JP2003505032A - 修飾された抗原性を有するアデノ随伴ウイルスの構造タンパク質と、その製造及び使用 - Google Patents

修飾された抗原性を有するアデノ随伴ウイルスの構造タンパク質と、その製造及び使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗原性を低減させる修飾を少なくとも１つ含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質、その製造及び使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、抗原性の低減をもたらす少なくとも１つの修飾を有するアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質と、その製造及び使用とに関する。
【０００２】 ＡＡＶウイルスは、パルボウイルスのファミリーに属する。これらは、１８〜
３０ｎｍの直径を有し、約５ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡを含有する、二十面体の無
外被カプシドによって識別される。ＡＡＶの効果的な複製は、ヘルパーウイルス
、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスとの宿主細
胞の同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合には、ＡＡＶは
潜伏状態に入り、ウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれることが
できる。宿主ゲノムに組み込まれるというＡＡＶの性質は、哺乳動物細胞のため
の形質導入ベクター(transduction vector)としてＡＡＶを特に重要にしている
。一般に、約１４５ｂｐ長さである２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）はベク
ター機能に関して充分である。これらは、宿主細胞ゲノム中への複製、パッケー
ジング及び組み込みのために必要な“シス”シグナルを有する。組換えベクター
粒子中へのパッケージングのためには、非構造タンパク質（Ｒｅｐタンパク質）
の遺伝子と構造タンパク質（Ｃａｐタンパク質）の遺伝子とを有するヘルパープ
ラスミドが、パッケージングに適した細胞、例えばＨｅＬａ又は２９３細胞中へ
トランスフェクトされ、これらの細胞は次に例えばアデノウイルスによって感染
する。数日後に、組換えＡＡＶ粒子を含有する溶解物(lysate)が得られる。適当
なヘルパープラスミドは、例えばChiorini et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6,
1531-1541又は Girod et al. (1999), Nat. Med.によって述べられている。
【０００３】 ＡＡＶカプシドは３つの異なるタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成
り、これらの相対的割合は５％ ＶＰ１、５％ ＶＰ２及び９０％ ＶＰ３であ
る。ＡＡＶカプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右手端部に局限され、異なる開始コ
ドンと、転写物(transcript)の２つの異なってスプライスされた変異体(variant
)とを用いて、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列をオーバー
ラップさせることによって、コードされる。ＶＰ１遺伝子はＶＰ２遺伝子配列全
体を含有し、このＶＰ２遺伝子配列は、特異的なＮ末端領域を有するＶＰ３遺伝
子配列全体を含有する。オーバーラッピングリーディングフレームが３種類のＡ
ＡＶカプシドタンパク質の全てをコードするという事実が、全てのカプシドタン
パク質の、程度の差こそあれ、必須の発現を生じることになる。
【０００４】 カプシドタンパク質の分子質量は、ＶＰ１が８７ｋＤ、ＶＰ２が７３ｋＤ及び
ＶＰ３が６２ｋＤである。カプシド遺伝子の配列は、例えば、Srivastava, A. e
t al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Mi
cro. Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 69
226930 又は Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319に述べら
れている。 ＡＡＶゲノムの物理的及び遺伝的マップは、例えば、Kotin, R.M. (
1994), Human Gene Therapy, 5, 793-801に述べられている。
【０００５】 種々なＡＡＶ血清型も知られており、これらのうちでヒトＡＡＶ血清型２（Ａ
ＡＶ２）が最も徹底的に研究されている。これらの分析は、ＡＡＶウイルスが身
体的遺伝子療法のためにウイルスベクターとして有利な性質を有することを示し
ている。本質的な利点は、ヒトに対する病原性が無いこと、細胞ゲノム中へのウ
イルスＤＮＡの安定な組み込み、非分割細胞(non-dividing cells)を感染させる
能力、高タイター（１０13〜１０14粒子／ｍｌ）までの精製を可能にするビリオ
ンの安定性、比較的低い免疫原性、及び組換えＡＡＶベクター中にウイルス遺伝
子と遺伝子産物とが存在しないこと（これは遺伝子療法に用いるために安全性の
見地から有利である）である。ＡＡＶベクター中への遺伝子のクローニングは現
在、例えば WO95/23867、Chiorini J.A. et al. (1995),Human Gene Therapy,6,
1531-1541又はKotin,R.M.(1994),上記文献に述べられているような、当業者に一
般に知られた方法によって行なわれる。
【０００６】 遺伝子療法へのまさにウイルスベクターの使用は、この療法の成果を妨害する
恐れがある免疫応答の強化に高い抗原性が関連するので、用いる系の抗原性に非
