。特定の実施形態において、当該方法は、以下：１つ以上のＶＰコード領域およびＡＡＶペイロードを含む本開示のウイルス産生システムを提供する工程と；当該ウイルス産生システムをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程と；当該ウイルス産生細胞の細胞機構がＡＡＶ産生システムの成分をｒＡＡＶ粒子へとプロセシングすることを可能にする条件に、当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程と；当該ＡＡＶウイルス産生細胞からｒＡＡＶ粒子を収集する工程とを含む。
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの製造の際のＡＡＶ複製タンパク質の量および／または比率の制御における使用のための操作された核酸コンストラクトを提示する。本開示は、操作された核酸コンストラクトを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造するためのウイルス産生システムおよびウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞など）について説明する。本開示は、本開示のウイルス産生細胞を製造する方法、ならびに本開示の、操作された核酸コンストラクト、ウイルス産生システム、およびウイルス産生細胞を使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法について説明する。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなど、の製造における使用のための核酸コンストラクトについて説明する。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＡＡＶ発現コンストラクトである。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ＡＡＶペイロードコンストラクトである。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするＲｅｐ５２配列を含むＲｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８配列を含むＲｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含む第１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域およびＲｅｐ７８コード領域の両方を含む。特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、単一のオープンリーディングフレームを含むか、単一のオープンリーディングフレームから実質的になるか、または単一のオープンリーディングフレームからなる。特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のオープンリーディングフレームと、Ｒｅｐ７８コード領域を含み、当該第１のオープンリーディングフレームとは異なる第２のオープンリーディングフレームとを含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、ウイルス性２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む２Ａ配列領域を含む。特定の実施形態において、当該２Ａヌクレオチド配列は、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、馬鼻炎（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）Ａウイルス由来のＥ２Ａ、豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ、細胞質多角体病ウイルス由来のＢｍＣＰＶ ２Ａ、カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）軟化病ウイルス由来のＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるウイルス性２Ａペプチドをコードする。
特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域および２Ａ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８コード領域および２Ａ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および２Ａ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列上においてＲｅｐ５２コード領域とＲｅｐ７８コード領域との間に位置する２Ａ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、およびＲｅｐ７８コード領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、およびＲｅｐ５２コード領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、開始コドンを含む開始コドン領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、停止コドンを含む停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、開始コドン領域および停止コドン領域を含む。
特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、および停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、および停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および停止コドン領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、Ｒｅｐ５２コード領域、および停止コドン領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、当該核酸コンストラクト内において内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をコードするＩＲＥＳヌクレオチド配列を含むＩＲＳＥ配列領域を含む。特定の実施形態において、当該ＩＲＥＳヌクレオチド配列は、口蹄疫ウイルス由来のＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス由来のＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ、およびそれらの組合せからなる群から選択された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。
特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、およびＩＲＥＳ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列上においてＲｅｐ５２コード領域とＲｅｐ７８コード領域との間に位置するＩＲＥＳ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ５２コード領域、ＩＲＥＳ配列領域、およびＲｅｐ７８コード領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ７８コード領域、ＩＲＥＳ配列領域、およびＲｅｐ５２コード領域を含む。
特定の実施形態において、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ７８コード領域を含む第２のオープンリーディングフレーム、および当該第１のオープンリーディングフレームと当該第２のオープンリーディングフレームとの間に位置するＩＲＥＳ配列領域を含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、ＩＲＥＳ配列領域、およびＲｅｐ７８コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームを含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端へ順番に、Ｒｅｐ７８コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、ＩＲＥＳ配列領域、およびＲｅｐ５２コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームを含む。
特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端へ順番に、第１の開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、および第１の停止コドン領域を含む第１のオープンリーディングフレームと；ＩＲＥＳ配列領域と；第２の開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および第２の停止コドン領域を含む第２のオープンリーディングフレームとを含む。特定の実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端へ順番に、第１の開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および第１の停止コドン領域を含む第１のオープンリーディングフレームと；ＩＲＥＳ配列領域と；第２の開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、および第２の停止コドン領域を含む第２のオープンリーディングフレームとを含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および当該核酸コンストラクト内における第１のヌクレオチド配列とは別の第２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のヌクレオチド配列とＲｅｐ７８コード領域を含む別の第２のヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および別個の第２のヌクレオチド配列を含み、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域および２Ａ配列領域を含み；当該第２のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８コード領域および２Ａ配列領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、当該核酸コンストラクトに対して必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む１つ以上の必須遺伝子領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、バキュロウイルスであり、ならびに当該必須遺伝子ヌクレオチド配列は、必須バキュロウイルスタンパク質をコードするバキュロウイルス配列である。特定の実施形態において、当該必須バキュロウイルスタンパク質は、バキュロウイルスエンベロープタンパク質またはバキュロウイルスカプシドタンパク質である。特定の実施形態において、当該必須バキュロウイルスタンパク質は、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質である。特定の実施形態において、当該必須バキュロウイルスタンパク質は、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質である。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および別個の第２のヌクレオチド配列を含み；この場合、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域および第１の必須遺伝子領域を含み；当該第２のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８コード領域および第２の必須遺伝子領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および別個の第２のヌクレオチド配列を含み；この場合、当該第１のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、および第１の必須遺伝子領域を含み；当該第２のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、および第２の必須遺伝子領域を含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および別個の第２のヌクレオチド配列を含み；この場合、当該第１のヌクレオチド配列は、順番に、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、および第１の必須遺伝子領域を含み；当該第２のヌクレオチド配列は、順番に、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、および第２の必須遺伝子領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、第１のヌクレオチド配列および別個の第２のヌクレオチド配列を含み；この場合、当該第１のヌクレオチド配列は、順番に、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、およびＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む第１の必須遺伝子領域を含み；当該第２のヌクレオチド配列は、順番に、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、およびＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む第２の必須遺伝子領域を含む。
特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含むＡＡＶ発現コンストラクトであり；さらに、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰコード領域も含む。特定の実施形態において、当該核酸コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含むＡＡＶペイロードコンストラクトであり；さらに、ＡＡＶペイロードを含むペイロード領域も含む。
本開示は、本開示の核酸コンストラクトを含むウイルス産生システムについて説明する。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトを含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含む。
特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含み；この場合、当該ＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含み、さらに、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰコード領域も含み；当該ＡＡＶペイロードコンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含み、さらに、ＡＡＶペイロードを含むペイロード領域も含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含み；この場合、当該ＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域、およびＶＰコード領域を含み；当該ＡＡＶペイロードコンストラクトは、Ｒｅｐ７８コード領域および
ＡＡＶペイロード領域を含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含み；この場合、当該ＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ７８コード領域、およびＶＰコード領域を含み；当該ＡＡＶペイロードコンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域およびＡＡＶペイロード領域を含む。
特定の実施形態において、当該ウイルス産生システムは、本開示のＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むウイルス産生細胞を含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。
本開示は、本開示のウイルス産生細胞を製造する方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示の１つ以上の発現コンストラクトを提供する工程；本開示のペイロードコンストラクトを提供する工程；当該１つ以上の発現コンストラクトおよび当該ペイロードコンストラクトをウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程を含む。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態において、当該ウイルス産生細胞は、ＡＡＶウイルス産生細胞である。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示の１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトを提供する工程；本開示のＡＡＶペイロードコンストラクトを提供する工程；ならびに当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトおよび当該ＡＡＶペイロードコンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含みかつＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰコード領域も含むＡＡＶ発現コンストラクトをトランスフェクトされる。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含みかつＡＡＶペイロードを含むペイロード領域も含むＡＡＶペイロードコンストラクトをトランスフェクトされる。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含みかつＶＰコード領域も含むＡＡＶ発現コンストラクトをトランスフェクトされ；さらに、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含みかつＡＡＶペイロードを含むペイロード領域も含むＡＡＶペイロードコンストラクトもトランスフェクトされる。
特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｒｅｐ５２コード領域およびＶＰコード領域を含むＡＡＶ発現コンストラクトをトランスフェクトされ、さらに、Ｒｅｐ７８コード領域およびＡＡＶペイロードを含むペイロード領域を含むＡＡＶペイロードコンストラクトもトランスフェクトされる。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｒｅｐ７８コード領域およびＶＰコード領域を含むＡＡＶ発現コンストラクトをトランスフェクトされ、さらに、Ｒｅｐ５２コード領域およびＡＡＶペイロードを含むペイロード領域を含むＡＡＶペイロードコンストラクトもトランスフェクトされる。
本開示は、本開示のＡＡＶウイルス産生細胞においてＲｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ５２タンパク質を発現させる方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：Ｒｅｐ５２コード領域を含む本開示の核酸コンストラクトを提供する工程；Ｒｅｐ７８コード領域を含む本開示の核酸コンストラクトを提供する工程；Ｒｅｐ５２コード領域を含む少なくとも１つの核酸コンストラクトとＲｅｐ７８コード領域を含む少なくとも１つの核酸コンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞にトランスフェクトする工程；当該複製細胞の細胞機構が当該Ｒｅｐ５２コード領域を対応するＲｅｐ５２タンパク質へとプロセシングしならびに当該Ｒｅｐ７８コード領域を対応するＲｅｐ７８タンパク質へとプロセシングすることを可能にする条件に当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程を含む。特定の実施形態において、当該Ｒｅｐ５２－コード領域および当該Ｒｅｐ７８－コード領域は、同じ核酸コンストラクト上に存する。特定の実施形態において、当該Ｒｅｐ５２－コード領域および当該Ｒｅｐ７８－コード領域は、同じ核酸コンストラクト上の同じオープンリーディングフレームに存する。特定の実施形態において、当該Ｒｅｐ５２－コード領域および当該Ｒｅｐ７８－コード領域は、同じ核酸コンストラクト上の同じヌクレオチド配列内における異なるオープンリーディングフレームに存する。特定の実施形態において、当該Ｒｅｐ５２－コード領域および当該Ｒｅｐ７８－コード領域は、同じ核酸コンストラクト上の異なるヌクレオチド配列に存する。特定の実施形態において、当該Ｒｅｐ５２－コード領域および当該Ｒｅｐ７８－コード領域は、異なる核酸コンストラクトに存する。
本開示は、本開示の核酸コンストラクトを使用してＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法について説明する。特定の実施形態において、当該方法は、以下：本開示の１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクト（さらに、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰコード領域も含む）および本開示のＡＡＶペイロードコンストラクト（ＡＡＶペイロードを含む）を提供する工程；当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトおよび当該ＡＡＶペイロードコンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞中へとトランスフェクトする工程；当該複製細胞の細胞機構がＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子へとプロセシングすることを可能にする条件に、当該ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程；ならびに当該ＡＡＶウイルス産生細胞からｒＡＡＶ粒子を収集する工程を含む。特定の実施形態において、当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域およびＲｅｐ７８コード領域を含む。特定の実施形態において、当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域を含み、ならびに当該ＡＡＶペイロードコンストラクトは、Ｒｅｐ７８コード領域を含む。特定の実施形態において、当該１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトは、Ｒｅｐ７８コード領域を含み、ならびに当該ＡＡＶペイロードコンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域を含む。
本開示の様々な実施形態の詳細は、以下の説明において詳細に述べられる。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。説明において、文脈において特に明記されない限り、単数形は複数形も包含する。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。相反する場合には、本明細書の説明が優先する。
先述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に例示される、本開示の特定の実施形態についての以下の説明から明らかであろう。これらの図は、必ずしも計量的または包括的である必要はなく、代わりに、本開示の様々な実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
本開示によるΔｐ１０プロモータに作動可能に連結されたＶＰ１のみの配列を含む、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の産生に使用するための本開示の核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を示す図。 本開示によるＣｔｘプロモータに作動可能に連結されたＶＰ１のみの配列を含む、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の産生に使用するための本開示の核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を示す図。 本開示のヌクレオチド配列を示しており、ヌクレオチド配列を使用してＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を製造する方法を示す図。図３は、「ＮＰＧＰ」を配列番号１８として開示している。 ２Ａドメインを含む本開示のヌクレオチド配列、ならびにこのヌクレオチド配列を使用してＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を製造する対応する方法の一実施形態を示す図。図４は、「ＮＰＧＰ」を配列番号１８として開示している。 ＩＲＥＳ領域を含む本開示のヌクレオチド配列、ならびにヌクレオチド配列を使用してＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を製造する対応する方法の一実施形態を示す図。 ＡＡＶ発現コンストラクト（図６Ａ）を含む、ウイルス産生システムにおけるウイルスコンストラクトの特定の実施形態を示す図。 ＡＡＶペイロードコンストラクト（図６Ｂ）を含む、ウイルス産生システムにおけるウイルスコンストラクトの特定の実施形態を示す図。 ＡＡＶ発現コンストラクト（図７Ａ）を含む、ウイルス産生システムにおけるウイルスコンストラクトの特定の実施形態を示す図。 ＡＡＶペイロードコンストラクト（図７Ｂ）を含む、ウイルス産生システムにおけるウイルスコンストラクトの特定の実施形態を示す。 Ｒｅｐ１ヌクレオチド配列および別個のＲｅｐ２ヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスコンストラクトを示すゲルカラムを提示する図。 ＶＰ３９領域のＲｅｐ１配列およびＧＰ６４領域のＲｅｐ２配列を含む本開示のバクミドを示す図。 Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドからのＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサートの分離を示すゲルカラムを提示する図。 Ｉ－ＣｅｕＩカット４２０ＢバクミドへのＣｔｘ－ＶＰ１挿入についてのコロニーＰＣＲスクリーニングの結果を示すゲルカラムを提示する図。 Ｉ－ＣｅｕＩカット４２０ＢバクミドへのＣｔｘ－ＶＰ１挿入についてのコロニーＰＣＲスクリーニングの結果を示すゲルカラムを提示する図。 Ｉ－ＣｅｕＩカット４２０ＢバクミドへのＣｔｘ－ＶＰ１挿入についてのコロニーＰＣＲスクリーニングの結果を示すゲルカラムを提示する図。 コロニー４２０と比較したコロニー４８７におけるＣａｐおよびＲｅｐタンパク質産生についてのウエスタンブロット分析の結果を示すゲルカラムを提示する図。 残りのｐＵＣ１８プラスミド断片からのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサートの分離を示すゲルカラムを提示する図。 ＦｓｅＩ－ｃｕｔ４８７バクミドへのＣｔｘ－ＶＰ２挿入についてのコロニーＰＣＲスクリーニングの結果を示すゲルカラムを提示する図。
１．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
概説
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡウイルスゲノムによって特徴付けられるパルボウイルス科の小型非エンベロープ二十面体カプシドウイルスである。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科で構成される。パルボウイルス科としては、限定するものではないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含む、脊椎動物宿主で複製し得るＡＡＶを含むディペンドウイルス属が挙げられる。
パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーは、一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、第６９章、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６年、第３版）に記載されており、その内容は、パルボウイルスに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
ＡＡＶは、その比較的単純な構造、宿主ゲノムへの組込みも複製もなしに広範囲の細胞（静止細胞および分裂細胞を含む）に感染するその能力、および比較的良性のその免疫原性プロファイルに起因して、生物学的ツールとして有用であることが証明されている。ウイルスのゲノムは、機能的な組換えウイルス、またはウイルス粒子（特定の組織を標的とし、所望のペイロードを発現または送達するようにロードまたは操作される）をアセンブルするための最小限の構成要素を含むように操られ得る。
ＡＡＶウイルスゲノム
野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、およそ５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、伝統的に５’末端と３’末端の両方でウイルスゲノムをキャップし、ウイルスゲノムの複製起点を提供する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶウイルスゲノムは、典型的には、２つのＩＴＲ配列を含む。これらのＩＴＲは、エネルギー的に安定した二本鎖領域を形成するｓｓＤＮＡの５’および３’末端にて自己相補的領域（野生型ＡＡＶでは１４５ｎｔ）によって定義される特徴的なＴ字型ヘアピン構造を有する。二本鎖ヘアピン構造は、限定はされないが、宿主ウイルス複製細胞の内因性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することによってＤＮＡ複製の起点として働くことを含む、複数の機能を含む。
野生型ＡＡＶウイルスゲノムはさらに、２つのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を含み、１つは４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０（Ｒｅｐ遺伝子によってコードされる））に関し、１つは３つのカプシドまたは構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３（カプシド遺伝子またはＣａｐ遺伝子によってコードされる））に関する。Ｒｅｐタンパク質は、複製およびパッケージングに重要であるが、カプシドタンパク質は、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドのタンパク質シェルを生成するためにアセンブルされる。選択的スプライシングおよび選択的開始コドンおよびプロモータは、単一のオープンリーディングフレームからの４つの異なるＲｅｐタンパク質の生成、ならびに単一のオープンリーディングフレームからの３つのカプシドタンパク質の生成をもたらす。ＡＡＶ血清型によってそれは異なるが、非限定的な例として、ＡＡＶ９／ｈｕ．１４（米国特許第７，９０６，１１１号明細書（その内容は、ＡＡＶ９／ｈｕ．１４に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）の配列番号１２３）について、ＶＰ１はアミノ酸１～７３６を指し、ＶＰ２はアミノ酸１３８～７３６を指し、ＶＰ３はアミノ酸２０３～７３６を指す。言い換えれば、ＶＰ１は全長のカプシド配列であり、一方、ＶＰ２およびＶＰ３は全体のより短い構成要素である。結果として、ＶＰ３領域の配列の変更は、ＶＰ１およびＶＰ２の変更でもあるが、親配列と比較した場合のパーセント差は、ＶＰ３が３つの中で最も短い配列であるのでＶＰ３で最大となる。ここではアミノ酸配列に関連して説明しているが、これらのタンパク質をコードする核酸配列も同様に説明され得る。まとめると、３つのカプシドタンパク質がアセンブルしてＡＡＶカプシドタンパク質を生成する。理論に拘束されることを望まないが、ＡＡＶカプシドタンパク質は典型的には、１：１：１０というＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３のモル比を含む。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ血清型」とは、主にＡＡＶカプシドによって定義される。場合によっては、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２／９）によっても具体的に説明される。
生物学的ツールとして使用するために、野生型ＡＡＶウイルスゲノムを改変して、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を、少なくとも１つのＩＴＲ領域を有するペイロード領域を含む核酸配列で置き換えてもよい。典型的には、組換えＡＡＶウイルスゲノムには２つのＩＴＲ領域がある。ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ＡＡＶ粒子を生成するために、産生中にトランスで提供され得る。
コードされた異種ペイロードに加えて、ＡＡＶベクターは、任意の天然に発生するかおよび／または組換えのＡＡＶ血清型ヌクレオチド配列またはバリアントのウイルスゲノムの全部または一部を含み得る。ＡＡＶバリアントは、概して物理的および機能的等価物であるコンストラクトを産生し、同様の機序によって複製し、および同様の機序によってアセンブルするように、核酸レベル（ゲノムまたはカプシド）およびアミノ酸レベル（カプシド）において有意に相同性である配列を有し得る。キオリーニら（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ． Ｖｉｒ．７１：６８２３－３３（１９９７）；スリバスタら（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５－６４（１９８３）；キオリーニら（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９－１３１９（１９９９）；ルートレッジら（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９－３１９（１９９８）；ａｎｄ ウーら（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５－４７（２０００）を参照。これらの各々の内容は、ＡＡＶバリアントおよびその等価物に関するものとして、本明細書において全体として参照により援用される。
ある特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムおよび／またはペイロード、ならびにそれらの使用方法は、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレットに記載されているとおりであり得、その内容は、ＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムおよび／またはペイロードに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
本開示のＡＡＶ粒子は、当業者に明らかなそのような製剤の任意の変形を含む、本開示の任意の遺伝子治療製剤中で製剤化され得る。本出願における「ＡＡＶ粒子」、「ＡＡＶ粒子製剤」および「製剤化されたＡＡＶ粒子」という言及は、製剤化され得るＡＡＶ粒子およびいずれの制限もなく製剤化されるＡＡＶ粒子を指す。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、複製欠損型である組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子であり、それらのウイルスゲノム内に機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠如する。これらの欠損ＡＡＶ粒子は、ほとんどのまたは全ての親コード配列を欠如してもよく、本質的に、１つまたは２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列および細胞、組織、臓器または生物に送達するための目的の核酸（すなわち、ペイロード）のみを有していてもよい。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そこにコードされたコード配列の複製、転写および翻訳を提供する少なくとも１つの制御エレメントを含む。コード配列が適切な宿主細胞中で複製、転写および／または翻訳されることが可能である限り、制御エレメントは全てが常に存在する必要があるわけではない。発現制御エレメントの非限定的な例としては、転写開始および／もしくは終結のための配列、プロモータおよび／もしくはエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列、翻訳有効性を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、ならびに／またはタンパク質プロセシングおよび／もしくは分泌を増強する配列が挙げられる。
本開示によれば、療法および／または診断に使用されるＡＡＶ粒子は、目的の核酸ペイロードまたはカーゴの形質導入に必要な最低限の成分へと純化または縮小されているウイルスを含む。このように、ＡＡＶ粒子は、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達ビヒクルとして操作される。
本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいていてもよい。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、本明細書に記載される核酸などの異種分子を輸送し、形質導入し、またはその他担体として働く任意の分子または部分を意味する。
一本鎖ＡＡＶウイルスゲノム（例えば、ｓｓＡＡＶ）に加えて、本開示はまた、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ウイルスゲノムも提供する。ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞において迅速に発現することが可能である。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶウイルスゲノムはｓｃＡＡＶである。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶウイルスゲノムはｓｓＡＡＶである。
ＡＡＶ粒子を作製および／または改変する方法は、シュードタイプＡＡＶ粒子など、当該技術分野において開示されている（国際公開第２０００２８００４号パンフレット、同第２００１２３００１号パンフレット、同第２００４１１２７２７号パンフレット、同第２００５００５６１０号パンフレットおよび同第２００５０７２３６４号パンフレット、これらの各々の内容は、ＡＡＶ粒子を作製および／または改変することに関するものとして、全体として参照により本明細書に援用される）。
ＡＡＶ粒子は、送達効率が増強されるように改変されてもよい。かかる改変されたＡＡＶ粒子は、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性で標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のカプシドは、米国特許出願公開第２０１３０１９５８０１号明細書に記載された方法に従って操作され、その内容は、送達の効率を高めるためのＡＡＶ粒子の改変に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、本開示のポリペプチドまたはタンパク質をコードするペイロード領域を含むＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞に導入され得る。
末端逆位反復配列（ＩＴＲ）
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域とペイロード領域とを有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは５’末端および３’末端でペイロード領域に隣接する。ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として働く。ＩＴＲは、相補的でかつ対称に配置され得る配列領域を含む。本開示のウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列または組換え的に誘導されたポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＩＴＲは、カプシドと同じ血清型またはその誘導体に由来していてもよい。ＩＴＲはカプシドとは異なる血清型のものであってもよい。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つ以上のＩＴＲを有する。非限定的な例において、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。特定の実施形態において、ＩＴＲは互いに同じ血清型のものである。別の実施形態において、ＩＴＲは異なる血清型のものである。非限定的な例としては、ＩＴＲのうちのゼロ個、一方、または両方がカプシドと同じ血清型を有することが挙げられる。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである。
独立に、各ＩＴＲは約１００～約１５０ヌクレオチド長であってもよい。ＩＴＲは、約１００～１０５ヌクレオチド長、１０６～１１０ヌクレオチド長、１１１～１１５ヌクレオチド長、１１６～１２０ヌクレオチド長、１２１～１２５ヌクレオチド長、１２６～１３０ヌクレオチド長、１３１～１３５ヌクレオチド長、１３６～１４０ヌクレオチド長、１４１～１４５ヌクレオチド長または１４６～１５０ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、ＩＴＲは１４０～１４２ヌクレオチド長である。ＩＴＲ長さの非限定的な例は、１０２、１３０、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長、およびそれと少なくとも９５％の同一性を有するものである。
特定の実施形態において、各ＩＴＲは、１４１ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、各ＩＴＲは、１３０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、各ＩＴＲは１１９ヌクレオチド長であり得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つのＩＴＲを含み、１つのＩＴＲは１４１ヌクレオチド長であり、他のＩＴＲは１３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つのＩＴＲを含み、両方のＩＴＲは１４１ヌクレオチド長である。
プロモータ
特定の実施形態において、ウイルスゲノムのペイロード領域は、導入遺伝子標的の特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するためのウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照；その内容は、ペイロード／導入遺伝子エンハンサーエレメントに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
当業者は、標的細胞における本開示のポリペプチドの発現が、種特異的、誘導性、組織特異的、または細胞周期であるプロモータを含むがこれらに限定されない特定のプロモータを必要とし得ることを認識し得る（パールら（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５～９頁（１９９７年）を参照；その内容は、ポリペプチド発現プロモータに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。
特定の実施形態において、プロモータは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域にコードされたポリペプチド（複数可）の発現を駆動する場合に効率的であるとみなされる。特定の実施形態において、プロモータは、標的とされている細胞中で発現をドライブする場合、有効とみなされるプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、標的とされる細胞に対して向性を有するプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ウイルス産生細胞に対して向性を有するプロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、標的細胞または組織においてペイロードの発現をある期間ドライブする。プロモータによって駆動される発現は、１～３１日（またはその中の任意の値もしくは範囲）、１～２３か月（またはその中の任意の値もしくは範囲）、２～１０年（またはその中の任意の値もしくは範囲）、または１０年以上という期間であり得る。発現は、１～５時間、１～１２時間、１～２日、１～５日、１～２週間、１～３週間、１～４週間、１～２か月、１～４か月、１～６か月、２～６か月、３～６か月、３～９か月、４～８か月、６～１２か月、１～２年、１～５年、２～５年、３～６年、３～８年、４～８年、または５～１０年であり得る。非限定的な例として、プロモータは、神経（例えば、ＣＮＳ）細胞または組織におけるペイロードの持続的発現のための弱いプロモータであり得る。
特定の実施形態において、プロモータは、本開示のポリペプチドの発現を、少なくとも１～１１か月（またはその中の任意の個々の値）、２～６５年（またはその中の任意の個々の値）、または６５年以上にわたって駆動する。
プロモータは、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくともよい。プロモータの非限定的な例としては、ウイルスプロモータ、植物プロモータおよび哺乳類プロモータが挙げられる。特定の実施形態において、プロモータは、ヒトプロモータであってもよい。特定の実施形態において、プロモータは、トランケート型または突然変異型であってもよい。
ほとんどの組織で発現をドライブまたは促進するプロモータとしては、限定はされないが、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよび／もしくはプロモータ、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられる。組織特異的発現エレメントを使用して、限定するものではないが、筋肉特異的プロモータ、Ｂ細胞プロモータ、単球プロモータ、白血球プロモータ、マクロファージプロモータ、膵臓星状細胞プロモータ、内皮細胞プロモータ、肺組織プロモータ、星状細胞プロモータ、または神経系プロモータ（発現をニューロンまたはニューロンのサブタイプ、星状細胞、または乏突起膠細胞に制限するために使用され得る）などの特定の細胞型に発現を制限し得る。
筋肉特異的プロモータの非限定的な例としては、哺乳動物の筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物のデスミン（ＤＥＳ）プロモータ、哺乳動物のトロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、および哺乳動物の骨格α－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータが挙げられる（例えば、その内容は、筋肉特異的プロモータに関連するものとして、参照によりその全体を本願明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１０２１２５２９号明細書を参照）。
ニューロンの組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝調節型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）または重鎖（ＮＦＨ）、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）および興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモータが挙げられる。アストロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモータが挙げられる。オリゴデンドロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータが挙げられる。
特定の実施形態において、プロモータは１ｋｂ未満であってもよい。プロモータは、２００～８００ヌクレオチド（またはその中の任意の値もしくは範囲）または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。プロモータは、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００または７００～８００の長さを有してもよい。
