ES2263481T3

ES2263481T3 - Proteina estructural de virus adenoasociados con propiedades cromatograficas modificadas.

Info

Publication number: ES2263481T3
Application number: ES00951400T
Authority: ES
Inventors: Michael Hallek; Anne Girod; Martin Ried; Christof Stolla; Ulrich Moebius
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 1999-07-19
Filing date: 2000-07-18
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2020-07-18
Also published as: EP1198580A1; CA2379564A1; US20100105123A2; US7285381B1; WO2001005991A1; ATE328101T1; JP2003505033A; AU6435400A; AU777885B2; DE50012863D1; JP4938189B2; CA2379564C; US20080241906A1; DE19933719A1; US20090246854A2; US20090098634A2; EP1198580B1

Abstract

Uso de una proteína estructural de virus adenoasociados (VAA) para la purificación de VAA y/o partículas de VAA, caracterizado porque la proteína estructural contiene al menos una mutación en forma de una inserción, que produce una modificación de las propiedades cromatográficas del virus y que se sitúa tras al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG.

Description

Proteína estructural de virus adenoasociados con propiedades cromatográficas modificadas.

La presente invención se refiere a una proteína estructural de virus adenoasociados, que contiene al menos una mutación, que produce una modificación de las propiedades cromatográficas, a su producción y uso.

El virus VAA pertenece a la familia de los parvovirus. Estos se caracterizan por una cápsida icosaédrica no cubierta con un diámetro de desde 18 hasta 30 nm, que contiene una cadena de ADN sencilla de aproximadamente 5 kb. Para un aumento eficaz de los VAA es necesaria una coinfección de la célula huésped con virus auxiliares, por ejemplo con adenovirus, virus herpes, virus vaccinia. En ausencia de un virus auxiliar el VAA pasa a un estado latente, pudiendo integrarse el genoma del virus en el genoma de la célula huésped de manera estable. La propiedad del VAA de integrarse en el genoma de la célula huésped lo convierte en especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos. Para las funciones del vector son suficientes en general las dos secuencias de repetición terminales invertidas de aproximadamente 145 pb de longitud (ITR: "Inverted Terminal Repeats"). Éstas aportan las señales "cis" necesarias para la replicación, el empaquetamiento e integración en el genoma de la célula huésped. Para el empaquetamiento en partículas vectoriales recombinantes se transfecta un plásmido auxiliar, que contiene los genes para las proteínas no estructurales (proteínas rep) y para las estructurales (proteínas cap), en células adecuadas para el empaquetamiento, por ejemplo células HeLa o 293, que en base a esto se infectan con adenovirus. Tras unos días se obtiene un lisado, que contiene partículas recombinantes de VAA. Plásmidos auxiliares adecuados se describen por ejemplo por Chiorini et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541 o por Girod et al. (1999), Nat. Med.

La cápsida de VAA se compone de tres proteínas diferentes: VP1, VP2 y VP3, cuyos porcentajes relativos son el 5% de VP1, el 5% de VP2%, y el 90% de VP3. Los genes de las cápsidas de VAA se localizan en el extremo derecho del genoma de VAA y se codifican mediante secuencias solapantes del mismo marco de lectura abierto (ORF) utilizando diferentes codones de iniciación así como dos transcriptores empalmados de diferente manera. El gen VP1 contiene la secuencia génica completa del VP2, que a su vez contiene la secuencia génica completa del VP3 con una zona N-terminal específica. El hecho de que los marcos de lectura solapantes codifiquen para las tres proteínas de cápsida de VAA, es responsable de la expresión obligatoria de todas las proteínas de cápsida aunque en porcentajes distintos.

Las masas moleculares de las proteínas de las cápsidas son de 87 kD para VP1, 73 kD para VP2 y 62 kD para VP3. Las secuencias de los genes de cápsidas se describen por ejemplo en Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro. Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 6922-6930 o Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319. El mapa físico y genético del genoma de VAA se describe por ejemplo en Kotin, R. M. (1994) Human Gene Theray, 5, 793-801.

