ES2320970T3

ES2320970T3 - Procedimiento para disminuir la antigenicidad de la proteina estructural de virus adeno-asociado.

Info

Publication number: ES2320970T3
Application number: ES00954493T
Authority: ES
Inventors: Michael Hallek; Anne Girod; Martin Ried
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2009-06-01
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: WO2001005990A1; US20090253897A1; EP1198581A1; CA2379220C; US7556965B2; AU6693100A; EP2060634A1; JP4842471B2; CA2379220A1; DE19933288A1; AU781397B2; ATE420192T1; DE50015518D1; US7252997B1; US20080064081A1; US7968340B2; EP1198581B1; JP2003505032A

Abstract

Procedimiento para disminuir la antigenicidad de la proteína estructural de virus adeno-asociado (AAV) frente a la del tipo natural, caracterizado porque la proteína estructural se modifica por medio de, al menos, de una inserción, que está localizada por delante y/o por detrás de, al menos, un aminoácido en la secuencia, elegida entre YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT o NVDFT VDTNG de VP3, y además la proteína estructural, mutada de este modo, sigue siendo capaz de formar partículas.

Description

Procedimiento para disminuir la antigenicidad de la proteína estructural de virus adeno-asociado.

La presente invención se refiere a un procedimiento para disminuir la antigenicidad de la proteína estructural de virus adeno-asociado (AAV) con respecto a la del tipo natural, en el cual la proteína estructural contiene, al menos, una inserción y es capaz de formar partículas.

El virus AAV pertenece a la familia de los parvovirus. Éstos se caracterizan por una cápside icosaédrica, no recubierta, con un diámetro comprendido entre 18 y 30 nm, que contiene un ADN lineal, monocatenario, de aproximadamente 5 kb. Para una multiplicación eficiente del AAV se requiere una coinfección de la célula huésped con virus auxiliares, por ejemplo con adenovirus, con herpes virus o con virus vacinales. En ausencia de un virus auxiliar el AAV pasa a un estado latente, siendo capaz el genoma vírico de integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped. La propiedad del AAV para integrarse en el genoma huésped hace que este virus sea espacialmente interesante como vector de transducción para las células de los animales mamíferos. Para las funciones de vector son suficientes, en general, las dos secuencias recurrentes terminales invertidas con una longitud de 145 bp aproximadamente (ITR: "Inverted Terminal Repeats"). Estas secuencias portan las necesarias señales "cis" para la replicación, el empaquetamiento y la integración en el genoma de la célula huésped. Para el empaquetamiento en partículas vectores recombinantes se lleva a cabo una transfección en un plásmido auxiliar, que porte los genes para proteínas no estructurales (proteínas Rep) y para proteínas estructurales (proteínas Cap), en células adecuadas para el empaquetamiento, por ejemplo células HeLa o células 293, que han sido infectadas con esta finalidad, por ejemplo, con adenovirus. Al cabo de algunos días se obtiene un lisado, que contiene partículas de AAV recombinantes. Los plásmidos auxiliares adecuados están descritos, por ejemplo, en la publicación Chiorini et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541 o en la publicación Girod et al. (1999), Nat. Med.

La cápside de AAV está constituida por tres proteínas diferentes: la VP1, la VP2 y la VP3, cuyas proporciones relativas son de un 5% para la VP1, de un 5% para la VP2 y de un 90% para la VP3. Los genes de la cápside de AAV están localizados sobre el extremo derecho del genoma de AAV y son codificados por secuencias solapantes del mismo marco de lectura abierto (ORF) por medio del empleo de diversos codones de iniciación así como por dos variantes empalmadas de manera diferente de un transcrito. El gen de la VP1 contiene la secuencia génica completa de la VP2, que contiene, a su vez, la secuencia génica completa de la VP3 con una región N-terminal específica. El hecho de que los marcos de lectura solapantes codifiquen las tres proteínas de la cápside de AAV es responsable de la expresión obligatoria de todas las proteínas de la cápside, aún cuando esto se haga en proporciones diferentes.

Las masas moleculares de las proteínas de la cápside son 87 kD para VP1, 73 kD para VP2 y 62 kD para VP3. Las secuencias de los genes de la cápside están descritas, por ejemplo, en las publicaciones de Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro. Immunol., 158, 97-129, de Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 6922-6930 o en la publicación de Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319. El mapa físico y genético del genoma de AAV está descrito, por ejemplo, en la publicación de Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy, 5, 793-801.