特定の実施形態において、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶおよびＣＢＡなど、同じまたは異なる開始または親プロモータの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００～８００ヌクレオチド（またはその中の任意の値もしくは範囲）または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。各成分は、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００または７００～８００の長さを有してもよい。特定の実施形態において、プロモータは、３８２ヌクレオチドＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドＣＢＡプロモータ配列との組合せである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはユビキタスプロモータを含む。ユビキタスプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈ等を含む）、ＥＦ－１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモータ）が挙げられる。
ユーら（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ ２０１１，７：６３；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、レンチウイルスベクターを使用してラットＤＲＧ細胞および初代ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモータ下のｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモータよりも弱い発現を示し、全てのプロモータについてわずか１０～１２％のグリア細胞発現しか見られなかったことを見出した。ソダーブロムら（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．）（Ｅ． Ｎｅｕｒｏ ２０１５；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、運動皮質における注射後のＣＭＶおよびＵＢＣプロモータを含むＡＡＶ８およびＣＭＶプロモータを含むＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモータを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモータによる発現よりも高い持続的気道発現を示した（例えば、ギルら（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，Ｖｏｌ．８，１５３９－１５４６（その内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと）。フサインら（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、ｈＧＵＳＢプロモータ、ＨＳＶ－１ＬＡＴプロモータおよびＮＳＥプロモータを含むＨβＨコンストラクトを評価し、このＨβＨコンストラクトがマウス脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見出した。パッシーニおよびウォルフ（Ｐａｓｓｉｎｉ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１，１２３８２－１２３９２、これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間にわたり持続的発現があったことを見出した。シューら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，８，１３２３－１３３２；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）により、ＮＦＬおよびＮＦＨプロモータを使用したとき、ＣＭＶ－ｌａｃＺ、ＣＭＶ－ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）と比較して全ての脳領域で低発現が見出された。Ｘｕらは、プロモータ活性が、降順に、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドプロモータであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドプロモータであり、両方とも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは固有受容感覚ニューロン、脳および脊髄に豊富にあり、ＮＦＨは心臓に存在する。ＳＣＮ８Ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現する４７０ヌクレオチドプロモータであり、特に海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に高発現が見られる（例えば、ドリューら（Ｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ ＳＣＮ８Ａ，Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ（２００７） １８：７２３－７３１；ａｎｄ レイモンドら（Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ α－ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）２７９（４４）４６２３４－４６２４１を参照のこと；この各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
前述のＹｕ、Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ、Ｇｉｌｌ、Ｈｕｓａｉｎ、Ｐａｓｓｉｎｉ、Ｘｕ、ＤｒｅｗｓまたはＲａｙｍｏｎｄによって教示されるプロモータはいずれも、本開示に使用することができる。
特定の実施形態において、プロモータは細胞特異的ではない。
特定の実施形態において、プロモータはユビキチンｃ（ＵＢＣ）プロモータである。ＵＢＣプロモータは、３００～３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＵＢＣプロモータは３３２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータは、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータである。ＧＵＳＢプロモータは、３５０～４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモータは３７８ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモータである。ＮＦＬプロモータはサイズが６００～７００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＬプロモータは６５０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータはニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモータである。ＮＦＨプロモータはサイズが９００～９５０ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＨプロモータは９２０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータはＳＣＮ８Ａプロモータである。ＳＣＮ８Ａプロモータはサイズが４５０～５００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＳＣＮ８Ａプロモータは４７０ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、プロモータは、フラタキシン（ＦＸＮ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、またはそのバリアントである。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＢ６プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、最小ＣＢプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、Ｈ１プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＡＧプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ＧＦＡＰプロモータである。特定の実施形態において、プロモータはシナプシンプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、操作されたプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、肝臓または骨格筋プロモータである。肝臓プロモータの非限定的な例としては、ヒトα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。骨格筋プロモータの非限定的な例としては、デスミン、ＭＣＫまたは合成Ｃ５－１２が挙げられる。特定の実施形態において、プロモータは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータである。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータは、Ｕ６である。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータは、Ｈ１である。特定の実施形態において、プロモータは、心筋細胞特異的プロモータである。心筋細胞特異的プロモータの非限定的な例としては、αＭＨＣ、ｃＴｎＴ、およびＣＭＶ－ＭＬＣ２ｋが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは２つのプロモータを含む。非限定的な例として、プロモータは、ＥＦ１αプロモータおよびＣＭＶプロモータである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサーエレメント、プロモータおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。また、エンハンサーエレメントは、本明細書では「エンハンサー」とも称され、限定はされないが、ＣＭＶエンハンサーであってもよく、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモータであってもよく、および５’ＵＴＲ／イントロンは、限定はされないが、ＳＶ４０およびＣＢＡ－ＭＶＭであってもよい。非限定的な例として、組合せで使用されるエンハンサー、プロモータおよび／またはイントロンは、（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＡ－ＭＶＭ ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモータ；（５）ＧＵＳＢプロモータ；（６）ＮＳＥプロモータ；（７）シナプシンプロモータ；（８）ＭｅＣＰ２プロモータおよび（９）ＧＦＡＰプロモータであってもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、操作されたプロモータを含む。
別の実施形態において、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質のプロモータを含む。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。一般的には、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写の終結シグナルまで継続する。
特定の標的臓器の、豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を、ＵＴＲ内に操作して、安定性およびタンパク質産生を増強することができる。非限定的な例として、肝臓において通常発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）に由来する５’ＵＴＲを、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用して、肝細胞株または肝臓での発現を増強することができる。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始に役割を果たす特徴を含む。コザック配列は、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが広く知られており、通常は５’ＵＴＲに含まれている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中Ｒは、開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、別の「Ｇ」がその後に続く。特定の実施形態において、ウイルスゲノムにおける５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムにおける５’ＵＴＲは、コザック配列を含まない。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー率を有する遺伝子において特に広く見受けられる。それらの配列特徴および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分離することができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９５年。その内容は、ＡＵリッチエレメントに関するものとして、本明細書において全体として参照により援用される）：限定はされないが、ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤなどのクラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。限定はされないが、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａなどのクラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。限定はされないが、ｃ－ＪｕｎおよびミオゲニンなどのクラスＩＩＩ ＡＲＥＳは、それほど十分に規定されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーである最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に、操作により加えることは、インビボにて、ＨｕＲ結合を、したがってメッセージの安定化をもたらすことになる。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または改変を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特異的なポリヌクレオチド（例えばウイルスゲノムのペイロード領域）を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドをより不安定にし、それにより、翻訳を減らし、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを、同定および除去または突然変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールを鋳型付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシード、結合部位または完全な配列を含み得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、核酸標的の部位に結合し、核酸分子安定性を低減することまたは翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９～２５ヌクレオチド非コードＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２～８位の領域の配列を含む。この配列は、核酸のｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソンクリック型相補性を有する。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、配列またはシード領域を含む、変更するまたは除去するように操作されていてもよい。
当該技術分野で公知の任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲを、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択されたかまたはそれらの配向性もしくは位置が変更され得る遺伝子と同じ配向性に配置され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用されるＵＴＲは、逆位化、短縮化、延長化、当該技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用されるとき、用語「変更される」は、ＵＴＲに関する場合、ＵＴＲが、参照配列に対して何らかの点で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示されるような配向性または位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更されていてもよく、または追加ヌクレオチドの介在、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって変更されていてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲのバリアントでない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択されているＵＴＲを含む。
ポリアデニル化配列
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＩＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列または「ポリＡ配列」は、存在しないものから約５００ヌクレオチド長までの範囲であり得る。ポリアデニル化配列は、長さが１～５００ヌクレオチド（またはその中の任意の値もしくは範囲）であり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は１２７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、長さが４７７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は５５２ヌクレオチド長である。
リンカー
本開示のウイルスゲノムは、コード領域または非コード領域を分離するために、１つ以上のスペーサーまたはリンカー領域で操作され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のペイロード領域は、任意選択で、１つ以上のリンカー配列をコードし得る。場合によっては、リンカーは、ペイロード領域によってコードされるポリペプチドを接続するために使用され得るペプチドリンカーであり得る。一部のペプチドリンカーは、発現後に切断されてポリペプチドドメインを分離し得、成熟タンパク質断片のアセンブリを可能にする。リンカーの切断は酵素的であり得る。場合によっては、リンカーは、細胞内または細胞外の切断を促進するための酵素的切断部位を含む。一部のペイロード領域は、ｍＲＮＡ転写産物からのリンカー配列の翻訳中にポリペプチド合成を中断するリンカーをコードする。そのようなリンカーは、単一の転写物からの別個のタンパク質ドメイン（例えば、重鎖および軽鎖抗体ドメイン）の翻訳を促進し得る。場合によっては、２つ以上のリンカーがウイルスゲノムのペイロード領域によってコードされる。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、フューリン切断部位を含むリンカーをコードする。フューリンはカルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼであり、塩基性アミノ酸標的配列（Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇ）のすぐ下流のタンパク質を切断する（トーマス ジー（Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．），２００２．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（１０）：７５３～６６頁；その内容は、リンカー分子または配列に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。フューリンは、細胞前駆体タンパク質の処理に関与するトランス－ゴルジネットワークに富んでいる。フューリンはまた、多くの病原体を活性化する役割を果たす。この活性は、本開示のポリペプチドの発現のために利用され得る。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、２Ａペプチドを含むリンカーをコードする。２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、豚テッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、または馬鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）などのウイルスに由来する小型「自己切断」ペプチド（１８～２２アミノ酸）である。２Ａの名称は、２ＡペプチドのＣ末端のグリシル－プロリル結合でリボソームスキップを引き起こすピコルナウイルスポリタンパク質の領域を具体的に指す（キム、ジェイ．エイチら（Ｋｉｍ、Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．）、２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅ１８５５６；その内容は、２Ａペプチドリンカーに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。このスキップにより、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドとの間が切断される。ＩＲＥＳリンカーとは対照的に、２Ａペプチドは２Ａペプチドに隣接するタンパク質の化学量論的発現を生成し、それらのより短い長さはウイルス発現ベクターの生成に有利であり得る。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、ＩＲＥＳを含むリンカーをコードする。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、ｍＲＮＡ配列の途中で翻訳を開始し得るヌクレオチド配列（＞５００ヌクレオチド）である（キム、ジェイ．エイチら（Ｋｉｍ、Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．）、２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅ１８５５６；その内容は、ＩＲＥＳ領域およびリンカーに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。ＩＲＥＳ配列を使用すると、ＩＲＥＳの前後の遺伝子の同時発現が保証されるが、ＩＲＥＳに続く配列は、ＩＲＥＳ配列に先行する配列よりも低いレベルで転写および翻訳され得る。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼまたはレグマイン切断部位を含む１つ以上のリンカーをコードし得る。そのようなリンカーは、例えば、シゼア（Ｃｉｚｅａｕ）およびマクドナルド（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ）により、国際公開第２００８０５２３２２号パンフレットに記載されており、その内容は、リンカー分子および配列に関連するものとして、その全体が本願明細書に援用されている。カテプシンは、特定のタンパク質を切断する固有の機構を有するプロテアーゼのファミリーである。カテプシンＢは、システインプロテアーゼであり、カテプシンＤは、アスパラギン酸プロテアーゼである。マトリックスメタロプロテイナーゼは、カルシウム依存性および亜鉛含有エンドペプチダーゼのファミリーである。レグマインは、タンパク質と小分子基質の（－Ａｓｎ－Ｘａａ－）結合の加水分解を触媒する酵素である。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、切断されないリンカーをコードし得る。そのようなリンカーは、グリシンに富む配列などの単純なアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、リンカーは、グリシンおよびセリン残基を含む可塑性のペプチドリンカーを含み得る。リンカーは、異なる長さの可塑性のペプチドリンカー、例えば、ｎｘＧ４Ｓを含み得、ここでｎ＝１～１０（配列番号１３）であり、およびコードされたリンカーの長さは５～５０アミノ酸の間で変化する。非限定的な例として、リンカーは、５ｘＧ４Ｓ（配列番号１４）であり得る。これらの可塑性のリンカーは小さく、側鎖がないため、抗体セグメント間に可塑性のリンカーを提供しながら、二次タンパク質構造に影響を与えない傾向がある（ジョージ、アール．エーら（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｒ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．）、２００２．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５（１１）：８７１－９；ヒューストン、ジェイ．エスら（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．）、１９８８．ＰＮＡＳ８５：５８７９～８３頁；およびシャン、ディーら（Ｓｈａｎ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．）、１９９９．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １６２（１１）：６５８９～９５頁；それらのそれぞれの内容は、リンカー分子および配列に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。さらに、セリン残基の極性は溶解性を改善し、凝集の問題を防ぐ。
特定の実施形態において、本開示のペイロード領域は、ヒューストンら（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）によって、米国特許第５５２５４９１号明細書（その内容は、リンカー分子および配列に関連するものとして、その全体を本願明細書に援用する）に記載されたリンカーなどの、小さくかつ分岐していないセリンに富むペプチドリンカーをコードし得る。セリンに富むリンカーによって連結された、本開示のペイロード領域によってコードされるポリペプチドは、溶解度が増加している。
特定の実施形態において、本開示のペイロード領域は、それらのそれぞれの内容が、リンカー分子および配列に関連して、それらの全体によって本願明細書に援用する、ホイットゥロウ（Ｗｈｉｔｌｏｗ）およびフィルピューラ（Ｆｉｌｐｕｌａ）によって米国特許第５８５６４５６号明細書、およびラドナーら（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）によって米国特許第４９４６７７８号明細書に記載されているリンカーなどの人工リンカーをコードし得。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＧ４Ｓ３リンカー（配列番号１５）をコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＧ４Ｓリンカー（配列番号１６）をコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのフューリン部位をコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＴ２Ａリンカーをコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＦ２Ａリンカーをコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＰ２Ａリンカーをコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列をコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのＧ４Ｓ５リンカー（配列番号１４）をコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのフューリンおよび１つの２Ａリンカーをコードする。特定の実施形態において、ペイロード領域は、少なくとも１つのヒンジ領域をコードする。非限定的な例として、ヒンジはＩｇＧヒンジである。
特定の実施形態において、リンカー領域は、１～５０、１～１００、５０～１００、５０～１５０、１００～１５０、１００～２００、１５０～２００、１５０～２５０、２００～２５０、２００～３００、２５０～３００、２５０～３５０、３００～３５０、３００～４００、３５０～４００、３５０～４５０、４００～４５０、４００～５００、４５０～５００、４５０～５５０、５００～５５０、５００～６００、５５０～６００、５５０～６５０、または６００～６５０長のヌクレオチドであり得る。リンカー領域は、１～６５０ヌクレオチド（またはその中の任意の値もしくは範囲）の長さ、または６５０を超える長さを有し得る。特定の実施形態において、リンカー領域は、１２ヌクレオチドの長さであり得る。特定の実施形態において、リンカー領域は１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は４５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は５４ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は６６ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は７５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は７８ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は８７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は１０８ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は１５３ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は１９８ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、リンカー領域は６２３ヌクレオチド長である。
イントロン
特定の実施形態において、ベクターゲノムは、イントロンなど、導入遺伝子標的の特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌｅｔ ａｌ．）Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５年を参照；その内容は、導入遺伝子標的化エンハンサーに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７～９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β－グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビンスプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
特定の実施形態において、イントロンまたはイントロン部分は、１００～５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０～１００、８０～１２０、８０～１４０、８０～１６０、８０～１８０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、２００～３００、２００～４００、２００～５００、３００～４００、３００～５００または４００～５００の長さを有してもよい。
スタッファー配列
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、スタッファーまたはフィラー配列などの、パッケージング効率および発現を改善するための少なくとも１つのエレメントを含む。スタッファー配列の非限定的な例として、アルブミンおよび／またはアルファ－１アンチトリプシンが挙げられる。任意の公知のウイルス、哺乳動物、または植物の配列を、スタッファー配列として使用するために操作してもよい。
特定の実施形態において、スタッファーまたはフィラー配列は、約１００～３５００ヌクレオチドの長さであり得る。スタッファー配列は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００の長さを有し得る。
ｍｉＲＮＡ
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、特定の組織における導入遺伝子の発現を低減するために、ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの配列を含む。ｍｉＲＮＡおよびそれらの標的組織は当該技術分野で周知である。非限定的な例として、ｍｉＲ－１２２ ｍｉＲＮＡを、ウイルスゲノムにコードして、肝臓でのウイルスゲノムの発現を低下し得る。
ペイロード
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのペイロード領域を含む少なくとも１つのペイロードコンストラクトを含んでもよいし、またはそれを使用して産生されてもよい。特定の実施形態において、ペイロード領域は、ペイロードコンストラクトのウイルスゲノムなどのウイルスゲノム内に位置し得る。ペイロード領域の５’および／または３’末端には、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）が存在し得る。ペイロード領域内には、プロモータ領域、イントロン領域、およびコード領域があり得る。
特定の実施形態において、本開示のペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても公知のバクミドであり得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のペイロード領域は、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、目的の２つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムを、複製して、ウイルス粒子にパッケージ化してもよい。ベクターゲノムを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一の標的細胞において１つ以上のポリペプチドのそれぞれを発現し得る。
ＡＡＶ粒子ペイロード領域がポリペプチドをコードする場合、このポリペプチドは、ペプチドであっても、ポリペプチドであっても、またはタンパク質であってもよい。非限定的な例として、ペイロード領域は、目的の少なくとも１つの治療用タンパク質をコードし得る。本明細書に記載されるポリペプチドをコードするＡＡＶウイルスゲノムは、ヒト疾患、ウイルス、感染症、獣医学的応用の分野、ならびに様々なインビボおよびインビトロ設定において有用であり得る。
特定の実施形態において、処方されたＡＡＶ粒子（ウイルスゲノムを含む）の対象への投与は、対象におけるタンパク質の発現を増大させる。特定の実施形態において、タンパク質の発現の増大は、ペイロードによってコードされるポリペプチドに関係する疾患または病気の影響および／または症状を低減する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、目的のタンパク質（すなわち、ペイロードタンパク質、治療用タンパク質）をコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、限定するものではないが、抗体、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＡｐｏＥ２、フラタキシン（Ｆｒａａｔａｘｉｎ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ、イズロン酸２－スルファターゼ、アルファ－Ｌ－イデュロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バテニン、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６（リンクリン）、ＭＦＳＤ８、ＣＬＮ８、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）、ＭｅＣＰ２、ベータガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）および／またはギガキソニン（ＧＡＮ）を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の国際刊行物のいずれか１つに記載される疾患関連タンパク質（およびその断片またはバリアント）のいずれかをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット；それらの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体がそれぞれ本願明細書に援用される。
本開示のウイルスゲノムのペイロード領域によってコードされるアミノ酸配列は、１つ以上の核酸、核酸の断片または上述のいずれかのバリアントによって独立してコードされ得る、ポリペプチド全体、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片として翻訳され得る。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合でペプチド結合によって一緒に連結されているアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。一部の場合において、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、その場合は、ポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドは、ペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長であろう。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、上述のものの相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の均等物、バリアント、および類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体であってもよい。また、それらは、単一鎖または複数鎖のポリペプチドを含んでいてもよく、付随または連結されていてもよい。用語「ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも該当し得る。
特定の実施形態において、「ポリペプチドバリアント」が提供される。用語「ポリペプチドバリアント」は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。大抵の場合、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％同一性（相同性）を有することになり、特定の実施形態において、天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％同一（相同性）であるだろう。
本開示は、そのベクターゲノムが調節性ポリヌクレオチド、例えば、治療剤としてのＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をコードする製剤化されたＡＡＶ粒子の使用を含む。よって、本開示は、目的の遺伝子を標的とする低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ）にプロセシングされるポリヌクレオチドをコードするベクターゲノムを提供する。本開示はまた、疾患、障害、および／または状態を処置するために、目的の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害するためのそれらの使用方法を提供する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１つ以上の調節性ポリヌクレオチドをコードするかまたは含む核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、目的の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。本開示の特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、治療剤として提示される。ＲＮＡ干渉媒介性遺伝子サイレンシングは、標的遺伝子の発現を特異的に阻害し得る。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、標的遺伝子発現および／または標的タンパク質産生を妨害する調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、阻害／修飾される遺伝子発現またはタンパク質産生としては、限定するものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、第９染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲＤＢＰ）、アタキシン－３（ＡＴＸＮ３）、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）（ＨＴＴ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、電圧ゲートナトリウムチャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、および／または電圧ゲートナトリウムチャネルアルファサブユニット１０（ＳＣＮ１０Ａ）が挙げられる。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の国際刊行物のいずれか１つに記載の調節性ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、および／またはＲＮＡ二重鎖のいずれかをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット；それらの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体がそれぞれ本願明細書に援用される。
特定の実施形態において、そのようなｓｉＲＮＡ分子、またはｓｉＲＮＡ分子の一本鎖をコードする核酸配列を、アデノ随伴ウイルスベクターに挿入し、細胞、具体的には中枢神経系の細胞に導入する。
ＡＡＶ粒子はいくつかの固有の特徴のおかげでｓｉＲＮＡ送達について研究されてきた。特徴の非限定的な例として、以下が挙げられる：（ｉ）分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉ）ヒト細胞を含む、感染性の広範な宿主範囲；（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶはいかなる疾患にも関係しておらず、感染細胞で複製することは示されていない；（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介性免疫応答の欠如、および（ｖ）宿主染色体における非統合的性質により、長期発現の可能性が低下する。さらに、ＡＡＶ粒子による感染は、細胞の遺伝子発現のパターンの変化に最小限の影響しか与えない（スティルウェルおよびサムルスキィら（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４，１４８）。
特定の実施形態において、本開示のコードされたｓｉＲＮＡ二本鎖は、一緒になってハイブリダイズして二本鎖構造を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、ここで、このアンチセンス鎖は、目的の標的遺伝子の核酸配列に相補的であり、このセンス鎖は、目的の標的遺伝子の核酸配列と相同である。他の態様では、各鎖の３’末端に０、１または２ヌクレオチドのオーバーハングがある。
本開示の製剤化されたＡＡＶ粒子のペイロードは、遺伝子発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導阻害を受けやすい１つ以上の薬剤をコードし得る。本明細書で提供されるのは、目的の遺伝子（本明細書では総称して「ｓｉＲＮＡ分子」と呼ばれる）を標的とするコードされたｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡである。そのようなｓｉＲＮＡ分子、例えば、コードされたｓｉＲＮＡ二重鎖、コードされたｄｓＲＮＡまたはコードされたｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ前駆体は、細胞、例えば、星状細胞またはミクログリア、皮質、海馬、嗅内、視床、感覚または運動ニューロンにおける遺伝子発現を低減またはサイレンシングし得る。
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クェリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、または同時抑制（ｃｏ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）としても公知）は、転写後遺伝子サイレンシングプロセスであり、ここではＲＮＡ分子が、典型的には、特定のｍＲＮＡ分子の破壊を生じることによって、配列特異的方式で遺伝子発現を阻害する。ＲＮＡｉの活性構成要素は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖／低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、典型的には１５～３０ヌクレオチド（例えば、１９～２５、１９～２４、または１９～２１ヌクレオチド）、および２－ヌクレオチド３’オーバーハングを含み、それは標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いＲＮＡ種は、より大きなｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ媒介性の切断によってｉｎ ｖｉｖｏで自然に産生され得、それらは哺乳動物細胞で機能的である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）としても公知の自然に発現する低分子ＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現を調節することによって遺伝子サイレンシングを誘発する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含むｍｉＲＮＡは、シード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの５’領域のヌクレオチド２～７、およびその３’領域と他の塩基対との完全な配列相補性を示すｍＲＮＡを標的とする。ｍｉＲＮＡを媒介した遺伝子発現のダウンレギュレーションは、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡの崩壊によって引き起こされ得る。ｍｉＲＮＡ標的化配列は通常、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。単一のｍｉＲＮＡが様々な遺伝子からの１００を超える転写産物を標的とする場合があり、１つのｍＲＮＡが異なるｍｉＲＮＡの標的となる場合がある。
特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、ＡＡＶ粒子のペイロードとして設計されてもよく、ＲＮＡｉプロセスを活性化するために細胞に導入されてもよい。エルバシルら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖（低分子干渉ＲＮＡと呼ばれる）が、哺乳動物細胞で免疫応答を誘発することなく、効力のあるかつ特異的な遺伝子ノックダウンをもたらし得ることを実証した（エルバシルエスエムら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４－４９８）。この最初の報告以来、ｓｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングは、哺乳動物細胞における遺伝子解析のための強力なツールとして直ちに出現し、新しい治療法を産生す可能性がある。
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖および標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二重鎖は、一本鎖（ｓｓ）－ｓｉＲＮＡ（例えば、アンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）を使用する場合と比較して、標的ＲＮＡ破壊の効率の点ではるかに有利である。多くの場合、対応する二本鎖の効果的な遺伝子サイレンシング効力を達成するには、より高濃度のｓｓ－ｓｉＲＮＡが必要である。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、分子足場も含む調節性ポリヌクレオチドにコードされ得る。本明細書で使用される場合、「分子足場」とは、後続の分子を設計または作製するための配列または構造的基礎を形成するフレームワークまたは出発分子である。
