ES2564553T3 - Procedimiento para purificar vectores víricos que tienen proteínas que se unen a ácido siálico - Google Patents

Procedimiento para purificar vectores víricos que tienen proteínas que se unen a ácido siálico

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ES2564553T3
ES2564553T3 ES02786355.4T ES02786355T ES2564553T3 ES 2564553 T3 ES2564553 T3 ES 2564553T3 ES 02786355 T ES02786355 T ES 02786355T ES 2564553 T3 ES2564553 T3 ES 2564553T3
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Abstract

Un procedimiento para aislar un objetivo de purificación que comprende una proteína que se une de forma específica a ácido siálico, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de: dejar que el objetivo de purificación entre en contacto con una molécula que comprende ácido siálico que se ha enlazado a un soporte sólido, por el que el objetivo de purificación que tiene un sitio de unión para ácido siálico se une de forma selectiva por la molécula, en el que el objetivo de purificación comprende una proteína de la cápside seleccionada del grupo que consiste en una proteína de la cápside de AAV serotipo 4, una proteína de la cápside de AAV serotipo 5 y una cápside que comprende un fragmento de una cápside de AAV4 o AAV5 que contiene el sitio de unión para ácido siálico.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para purificar vectores vmcos que tienen protemas que se unen a acido sialico
El presente trabajo ha sido subvencionado, en parte, mediante la financiacion de los National Institutes of Health, P30 DK47757. El Gobierno de EE. UU. puede tener determinados derechos en la presente invencion.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los vectores de terapia genica basados en virus adenoasociado (AAV) serotipo 2 han demostrado ser preferentes para lograr una transduccion estable tras la administracion in vivo. Sin embargo, mientras que la estabilidad de la expresion transgenica era impresionante, su eficacia a menudo no lo era.
La investigacion basica y el desarrollo comercial de vectores basados en el serotipo 2 se ha potenciado con el desarrollo de procedimientos cromatograficos para la purificacion. Con el desarrollo de vectores AAV de otros serotipos ha surgido la necesidad de procedimientos de purificacion de dichos vectores. Uno de dichos vectores, el AAV serotipo 5 (AAV5), ha demostrado ser un vector util. Hasta la fecha, sin embargo, la purificacion de vectores basados en AAV5 requena sedimentacion con cloruro de cesio (CsCh), puesto que no se une a la heparina que se ha usado para la purificacion de AAV2. La sedimentacion con CsCh lleva mucho tiempo, no se puede realizar a escala y proporciona preparaciones muy contaminadas con protemas celulares.
Kaludov et al. J. Virol. 6884 (2001) divulga que AAV4 y AAV5 requieren la union a acido sialico para la union y transduccion. El documento divulga la purificacion de AAV mediante gradientes de cloruro de cesio convencionales.
Lo que se necesita son procedimientos de purificacion para vectores basados en AAV5 que sean rapidos y se puedan aumentar a escala facilmente para su uso en produccion.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un procedimiento rapido para identificar y purificar de vectores vmcos AAV4 y AAV5 de cultivos y otras soluciones que contienen materiales celulares y otros materiales vmcos.
Por tanto, en un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 10. El procedimiento de la invencion es particularmente muy adecuado para aislar construcciones que contienen protemas de la capside de virus adenoasociados (AAV) serotipo 4 (AAV4) o AAV serotipo 5 (AAV5). El procedimiento implica poner en contacto la solucion que contiene el aAV4 o AAV5 con acido sialico que se ha enlazado a un soporte solido. Por tanto, la construccion que tiene una protema de la capside que tiene un sitio de union para acido sialico se une de forma selectiva a la molecula enlazada a acido sialico.
En un modo de realizacion preferente, el procedimiento de la invencion implica dejar que una mezcla que contiene el AAV contacte con la mucina que se ha enlazado a un soporte solido. Asf, la AAV se une de forma selectiva al soporte enlazado a mucina. A continuacion, el soporte solido se lava para retirar material de la mezcla que esta unida de forma inespedfica al soporte enlazado a mucina.
La invencion se puede utilizar para proporcionar un kit util para separar AAV4 o AAV5 que comprende una columna de cromatograffa de lfquidos o una solucion que contiene un soporte solido que tiene mucina enlazada al mismo.
En otro aspecto, la invencion proporciona un kit util para detectar la presencia de AAV4 o AAV5 en una muestra biologica, de acuerdo con la reivindicacion 15. Dicho kit contiene un soporte solido que tiene una molecula que comprende acido sialico enlazado a la misma y un reactivo que permita la deteccion visual de la union de dicho AAV4 o AAV5 a la molecula.