Por otra parte, se conocen diversos serotipos de AAV, siendo el que ha sido mejor investigado el serotipo 2 de AAV humano (AAV2). En estos análisis se observa que los virus AAV tienen, a manera de vectores virales, ventajosas propiedades para la terapia génica somática. Las ventajas esenciales consisten en la ausencia de patogenicidad para los seres humanos, en la integración estable del ADN viral en el genoma celular, en la capacidad para infectar células no divisibles, en la estabilidad del virión, lo cual posibilita la purificación hasta títulos elevados (desde 10^{13} hasta 10^{14} partículas por ml), en la inmunogenicidad relativamente baja, así como en la ausencia de genes virales y de productos génicos en el vector de AAV recombinante, lo cual es ventajoso bajos aspectos de seguridad para el empleo en la terapia génica. La clonación de genes en el vector de AAV se lleva a cabo, en la actualidad, según los métodos, que son conocidos, en general, por el técnico en la materia, como los que han sido descritos, por ejemplo, en la publicación WO 95/23 867, en la publicación de Chiorini, J. A. et al. (1995), Human Gene Therapy, 6, 1531-1541 o en la publicación de Kotin, R. M. (1994), supra.

El empleo de vectores virales lineales en la terapia génica depende, en gran medida, de la antigenicidad del sistema empleado puesto que, una elevada antigenicidad va acompañada, así mismo, por una respuesta inmune reforzada, que podría interferir con el éxito de la terapia. Por lo tanto, la antigenicidad del virus AAV tiene un significado decisivo, también, para su aplicabilidad en la terapia. Se entiende por el término antígeno aquellos productos, que desencadenan una respuesta inmune específica tras la introducción en el organismo de los seres humanos y de los animales. Esto se pone de manifiesto bien por medio de la formación de anticuerpos (respuesta inmune humoral) y del desarrollo de una inmunidad inducida por vía celular (respuesta inmune celular) o bien por medio de en una tolerancia inmunológica específica. La condición previa para una respuesta inmune (para la inmunogenicidad del antígeno) consiste, en general, en que el antígeno sea reconocido como exógeno por parte del organismo, que tenga un peso molecular (MW) > 1 kDa y que pertenezca a la clase de substancias correspondiente a las proteínas o a los polisacáridos, en ocasiones más raras a los ácidos desoxirribonucléicos o a los lípidos. Las estructuras más complejas tales como, por ejemplo, las bacterias, los virus o los eritrocitos (antígenos de partículas) son, en general, antígenos aún más activos, por lo tanto tienen una antigenicidad elevada. Así pues, se entiende por antigenicidad, en el sentido de esta invención, la capacidad de integrarse con (de ser reconocido por) el sistema inmune (humoral y celular) mediante enlace. En este caso, el término abarca también la inmunogenicidad, es decir también la capacidad de desencadenar una respuesta inmune. Precisamente, en el caso de los virus, pueden ser determinados en principio, en este caso, estructuras antígenas para el enlace de los anticuerpos no solamente por medio de la estructura primaria sino, también, por medio de la estructura secundaria, de la estructura terciaria o de la estructura cuaternaria de la proteína de la cápside o bien de la cápside.

Los autores Chapman M. S. y Rossmann M. G. (1993), Virology, 194, 491-508 pudieron identificar los determinantes antígenos más importantes de la cápside de CPV mediante la comparación de las secuencias con diversos parvovirus, a partir de la cual se predijeron las diferencias antígenas entre la proteínas de la cápside. De conformidad con esta investigación, la antigenicidad de la proteína de la cápside de CPV está enlazada, en principio, sobre el lazo externo expuesto con elevada variabilidad de la secuencia. Por el contrario, no existen todavía investigaciones de este tipo para la cápside del virus de AAV. Únicamente la publicación WO 96/00587 describe proteínas de fusión de la cápside de AAV, en las cuales se ha introducido, por ejemplo, en el ADN que codifica una proteína de la cápside, el ADN que codifica el antígeno relevante desde el punto de vista clínico, sin que esto interfiera con la formación de la cápside, y se expresa el constructo en forma de proteína de fusión de la cápside de AAV. Los antígenos relevantes desde el punto de vista clínico son los epitopos, que proceden, por ejemplo, de bacterias (por ejemplo salmonela), de virus (por ejemplo de HIV-env) o de células tumorales. Las proteínas de fusión de la cápside de AAV formadas desencadenarían una respuesta inmune, es decir que se encargarían de producir una antigenicidad acrecentada de los virus de AAV. La publicación WO/9738723 divulga la transferencia específica de un AAV, cuya proteína estructural ha sido modificada por medio de una secuencia diana.

En el estado de la técnica no ha sido tratada una antigenicidad disminuida del AAV. Para la aplicación práctica de los vectores de AAV - precisamente en la terapia génica - es ventajosa precisamente una antigenicidad disminuida en comparación con la del tipo natural o en comparación con la de los vectores de AAV, derivados del tipo natural. Dado que el AAV de tipo natural tiene, así mismo, determinantes absolutamente antígenos. De este modo, existen individuos anti-AAV2 Ig positivos, en los cuales es obligatoriamente difícil, hasta incluso imposible, una terapia con vectores de AAV de una antigenicidad de tipo natural. De igual modo, un paciente podría desarrollar una respuesta inmune humoral y/o celular cada vez mayor contra los vectores de AAV empleados en el caso de una terapia repetitiva con vectores de AAV. Una inmunización de este tipo reduciría, o incluso impediría, el éxito de una terapia. Por lo tanto, cuanto menor sea la antigenicidad de un virus de AAV recombinante o cuanto más se diferencie su antigenicidad de la de un virus de tipo natural o de la de un virus de AAV recombinante, que haya sido utilizado precedentemente, tanto más prometedor se presenta el éxito de su empleo terapéutico.