常に依存する。それ故、ＡＡＶウイルスの抗原性は療法へのその使用可能性のた
めにも決定的に重要である。抗原なる用語は、ヒト又は動物体内への導入後に、
特定の免疫応答を誘発する物質を意味する。これは、抗体の産生（体液性免疫応
答）と細胞仲介免疫性（細胞免疫応答）の発生とによって、又は特異的な免疫寛
容によって明示される。免疫応答のため（抗原の免疫原性のため）の一般的前提
条件は、抗原が身体によって異物として認識されること、抗原が＞１ＫＤａのＭ
Ｗを有し、タンパク質若しくは多糖類、稀にはデオキシリボ核酸又は脂質のクラ
スに属することである。例えば、細菌、ウイルス又は赤血球（粒状抗原）のよう
な複雑な構造は、一般に、さらに効果的な抗原である、即ち、高い抗原性を有す
る。それ故、本発明のために、抗原性とは結合によって免疫系（体液性と細胞性
）と相互作用する（免疫系によって認識される）能力を意味する。さらに、この
用語は免疫原性、即ち、免疫応答を誘発する能力をも包含する。この場合、まさ
にウイルスでは、抗体結合のための根本的な抗原構造がカプシドタンパク質又は
カプシドの一次構造によってのみでなく、二次、三次又は四次構造によっても決
定される可能性がある。
【０００７】 Chapman M.S.とRossmann M.G. (1993), Virology, 194, 491508は、種々なパ
ルボウイルスとの配列比較によってＣＰＶカプシドの主要な抗原決定基を同定す
ることができ、これからカプシドタンパク質間の抗原差異を予測した。この研究
によると、ＣＰＶカプシドタンパク質の抗原性は、高度な配列可変性を有する外
側に暴露されたループに主として関連する。他方では、このような研究はＡＡＶ
ウイルスカプシドに関してはまだ行なわれていない。ＷＯ９６／００５８７のみ
が、例えば、臨床的に有意味な抗原をコードするＤＮＡがカプシドタンパク質を
コードするＤＮＡ中にカプシド形成を妨害せずに挿入され、この構築体がＡＡＶ
カプシド融合タンパク質として発現される、ＡＡＶカプシド融合タンパク質を述
べている。 臨床的に有意味な抗原は、例えば細菌（例えば、サルモネラ）、ウイルス（例え
ば、ｅｎｖ−ＨＩＶ）又は腫瘍細胞に由来するエピトープである。得られるＡＡ
Ｖカプシド融合タンパク質は免疫応答を惹起し、さらにＡＡＶウイルスの抗原性
を増強させることになる。
【０００８】 先行技術には、ＡＡＶ抗原性の低減は示唆されていない。しかし、ＡＡＶベク
ターの−特に遺伝子療法における−実際の使用のために、野性型に比べて又は野
性型に由来するＡＡＶベクターに比べて低減した抗原性は有利である。この理由
は、野性型ＡＡＶも確実に抗原決定基を有するからである。したがって、野生型
抗原性のＡＡＶベクターによる治療が不可避に困難であるか又は不可能である抗
ＡＡＶ２ Ｉｇ陽性の個人が存在する。同様に、ＡＡＶベクターによる反復治療
時に、患者が用いられるＡＡＶベクターに対して体液性及び／又は細胞性免疫応
答をますます発生させる可能性がある。このような免疫化は治療をあまり成功的
ではなく又は不成功にすると考えられる。したがって、組換えＡＡＶウイルスの
抗原性が低ければ低いほど、又はその抗原性が野性型ウイルス若しくは以前に用
いられた組換えＡＡＶウイルスから大きく異なれば異なるほど、その治療的使用
はますます有望であると思われることを意味する。
【０００９】 それ故、本発明の課題は、ＡＡＶウイルスの抗原性、特に構造タンパク質の抗
原性を野性型に比べて低減することであった。特異的で、効果的な遺伝子転移を
可能にするが、免疫応答をより良く又は完全に回避するＡＡＶベクターを修飾に
よって開発することが、特に意図された。それ故、この修飾は好ましくは、同時
にウイルスの感染性を無視できるほどに低減する又は少なくとも保持するような
修飾であるべきである。
【００１０】 今回、抗原性が低減され、その際に感染性も無視できるほどに低減されるが、
感染性が少なくとも保持されるようなやり方でＡＡＶの構造タンパク質又はカプ
シドタンパク質が修飾されうることが意外にも発見された。
【００１１】 それ故、本発明の１態様は、抗原性を低減させる修飾を少なくとも１つ含むＡ
ＡＶの構造タンパク質である。
【００１２】 本発明の意図及び上記定義において、抗原性の低減とは特定の配列若しくはエ
ピトープの、特に野性型に存在する特定のエピトープ及び配列の修飾、欠失若し
くは付加、又はこれらの手段の組み合わせによる抗体産生及び／又は抗体結合の
低減を意味する。低減した抗原性は、例えば、ＡＡＶベクターによる療法による
生物の低減した免疫化を意味する。これに関連して、絶対的表現において、即ち
、免疫応答の平均強度において単に変化した抗原性も、本発明の構造タンパク質
が野性型によっては誘発されたであろう抗体（免疫）応答を誘発しないならば、
本発明の意図では低減したと見なされるべきである。絶対的表現で単に変化して
いる、このような抗原性は、抗原性の異なる本発明のＡＡＶベクターを連続的治
療に用いるならば、低減した免疫化を生じる可能性がある。さらに、この場合、
変化した抗原性とは体液性及び細胞性免疫応答の両方に関係しうる。
【００１３】 体液性免疫応答に関して、低減した抗原性は、例えば、本発明の修飾されたＡ
ＡＶカプシドタンパク質又はＡＡＶカプシドをもはや認識しないか又はあまり充
分に認識しない、非修飾（野性型）ＡＡＶカプシドタンパク質又はＡＡＶカプシ
ドに結合することができる抗体によって検出されることができる。このような検
出は、例えばエンザイム−リンクト イムノアブソルベント アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）のような標準方法によって行なうことができる。適当な抗体は、例えば、
Ａ２０モノクローナル抗体である（Wistuba,A.et al. (1997) J.Virol.,71, 134
1-52参照）、この抗体は野性型の完全にアセンブルされたＡＡＶ２カプシドのみ
を特異的に認識するが、遊離のカプシドタンパク質を認識しない。
【００１４】 細胞性免疫応答に関して、修飾された抗原性は、修飾構造タンパク質の粒子に
よって感染している抗原提示細胞によって、オリジナルの構造タンパク質の粒子