Además se conocen diversos serotipos de VAA, de los cuales el serotipo 2 de VAA humano (VAA2) es el mejor estudiado. En estos análisis se ha demostrado, que los virus VAA como vectores viriales poseen propiedades ventajosas para la terapia génica somática. Las ventajas fundamentales son la ausencia de patogenicidad hacia los humanos, la integración estable del ADN viral en el genoma celular, la capacidad de infectar células que no se están dividiendo, la estabilidad de virión, que posibilita la purificación obteniendo títulos (de 10^{13} a 10^{14} partículas por ml), la escasa antigenicidad así como la falta de genes virales y productos génicos en el vector recombinante VAA, lo cual es ventajoso desde el punto de vista de la seguridad para su uso en la terapia génica. La clonación de genes en el vector VAA se lleva acabo entre tanto según los métodos conocidos en general por del experto, tal como se describen por ejemplo en los documentos WO 95/23 867, en Chiorini, J. A. et al. (1995), Human Gene Therapy, 6, 1531-1541 o en Kotin, R. M. (1994), anteriormente.

Para el uso de VAA como vector de transducción viral se precisan en general títulos elevados de partículas recombinantes de VAA. Debido a la relativamente baja producción de partículas dada por la naturaleza, es un camino para obtener títulos elevados un enriquecimiento eficaz de las partículas. Además las partículas para aplicaciones en vivo deben estar lo más libres de impurezas posible, que pueden estar compuestas de componentes celulares, ADN, proteínas, virus auxiliares, y componentes del medio. Por eso es necesario disponer de una purificación mejorada para partículas VAA.

Una posibilidad fundamental para la purificación la ofrece la cromatografía. En este procedimiento físico de separación la separación de las sustancias se lleva a cabo mediante la distribución entre una fase móvil y una estacionaria. Dependiendo de los procesos físicos puede dividirse la cromatografía en dos grupos: la cromatografía de adsorción con un sólido como fase estacionaria y la cromatografía de distribución en el caso de dos fases inmiscibles entre sí, apareciendo en la mayoría de los casos formas mixtas. El procedimiento de separación de una sustancia en la cromatografía depende a este respecto de sus propiedades cromatográficas, especialmente de su tamaño, de su carga, de su capacidad de adsorción, así como de su afinidad específica, de su hidrofobicidad, etc. Por consiguiente las propiedades cromatográficas ofrecen un punto de partida central, para conseguir a través de una modificación una mejora de la purificación y por consiguiente por ejemplo un enriquecimiento o una mayor pureza, permitiéndose así una modificación total, por ejemplo con respecto al tipo natural, una separación y con esto una mejor purificación.

Procedimientos de purificación para VAA, en especial por medio de cromatografía, se describen en el documento WO 97/08298, pero no una mutación de las proteínas estructurales de VAA. Por lo demás se remite en el documento WO 96/00587 a proteínas de fusión de cápsida VAA, que no interfieren con la formación de cápsidas y que deben contener epítopos heterólogos de antígenos de relevancia clínica, mediante lo cual sólo debe inducirse una respuesta inmunológica. La publicación contiene además sólo una nota general sobre las proteínas de fusión sin indicar con más detalle la viabilidad, especialmente en sitios de inserción. Una modificación de las propiedades cromatográficas especialmente para la mejora de la purificación no se describen por ejemplo mediante la modificación de las afinidades.

Por tanto el objetivo de la presente solicitud era cambiar las propiedades de purificación del virus VAA, especialmente de una proteína estructural con respecto al tipo natural.

Sorprendentemente se descubrió, que las proteínas estructurales o de cápsida pueden modificarse de tal manera que se obtienen con esto una modificación de las propiedades cromatográficas.

Por tanto un objeto de la presente invención se refiere al uso de una proteína estructural de virus adenoasociados (VAA) para la purificación de VAA y/o las partículas VAA, conteniendo la proteína estructural al menos una mutación en forma de una inserción, que provoca una modificación de las propiedades cromatográficas del virus y que se localiza en un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG. A este respecto se prefiere, que la modificación de las propiedades cromatográficas permita una mejora de la purificación, especialmente un enriquecimiento del virus, preferiblemente de las partículas de virus, para dar títulos más elevados, una purificación para dar una mayor pureza y/o una purificación eficaz. Mediante las propiedades cromatográficas modificadas puede lograrse por ejemplo en una etapa de depuración más eficaz y/o más específica para partículas de virus en el marco de una purificación, que conduce a títulos más elevados de partículas, a partículas más puras o a una purificación más eficaz. El título de partículas recombinantes puede determinarse por ejemplo mediante la adición de una disolución que contiene partículas en una serie de dilución sobre una membrana e hibridando esta membrana con ADN de VAA marcado. Mediante la identificación del ADN hibridado puede averiguarse cuantitativa o cualitativamente la concentración de partículas según la realización del ensayo. La pureza de las partículas puede determinarse mediante la razón de la proteína estructural o de las proteínas de partícula con respecto a las proteínas de partículas foráneas. Una purificación más eficaz en el sentido de la presente invención tiene lugar cuando la purificación consta por ejemplo de menos etapas, transcurre con mayor velocidad o especialmente siendo más barata en la realización para la aplicación a gran escala.