特定の実施形態において、ペイロード（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは本明細書に記載の他のＲＮＡｉ剤）を含む調節性ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得、全体としてもしくは部分的に野生型マイクロＲＮＡ配列から誘導され得るか、または完全に人工的である先行５’隣接配列を含む分子足場を含む。３’隣接配列は、サイズおよび起源において５’隣接配列を反映している場合がある。特定の実施形態において、５’および３’隣接配列の一方または両方が存在しない。
特定の実施形態において、分子足場は、当該技術分野で公知の１つ以上のリンカーを含み得る。このリンカーは、領域または１つの分子足場を別の分子足場から分離し得る。非限定的な例として、分子足場はポリシストロン性であり得る。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、以下の特性のうちの少なくとも１つを使用して設計される：ループバリアント、シードミスマッチ／バルジ／ウォブルバリアント、ステムミスマッチ、ループバリアントおよび基底ステムミスマッチバリアント、シードミスマッチおよび基底ステムミスマッチバリアント、ステムミスマッチおよび基底ステムミスマッチバリアント、シードウォブルおよび基底ステムウォブルバリアント、またはステム配列バリアント。
ゲノムサイズ
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むＡＡＶ粒子は、一本鎖または二本鎖ベクターゲノムであり得る。ベクターゲノムのサイズは、小型、中型、大型または最大サイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むベクターゲノムは、小型一本鎖ベクターゲノムであり得る。小型一本鎖ベクターゲノムは、２．１～３．５ｋｂのサイズ、例えば、約２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、および３．５ｋｂサイズであり得る。非限定的な例として、小型一本鎖ベクターゲノムは、３．２ｋｂサイズであり得る。別の非限定的な例として、小型一本鎖ベクターゲノムは、２．２ｋｂサイズであり得る。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むベクターゲノムは、小型二本鎖ベクターゲノムであり得る。小型二本鎖ベクターゲノムは、１．３～１．７ｋｂサイズ、例えば、約１．３、１．４、１．５、１．６、および１．７ｋｂサイズであり得る。非限定的な例として、小型二本鎖ベクターゲノムは、１．６ｋｂサイズであり得る。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロード、例えば、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含むベクターゲノムは、中型一本鎖ベクターゲノムであり得る。中型一本鎖ベクターゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂサイズなど、３．６～４．３ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型一本鎖ベクターゲノムは、４．０ｋｂサイズであり得る。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むベクターゲノムは、中型二本鎖ベクターゲノムであり得る。中型二本鎖ベクターゲノムは、約１．８、１．９、２．０、および２．１ｋｂサイズなど、１．８～２．１ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型二本鎖ベクターゲノムは、２．０ｋｂサイズであり得る。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むベクターゲノムは、大型一本鎖ベクターゲノムであり得る。大型一本鎖ベクターゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂサイズなど、４．４～６．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは、４．７ｋｂサイズであり得る。別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは、４．８ｋｂサイズであり得る。さらに別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは６．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載のペイロードを含むベクターゲノムは、大型二本鎖ベクターゲノムであり得る。大型二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂサイズなど、２．２～３．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型二本鎖ベクターゲノムは、２．４ｋｂサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
ＡＡＶ血清型
本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然もしくは組換えＡＡＶ血清型を含んでもよいし、またはそれらに由来してもよい。本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、血清型を利用しても、もしくはそれに基づいてもよく、または以下のいずれかから選択されるペプチドを含んでもよい：ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、カプリンＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、真型（ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ）ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、日本ＡＡＶ １０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ
８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３２／３３、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４６、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．２６、またはそれらのバリアントもしくは誘導体。
ＡＡＶ－ＤＪ配列には、（１）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変更されるＲ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変更されるＲ５９０Ｔという２つの突然変異が含まれてもよい。別の非限定的な例として、以下の３つの突然変異が含まれる場合がある：（１）アミノ酸４０６のリジン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変更されるＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変更されるＲ５８７Ｑ、および（３）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変更されるＲ５９０Ｔ。
特定の実施形態において、ＡＡＶは、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１ナンバリング）に突然変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリーによって生成された血清型であり得る。血清型ならびに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸置換は、限定するものではないが、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ、；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得る。
本明細書において引用および／または記載したＤＮＡおよびＲＮＡ配列のいずれかにおいて、一文字記号は以下の説明を有する：Ａはアデニンであり；Ｃはシトシンであり；Ｇはグアニンであり；Ｔはチミンであり；Ｕはウラシルであり；Ｗはアデニンまたはチミンなどの弱塩基であり；Ｓはシトシンおよびグアニンなどの強ヌクレオチドであり；Ｍはアデニンおよびシトシンなどのアミノヌクレオチドであり；Ｋはグアニンおよびチミンなどのケトヌクレオチドであり；Ｒはプリンのアデニンおよびグアニンであり；Ｙはピリミジンのシトシンおよびチミンであり；ＢはＡではない任意の塩基（例えば、シトシン、グアニン、およびチミン）であり；ＤはＣではない任意の塩基（例えば、アデニン、グアニン、およびチミン）であり；ＨはＧではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびチミン）であり；ＶはＴではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）であり；Ｎは任意のヌクレオチドであり（ギャップではない）；Ｚはゼロである。
本明細書で参照および／または記載されているアミノ酸配列のいずれにおいても、一文字記号は以下の説明を有する：グリシンはＧ（Ｇｌｙ）であり；アラニンはＡ（Ａｌａ）であり；ロイシンはＬ（Ｌｅｕ）であり；メチオニンはＭ（Ｍｅｔ）であり；フェニルアラニンはＦ（Ｐｈｅ）であり；トリプトファンはＷ（Ｔｒｐ）であり；リジンはＫ（Ｌｙｓ）であり；グルタミンはＱ（Ｇｌｎ）であり；グルタミン酸はＥ（Ｇｌｕ）であり；セリンはＳ（Ｓｅｒ）であり；プロリンはＰ（Ｐｒｏ）であり；バリンはＶ（Ｖａｌ）であり；イソロイシンはＩ（Ｉｌｅ）であり；システインはＣ（Ｃｙｓ）であり；チロシンはＹ（Ｔｙｒ）であり；ヒスチジンはＨ（Ｈｉｓ）であり；アルギニンはＲ（Ａｒｇ）であり；アスパラギンはＮ（Ａｓｎ）であり；アスパラギン酸はＤ（Ａｓｐ）であり；スレオニンはＴ（Ｔｈｒ）であり；アスパラギン酸またはアスパラギンはＢ（Ａｓｘ）であり；ロイシンまたはイソロイシンはＪ（Ｘｌｅ）であり；ピロリシンはＯ（Ｐｙｌ）であり；セレノシステインはＵ（Ｓｅｃ）であり；任意のアミノ酸はＸ（Ｘａａ）であり；およびグルタミンまたはグルタミン酸はＺ（Ｇｌｘ）である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、国際公開第２０１５０３８９５８号パンフレット、国際公開第２０１７１００６７１号パンフレット、国際公開第２０１６１３４３７５号パンフレット、国際公開第２０１７０８３７２２号パンフレット、国際公開第２０１７０１５１０２号パンフレット、国際公開第２０１７０５８８９２号パンフレット、国際公開第２０１７０６６７６４号パンフレット、米国特許第９６２４２７４号明細書、米国特許第９４７５８４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６９２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１４５４０５号明細書に記載のような配列、インサート、改変または突然変異であってもよいし、またはそれらを含んでもよく、それらの内容は、ＡＡＶ血清型および改変に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、ＡＡＶは、デバーマンら（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４（２）：２０４－２０９（２０１６））によって記載されるように、Ｃｒｅ組換えベースのＡＡＶ標的進化（ＣＲＥＡＴＥ）によって生成される血清型であってもよく、その内容は、その全体を参照により本願明細書に援用する。特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ジャクソンら（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９：１５４頁（２０１６年））に記載されているとおりであり得、その内容は、その全体のＡＡＶ血清型および改変が参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、中枢神経系の細胞に対するその向性に起因して使用のために選択される。特定の実施形態において、中枢神経系の細胞はニューロンである。別の実施形態において、中枢神経系の細胞は星状細胞である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、筋肉の細胞（複数可）に対するその向性に起因して使用のために選択される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、米国特許第８１６３５４３号明細書に記載されるように、ＣＴＧ、ＴＴＧ、またはＧＴＧであり得、その内容は、その全体のＡＡＶ血清型および改変が参照により本願明細書に援用する。
本開示は、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子にコードされる構造的カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む）に言及する。これらのカプシドタンパク質はＡＡＶなどのウイルスベクターのタンパク質外部の構造的殻（すなわちカプシド）を形成する。Ｃａｐポリヌクレオチドから合成されたＶＰカプシドタンパク質には、一般に、ペプチド配列中の最初のアミノ酸としてメチオニンが含まれ（Ｍｅｔ１）、これは対応するＣａｐヌクレオチド配列中の開始コドン（ＡＵＧまたはＡＴＧ）に関連している。しかし、最初のメチオニン（Ｍｅｔ１）残基または一般にどの最初のアミノ酸（ＡＡ１）でも、ポリペプチド合成後またはその間に、Ｍｅｔ－アミノペプチダーゼなどのタンパク質プロセシング酵素によって切断されることが一般的である。この「Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング」プロセスは、しばしば、ポリペプチド配列中の２番目のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、セリン、スレオニンなど）の対応するアセチル化に関連している。Ｍｅｔクリッピングは一般的にＶＰ１およびＶＰ３のカプシドタンパク質で起こるが、ＶＰ２カプシドタンパク質でも起こる場合がある。
Ｍｅｔ／ＡＡクリッピングが不完全である場合、ウイルスカプシドを含む１つ以上（１、２または３）のＶＰカプシドタンパク質の混合物が産生され得、そのいくつかは、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）を含み得、およびそのうちのいくつかは、Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）の結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠いている場合がある。カプシドタンパク質のＭｅｔ／ＡＡクリッピングに関するさらなる考察については、ジンら（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．）組換えアデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質の完全な特性評価のための直接液体クロマトグラフィー／質量分析（Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）．ヒューマン・ジーン・セラピー・メソッズ（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．）２０１７年１０月 ２８（５）：２５５～２６７頁；ウォンら（Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）細胞タンパク質のＮ末端アセチル化は、特定の分解シグナルを生成する（Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｒｅａｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）．２０１０年２月 １９．３２７（５９６８）：９７３～９７７頁を参照；それらの内容はそれぞれ、カプシドタンパク質の修飾およびクリッピングに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
本開示によれば、カプシドタンパク質への言及は、クリップされた（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）またはクリップされていない（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）のいずれかに限定されず、文脈において、独立したカプシドタンパク質、本開示のカプシドタンパク質をコードするか、記述するか、産生するか、またはもたらすカプシドタンパク質、および／またはポリヌクレオチド配列（またはその断片）の混合物を含むウイルスカプシドを指す場合がある。「カプシドタンパク質」または「カプシドポリペプチド」（ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ２など）への直接参照には、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）を含むＶＰカプシドタンパク質、および対応するＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）の結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠く）も含まれる場合がある。
さらに本開示によれば、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）を含む１つ以上のカプシドタンパク質をそれぞれ含むかまたはコードする特定の配列番号（タンパク質であるかまたは核酸であるか）への言及は、その配列のレビュー時に、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠くＶＰカプシドタンパク質を教示すると理解されるべきであり、最初に列挙されたアミノ酸を単に欠く任意の配列（Ｍｅｔ１／ＡＡ１であるか否かにかかわらず）は容易に明らかである。
非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、ＡＵＧ／ＡＴＧ開始コドンによってコードされる「Ｍｅｔ１」アミノ酸（Ｍｅｔ＋）を含むＶＰ１ポリペプチド配列への言及はまた、７３５アミノ酸長であり、７３６アミノ酸Ｍｅｔ＋配列の「Ｍｅｔ１」アミノ酸（Ｍｅｔ－）を含まないＶＰ１ポリペプチド配列を教示することも理解され得る。第２の非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、任意のＮＮＮ開始コドンによってコードされる「ＡＡ１」アミノ酸（ＡＡ１＋）を含むＶＰ１ポリペプチド配列への言及はまた、７３５アミノ酸長であり、７３６アミノ酸のＡＡ１＋配列の「ＡＡ１」アミノ酸（ＡＡ１－）を含まないＶＰ１ポリペプチド配列を教示すると理解され得る。
ＶＰカプシドタンパク質から形成されるウイルスカプシドへの言及（特定のＡＡＶカプシド血清型への言及など）は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）を含むＶＰカプシドタンパク質、Ｍｅｔ／ＡＡ１－クリッピング（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）の結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠く、対応するＶＰカプシドタンパク質、およびそれらの組合せ（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋およびＭｅｔ－／ＡＡ１－）を組み込み得る。
非限定的な例として、ＡＡＶカプシド血清型は、ＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ１（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）、またはＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）とＶＰ１（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）との組合せを含み得る。ＡＡＶカプシド血清型には、ＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ３（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）、またはＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）とＶＰ３（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）との組合せも含み得る；また、ＶＰ２（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１）とＶＰ２（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）の同様のオプションの組合せも含み得る。
細胞への導入
本開示のコードされたｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、ＡＡＶ粒子のベクターゲノムによってコードされることによって細胞に導入され得る。これらのＡＡＶ粒子は、トランスフェクション／形質導入を容易に修正できない細胞への進入を促進するように操作および最適化されている。また、一部の合成ウイルスベクターは、ｓｈＲＮＡを細胞ゲノムに組み込む能力を保有しており、それによって、安定したｓｉＲＮＡ発現および標的遺伝子の長期的なノックダウンにつながる。このように、ウイルスベクターは、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または統合機能を欠きながら、特定の送達のための媒体として操作されている。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で転写されたときにｓｉＲＮＡ分子を産生し得る核酸配列を含むＡＡＶ粒子を細胞にトランスフェクト、感染、または形質導入することによって細胞に導入される。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で転写されたときにｓｉＲＮＡ分子を産生し得る核酸配列を含むＡＡＶ粒子を細胞または組織に注入することによって細胞に導入される。
特定の実施形態において、トランスフェクション／形質導入の前に、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子を細胞にトランスフェクトしてもよい。
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶ粒子を導入する他の方法には、米国特許出願公開第２０１２０２６４８０７号明細書に記載されているような光化学的内在化が含まれ得る；その内容は、光化学的内在化に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、本明細書に記載される製剤は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含み得る。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、１つの標的部位で目的の遺伝子を標的し得る。別の実施形態において、製剤は、複数のＡＡＶ粒子を含み、各ＡＡＶ粒子は、異なる標的部位で目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。目的の遺伝子は、２、３、４、５、または５つ以上の部位で標的され得る。
特定の実施形態において、ヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラットまたはサルなどであるがこれらに限定されない任意の関連種由来のＡＡＶ粒子を細胞に導入してもよい。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、治療される疾患に関連する細胞または組織に導入され得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、標的配列の内因性発現が高レベルである細胞に導入され得る。
別の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、標的配列の内因性発現が低レベルである細胞に導入され得る。
特定の実施形態において、細胞は、ＡＡＶ形質導入の効率が高い細胞であり得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、中枢神経系に対しｓｉＲＮＡ分子を送達するために使用され得る（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書；その内容は、ｓｉＲＮＡ分子およびＡＡＶ粒子の送達および治療的使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、非ウイルス起源のペプチドを含む改変カプシドをさらに含み得る。他の局面において、ＡＡＶ粒子は、脳および脊髄へのコードされたｓｉＲＮＡ二重鎖の送達を促進するためにＣＮＳ特異的キメラカプシドを含み得る。例えば、ＣＮＳ向性を示すＡＡＶバリアントからのｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントを構築して、可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定し得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、ポリシストロン性分子であるｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子の領域間に１つ以上のリンカーを加えて含み得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ配列または二本鎖のうちの少なくとも１つをコードする調節性ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み得る。
特定の実施形態において、発現ベクターは、ＩＴＲから５’から３’に記載されるＩＴＲまで、ＩＴＲ、プロモータ、イントロン、調節性ポリヌクレオチド、ポリＡ配列およびＩＴＲを含み得る。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、限定するものではないが、ＣＭＶ、Ｕ６、Ｈ１、ＣＢＡまたはＣＢＡプロモータ（ＳＶ４０イントロンを有する）など、発現ベクター中のプロモータの下流に位置し得る。さらに、コードされたｓｉＲＮＡ分子はまた、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置されてもよい。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えるヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０のヌクレオチド内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％を超えるのヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％に位置し得る。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置し得る。さらに、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中の限定するものではないが、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡ、またはＣＢＡプロモータ（ＳＶ４０イントロンを有する）などのプロモータの下流に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えるヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０のヌクレオチド内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％を超えるヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％に位置し得る。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｃＡＡＶに位置し得る。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｓＡＡＶに位置し得る。
特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端の近くに位置し得る。別の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端近くに位置し得る。さらに別の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの５’末端近くに位置し得る。さらに別の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの３’末端近くに位置し得る。特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置し得る。特定の実施形態において、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との中間、またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間の中間）に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えるヌクレオチド内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えるヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流の最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％を超えるヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップＩＴＲまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％内に位置し得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ＣＮＳ送達のために製剤化され得る。脳血液関門を通過する薬剤を使用してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を脳血液関門内皮に標的化し得るいくつかの細胞透過性ペプチドを使用して、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を製剤化してもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、ＣＮＳに直接投与され得る。非限定的な例として、ベクターは、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子の組成物は、ベクターまたはｓｉＲＮＡ分子が中枢神経系に入り、運動ニューロンに浸透するのを促進する方法で投与され得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡが、脊髄および／または脳幹において、運動ニューロンおよび星状細胞を標的とするための治療有効量で、対象に（例えば、髄腔内投与を介して対象のＣＮＳに）投与され得る。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、タンパク質またはｍＲＮＡの発現を低下し得る。
ＩＩ．ＡＡＶ産生
一般的なウイルス製造プロセス
ｒＡＡＶ粒子を産生するためのウイルス産生細胞としては、一般に哺乳動物の細胞型が挙げられる。しかしながら、哺乳動物細胞は、ｒＡＡＶ粒子の大規模産生にいくつかの問題を引き起こし、これには、１複製細胞あたりのウイルス粒子の一般的な低収量、およびウイルス産生細胞内の他の哺乳動物生物材料による望ましくない汚染のリスクが高いことが挙げられる。結果として、昆虫細胞は、ｒＡＡＶ粒子の大規模産生のための代替ビヒクルとなった。
昆虫細胞を使用したＡＡＶ産生システムにも様々な問題がある。例えば、ｒＡＡＶ粒子の高収量産生には、Ｒｅｐ５２と比較してＲｅｐ７８の発現がより低いことが必要である場合が多い。したがって、昆虫細胞におけるＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２の相対的な発現を制御するには、Ｒｅｐオペロン内で注意深く設計された制御機構が必要である。これらの制御機構には、個別に操作された昆虫細胞プロモータ、例えば、Ｒｅｐ７８のΔＩＥ１プロモータ、およびＲｅｐ５２のＰｏｌＨプロモータ、またはＲｅｐをコードするヌクレオチド配列を独立して操作した配列またはコンストラクトへの分割が含まれ得る。しかしながら、これらの制御機構を実装すると、ｒＡＡＶ粒子の収量の減少、または構造的に不安定なビリオンにつながる場合が多い。
別の例では、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ＡＡＶカプシドを形成するためにアセンブルするＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を必要とする。ｒＡＡＶ粒子の高収率産生には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の調整された比率が必要であり、これは、一般に、それぞれ約１：１：１０であるべきだが、１０のＶＰ３コピーに対して、ＶＰ１の場合は１～２、および／またはＶＰ２の場合は１～２で変化し得る。ＶＰ１が多すぎるとカプシドが不安定になり、ＶＰ１が少なすぎるとウイルスの感染力が低下するので、この比率はカプシドの品質にとって重要である。
野生型ＡＡＶは、ＶＰ１発現を制御するために不十分なスプライシング法を使用する；ＶＰ２を制御するための特別な周辺配列（「コザック」配列）を有する弱い開始コドン（ＡＣＧ）；およびＶＰ３発現のための標準開始コドン（ＡＴＧ）。しかしながら、一部のバキュロウイルスシステムでは、哺乳動物のスプライシング配列が常に認識されるとは限らず、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の産生を適切に制御できない。その結果、隣接するヌクレオチドおよびＶＰ２由来のＡＣＧ開始配列を使用して、カプシドタンパク質の産生を駆動し得る。残念ながら、ほとんどのＡＡＶ血清型では、この方法により、ＶＰ２と比較してＶＰ１の比率がより低いカプシドが生成される（１０個のＶＰ３コピーに対して１未満）。ＶＰタンパク質の産生をより効果的に制御するために、ＴＴＧ、ＧＴＧ、ＣＴＧなどの非標準または開始コドンが使用されている。しかしながら、これらの開始コドンは、野生型ＡＴＧまたはＡＣＧ開始コドンに比べて最適ではないと当業者によってみなされている（それらの内容が、ＡＡＶカプシドタンパク質の産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、国際公開第２００７０４６７０３号パンフレットおよび国際公開第２００７１４８９７１号パンフレットを参照）。
別の例では、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムを使用したｒＡＡＶ粒子の産生には、一般に、大規模なＡＡＶ産生に最適化されていない広く使用されているバクミドベースのバキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶ）が必要である。バキュロウイルス／Ｓｆ９システムを使用したＡＡＶカプシドタンパク質の信頼性の高い大規模産生を妨げる、バクミドベースのＢＥＶにおけるウイルスタンパク質の異常なタンパク質分解は予期されなかった問題点である。
哺乳動物および昆虫細胞におけるｒＡＡＶ粒子の効果的かつ効率的な大規模（商業的）産生を可能にする方法およびシステムに対する継続的な必要性がある。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載されている。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。この説明では、単数形はまた、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数形を含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当該分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。援用された開示と矛盾する場合は、本書の明示的な説明が優先される。
特定の実施形態において、本開示のコンストラクト、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、血清型、カプシド製剤、または粒子は、以下の国際刊行物の１つに記載の任意の配列、エレメント、コンストラクト、システム、標的またはプロセスであってもよいし、それらを含んでもよいし、それらによって改変されてもよいし、それらによって使用されてもよいし、それらのために使用されてもよいし、それらとともに使用されてもよいし、またはそれらで製造されてもよい：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット；それらの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体がそれぞれ本願明細書に援用される。
本開示のＡＡＶ産生は、標的細胞に接触してペイロード、例えば、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えウイルスコンストラクトを送達し得る、ＡＡＶ粒子およびウイルスベクターを製造するためのプロセスおよび方法を含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である。
本開示は、（ａ）ウイルス産生細胞を、少なくとも１つのキメラカプシドタンパク質をコードする１つ以上のウイルス発現コンストラクト、および１つ以上のペイロードコンストラクトベクターと接触させることであって、ここで前記ペイロードコンストラクトベクターが、導入遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および調節性核酸からなる群より選択されるペイロード分子をコードするペイロードコンストラクトを含むこと；（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターが産生されるような条件下で前記ウイルス産生細胞を培養すること、ならびに（ｃ）前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを単離することによって、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを製造する方法を提供する。
これらの方法において、ウイルス発現コンストラクトは、少なくとも１つの構造タンパク質および／または少なくとも１つの非構造タンパク質をコードし得る。構造タンパク質は、天然型または野生型カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３またはキメラタンパク質のいずれかを含み得る。非構造タンパク質は、天然型または野生型のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０のタンパク質またはキメラタンパク質のいずれかを含み得る。
特定の実施形態において、接触は、一過性のトランスフェクション、ウイルス形質導入および／またはエレクトロポレーションを介して生じる。
特定の実施形態において、ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群より選択される。特定の実施形態において、昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞を含む。特定の実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９昆虫細胞を含む。特定の実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ２１昆虫細胞を含む。
本開示のペイロードコンストラクトベクターは、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み得、そして哺乳動物ＤＮＡを含み得る。
本明細書に記載の方法に従って製造されたＡＡＶ粒子およびウイルスベクターも提供される。
本開示のＡＡＶ粒子は、１つ以上の許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターは、本明細書に記載の方法によって製造され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞）を、少なくとも１つのカプシドタンパク質および少なくとも１つのペイロードコンストラクトベクターをコードする少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトと接触させることによって製造され得る。ウイルス産生細胞は、一過性のトランスフェクション、ウイルス形質導入、および／またはエレクトロポレーションによって接触され得る。ペイロードコンストラクトベクターは、導入遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および調節性核酸などであるがこれらに限定されないペイロード分子をコードするペイロードコンストラクトを含み得る。ウイルス産生細胞は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターが産生され、単離され（例えば、温度誘導溶解、機械的溶解および／または化学的溶解を使用して）、および／または精製される（例えば、濾過、クロマトグラフィーおよび／または免疫親和性精製を使用して）ような条件下で培養され得る。非限定的な例として、ペイロードコンストラクトベクターは、哺乳動物のＤＮＡを含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の方法を使用して、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）において製造される。非限定的な例として、昆虫細胞は、バキュロウイルス形質導入を含み得るウイルス形質導入を使用して接触される。
別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の方法を使用して哺乳動物細胞において製造される。非限定的な例として、哺乳動物細胞は、一過性トランスフェクションを使用して接触させられる。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、少なくとも１つの構造タンパク質および少なくとも１つの非構造タンパク質をコードし得る。非限定的な例として、構造タンパク質としては、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３を含む。別の非限定的な例として、非構造タンパク質には、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０が含まれる。
特定の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶ粒子製造方法は、ウイルス産生細胞において、１０１を超える、１０２を超える、１０３を超える、１０４を超える、または１０５を超えるＡＡＶ粒子を製造する。
特定の実施形態において、本開示のプロセスは、少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトおよび少なくとも１つのペイロードコンストラクトを含むウイルス産生システムを使用するウイルス産生細胞におけるウイルス粒子の産生を含む。少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトおよび少なくとも１つのペイロードコンストラクトは、ウイルス産生細胞に同時トランスフェクトされ得る（例えば、二重トランスフェクション、三重トランスフェクション）。トランスフェクションは、当業者に公知であり、かつ慣用的に行われている標準的な分子生物学技術を使用して完了する。ウイルス産生細胞は、ペイロードコンストラクトを複製するＲｅｐタンパク質および複製されたペイロードコンストラクトを封入するカプシドを形成するためにアセンブルするＣａｐタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子を産生するために必要なタンパク質および他の生体材料の発現に必要な細胞機構を提供する。得られたＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞から抽出され、投与用の医薬品に加工される。
一旦、投与されれば、ＡＡＶ粒子は標的細胞に接触し、エンドソーム内の細胞に入る。ＡＡＶ粒子はエンドソームから放出され、続いて標的細胞の核に接触してペイロードコンストラクトを送達する。ペイロードコンストラクト、例えば組換えウイルスコンストラクトは、ペイロードコンストラクトによってコードされるペイロード分子が発現され得る標的細胞の核に送達される。
特定の実施形態において、ウイルス粒子の産生のためのプロセスは、１つ以上のバキュロウイルス（例えば、ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトベクターをトランスフェクトされたバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）またはバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ））を含むウイルス産生細胞のシード培養物を利用する。特定の実施形態において、シード培養物を、回収し、アリコートに分割して凍結して、そして後の時点で、ナイーブな産生細胞集団の感染を開始するために使用してもよい。
ＡＡＶ粒子の大規模産生はバイオリアクターを利用し得る。バイオリアクターの使用により、質量、温度、混合条件（インペラーＲＰＭまたは波動振動）、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、ガス散布率および容積、ガスオーバーレイ率および容積、ｐＨ、生細胞密度（ＶＣＤ）、細胞生存率、細胞直径、および／または光学密度（ＯＤ）などのウイルス産生細胞の増殖および活動をサポートする変数の正確な測定および／または制御が可能になる。特定の実施形態において、バイオリアクターは、培養物全体が実験的に決定された時点で回収され、ＡＡＶ粒子が精製されるバッチ産生に使用される。別の実施形態において、バイオリアクターは、培養物の一部がＡＡＶ粒子の精製のために実験的に決定された時点で回収され、バイオリアクター内の残りの培養物が追加の増殖培地成分でリフレッシュされる連続産生に使用される。
ＡＡＶウイルス粒子は、細胞溶解、清澄化、滅菌、および精製を含むプロセスにおいてウイルス産生細胞から抽出され得る。細胞溶解には、ウイルス産生細胞の構造を破壊し、それによってＡＡＶ粒子を放出する任意のプロセスが含まれる。特定の実施形態において、細胞溶解は、熱衝撃、化学的、または機械的溶解方法を含み得る。清澄化には、溶解した細胞、培地成分、およびＡＡＶ粒子の混合物の大まかな精製が含まれ得る。特定の実施形態において、清澄化は、遠心分離および／または濾過を含み、これには、限定するものではないが、デプスエンド（ｄｅｐｔｈ ｅｎｄ）、接線流、および／または中空繊維濾過が挙げられる。
ウイルス産生の最終結果は、以下の２つの構成要素を含むＡＡＶ粒子の精製されたコレクションである：（１）ペイロードコンストラクト（例えば、組換えウイルスゲノムコンストラクト）および（２）ウイルスカプシド。
特定の実施形態において、本開示のウイルス産生システムまたはプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）およびプラスミドコンストラクトを使用して、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を産生するためのステップを含む。セルバンク（ＣＢ）からのウイルス産生細胞（ＶＰＣ）を、解凍および拡張して、目標の作業量およびＶＰＣ濃度を得る。得られるＶＰＣのプールは、Ｒｅｐ／ＣａｐＶＰＣプールおよびｊペイロードＶＰＣプールに分割される。１つ以上のＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドコンストラクト（ウイルス発現コンストラクト）がＲｅｐ／Ｃａｐバクミドポリヌクレオチドにプロセシングされ、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＶＰＣプールにトランスフェクトされる。１つ以上のペイロードプラスミドコンストラクト（ペイロードコンストラクト）が、ペイロードバクミドポリヌクレオチドにプロセシングされ、ペイロードＶＰＣプールにトランスフェクトされる。２つのＶＰＣプールをインキュベートして、Ｐ１ Ｒｅｐ／Ｃａｐバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）およびＰ１ペイロードＢＥＶを産生する。２つのＢＥＶプールを、プラークのコレクションに拡張し、クローンプラーク（ＣＰ）精製用に１つのプラークを選択する（シングルプラーク拡張とも呼ばれる）。このプロセスには、単一のＣＰ精製ステップを含んでもよく、または複数のＣＰ精製ステップを直列でまたは他の処理ステップで分離するかで含んでもよい。１つ以上のＣＰ精製ステップは、ＣＰ Ｒｅｐ／ＣａｐＢＥＶプールおよびＣＰペイロードＢＥＶプールを提供する。次いで、これらの２つのＢＥＶプールを、保存して将来の産生ステップに使用してもよいし、次いでＶＰＣにトランスフェクトして、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣプールおよびペイロードＢＩＩＣプールを産生してもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス産生システムまたはプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）およびバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を使用して、ＡＡＶ粒子を産生するためのステップを含む。セルバンク（ＣＢ）のウイルス産生細胞（ＶＰＣ）を、解凍および拡張して、標的の作業量およびＶＰＣ濃度を提供する。ウイルス産生細胞の作業容積を、産生バイオリアクターに播種し、ＢＩＩＣ感染の標的ＶＰＣ濃度で２００～２０００Ｌの作業容積にさらに拡張し得る。次いで、産生バイオリアクターにおけるＶＰＣの作業容積は、標的ＶＰＣ：ＢＩＩＣ比および標的ＢＩＩＣ：ＢＩＩＣ比で、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣおよびペイロードＢＩＩＣで同時感染される。ＶＣＤ感染はまた、ＢＥＶを利用もし得る。同時感染したＶＰＣを、産生バイオリアクターにて培養および増殖し、ＡＡＶ粒子およびＶＰＣのバルク回収物を生じる。