によって感染している抗原提示細胞によるほど強く刺激されないＡＡＶ特異性免
疫細胞によって検出されることができる。この方法は、ワクシニアウイルス及び
アデノウイルスに関する方法に類似する（Tarpey, I. et al., (1994), Immunol
ogy, 81, 222-7; Nimako, M. et al., (1997), Cancer Res. 57, 4855-61)。免
疫細胞の刺激は、例えば、サイトカインアッセイによって定量的に測定すること
ができる（Current Protocols in Immunology (1999), Coligan J.E. et al.編
集, John Wiley & Sons,Chapter 6.2 - 6.24)。
【００１５】 本発明の構造タンパク質の修飾がウイルスの感染性の無視できるほどの低減を
生じるか、又は感染性が少なくとも保持されることが、特に好ましい。本発明の
意図において、感染性とは、細胞に形質導入する能力を意味する。
【００１６】 さらに、本発明の構造タンパク質がそのうえ、粒子形成する、即ち、特にＡＡ
Ｖカプシドとして二十面体カプシドを形成する能力を有することが好ましい、こ
の理由は粒子及びカプシドが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクタ
ーのキャリヤーとして特に適しているからである。粒子の形成は、例えば、電子
顕微鏡によって検出することができる。他の検出方法は、塩化セシウム密度勾配
遠心分離中の沈降挙動と、続いての粒子中に存在するウイルスＤＮＡの任意の検
出である。
【００１７】 一般に、修飾はＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶ３構造タンパク質、好ましくはＶ
Ｐ１及び／又はＶＰ３構造タンパク質中に存在しうる。さらに、構造タンパク質
は全てのＡＡＶ血清型に、特にヒト血清型に、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、
ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３
及び／又はＡＡＶ６に由来することができる。
【００１８】 修飾（単数又は複数）は好ましくはウイルス表面に局限する。構造タンパク質
の表面局限領域の決定に関して、本発明によって、ＣＰＶ（イヌパブロウイルス
）とＡＡＶ２の配列及び構造が匹敵することが意外にも発見された。それ故、好
ましくは、例えばパブロウイルスＢ１９又はＣＰＶのようなパブロウイルスの既
知結晶構造に頼って、ホモロジー比較によって、ウイルス表面に局限するタンパ
ク質ドメインを同定することが可能である。それ故、本発明によると、例えば、
ＣＰＶとＡＡＶ２とのコンピューター補助比較、及びパブロウイルスＢ１９とＡ
ＡＶ２とのコンピューター補助比較が、配列が変化して、即ち、低いホモロジー
を有して、ウイルス表面に局限すると期待される、ＶＰ３中のループの同定を意
外にも再現可能に生じた。体液性免疫応答に対する抗原は抗体に、したがってウ
イルス表面にアクセス可能でなければならないので、これらのループは修飾のた
めの好ましい候補である。このように、ＣＰＶ ＶＰ２カプシドタンパク質の既
知結晶構造（例えば、Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209211; Wu and Ro
ssmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244; Tsao J. et al. (1991) Scienc
e, 251, 1456-1464)は、ウイルスカプシド表面上に暴露され、局部的アミノ酸配
列に基づいてペプチド配列の挿入を克服するために充分にフレキシブルである領
域を見出すために、タンパク質の二次構造におけるＡＡＶ２ ＶＰ３との大きな
類似性に基づいてパターンと見なされた。この場合に、カプシドを不安定化する
と考えられるＡＡＶ２カプシドタンパク質の二次構造要素を選択しないように注
意した。
【００１９】 好ましい実施態様では、修飾（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に局
限する、この理由は、例えばパブロウイルスＢ１９の場合にはＮ末端が細胞表面
に局限することが発見されているからである。
【００２０】 構造タンパク質の表面局限領域を決定するための他の可能性は、異なるＡＡＶ
血清型からのカプシドをコードする核酸配列を比較することである。このために
、例えばＡＡＶ２の可能なカプシド形態の構造分析のために、例えばＡＡＶ１、
ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のような、異なるＡＡＶ
血清型からの既知ＤＮＡ配列を用いることが可能であり、この場合に、最初から
、可能な三次構造を算出して、一般に知られたアミノ酸性質に基づいて配列領域
を内側又は外側カプシド領域に割り当てることが可能である。したがって、本発
明によると、例えば、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ３領域における可能な挿入部位を
確定することが可能であり、これらの部位は、例えばペプチドを挿入して、それ
らをウイルス表面上に発現させることを可能にした（以下参照）。
【００２１】 修飾は、例えば、１つ以上のアミノ酸又はアミノ酸配列への分子の共有結合又
は非共有結合によって得られるカプシドタンパク質の変化を意味する。したがっ
て、例えば、１つ以上のアミノ酸への単糖若しくはオリゴ糖、ビオチン又は他の
高分子量化合物の共有結合によってカプシドタンパク質を修飾することができる
。しかし、１つ以上のアミノ酸への例えばヒドロキシル基のような低分子量化合
物の共有結合によって、修飾を達成することもできる。さらなる可能性は、分子
又は分子複合体を非共有結合によってカプシドタンパク質に付着させることによ
って、抗原領域をシールドすることである。これは、例えば、免疫グロブリンの
抗原結合部位であることができ、抗原領域又は隣接領域に対して高いアフィニテ