Todavfa otras caractensticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un procedimiento para aislar y detectar virus que tienen protemas de superficie que se unen de forma espedfica a acido sialico (tales como aAV4 o AAV5) usando mucina fijada a un soporte solido. La retirada de los virus unidos de forma espedfica por elucion o incubacion con una solucion de alta salinidad recupera eficazmente virus altamente activos de pureza mayor que la que se logra mediante la sedimentacion con CsCh. Los virus aislados son altamente infecciosos y mas puros que los aislados usando gradientes de CsCh convencionales. Ademas, esta tecnica es rapida, no requiere equipo especial y se puede aumentar a escala facilmente. Estas son caractensticas importantes para la produccion de virus de alta calidad que se van a usar en la investigacion de transferencia. La invencion proporciona ademas kits utiles para el aislamiento y deteccion de virus usando los procedimientos descritos en el presente documento, que utilizan una columna de afinidad de una sola
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etapa para la purificacion y deteccion de vectores vmcos y, opcionalmente, un sistema marcador visualmente detectable.
Estos y otros aspectos de la invencion se describen en mas detalle en el presente documento.
OBJETIVOS DE PURIFICACION
El procedimiento de la invencion es particularmente muy adecuado la separacion y aislamiento de vectores vmcos que tienen capsides compuestas por protemas de la capside de AAV serotipo 5 o protemas de la capside de AAV serotipo 4. Los inventores han descubierto que estos serotipos de AAV se pueden separar facilmente de los materiales encontrados en los cultivos en los que se producen estos virus por la capacidad de su capsides para unirse de forma espedfica a acido 2,3-sialico. Por el contrario, los otros materiales (por ejemplo, protemas celulares y otras protemas vmcas) encontrados en cultivos de produccion libres de colaborador para AAV no se unen de forma espedfica a acido sialico. De forma similar, el procedimiento de la invencion es util para la separacion y aislamiento de protemas de la capside de AAV4 o AAV5 a partir de cultivos de produccion dependientes de colaborador, ya que los adenovirus, AAV1, y los demas materiales celulares encontrados en dichos cultivos no se unen de forma espedfica a acido sialico.
Ademas, el procedimiento de la invencion tambien se puede aplicar facilmente a la purificacion de cualquier virus encapsidados o envuelto en una protema que contiene sitios de union para acido sialico, o a otros tipos de protemas que contienen sitios de union para acido sialico. Por ejemplo, se entendera facilmente que los vectores vmcos que contienen protemas de la envoltura o de la capside quimericas, por ejemplo, los que contienen porciones de protema de la capside de AAV5 y/o AAV4 que tienen sitios de union a acido sialico, o vectores vmcos seudotipados en una capside de AAV4, AAV5 o quimerica, se pueden detectar, separar y aislar de acuerdo con la invencion. Todavfa se pueden separar, aislar, y/o purificar otros vectores vmcos, protemas quimericas o fragmentos de protemas de acuerdo con la invencion. Teniendo en cuenta la informacion proporcionada en el presente documento, esta claramente dentro de la capacidad de un experto en la tecnica determinar si una protema de la capside u otra protema seleccionada se une de forma espedfica a acido sialico. Por conveniencia a lo largo de la presente memoria descriptiva, estos vectores vmicos (por ejemplo, AAV4 y AAV5) y otras protemas que tienen sitios de union espedficos para acido sialico como se describe en el presente documento, se denominan "objetivos de purificacion".
MOLECULAS QUE CONTIENEN ACIDO SIALICO
Para su uso en la presente invencion, una o mas moleculas de acido sialico se pueden unir directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de un enlazador adecuado) a un soporte solido, como se define en el presente documento. De forma alternativa, se puede encontrar acido sialico en una variedad de moleculas proteinaceas y qrnmicas que se pueden unir (directa o indirectamente) a un soporte solido. Dichas moleculas se pueden obtener a partir de una variedad de procedimientos naturales, sinteticos, recombinantes u otros adecuados.
Un ejemplo de una molecula proteinacea que contiene acido sialico es la mucina. La mucina es una protema de marnffero presente en la saliva, el jugo intestinal y otras secreciones que son altamente ricas en acido sialico. Se conoce una variedad de protemas de mucina y se pueden usar facilmente en los procedimientos y composiciones de la invencion. De forma alternativa, se pueden utilizar facilmente fragmentos de mucinas u otras moleculas que contienen acido sialico. Vease, por ejemplo, Gendler S J, et al. Molecular cloning and expression of human tumor- associated polymorphic epithelial mucin. J. Biol. Chem. 265: 15286 (1990); Siddiqui J, etal., Isolation and sequencing of a cDNa coding for the human DF3 breast carcinoma-associated antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2320 (1988); Ligtenberg M J L, et al., Episialin, a carcinoma-associated mucin, is generated by a polymorphic gene encoding splice variants with alternative amino termini. J. Biol. Chem. 265: 5573 (1990) pancreas; Gum J R, et al. Molecular cloning of cDNAS derived from a novel human intestinal mucin gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 407 (1990); small intestine, Gum J R, et al., Molecular cloning of human intestinal mucin cDNAs. Sequence analysis and evidence for genetic polymorphism. J. Biol. Chem. 264: 6480 (1989); Gum J R, et al., Molecular cloning of cDNAS derived from a novel human intestinal mucin gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 407 (1990); and bronchoepithelial cell mucin, Porchet N, et al., Molecular cloning and chromosomal localization of a novel human tracheo-bronchial mucin CDNA containing tandemly repeated sequences of 48 base pairs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 414 (1991). Se pueden obtener secuencias para mucinas se pueden obtener a partir de una variedad de bases de datos informaticas, incluyendo GenBank y PubMed. Estas y otras mucinas se pueden purificar a partir de fuentes naturales, producir de forma recombinante o generar de forma sintetica.