En el sentido de esta invención tiene lugar una modificación de las propiedades cromatográficas del virus unida con una mejora de la purificación por ejemplo ya cuando la mutación provoca únicamente un traslado del fenómeno de elución a una columna cromatográfica, o sea por ejemplo hacia concentraciones de sal más altas o más bajas. Un problema general en la purificación cromatográfica es que se eluyen con la misma fracción y con el mismo contenido en sal las fracciones del producto deseadas (por ejemplo partículas de virus) y fracciones de impurezas (otros virus, virus de tipo natural, restos de lisados celulares, ADN, proteínas, especialmente proteínas del suero). Mediante una mutación selectiva según la invención y el desplazamiento unido a ésta del comportamiento de elución, entonces la fracción con las partícula de virus mutadas, deseadas ya no se eluye con la fracción impureza, sino en otra fracción de elución (por ejemplo -según la carga- a concentraciones de sal más altas o más bajas). En ciertas circunstancias, pero no siempre, a este respecto los desplazamientos para dar concentraciones altas de sal presentan ventajas especiales, por ejemplo a través de la inserción de aminoácidos en su mayoría de carga negativa o positiva o His-Tag en la proteína de cápsida, ya que las impurezas son en la mayoría de los casos componentes pequeños y se eluyen con los procedimientos de purificación habituales en la mayoría de los casos a bajas concentraciones de sal. Los mutantes de cápsida se unen mejor entonces por ejemplo al material de la columna y se eluyen más tarde, o sea a altas concentraciones de sal. Un efecto deseado adicional debido a la incorporación de aminoácidos con carga es la posibilidad de cargar un intercambiador de iones con concentraciones de sal más elevadas, mediante lo cual puede reducirse la cantidad de material de
columna necesario, lo que facilita el manejo así como ahorra costes en un procedimiento de fabricación industrial.

Se prefiere especialmente, que la mutación en la proteína estructural según invención no provoque una reducción esencial de la infectividad del virus, pero especialmente también aumente la infectividad. Por infectividad se entiende en el sentido de esta invención la capacidad de transducir células.

Una conformación adicional de esta invención es que la proteína estructural modificada con respecto al tipo natural VAA presente un aumento de la estabilidad térmica. De esta manera sería posible en el caso de un aumento de la estabilidad térmica una mejor activación por calor de otros microorganismos o virus no deseados, tal como es el caso para el tipo natural VAA. Las proteínas estructurales de este tipo pudieron determinarse fácilmente porque se sometió a ensayo un gran número de mutantes con respecto a su estabilidad térmica.

Por lo demás la proteína estructural modificada preferiblemente todavía puede formar partículas, es decir forma una cápsida icosaédrica, especialmente en forma de una cápsida de VAA, ya que las partículas o cápsidas son especialmente adecuadas. La formación de las partículas puede probarse por ejemplo mediante microscopía electrónica. Otra comprobación es el procedimiento de sedimentación durante una centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio con una comprobación posterior, opcional, del ADN viral contenido en las partículas.

En general la(s) mutación(ones) puede(n) encontrarse en la proteína estructural VP1, VP2 y/o VP3, prefiriéndose la proteína estructural VP1 y/o la VP3. Por lo demás puede derivarse la proteína estructural de todos los serotipos de VAA, especialmente de serotipos humanos, preferiblemente de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6, sobre todo de VAA2, VAA3 y/o VAA6.

En una forma de realización preferida se insertan aminoácidos de una secuencia funcional, que son adecuados para la cromatografía de afinidad.