ウイルス発現コンストラクト
本開示のウイルス産生システムは、ウイルス産生細胞にトランスフェクト／形質導入され得る１つ以上のウイルス発現コンストラクトを含む。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても公知のバクミドであり得る。特定の実施形態において、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のためのタンパク質コードヌクレオチド配列および少なくとも１つの発現制御配列を含む。特定の実施形態において、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたタンパク質コードヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、１つ以上のプロモータの制御下にあるパルボウイルス遺伝子を含む。パルボウイルス遺伝子は、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子などの非構造ＡＡＶ複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。パルボウイルス遺伝子には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質をコードするＣａｐ遺伝子など、構造ＡＡＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２コード領域を含んでもよい；Ｒｅｐ５２コード領域は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするＲｅｐ５２ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ７８コード領域を含んでもよい；Ｒｅｐ７８コード領域は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ４０コード領域を含んでもよい；Ｒｅｐ４０コード領域は、Ｒｅｐ４０タンパク質をコードするＲｅｐ４０ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ６８コード領域を含んでもよい；Ｒｅｐ６８コード領域は、Ｒｅｐ６８タンパク質をコードするＲｅｐ６８ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰコード領域を含んでもよい；ＶＰコード領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはそれらの組合せをコードするＶＰヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ１コード領域を含んでもよい；ＶＰ１コード領域は、ＶＰ１タンパク質をコードするＶＰ１ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ２コード領域を含んでもよい；ＶＰ２コード領域は、ＶＰ２タンパク質をコードするＶＰ２ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ３コード領域を含んでもよい；ＶＰ３コード領域は、ＶＰ３タンパク質をコードするＶＰ３ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
ウイルス発現コンストラクトの構造ＶＰタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ならびに非構造タンパク質であるＲｅｐ５２、Ｒｅｐ７８は、選択的スプライシングアクセプターと非標準翻訳開始コドンの両方を利用して調節される単一のオープンリーディングフレームにコードされ得る。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２は両方とも、単一の転写産物から翻訳され得る：Ｒｅｐ７８翻訳は、Ｒｅｐ７８配列内の最初の開始コドン（ＡＵＧまたは非ＡＵＧ）から始まり、Ｒｅｐ５２の翻訳はＲｅｐ５２開始コドン（例えば、ＡＵＧ）から始まる。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２は、独立した開始コドンを有する別々の転写産物から翻訳もされ得る。Ｒｅｐ７８配列内のＲｅｐ５２開始コドンは、改変されたＲｅｐ７８配列のプロセシングがＲｅｐ５２タンパク質を産生しないように、突然変異されても、改変されても、または除去されてもよい。
ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、ヌクレオチド転写産物によって産出されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を制御するように、フレーム内および／またはフレーム外の両方の開始コドンが操作される、単一の転写産物から転写および翻訳され得る。特定の実施形態において、ＶＰ１は、ＶＰ１のみをコードする配列から産出され得る。本明細書で使用する場合、用語「ＶＰ１についてのみ」または「ＶＰ１のみ」は、ヌクレオチド配列または転写物であって、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードし、かつ（ｉ）同じ配列からのＶＰ２およびＶＰ３の完全な転写または翻訳のための、ＶＰ１配列内の必要な開始コドンを欠く（すなわち、欠失または突然変異）；（ｉｉ）同じ配列からのＶＰ２およびＶＰ３の転写または翻訳を妨げるＶＰ１配列内の追加のコドンを含む；あるいは（ｉｉｉ）ＶＰ１がヌクレオチド転写物によって産生される主要なＶＰタンパク質であるように、ＶＰ１の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含むヌクレオチド配列または転写物を指す。
特定の実施形態において、ＶＰ２は、ＶＰ２のみをコードする配列から産生され得る。本明細書で使用する場合、用語「ＶＰ２についてのみ」または「ＶＰ２のみ」は、ヌクレオチド配列または転写物であって、ＶＰ２カプシドタンパク質をコードし、かつ（ｉ）このヌクレオチド転写物が、ＶＰ２のみおよびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする完全なＶＰカプシド配列の短縮型バリアントであり；かつ（ｉｉ）ＶＰ２がヌクレオチド転写物によって産生される主要なＶＰタンパク質であるように、ＶＰ２の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含む、ヌクレオチド配列または転写物を指す。
特定の実施形態において、ＶＰ１およびＶＰ２は、ＶＰ１およびＶＰ２のみをコードする配列から産生され得る。本明細書で使用する場合、用語「ＶＰ１およびＶＰ２のみ」または「ＶＰ１およびＶＰ２のみ」は、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列または転写物であって、（ｉ）同じ配列からのＶＰ３の完全な転写または翻訳のための、ＶＰ配列内の必要な開始コドンを欠く（すなわち、削除または突然変異）；（ｉｉ）同じ配列からのＶＰ３の転写または翻訳を妨げるＶＰ配列内の追加のコドンを含む；（ｉｉｉ）ＶＰ１およびＶＰ２がヌクレオチド転写物によって産生される主要なＶＰタンパク質であるように、ＶＰ１（例えば、ＡＴＧ）およびＶＰ２（例えば、ＡＴＧ）の開始コドンを含む；あるいは（ｉｖ）ＶＰ１のみのヌクレオチド転写物およびＩＲＥＳ領域などのリンカーによって接続されたＶＰ２のみのヌクレオチド転写物を含むヌクレオチド配列または転写物を指す。
本開示のウイルス産生システムは、パルボウイルス機能をウイルス複製細胞に導入するために使用されるウイルス発現ベクターによって制限されない。ウイルス複製細胞におけるウイルス発現コンストラクトの存在は、永続的である必要はない。ウイルス発現コンストラクトは、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、または感染として公知の任意の手段によって導入され得る。
本開示のウイルス発現コンストラクトは、核酸による細胞の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を促進する、生物学的または化学的な任意の化合物または製剤を含み得る。例示的な生物学的ウイルス発現コンストラクトには、プラスミド、線状核酸分子、およびバキュロウイルスを含む組換えウイルスが含まれる。例示的な化学ベクターには、脂質複合体が含まれる。ウイルス発現コンストラクトは、本開示に従って、核酸配列をウイルス複製細胞に組み込むために使用される。（オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）、デイビッド・アール（Ｄａｖｉｄ Ｒ．）、ロイス・ケー・ミラー（Ｌｏｉｓ Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ）、およびベルネ・エー・ルッコウ（Ｖｅｒｎｅ Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ．）、バキュロウイルス発現ベクター（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），１９９４年）；マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）編．分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）．ＣＳＨ・ラボラトリー（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク州、ニューヨーク（ＮＹ）．（１９８２年）；ならびに、フィリッポート（Ｐｈｉｌｉｐｏｒｔ）およびスクラバー（Ｓｃｌｕｂｅｒ）編、基礎的研究および産業におけるツールとしてのリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）．シー・アール・シー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ミシガン州、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）（１９９５年）、その各々の内容は、ウイルス発現コンストラクトおよびその使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、非構造ＡＡＶ複製タンパク質、構造ＡＡＶカプシドタンパク質、またはそれらの組合せをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ発現コンストラクトである。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、プラスミドベクターであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、バキュロウイルスコンストラクトであり得る。
本開示は、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを産生するために用いられるウイルス発現コンストラクトの数によって制限されない。特定の実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のウイルス発現コンストラクトを用いて、本開示に従って、ウイルス産生細胞においてＡＡＶ粒子を産生し得る。１つの非限定的な例として、５つの発現コンストラクトは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＡＡＶ ＶＰ２、ＡＡＶ ＶＰ３、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ７８を個別にコードし得、そして付随するペイロードコンストラクトは、ペイロードポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む。別の実施形態において、発現コンストラクトは、例えば、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８を発現するために用いられ得る。発現コンストラクトは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０、およびＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８コード配列の任意の組合せを含み得る。
本開示の特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞においてＡＡＶ粒子の産生のために使用され得る。特定の実施形態において、改変は、例えば、感染力もしくは特異性の増大などのウイルス粒子の属性を改善するために、または産生収量を増強するために、カプシドおよび／またはｒｅｐ遺伝子の野生型ＡＡＶ配列に対して行われ得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の間に１つ以上の発現制御配列を含んでもよい。特定の実施形態において、発現制御領域は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードするＩＲＥＳヌクレオチド配列を含むＩＲＥＳ配列領域を含み得る。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、口蹄疫ウイルス由来のＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス由来のＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。
特定の実施形態において、発現制御領域は、ウイルス２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む２Ａ配列領域を含んでもよい。ウイルス２Ａ配列は、Ａｓｐ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号１７）のコンセンサス配列を含む比較的短い（約２０アミノ酸）配列である。この配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で複数のポリペプチドの同時翻訳を可能にする。ＯＲＦが翻訳されると、２Ａ配列を有するグリシンおよびプロリン残基が、正常なペプチド結合の形成を防ぎ、その結果、ポリペプチド鎖内でリボソームの「スキップ」および「自己切断」が起こる。ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、馬鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ、豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ、細胞質多面体ウイルス由来のＢｍＣＰＶ２Ａ、Ｂ．ｍｏｒｉ軟化病ウイルス由来のＢｍＩＦＶ２Ａ、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、１つ以上の開始コドン領域を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列などの、開始コドン領域を含むヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、開始コドン領域は、発現制御配列内にあり得る。開始コドンは、ＡＴＧまたは非ＡＴＧコドン（すなわち、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧである次善の開始コドン）であり得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ産生に使用されるウイルス発現コンストラクトは、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧ、すなわち、次善の開始コドンである、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得、宿主細胞の改善された感染性を提供するための、産生システムにおけるウイルスカプシドタンパク質の改変された比率の発現を可能にする。非限定的な例として、ウイルスコンストラクトベクターは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含み得、ここで、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、その内容が、ＡＡＶカプシドタンパク質およびその産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許第８，１６３，５４３号明細書に記載されているＣＴＧ、ＴＴＧ、またはＧＴＧである。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞における発現のためにパルボウイルスｒｅｐタンパク質をコードするプラスミドベクターまたはバキュロウイルスコンストラクトであり得る。特定の実施形態において、単一のコード配列が、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質に使用され、ここでＲｅｐ７８タンパク質の翻訳のための開始コドンは、例えば、Ｒｅｐ５２と比較してＲｅｐ７８のより少ない発現を促進するために（これは、高いベクター収量を促進するという点であり得る）、その内容全体が参照により本願明細書に援用する、米国特許第８，５１２，９８１号明細書に記載されているように、昆虫細胞での発現の際に、部分的エクソンスキッピングを達成する、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧおよびＧＴＧからなる群より選択される次善の開始コドンである。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、例えば、Ｒｅｐタンパク質、例えば、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２の改善された比率を達成するために、異なるコドンバイアスを有する反復コドンを含む昆虫細胞における発現のためのプラスミドベクターであっても、またはバキュロウイルスコンストラクトであってもよく、それにより、その内容が、ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許第８，６９７，４１７号明細書に教示されているように、昆虫細胞におけるウイルス発現コンストラクトおよび／またはペイロードコンストラクトベクターの大規模（商業的）産生が改善される。
別の実施形態において、ｒｅｐタンパク質の改善された比率は、その内容が、ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許第８，６４２，３１４号明細書に記載の方法およびコンストラクトを使用して達成され得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、大規模産生のためのより高いウイルス力価の調製など、それらの対応する野生型Ｒｅｐポリペプチドと比較して１つ以上の改善された特性を有する突然変異体パルボウイルスＲｅｐポリペプチドをコードし得る。あるいは、それらは、より高品質のウイルス粒子の産生を可能にするか、またはウイルスのより安定した産生を維持することを可能にし得る。非限定的な例として、ウイルス発現コンストラクトは、ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関連するものとして、その内容が、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１３００２３０３４号明細書に記載されているように、突然変異した核局在化配列またはジンクフィンガードメインを有する突然変異体Ｒｅｐポリペプチドをコードし得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、パルボウイルスカプシドタンパク質に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１０１７１２６２号明細書に記載されているように、免疫浸潤配列として機能し得る、組み込まれたＧｌｙ－Ａｌａリピート領域を有するパルボウイルスカプシドの構成要素をコードし得る。
本開示の特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の産生のために使用され得る。特定の実施形態において、例えば、感染力もしくは特異性の増大などのウイルス粒子の属性を改善するために、または産生収量を向上するために、カプシドおよび／またはｒｅｐ遺伝子の野生型ＡＡＶ配列に対して、改変が行われ得る。
特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、特定のＡＡＶ血清型の１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。ＶＰコード領域のＡＡＶ血清型は、同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、コドン最適化され得る。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞に対してコドン最適化され得る。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、昆虫細胞に対してコドン最適化され得る。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に対してコドン最適化され得る。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株に対してコドン最適化され得る。
特定の実施形態において、１つ以上のＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１００％未満の参照ヌクレオチド配列とのヌクレオチド相同性を有するようにコドン最適化され得る。特定の実施形態において、コドン最適化ＶＰヌクレオチド配列と参照ＶＰヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５未満％、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０未満％、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、および４０％未満である。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても公知であるバクミドであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクト（例えば、バクミド）は、当業者によって公知であり、実行される標準的な分子生物学技術によって、相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によってバクミドに組み込まれるポリヌクレオチドを含み得る。
特定の実施形態において、バクミドに組み込まれるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドインサート）は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含んでもよい。特定の実施形態において、バクミドに組み込まれるポリヌクレオチドは、ｐ１０またはｐｏｌＨなどのプロモータを含み、かつ構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。特定の実施形態において、バクミドに組み込まれるポリヌクレオチドは、ｐ１０またはｐｏｌＨなどのプロモータを含み、かつ非構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２、またはそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子の位置でバクミドに組み込んでもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、必須ではないバキュロウイルス遺伝子の位置でバクミドに組み込んでもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子またはバキュロウイルス遺伝子の一部をこのポリヌクレオチドインサートで置き換えることによって、バクミドに組み込んでもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子またはバキュロウイルス遺伝子の一部を、このポリヌクレオチドインサートおよび置換されているバキュロウイルス遺伝子（またはその一部）を含む融合ポリヌクレオチドで置き換えることによって、バクミドに組み込んでもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子をポリヌクレオチドインサートで分割することによってバクミドに組み込んでもよい（すなわち、ポリヌクレオチドインサートは、遺伝子の５’部分をバクミド遺伝子の３’部分から分離する、遺伝子の中央に組み込まれる）。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、ポリヌクレオチドインサートおよび分割されたバキュロウイルス遺伝子の一部を含む融合ポリヌクレオチドでバキュロウイルス遺伝子を分割することによって、バクミドに組み込んでもよい。特定の実施形態において、融合ポリヌクレオチドの３’末端は、分割された遺伝子の５’部分を含み、その結果、融合ポリヌクレオチド中の遺伝子の５’部分およびバクミドに残っている遺伝子の３’部分が、バキュロウイルス遺伝子の完全な部分または機能的な部分を形成する。特定の実施形態において、融合ポリヌクレオチドの５’末端は、分割された遺伝子の３’部分を含み、その結果、融合ポリヌクレオチド中の遺伝子の３’部分およびバクミドに残っている遺伝子の５’部分が、バキュロウイルス遺伝子の完全な部分または機能的な部分が形成される。非限定的な例が実施例１３および１４に提示され、ここで、融合ポリヌクレオチドは、ｇｔａ遺伝子ＯＲＦ（完全／部分Ａｃ－ｌｅｆ１２プロモータ、完全／部分Ａｃ－ｇｔａ遺伝子）由来の構成要素を含むように操作および産生される。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、バキュロウイルス遺伝子に関係する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断部位（すなわち、ＲＥＮアクセスポイント）の位置でバクミドに組み込んでもよい。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＦｓｅＩ（ｇｔａバキュロウイルス遺伝子に対応する）（ｇｇｃｃｇｇｃｃ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＳｄａＩ（ＤＮＡポリメラーゼバキュロウイルス遺伝子に対応する）（ｃｃｔｇｃａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＭａｕＢＩ（ｌｅｆ－４バキュロウイルス遺伝子に対応する）（ｃｇｃｇｃｇｃｇ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＳｂｆＩ（ｇｐ６４／ｇｐ６７バキュロウイルス遺伝子に対応する）（ｃｃｔｇｃａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、Ｉ－ＣｅｕＩ（ｖ－ｃａｔｈバキュロウイルス遺伝子に対応する）（配列番号１）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＡｖｒＩＩ（ｅｇｔバキュロウイルス遺伝子に対応する）（ｃｃｔａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＮｈｅＩ（ｇｃｔａｇｃ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＳｐｅＩ（ａｃｔａｇｔ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＢｓｔＺ１７Ｉ（ｇｔａｔａｃ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＮｃｏＩ（ｃｃａｔｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミドにおけるＲＥＮアクセスポイントは、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）である。
バクミドが二本鎖コンストラクトである特定の実施形態において、ＲＥＮ切断部位は、一方の鎖に切断配列を含み、他方の鎖に切断配列の逆相補体（切断配列としても機能する）を含む場合もある。したがって、ポリヌクレオチドインサート（またはその鎖）は、ＲＥＮ切断配列または逆相補体ＲＥＮ切断配列（これらは一般に機能的に交換可能である）を含んでもよい。非限定的な例として、ポリヌクレオチドインサートの鎖は、ＦｓｅＩ切断配列（ｇｇｃｃｇｇｃｃ）またはその逆相補性ＲＥＮ切断配列（ｃｃｇｇｃｃｇｇ）を含んでもよい。
ポリヌクレオチドは、以下によってこれらのＲＥＮアクセスポイントに組み込んでもよい：（ｉ）標的ＲＥＮ切断配列を含むように操作されたポリヌクレオチドインサート（例えば、ポリヌクレオチドの両端にＦｓｅＩ ＲＥＮ配列を含むように操作されたポリヌクレオチドインサート）を提供する工程；（ｉｉ）ポリヌクレオチド挿入のための標的ＲＥＮアクセスポイントを含むバクミドを提供する工程（例えば、ＦｓｅＩ切断部位を含むＡｃＭＮＰＶバクミドｂＭＯＮ１４２７２のバリアント）（ｉｉ）適切なＲＥＮ酵素でＲＥＮ操作されたポリヌクレオチドを消化する工程（例えば、ＦｓｅＩ酵素を使用して、両端にＦｓｅＩ領域を含むＲＥＮ操作ポリヌクレオチドを消化して、ポリヌクレオチド－ＦｓｅＩインサートを産生する工程）；（ｉｉｉ）同じＲＥＮ酵素でバクミドを消化して、ＲＥＮアクセスポイントでシングルカットバクミドを産生する工程（例えば、ＦｓｅＩ酵素を使用してＦｓｅＩ位置でシングルカットバクミドを産生する工程）；および（ｉｖ）Ｔ４リガーゼ酵素などの適切なライゲーションを使用してポリヌクレオチドインサートをシングルカットバクミドにライゲーションする工程。この結果は、標的ＲＥＮアクセスポイントで操作されたポリヌクレオチドインサートを含む操作されたバクミドＤＮＡである。
この挿入プロセスを１回以上繰り返して、他の操作されたポリヌクレオチドインサートを、異なるＲＥＮアクセスポイントで同じバクミドに組み込んでもよい（例えば、最初の操作されたポリヌクレオチドインサートを、ｅｇｔのＡｖｒＩＩ ＲＥＮアクセスポイントに挿入し、続いてｃａｔｈ遺伝子のＩ－ＣｅｕＩ ＲＥＮアクセスポイントに第２の操作されたポリヌクレオチドインサートを挿入し、続いてｇｔａ遺伝子のＦｓｅＩ ＲＥＮアクセスポイントに第３の操作されたポリヌクレオチドインサートを挿入する）。
特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断は、バクミドから１つ以上の野生型遺伝子を除去するために使用され得る。特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断を使用して、以前にバクミドに挿入された１つ以上の操作されたポリヌクレオチドインサートを除去してもよい。特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断を使用して、１つ以上の操作されたポリヌクレオチドインサートを、同じＲＥＮ切断配列を含む異なる操作されたポリヌクレオチドインサートで置き換えてもよい（例えば、ＦｓｅＩ ＲＥＮアクセスポイントでの操作されたポリヌクレオチドインサートは、ＦｓｅＩ ＲＥＮ切断配列を含む、異なる操作されたポリヌクレオチドインサートで置き換えてもよい）。
特定の実施形態において、米国特許第８，５１２，９８１号明細書、米国特許第８，１６３，５４３号明細書、米国特許第８，６９７，４１７号明細書、米国特許第８，６４２，３１４号明細書、米国特許出願公開第２０１３０２９６５３２号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１９７７７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１３６２２７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１７１２６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３００２３０３４号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０６１３、ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５００７６、ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０３５２、ＰＣＴ／ＮＬ２０１１／０５０１７０、ＰＣＴ／ＮＬ２０１２／０５０６１９および米国特許出願第１４／１４９，９５３号明細書（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、それらの全体において参照により本願明細書に援用する）に教示されるウイルス発現コンストラクトが用いられ得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、米国特許第６，４６８，５２４号明細書、米国特許第６，９８４，５１７号明細書、米国特許第７，４７９，５５４号明細書、米国特許第６，８５５，３１４号明細書、米国特許第７，２７１，００２号明細書、米国特許第６，７２３，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１０７１８６号明細書、米国特許出願第０９／７１７，７８９号明細書、米国特許出願第１１／９３６，３９４号明細書、米国特許出願第１４／００４，３７９号明細書、欧州特許出願第１０８２４１３号明細書、欧州特許出願第２５００４３４号明細書、欧州特許出願第２６８３８２９号明細書、欧州特許出願第１５７２８９３号明細書、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１９５８、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９１２３、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５４３０３、およびＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３５８２９（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に教示されているウイルス発現コンストラクトに由来し得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、サル種からの配列を含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５６９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０３３２５６、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１９７３５、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６４５、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６６、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６５、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６２５４８、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１３４４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６３３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６１６３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１５６５、米国特許出願第１３／４７５５３５号明細書、米国特許出願第１３／８９６７２２号明細書、米国特許出願第１０／７３９０９６号明細書、米国特許出願第１４／０７３９７９号明細書、米国特許出願公開第２００１００４９１４４号明細書、米国特許出願公開第２０１２００９３８５３号明細書、米国特許出願公開第２００９０２１５８７１号明細書、米国特許出願公開第２００４０１３６９６３号明細書、米国特許出願公開第２００８０２１９９５４号明細書、米国特許出願公開第２００４０１７１８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１２００９３７７８号明細書、米国特許出願公開第２００８００９０２８１号明細書、米国特許出願公開第２００５００６９８６６号明細書、米国特許出願公開第２０１００２６０７９９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２４７４９０号明細書、米国特許出願公開第２０１４００４４６８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００２５４９４７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２２３１３５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３０９２０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１８９５８２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０００４４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３１５８７１号明細書、米国特許第６０８３７１６号明細書、米国特許第７８３８２７７号明細書、米国特許第７３４４８７２号明細書、米国特許第８６０３４５９号明細書、米国特許第８１０５５７４号明細書、米国特許第７２４７４７２号明細書、米国特許第８２３１８８０号明細書、米国特許第８５２４２１９号明細書、米国特許第８４７０３１０号明細書、欧州特許出願第２３０１５８２号明細書、欧州特許第２２８６８４１号明細書、欧州特許第１９４４０４３号明細書、欧州特許第１４５３５４３号明細書、欧州特許第１４０９７４８号明細書、欧州特許第２４６３３６２号明細書、欧州特許第２２２０２１７号明細書、欧州特許第２２２０２４１号明細書、欧州特許第２２２０２４２号明細書、欧州特許第２３５０２６９号明細書、欧州特許第２２５０２５５号明細書、欧州特許第２４３５５５９号明細書、欧州特許第２６４３４６５号明細書、欧州特許第１４０９７４８号明細書、欧州特許第２３２５２９８号明細書、欧州特許第１２４０３４５号明細書（それらのそれぞれの内容は、本開示と矛盾しない限り、参照によりその全体を本願明細書に援用する）からのカプシドおよびｒｅｐ配列を含むがこれらに限定されない配列を含み得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２５０９６、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６２９、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１２４０５、米国特許出願第１０／２９１５８３号明細書、米国特許出願第１０／４２０２８４号明細書、米国特許第７，３１９，００２号明細書、米国特許出願公開第２００４０１９１７６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３００４５１８６号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２６３０２７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１５１４３４号明細書、米国特許出願公開第２００３０１３８７７２号明細書、米国特許出願公開第２００３０２０７２５９号明細書、欧州特許第２３３８９００号明細書、欧州特許第１４５６４１９号明細書、欧州特許第１３１０５７１号明細書、欧州特許第１３５９２１７号明細書、欧州特許第１４２７８３５号明細書、欧州特許第２３３８９００号明細書、欧州特許第１４５６４１９号明細書、欧州特許第１３１０５７１号明細書、欧州特許第１３５９２１７号明細書、および米国特許第７，２３５，３９３号および米国特許第８，５２４，４４６号は、それらが本開示と矛盾しない限りにおいて、それらに記載される１つ以上のウイルスコンストラクト由来の１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／０２５６９４、ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／０１００９６、ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０１３０００、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／２５９７６、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３１、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３０、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１６０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５５５０、米国特許第８６３７２５５号明細書、米国特許第８６３７２５５号明細書、米国特許第７１８６５５２号明細書、米国特許第７１０５３４５号明細書、米国特許第６７５９２３７号明細書、米国特許第７０５６５０２号明細書、米国特許第７１９８９５１号明細書、米国特許第８３１８４８０号明細書、米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書、米国特許出願公開第２０１３００５９２８９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３３号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３２号明細書、米国特許出願公開第２０１００２７８７９１号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４５号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４３号明細書、米国特許出願公開第２００８０００８６８４号明細書、米国特許出願公開第２００６０２０４４７９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３１号明細書、米国特許出願公開第２００４００５２７６４号明細書、米国特許出願公開第２００３００１３１８９号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２７０３０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７４０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７３７号明細書、米国特許出願公開第２００３０２２８２８２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３２３２２６号明細書、米国特許出願公開第２００５００１４２６２号明細書、米国特許出願第１４／１３６３３１号明細書、米国特許出願第０９／０７６３６９号明細書、米国特許出願第１０／７３８６０９号明細書、欧州特許第２５７３１７０号明細書、欧州特許第１１２７１５０号明細書、欧州特許第２３４１０６８号明細書、欧州特許第１８４５１６３号明細書、欧州特許第１１２７１５０号明細書、欧州特許第１０７８０９６号明細書、欧州特許第１２８５０７８号明細書、欧州特許第１４６３８０５号明細書、欧州特許第２０１０１７８９４０号明細書、米国特許出願公開第２０１４０００４１４３号明細書、欧州特許第２３５９８６９号明細書、欧州特許第１４５３５４７号明細書、欧州特許第２３４１０６８号明細書、および欧州特許第２６７５９０２（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載される配列または組成物を含み得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、米国特許第７１８６５５２号明細書、米国特許第７１０５３４５号明細書、米国特許第６７５９２３７号明細書、米国特許第７０５６５０２号明細書、米国特許第７１９８９５１号明細書、米国特許第８３１８４８０号明細書、米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書、米国特許出願公開第２０１３００５９２８９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３３号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３２号明細書、米国特許出願公開第２０１００２７８７９１号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４５号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４３号明細書、米国特許出願公開第２００８０００８６８４号明細書、米国特許出願公開第２００６０２０４４７９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０００４１４３号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２７０３０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７４０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７３７号明細書、米国特許出願公開第２００３０２２８２８２号明細書、米国特許出願公開第２００４００５２７６４号明細書、米国特許出願公開第２００３００１３１８９号明細書、米国特許出願公開第２００５００１４２６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３２３２２６号明細書、米国特許出願第１４／１３６３３１号、米国特許出願第１０／７３８６０９号明細書、欧州特許出願第１１２７１５０号明細書、欧州特許第２３４１０６８号明細書、欧州特許第１８４５１６３号明細書、欧州特許第１１２７１５０号明細書、欧州特許第１０７８０９６号明細書、欧州特許第１２８５０７８号明細書、欧州特許第２５７３１７０号明細書、欧州特許第１４６３８０５号明細書、欧州特許第２６７５９０２号明細書、欧州特許第２３５９８６９号明細書、欧州特許第１４５３５４７号明細書、欧州特許第２３４１０６８号明細書（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されるコンストラクトの１つ以上に由来する１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９９５／０１４０１８、ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０２６４４９、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８８１７、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３３７５、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１００５６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２１５８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０１３５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３５９６、米国特許出願第１２／４７３９１７号明細書、米国特許出願第０８／３３１３８４号明細書、米国特許出願第０９／６７０２７７号明細書、米国特許第５８７１９８２号明細書、米国特許第５８５６１５２号明細書、米国特許第６２５１６７７号明細書、米国特許第６３８７３６８号明細書、米国特許第６３９９３８５号明細書、米国特許第７９０６１１１号明細書、欧州特許出願第２０００１０３６００号明細書、欧州特許公開第７９７６７８号明細書、欧州特許第１０４６７１１号明細書、欧州特許第１６６８１４３号明細書、欧州特許第２３５９８６６号明細書、欧州特許第２３５９８６５号明細書、欧州特許第２３５７０１０号明細書、欧州特許第１０４６７１１号明細書、欧州特許第１２１８０３５号明細書、欧州特許第２３４５７３１号明細書、欧州特許第２２９８９２６号明細書、欧州特許第２２９２７８０号明細書、欧州特許第２２９２７７９号明細書、欧州特許第１６６８１４３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１９７３３８号明細書、欧州特許第２３８３３４６号明細書、欧州特許第２３５９８６７号明細書、欧州特許第２３５９８６６号明細書、欧州特許第２３５９８６５号明細書、欧州特許第２３５７０１０号明細書、欧州特許第１８６６４２２号明細書、米国特許出願公開第２００９０３１７４１７号明細書、欧州特許第２０１６１７４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２３６３５３号明細書、米国特許出願公開第２００７００３６７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１８６１０３号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１３７３７９号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０２８１５１６号明細書（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されるように、改変ＡＡＶのコンストラクトを含み得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３６７、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９６５、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４５５６、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９６９９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２９４３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６２８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６１６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３４３５５、米国特許第８３９４３８６号明細書、欧州特許第１７４２６６８号明細書、米国特許出願公開第２００８０２４１１８９号明細書、米国特許出願公開第２０１２００４６３４９号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１９５８０１号明細書、米国特許出願公開第２０１４００３１４１８号明細書、欧州特許第２４２５０００号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１０１５５８号明細書、欧州特許第１７４２６６８号明細書、欧州特許第２５６１０７５号明細書、欧州特許第２５６１０７３号明細書、欧州特許第２６９９６８８号明細書（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載される１つ以上のコンストラクトを含み得る。