Por lo tanto, la tarea de la presente invención consistía en reducir la antigenicidad del virus de AAV, especialmente de una proteína estructural, frente a la del tipo natural. De manera especial, deberían desarrollarse vectores de AAV por medio de modificación, que posibilitasen una transferencia génica específica y eficiente, pero que se opusiesen de mejor manera, o por completo, a la respuesta inmune. Por lo tanto, la modificación debería llevarse a cabo, preferentemente, de tal manera que, al mismo tiempo, no se redujese, de manera esencial, el carácter infeccioso del virus o que, al menos, se mantuviese.

De manera sorprendente, se ha encontrado ahora que las proteínas estructurales o bien que las proteínas de la cápside de AAV pueden ser modificadas de tal manera, que se provoca, de este modo, una disminución de la antigenicidad, sin que tampoco se reduzca esencialmente el carácter infeccioso, manteniéndose éste al menos.

Un objeto de la presente invención consiste, por lo tanto, en un procedimiento para la disminución de la antigenicidad de la proteína estructural de virus adeno-asociado (AAV) con respecto a la del tipo natural, modificándose la proteína estructural por medio de, al menos, una inserción, que está localizada por delante y/o por detrás de, al menos, un aminoácido en la secuencia elegida entre YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT o NVDFT VDTNG de la VP3, y, además, la proteína estructural, mutada de este modo, sigue siendo capaz de formar partículas.

En el sentido de la invención y de las definiciones precedentes se entiende por la disminución de la antigenicidad, la disminución de la formación de anticuerpos y/o del enlace con anticuerpos por medio de la modificación, de la eliminación o del aporte de determinadas secuencias o epitopos o por medio de una combinación de estas medidas, especialmente de determinados epitopos y secuencias, que están presentes en el tipo natural. Por medio de una antigenicidad disminuida se reduce, por ejemplo, una inmunización de un organismo por medio de una terapia con un vector de AAV. En este caso, se considera también, en el sentido de esta invención, como disminuida una antigenicidad simplemente modificada, visto desde el punto de vista absoluto, es decir en promedio de la intensidad de la respuesta inmune, cuando no se desencadene con la proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, una respuesta a los anticuerpos -(inmune-), que se desencadenaría con el tipo natural. Una antigenicidad de este tipo, simplemente modificada, visto desde el punto de vista absoluto, puede conducir a una menor inmunización cuando se utilicen, en terapias sucesivas, vectores de AAV, preparados de conformidad con la invención, con antigenicidad variable. La antigenicidad modificada puede referirse en este caso tanto a la respuesta inmune humoral así como, también, a la respuesta inmune celular.

La antigenicidad disminuida puede demostrarse para la respuesta inmune humoral, por ejemplo, debido a que un anticuerpo, que puede enlazarse sobre la proteína de la cápside de AAV no modificada (de tipo natural) o sobre la cápside de AAV, ya no reconoce, o reconoce de una manera esencialmente peor, a la proteína de la cápside de AAV, modificada de conformidad con la invención, o a la cápside de AAV. Estas demostraciones pueden llevarse a cabo por medio de procedimientos normalizados como el enzimoinmunoanálisis de absorción (Enzyme linked Immuno-absorbent Assay (ELISA)). Un anticuerpo adecuado es, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal A20 (véase la publicación de Wistuba, A. et al. (1997) J. Virol., 71, 1341-52), que reconoce de manera específica sólo la cápside de AAV2 del tipo natural, completamente ensamblada, pero que, sin embargo, no reconoce a ninguna de las proteínas libres de la cápside.

Para la respuesta inmune celular puede llevarse a cabo una demostración de la antigenicidad modificada puesto que las inmunocélulas específicas de AAV no son estimuladas por las células que presentan antígeno, que han sido infectadas con partículas constituidas por proteínas estructurales modificadas, de una manera tan intensa como lo hacen las células que presentan antígenos, que han sido infectadas con partículas constituidas por proteínas estructurales originales. Este procedimiento se lleva a cabo en analogía con los procedimientos para los virus vacinales y para los adenovirus (Tarpey, I. et al., (1994), Immunology, 81, 222-7; Nimako, M. et al., (1997), Cancer Res. 57, 4855-61). La estimulación de las inmunocélulas puede medirse cuantitativamente, por ejemplo, por medio de un ensayo de citocina (capítulos 6.2 hasta 6.24 en la publicación Current Protocols in Immunology (1999), editada por Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons).

Es especialmente preferente que la inserción en la proteína estructural no provoque una disminución esencial de la carácter infeccioso del virus, o bien que el carácter infeccioso se mantenga al menos. Se entiende por carácter infeccioso, en el sentido de esta invención, la capacidad para transducir células.