La smtesis qmmica de mucina, un fragmento rico en acido sialico de la misma, u otros peptidos se conoce bien en la tecnica, tal como la proteccion con TBOC o FMOC de los grupos alfa-amino. (Vease, Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unidad 9). De forma alternativa, tambien se pueden sintetizar peptidos mediante los bien conocidos procedimientos de smtesis de peptidos en fase solida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62).
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De forma alternativa, se puede utilizar una molecula qmmica que contenga uno o mas restos de acido sialico, tal que la molecula qmmica este fijada a un soporte solido. En aun otra alternativa, un soporte solido para su uso en la purificacion se puede modificar qmmicamente o de otro modo para contener un, y preferentemente mas de un, resto de acido sialico. Dichos restos de acido sialico se pueden enlazar directamente al soporte solido, por ejemplo, por un enlace covalente u otro unido adecuado que sustente la union del acido sialico al objetivo de purificacion y la retirada de los materiales unidos de forma inespedfica. De forma alternativa, los restos de acido sialico se pueden enlazar indirectamente al soporte solido, por ejemplo, por un resto que facilite la union de acido sialico al soporte. Dicho resto puede ser una protema, un resto qmmico, u otro enlazador adecuado.
De forma deseable, el soporte solido y/o la molecula que contiene acido sialico contiene acido 2,3-O-sialico y acido 2,3-N-sialico, o mas de uno de cualquiera o ambos restos. Un soporte solido (y/o molecula que contiene acido sialico) contiene uno o mas restos de acido 2,3-O-sialico, es particularmente muy adecuado para su uso cuando el objetivo de purificacion se deriva de AAV4. En todavfa otro modo de realizacion, un soporte solido (y/o molecula que contiene acido sialico) que contiene uno o mas restos de acido 2,3-N-sialico es particularmente muy adecuado para su uso cuando el objetivo de purificacion se deriva de AAV5.
Los procedimientos para fijar los restos de acido sialico y/o las moleculas que contienen acido sialico, directa o indirectamente, al soporte solido son conocidos por los expertos en la tecnica.
Soportes solidos
La mucina, u otra molecula que lleva acido sialico, se enlaza de forma deseable a un soporte solido que se puede usar para la union del objetivo de purificacion (por ejemplo, AAV5). Por conveniencia, se hara referencia a la mucina. Sin embargo, un experto en la tecnica entendera que cualquier otra de las moleculas que llevan acido sialico se puede sustituir en la invencion. En un modo de realizacion particularmente deseable, la mucina esta unida covalentemente al soporte solido. Se conocen procedimientos adecuados en la tecnica, y tambien estan disponibles de los fabricantes de soportes solidos.
Como se usa en el presente documento, el termino "soporte solido" se refiere a cualquier sustancia, incluyendo geles, resinas, perlas, polvos y otros solidos, a la que se puede unir acido sialico o una molecula que contiene acido(s) sialico(s) de modo que la molecula de acido sialico unida al soporte solido sustente la union del acido sialico al objetivo de purificacion y la retirada de los materiales unidos de forma inespedfica. Los ejemplos de soportes solidos adecuados incluyen resinas compuestas por sefarosa, agarosa, agarosa reticulada, agarosa-poliacrilamida mezcladas, o poliacrilema; perlas (incluyendo microperlas); silicio; vidrio; microceldas; microcapsulas; placas de microvaloracion; y biochips. Los soportes utiles incluyen los descritos en la publicacion de patente internacional WO 99/27351, publicada el 3 de junio de 1999; la publicacion de patente internacional WO 99/27140, publicada el 3 de junio de 1999; la patente de Ee. UU. n.°. 6.096.273; la publicacion de patente internacional WO 00/14197, publicada el 16 de marzo de 2000, entre otros.