発現制御
発現制御領域
本開示のウイルス発現コンストラクトは、発現制御配列によってコードされる１つ以上の発現制御領域を含んでもよい。特定の実施形態において、この発現制御配列は、昆虫細胞などのウイルス産生細胞における発現のためのものである。特定の実施形態において、この発現制御配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、この発現制御配列は、ＶＰコードヌクレオチド配列またはＲｅｐコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
本明細書において、用語「コードヌクレオチド配列」、「タンパク質コード遺伝子」または「タンパク質コードヌクレオチド配列」は、ＶＰタンパク質またはＲｅｐタンパク質などのタンパク質産物をコードするかまたはそれに翻訳されるヌクレオチド配列を指す。「作動可能に連結された」とは、発現制御配列が、コードされた遺伝子産物の発現を促進し得るように、コード配列に対して配置されていることを意味する。
「発現制御配列」とは、作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御および調節する場合、この発現制御配列はヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されている。したがって、発現制御配列には、プロモータ、エンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、および停止コドンが含まれ得る。用語「発現制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を含むことを意図しており、追加の有利な構成要素を含んでもよい。例えば、リーダー配列および融合パートナー配列は、発現制御配列である。この用語はまた、フレーム内およびフレーム外の望ましくない潜在的な開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計も含み得る。それはまた、望ましくない潜在的なスプライス部位が除去されるような核酸配列の設計も含んでもよい。それは、ポリＡテール、すなわち、ｍＲＮＡの３’末端にある一連のアデニン残基のストリング、ポリＡ配列と呼ばれる配列の付加を指示する配列またはポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。また、これはｍＲＮＡの安定性を高めるようにも設計されてもよい。転写および翻訳の安定性に影響を与える発現制御配列、例えばプロモータ、ならびに翻訳に影響を与える配列、例えばコザック配列は、昆虫細胞において公知である。発現制御配列は、より低い発現レベルまたはより高い発現レベルが達成されるように、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するような性質のものであり得る。
特定の実施形態において、発現制御配列は、１つ以上のプロモータを含んでもよい。プロモータとしては、限定するものではないが、バキュロウイルスの主要後期プロモータ、昆虫ウイルスプロモータ、非昆虫ウイルスプロモータ、脊椎動物ウイルスプロモータ、核遺伝子プロモータ、ウイルスおよび非ウイルスエレメントを含む１つ以上の種由来のキメラプロモータ、および／または合成プロモータが挙げられ得る。特定の実施形態において、プロモータは、Ｃｔｘ、Ｏｐ－ＥＩ、ＥＩ、ΔＥＩ、ＥＩ－１、ｐＨ、ＰＩＯ、ｐｏｌＨ（多面体）、ΔｐｏｌＨ、Ｄｍｈｓｐ７０、Ｈｒ１、Ｈｓｐ７０、４ｘＨｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０、ＩＥ、ＩＥ－１、ΔＩＥ－１、ΔＩＥ、ｐ１０、Δｐ１０（ｐ１０の改変されたバリエーションまたは誘導体）、ｐ５、ｐ１９、ｐ３５、ｐ４０、ｐ６．９、およびそれらのバリエーションまたは誘導体であり得る。特定の実施形態において、プロモータは、Ｃｔｘプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ｐ１０プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ｐｏｌＨプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータ、細胞型特異的プロモータ、細胞周期特異的プロモータ、およびそれらのバリエーションまたは誘導体から選択され得る。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＭＶプロモータ、アルファ１－アンチトリプシン（α１－ＡＴ）プロモータ、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータ、チロキシン結合グロブリン（ＬＰＳ）プロモータ、ＨＣＲ－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモータ、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモータ、アルブミンプロモータ、アポリポプロテインＥプロモータ、α１－ＡＴ＋ＥａＩｂプロモータ、腫瘍選択的Ｅ２Ｆプロモータ、単核血ＩＬ－２プロモータ、およびそれらのバリエーションまたは誘導体であってもよい。特定の実施形態において、プロモータは、低発現プロモータ配列である。特定の実施形態において、プロモータは、発現強化プロモータ配列である。特定の実施形態において、プロモータは、米国特許出願公開第２０１１０１３６２２７号明細書に記載されているようなＲｅｐまたはＣａｐプロモータを含んでもよく、その内容は、発現プロモータに関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、全てのヌクレオチド配列において同じプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、２つ以上のヌクレオチド配列において同じプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、２つ以上のヌクレオチド配列において異なるプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、全てのヌクレオチド配列において異なるプロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、特定の細胞型における発現を改善するためのエレメントをコードする。さらなる実施形態において、発現コンストラクトは、哺乳動物細胞または昆虫細胞における所望の遺伝子の発現のための、ｐｏｌｈおよび／またはΔＩＥ－１昆虫転写プロモータ、ＣＭＶ哺乳動物転写プロモータ、および／またはｐ１０昆虫特異的プロモータを含み得る。
２つ以上の発現制御配列を、所与のヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。例えば、プロモータ配列、翻訳開始配列、および停止コドンは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、１つ以上の開始コドン領域を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列などの、開始コドン領域を含むヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、開始コドン領域は、発現制御配列内にあり得る。
真核生物のｍＲＮＡの翻訳開始部位は、コザック Ｍ（Ｋｏｚａｋ，Ｍ）Ｃｅｌｌ．１９８６年１月３１日；４４（２）：２８３～９２頁およびコザック Ｍ．Ｊ（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｊ）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９年２月；１０８（２）：２２９～４１頁（それらのそれぞれの内容は、コザック配列およびその使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載のように、コザック配列と呼ばれるヌクレオチド配列によって部分的に制御されている。コザック形態の天然および合成の両方の翻訳開始部位は、分子遺伝学的技術、コザック Ｍ（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ．１９９６年８月；７（８）：５６３～７４頁（その内容は、コザック配列およびその使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）によるポリペプチドの産生に使用され得る。スプライス部位は、ｍＲＮＡの転写（形成）後のｍＲＮＡ配列の一部の除去を促進するｍＲＮＡ上の配列である。典型的には、スプライシングは、ｍＲＮＡが細胞の細胞質に輸送される前に核内で生じる。
本開示の方法は、特定の発現制御配列の使用によって限定されない。しかしながら、ＶＰ製品のある特定の化学量論が達成された場合（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３でそれぞれ１：１：１０に近い）、およびＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０（ｐ１９ Ｒｅｐｓとも呼ばれる）のレベルが、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８（ｐ５ Ｒｅｐｓとも呼ばれる）よりも有意に高い場合、産生細胞（昆虫細胞など）におけるＡＡＶの収量が向上する場合がある。特定の実施形態において、ｐ５／ｐ１９比は、０．６未満、０．４未満、または０．３未満であるが、常に少なくとも０．０３である。これらの比率は、タンパク質のレベルで測定されてもよく、特定のｍＲＮＡの相対レベルから関係付けられてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、２：２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、２：０：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、１～２：０～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、約２～３：０～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、約２～３：２～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、３：３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、３～５：０～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）において産生され、ここで、３つ全てのＶＰタンパク質は、３～５：３～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近いか、ほぼそうであるか、そのとおりである化学量論で発現される。
特定の実施形態において、発現制御領域は、以下からなる群より選択されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を産生するように操作される：およそまたは正確に１：０：１０；およそまたは正確に１：１：１０；およそまたは正確に２：１：１０；およそまたは正確に２：１：１０；およそまたは正確に２：２：１０；およそまたは正確に３：０：１０；およそまたは正確に３：１：１０；およそまたは正確に３：２：１０；およそまたは正確に３：３：１０；およそまたは正確に４：０：１０；およそまたは正確に４：１：１０；およそまたは正確に４：２：１０；およそまたは正確に４：３：１０；およそまたは正確に４：４：１０；およそまたは正確に５：５：１０；およそまたは正確に１～２：０～２：１０；およそまたは正確に１～２：１～２：１０；およそまたは正確に１～３：０～３：１０；およそまたは正確に１～３：１～３：１０；およそまたは正確に１～４：０～４：１０；およそまたは正確に１～４：１～４：１０；およそまたは正確に１～５：１～５：１０；およそまたは正確に２～３：０～３：１０；およそまたは正確に２～３：２～３：１０；およそまたは正確に２～４：２～４：１０；およそまたは正確に２～５：２～５：１０；およそまたは正確に３～４：３～４：１０；およそまたは正確に３～５：３～５：１０；そしておよそまたは正確に４～５：４～５：１０。
本開示の特定の実施形態において、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ７８は、バキュロウイルス由来の多面体プロモータ（ｐｏｌｈ）から転写される。Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ７８はまた、より弱いプロモータ、例えば、ＩＥ－１プロモータの欠失突然変異体であるΔＩＥ－１プロモータ（そのＩＥ－１プロモータの転写活性の約２０％を有する）から転写されてもよい。ΔＩＥ－１プロモータに実質的に相同なプロモータを使用してもよい。プロモータに関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の相同性は、実質的に相同なプロモータであるとみなされる。
ウイルス産生細胞およびベクター
哺乳動物細胞
本明細書に開示される本開示のウイルス産生は、標的細胞に接触してペイロードコンストラクト、例えば、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ粒子またはウイルスコンストラクトを送達するＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを製造するためのプロセスおよび方法を記載している。ウイルス産生細胞は、原核生物（例えば、細菌）細胞を含む任意の生物、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核生物細胞から選択され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞を含むウイルス産生細胞において産生され得る。ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ．Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびに哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞、および筋芽細胞を含み得る。ウイルス産生細胞としては、限定するものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む哺乳動物種に由来する細胞、または限定するものではないが、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞などを含む細胞型を含み得る。
組換えＡＡＶ粒子の産生に一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞としては、限定するものではないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、ＢＨＫ、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号明細書、第５，３８７，４８４号明細書、第５，７４１，６８３号明細書、第５，６９１，１７６号明細書、第６，４２８，９８８号明細書および第５，６８８，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号明細書、および国際特許公開第００／４７７５７号パンフレット、国際公開第００／２４９１６号パンフレット、および国際公開第９６／１７９４７号パンフレット（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されるように他の哺乳動物細胞株が挙げられる。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、複製欠損ヘルパーウイルス、例えば、ＨＥＫ２９３細胞または他のＥａトランス補完細胞から欠失された機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株である。
特定の実施形態において、パッケージング細胞株２９３－１０－３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－２３６１）を使用して、米国特許第６，２８１，０１０号明細書（２９３－１０－３パッケージング細胞株およびその使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されているように、ＡＡＶ粒子を産生してもよい。
本開示の特定の実施形態において、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータの制御下でアデノウイルスＥ１ａおよびアデノウイルスＥ１ｂをコードする、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターをトランス相補するためのＨｅＬＡ細胞株などの細胞株は、米国特許第６３６５３９４号明細書に記載されているようにＡＡＶ粒子の産生に使用され得、その内容は、ＨｅＬＡ細胞株およびその使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ペイロードコンストラクト、パルボウイルスＲｅｐおよびパルボウイルスＣａｐならびにヘルパーコンストラクトが３つの異なるコンストラクト内に含まれる三重トランスフェクション法を使用して哺乳動物細胞において産生される。ＡＡＶ粒子産生の３つの構成要素の三重トランスフェクション法は、形質導入効率、標的組織（向性）評価、および安定性を含むアッセイのための少量のウイルスを産生するために利用され得る。
製剤化されるＡＡＶ粒子は、三重トランスフェクションもしくはバキュロウイルス媒介ウイルス産生、または当該技術分野で公知の他の任意の方法によって製造され得る。当該技術分野で公知の任意の好適な許容細胞またはパッケージング細胞を用いて、ベクターを産生してもよい。特定の実施形態において、複製欠損ヘルパーウイルス、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞から欠失された機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株を使用する。
遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）のｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の一部または全てを含み得る。特定の実施形態において、ｃａｐおよびｒｅｐ機能の一部または全ては、カプシドおよび／またはＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクター（複数可）を細胞に導入することによってトランスで提供される。特定の実施形態において、遺伝子カセットは、カプシドまたはＲｅｐタンパク質をコードしない。あるいは、ｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子を発現するように安定して形質転換されるパッケージング細胞株が使用される。
組換えＡＡＶウイルス粒子は、特定の実施形態において、米国特許出願公開第２０１６／００３２２５４号明細書に記載されるような手順に従って培養上清から産生および精製され、その内容は、組換えＡＡＶウイルス粒子の産生およびプロセシングに関連するものとして、その全体が参照により援用される。産生はまた、２９３Ｔ細胞を使用する方法、三重トランスフェクション、または任意の好適な製造方法を含む、当該技術分野で公知の方法を含み得る。
特定の実施形態において、哺乳動物ウイルス産生細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）は、接着／付着状態（例えば、リン酸カルシウムを伴う）または懸濁状態（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を伴う）にあり得る。哺乳動物ウイルス産生細胞は、ＡＡＶの産生に必要なプラスミド（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐコンストラクト、アデノウイルスヘルパーコンストラクト、および／またはＩＴＲ隣接ペイロードコンストラクト）をトランスフェクトされる。特定の実施形態において、トランスフェクションプロセスは、任意選択の培地交換を含んでもよい（例えば、接着形態における細胞の培地交換、懸濁液形態における細胞の培地交換なし、必要に応じて懸濁液形態における細胞の培地交換）。特定の実施形態において、トランスフェクションプロセスは、ＤＭＥＭまたはＦ１７などのトランスフェクション培地を含んでもよい。特定の実施形態において、トランスフェクション培地は、血清を含んでもよいし、または無血清であってもよい（例えば、リン酸カルシウムおよび血清を伴う接着状態における細胞、ＰＥＩを伴うおよび血清を伴わない懸濁状態における細胞）。
その後、細胞は、掻き取り（接着形態）および／またはペレット化（懸濁形態および掻き取られた付着形態）によって収集され、レセプタクルに移され得る。産生された細胞を完全に収集するために、必要に応じて収集ステップを繰り返してもよい。次に、細胞溶解は、連続的な凍結融解サイクル（－８０Ｃ～３７Ｃ）、化学的溶解（界面活性剤トリトンの添加など）、機械的溶解、または約０％の生存率に達した後に細胞培養を分解させることによって達成され得る。細胞の破片は、遠心分離および／または深層濾過によって除去される。試料は、ＤＮＡｑＰＣＲによるＤＮａｓｅ耐性ゲノム滴定によってＡＡＶ粒子について定量化される。
ＡＡＶ粒子力価は、ゲノムコピー数（１ミリリットルあたりのゲノム粒子）に従って測定される。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されたベクターＤＮＡのＤＮＡ ｑＰＣＲに基づいている（クラークら（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．、１０巻：１０３１～１０３９頁（１９９９年）；フェルトワイクら（Ｖｅｌｄｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、６巻：２７２～２７８頁（２００２年）、その内容はそれぞれ、粒子濃度の測定に関連するものとして、その全体が参照により援用されている）。
昆虫細胞
本開示のウイルス産生は、標的細胞に接触してペイロードコンストラクト、例えば、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えウイルスコンストラクトを送達するＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを製造するためのプロセスおよび方法を含む。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子またはウイルスベクターは、昆虫細胞を含むウイルス産生細胞において産生され得る。
培養中の昆虫細胞の増殖条件、および培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当該技術分野で周知であり、その内容が、ウイルス産生における昆虫細胞の増殖および使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する、米国特許第６，２０４，０５９号明細書を参照。
パルボウイルスの複製を可能にし、培養中に維持され得る任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用してもよい。組換えＡＡＶ粒子の産生に一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞としては、限定するものではないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、例としては、限定するものではないが、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、または蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞株が挙げられる。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば、昆虫細胞適合性ベクターなどの核酸をそのような細胞に導入する方法、およびそのような細胞を培養中に維持する方法と同様に、十分に文書化されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）編、ヒューマナ・プレス，ニュージャージー州（１９９５年）；オライリーら（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）（１９９４年）；サムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒ．６３巻：３８２２～８頁（１９８９年）；カジガヤら（Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：４６４６～５０頁（１９９１年）；ラフィンら（Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒ．６６巻：６９２２～３０頁（１９９２年）；キムバウアーら（Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒ．２１９巻：３７～４４頁（１９９６年）；チャオら（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒ．２７２巻：３８２～９３頁（２０００年）；およびサムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，２０４，０５９号明細書（それらのそれぞれの内容は、ウイルス産生における昆虫細胞の使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）を参照。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１５／１９１５８０号パンフレットに記載の方法を使用して作製され、その内容は、本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する。
特定の実施形態において、昆虫宿主細胞システムは、バキュロウイルスシステムと組合せて（例えば、ルコウら（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６巻：４７頁（１９８８年）によって記載されるように）使用され得る。特定の実施形態において、キメラペプチドを調製するための発現システムは、米国特許第６６６０５２１号明細書（その内容は、ウイルス粒子の産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されているように、高レベルのタンパク質に使用され得る、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ，Ｔｎ ５Ｂ１～４昆虫細胞／バキュロウイルスシステムである。
昆虫細胞の増殖、培養、トランスフェクション、感染および保存は、当該技術分野で公知の任意の細胞培養培地、細胞トランスフェクション培地、または保存培地、例としては、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＦＸ昆虫細胞培養培地（Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、発現システム（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）ＥＳＦ ＡＦ昆虫細胞培養培地（Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ９００ＩＩ培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ９００ＩＩＩ培地、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＧｒａｃｅの昆虫培地（Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉａ）で行い得る。本開示の昆虫細胞混合物はまた、塩、酸、塩基、緩衝液、界面活性剤（ポロキサマー１８８／プルロニックＦ－６８など）、およびその他の公知の培養培地要素を含む（ただしこれらに限定されない）、本開示に記載の製剤添加物または要素のいずれかも含んでもよい。製剤添加物は、徐々に組み込んでもよいし、「スパイク」（短時間で大量に組み込む）として組み込んでもよい。
バキュロウイルス産生システム
特定の実施形態において、本開示のプロセスは、ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトベクターを使用するバキュロウイルスシステムにおいてＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの産生を含み得る。特定の実施形態において、バキュロウイルスシステムは、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）および／またはバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても公知のバクミドであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、当業者によって公知であり、かつ実行される標準的な分子生物学技術により、相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によってバクミドに組み込まれるポリヌクレオチドであり得る。別々のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションによって、バキュロウイルス（ＢＥＶ）の２つ以上の群（例えば、２、３）、ウイルス発現コンストラクト（発現ＢＥＶ）を含み得る１つ以上の群、およびペイロードコンストラクト（ペイロードＢＥＶ）を含み得る１つ以上の群が産生される。バキュロウイルスを使用して、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの産生のためにウイルス産生細胞に感染させてもよい。
特定の実施形態において、このプロセスは、ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトの両方を含む、単一のバキュロウイルス（ＢＥＶ）群を産生するための単一のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションを含む。これらのバキュロウイルスを使用して、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの産生のためにウイルス産生細胞に感染させてもよい。
特定の実施形態において、ＢＥＶは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、ＷＦＩ水、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ試薬などのバクミドトランスフェクション剤を使用して産生される。特定の実施形態において、ＢＥＶは、昆虫細胞などのウイルス産生細胞において産生および増殖される。
特定の実施形態において、この方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む、１つ以上のＢＥＶを含むウイルス産生細胞のシード培養物を利用する。シードＢＩＩＣは、ウイルス発現コンストラクトを含む発現ＢＥＶ、およびまたペイロードコンストラクトを含むペイロードＢＥＶでもトランスフェクト／形質導入／感染されている。特定の実施形態において、シード培養物を、回収し、アリコートに分割して凍結して、そして後の時点で、ナイーブな産生細胞集団のトランスフェクション／形質導入／感染を開始するために使用してもよい。特定の実施形態において、シードＢＩＩＣのバンクは、－８０℃で、またはＬＮ２蒸気中で保存される。
バキュロウイルスは、複製タンパク質、エンベロープタンパク質、およびカプシドタンパク質など、バキュロウイルスの機能および複製に不可欠ないくつかの必須タンパク質で構成されている。したがって、バキュロウイルスゲノムには、必須タンパク質をコードするいくつかの必須遺伝子ヌクレオチド配列が含まれている。非限定的な例として、ゲノムは、バキュロウイルスコンストラクトの必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む必須遺伝子領域を含んでもよい。必須タンパク質としては、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質、またはバキュロウイルスコンストラクトの他の同様の必須タンパク質が挙げられ得る。
スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞を含むがこれに限定されない昆虫細胞においてＡＡＶ粒子を産生するためのバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、高力価のウイルスベクター産物を提供する。ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトをコードする組換えバキュロウイルスは、ウイルスベクター複製細胞の増殖性感染を開始する。一次感染から放出された感染性バキュロウイルス粒子は、培養中の追加の細胞に二次感染し、感染の初期多重度の関数である多数の感染サイクルにおいて細胞培養集団全体に指数関数的に感染する。卜部、Ｍら（Ｕｒａｂｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６年２月；８０（４）：１８７４～８５頁（その内容は、ＢＥＶおよびウイルス粒子の産生および使用に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）を参照。
昆虫細胞システムにおけるバキュロウイルスによるＡＡＶ粒子の産生は、公知のバキュロウイルスの遺伝的および物理的不安定性に対処し得る。
特定の実施形態において、本開示の産生システムは、力価のない感染細胞保存およびスケールアップシステムを利用することによって、複数の継代にわたるバキュロウイルスの不安定性に対処する。ウイルス産生細胞の小規模シード培養物は、ＡＡＶ粒子の構造的および／または非構造的構成要素をコードするウイルス発現コンストラクトをトランスフェクトされる。バキュロウイルスに感染したウイルス産生細胞は、液体窒素で凍結保存され得るアリコートに回収される；このアリコートは、大規模なウイルス産生細胞培養の感染に関して生存率および感染力を保持している。ワシルコ ＤＪら（Ｗａｓｉｌｋｏ ＤＪ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００９年６月；６５（２）：１２２～３２頁（その内容は、ＢＥＶおよびウイルス粒子の産生および使用に関連して、その全体を参照により本願明細書に援用する）。
遺伝的に安定なバキュロウイルスを使用して、無脊椎動物細胞においてＡＡＶ粒子を産生するための構成要素の１つ以上の供給源を産生してもよい。特定の実施形態において、欠損のあるバキュロウイルス発現ベクターは、昆虫細胞においてエピソーム的に維持され得る。そのような実施形態において、対応するバクミドベクターは、プロモータ、エンハンサー、および／または細胞周期調節複製エレメントを含むがこれらに限定されない複製制御エレメントで操作される。
特定の実施形態において、バキュロウイルスは、キチナーゼ／カテプシン遺伝子座への組換えのためのマーカーで操作されてもよい。ｃｈｉａ／ｖ－ｃａｔｈ遺伝子座は、組織培養でバキュロウイルスを増殖させるために必須ではなく、Ｖ－ｃａｔｈ（ＥＣ ３．４．２２．５０）は、Ａｒｇ－Ａｒｇジペプチド含有基質で最も活性のあるシステインエンドプロテアーゼである。Ａｒｇ－Ａｒｇジペプチドは、デンソウイルスおよびパルボウイルスカプシド構造タンパク質に存在するが、ディペンドウイルスＶＰ１ではまれにしか発生しない。
特定の実施形態において、バキュロウイルス感染を許容する安定なウイルス産生細胞は、限定するものではないが、ＡＡＶゲノム全体、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、個別の転写カセットとしての各Ｒｅｐタンパク質、個別の転写カセットとしての各ＶＰタンパク質、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、またはネイティブまたは非ネイティブのプロモータを有するバキュロウイルスヘルパー遺伝子の少なくとも１つを含むＡＡＶ複製およびベクター産生に必須のエレメントのいずれかの少なくとも１つの安定な組み込まれたコピーで操作される。
特定の実施形態において、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスまたはＢｍＮＰＶバキュロウイルスＢｍＮＰＶに基づく。特定の実施形態において、本開示のバクミドは、ｂｍｏｎ１４２７２、ｖＡｃｅ２５ｋｏまたはｖＡｃｌｅｆ１１ＫＯなどのＡｃＭＮＰＶバクミドに基づく（すなわち、その操作されたバリアント）。
特定の実施形態において、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子が欠失されたＢＥＶ（「ｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ」）または突然変異されたＢＥＶである。
本開示のウイルス産生バクミドは、特定のバキュロウイルス遺伝子または遺伝子座の欠失を含んでもよい。
その他
特定の実施形態において、発現宿主としては、限定するものではないが、エシェリキア属、バチルス属、シュードモナス属、サルモネラ属内の細菌種が挙げられる。
特定の実施形態において、細胞の染色体内に安定して組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む宿主細胞は、ＡＡＶ粒子産生のために使用され得る。非限定的な例として、その染色体に少なくとも２つのＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子のコピーが安定して組み込まれている宿主細胞を使用して、米国特許第７２３８５２６号明細書（その内容は、ウイルス粒子の産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載の方法およびコンストラクトに従ってＡＡＶ粒子を製造してもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、米国特許出願公開第２００３００９２１６１号明細書および欧州特許第１１８３３８０号明細書（その内容は、ウイルス粒子の産生に関連するものとして、その全体を参照により本願明細書に援用する）に記載されるように、宿主細胞におけるまれな制限酵素の調節された発現を可能にする核酸配列を含む分子で安定に形質転換された宿主細胞において産生され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子を製造するための製造方法および細胞株は、ＰＣＴ／ＵＳ１９９６／０１０２４５、ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５７１６、ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５６９１、ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４７９、ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４６３、ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０００４１５、ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０４０８７２、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６１４、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１００５５、ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００５８７０、ＰＣＴ／ＵＳ２０００／００４７５５、米国特許出願第０８／５４９４８９号明細書、米国特許出願第０８／４６２０１４号明細書、米国特許出願第０９／６５９２０３号明細書、米国特許出願第１０／２４６４４７号明細書、米国特許出願第１０／４６５３０２号明細書、米国特許第６２８１０１０号明細書、米国特許第６２７０９９６号明細書、米国特許第６２６１５５１号明細書、米国特許第５７５６２８３号明細書（ＮＩＨに割り当て）、米国特許第６４２８９８８号明細書、米国特許第６２７４３５４号明細書、米国特許第６９４３０１９号明細書、米国特許第６４８２６３４号明細書、（ＮＩＨに割り当て：米国特許第７２３８５２６号明細書、米国特許第６４７５７６９号明細書）、米国特許第６３６５３９４号明細書（ＮＩＨに割り当て）、米国特許第７４９１５０８号明細書、米国特許第７２９１４９８号明細書、米国特許第７０２２５１９号明細書、米国特許第６４８５９６６号明細書、米国特許第６９５３６９０号明細書、米国特許第６２５８５９５号明細書、欧州特許第２０１８４２１号明細書、欧州特許第１０６４３９３号明細書、欧州特許第１１６３３５４号明細書、欧州特許第８３５３２１号明細書、欧州特許第９３１１５８号明細書、欧州特許第９５０１１１号明細書、欧州特許第１０１５６１９号明細書、欧州特許第１１８３３８０号明細書、欧州特許第２０１８４２１号明細書、欧州特許第１２２６２６４号明細書、欧州特許第１６３６３７０号明細書、欧州特許第１１６３３５４号明細書、欧州特許第１０６４３９３号明細書、米国特許出願公開第２００３００３２６１３号明細書、米国特許出願公開第２００２０１０２７１４号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３２３２号明細書、米国特許出願公開第２００３００４０１０１号明細書（ＮＩＨに割り当て）、米国特許出願公開第２００６０００３４５１号明細書、米国特許出願公開第２００２００９０７１７号明細書、米国特許出願公開第２００３００９２１６１号明細書、米国特許出願公開第２００７０２３１３０３号明細書、米国特許出願公開第２００６０２１１１１５号明細書、米国特許出願公開第２００９０２７５１０７号明細書、米国特許出願公開第２００７００４０４２号明細書、米国特許出願公開第２００３０１１９１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２００１９０５０号明細書（それらのそれぞれの内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、その全体を参照により本願明細書に援用する）で教示されるものを含み得るが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．定義
本開示の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基または特性は、群または範囲で、開示されている。本開示が、そのような群および範囲のメンバーの各々のかつあらゆる個体またはサブコンビネーションを含むことが特に意図されている。
特に記載のない限り、以下の用語および句は下に記載の意味を有する。定義は、本質的に限定的であることを意味するものではなく、本開示の特定の態様のより明確な理解を提供するのに役立つ。
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載される値の±１０％を意味する。
アデノ随伴ウイルス：用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用されるとき、ディペンドウイルス属のメンバーを指し、それに由来する任意の粒子、配列、遺伝子、タンパク質、または成分を含む。
ＡＡＶ粒子：本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つのＩＴＲ領域を有するカプシドおよびウイルスゲノムを含むウイルスである。本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生され得、そしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づく場合がある。ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるもしくは当該技術分野において公知の任意の血清型（血清型の組合せ（すなわち、「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含む、または様々なゲノム（例えば、一本鎖もしくは自己相補的）に由来してもよい。加えて、ＡＡＶ粒子は複製欠損型および／またはターゲティング型であってもよい。
活性：本明細書で使用されるとき、用語「活性」は、物事が生じているまたは行われている状態を指す。本開示の組成物は、活性を有してもよく、この活性は、１つ以上の生物学的事象を含み得る。
投与：本明細書で使用されるとき、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供する工程を指す。
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、用語「組み合わせて投与される」または「組合せ投与」は、２つ以上の薬剤（例えば、ＡＡＶ）が、患者に各薬剤の効果のオーバーラップが存在し得るように、および／または対象がある時点で両方に同時に曝露されるように、同時にまたはある間隔以内に、対象に投与されることを意味する。特定の実施形態において、これらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、もしくは１分以内に投与される。特定の実施形態において、薬剤の投与は、コンビナトリアル（例えば、相乗）効果が達成されるように、十分に一緒に近接した間隔となっている。
改善：本明細書で使用されるとき、用語「改善」または「改善すること」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を低下させることを指す。例えば、神経変性障害の文脈では、改善はニューロン喪失の低減を含む。
動物：本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。特定の実施形態において、「動物」は、発達の任意のステージにあるヒトを指す。特定の実施形態において、「動物」は、発達の任意のステージにある非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。特定の実施形態において、動物は、限定はされないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫を含む。特定の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
アンチセンス鎖：本明細書で使用されるとき、用語、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第１の鎖」または「ガイド鎖」は、サイレンシングのターゲティング遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド、例えば、約１５～３０、１６～２５、１８～２３、または１９～２２ヌクレオチドのセクションと実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを誘導するために所望の標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補的な、例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすために十分な相補性の配列を有する。
およそ：本明細書で使用されるとき、１つ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、言及された参照値に類似である値を指す。特定の実施形態において、用語「およそ」は、別段に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、言及された参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたは小さい）、２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ以下に入る値の範囲を指す（ただし、かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