Por otra parte, la proteína estructural, preparada de este modo, es capaz también, de manera preferente, de formar partículas, es decir de formar una cápside icosaédrica, especialmente en forma de una cápside de AAV, puesto que las partículas o bien las cápsides son especialmente adecuadas como portadores de los compuestos elegidos, por ejemplo para los vectores de transducción AAVr. La formación de partículas puede demostrarse, por ejemplo, por medio de la microscopia electrónica. Otra demostración consiste en el comportamiento a la sedimentación durante una centrifugación con gradiente de densidad con cloruro de cesio con subsiguiente demostración, opcional, del ADN viral contenido en las partículas.

En general, la modificación puede encontrarse en la proteína estructural VP1, en la proteína estructural VP2 y/o en la proteína estructural VP3, siendo preferente la proteína estructura VP1 y/o la proteína estructural VP3. Por otra parte, la proteína estructural puede derivarse de todos los serotipos de AAV, especialmente de los serotipos humanos, de manera preferente de AAV1, de AAV2, de AAV3, de AAV4 de AAV5 y/o de AAV6, ante todo de AAV2, AAV3 y/o de AAV6.

De manera preferente, la/las modificaciones están localizadas sobre la superficie del virus. Para la determinación de las regiones de la proteína estructural, localizadas en la superficie, se ha encontrado, de manera sorprendente, que son comparables el CPV (Canine Parvovirus) y las secuencias y las estructuras de AAV2. Por lo tanto, puede recurrirse de manera preferente a las conocidas estructuras cristalinas de los parvovirus como las del parvovirus B19 o del CPV y a la identificación de los dominios proteicos, con ayuda de la comparación de la homología, cuyos dominios están localizados sobre la superficie del virus. De manera ejemplificativa, una comparación realizada con ayuda de un ordenador entre CPV y AAV2 o bien entre el parvovirus B19 y AAV2, conduce de una manera sorprendentemente reproducible, a la identificación de los lazos (loops) en VP3, cuya secuencia varía, es decir que tienen una pequeña homología y que están localizados supuestamente sobre la superficie del virus. Puesto que los antígenos tienen que ser accesibles a los anticuerpos para respuesta inmune humoral y, por lo tanto, tienen que encontrarse sobre la superficie del virus, estos lazos representan candidatos preferentes para las modificaciones. De este modo, se tomó como muestra la conocida estructura cristalina de la proteína de la cápside de CPV VP2 (por ejemplo Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu y Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244; Tsao J. et al. (1991) Science, 251, 1456-1464) debido a su elevada similitud con AAV2 VP3 en la estructura secundaria de la proteína, con el objeto de encontrar aquellas regiones que estén expuestas sobre la superficie de la cápside viral y que sean suficientemente flexibles, debido a la secuencia local de aminoácidos, por ejemplo para soportar la inserción de una secuencia péptida. En este caso, se tomaron precauciones minuciosas para que no se eligiese ningún elemento estructural secundario de la proteína de la cápside de AAV2 que desestabilizase a la cápside.

En una forma de realización que ha sido descrita, la o las modificaciones están localizadas sobre el extremo N de la proteína estructural puesto que se ha encontrado que, por ejemplo, en el caso del parvovirus B 19, el extremo N se encuentra sobre la superficie de la célula.

Otra posibilidad para llevar a cabo la determinación de las regiones localizadas en la superficie de la proteína estructura consiste en una comparación de las secuencias de ácidos nucleicos, que codifican la cápside, de diversos serotipos de AAV. Con esta finalidad puede recurrirse, por ejemplo, a las secuencias de ADN conocidas de diversos serotipos de AAV, tales como de AAV1, de AAV2, de AAV3, de AAV4, de AAV5 o de AAV6, para el análisis estructural de las posibles morfologías de la cápside, por ejemplo de AAV2, pudiendo ser calculadas desde un inicio las posibles estructuras terciarias y pudiendo ser asociadas las regiones de la secuencia a las regiones internas o a las regiones externas de la cápside, en base a los mapas propios de los aminoácidos, conocidos en general. De este modo, podrían determinarse, de conformidad con la presente invención, los posibles puntos de inserción en la región VP3 de la cápside de AAV2, que posibilitasen (véase más adelante) la inserción de, por ejemplo, péptidos y su expresión sobre la superficie del virus.