ィを有する、例えばＦabフラグメント又は他の分子でありうる。このような分子
を分子ライブラリーから例えばそれらのアフィニティに関してスクリーニングす
ることができる。抗原領域又はカプシドタンパク質の三次元構造が既知である場
合には、一連の可能な結合する分子を設計して、合成し、次にこれらの分子をそ
れらのアフィニティに関して試験することができる。
【００２２】 しかし、修飾はさらに、例えば１つ以上の突然変異、即ち、アミノ酸の配列に
おける変化を意味する。突然変異なる用語は、例えば、点突然変異、複数のアミ
ノ酸の突然変異、１つ以上の欠失、１つ以上の挿入又はこれらの突然変異の組み
合わせを包含する。さらに、点突然変異又は複数のアミノ酸の突然変異がＴ又は
Ｂ細胞エピトープ中に存在することが可能であり、修飾が同時に点突然変異、複
数のアミノ酸の突然変異、挿入及び／又は欠失から成ることが可能である。
【００２３】 好ましい実施態様では、タンパク質又はペプチドの挿入、好ましくは免疫抑制
性タンパク質又はペプチドの挿入が存在する。この場合のペプチドは例えば５〜
３０アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸、特に１０〜１８アミノ酸から成る
ことができる。これらのペプチドは例えば配列QAGTFALRGDNPQG又はこれと高度に
ホモロジーである配列を有する。
【００２４】 特に好ましい、本発明の構造タンパク質は少なくとも１つの他の修飾を含む。
このことは、構造タンパク質が、ウイルスの抗原性を低減させる修飾の他に、ウ
イルスの抗原性を必ずしも低減させない他の修飾をも含むことを意味する。これ
に関連して、ウイルスの感染性を変化させる、好ましくは増強させる他の変化が
特に好ましい。
【００２５】 他の好ましい実施態様では、該他の修飾は構造タンパク質における１つ以上の
欠失及び／又は１つ以上の挿入又はこれらの修飾の組み合わせを表す。これに関
連して、挿入は好ましくは、細胞膜受容体リガンドの挿入、例えばＲｅｐドメイ
ンとしてのＲｅｐタンパク質若しくはペプチドの挿入、免疫抑制性タンパク質若
しくはペプチドの挿入及び／又は、導入遺伝子(transgene)若しくは異種遺伝子(
foreign gene)の二本鎖合成のためのシグナルを有するタンパク質若しくはペプ
チドの挿入である。
【００２６】 他の挿入の例は、特に、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、イ
ンテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、例えばGMCSF, IL-2, IL-12
, CD40L, TNF, NGF, PDGF若しくは EGF、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体
、いわゆる一本鎖抗体(scFv)、例えば表面受容体CD40, CD40L, B7, CD28 若しく
はCD34に結合する一本鎖抗体、又は例えば抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のよ
うな特定の抗体によって若しくは化学物質若しくは例えばカテコールアミンのよ
うなホルモンによって認識されるエピトープ若しくは受容体結合部位である。
【００２７】 他の修飾の好ましい実施態様では、例えばプロテインＡ、プロテインＧ又は抗
Ｆｃ抗体又はこれらの部分のような抗体結合構造が挿入される。これらに、再び
、特定の細胞表面構造に対して（例えば、リンパ細胞の場合にはＣＤ４０に対し
て又は造血細胞の場合にはＣＤ３４に対して）特異的な抗体が結合する。
【００２８】 好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ切断部位における
１つ以上の挿入によって、他の好ましい実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸
のＢｓｒＢＩ切断部位における１つ以上の挿入によって修飾が行なわれる。本発
明の構造タンパク質の他の好ましい実施態様は、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓ
ｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失と、好ましくは該欠失部位における１つ
以上の挿入とによって行なわれる。
【００２９】 本発明の他の好ましい実施態様では、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング
核酸のＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、修飾（単数又
は複数）が行なわれる（Hermonat, P.L. et al. (1984), J. Virol., 51, 329-3
39)。他の好ましい、対応する実施態様では、上記欠失内に局限され、２９アミ
ノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に、
欠失（単数又は複数）が局限される。この欠失はＲｅｐ遺伝子とのオーバーラッ
プを有さないので、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点
を有する。
【００３０】 他の好ましい実施態様では、ＶＰ３構造タンパク質(Rutledge, E.A. et al. (
1998) 上記文献) 中の、YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV
, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNGから選択された配列における少なく
とも１つのアミノ酸の前及び／又は後に１つ以上の挿入が存在する、この理由は
これらの部位がループの暴露部位に局限され、この場合にはＶＰ３構造が変化す
る危険性が低いからである。
【００３１】 点突然変異（単数又は複数）、幾つかのアミノ酸の突然変異（単数又は複数）