会合している：本明細書で使用されるとき、用語「会合している」、「コンジュゲートされている」、「連結されている」、「結合している」、および「繋がれている」は、２つ以上の部分に関して使用される場合、これらの部分が、直接または連結剤として働く１つ以上の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合または接続されて、十分に安定な構造体を形成しており、その結果、それらの部分が、その構造体が使用される条件、例えば、生理学的条件下において、物理的に会合されたまま保たれることを意味する。「会合」は、必ずしも、厳密に、直接的な共有結合による化学結合を通じたものである必要はない。これは、イオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく、「会合している」実体が、物理的に会合されたまま保たれるような十分に安定な接続も示唆し得る。
バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）：本明細書で使用されるとき、ＢＥＶは、バキュロウイルス発現ベクター、すなわち、バキュロウイルス起源のポリヌクレオチドベクターである。ＢＥＶを使用するシステムは、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）として公知である。
ｍＢＥＶまたは改変ＢＥＶ：本明細書で使用されるとき、改変ＢＥＶは、以下の１つ以上の付加および／または欠失および／または複製および／または反転によって開始ＢＥＶ（野生型または人工のいずれか）から改変されたバキュロウイルス起源の発現ベクターである：遺伝子；遺伝子断片；切断部位；制限部位；配列領域；ペイロードまたは目的の遺伝子をコードする配列（複数可）；または前述の組合せ。
二機能性：本明細書で使用されるとき、用語「二機能性」は、少なくとも２つの機能を行うことができる、またはそれを維持する任意の物質、分子、または部分を指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与えてもよい。機能をもたらす構造は同じであっても異なってもよい。
ＢＩＩＣ：本明細書で使用されるとき、ＢＩＩＣは、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞である。
生体適合性：本明細書で使用されるとき、用語「生体適合性」は、免疫系による傷害、毒性または拒絶のリスクをほとんどまたは全くもたらさない生細胞、組織、器官またはシステムとの適合性を意味する。
生分解性：本明細書で使用されるとき、用語「生分解性」は、生物の作用によって無害な製品に分解可能であることを意味する。
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、語句「生物学的に活性」は、生物システムおよび／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された際に、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、コードされたペイロードの一部でさえ生物学的に活性であるか、または生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合、生物学的に活性であるとみなされ得る。
カプシド：本明細書で使用されるとき、用語「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質シェルを指す。
コドン最適化：本明細書で使用されるとき、用語「コドン最適化」または「コドン最適化」は、改変された核酸配列であって、親／参照配列と同じアミノ酸配列をコードするが、改変された核酸配列のコドンが、特定のシステム（特定の種または種の群など）における発現のために最適化または改善されているように変更されている、改変された核酸配列を指す。非限定的な例として、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む核酸配列は、昆虫細胞またはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞などの特定の昆虫細胞における発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当業者に公知の方法およびデータベースを使用して完了され得る。
相補的および実質的に相補的：本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的に、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式で（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で、塩基対を形成することができる。当業者は認識しているように、ＤＮＡとは対照的にＲＮＡを使用する際、チミンではなくウラシルがアデノシンと相補的であるとみなされる塩基である。しかし、本開示の文脈でＵと表記された際、別段に示されない限りは、Ｔに置き換え可能であることが含意される。完全な相補性または１００％の相補性とは、一方のポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全でない相補性とは、２本の鎖の全てではないが一部のヌクレオチド単位が、互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２本の２０量体について、各鎖の２個の塩基対のみが互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例で、各鎖の１８個の塩基対が互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を呈する。本明細書で使用されるとき、用語「実質的に相補的」は、ｓｉＲＮＡが、所望の標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングを引き起こすために十分な配列を（例えば、アンチセンス鎖中に）有することを意味する。
化合物：本開示の化合物は、中間または最終化合物に発生する原子の全ての同位体を含む。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることから生じる、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体は、トリチウムおよび重水素を含む。
本開示の化合物および塩は、ルーチン的な方法により、溶媒または水分子と組み合わせて、溶媒和物および水和物を形成して、調製することができる。
条件付き活性：本明細書で使用されるとき、用語「条件付き活性」は、野生型ポリペプチドの突然変異体またはバリアントを指し、この突然変異体またはバリアントは、親ポリペプチドよりも生理学的条件で多かれ少なかれ活性である。さらに、条件付き活性なポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、異常な状態で活性が増大してもまたは減少してもよい。条件付き活性なポリペプチドは、通常の生理学的な状態または異常な状態で、可逆的または不可逆的に不活性化され得る。
保存されている：本明細書で使用されるとき、用語「保存されている」は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置に変更されずに生じる、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中の別の箇所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、より関連する配列間で保存されているものである。
特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合に、「完全に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはポリペプチドの全長に適用され得るか、または、その一部分、領域、もしくは特徴に適用され得る。
制御エレメント：本明細書で使用されるとき、「制御エレメント」、「調節制御エレメント」または「調節配列」とは、プロモータ領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなど（レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を提供する）を指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および／または翻訳され得る限り、これらの制御エレメントの全てが常に存在する必要はない。
制御放出：本明細書で使用されるとき、用語「制御放出」は、治療結果に影響を与える特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
細胞増殖抑制性：本明細書で使用されるとき、「細胞増殖抑制性」とは、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはそれらの組合せの増殖、分裂または複製を阻害、軽減、抑制する工程を指す。
細胞毒性：本明細書で使用されるとき、「細胞毒性」とは、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはそれらの組合せを殺傷するか、またはそれらに対して有害、毒性もしくは致死的な影響を生じる工程を指す。
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、ＡＡＶ粒子、化合物、物質、実体、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する動作または方式を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、少なくとも部分的に、ターゲティングされる細胞への、ＡＡＶ粒子のインビボ送達を容易にする、任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用されるとき、用語「不安定化させた」、「不安定化させる」、または「不安定化領域」は、同じ領域または分子の出発時点、野生型、または天然の形態よりも、安定性が低い領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、放射線撮影法、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む、当該技術分野で公知の方法によって容易に検出される、別の実体に結合される、組み込まれる、または会合される、１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質の任意の位置に配置され得る。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内にあってもよいし、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置していてもよい。
消化：本明細書で使用されるとき、用語「消化」は、より小さな断片または構成要素に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位：本明細書で使用されるとき、用語「遠位」は、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
投薬レジメン：本明細書で使用されるとき、「投薬レジメン」は、投与のスケジュール、または医師により決定される治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
カプセル化：本明細書で使用されるとき、用語「カプセル化」は、囲む、包囲する、または包むことを意味する。
操作：本明細書で使用されるとき、本開示の実施形態は、構造的または化学的であるかを問わず、出発点、野生型または天然分子から変化する、特徴または特性を有するように設計される場合に「操作」されている。
有効量：本明細書で使用されるとき、用語、薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすために十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されるコンテクストに依存する。例えば、がんを治療する薬剤を投与するコンテクストでは、薬剤の有効量は、例えば、その薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、本明細書に定義される通りのがんの治療を達成するために十分な量である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
特徴：本明細書で使用されるとき、「特徴」は、特徴、特性、または特有のエレメントを指す。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子ならびに送達剤または賦形剤を含む。
断片：「断片」は、本明細書で使用されるとき、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離した完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含んでもよい。
機能性：本明細書で使用されるとき、「機能性」生体分子は、それによって特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態を有する生体分子である。
遺伝子発現：用語「遺伝子発現」は、核酸配列が首尾よく転写およびほとんどの場合は翻訳を受けて、タンパク質またはペプチドを産生する過程を指す。明確にするため、「遺伝子発現」の測定に言及する場合、これは、測定が、核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味するものと理解されたい。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定する方法は当該技術分野において周知である。
相同性：本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全般的な関連性を指す。特定の実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合に、互いに「相同」であるとみなされる。用語「相同」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本開示に従って、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合に、相同であるとみなされる。特定の実施形態において、相同的なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の固有に指定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４～５個の固有に指定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。本開示に従って、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合に、相同であるとみなされる。
異種領域：本明細書で使用されるとき、用語「異種領域」は、相同領域とはみなされない領域を指す。
相同領域：本明細書で使用されるとき、用語「相同領域」は、位置、構造、進化の起源、特徴、形態または機能が類似している領域を指す。
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／もしくはポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全般的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、２つの配列を最適な比較の目的でアラインメントすることによって、行ってもよい（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２の核酸配列の一方または両方に導入することができ、非同一配列は比較目的で無視することができる）。特定の実施形態において、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．），ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．），ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，フォン・ハインイェ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，グリフィン，Ａ． Ｍ．およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ． Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）， ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，グリブスコフ，Ｍ．およびデブロー，Ｊ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．），ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されるものなどの方法を使用して、決定することができる。これらの各々は、それらが本開示と矛盾しない限り、本明細書において参照により援用される。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、アライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４：ｐ．１１～１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０の重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、代替として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法としては、限定はされないが、カリーヨ，Ｈ．，およびリップマン，Ｄ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．），ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられ、これは、それらが本開示と矛盾しない限り、本明細書において参照により援用される。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、（デブロー，Ｊ．ら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（アルチュール，Ｓ．Ｆ．ら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられる。
遺伝子の発現の阻害：本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現の阻害」は、遺伝子の発現産物量の減少を生じさせることを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってもよい。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの減少は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの減少をもたらす。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準技法を使用して決定してもよい。
インビトロ：本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応槽内、細胞培養物中、ペトリ皿内等で起こる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、それが以前に会合していた（天然環境であるか実験環境であるかにかかわらない）成分のうちの少なくとも一部から分離されている物質または実体を指す。単離された物質は、それが会合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有してもよい。単離された物質および／または実体は、それが最初に会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離されていてもよい。特定の実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％より高く、または約９９％を上回って純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、物質が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の物質またはＡＡＶ粒子が濃縮された組成物を含むことができる。実質的な分離は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物を含むことができる。化合物およびそれらの塩を単離する方法は当該技術分野においてルーチン的である。
リンカー：本明細書で使用されるとき、「リンカー」とは、２つの分子を接続する分子または分子の群を指す。リンカーは、２つの異なるポリペプチドをコードする２つの核酸配列を接続する核酸配列であり得る。リンカーは翻訳される場合とされない場合がある。リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるとき、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位とは、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する核酸転写物のヌクレオチド位置または領域を表す。
改変された（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）：本明細書で使用されるとき、「改変された」は、本開示の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含めて、多くの様式で改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、本開示の実施形態は、それらが、構造的または化学的であるかを問わず、出発点、野生型または天然分子から変化する、特徴または特性を有するかまたは所有する場合に「改変」される。
突然変異：本明細書で使用されるとき、「突然変異」という用語は、遺伝子の構造の任意の変化であって、その後の世代に伝達され得るバリアント（「突然変異体」とも呼ばれる）形態をもたらす変化を指す。遺伝子の突然変異は、ＤＮＡの単一塩基の変化、または遺伝子や染色体のより大きなセクションの欠失、挿入、もしくは再配列によって引き起こされ得る。
天然に存在する：本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」または「野生型」は、人工的な補助または人間の手の関与を伴わずに天然に存在していることを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用されるとき、「非ヒト脊椎動物」は、野生種および家畜種を含む、ホモ・サピエンス以外の全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定はされないが、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクなどの哺乳動物が挙げられる。
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、リーディングフレームの終わりを除いて、所与のリーディングフレーム内に停止コドンを含まない配列を指す。
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、語句「作動可能に連結された」は、２つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能的接続を指す。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求めているもしくは必要としていてもよい対象、治療を必要としている対象、治療を受けている対象、治療を受けるであろう対象、または、特定の疾患もしくは状態について訓練された専門家によるケアを受けている対象を指す。
ペイロード：本明細書で使用されるとき、「ペイロード」または「ペイロード領域」とは、ウイルスゲノムによってもしくはウイルスゲノム内でコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えば、導入遺伝子、ポリヌクレオチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または調節核酸もしくは調節核酸の発現産物を指す。
ペイロードコンストラクト：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト」とは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が一方または両方に隣接するペイロードをコードするかまたは含むポリヌクレオチド領域を含む、１つ以上のベクターコンストラクトである。このペイロードコンストラクトは、治療用ウイルスゲノムを産生するためにウイルス産生細胞で複製される鋳型を提示する。
ペイロードコンストラクトベクター：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクトベクター」とは、ペイロードコンストラクト、ならびに細菌細胞におけるペイロードコンストラクトの複製および発現のための調節領域をコードするかまたは含むベクターである。
ペイロードコンストラクト発現ベクター：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト発現ベクター」は、ペイロードコンストラクトをコードするまたは含み、ウイルス複製細胞におけるウイルス発現のための成分をコードするまたは含む１つ以上のポリヌクレオチド領域をさらに含む、ベクターである。
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長未満であるかそれに等しく、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
薬学的に許容可能：語句「薬学的に許容可能」は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしでヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適しており、妥当なリスク対効果比に相応の、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して用いられる。
薬学的に許容可能な賦形剤：語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する、本明細書に記載される化合物（例えば、活性化合物を懸濁または溶解し得るビヒクル）以外の任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、滑剤（流動増強剤）、潤沢剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和の水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、限定はされないが、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容される塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、開示された化合物の誘導体または形態を指し、ここで、親化合物は、既存の酸または塩基部分をその塩形態へと変換させることによって改変される（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって生成される）。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミン類などの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられ、限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の慣用の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から、慣例の化学的方法によって合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機溶媒中、あるいはその２つの混合物中の化学量論量の適切な塩基または酸の量と反応させることによって調製され得る；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用してもよい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．シュタールおよびＣ．Ｇ．ヴェルムス（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，ａｎｄ Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）において見出され、これらの各々は、それらが本開示と矛盾しない限り、本明細書においてその全体として参照により援用される。
薬学的に許容可能な溶媒和物：用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子内に取り込まれている、本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生きている生物に投与される物質の運命の決定に関連する、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度および速度を含む、いくつかの領域へと分割される。これは一般的にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収は、物質が血液循環に入るプロセスであり；（Ｄ）分布は、身体の体液および組織全体への物質の分散または拡散であり；（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり；（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。珍しい事例では、一部の薬物は、身体組織中に不可逆的に蓄積される。
物理化学的：本明細書で使用されるとき、「物理化学的」は、物理的および／または化学的な特性を意味する、またはそれに関連することを意味する。
予防：本明細書で使用されるとき、用語「予防する工程」または「予防」は、感染、疾患、障害、および／または状態の発症を部分的または完全に遅らせる工程；特定の感染症、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、または臨床兆候の発症を部分的または完全に遅らせる工程；特定の感染症、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、または兆候の発症を部分的または完全に遅らせる工程；感染症、特定の疾患、障害および／または状態からの進行を部分的または完全に遅らせる工程；ならびに／あるいは感染症、疾患、障害、および／または状態に関係する病状を発症するリスクを低減する工程、を指す。
増殖する：本明細書で使用されるとき、用語「増殖する」は、成長、拡大、もしくは増加すること、または成長、拡大、もしくは増加を迅速に引き起こすことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」とは、増殖性の特性に反するか、または反対の特性を有することを意味する。
予防的：本明細書で使用されるとき、「予防的」は、疾患の拡がり予防するために使用される療法剤または行動方針を指す。
予防：本明細書で使用されるとき、「予防」は、健康を維持し、疾患の拡がり予防するために取られる措置を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書に提供されるもの、ならびにその断片、突然変異体、バリアント、および変更形態を含む。
近位：本明細書で使用されるとき、用語「近位」は、中心または目的の点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
精製された：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製された」、「精製」は、望まない成分、汚染材料、混合物、または不完全物質から実質的に純粋にする、またはそれらを実質的に排除することを意味する。「精製された」は、純粋である状態を指す。「精製」とは、純粋にするプロセスを指す。
領域：本明細書で使用されるとき、用語「領域」は、区域または一般的な範囲を指す。特定の実施形態において、タンパク質またはタンパク質モジュールに言及する場合、領域は、タンパク質もしくはタンパク質モジュールに沿ったアミノ酸の線形配列を含んでもよく、または、三次元の範囲、エピトープ、および／もしくはエピトープのクラスターを含んでもよい。特定の実施形態において、領域は末端領域を含む。本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、所与の薬剤の末端または末端に位置する領域を指す。タンパク質に言及する場合、末端領域はＮおよび／またはＣ末端を含んでもよい。Ｎ末端は、遊離アミノ基を有するアミノ酸を含むタンパク質の端部を指す。Ｃ末端は、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を含むタンパク質の端部を指す。したがって、Ｎおよび／またはＣ末端領域は、Ｎおよび／またはＣ末端ならびに周囲のアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、Ｎおよび／またはＣ末端領域は、約３個のアミノ酸～約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸および／または少なくとも１００個のアミノ酸を含む。特定の実施形態において、Ｎ末端領域は、Ｎ末端を含むがＣ末端を含まない、任意の長さのアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、Ｃ末端領域は、Ｃ末端を含むがＮ末端を含まない、任意の長さのアミノ酸を含んでもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドに言及する場合、領域は、ポリヌクレオチドに沿った核酸の線形配列を含んでもよく、または、三次元の範囲、二次構造、もしくは三次構造を含んでもよい。特定の実施形態において、領域は末端領域を含む。本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、所定の薬剤の端部または末端に位置する領域を指す。ポリヌクレオチドに言及する場合、末端領域は５’および３’末端を含み得る。５’末端とは、遊離リン酸基を有する核酸を含むポリヌクレオチドの末端を指す。３’末端とは、遊離ヒドロキシル基を有する核酸を含むポリヌクレオチドの末端を指す。したがって、５’および３’領域には、５’および３’末端、ならびに周囲の核酸が含まれてもよい。特定の実施形態において、５’および３’末端領域は、約９個の核酸～約９０個の核酸、約１５個の核酸～約１２０個の核酸、約３０個の核酸～約１５０個の核酸、約６０個の核酸～約３００個の核酸および／または少なくとも３００個の核酸を含む。特定の実施形態において、５’領域は、５’末端を含むが３’末端を含まない、任意の長さの核酸を含んでもよい。特定の実施形態において、３’領域は、３’末端を含むが５’末端を含まない、任意の長さの核酸を含んでもよい。
ＲＮＡまたはＲＮＡ分子：本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを指し、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば、それぞれＤＮＡの複製およびＤＮＡの転写によって、天然で合成することができるか、または化学的に合成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡもしくはｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であることができる。用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、１本以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ：本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらす、ＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物、菌類など、多数の種類の生物で観察されている。ＲＮＡｉは細胞内で自然に発生し、外来ＲＮＡ（ウイルスＲＮＡなど）を除去する。天然のＲＮＡｉは、分解機構を他と同様のＲＮＡ配列に向ける、遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞質内の短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子によって開始され、そこで触媒ＲＩＳＣ構成要素のアルゴノートと相互作用する。ｄｓＲＮＡ分子は外因的に細胞に導入されてもよい。外因性ｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質Ｄｉｃｅｒを活性化することによってＲＮＡｉを開始し、リボヌクレアーゼタンパク質Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡに結合して切断して、両端に２～３の不対のオーバーハング塩基を有する２１～２５塩基対の二本鎖断片を産生する。これらの短い二本鎖断片は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
試料：本明細書で使用されるとき、用語「試料」または「生物学的試料」は、その組織、細胞または構成要素のサブセット（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液および精液を含むがこれらに限定されない体液）を指す。試料は、全生物、あるいは、限定はされないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液；皮膚、呼吸器、腸、および尿生殖管の外切片；涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または臓器を含む、その組織、細胞、もしくは成分部分のサブセット、またはその画分もしくは一部分から調製された、ホモジネート、ライセート、または抽出物をさらに含んでもよい。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含み得る栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指す。
自己相補性ウイルス粒子：本明細書で使用されるとき、「自己相補性ウイルス粒子」は、少なくとも２つの成分、タンパク質カプシドおよびカプシド内に封入された自己相補性ゲノムをコードするポリヌクレオチド配列から構成される粒子である。
センス鎖：本明細書で使用されるとき、用語、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第２の鎖」または「パッセンジャー鎖」は、アンチセンス鎖または第１の鎖と相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンスおよびセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書で使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、サイレンシングにターゲティングされた遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０個のヌクレオチドのセクションと十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖、および他のｓｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するために十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖を含む。
短鎖干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、用語「短鎖干渉ＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導または媒介し得る、約５～６０個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡ類似体）を指す。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～３０個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、約１６～２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１８～２３個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１９～２２個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１、または２２個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）、約１９～２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、および約１９～２４個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。用語「短い」ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドなどの５～２３ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。用語「長鎖」ｓｉＲＮＡは、２４～６０個のヌクレオチド、例えば、約２４～２５個のヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５、または２６個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。一部の例では、短鎖ｓｉＲＮＡは、１９個よりも少ないヌクレオチド、例えば、１６、１７、もしくは１８個のヌクレオチド、またはわずか５個のヌクレオチドを含んでもよいが、ただし、これらのより短いｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを媒介する能力を保持している。同様に、一部の例では、長鎖ｓｉＲＮＡは、２６個より多くのヌクレオチド、例えば、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、またはさらには６０個のヌクレオチドを含んでもよいが、ただし、これらのより長いｓｉＲＮＡは、短鎖ｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング、例えば酵素的プロセシングが存在しない限り、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介する能力を保持している。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ－ｓｉＲＮＡ）、またはハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖と呼ばれる二重鎖構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ－ｓｉＲＮＡ）であることができる。
シグナル配列：本明細書で使用されるとき、句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送または局在化を指示し得る配列を指す。
単一単位用量：本明細書で使用されるとき、「単一単位用量」とは、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち単一の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。特定の実施形態において、単一の単位用量は、別個の剤形（例えば、錠剤、カプセル、パッチ、充填済み注射器、バイアルなど）として提供される。
類似性：本明細書で使用されるとき、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対する類似性パーセントの計算は、同一性パーセントの計算と同じ方式で行うことができるが、ただし、類似性パーセントの計算は、当該技術分野において理解される保存的置換を考慮に入れることを除く。
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単一単位用量または総１日用量を２つ以上の用量に分割するものである。
安定：本明細書で使用されるとき、「安定」は、反応混合物から有用な程度の純度への単離に耐えるために十分に頑強であり、特定の実施形態において、有効な療法剤へと製剤化することができる、化合物を指す。
安定化された：本明細書で使用されるとき、用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定にするまたは安定になることを意味する。
対象：本明細書で使用されるとき、用語「対象」または「患者」は、例えば、実験的、診断的、予防的、および／または治療的な目的で本開示に係る組成物を投与してもよい、任意の生物を指す。典型的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類）ならびに／または植物を含む。
実質的に：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の完全またはほぼ完全な程度または度合を呈する定性的状態を指す。生物学分野の当業者には、生物学的および化学的な現象が完全となるおよび／もしくは完全性へと進行する、または絶対的な結果を達成するもしくは回避することは、あったとしても稀であることを理解されるであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的な現象において固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。
実質的に同等：本明細書で使用されるとき、用量間の時間的相違に関しての場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用されるとき、複数の用量に関しての場合、この用語は、典型的に、２秒以内を意味する。
罹患している：疾患、障害、および／または状態を「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または状態、例えばパーキンソン病などを診断されている、またはその１つ以上の症状を呈する。
罹り易い：疾患、障害、および／または状態に「罹り易い」個体は、疾患、障害、および／または状態を診断されていない、および／またはその症状を呈さなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。特定の実施形態において、疾患、障害、および／または状態（例えば、がん）に罹り易い個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられてもよい：（１）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝的多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する微生物への曝露および／または感染。一部の実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹り易い個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。特定の実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹り易い個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。
持続放出：本明細書で使用されるとき、用語「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：用語「合成」は、人間の手によって生成、調製、および／または製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
ターゲティング：本明細書で使用されるとき、「ターゲティング」は、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘導するであろう核酸配列の設計および選択のプロセスを意味する。
ターゲティングされる細胞：本明細書で使用されるとき、「ターゲティングされる細胞」は、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは臓器において見出されてもよい。生物は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、またはヒト患者であってもよい。
末端領域：本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、連結されたヌクレオシドまたはアミノ酸（それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の領域の５’または３’末端上の領域を指す。
末端が最適化された：核酸を指すときの用語「末端が最適化された」は、核酸の末端領域が、天然または野生型の末端領域よりも何らかの方法で、例えば、コドン最適化されて改善されることを意味する。
療法剤：用語「療法剤」は、対象に投与された際に、治療的、診断的、および／もしくは予防的な効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは罹り易い対象に投与された際に、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、それを診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるために十分である、送達しようとする薬剤（例えば、核酸、薬物、療法剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。特定の実施形態において、治療有効量は単一用量で提供される。特定の実施形態において、治療有効量は、複数の用量を含む投薬レジメンで投与される。当業者には、特定の実施形態において、単位剤形は、かかる投薬レジメンの一部として投与された場合に有効である量を含む場合に、治療有効量の特定の薬剤または実体を含むとみなされてよいことが理解されよう。