Se entenderá por una inserción, por ejemplo, una modificación de la proteína de la cápside, que se consigue mediante enlace covalente o no covalente de una molécula sobre uno o sobre varios aminoácidos o secuencias de aminoácidos. De este modo, puede modificarse una proteína de la cápside, por ejemplo mediante enlace covalente de monosacáridos o de oligosacáridos, de biotina o de otros compuestos de elevado peso molecular, sobre uno o sobre varios aminoácidos. Sin embargo, la inserción puede conseguirse también mediante enlace covalente de compuestos de bajo peso molecular, tal como un grupo hidroxilo, sobre uno o varios aminoácidos. De la misma manera, pueden adicionarse moléculas o complejos moleculares sobre la proteína de la cápside por medio de enlace no covalente y, de este modo, pueden apantallarse las regiones antígenas. Éste puede ser, por ejemplo, el punto de enlace del antígeno de las inmunoglobulinas, por ejemplo un fragmento F_{ab} u otras moléculas, que presenten una elevada afinidad con respecto a la región antígena o con respecto a las regiones contiguas. Tales moléculas pueden ser seleccionadas con respecto a su afinidad, por ejemplo, a partir de bancos moleculares. En el caso de la estructura tridimensional, conocida, de la región antígena o de la proteína de la cápside, puede ser concebida y sintetizada una serie de moléculas potencialmente enlazantes, cuyas moléculas pueden ser ensayadas a continuación con respecto a su afinidad.

En una realización preferente, se inserta proteína o péptido, de manera preferente proteína o péptido inmunosupresor. En este caso, el péptido puede estar constituido, por ejemplo, por 5 hasta 30 aminoácidos, de manera preferente puede estar constituido por 8 hasta 20 aminoácidos y, de manera especial, puede estar constituido por 10 hasta 18 aminoácidos. El péptido tiene, por ejemplo, la secuencia QAGTFALRGDNPQG o tiene una secuencia que sea fuertemente homóloga con esta.

Es especialmente preferente una proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, que contenga, al menos, otra modificación. Se entenderá por este término que la proteína estructural contiene, además de una modificación, que provoque una disminución de la antigenicidad del virus, también otra modificación, que no provoque obligatoriamente también una disminución de la antigenicidad del virus. En este caso, es especialmente preferente otra modificación que provoque una modificación, preferentemente que provoque un aumento de la carácter infeccioso del virus.

En otra forma preferente de realización la otra o las otras modificaciones representan una o varias eliminaciones y/o una o varias inserciones en la proteína estructural o representan combinaciones de estas modificaciones. En este caso, la inserción es, de manera preferente, la inserción de un ligando del receptor de la membrana celular, una proteína Rep o un péptido Rep, por ejemplo en forma de un dominio Rep, de una proteína inmunosupresora o de un péptido inmunosupresor y/o de una proteína o de un péptido con una señal para la síntesis en doble hebra de un transgen o bien de un gen exógeno.

Ejemplos de otras inserciones son, entre otras, la integrina, la citocina o los dominios de enlace del receptor de las citocinas, de las integrinas o de los factores del crecimiento tales como, por ejemplo, GM-CSF, IL-2, IL-12, CD40L, TNF, NGF, PDGF o EGF, sobre anticuerpos monocelulares, que se enlazan sobre los receptores superficiales de la célula, denominados anticuerpos monocatenarios "single chain" (scFv), por ejemplo los anticuerpos monocatenarios, que se enlazan sobre los receptores superficiales CD40, CD40L, B7, CD28 o CD34, o los epitopos o bien los puntos de enlace con el receptor que son reconocidos por su parte, por ejemplo, por determinados anticuerpos, por ejemplo por los anticuerpos anti-CD40L- monoclonales, o bien por substancias químicas o por hormonas, por ejemplo la catecolamina.

En una forma preferente de realización de la otra modificación, se insertan estructuras enlazantes con los anticuerpos, tales como, por ejemplo, la proteína A, la proteína G o los anticuerpos anti-Fc, o bien partes de los mismos. Sobre éstos se acoplan, a su vez, anticuerpos específicos contra determinadas estructuras superficiales de la célula (por ejemplo contra el CD40 en el caso de las células linfáticas o contra el CD34 en el caso de las células hematopoyéticas).

En la forma de realización presente se encuentran una o varias inserciones en la proteína estructural VP3 (Rutledge, E. A. et al. (1998) supra) por delante y/o por detrás de, al menos, un aminoácido en la secuencia elegida entre YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG, puesto que estos puntos se encuentran en los puntos expuestos de un lazo, siendo pequeño el riesgo de que se modifique la estructura de la VP3.

La proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, puede estar presente así mismo en forma de una partícula de AAV, especialmente en forma de una cápside de AAV, puesto que las partículas o bien las cápsides son especialmente adecuadas como portadores de compuestos seleccionados, por ejemplo de los vectores de transducción AAVr.

La presente descripción se refiere, así mismo, a un ácido nucleico, de manera preferente a un ARN o a un ADN, de manera especial, se refiere a un ADN de doble hebra, que codifica una proteína estructural, preparada de conformidad con la invención.

La presente descripción se refiere, así mismo, a una célula, de manera preferente, se refiere a una célula de animal mamífero, de manera especial, se refiere a una célula COS, a una célula HeLa o a una célula 293, que contenga el ácido nucleico citado. Tales células son adecuadas, por ejemplo, para la obtención de partículas de AAV recombinantes.