Por cromatografía de afinidad se entiende un método de la cromatografía, que se basa en la capacidad de determinadas partes asociadas tales como antígeno-anticuerpo, enzima-sustrato, etc., de reconocerse entre sí y de interactuar entre sí. A este respecto se fija en la mayoría de los casos una de las partes en un sorbente cromatográfico como soporte, al que se une entonces el componente que corresponde específicamente. Posteriormente se eluye con pH modificado, otra fuerza iónica o por ejemplo análogos del componentes que corresponde. Por consiguiente se comprende también la cromatografía covalente por ejemplo a través de la formación de puentes disulfuro y la cromatografía hidrófoba, en la que se aprovechan interacciones hidrófobas.

Especialmente puede seleccionarse el aminoácido insertado del grupo siguiente: un ligando de un receptor o el receptor de un ligando, un anticuerpo o parte de un anticuerpo, especialmente un epítopo de un anticuerpo, un antígeno o un epítopo de un antígeno, una hormona, un receptor de una hormona, una enzima, un sustrato enzimático, una lectina y/o un aminoácido que porta azúcar.

Preferiblemente estos pueden ser:

\bullet: un péptido rico en histidina (His-TAG), que permite una purificación a través de un medio de afinidad de quelato metálico;

\bullet: un péptido con varias cargas, que modifica el procedimiento de unión o de elución durante una cromatografía en intercambiador iones y así configura de una manera más específica o más eficaz una etapa de purificación de este tipo;

\bullet: la glutatión-S-transferasa (GST-Tag), que permite una purificación a través de un medio de afinidad de glutatión;

\bullet: una parte F_{c} de un anticuerpo, que permite una purificación a través de un medio de afinidad de proteína A o proteína G;

\bullet: un dominio de unión que forma inmunoglobulina, por ejemplo la proteína A o proteína G o partes de las mismas, que permite una purificación a través de un medio de afinidad con un anticuerpo o un parte F_{c} de un anticuerpo;

\bullet: un determinado epítopo de un anticuerpo, que permite una purificación a través de un medio con anticuerpos acoplados, que son específicos para el epítopo;

\bullet: una lecitina, que permite una purificación a través de un medio de glucoproteína;

\bullet: un sitio de unión a ácido nucleico, que permite una purificación a través de medios de ácido nucleico;

\bullet: un sitio de unión a heparina, que permite una purificación a través de un medio de heparina, existiendo ya un sitio de unión a heparina intrínseco en el tipo natural VAA, de modo que un sitio de unión adicional únicamente reforzaría la unión;

\bullet: estreptavidina, que permite una purificación a través de biotina o proteínas biotiniladas;

\bullet: un ligando determinado, que permite una purificación a través de un medio con el receptor correspondiente o

\bullet: un receptor determinado, que permite una purificación a través de un medio con el ligando correspondiente.

También se prefieren una integrina, una citocina o un dominio de unión a un receptor de una citocina, integrina o factor de crecimiento, un anticuerpo de cadena sencilla que se une a un receptor de la superficie celular, un anticuerpo contra las estructuras de la superficie celular, un epítopo y/o una estructura que se une a anticuerpos.

En una forma de realización preferida se inserta un péptido con por ejemplo de 5 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 20 aminoácidos y especialmente de 10 a 18 aminoácidos. El péptido tiene por ejemplo la secuencia QAGTFALRGDNPQG o una secuencia, que es muy homóloga a ésta. En el caso de estos ligandos especialmente preferidos se trata del péptido P1, que representa un péptido de 14 aminoácidos de longitud de la secuencia núcleo de un cadena alfa de la familia de la laminina. Esta secuencia es por ejemplo suficiente, para reconocer un receptor de integrina, que entre otros interviene en la endocitosis de partículas virales, por ejemplo de adenovirus. El péptido P1 se une independientemente de su conformación (lineal o circular) al receptor de integrina. Según la presente invención se introduce la secuencia de ADN codificante del péptido P1 en el gen que codifica para una proteína estructural de VAA, que se encuentra por ejemplo en un plásmido auxiliar. Tras el empaquetamiento con el plásmido auxiliar mutante se obtiene VAA recombinante con P1 en la cápsida (rVAA-P1). Para la inserción de este péptido pudo demostrarse, que estas partículas de VAA en comparación con las partículas de VAA sin modificar ya se eluyen con una conductividad menor de un intercambiador de cationes y así, según las condiciones, permiten una separación mejorada (por ejemplo del tipo natural) y una purificación.