治療上有効な結果：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な結果」は、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは罹り易い対象において、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、それを診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるために十分である結果を意味する。
総１日用量：本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間の期間内に与えられるまたは処方される量である。これは単一単位用量として投与されてもよい。
トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸を細胞内に導入する方法を指す。トランスフェクション方法としては、限定はされないが、化学的方法、物理的処理、およびカチオン性脂質または混合物が挙げられる。
治療すること：本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」は、特定の感染症、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に軽減させる、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、緩和させる、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低減させる、および／またはその発生を低減させることを指す。例えば、がんを「治療すること」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡がりを阻害することを指してもよい。治療は、疾患、障害、および／もしくは状態の兆候を呈さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期兆候のみを呈する対象に、疾患、障害、および／または状態と関連する病理を発症する危険性を減少させる目的で投与されてもよい。
未修飾（Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）：本明細書で使用されるとき、「未修飾」は、任意の様式で変化される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、生体分子または実体の野生型または天然の形態を指してもよいが、必ずしもそうとは限らない。分子は一連の修飾を受けてもよく、その場合、各々の修飾された分子は、後続の修飾の「未修飾」の出発分子として役割を果たしてもよい。
ベクター：本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、異種分子を輸送する、形質導入する、またはその他担体として働く、任意の分子または部分である。本開示のベクターは組換えにより産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい、および／またはそれを含んでもよい。かかる親または参照ＡＡＶ配列は、ベクターを操作するための元の、第２の、第３の、または後続の配列として働いてもよい。非限定的な例において、かかる親または参照ＡＡＶ配列は、以下の配列のうちの任意の１つ以上を含んでもよい：野生型であるまたは野生型から改変されていてもよく、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質の１つ以上のサブユニットの完全長または部分配列をコードしてもよい、ポリペプチドまたはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；野生型であるまたは野生型から改変されていてもよい、調節性または制御性核酸を含むポリヌクレオチド；ならびに野生型配列から改変されていても改変されていなくてもよいトランス遺伝子。これらのＡＡＶ配列は、１つ以上のコドン（核酸レベルで）もしくはアミノ酸（ポリペプチドレベルで）の「ドナー」配列、または１つ以上のコドン（核酸レベルで）もしくはアミノ酸（ポリペプチドレベルで）の「アクセプター」配列のいずれかとして働いてもよい。
ウイルスゲノム：本明細書で使用されるとき、「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」とは、ＡＡＶ粒子にカプセル化された核酸配列（複数可）を指す。
ＩＶ．均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本開示に係る具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確かめることが可能であろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されているとおりである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、その群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する場合に満たされるものとみなされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、２つ以上の、または全ての群メンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。
また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的（ｏｐｅｎ）であることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容するがそれは必須でないことにも注意されたい。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も包含され、開示される。
範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、示されない限り、またはそうでない場合は文脈および当業者の理解から明白でない限りは、範囲として表される値は、文脈により明白にそうでないと指示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本開示の様々な実施形態において記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲をとることができることが理解されよう。
加えて、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分または有効成分；任意の製造方法；任意の使用方法など）は、理由を問わず、または先行技術の存在とは関係なく、任意の１つ以上の請求項から除外され得る。
使用されている単語は限定ではなく説明の単語であること、ならびに、本開示のより広い側面における真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更を加えることができることを理解されたい。
本開示をかなり詳しく、いくつかの説明される実施形態に関するある具体性をもって説明したが、それが任意のかかる具体例もしくは実施形態または任意の具体的な実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、したがって本開示の意図される範囲を有効に包含するように添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。加えて、セクションの見出し、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
実施例１．ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の産生
本開示は、図１に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を製造する方法を含む。
第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸コンストラクトが提供される。第１のＯＲＦは、以下を含む：第１のプロモータ配列としてｐ１０プロモータを含む第１の発現制御領域：ＡＴＧ開始コドンを含む開始コドン領域；ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域；ならびに停止コドンを含む停止コドン領域。第２のＯＲＦは、以下を含む：第２のプロモータ配列としてΔｐ１０プロモータを含む第２の発現制御領域；ＡＴＧ開始コドンを含む開始コドン領域；ＶＰ１ ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域；ならびに停止コドンを含む停止コドン領域。Δｐ１０プロモータは、ｐ１０プロモータの短縮型バリアントである。
一代替では、第２のＯＲＦは、図２に示されるように、ＶＰ１のみの配列のためのΔｐ１０プロモータの代わりにＣｔｘプロモータを含む。
第１のＯＲＦおよび第２のＯＲＦの両方において、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞、特にソドプテラ・フルギペルダ（Ｓｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に対してコドン最適化されており、参照配列とのヌクレオチド相同性が９０％未満になるように最適化されている。
ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質を産生するために、核酸コンストラクトをウイルス産生細胞に導入する。各ＯＲＦのＤＮＡ配列は、細胞機構によって、対応する構成要素（開始コドン領域、ＶＰコード領域、および停止コドン領域）を有するｍＲＮＡ配列に転写される。次いで、ｍＲＮＡ配列は、細胞機構（各ＯＲＦの各開始コドン領域で独立して開始すること）によって対応するポリペプチド鎖に翻訳される。
第１のＯＲＦに対応するｍＲＮＡが翻訳され、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質が産生される。第２のＯＲＦに対応するｍＲＮＡは、ＶＰ１タンパク質のみを産生するように翻訳される。得られるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の組合せは、１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率であり、より好ましくは１：１：１０の比率である。
得られたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、ペイロードコンストラクトと機能してｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例２．ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の産生
本開示は、図１に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を製造する方法を含む。
第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および第２のオープンリーディングフレームを含む核酸コンストラクトが提供される。第１のＯＲＦは、以下を含む：第１のプロモータ配列としてｐ１０プロモータを含む第１の発現制御領域；ＡＴＧ開始コドンを含む開始コドン領域；ＶＰ２およびＶＰ３ ＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１ではない）のみをコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域；ならびに停止コドンを含む停止コドン領域。第２のＯＲＦは、以下を含む：第２のプロモータ配列としてΔｐ１０プロモータを含む第２の発現制御領域；ＡＴＧ開始コドンを含む開始コドン領域；ＶＰ１ ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域；ならびに停止コドンを含む停止コドン領域。Δｐ１０プロモータは、ｐ１０プロモータの短縮型バリアントである。
一代替では、第２のＯＲＦは、図２に示されるように、ＶＰ１のみの配列のためのΔｐ１０プロモータの代わりにＣｔｘプロモータを含む。
第２のＯＲＦ中のＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞、具体的にはソドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に対してコドン最適化されており、参照配列とのヌクレオチド相同性が９０％未満になるように最適化されている。
ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を産生するために、核酸コンストラクトをウイルス産生細胞に導入する。各ＯＲＦのＤＮＡ配列は、細胞機構によって、対応する構成要素（開始コドン領域、ＶＰコード領域、および停止コドン領域）を有するｍＲＮＡ配列に転写される。次いで、このｍＲＮＡ配列は、細胞機構（各ＯＲＦの各開始コドン領域で独立して開始すること）によって対応するポリペプチド鎖に翻訳される。
第１のＯＲＦに対応するｍＲＮＡは翻訳されてＶＰ２およびＶＰ３タンパク質のみが産生される。第２のＯＲＦに対応するｍＲＮＡは、ＶＰ１タンパク質のみを産生するように翻訳される。得られるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の組合せは、１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率であり、より好ましくは１：１：１０の比率である。
得られたＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例３．単一のＯＲＦからのＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８ポリペプチドの産生
本開示は、図３に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を製造する方法を含む。
約３１００ｂｐ長の単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸コンストラクトが提供される。このＯＲＦには、開始コドン領域（開始コドンを含む）、Ｒｅｐ５２コード領域（Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする）、２Ａ配列領域（豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａペプチドなどのウイルス２Ａペプチドをコードする）、Ｒｅｐ７８コード領域（Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする）、および停止コドン領域（停止コドンを含む）を含む。Ｒｅｐ５２コード領域およびＲｅｐ７８コード領域は２Ａ配列領域によって分離されている。
より具体的には、ＯＲＦは、ＯＲＦの５’末端に開始コドン領域を含む。開始コドン領域は、ＡＴＧ開始コドンを含む。開始コドン領域は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする核酸配列を含むＲｅｐ５２コード領域の５’末端に隣接している。Ｒｅｐ５２コドン領域の３’末端は、ウイルス２Ａペプチドをコードする核酸配列を含む、２Ａ配列領域の５’末端に隣接している。２Ａ配列領域の３’末端は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする核酸配列を含む、Ｒｅｐ７８コード領域の５’末端に隣接している。最終的に、Ｒｅｐ７８コドン領域の３’末端は、ＯＲＦの３’末端にある停止コドン領域に隣接している。停止コドン領域は、ＴＡＡ停止コドンを含む。
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を産生するために、ＯＲＦを含む核酸コンストラクトをウイルス産生細胞に導入する。ＯＲＦのＤＮＡ配列は、細胞機構によって、対応する構成要素（開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、Ｒｅｐ７８コード領域、および停止コドン領域）を有するｍＲＮＡ配列に転写される。次いで、ｍＲＮＡ配列は、細胞機構（開始コドン領域から開始すること）によって対応するポリペプチド鎖に翻訳される。翻訳プロセスは、開始コドンからＲｅｐ－５２コード領域を通じて進行する。翻訳プロセスが２Ａ配列領域に到達するとき、２Ａ配列領域の３’末端でグリシンとプロリンとの間で「リボソームスキップ」が発生する。第１のポリペプチドが放出され、Ｒｅｐ５２タンパク質に形成される。次いで、ｍＲＮＡの翻訳は、Ｒｅｐ７８コード領域を通じて停止コドン領域まで続き、Ｒｅｐ７８タンパク質を形成する第２のポリペプチドを産生する。この結果は、等モルレベルでの単一のポリシストロン性ｍＲＮＡからのＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８ポリペプチドの同時翻訳であり、２Ａペプチドは２つのポリペプチド間に自然な「自己切断」部位をもたらす。
得られたＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質は、ウイルス産生細胞におけるの他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例４．単一のＯＲＦからのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの産生
本開示は、図４に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を製造する方法を含む。
約３１００ｂｐ長の単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸コンストラクトが提供される。ＯＲＦには、開始コドン領域（開始コドンを含む）、Ｒｅｐ７８コード領域（Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする）、２Ａ配列領域（豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａペプチドなどのウイルス２Ａペプチドをコードする）、Ｒｅｐ５２コード領域（Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする）、および停止コドン領域（停止コドンを含む）を含む。Ｒｅｐ７８コード領域およびＲｅｐ５２コード領域は２Ａ配列領域によって分離されている。
より具体的には、ＯＲＦはＯＲＦの５’末端で開始コドン領域を含む。この開始コドン領域は、ＡＴＧ開始コドンを含む。この開始コドン領域は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする核酸配列を含むＲｅｐ７８コード領域の５’末端に隣接している。Ｒｅｐ７８コドン領域の３’末端は、ウイルス２Ａペプチドをコードする核酸配列を含む２Ａ配列領域の５’末端に隣接している。２Ａ配列領域の３’末端は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする核酸配列を含む、Ｒｅｐ５２コード領域の５’末端に隣接している。最終的に、Ｒｅｐ５２コドン領域の３’末端は、ＯＲＦの３’末端で停止コドン領域に隣接している。停止コドン領域は、ＴＡＡ停止コドンを含む。
Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を産生するために、ＯＲＦを含む核酸コンストラクトをウイルス産生細胞に導入する。ＯＲＦのＤＮＡ配列は、細胞機構によって、対応する構成要素（開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、Ｒｅｐ５２コード領域、および停止コドン領域）を有するｍＲＮＡ配列に転写される。次いで、ｍＲＮＡ配列は、細胞機構（開始コドン領域から開始すること）によって、対応するポリペプチド鎖に翻訳される。この翻訳プロセスは、開始コドンからＲｅｐ－７８コード領域を通じて進行する。翻訳プロセスが２Ａ配列領域に到達すると、２Ａ配列領域の３’末端でグリシンとプロリンとの間で「リボソームスキップ」が発生する。第１のポリペプチドが放出され、Ｒｅｐ７８タンパク質に形成される。次いで、ｍＲＮＡの翻訳は、Ｒｅｐ５２コード領域を通じて停止コドン領域まで続き、Ｒｅｐ５２タンパク質を形成する第２のポリペプチドが産生される。この結果は、等モルレベルでの単一のポリシストロン性ｍＲＮＡからのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの同時翻訳であり、２Ａペプチドは、２つのポリペプチド間に自然な「自己切断」部位をもたらす。
得られたＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例５．単一のヌクレオチド配列における異なるＯＲＦからのＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８ポリペプチドの産生
本開示は、図５に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を製造する方法を含む。
約３１００ｂｐ長のヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトが提供される。このヌクレオチド配列は、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＩＲＥＳ配列領域、および第２のオープンリーディングフレームを含む。第１のＯＲＦには、開始コドン領域（開始コドンを含む）、Ｒｅｐ５２コード領域（Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする）、および停止コドン領域（停止コドンを含む）が含まれる。第２のＯＲＦには、開始コドン領域（開始コドンを含む）、Ｒｅｐ７８コード領域（Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする）、および停止コドン領域（停止コドンを含む）が含まれる。第１のＯＲＦ（Ｒｅｐ５２ ＯＲＦ）および第２のＯＲＦ（Ｒｅｐ７８ ＯＲＦ）は、ＩＲＥＳ配列領域によって分離されている。
より具体的には、ヌクレオチド配列の第１のＯＲＦは、第１のＯＲＦの５’末端に第１の開始コドン領域を含む。第１の開始コドン領域は、ＡＴＧ開始コドンを含む。第１の開始コドン領域は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする核酸配列を含む、Ｒｅｐ５２コード領域の５’末端に隣接している。Ｒｅｐ５２コドン領域の３’末端は、第１のＯＲＦの３’末端にある第１の停止コドン領域に隣接している。この第１の停止コドン領域は、ＴＡＡ停止コドンを含む。第１のＯＲＦの３’末端は、ＩＲＥＳ配列領域の５’末端に隣接しており、この領域には、ＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ（口蹄疫ウイルス由来）またはＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルス由来）などの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列が含まれる。ＩＲＥＳ配列領域の３’末端は、第２のＯＲＦの５’末端、より具体的には、第２のＯＲＦの５’末端にある第２の開始コドン領域の５’末端に隣接している。この第２の開始コドン領域は、ＡＴＧ開始コドンを含む。この第２の開始コドン領域は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする核酸配列を含むＲｅｐ７８コード領域の５’末端に隣接している。Ｒｅｐ７８コドン領域の３’末端には、第２のＯＲＦの３’末端にある第２の停止コドン領域が隣接している。この第２の停止コドン領域は、ＴＡＡ停止コドンを含む。
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を産生するために、ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを、ウイルス産生細胞に導入する。このヌクレオチド配列は、細胞機構によって、対応する構成要素（第１のオープンリーディングフレーム（第１の開始コドン領域、Ｒｅｐ５２コード領域、第１の停止コドン領域）、ＩＲＥＳ領域、および第２のオープンリーディングフレーム（第２の開始コドン領域、Ｒｅｐ７８コード領域、第２の停止コドン領域））を有するｍＲＮＡ配列に転写される。次いで、ｍＲＮＡ配列は、細胞機構によって対応するポリペプチド鎖に翻訳される。
第１のオープンリーディングフレームのリボソーム翻訳は、第１の開始コドン領域の５’キャップで始まり、Ｒｅｐ５２コード領域を通じて第１の停止コドン領域の停止コドンまで進行する。Ｒｅｐ５２タンパク質を形成する第１のポリペプチドが放出される。
第２のオープンリーディングフレームのリボソーム翻訳は、ＩＲＥＳ領域によって促進される第２の開始コドン領域で始まる。ＩＲＥＳ領域のＩＲＥＳ配列は、複雑な二次構造を形成し、リボソーム機構が第２のオープンリーディングフレームのすぐ上流にある配列の中央（通常の５’ｃａｐを必要としない）のｍＲＮＡに結合することを可能にする。次いで、翻訳は、Ｒｅｐ７８コード領域を通じて第２の停止コドン領域の停止コドンに進む。Ｒｅｐ７８タンパク質を形成する第２のポリペプチドが放出される。
その結果は、Ｒｅｐ５２ポリペプチド（５’ｃａｐから）およびＲｅｐ７８ポリペプチド（ＩＲＥＳ配列から）が、比較的等モルレベルで単一のポリシストロン性ヌクレオチド配列から同時に翻訳される。得られたＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例６．異なるコンストラクトからのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの翻訳
本開示は、図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を製造する方法を含む。具体的には、この方法は発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトを使用する。
発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトを含むウイルス産生システムが提供される。この発現コンストラクトは、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、ドナープラスミドベクター（図６Ａを参照）の形態で提供される。発現コンストラクトＯＲＦは、Ｒｅｐ７８コード領域（Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする）、Ｒｅｐ７８コード領域に隣接するＲｅｐ７８プロモータ領域（ＯｐＥＩ、ｄＥＩまたはｐＨなどのＲｅｐ７８プロモータ配列を含む）、ＶＰコード領域（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする）、およびＶＰコード領域に隣接するＶＰプロモータ領域（ｐ１０などのＶＰプロモータ配列を含む）を含む。
ペイロードコンストラクトは、第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むドナープラスミドベクター（図６Ｂを参照）の形態で提供される。ペイロードコンストラクトＯＲＦには、Ｒｅｐ５２コード領域（Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする）、Ｒｅｐ５２コード領域に隣接するＲｅｐ５２プロモータ領域（ＯｐＥＩ、ｄＥＩ、ｐＨなどのＲｅｐ５２プロモータ配列を含む）、およびペイロード領域（５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子を含む）を含む。
Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質を産生するために、ウイルス産生システム（発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトの両方を含む）をウイルス産生細胞にトランスフェクトする。発現コンストラクトのヌクレオチド配列は、細胞機構によって、Ｒｅｐ７８コード領域を含むｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの第１のセットに転写される。ペイロードコンストラクトのヌクレオチド配列は、細胞機構によって、Ｒｅｐ５２コード領域を含むｍＲＮＡを含む第２のｍＲＮＡセットに転写される。
次いで、Ｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ配列は、細胞機構によって、対応するＲｅｐ７８ポリペプチド鎖に翻訳され、これがＲｅｐ７８タンパク質を形成する。Ｒｅｐ５２ ｍＲＮＡ配列はまた、細胞機構によって、対応するＲｅｐ５２ポリペプチド鎖に翻訳され、これがＲｅｐ５２タンパク質を形成する。得られたＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
機能的Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質はまた、Ｒｅｐ７８コード領域の代わりにＲｅｐ５２コード領域（およびプロモータ）を含む発現コンストラクトを使用して（図７Ａ）；および対応して、Ｒｅｐ５２コード領域の代わりにＲｅｐ７８コード領域（およびプロモータ）を含むペイロードコンストラクトを使用して（図７Ｂ）、同様の方法で製造され得る。
実施例７．バキュロウイルスコンストラクトにおける必須遺伝子を使用したＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８ポリペプチドの産生
本開示は、図８に示されるように、操作された核酸コンストラクトおよびヌクレオチド配列を使用して、ウイルス産生細胞内でＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を製造する方法を含む。
核酸コンストラクトは、約１３５Ｋｂｐ長のバキュロウイルスｓｓＤＮＡループの形態で提供される（図８を参照）。バキュロウイルスコンストラクトは、第１のＯＲＦセグメントおよび第２のＯＲＦセグメントを含む。第１のＯＲＦセグメントには、Ｒｅｐ５２コード領域（Ｒｅｐ５２タンパク質をコードする）、２Ａ配列領域（豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａペプチドなどのウイルス２Ａペプチドをコードする）、および第１の必須遺伝子領域（ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質などの必須バキュロウイルスタンパク質をコードする）を含む。Ｒｅｐ５２コード領域および第１の必須遺伝子領域は、２Ａ配列領域によって分離されている。第２のＯＲＦセグメントには、Ｒｅｐ７８コード領域（Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする）、２Ａ配列領域（豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａペプチドなどのウイルス２Ａペプチドをコードする）、および第２の必須遺伝子領域（ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質などの必須バキュロウイルスタンパク質をコードする）を含む。Ｒｅｐ７８コード領域および第２の必須遺伝子領域は、２Ａ配列領域によって分離されている。バキュロウイルスコンストラクトはまた、ＶＰコード領域（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする）、および対応するＶＰプロモータ領域を含む第３のＯＲＦセグメントを含んでもよい。
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質を産生するために、バキュロウイルスコンストラクトを、ウイルス産生細胞に導入する。各ＯＲＦ（第１の、第２の、および第３の）ｓｓＤＮＡ配列は、細胞機構によって、それらの供給源のＤＮＡに対応する構成要素領域を有する個体のｍＲＮＡ配列に転写される。第１のＯＲＦセグメントに対応する第１のｍＲＮＡには、Ｒｅｐ５２コード領域、２Ａ配列領域、および第１の必須遺伝子領域が含まれる。第２のＯＲＦセグメントに対応する第２のｍＲＮＡには、Ｒｅｐ７８コード領域、２Ａ配列領域、および第２の必須遺伝子領域が含まれる。次いで、各ｍＲＮＡ配列は、細胞機構によって、対応するポリペプチド鎖に翻訳される。
第１のｍＲＮＡの翻訳プロセスは、実施例３のバイシストロン性配列の翻訳と同様の方法で進行する。具体的には、翻訳プロセスは、翻訳が２Ａ配列領域に到達するまで、Ｒｅｐ５２コード領域を通じて進行し、「リボソームスキップ」は、２Ａ配列領域の３’末端でグリシンとプロリンの間で発生する。第１のポリペプチドが放出され、それが次いでＲｅｐ５２タンパク質を形成する。ｍＲＮＡの翻訳は、第１の必須遺伝子領域を通じて継続し、第１の必須タンパク質（ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質など）を形成するポリペプチドを産生する。
第２のｍＲＮＡの翻訳も同様に進行し、翻訳が２Ａ配列領域に到達するまでＲｅｐ７８コード領域を通じて翻訳プロセスが進行する。「リボソームスキップ」は、２Ａ配列領域の３’末端でグリシンとプロリンの間で発生し、ポリペプチドが放出されて、次いでこれがＲｅｐ７８タンパク質に形成される。ｍＲＮＡの翻訳は、第２の必須遺伝子領域を通じて継続し、第２の必須タンパク質（ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質など）を形成するポリペプチドを産生する。
得られたＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ウイルス産生細胞における他の発現タンパク質、構造タンパク質、およびペイロードコンストラクトと機能して、ｒＡＡＶ粒子を産生し得る。
実施例８．Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、発現制御領域、およびＶＰ１配列などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むように操作されている。この発現制御領域は、対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を駆動するためのＣｔｘプロモータを含むように操作された。ＡＡＶ．ＰＨＰＮカプシドのＶＰ１配列（ＶＰ１の通常のＡＴＧ開始コドンを有するＶＰ配列）を、例示的なタンパク質コードヌクレオチドコンストラクトとして使用した。
Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されている。ポリヌクレオチドは、ＡＴＧ開始コドンを有するＶＰ１ ＯＲＦ、Ｃｔｘプロモータを含む５０５ｂｐ ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域、およびＣｔｘポリアデニル化部位を含む７１９ｂｐ ３’ＵＴＲ領域を含むように操作された。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域では、ナンセンス翻訳産物を防ぐために全てのＡＴＧコドンがＴＴＧに変更され、挿入カセットの外側からの翻訳の読み取りを防ぐために、挿入カセットの３フレームに停止コドンが隣接していた。ポリヌクレオチドはまた、好適なバキュロウイルスプラスミドまたはベクターに挿入／クローニングされるように操作もされた。ポリヌクレオチドインサートの両端にＩ－ＣｅｕＩ切断配列（配列番号１）を含めて、標的バキュロウイルスプラスミドのＩ－ＣｅｕＩ部位へのポリヌクレオチドのクローニングを可能にした。
得られたポリヌクレオチドインサートを、ｐＵＣ１８ドナープラスミドにクローニングし、Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドを産生した。
実施例９．Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドをバクミドのＩ－ＣｅｕＩ遺伝子座にクローニングする
消化
Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドインサート（配列番号２）を含む実施例８由来のＣｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドが提供された。次いで、１０μＬ（３０μｇ）のＣｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８を、１７０μＬの水中で２０μＬの１０Ｘ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．））および４μＬのＩ－ＣｅｕＩ酵素（５Ｕ／μＬ）を使用して、３７℃で２時間消化し、続いて７５℃で５０分間曝露して、酵素を熱不活性化した。得られたＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサート（３５０４ｂｐ）を、ゲル精製（０．８％ｗ／ｖアガロース、１Ｘ ＴＡＥゲル、４５分、１２０Ｖでの電気泳動）を使用して精製した。このプロセスを繰り返して、必要に応じて追加のＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサートを収集した。
図１０に提示されたゲルは、残りのＣｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミド（６，１９０ｂｐ）およびｐＵＣ１８断片（２，６８６ｂｐ）からのＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサート（３，５０４ｂｐ）の明確な分離を示している。
コロニー４２０Ｂ由来のバクミドが提供され、それぞれがＩ－ＣｅｕＩ領域およびＡＡＶウイルス発現コンストラクトを有していた。ウイルス発現コンストラクトには、ｐｏｌＨプロモータ下のＡＡＶ Ｒｅｐ配列（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５１タンパク質をコードする）、ならびにｐ１０プロモータ下のＡＡＶＰＨＰＮ Ｃａｐ配列（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする）が含まれていた。５４μＬ（５μｇ）の４２０Ｂバクミドを、６μＬの１０Ｘ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））および４μＬのＩ－ＣｅｕＩ酵素（５Ｕ／μＬ）を使用して３７℃で２時間消化し、続いて７５℃で５０分間曝露して酵素を熱不活性化し、Ｉ－ＣｅｕＩ遺伝子座で４２０Ｂバクミドをシングルカットした。このプロセスを繰り返して、必要に応じて追加のＩ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ ４２０Ｂバクミドを収集した。
一代替では、バクミドのＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３ ＡＡＶＰＨＰＮ Ｃａｐ配列を、ＶＰ３のみの配列に置き換える。ｐ１０プロモータ下のＶＰ３のみの配列（ＡＴＧ開始コドン）の非限定的な例は、配列番号３および配列番号４に示されている。
ライゲーション
Ｉ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ４２０Ｂバクミドを、４０μＬのＩ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ４２０Ｂバクミド、３０μＬのＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサート、７μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ、３．３μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液および３μＬのＴ４リガーゼ酵素（４００Ｕ／μＬ）を、ＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩインサートと組合せること、次いで３７℃で３時間インキュベートすることによってライゲーションした。次いで、得られた水相を、５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２００μＬのエタノールと混合し、次いで－２０℃で１０分間冷却した。沈殿したＤＮＡペレットを遠心分離によって収集し、３０μＬのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁した。次いで、得られたライゲーションされたプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））に形質転換した。
細菌コロニー４６１～４９２を増殖させ、コロニーピックＰＣＲでスクリーニングして、Ｉ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ ４２０ＢバクミドへのＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩの挿入を試験した。
ＰＣＲのスクリーニングおよび分析
プライマーＪＳ１６－Ｌｅｆ７－ＬＰ１（配列番号５）、プライマーＪＳ１７－ｇｐ６４ＵＴＲ－ＲＰ（配列番号６）、およびプライマーＪＳ６１－ＶＰ３－プライマー２（配列番号７）という３つのプライマーの組合せを使用してコロニーＰＣＲスクリーニングを完了した。陽性のＰＣＲ結果は、使用したプライマーに基づいて、約１９６２ｂｐ（ＪＳ１６－ＪＳ６１）および４６６３ｂｐ（ＪＳ１６－ＪＳ１７）の標的を有した。
Ｉ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ ４２０ＢバクミドへのＩＣｅｕＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ１－ＩＣｅｕＩ挿入についての細菌コロニーのＪＳ１６～ＪＳ９１ ＰＣＲスクリーニングの結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＰＣＲスクリーニングは、コロニー４６９～４７２（図１１Ａ）ならびにコロニー４７７、４７９、４８６～４８７および４８９（図１１Ｂ）が１９６２ｂｐ付近に強いバンドを有することを示し、Ｃｔｘ－ＶＰ１インサートがＩ－ＣｅｕＩ－カット－４２０Ｂバクミドに挿入されている可能性があることを示した。
コロニー４６９～４７２、４７７、４７９、４８６～４８７および４８９のＪＳ１６～ＪＳ１７ＰＣＲスクリーニングの結果を、図１１Ｃに示す。ＰＣＲスクリーニングは、コロニー４６９、４７０、および４８７が、４６６３ｂｐ付近に強いバンドを有することを示し、Ｉ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ ４２０ＢバクミドへのＣｔｘ－ＶＰ１インサートの挿入の可能性を示している。
ウエスタンブロット試験
コロニー４８７は、抗ＡＡＶ Ｃａｐ ＥＣＬウエスタンブロットおよび抗ＡＡＶ Ｒｅｐ ＥＣＬウエスタンブロットを使用して試験し、バクミド４２０Ｂから増殖させたコロニーを参照として使用した。コロニー４８７およびコロニー４２０Ｂ由来のバクミドを、Ｓｆ９細胞に感染させ、感染後３日での全細胞溶解物を、ウエスタンブロットを使用して分析した。結果を図１２に示す。
図１２の結果は、ＶＰ２およびＶＰ３産生（これらは一貫していた）と比較して、ＶＰ１産生の適度な増大を示している。ｒｅｐタンパク質産生も、バクミド４８７とバクミド４２０Ｂとの間で一貫していることが示された。
実施例１０．Ｃｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、発現制御領域およびＶＰ２／ＶＰ３配列などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むように操作した。発現制御領域は、対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を駆動するためのＣｔｘプロモータを含むように操作した。ＡＡＶ．ＰＨＰＮカプシドのＶＰ２／ＶＰ３配列（ＶＰ２の通常のＡＴＧ開始コドンを有するＶＰ２ ＯＲＦ）を、例示的なタンパク質コードヌクレオチドコンストラクトとして使用した。
Ｃｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドは、配列番号８に示されている。ポリヌクレオチドは、ＡＴＧ開始コドンを有するＶＰ２ ＯＲＦ、Ｃｔｘプロモータを含む５０５ｂｐ ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域、およびＣｔｘポリアデニル化部位を含む７１９ｂｐの３’ＵＴＲ領域を含むように操作された。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域では、ナンセンスな翻訳産物を防ぐために全てのＡＴＧコドンがＴＴＧに変更され、挿入カセットは、その挿入カセットの外側からの翻訳の読み取りを防ぐために、３フレームに停止コドンが隣接していた。ポリヌクレオチドはまた、好適なバキュロウイルスプラスミドまたはベクターに挿入／クローニングされるように操作した。ポリヌクレオチドインサートの両端にＡｖｒＩＩ切断配列（ｃｃｔａｇｇ）およびＦｓｅＩ切断配列（ｇｇｃｃｇｇｃｃ）を含め、標的バキュロウイルスプラスミドのＡｖｒＩＩ（ｅｇｔ ＯＲＦ）およびＦｓｅＩ（ｇｔａ ＯＲＦ）部位へのポリヌクレオチドのクローニングを可能にした。
得られたポリヌクレオチドインサートを、ｐＵＣ１８ドナープラスミドにクローニングして、Ｃｔｘ－ＶＰ１（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドを産生した。
一代替では、Ｒｅｐタンパク質配列を含む追加のポリヌクレオチドインサートを、Ｃｔｘ－ＶＰ２ポリヌクレオチドインサートの５’末端にライゲーションして、ＦｓｅＩ－Ｒｅｐ－ＣｔｘＶＰ２－ＦｓｅＩまたはＡｖｒＩＩ－Ｒｅｐ－ＣｔｘＶＰ２－ＡｖｒＩＩポリヌクレオチドインサートを提供する。Ｒｅｐポリヌクレオチドインサートは、ｐｏｌＨ－Ｒｅｐ７８ＡＴＧ、ｐ１０－Ｒｅｐ７８ＡＴＧ、ＯｐＩＥ１－Ｒｅｐ７８ＡＴＧ、ｐｏｌＨ－Ｒｅｐ５２、ｐ１０－Ｒｅｐ５２またはＯｐＩＥ１－Ｒｅｐ５２を含んでもよい。
実施例１１．Ｃｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドをＣｔｘ－ＶＰ１－ＰＨＰＮバクミドのＦｓｅＩ遺伝子座にクローニングする
消化
Ｃｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）ポリヌクレオチドインサート（配列番号８）を含む実施例１０由来のＣｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドが提供された。次いで、１５μＬ（４５μｇ）のＣｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８を、２５μＬの１０Ｘ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））、４μＬのＦｓｅＩ酵素および３μＬのＢｓａＩ酵素を使用して、２１０μＬの水中で、３７℃で３時間消化し、続いて７５℃で３０分間曝露し、酵素を熱不活性化した。得られたＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサート（３５０４ｂｐ）をゲル精製し、このプロセスを繰り返して、必要に応じて追加のＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサートを収集した。
図１３に提示されたゲルは、残りのｐＵＣ１８断片（ＢｓａＩ酵素切断後の約１３００ｂｐ断片）からのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサート（３，０７４ｂｐ）の明確な分離を示している。
コロニー４８７（実施例９）からバクミドを得て、それぞれＦｓｅＩ領域を有した。２４μＬ（３９８ｎｇ／μＬ）のバクミド４８７を、６μＬの１０Ｘ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））および３μＬのＦｓｅＩ酵素を使用して、３０μＬの水中で３７℃で３時間消化し、続いて７５℃で３０分間曝露して、酵素を熱不活性化し、ＦｓｅＩ遺伝子座で４８７バクミドをシングルカットした。このプロセスを繰り返して、必要に応じて追加のＦｓｅＩ－ｃｕｔ４８７バクミドを収集した。
一代替では、Ｃｔｘ－ＶＰ２（ＰＨＰＮ）－ｐＵＣ１８ドナープラスミドおよび４８７バクミドを、ＡｖｒＩＩ酵素を使用して消化して、ＡｖｒＩＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＡｖｒＩＩポリヌクレオチドインサートを、４８７バクミドのｅｇｔ ＯＲＦのＡｖｒＩＩ部位に挿入してもよい。
ライゲーション
ＦｓｅＩ－ｃｕｔ ４８７バクミドを、１０μＬのＦｓｅＩカット４８７バクミド、３０μＬのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサート、５μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液および２μＬのＴ４リガーゼ酵素（８００Ｕ／μＬ）を組合せること、次いで２０℃で１時間インキュベートすることによってＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサートとライゲーションした。一代替では、ライゲーション混合物には、１０μＬのＦｓｅＩカット４８７バクミド、１０μＬのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサート、５μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液および２μＬのＴ４リガーゼ酵素（８００Ｕ／μＬ）が２５μＬのＨ２Ｏ中に含まれていた。一代替では、ライゲーション混合物には、１０μＬのＦｓｅＩ－ｃｕｔ４８７バクミド、５μＬのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩインサート、５μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液、および２μＬのＴ４リガーゼ酵素（８００Ｕ／μＬ）が３０μＬのＨ２Ｏ中に含まれていた。
次いで、得られた水相を、３μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１００μＬのエタノールと混合し、次いで－２０℃で１０分間冷却した。沈殿したＤＮＡペレットを、遠心分離機で収集し、２０μＬのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁した。次いで、得られたライゲーションされたプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ニュー・イングランド・バイオラボ株式会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））に形質転換した。