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Otro objeto de la presente descripción consiste, por lo tanto, también en un procedimiento para la obtención de una proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, especialmente para la obtención de una proteína estructural en forma de una partícula de AAV, cultivándose una célula adecuada, que contenga un ácido nucleico, que codifique la proteína estructura y, en caso dado, se aísla la proteína estructural expresada. De manera ejemplificativa, puede aislarse la proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, por medio de un gradiente de cloruro de cesio, tal como se ha descrito, por ejemplo, en la publicación de Chiorini, J. A. et al. (1995), supra.

Otro objeto de la presente descripción se refiere, así mismo, a un medicamento, que contiene una proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, o un ácido nucleico citado o una célula citada y, en caso dado, productos auxiliares y aditivos adecuados tales como, por ejemplo, una solución fisiológica de sal común, estabilizantes, inhibidores de proteinasa, inhibidores de la desoxirribonucleasa (DNA-asa), etc.

Así mismo, el medicamento puede contener, al menos, dos proteínas estructurales diferentes, preparadas de conformidad con la invención, que presenten, respectivamente, modificaciones diferentes. En este caso, es especialmente preferente que tengan una antigenicidad diferente.

Otro objeto de la descripción consiste, así mismo, en un estuche (kit), que contiene, al menos, dos proteínas estructurales diferentes, preparadas de conformidad con la invención, estando presente en el estuche cada proteína estructural de manera independiente del/de las otras proteínas estructurales.

Para una aplicación del estuche o bien del medicamento con, al menos, dos proteínas estructurales diferentes, preparadas de conformidad con la invención, por ejemplo en el ámbito de una terapia, se aplicará, en este caso, en primer lugar una proteína estructural. Para una o varias aplicaciones ulteriores se emplea o se emplean proteínas estructurales con otra antigenicidad. Por consiguiente, una terapia con ayuda del medicamento o bien del estuche comprende la administración sucesiva de proteínas estructurales, preparadas de conformidad con la invención. El medicamento o bien el estuche tienen, por lo tanto, la ventaja de que (1) puede evitarse la potenciación de una respuesta inmune, desencadenada en el caso de una aplicación repetitiva de la misma proteína estructural y de que (2) en el caso en que se desencadene una reacción inmune durante la primera aplicación, la reacción de defensa presente contra la segunda aplicación es menos activa, como consecuencia de la utilización de una proteína estructura con una antigenicidad diferente, que lo que ocurriría en el caso de una aplicación con la primera proteína estructural. La inmunización del apaciento, que queda reducida de este modo, aumenta la actividad. Por lo tanto, en el caso de aplicaciones continuas, puede intercambiarse varias veces entre diversas proteínas estructurales diferentes, con objeto de mantener tan baja como sea posible una inmunización del paciente. Es preferente un juego con varias proteínas estructurales en forma de partículas infecciosas con antigenicidad diferente, que son empleadas como vector para la transferencia múltiple de, por ejemplo, genes terapéuticos idénticos. Otro medicamento abarca un juego de proteínas estructurales en forma de partículas infecciosas, que se emplean como vector para terapias diferentes.

La proteína estructural, preparada de conformidad con la invención, puede ser empleada para la transformación de una célula y/o - en forma de vectores adecuados de AAVr - para la terapia génica. Se entiende por terapia génica, aquella forma de terapia en la que se expresa un gen efector y, por lo tanto, en la mayoría de los casos una proteína, por medio de la introducción de ácidos nucleicos en la célula. En principio, se hace una distinción entre procedimientos in-vitro y procedimientos in-vivo. En los procedimientos in-vitro se toman células del organismo y se someten a una transducción ex-vivo con vectores, con objeto de ser reintroducidas a continuación en el mismo organismo o en otro organismo. En el caso de la terapia génica in-vivo se aplican de manera sistémica vectores, por ejemplo para la lucha contra tumores, (por ejemplo a través del riego sanguíneo) o son aplicados de manera local (por ejemplo en el tumor).

Una ventaja esencial de la presente invención consiste en que puede modificarse la antigenicidad, por medio de la mutagénesis de las proteínas estructurales de AAV, de conformidad con la invención, esencialmente sin pérdida de la eficiencia de empaquetamiento de los vectores de AAV recombinantes - y por lo tanto de la condición previa básica del carácter infeccioso - dentro de la cápside del virus. Por lo tanto, las proteínas estructurales, preparadas de conformidad con la invención, son adecuadas, de manera especial, para la transducción in vivo de células, por ejemplo para la terapia génica somática, cuando sea deseable una inmunización disminuida de los pacientes.

Los ejemplos siguientes explican la invención con mayor detalle, sin limitarla.