、欠失（単数又は複数）又は挿入（単数又は複数）は、一般に知られた方法に従
って、構造タンパク質をコードする遺伝子中の欠失及び挿入によって行なわれる
。欠失は例えばＰＣＲ補助突然変異誘発によって個々の構造タンパク質遺伝子中
に導入することができる。挿入は一般に知られた方法に従って、例えば、適当な
構造タンパク質遺伝子の制限エンドヌクレアーゼによる加水分解とそれに続くリ
ガーゼ反応とによって導入することができる。その後の突然変異遺伝子の発現が
本発明の構造タンパク質を生じる。
【００３２】 本発明の他の態様もまた、ＡＡＶ粒子としての、特にＡＡＶカプシドとしての
本発明の構造タンパク質である、この理由は、粒子及びカプシドが選択された化
合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているから
である。
【００３３】 本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質をコードする核酸、好ましくは
ＲＮＡ又はＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。
【００３４】 本発明はまた、本発明の核酸を含む細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣ
ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞に関する。このような細胞は、組換えＡ
ＡＶ粒子を製造するために適している。
【００３５】 それ故、本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質の製造方法、特にＡＡ
Ｖ粒子としての本発明による構造タンパク質の製造方法であって、本発明による
構造タンパク質をコードする核酸を含む適当な細胞を培養して、適当である場合
には、発現された構造タンパク質を単離する前記方法でもある。例えば、本発明
の構造タンパク質は、例えばChiorini,J.A.et al.(1995),上記文献に述べられて
いる塩化セシウム勾配上で単離することができる。
【００３６】 本発明の他の態様はまた、本発明の構造タンパク質又は本発明の核酸又は本発
明の細胞と、適当である場合には、例えば生理食塩溶液、安定剤、プロテイナー
ゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ阻害剤等のような、適当な賦形剤及び添加剤とを含む薬剤
にも関する。
【００３７】 本発明の他の態様は、各々が異なる修飾を有する、少なくとも２種類の異なる
、本発明の構造タンパク質を含む薬剤である。これに関連して、これらの構造タ
ンパク質が抗原性において異なることが特に好ましい。
【００３８】 他の好ましい態様は、少なくとも２種類の異なる、本発明の構造タンパク質を
含むキットであって、各構造タンパク質がキット内で他の構造タンパク質（単数
又は複数）から分離して存在する前記キットである。
【００３９】 少なくとも２種類の異なる、本発明の構造タンパク質を有するキット又は薬剤
の、例えば療法の一部としての使用に関して、最初に１つの構造タンパク質を用
いる。その後の１回以上の使用のために、抗原性の異なる構造タンパク質が用い
られる。したがって、薬剤又はキットを用いる療法は、本発明の構造タンパク質
の連続的投与を含む。したがって、薬剤及びキットは、（１）同じ構造タンパク
質の反復使用時に誘発される免疫応答の可能性を回避することができる及び（２
）最初の使用中に免疫応答が誘発される場合には、抗原性の異なる構造タンパク
質の使用によって、この第２使用に対する防御応答は第１構造タンパク質による
使用に対するよりも効果的でないことが実証されるという利点を有する。このよ
うにして低減される患者の免疫化は、効力を高める。したがって、連続使用のた
めには、患者の免疫化をできるだけ低く維持するように、種々な構造タンパク質
の間で多重に交換することが可能である。抗原性の異なる感染性粒子としての一
組の幾つかの構造タンパク質が好ましく、これらは例えば同じ治療用遺伝子(the
rapeutic gene)の多数回転移のためのベクターとして用いられる。他の薬剤は、
異なる治療のためにベクターとして用いられる感染性粒子としての一組の構造タ
ンパク質を含む。
【００４０】 本発明の他の態様は、ＡＡＶの抗原性を変えるため、細胞を形質転換するため
及び／又は−適当なｒＡＡＶベクターとして−遺伝子療法のための本発明の構造
タンパク質の使用に関する。遺伝子療法は、細胞中への核酸の導入によって、エ
フェクター遺伝子、したがって通常はタンパク質が発現される療法のタイプを意
味する。原則として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法とｉｎ ｖｉｖｏ方法とが区別され
る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法では、細胞が生物から取り出され、続いて、同じ生物
又は他の生物中に再び導入されるために、ベクターによってｅｘ ｖｉｖｏで形
質導入される。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法では、例えば腫瘍を制圧するためのベ
クターが全身的に（例えば、血流によって）又は局部に（例えば、腫瘍中に）投
与される。
【００４１】 本発明の本質的な利点は、組換えＡＡＶベクターのパッケージング効率を実際
に損失させずに、−したがって、感染性のための基本的な前提条件を実際に損失
させずに−ＡＡＶ構造タンパク質の本発明による突然変異誘発によってウイルス
のカプシド内で抗原性を変化させることができることである。それ故、本発明は
、患者の免疫化低減が望ましい場合に、例えば身体の遺伝子療法のための細胞の
ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入に特に適している。
【００４２】 下記実施例は、本発明を限定せずに、本発明を詳細に例示するように意図され
る。