Se conoce una variedad de microperlas, incluyendo las perlas de aminodextrano descritas en las patentes de EE. UU. n.os 6.074.884; 5.945.293; y 5.658.741. Tambien se pueden emplear partfculas en dispersiones coloidales monodispersas recubiertas de aminodextrano de ferrita magnetica [patente UU. n.° 5.240.640 ]; metal [patente de EE. UU. n.° 5.248.772 ]; poliestireno [patente de EE. UU. n.° 5.466.609; patente de EE. UU. n.° 5.707.877; patente de EE. UU. n.° 5.639.620; patente de EE. UU. n.° 5.776.706 ], y poliestireno-metal [patente de EE. UU. n.° 5.552.086; patente de EE. UU. n.° 5.527.713] como soportes solidos de acuerdo con la presente invencion. Otro tipo de soporte solido puede contener el sustrato recubierto descrito anteriormente con una capa de solido metalico de tamano coloidal superpuesto al recubrimiento de aminodextrano. Se han descrito perlas de poliestireno- aminodextrano recubiertas de oro/plata coloidal, su preparacion, caracterizacion y uso en analisis de subtipos de leucocitos en sangre entera. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.248.772; la patente de EE. Uu. n.° 5.552.086; la patente de EE. UU. n.° 5.945.293; O. Siiman y A. Burshteyn, J. Phys. Chem., 104:9795-9810 (2000); y O. Siiman et al., Cytometry, 41:298-307 (2000). Una alternativa a este sustrato recubierto emplea partfculas de poliestireno con funcionalidad carboxi como el sustrato central, recubiertas con aminodextrano por acoplamiento con EDAC como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.639.620. Estos y otros soportes solidos se conocen bien por los expertos en la tecnica y estan disponibles a partir de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitacion, Amersham Pharmacia (Uppsula, Suecia); Pierce; Biorad (Richmond, VA) y Beckman Coulter, entre otros.
En un modo de realizacion, el soporte solido esta compuesto de sefarosa activada. La sefarosa activada con CNBr se puede adquirir de Amersham Pharmacia. Sin embargo, son conocidas otras fuentes de sefarosa y sefarosa activada, como lo son los procedimientos y compuestos de activacion. Los ejemplos de sefarosa activada adecuada incluyen sefarosa activada con CNBr, carbonildiimidazol, glutaraldelddo, hidroxisuccinimida y cloruro de tosilo.
Los procedimientos para unir el acido sialico, o la molecula que comprende acido sialico (por ejemplo, mucina), al soporte solido se pueden seleccionar de entre los procedimientos conocidos. Dichos procedimientos tambien estan provistos por los fabricantes de los soportes solidos.
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En un modo de realizacion, el soporte solido enlazado a mucina se carga en una columna de afinidad para la separacion, aislamiento y/o purificacion de una protema que contiene sitios de union a acido sialico. En este modo de realizacion, se deja que una muestra que contiene el objetivo de purificacion (por ejemplo, lisado de un cultivo celular de AAV5) fluya a traves de la columna de forma que el objetivo de purificacion se una de forma espedfica al soporte solido enlazado a mucina. A continuacion, la columna se lava para retirar el material unido de forma inespedfica, mientras se retiene el objetivo de purificacion unido de forma espedfica. De forma deseable, el reactivo de lavado es solucion salina, u otro reactivo adecuado, que esta tamponado a pH fisiologico (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato). La columna se somete despues a una etapa de lavado adicional en condiciones que retiran el objetivo de purificacion. De forma adecuada, el reactivo de elucion es una solucion que contiene altas concentraciones de sal. Un ejemplo adecuado, es una solucion salina tamponada con fosfato que contiene NaCl a concentraciones de al menos aproximadamente 0,1 M. Otra solucion adecuada contiene solucion salina tamponada con fosfato y al menos aproximadamente NaCl 0,4 M. Teniendo en cuenta esta informacion, un experto en la tecnica puede seleccionar facilmente una solucion salina alternativa que logre un efecto similar. De forma alternativa, el reactivo de elucion puede ser cualquier reactivo acido adecuado, o sal del mismo, (por ejemplo, un reactivo que tiene un pH bajo en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. Los ejemplos de dichos reactivos incluyen acido acetico (por ejemplo, 1 mM) y sales del mismo tales como acetato de sodio y glicina 0,1 M (pH 3), entre otros, que seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. Despues de la elucion del objetivo de purificacion (por ejemplo, AAV5), el AAV5 se puede someter a concentracion por tecnicas convencionales.
En otro modo de realizacion, el soporte solido enlazado a mucina (o el soporte solido enlazado a otra molecula que contiene acido sialico deseada) se puede incubar con una muestra que contiene el objetivo de purificacion. En dicho modo de realizacion, la muestra puede ser una solucion que contiene el lisado de un cultivo celular en el que se produjo la protema que se va a aislar. De forma alternativa, la muestra puede ser una muestra biologica de un sujeto, o una muestra biologica de un sujeto mezclada con un diluyente adecuado.
Las "muestras biologicas de un sujeto" de la invencion pueden incluir cualquier muestra, incluyendo, entre otros, fluidos, sangre entera, plasma o suero, donde los cuerpos formados son celulas, en particular globulos sangumeos. Dichas muestras se pueden purificar por procedimientos convencionales, tales como separacion por centrifugacion, etc., para la manipulacion de otras muestras de ese tipo. Estas "muestras biologicas de un sujeto" se pueden mezclar con compuestos de marcado y/o mezclar opcionalmente con tampones o diluyentes a fin de ajustar la concentracion de la muestra, o preparar de otro modo la muestra para analisis. En aun otra alternativa, la muestra biologica puede ser una muestra de tejido, y el soporte solido enlazado a mucina se puede mezclar con un tampon adecuado u otro diluyente para la incubacion con la muestra de tejido.