細菌コロニー５０３～５２１を増殖させ、コロニーピックＰＣＲでスクリーニングして、ＦｓｅＩ－ｃｕｔ ４８７バクミドへのＦｓｅＩ－Ｃｔｘ－ＶＰ２－ＦｓｅＩの挿入を試験した。
ＰＣＲのスクリーニングおよび分析
コロニーＰＣＲスクリーニングは、２つのプライマーの２つの組合せを使用して完了した：（１）プライマーＪＳ９０－ｇｔａ－ＬＰ１（配列番号９）およびプライマーＪＳ９２－ＡＡＰ－ＲＰ１（配列番号１０）；ならびに（２）プライマーＪＳ９３－ＶＰ１２３－ｅｎｄＬＰ１（配列番号１１）およびプライマーＪＳ９１－ｇｔａ－ＲＰ１（配列番号１２）。陽性のＰＣＲ結果では、使用したプライマーに基づいて、約９７６ｂｐ（ＪＳ９０～ＪＳ９２）および８０４ｂｐ（ＪＳ９３～ＪＳ９１）の標的を有した。ＪＳ９０～ＪＳ９２ＰＣＲスクリーニングおよびＪＳ９３～ＪＳ９１ＰＣＲスクリーニングの結果を、図１４に示す。
ＰＣＲスクリーニングは、コロニー５０６～５０７、５１２、および５１７～５１８（図１４）が、９７６ｂｐおよび８０４ｂｐの両方の周りに強いバンドを有することを示し、Ｃｔｘ－ＶＰ２インサートがＩ－ＣｅｕＩ－ｃｕｔ ４８７バクミドに挿入される可能性を示した。
実施例１２．ｐ６９ＶＰ１～ｐ６９ＶＰ２－ＰＨＰＮバクミドの産生
ＶＰ１ポリヌクレオチドインサートは、実施例８に従って操作され、Ｃｔｘプロモータの代わりにｐ６．９プロモータエレメントが使用されている。得られたｐ６９－ＶＰ１インサートを、実施例９に従ってバクミドのＩ－ＣｅｕＩ遺伝子座にクローニングし、ｐ６９ＶＰ１－ＰＨＰＮバクミドを得る。
ＶＰ２ポリヌクレオチドインサートは、Ｃｔｘプロモータの代わりにｐ６．９プロモータエレメントを使用して、実施例１０に従って操作する。得られたｐ６９－ＶＰ２インサートを、実施例１１に従ってｐ６９ＶＰ１－ＰＨＰＮバクミドのＦｓｅＩ遺伝子座にクローニングして、ｐ６９ＶＰ１－Ｐ６９ＶＰ２－ＰＨＰＮバクミドを得る。

Claims (146)

  1. ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のＶＰコード領域と；ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２のＶＰコード領域とを含むＡＡＶ発現コンストラクト。
  2. 前記第１のＶＰコード領域が、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  3. 前記第１のＶＰコード領域が、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  4. 前記第１のＶＰコード領域が、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質のみをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  5. 前記第１のＶＰコード領域が、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしないヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  6. 前記第２のＶＰコード領域が、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  7. 前記第２のＶＰコード領域が、ＶＰ１のみをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  8. 前記第２のＶＰコード領域が、ＶＰ１をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしないヌクレオチド配列を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  9. 前記第１のＶＰコード領域および前記第２のＶＰコード領域が、ＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  10. 前記第１のＶＰコード領域の前記ＡＡＶ血清型が、前記第２のＶＰコード領域の前記ＡＡＶ血清型と同じである、請求項９に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  11. 前記第１のＶＰコード領域の前記ＡＡＶ血清型が、前記第２のＶＰコード領域の前記ＡＡＶ血清型と異なる、請求項９に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  12. 前記第１のＶＰコード領域および前記第２のＶＰコード領域の前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、Ａ
    ＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、およびそのバリアントまたはキメラからなる群から独立して選択される、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  13. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列から最適化されたコドンである、請求項９乃至１２のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  14. 前記第１のＶＰコード領域が、昆虫細胞に対して最適化されたコドンである、請求項１３に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  15. 前記第１のＶＰコード領域が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に対して最適化されたコドンである、請求項１３に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  16. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオクレオチド配列に対して１００％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  17. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して９５％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  18. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して９０％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  19. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して８５％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  20. 前記第１のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して８０％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  21. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列から最適化されたコドンである、請求項９乃至２０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  22. 前記第２のＶＰコード領域が、昆虫細胞に対して最適化されたコドンである、請求項２１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  23. 前記第２のＶＰコード領域が、スポドプテラ・フルギペルダ細胞に対して最適化されたコドンである、請求項２１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  24. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して１００％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  25. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して９５％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  26. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して９０％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  27. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して８５％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  28. 前記第２のＶＰコード領域が、参照ヌクレオチド配列に対して８０％未満のヌクレオチド相同性を有するように最適化されたコドンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  29. 前記第１のＶＰコード領域を含む第１のヌクレオチド配列と、前記第２のＶＰコード領域を含む第２のヌクレオチド配列とを含む、請求項１乃至２８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  30. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記第１のＶＰコード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなり、前記第２のヌクレオチド配列が、前記第２のＶＰコード領域を含む第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなり、前記第１のオープンリーディングフレームは、前記第２のオープンリーディングフレームと異なる、請求項２９に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  31. 前記第１のオープンリーディングフレームが、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、請求項３０に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  32. 前記第１のオープンリーディングフレームが、ＶＰ２およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ１をコードしない、請求項３０に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  33. 前記第２のオープンリーディングフレームが、ＶＰ１ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするがＶＰ２またはＶＰ３をコードしない、請求項３０乃至３２のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  34. 開始コドンを含む１つ以上の開始コドン領域と、停止コドンを含む１つ以上の停止コドン領域とを含む、請求項１乃至３３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  35. 前記第１のヌクレオチド配列が、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域とを含み；前記第２のヌクレオチド配列が、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域とを含む、請求項２９乃至３３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  36. 前記第１のオープンリーディングフレームが、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域とを含み；前記第２のオープンリーディングフレームが、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域とを含む、請求項３０乃至３３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  37. １つ以上のプロモータ配列を含む１つ以上の発現制御領域を含む、請求項１乃至３６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  38. 前記第１のヌクレオチド配列が、第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含み；前記第２のヌクレオチド配列が、第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む、請求項２９乃至３６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  39. 前記第１のオープンリーディングフレームが、第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域を含み；前記第２のオープンリーディングフレームが、第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域を含む、請求項３０乃至３３および３６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  40. 各プロモータ配列が、バキュロウイルス主要後期プロモータ、昆虫ウイルスプロモータ、非昆虫ウイルスプロモータ、脊椎動物ウイルスプロモータ、核遺伝子プロモータ、ウイルスおよび非ウイルスエレメントを含む１つ以上の種に由来するキメラプロモータ、合成プロモータ、およびそのバリエーションまたは誘導体からなる群から独立して選択される、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  41. 各プロモータ配列が、ｐｏｌｈ昆虫転写プロモータ、ΔＩＥ－１昆虫転写プロモータ、ｐ１０昆虫特異的プロモータ、Δｐ１０昆虫特異的プロモータ、ＣＭＶ哺乳動物転写プロモータ、およびそのバリエーションまたは誘導体からなる群から独立して選択される、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  42. 前記第１のプロモータ配列が、ｐ１０昆虫特異的プロモータである、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  43. 前記第２のプロモータ配列が、Δｐ１０昆虫特異的プロモータである、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  44. 前記第１のプロモータ配列が、ｐ１０昆虫特異的プロモータであり；前記第２のプロモータ配列が、Δｐ１０昆虫特異的プロモータである、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  45. 前記１つ以上の発現制御領域が、約または正確に１：１：１０；約または正確に２：２：１０；約または正確に３：３：１０；約または正確に４：４：１０；約または正確に５：５：１０；約または正確に１～２：１～２：１０；約または正確に１～３：１～３：１０；約または正確に１～４：１～４：１０；約または正確に１～５：１～５：１０；約または正確に２～３：２～３：１０；約または正確に２～４：２～４：１０；約または正確に２～５：２～５：１０；約または正確に３～４：３～４：１０；約または正確に３～５：３～５：１０；ならびに約または正確に４～５：４～５：１０からなる群から選択されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を生じるように最適化される、請求項３７乃至４４のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  46. 前記第１のヌクレオチド配列が、第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域と、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、前記第１のＶＰコード領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域とを含み；前記第２のヌクレオチド配列が、第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域と、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、前記第２のＶＰコード領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域とを含む、請求項２９乃至３３、３５乃至３６、および３８乃至４５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  47. 前記第１のオープンリーディングフレームが、第１のプロモータ配列を含む第１の発現制御領域と、第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域と、前記第１のＶＰコード領域と、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域とを含み、前記第２のオープンリーディングフレームが、第２のプロモータ配列を含む第２の発現制御領域と、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域と、前記第２のＶＰコード領域と、第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域とを含む、請求項３０乃至３３、３６、および３９乃至４５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  48. ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードを含むＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システム。
  49. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項４８に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  50. ＡＡＶウイルス産生細胞を含む、請求項４８乃至４９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  51. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、前記ＡＡＶ発現コンストラクトと前記ＡＡＶペイロードコンストラクトとを含む、請求項５０に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  52. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５０乃至５１のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  53. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項５０乃至５１のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  54. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項５０乃至５１のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  55. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項５０乃至５１のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  56. ＡＡＶウイルス産生細胞を製造する方法であって、ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程とを含む方法。
  57. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項４８乃至４９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５６乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項５６乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項５６乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項５６乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
  63. ＡＡＶウイルス産生細胞においてＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質を発現させる方法であって、１つ以上のＶＰコード領域を含むＡＡＶ発現コンストラクトを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程と；前記ＡＡＶウイルス産生細胞が前記ＶＰコード領域を対応するＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ＡＡＶカプシドタンパク質中へとプロセシングすることを可能にする条件に、前記ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程とを含む方法。
  64. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項４８乃至４９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６３乃至６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項６３乃至６５のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項６３乃至６５のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項６３乃至６５のいずれか１項に記載の方法。
  70. ＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法であって、ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程であって、前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のＶＰコード領域を含み、前記ＡＡＶペイロードコンストラクトが、ＡＡＶペイロードを含むペイロード領域を含む、工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程と；前記ＡＡＶウイルス産生細胞が前記ＡＡＶ発現コンストラクトおよび前記ＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子中へとプロセシングすることを可能にする条件に前記ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程と；前記ＡＡＶウイルス産生細胞から前記ｒＡＡＶ粒子を収集する工程とを含む方法。
  71. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項１乃至４７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項４８乃至４９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項６４に記載の方法。
  73. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項７０乃至７２のいずれか１項に記載の方法。
  77. Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするＲｅｐ５２配列を含むＲｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８配列を含むＲｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含む第１のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ発現コンストラクト。
  78. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域と前記Ｒｅｐ７８コード領域とを含む、請求項７７に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  79. 前記第１のヌクレオチド配列が、ウイルス性２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む２Ａ配列領域を含む、請求項７８に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  80. 前記２Ａヌクレオチド配列が、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、馬鼻炎（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）Ａウイルス由来のＥ２Ａ、豚テッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ、細胞質多角体病ウイルス由来のＢｍＣＰＶ ２Ａ、カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）軟化病ウイルス由来のＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるウイルス性２Ａペプチドをコードする、請求項７９に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  81. 前記２Ａ配列領域が、前記第１のヌクレオチド配列において、前記Ｒｅｐ５２コード領域と前記Ｒｅｐ７８コード領域との間に位置する、請求項７９乃至８０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  82. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：前記Ｒｅｐ５２コード領域、前記２Ａ配列領域、および前記Ｒｅｐ７８コード領域をその順において含む、請求項７９乃至８０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  83. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：前記Ｒｅｐ７８コード領域、前記２Ａ配列領域、および前記Ｒｅｐ５２コード領域をその順において含む、請求項７９乃至８０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  84. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：開始コドンを含む開始コドン領域、前記Ｒｅｐ５２コード領域、前記２Ａ配列領域、前記Ｒｅｐ７８コード領域、および停止コドンを含む停止コドン領域をその順において含む、請求項７９乃至８０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  85. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：開始コドンを含む開始コドン領域、前記Ｒｅｐ７８コード領域、前記２Ａ配列領域、前記Ｒｅｐ５２コード領域、および停止コドンを含む停止コドン領域をその順において含む、請求項７９乃至８０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  86. 前記開始コドンが、ＡＴＧ開始コドンである、請求項８４乃至８５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  87. 前記第１のヌクレオチド配列が、実質的に、単一のオープンリーディングフレームからなる、請求項７８乃至８６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  88. 前記第１のヌクレオチド配列が、単一のオープンリーディングフレームからなる、請求項７８乃至８６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  89. 前記第１のヌクレオチド配列が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｇｈｔ）をコードするＩＲＥＳヌクレオチド配列を含むＩＲＳＥ配列領域を含む、請求項７８に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  90. 前記ＩＲＥＳヌクレオチド配列が、口蹄疫ウイルス由来のＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス由来のＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ、およびそれらの組合せからなる群から選択された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、請求項８９に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  91. 前記ＩＲＥＳ配列領域が、前記第１のヌクレオチド配列において、前記Ｒｅｐ５２コード領域と前記Ｒｅｐ７８コード領域との間に位置する、請求項８９乃至９０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  92. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：前記Ｒｅｐ５２コード領域、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ７８コード領域をその順において含む、請求項８９乃至９０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  93. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：前記Ｒｅｐ７８コード領域、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ５２コード領域をその順において含む、請求項８９乃至９０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  94. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域、前記Ｒｅｐ５２コード領域、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域、前記ＩＲＥＳ配列領域、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域、前記Ｒｅｐ７８コード領域、および第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域をその順において含む、請求項８９乃至９０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  95. 前記第１のヌクレオチド配列が、以下の領域：第１の開始コドンを含む第１の開始コドン領域、前記Ｒｅｐ７８コード領域、第１の停止コドンを含む第１の停止コドン領域、前記ＩＲＥＳ配列領域、第２の開始コドンを含む第２の開始コドン領域、前記Ｒｅｐ５２コード領域、および第２の停止コドンを含む第２の停止コドン領域をその順において含む、請求項８９乃至９０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  96. 前記開始コドンが、ＡＴＧ開始コドンである、請求項９４乃至９５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  97. 前記第１のヌクレオチド配列が、実質的に、前記Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ７８コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームからなる、請求項８９乃至９６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  98. 前記第１のヌクレオチド配列が、実質的に、前記Ｒｅｐ７８コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ５２コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームからなる、請求項８９乃至９６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  99. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ７８コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームからなる、請求項８９乃至９６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  100. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ７８コード領域を含む第１のオープンリーディングフレーム、前記ＩＲＥＳ配列領域、および前記Ｒｅｐ５２コード領域を含む第２のオープンリーディングフレームからなる、請求項８９乃至９６のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  101. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域を含み、前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、前記第１のヌクレオチド配列とは異なる第２のヌクレオチド配列であって、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８配列を含む第２のヌクレオチド配列を含む、請求項７７に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  102. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域と前記ＡＡＶ発現コンストラクトにとっての必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む第１の必須遺伝子領域とを含み、前記第２のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ７８コード領域と前記ＡＡＶ発現コンストラクトにとっての必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む第２の必須遺伝子領域とを含む、請求項１０１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  103. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域と、ウイルス性２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む第１の２Ａ配列領域と、前記第１の必須遺伝子領域とを含み；前記第２のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ７８コード領域と、ウイルス性２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む第２の２Ａ配列領域と、前記ＡＡＶ発現コンストラクトにとっての必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む第２の必須遺伝子領域とを含む、請求項１０２に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  104. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、バキュロウイルスコンストラクトである、請求項１０３に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  105. 前記第１の必須遺伝子領域および前記第２の必須遺伝子領域における前記必須遺伝子ヌクレオチド配列が、それぞれ、必須バキュロウイルスタンパク質をコードする、請求項１０４に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  106. 前記第１の必須遺伝子領域および前記第２の必須遺伝子領域における前記必須遺伝子ヌクレオチド配列が、それぞれ、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質、およびそれらの組合せからなる群から独立して選択される必須バキュロウイルスタンパク質をコードする、請求項１０４に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  107. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域と、前記第１の２Ａ配列領域と、前記第１の必須遺伝子領域とを含み、前記第１の必須遺伝子領域は、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含み、前記第２のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ７８コード領域と、前記第２の２Ａ配列領域と、前記第２の必須遺伝子領域とを含み、前記第２の必須遺伝子領域は、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む、請求項１０４に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  108. 前記第１のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ５２コード領域と、前記第１の２Ａ配列領域と、前記第１の必須遺伝子領域とを含み、前記第１の必須遺伝子領域は、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含み；前記第２のヌクレオチド配列が、前記Ｒｅｐ７８コード領域と、前記第２の２Ａ配列領域と、前記第２の必須遺伝子領域とを含み、前記第２の必須遺伝子領域は、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む、請求項１０４に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  109. ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システム。
  110. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１０９に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  111. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含み、ならびにＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のＶＰコード領域も含み；前記ＡＡＶペイロードコンストラクトが、Ｒｅｐ５２コード領域、Ｒｅｐ７８コード領域、またはそれらの組合せを含み、ならびにＡＡＶペイロードを含むペイロード領域も含む、請求項１０９乃至１１０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  112. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、Ｒｅｐ５２コード領域とＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のＶＰコード領域とを含み；前記ＡＡＶペイロードコンストラクトが、Ｒｅｐ７８コード領域とＡＡＶペイロードを含むペイロード領域とを含む、請求項１０９乃至１１０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  113. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、Ｒｅｐ７８コード領域とＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のＶＰコード領域とを含み；前記ＡＡＶペイロードコンストラクトが、Ｒｅｐ５２コード領域とＡＡＶペイロードを含むペイロード領域とを含む、請求項１０９乃至１１０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  114. 前記Ｒｅｐ５２コード領域が、ＯｐＥＩ、ｄＥＩ、ｐＨ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロモータを含む、請求項１１１乃至１１３のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  115. 前記Ｒｅｐ７８コード領域が、ＯｐＥＩ、ｄＥＩ、ｐＨ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるプロモータを含む、請求項１１１乃至１１３のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  116. 前記１つ以上のＶＰコード領域が、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含み、前記ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ Ｃ
    Ｌｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、およびそのバリアントまたはキメラからなる群から選択される、請求項１１１乃至１１５のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  117. ＡＡＶウイルス産生細胞を含む、請求項１０９乃至１１６のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  118. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、前記ＡＡＶ発現コンストラクトと前記ＡＡＶペイロードコンストラクトとを含む、請求項１１７に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  119. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１１７乃至１１８のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  120. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１１７乃至１１８のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  121. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項１１７乃至１１８のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  122. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項１１７乃至１１８のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  123. ＡＡＶウイルス産生細胞を製造する方法であって、ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程とを含む方法。
  124. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項１０９乃至１１６のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１２３乃至１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１２３乃至１２５のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項１２３乃至１２５のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項１２３乃至１２５のいずれか１項に記載の方法。
  130. ＡＡＶウイルス産生細胞においてＲｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ５２タンパク質を発現させる方法であって、Ｒｅｐ５２コード領域を含む少なくとも１つの核酸コンストラクトとＲｅｐ７８コード領域を含む少なくとも１つの核酸コンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程と；前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、前記Ｒｅｐ５２コード領域を対応するＲｅｐ５２タンパク質へとプロセシングすることおよび前記Ｒｅｐ７８コード領域を対応するＲｅｐ７８タンパク質へとプロセシングすることを可能にする条件に、前記ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程とを含む方法。
  131. Ｒｅｐ５２コード領域を含む前記少なくとも１つの核酸コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１３０に記載の方法。
  132. Ｒｅｐ７８コード領域を含む前記少なくとも１つの核酸コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１３０に記載の方法。
  133. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、Ｒｅｐ５２コード領域とＲｅｐ７８コード領域とを含む少なくとも１つの核酸コンストラクトを含む、請求項１３０に記載の方法。
  134. Ｒｅｐ５２コード領域とＲｅｐ７８コード領域とを含む前記少なくとも１つの核酸コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１３３に記載の方法。
  135. ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項１０９乃至１１６のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項１３０に記載の方法。
  136. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１３０乃至１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１３０乃至１３５のいずれか１項に記載の方法。
  138. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項１３０乃至１３５のいずれか１項に記載の方法。
  139. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項１３０乃至１３５のいずれか１項に記載の方法。
  140. ＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを製造する方法であって、ＡＡＶ発現コンストラクトとＡＡＶペイロードコンストラクトとを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程であって、前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のＶＰコード領域を含み、前記ＡＡＶペイロードコンストラクトが、ＡＡＶペイロードを含むペイロード領域を含む、工程と；前記ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞内へとトランスフェクトする工程と；前記ＡＡＶウイルス産生細胞が前記ＡＡＶ発現コンストラクトおよび前記ＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子中へとプロセシングすることを可能にする条件に、前記ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程と、前記ＡＶウイルス産生細胞から前記ｒＡＡＶ粒子を収集する工程とを含む方法。
  141. 前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項７７乃至１０８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトである、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記ＡＡＶウイルス産生システムが、請求項１０９乃至１１６のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システムである、請求項１４０に記載の方法。
  143. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１４０乃至１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１４０乃至１４２のいずれか１項に記載の方法。
  145. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、昆虫細胞である、請求項１４０乃至１４２のいずれか１項に記載の方法。
  146. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項１４０乃至１４２のいずれか１項に記載の方法。
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