【００４３】 実施例１ ＶＰ３におけるＰ１突然変異： 出発点は、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．
）のＢａｍＨＩ切断部位中にｐＡＶ２（ＡＴＣＣ３７２６１，ｒｅｆ．５３）の
４．８ｋｂ ＢｇｌＩＩフラグメントをサブクローニングすることによって製造
されたプラスミドｐＵＣ−ＡＶ２であった。該プラスミド中の一定の部位におい
て当業者に知られたＰＣＲ補助突然変異誘発によって突然変異を生じさせた。こ
れはＰ１、ラミニンフラグメントのＲＧＤ結合モチーフ(Aumailly et al. (1990
) FEBS Lett. 262, 82-86)を含有するＡＡ配列 QAGTFALRGDNPQGを含む１４ＡＡ
ペプチドをコードする配列をヌクレオチド２９８５、３３４５及び３９６３の後
に挿入することを包含する。これは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質におけるアミ
ノ酸２６１、３８１及び５８７（ＡＡＶ２のＶＰ−１におけるＮ末端の始点から
のアミノ酸（ＡＡ）後に数えられるＡＡ数に応じて名付けられる）後の挿入に相
当する。その後のＰＣＲでは、各場合に２つの突然変異特異性プライマーが用い
られ、キャップ遺伝子のみを含有し、ｐＵＣ−ＡＶ２から２．２ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｓｐＭＩフラグメントを切り取って、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ切断部位に
それを挿入することによって形成されるプラスミド、ｐＣａｐが鋳型として用い
られる。続いて、ＰＣＲ産物を細菌中で増幅し、配列決定して、Ｐ１を含有する
１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ−ＸｃｍＩフラグメントを、対応する野性型キャップ配
列が切り取られているｐＵＣ−ＡＶ２中にサブクローニングする。その結果とし
て、ＡＡ挿入後に部位ｐＩ−２６１、ｐＩ−３８１及びｐＩ−５８７と名付けら
れるプラスミド（変異体）は完全なＡＡＶ２ゲノムを含有した。対応する突然変
異タンパク質はＩ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７と呼ばれる。
【００４４】 実施例２ ＡＡＶ２粒子の産生 ＨｅＬａ細胞（ヒト頚部上皮細胞系）を実施例１のプラスミドによってトラン
スフェクトし、約２０時間インキュベートしてから、アデノウイルス型５によっ
て感染させた。感染後７２時間に、細胞を破壊して、ＡＡＶ２粒子をＣｓＣｌ勾
配で精製した。
【００４５】 実施例３ 実施例１のカプシド変異体の特徴付け これらの実験の意図は、カプシド変異体がウイルスゲノムをパッケージして、
完全なカプシドを形成することができるかどうかを確認することであった。実施
例２による変異体のＡＡＶ２粒子がウイルスゲノムを有するかどうか、もし有す
るならば、如何に多くの粒子がウイルスゲノムを有するのか、及び如何に多くの
ＤＮＡがカプシド変異体中にパッケージされているかを知るために、実施例２に
よる変異体のＡＡＶ２粒子を試験した。このために、実施例２で精製したウイル
ス粒子（変異体と野性型）をＤＮＡｓｅで処理し、ブロッティングして、Ｒｅｐ
プローブとハイブリダイズさせた。
【００４６】 これから生ずるタイターは野性型との量的又は質的な差異を示さなかった（表
１参照）。ウイルスはゲノムをパッケージする能力を保持した。 さらに、カプシドも形成されることを電子顕微鏡分析によって確認することが
できた。
【００４７】 それ故、正確なフォールディング、カプシド構築又はゲノムのパッケージング
のために重要である領域では、突然変異は行なわれなかった。本発明のＡＡＶ粒
子の機能は損なわれない。
【００４８】 実施例４ 実施例１のカプシド変異体の抗原性 突然変異カプシドの抗原性を察知することができるために、さらなる実験にお
いてＥＬＩＳＡにＡ２０モノクローナル抗体（Ａ２０ＭＡｂ）を用いた。Ａ２０
ＭＡｂは野性型の完全に構築されたＡＡＶ２カプシドと特異的に反応する（Wist
uba et al., (1997), J.Virol. 71, 13411352)。この場合にも、結果を表１に示
す。これから、Ａ２０モノクローナル抗体は、変異体Ｉ−２６１及びＩ−３８１
中への挿入によって、野性型及びＩ−５８７とは対照的にもはや結合することが
できないことが分かる。
【００４９】
【表１】
【００５０】 ゲノムウイルスタイター（ドット−ブロット）とＡ２０カプシドＥＬＩＳＡに
よるタイターとを示す。濃度は粒子数／ｍｌで記載する。“ｎ．ｍ．”は“測定
不能”を意味する。
【００５１】 実施例５ 実施例１のカプシド変異体による感染試験 カプシド変異体Ｉ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７のトロピズム(tropism
)を試験するために、細胞系Ｃｏ−１１５の細胞を突然変異ウイルスによって感
染させた。Ｃｏ−１１５細胞を用いて、ビリオンの野性型受容体トロピズムを試
験した、この理由は野性型ＡＡＶ２によって後者に形質導入することができるか
らである。感染後３日目に、ウイルスＲｅｐタンパク質が発現したかどうかを知
るために、細胞を抗Ｒｅｐ抗体を用いて免疫蛍光測定によって調べた（Wistuba
et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 6
9, 5311-5319)。細胞を顕微鏡スライド上で７０％集密度まで増殖させ、無血清
培地中でアデノウイルス５と一緒に、種々な濃度の本発明のウイルス製剤と共に
インキュベートした。３日間後に、免疫蛍光アッセイにおいてＲｅｐタンパク質
合成のｉｎ ｓｉｔｕ検出によって、ウイルス製剤のタイターを測定した（Ｒｅ
ｐタイター）。この場合に、Ｗｉｓｔｕｂａ等の方法(Wistuba et al. (1997) J
. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319)に
よって、ＡＡＶ２感染細胞に関して免疫蛍光染色を行なった。顕微鏡スライドを