KITS DE DIAGNOSTICO Y PURIFICACION
En otro modo de realizacion, la invencion proporciona un kit util para separar el objetivo de purificacion. Este kit esta particularmente bien adaptado para su uso en la produccion de vectores vmcos (por ejemplo, AAV4 o AAV5).
Tfpicamente, dicho kit contiene un soporte solido que tiene acido sialico o una molecula que contiene acido sialico enlazado al mismo. Dichos soportes solidos se pueden seleccionar de entre los descritos anteriormente. En un modo de realizacion deseable, el soporte solido es una perla o gel para la incubacion con la muestra. En otro modo de realizacion deseable, el soporte solido se carga en una columna de afinidad (por ejemplo, una columna de cromatograffa de lfquidos), y la muestra se pasa a traves de la columna.
Ademas, un kit de la invencion tambien puede contener los reactivos deseados, incluyendo reactivos de lavado, reactivos de elucion y reactivos de concentracion. Estos reactivos se pueden seleccionar facilmente de entre los reactivos descritos en el presente documento y de entre reactivos de concentracion convencionales. En un modo de realizacion deseable, el reactivo de lavado es una solucion salina isotonica que se ha tamponado a pH fisiologico, tal como solucion salina tamponada con fosfato (PBS); el reactivo de elucion es PBS que contiene NaCl 0,4 M, y dispositivos y reactivos de concentracion. Por ejemplo, un experto en la tecnica reconocera que pueden ser utiles reactivos, tales como polietilenglicol (PEG), o NH4SO4, o los dispositivos, tales como dispositivos de filtracion. Por ejemplo, un dispositivo de filtracion con una membrana de 100 K concentrana rAAV.
Estos kits ademas pueden contener los reactivos necesarios para mantener o preservar las muestras. De forma mas importante, el kit contiene instrucciones para realizar el ensayo competitivo y preparar los controles. Tambien se pueden proporcionar en un kit diluyentes y tampones adecuados para las muestras, graficas indicadoras para las comparaciones de senales, guantes desechables, instrucciones de descontaminacion, tiras o envases de aplicadores y recipientes de preparacion de muestras. Los kits tambien contienen preferentemente medios o sustancias tampon necesarios, segun se requiera. Un experto en la tecnica podna montar cualquier numero de kits con la informacion y componentes necesarios para realizar el procedimiento en un paciente para cualquier receptor espedfico y celula objetivo, y comparar los resultados con los patrones para ese sitio de union.
En todavfa otro modo de realizacion, la invencion proporciona un kit util para detectar la presencia del objetivo de purificacion (por ejemplo, AAV2/5) en una muestra. Ademas de los componentes descritos anteriormente, un kit de este tipo tambien puede contener un reactivo marcador que permita la deteccion visual de la union del objetivo de
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purificacion a la molecula. Este kit esta particularmente bien adaptado para la deteccion del objetivo de purificacion en una muestra biologica de un sujeto, por ejemplo, la sangre. Este tipo de kit, ademas de contener el soporte enlazado a acido sialico y reactivos descritos anteriormente, ademas puede incluir marcadores que sean visualmente detectables.
El termino “marcadores” en general se refiere a moleculas, preferentemente moleculas proteinaceas, pero tambien a pequenas moleculas qmmicas, preferentemente las que sean visualmente detectables. En un ejemplo, estos marcadores posibilitan la deteccion emitiendo una senal detectable de una longitud de onda particular al ser excitados por un laser. Las ficobiliproteinas, los tintes en tandem, determinadas protemas fluorescentes, pequenas moleculas qmmicas y determinadas moleculas detectables por otros medios pueden considerarse en su totalidad marcadores para estos analisis. Veanse, por ejemplo, los marcadores enumerados en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6.° ed., R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996).