Ejemplo 1 Mutación P1 en la VP3

En primer lugar, se partió de un plásmido pUC-AV2, que se preparó mediante subclonación del fragmento BgIII de 4,8 kb del pAV2 (ATCC 37261, ref. 53) en el sitio de restricción BamHI del pUC19 (New England BioLabs Inc.). Se llevaron a cabo mutaciones, por medio de la mutagénesis, basada en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), que es conocida por el técnico en la materia, mutaciones en sitios definidos del plásmido. En este caso, se introdujo detrás de los nucleótidos 2985, 3345 y 3963 una secuencia que codifica P1, un péptido 14 AS, con la secuencia AS QAGTFALRGDNPQG, que contiene el motivo de enlace RGD de un fragmento de laminina (Aumailley et al. (1990) FEBS Lett. 262, 82-86). Esto corresponde a una inserción por detrás de los aminoácidos 261, 381 y 587 de la proteína de la cápside de AAV2 (nomenclatura de acuerdo con el número de los aminoácidos (AS) contados por detrás del AS a partir del inicio del extremo N en la VP-1 del AAV2). En la RCP subsiguiente se utilizan, respectivamente, 2 cebadores específicos de la mutación y como matriz se emplea un plásmido, pCap, que únicamente contiene el gen cap y que se forma porque se retira por restricción a partir de pUC-AV2 el fragmento EcoRI-BspMI de 2,2 kb y se inserta en el sitio de restricción EcoRI del pUC19. A continuación, se amplifican en bacterias los productos de la RCP, se secuencian y se subclona en pUC-AV2 el fragmento EcoNI-XcmI de 1,4-kb, que contiene la P1, en el que se ha retirada por restricción la correspondiente secuencia cap del tipo natural. Por lo tanto, los plásmidos (mutantes) pI-261, pI-381 y pI-587, denominados según los puntos de inserción AS, contienen el genoma completo de AAV2. Las proteínas correspondientes se denominan I-261, I-381 y I-587.

Ejemplo 2 Obtención de partículas de AAV2

Se transfectaron células HeLa (una línea celular humana del epitelio del cuello de matriz) con los plásmidos, de conformidad con el ejemplo 1, a continuación se incubaron durante 20 horas aproximadamente y, seguidamente, se infectaron con adenovirus tipo 5. Al cabo de 72 horas desde la infección se sometieron a digestión las células y se purificaron las partículas de AAV2 por medio de un gradiente de CsCl.

Ejemplo 3 Caracterización de los mutantes de la cápside según el ejemplo 1

En estos ensayos debía establecerse si los mutantes de la cápside empaquetan el genoma viral y si pueden formar cápsides completas. Se ensayaron partículas de AAV2 de los mutantes, de conformidad con el ejemplo 2, con relación a si el genoma del virus porta partículas y, en caso dado, en qué cantidad lo hace y en qué cantidad estaba empaquetado el ADN en los mutantes de la cápside. Con esta finalidad se trataron los virus purificados, de conformidad con el ejemplo 2, (mutantes y de tipo natural) con desoxirribonucleasa (ADN-asa), se sometieron a un análisis por transferencia y se hibridizaron con una sonda Rep.

Los títulos, obtenidos de este modo, no mostraron una diferencia cuantitativa o cualitativa en comparación con los del tipo natural (véase la tabla 1). Los virus mantenían la capacidad de empaquetar el genoma.

Por otra parte, pudo demostrarse mediante análisis por microscopía electrónica que, incluso, se forma la cápside.

Por lo tanto, no se llevaron a cabo las mutaciones en aquellas regiones, que son significativas para el plegamiento correcto, para la composición de la cápside o para el empaquetamiento del genoma. Las partículas de AAV, de conformidad con la invención, no quedan perjudicadas en cuanto a su función.

Ejemplo 4 Antigenicidad de los mutantes de la cápside de conformidad con el ejemplo 1

Con el fin de poder evaluar la antigenicidad de las cápsides mutadas, se emplearon, en otro experimento, anticuerpos monoclonales A20 (A20MAb) en un ELISA. Los A20MAb reaccionaron de manera específica con la cápside de AAV2 del tipo natural, compuesta de manera completa (Wistuba et al., (1997), J. Virol. 71, 1341-1352). También, en este caso se han representado los resultados en la tabla 1. En este caso, se observa que, por medio de la inserción en los mutantes I-261 e I-381 ya no pueden enlazarse anticuerpos monoclonales, en contra de lo que ocurre en el caso del tipo natural y de I-587 del A20.

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TABLA 1 Eficacia de empaquetadura y antigenicidad de los mutantes víricos preparados de conformidad con el ejemplo 1

1

Se han mostrado los títulos víricos genómicos (hibridación en gota -Dot-Blot-) y el título con la cápside de A20-ELISA. Las concentraciones han sido dadas en partículas/ml. "n.m." significa "no medible".