Se prefiere especialmente una proteína estructural según la invención, que contiene al menos una mutación adicional. Por esto debe entenderse, que la proteína estructural además de una mutación, que provoca una modificación de las propiedades cromatográficas del virus, también contiene una mutación adicional, que no necesariamente provoca también una modificación de las propiedades cromatográficas del virus. Aquí se prefiere especialmente una mutación adicional, que provoca una modificación, preferiblemente un aumento, de la infectividad del virus.

Otro objeto preferido de la presente invención es una proteína estructural de VAA, en la que la(s) mutación(ones) adicional(es) provoca(n) una reducción de la antigenicidad.

Por antigenicidad se entiende en el sentido de esta invención la iniciación tanto de una formación de como una unión a anticuerpos debido al sistema inmunitario. El término comprende también la inmunogenicidad, es decir la iniciación de una respuesta inmunitaria. Por tanto por reducción de la antigenicidad se entiende la reducción de la formación de y la unión a anticuerpos tanto por la reducción de los epítopos antigénicos, como por la reducción de la acción antigénica de determinados epítopos o por la modificación y la eliminación de determinados epítopos existentes en el tipo natural. A este respecto la antigenicidad modificada puede referirse tanto a la respuesta inmunitaria tanto humoral como celular.

En otra forma de realización preferida la(s) mutación(ones) adicional(es) representa(n) una o varias deleciones y/o una o varias inserciones en la proteína estructural o combinaciones de las modificaciones mencionadas. A este respecto la inserción es preferiblemente la inserción de un ligando de receptor de la membrana celular, una proteína o péptido rep, por ejemplo en forma de un dominio rep, de una proteína o péptido inmunosupresor y/o una proteína o péptido con una señal para la síntesis de doble cadena de un transgén o gen foráneo. A este respecto se prefiere por ejemplo el péptido P1 (QAGTFALRGDNPQG) (véase anteriormente).

Ejemplos de inserciones en el caso de la mutación adicional son entre otros la integrina, citocina o dominios de unión a receptor de citocinas, integrinas o factores de crecimiento, tales como por ejemplo GM-CSF, IL-2, IL-12, CD40L, TNF, NGF, PDGF o EGF, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular, los denominados anticuerpos "de cadena sencilla" (scFv), por ejemplo anticuerpos de cadena sencilla que se unen a los receptores de superficie CD40, CD40L, B7, CD28 o CD34, o epítopos o sitios de unión a receptores, que por ejemplo pueden ser reconocidos por su parte por determinados anticuerpos, por ejemplos anticuerpos monoclonales anti-CD40L, o por sustancias químicas u hormonas, por ejemplo catecolamina.

En una forma de realización preferida de la mutación adicional se insertan estructuras que se unen a anticuerpos, tales como por ejemplo proteína A, proteína G o anticuerpos anti-F_{c}, o partes de estos. A estos se acoplan a su vez anticuerpos específicos contra determinadas estructuras de la superficie celular (por ejemplo contra el CD40 en células linfáticas o contra el CD34 en células hematopoyéticas).

Preferiblemente la mutación(ones) se localiza(n) en la superficie del virus. Para la determinación de las zonas localizadas en la superficie de la proteína estructural se encontró sorprendentemente según la presente invención, que las estructuras y secuencias de CPV y VAA2 son comparables. Por tanto puede recurrirse preferiblemente a estructuras cristalinas conocidas de parvovirus tales como parvovirus B19 o de CPV (parvovirus canino) y con ayuda de comparación de homología identificar dominios de proteína, que se localizan sobre la superficie del virus. Por tanto, según la presente invención por ejemplo una comparación asistida por ordenador entre CPV y VAA2 o parvovirus B19 y VAA2 de manera sorprendentemente reproducible ha conducido a la identificación de lazos (loops) en VP3, cuya secuencia varía, es decir que poseen una homología reducida y que se localizan previsiblemente sobre la superficie del virus. Ya que los antígenos para la respuesta inmunitaria están disponibles para los anticuerpos y por consiguiente deben estar sobre la superficie del virus, estos lazos representan candidatos preferidos para las mutaciones. Así se tomó como patrón la estructura cristalina conocida de la proteína de cápsida VP2 de CPV (por ejemplo Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu y Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244) debido a la elevada similitud con la VP3 de VAA2 en la estructura secundaria de la proteína, para descubrir las regiones, que están expuestas sobre la superficie de la cápsida y que debido a la secuencia de aminoácidos local son suficientemente flexibles, para por ejemplo superar la inserción de una secuencia de péptidos. A este respecto se prestó especial atención con mucho cuidado, a que no se seleccionara ningún elemento estructural secundario de la proteína de cápsida VAA2, que desestabilizara la cápsida.