Los ejemplos de ficobiliproteinas utiles en la presente invencion son ficocianina, aloficocianina (APC), aloficocianina B, ficoeritrina (PE) y preferentemente R-ficoeritrina. La PE esta entre los colorantes fluorescentes mas brillantes disponibles en la actualidad. Se ha usado PE conjugada a un anticuerpo para detectar interleucina-4 en un ensayo de placas fluorescentes y en M.C. Custer y M.T. Lotze, J. Immunol. Met., 128, 109-117 (1990), y se descubrio que fue el unico fluoroforo sometido a prueba que produda una senal adecuada. Los tintes en tandem son moleculas no naturales que pueden estar formadas por una ficobiliprotema y otro tinte. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.542.104 y la patente de EE. UU. n.° 5.272.257. Los ejemplos de tintes en tandem utiles en la presente invencion son ficoeritrocianina o PC5 (PE-Cy5, ficoeritrina-cianina 5.1; excitacion: 486-580 nm, emision: 660-680 nm) [ A.S. Waggoner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 677:185-193 (1993) y la patente de EE. UU. n.° 5.171.846 ] y ECD (ficoeritrina-rojo texas; excitacion, 486-575 nm, emision, 610-635 nm) [patente de EE. UU. n.° 4.542.104 y patente de EE. UU. n.° 5.272.257]. Otros tintes en tandem conocidos son PE-Cy7, APC-Cy5, y APC-Cy7 [M. Roederer et al., Cytometry, 24:191-197 (1996)]. Los tintes en tandem, PC5 y ECD, se han conjugado directamente satisfactoriamente con anticuerpos monoclonales por varios procedimientos que implican la activacion con iminotiolano del tinte. Todavfa otros marcadores que se pueden conjugar directamente con un ligando y usar con las ficobiliproteinas o tintes en tandem en la presente invencion para anadir numeros adicionales de marcadores (ligandos marcados) al procedimiento incluyen moleculas pequenas que al ser excitadas emiten longitudes de onda de menos de 550 nm. Dichas moleculas no se superponen con las emisiones de las ficobiliprotemas. Un ejemplo de dicho marcador es isotiocianato de fluorescema (FlTC). Otros se enumeran en el Handbook citado anteriormente. Todavfa otros marcadores que se pueden emplear en este procedimiento para proporcionar colores adicionales son las protemas conocidas como protemas verdes fluorescentes y protemas azules fluorescentes; tambien pueden ser utiles los marcadores que emiten al ser excitados por luz ultravioleta. Las biliprotemas y los tintes en tandem estan comercialmente disponibles a partir de de diversas fuentes como Coulter International Corporation, Miami, FL, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR y Prozyme, Inc., San Leandro, CA. Los demas marcadores o etiquetas que se analizan anteriormente se pueden obtener comercialmente a partir de fuentes conocidas.
Los procedimientos para utilizar estos marcadores seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica, y pueden implicar incubar la muestra en presencia de un marcador antes de ponerla en contacto con el soporte solido enlazado a acido sialico. De forma alternativa, el marcador puede estar unido al soporte solido. En aun otra alternativa, el marcador se puede incubar en el eluato que contiene el objetivo de purificacion seguido de la etapa de lavado que retira el objetivo de purificacion unido de forma espedfica del soporte solido. La seleccion del marcador y el sistema de deteccion no son una limitacion de la presente invencion.
Los kits provistos por la presente invencion son utiles para realizar los procedimientos descritos en el presente documento.
Se proporcionan los ejemplos siguientes para ilustrar la invencion y no limitan el alcance de la misma.
Ejemplo 1 - Produccion de matriz para la purificacion de vectores
Para producir una matriz para la purificacion por afinidad de vectores con una capside de AAV5, se acoplo mucina a sefarosa activada con CNBr.
En resumen, se acoplaron 120 mg de mucina tipo I-S (Sigma, St. Louis, MI) a 3,5 g de sefarosa activada con CNBr (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La resina (3,5 mg de polvo liofilizado + 120 mg de mucina) se relleno en una columna de cromatograffa de lfquidos de 2,5 cm de diametro (Sigma) y se lavo con 24 ml de PBS, pH 7,4 (Life Technologies, Grand Island, NY).
Se produjo AAV2/5 recombinante por transfeccion en 293 celulas de plasmidos que codificaban la repeticion de AAV serotipo 2 y caperuza de serotipo 5 y las funciones de colaborador Ad como se describe (A. Auricchio, et al., Hum Gene Ther, 12:71-76 (2001)). Las celulas de placas de 50 x 150 mm se recogieron, resuspendieron en 2,5 ml de DMEM libre de suero/placa y se lisaron mediante dos tandas de congelacion y descongelacion. El vector vmco resultante contiene las repeticiones terminales invertidas de AAV2 que flanquean el gen que indicado en la tabla 1 (p-galactosidasa o la protema verde fluorescente potenciada (EGFP)) y otros elementos vectoriales, en una protema
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de la capside de AAV serotipo 5. Antes de la aplicacion sobre la columna de afinidad, el lisado que contema el vector AAV2/5 se trato como se describe para AAV2 (Auricchio, et al. citado anteriormente).
El lisado filtrado se dejo fluir a traves de la columna a una velocidad de Igota/segundo, seguido de 2 lavados de PBS (20 ml) y elucion con PBS + NaCl 0,4 M (15 ml). El eluato se concentro hasta 2-3 ml a traves de un dispositivo con filtro Millipore, se lavo una vez con 15 ml de PBS y se reconcentro hasta un volumen final de 2-3 ml con tampon de intercambio.
La caracterizacion de las preparaciones del vector AAV2/5 incluyo valores ffsicos (copias de genoma), valores de transduccion despues de infecciones con diluciones limitantes de 293 celulas y ensayos de foco infeccioso (Tabla I). Las copias de genoma se determinaron mediante PCR en tiempo real como se describe (G. Gao, et al., Hum Gene Ther, 11:2079-2091 (2000)). Se midieron las unidades infecciosas tras la infeccion con diluciones limitantes de una lmea celular que expresaba la repeticion-caperuza en presencia de adenovirus como se describe (G. Gao, et al., citado anteriormente).
Tabla I.
Comparacion de rendimientos e infectividad de AAV2/5purificados mediante gradientes de CsC2 frente a columna de afinidad.