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Ejemplo 5 Ensayos de infección con mutantes de cápside de conformidad con el ejemplo 1

Con objeto de ensayar el tropismo de los mutantes de la cápside I-261, I-381 e I-587 se infectaron las células de la línea celular Co-115 con los virus mutados. Las células Co-115 se utilizaron para el ensayo del tropismo receptor del tipo natural de los viriones, puesto que éstos son susceptibles frente al tipo natural AAV2. Al cabo de tres días, desde la infección, se investigó, por medición con inmunofluorescencia con ayuda de un anticuerpo anti-Rep, si las células expresan la proteína Rep viral (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319). Las células se cultivaron sobre portaobjetos hasta una confluencia del 70% y se incubaron, en medio exento de suero, con diversas concentraciones de las preparaciones virales, de conformidad con la invención, junto con el adenovirus 5. El título de las preparaciones virales se determinó tres días más tarde bien por medio de la detección in situ de la síntesis de la proteína Rep en un ensayo de inmunofluorescencia (título Rep). En este caso se llevó a cabo la coloración de inmunofluorescencia con células infectadas con AAV2, según un método de Wistuba et al. (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319). Los portaobjetos se lavaron una vez con fosfato salino tamponado (PBS), se fijaron en metanol (5 minutos, 4ºC) y, a continuación, se trataron con acetona (5 minutos, 4ºC). Las células se incubaron, a continuación, durante una hora a la temperatura ambiente con el anticuerpo monoclonal 76-3, que reacciona con las proteínas Rep de AAV2. A continuación, se lavaron y se incubaron durante una hora con anticuerpo secundario anti-ratón conjugado de rodamina, con una dilución de 1:50 en PBS con un 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Los títulos se calcularon a partir de la última dilución limitadora de la solución madre viral, que había conducido a células positivas a la fluorescencia.

Tras la infección con el tipo natural de AAV2 y con los mutantes I-261 e I-587, pudieron ser detectadas células CO115 Rep-positivas, siendo el carácter infeccioso de los mutantes un orden de magnitud entre dos y tres veces menor que el del tipo natural, o bien que el de un mutante no infeccioso (I-381) (tabla 2). Sin embargo, pudo observarse que, en el caso del mutante I-261, se mantuvo el carácter infeccioso a pesar de que la antigenicidad era menor (véase el ejemplo 14).

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TABLA 2 Título vírico sobre la superficie de las células

3

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Se han mostrado los títulos sobre las células CO115 susceptibles al tipo natural. Los títulos se han expresado en Rep-EFU/ml para I-261, para I-381 y para I-587 como para el tipo natural. En este caso, EFU significa unidades formadoras de expresión (Expressing Forming Unit). En este caso "n.m." significa "no medible".

<110> MediGene Aktiengesellschaft

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<120> Proteína estructural de virus adeno-asociado con antigenicidad modificada, su obtención y empleo

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<140> 199 33 288.6

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<141> 15.07.1999

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<160> 9

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<170> Word 6.0, PC-DOS/MS-DOS

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 1

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100

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 2

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101

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<210> 3

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<400> 3

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102

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<210> 4

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 4

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103

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 5

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104

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<210> 6

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 6

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105

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<210> 7

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 7

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106

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<210> 8

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 8

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107

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<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus adeno-asociado

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<400> 9

\hskip1cm

108

Claims

1. Procedimiento para disminuir la antigenicidad de la proteína estructural de virus adeno-asociado (AAV) frente a la del tipo natural, caracterizado porque la proteína estructural se modifica por medio de, al menos, de una inserción, que está localizada por delante y/o por detrás de, al menos, un aminoácido en la secuencia, elegida entre YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT o NVDFT VDTNG de VP3, y además la proteína estructural, mutada de este modo, sigue siendo capaz de formar partículas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la inserción no provoca una disminución esencial del carácter infeccioso del virus.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la proteína estructural se deriva de AAV1, de AAV2, de AAV3, de AAV4, de AAV5 y/o de AAV6 así como de otros serotipos de AAV, especialmente derivados de AAV2.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la inserción está basada en un enlace covalente o en un enlace no covalente de uno o de varios compuestos de elevado peso molecular o de bajo peso molecular, por ejemplo de biotina, de un monosacárido o de un oligosacárido, de un grupo hidroxilo o de un fragmento F_{ab}, sobre uno o sobre varios aminoácidos o sobre una o sobre varias secuencias de aminoácidos.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se inserta una proteína o un péptido, de manera preferente se inserta una proteína inmunosupresora o un péptido inmunosupresor.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proteína estructural contiene, al menos, otra modificación.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la otra o las otras modificaciones provocan una modificación del carácter infeccioso del virus.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque la otra o las otras modificaciones son una o varias eliminaciones, una o varias inserciones o una combinación de estas modificaciones.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la inserción es un ligando receptor de la membrana celular, una proteína Rep o un péptido Rep, una proteína inmunosupresora o un péptido inmunosupresor y/o una proteína o un péptido con una señal para la síntesis en doble hebra del gen exógeno.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la inserción se elige entre una integrina, una citocina o un dominio de enlace con el receptor de una citocina, de una integrina o de un factor de crecimiento, un anticuerpo monocatenario, enlazante con un receptor superficial celular, un anticuerpo contra estructuras superficiales celulares, una estructura enlazante con anticuerpos o un epitopo.