ＰＢＳによって１回洗浄し、メタノール中で固定し（５分間、４℃）、次に、ア
セトンによって処理した（５分間、４℃）。次に、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質
と反応するモノクローナル抗体７６−３と共に、これらの細胞を室温において１
時間インキュベートした。これに続いて、洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で
１：５０に希釈して、ローダミン結合抗マウス二次抗体と共に１時間インキュベ
ートした。蛍光陽性細胞に達したウイルスストック溶液の最後に限定した希釈度
からタイターを算出した。
【００５２】 Ｒｅｐ陽性ＣＯ１１５細胞は、野性型ＡＡＶ２及び変異体Ｉ−２６１とＩ−５
８７による感染後に、検出可能であり、この場合に変異体の感染性は野性型の感
染性よりも２〜３桁低かった、又は１つの変異体は感染性ではなかった（Ｉ−３
８１）（表２）。しかし、変異体Ｉ−２６１に関しては、低減した抗原性にも拘
わらず（実施例４参照）感染性が保持された。
【００５３】
【表２】
【００５４】 野性型感受性ＣＯ１１５細胞のタイターを示す。これらのタイターは野性型に
関してと同様にＩ−２６１、Ｉ−３８１及びＩ−５８７に関してＲｅｐ ＥＦＵ
／ｍｌで表される。この場合に、ＥＦＵは発現形成単位（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）を意味する。さらに、“ｎ．ｍ．”は“測定不能
”を意味する。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/075 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 リート，マルティーン ドイツ連邦共和国デー−86697 ジニング， アム・ローヴァルト 36 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA95Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 AA14 AA24 AA27 BA01 BA08 BA23 BA34 BA35 BA37 BA41 CA01 CA25 MA02 NA01 NA06 NA13 ZB072 4C087 AA01 BC83 CA16 CA20 MA02 NA01 NA06 NA13 ZB07 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA01 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 構造タンパク質がウイルスの抗原性を低減させる修飾を少な
    くとも１つ含むことを特徴とする、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパ
    ク質。
  2. 【請求項２】 修飾が、ウイルスの感染性をごく僅かに低減させることを特
    徴とする、請求項１記載の構造タンパク質。
  3. 【請求項３】 突然変異した構造タンパク質が粒子形成する能力があること
    を特徴とする、請求項１又は２に記載の構造タンパク質。
  4. 【請求項４】 修飾ＶＰ１、修飾ＶＰ２及び／又は修飾ＶＰ３から選択され
    ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
  5. 【請求項５】 ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／
    又はＡＡＶ６に由来する、並びにこれらに、特にＡＡＶ２に由来する他のＡＡＶ
    血清型に由来することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の構造タン
    パク質。
  6. 【請求項６】 修飾（単数又は複数）がウイルス表面に局限されることを特
    徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の構造タンパク質。
  7. 【請求項７】 修飾（単数又は複数）が構造タンパク質のＮ末端に局限され
    ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の構造タンパク質。
  8. 【請求項８】 修飾が、１つ以上のアミノ酸又はアミノ酸配列に対する１つ
    以上の高分子量又は低分子量化合物、例えばビオチン、単糖若しくはオリゴ糖、
    ヒドロキシル基又はＦａｂフラグメントの共有結合又は非共有結合に基づくもの
    であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質。
  9. 【請求項９】 修飾が、突然変異、例えば点突然変異、複数個のアミノ酸の
    突然変異、１つ以上の欠失、１つ以上の挿入又はこれらの突然変異の組み合わせ
    であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の構造タンパク質。
  10. 【請求項１０】 タンパク質若しくはペプチド、好ましくは免疫抑制性タン
    パク質若しくはペプチドが挿入されることを特徴とする、請求項９記載の構造タ
    ンパク質。
  11. 【請求項１１】 構造タンパク質が少なくとも１つの他の修飾を含むことを
    特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の構造タンパク質。
  12. 【請求項１２】 該他の修飾（単数又は複数）がウイルスの感染性の変化を
    もたらすことを特徴とする、請求項１１記載の構造タンパク質。
  13. 【請求項１３】 該他の修飾（単数又は複数）が１つ以上の欠失、１つ以上
    の挿入、又はこれらの修飾の組み合わせであることを特徴とする、請求項１１又
    は１２のいずれかに記載の構造タンパク質。
  14. 【請求項１４】 該挿入が細胞膜受容体リガンド、Ｒｅｐタンパク質若しく