N.° Purif. CG/ml Rendimiento UT/ml CG/ UI
CMV.lacZ
AA116 CsCl2 5,2 x 1012 1,56 x 1013 3,8 x 107 288
CMV.lacZ
AA115 columna 1,8 x 1012 8,1 x 1012 2,1 x 107 180
CMV.lacZ
AA109 columna 6 x 1011 2,4 x 1013 1 x 107 300
CMV.EGF
AA72 CsCl2 1,3 x 1012 1,95 x 1012 2 x 107 928
CMV.EGF
AA131 columna 5,6 x 1012 2,52 x 1013 2,2 x 107 1600
CMV.EGF
AA 139 columna 3,8 x 1012 2 x 1013 4 x 107 1055
CMV.EGF
AA144 columna 3,2 x 1012 9,6 x 1012 3,8 x 107 547
NB. CG: copias de genoma; UT: unidades de transduccion; UI: unidades infecciosas; CMV: promotor de citomegalovirus; EGFP: protema verde fluorescente mejorada.
Ejemplo 2 - Capacidad de la invencion para diferenciar entre AAV2/5 y AAV2
Para someter a prueba la hipotesis de que la mucina se podna unir eficazmente a vectores que portan una capside de AAV5, se preabsorbieron parffculas de AAV2/5 o AAV2 con mucina soluble y despues se sometieron a prueba para determinar su infectividad en las celulas objetivo como sigue.
Se incubaron (o no) 1x1010 copias de genoma (CG) de bien AAV2/5- o AAV2-CMV-EGFP durante una hora a 37 °C con 20 mg de mucina/ml en medio Eagle modificado por Dulbecco antes de la infeccion de 293 celulas. Cuarenta y ocho horas mas tarde se evaluaron las celulas transducidas bajo microscopio de fluorescencia usando un filtro triple (que permite visualizar DAPI-FITC y rodamina).
Se observo que la mucina inhibio la transduccion de 293 celulas por AAV2/5 pero no por AAV2, lo que indicaba que el componente de acido sialico de esta protema fue podfa bloquear los sitios de union de la capside de AAV5. Por tanto, la invencion proporciona un procedimiento para separar facilmente AAV5 de AAV2 y otros materiales vfficos proteinaceos y celulares que carecen de la capacidad de unirse a acido sialico.
Ejemplo 3 - Comparacion in vitro de vectores AAV2/5 aislados mediante columna de mucina de la invencion frente al procedimiento de la tecnica anterior
Las caractensticas de rendimiento, transduccion, eficacia e infectividad evaluadas in vitro son comparables entre los vectores AAV2/5 purificados usando sedimentacion con CsCh y la columna de mucina de la invencion.
Las preparaciones AA115 y 116 se produjeron a partir de un lisado de celulas que conteman un vector comun y se dividieron en dos fracciones iguales. Los vectores AAV2/5-CMV-lacZ bien se purificaron por purificacion de AAV2/5 por CsCl2 (AA116) o columna de mucina (AA115) para evaluar su capacidad de infectar epitelios humanos diferenciados de las vfas respiratorias de la zona apical. Una semana despues de la transduccion, los vectores se purificaron por gradientes ffsicos o la columna de mucina de la invencion, y se realizo una tincion con X-gal.
La pureza de los AAV2/5 purificados mediante la columna de mucina de acuerdo con la invencion se comparo con la de los obtenidos por CsCl2 usando gel de poliacrilamida-SDS (4-12% de SDS PAGE) seguido por tincion con azul
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Comassie para visualizar las protemas. Las unicas bandas detectadas en las preparaciones purificadas mediante columna representan las protemas de la capside VP 1, 2 y 3 al contrario de lo que se observo en las preparaciones purificadas con CsCl2 que conteman varias protemas contaminantes. El numero de unidades formadoras de azul (es decir, celulas que expresan X-gal, ufa) fue similar entre el vector purificado mediante CsCl2- (54,6 ufa/1x1010 CG) y mediante columna (58 ufa/1x1010 CG).
Ejemplo 4 - Comparacion in vivo de vectores aislados mediante columna de mucina de la Invencion frente al procedimiento de la tecnica anterior
Se evaluaron la infectividad de los vectores de AAV2/5 purificados mediante CsCl2 (prep. AA116) y mucina (AA115) in vivo despues de la inyeccion en musculos esqueleticos como sigue y se cuantifico la expresion de lacZ por ELISA de los homogeneizados o por tincion con X- gal de cortes histologicos.
A ratones macho C57B1/6 de seis semanas de edad se inyectaron en el tibial anterior de ambas patas 1 x 1011 CG de AAV2-CMV-lacZ bien purificadas por columna de mucina o gradientes de CsCl2. Veintiun dfas despues de la administracion de los vectores, se extirparon los musculos derechos, se cortaron y se tineron con X-gal.
Se confirmo la similitud en intensidad y numero de celulas musculares (3-gal positivas a las que se administro CsCl2 y los vectores purificados mediante columna de mucina de acuerdo con la invencion mediante cuantificacion por ELISA de la p-galactosidasa (CsCh: N = 5, 113 ± 13 ng/ml; columna de mucina: N = 5, 183 ± 123 ng/ml).
Esto indica que el procedimiento de purificacion de la invencion no tiene un impacto negativo en la infectividad de las construcciones vmicas purificadas con el mismo.
Aunque la invencion se ha descrito con referencia a un modo de realizacion particularmente preferente, se entendera que se pueden realizar modificaciones. Tambien se pretende que dichas modificaciones entren dentro del ambito de las reivindicaciones adjuntas.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para aislar un objetivo de purificacion que comprende una protema que se une de forma espedfica a acido sialico, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de:
    dejar que el objetivo de purificacion entre en contacto con una molecula que comprende acido sialico que se ha enlazado a un soporte solido, por el que el objetivo de purificacion que tiene un sitio de union para acido sialico se une de forma selectiva por la molecula, en el que el objetivo de purificacion comprende una protema de la capside seleccionada del grupo que consiste en una protema de la capside de AAV serotipo 4, una protema de la capside de AAV serotipo 5 y una capside que comprende un fragmento de una capside de AAV4 o aAV5 que contiene el sitio de union para acido sialico.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la molecula que comprende acido sialico es mucina.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el soporte solido se selecciona del grupo que consiste en sefarosa, agarosa y una resina de poliacrilamida.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que el soporte solido es sefarosa activada con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en CNBr, carbonildiimidazol, glutaraldelddo, hidroxisuccinimida y cloruro de tosilo.
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el objetivo de purificacion y el soporte solido enlazado a la molecula se ponen en contacto incubando una solucion que comprende el AAV y los materiales celulares y el soporte.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el soporte solido se rellena en una columna de cromatograffa de lfquidos.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas la etapa de lavar el soporte solido para retirar el material de la mezcla que esta unido de forma inespedfica al soporte enlazado a la molecula.
  8. 8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas la etapa de separar el objetivo de purificacion del soporte solido.
  9. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende ademas la etapa de concentrar el objetivo de purificacion separado.
  10. 10. Un procedimiento para aislar un vector vmco a partir de una mezcla, comprendiendo dicho vector vmco una protema de la capside seleccionada del grupo que consiste en una protema de la capside de AAV serotipo 4, una protema de la capside de AAV serotipo 5, y una capside que comprende un fragmento de una capside de AAV4 o AAV5 que contiene el sitio de union para el acido sialico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    a) dejar que una mezcla que contiene dicho vector vmco entre en contacto con mucina que se ha enlazado a un soporte solido, con lo que el virus se une de forma selectiva por el soporte enlazado a mucina, y
    b) lavar el soporte solido para retirar el material de la mezcla que se une de forma inespedfica al soporte enlazado a mucina.
  11. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, que comprende ademas, despues de la etapa de lavado (b), la etapa de separar el vector vmco del soporte solido.
  12. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la separacion se realiza mediante una etapa de lavado adicional usando una solucion salina concentrada.
  13. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que la solucion salina concentrada es solucion salina tamponada con fosfato y cloruro de sodio 0,4 M.
  14. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, que comprende ademas la etapa de concentrar el vector vmco separado.
  15. 15. Un kit util para detectar un objetivo de purificacion en una mezcla, comprendiendo dicho kit un acido sialico enlazado a un soporte solido y un reactivo que permita la deteccion visual de la union del objetivo de purificacion, en el que el objetivo de purificacion comprende una protema seleccionada del grupo que consiste en una protema de la
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    capside de AAV serotipo 4, una protema de la capside de AAV serotipo 5, o un fragmento de una protema de la capside de AAV4 o AAV5 que tiene un sitio de union para el acido sialico.
  16. 16. El kit de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el soporte solido es agarosa activada con mucina enlazada al mismo.
  17. 17. El kit de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el soporte solido se carga en una columna de afinidad.
  18. 18. El kit de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que la columna de afinidad es una columna de cromatograffa de lfquidos.
  19. 19. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el kit comprende ademas reactivos de lavado, elucion y concentracion.
  20. 20. Un procedimiento de deteccion en una muestra la presencia de un virus con una protema de superficie seleccionada de una protema de la capside de un virus adenoasociado (AAV) serotipo 4 o una protema de la capside de AAV serotipo 5, o un fragmento de las mismas que tiene un sitio de union para acido sialico, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de utilizar el kit de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 en una muestra para detectar visualmente la union del virus.
  21. 21. Una composicion util en la union de un objetivo de purificacion de una mezcla que comprende al menos un resto de acido 2-3,O-sialico y al menos un resto de acido 2,2-N-sialico enlazado a un soporte solido.
  22. 22. Un procedimiento de union de un vector vmco adenoasociado (AAV) que tiene una protema de AAV serotipo 4 o una protema de la capside de AAV serotipo 5 de un cultivo, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de incubar la composicion de la reivindicacion 21 en lisado o medio de cultivo.
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