    はペプチド、免疫抑制性タンパク質若しくはペプチド、及び／又は異種遺伝子の
    二本鎖合成のためのシグナルを有するタンパク質若しくはペプチドであることを
    特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の構造タンパク質。
  15. 【請求項１５】 該挿入が、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイ
    ン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結
    合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、抗体結合構造又はエピトープか
    ら選択されることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれかに記載の構造タン
    パク質。
  16. 【請求項１６】 該修飾（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸の
    ＸｈｏＩ切断部位における１つ以上の挿入によってもたらされることを特徴とす
    る、請求項１〜１５のいずれかに記載の構造タンパク質。
  17. 【請求項１７】 該修飾（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸の
    ＢｓｒＢＩ切断部位における１つ以上の挿入によってもたらされることを特徴と
    する、請求項１〜１６のいずれかに記載の構造タンパク質。
  18. 【請求項１８】 該修飾（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸の
    ＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の１つ以上の欠失と、１つ以上の挿入とに
    よってもたらされることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の構造
    タンパク質。
  19. 【請求項１９】 該修飾（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸の
    ＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によってもたらされることを特
    徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の構造タンパク質。
  20. 【請求項２０】 該修飾（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸の
    ＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の１つ以上の欠失によってもたらされるこ
    とを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の構造タンパク質。
  21. 【請求項２１】 ＶＰ３における１つ以上の挿入が、ＹＫＱＩＳ ＳＱＳＧ
    Ａ、ＹＬＴＬＮ ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ ＰＱＳＧ
    Ｖ、ＮＰＶＡＴ ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ ＶＤＴＮ
    Ｇから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に局
    限されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の構造タンパク質
    。
  22. 【請求項２２】 ＡＡＶ粒子の形態、特にＡＡＶカプシドの形態である、請
    求項１〜２１のいずれかに記載の構造タンパク質。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜２２のいずれかに記載の構造タンパク質をコー
    ドする核酸。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載の核酸を含む細胞。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜２１のいずれかに記載の構造タンパク質の製造
    方法であって、請求項２３記載の細胞を培養し、適当である場合には、発現され
    た構造タンパク質を単離することを特徴とする前記方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜２１のいずれかに記載の構造タンパク質、請求
    項２２記載の核酸及び／又は請求項２３記載の細胞及び／又は、適当である場合
    には、賦形剤及び／又は添加剤を含む薬剤。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜２１のいずれかに記載の少なくとも２つの異な
    る構造タンパク質を含む薬剤であって、各構造タンパク質が異なる修飾を有する
    ことを特徴とする前記薬剤。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜２１のいずれかに記載の少なくとも２つの異な
    る構造タンパク質を含むキットであって、該キット内で各構造タンパク質が他の
    構造タンパク質（単数又は複数）から分離して存在することを特徴とする前記キ
    ット。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜２１のいずれかに記載の構造タンパク質、請求
    項２２記載の核酸及び／又は請求項２３記載の細胞の、ＡＡＶの抗原性を変える
    ため、細胞を形質転換するため及び／又は遺伝子療法のための使用。
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