En una forma de realización preferida se localizan la(s) mutación(ones) en el extremo N-terminal de la proteína estructural, ya que se descubrió, que por ejemplo en el caso de los parvovirus CPV y B19 el extremo N-terminal se encuentra en la superficie celular.

Otra posibilidad para la determinación de las zonas localizadas en la superficie de las proteínas estructurales es una comparación de las secuencias de aminoácidos que codifican para las cápsidas de diferentes serotipos de VAA. Para esto puede recurrirse por ejemplo a secuencias de ADN conocidas de diferentes serotipos de VAA, tales como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 o VAA6, para los análisis estructurales de posibles morfologías de cápsida de por ejemplo VAA2, pudiendo calcular desde el inicio posibles estructuras terciarias y asignar zonas de secuencia debido a las propiedades de los aminoácidos generalmente conocidas a las zonas de cápsida internas o externas. Así pudieron determinarse por ejemplo según la presente invención posibles sitios de inserción en la zona de VP3 de la cápsida VAA2, que permitieron la inserción por ejemplo de péptidos y su expresión sobre la superficie del virus (véase a continuación).

En otra forma de realización preferida existen una o más inserciones en la proteína estructural VP3 (Rutledge, E. A. et al. (1998) anteriormente) antes y/o tras al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG, ya que estos sitios se encuentran en los sitios expuestos de un lazo, siendo el riesgo reducido, de modificar la estructura de VP3.

La(s) inserción(ones) se realiza(n) según métodos conocidos en general mediante la inserción en el gen que codifica para la proteína estructural. Las inserciones pueden incorporarse mediante métodos conocidos en general por ejemplo por medio de hidrólisis mediante endonucleasas de restricción de los genes correspondientes de la proteína estructural y posterior reacción de la ligasa. La expresión posterior del gen mutado conduce a la proteína estructural según la invención.

Un objeto de la presente invención es también el uso según la invención de la proteína estructural en forma de una partícula de VAA, especialmente en forma de una cápsida de VAA, ya que las partículas o cápsidas son especialmente adecuadas como soportes de compuestos seleccionados, por ejemplo vectores de transducción rVAA.

La presente descripción se refiere también a un ácido nucleico, preferiblemente un ARN o ADN, especialmente un ADN de doble cadena, que codifica para una proteína estructural según la invención, y a una célula, preferiblemente una célula de mamífero por ejemplo una célula COS, célula HeLa o célula 293, que contiene el ácido nucleico en cuestión. Las células de este tipo son adecuadas por ejemplo para la producción de las partículas de VAA recombi-
nantes.

Por tanto la presente descripción se refiere también a un procedimiento para la producción de la proteína estructural en cuestión, especialmente para la producción de la proteína estructural en cuestión en forma de una partícula de VAA, cultivándose una célula adecuada, que contiene un ácido nucleico, que codifica para la proteína estructural correspondiente y dado el caso aislándose la proteína estructural expresada. Por ejemplo puede purificarse y aislarse la proteína estructural correspondiente cromatográficamente.

La presente descripción se refiere también a un fármaco, que contiene la proteína estructural en cuestión, a un ácido nucleico correspondiente y/o a un célula correspondiente y dado el caso a excipientes o aditivos adecuados tales como por ejemplo una disolución de cloruro de sodio fisiológica, estabilizantes, inhibidores de la proteinasa, o ADNasa, etc.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de la proteína estructural en cuestión, para la purificación de VAA y partículas de VAA, para la modificación del tropismo de VAA, para la modificación de la antigenicidad de VAA, para la transformación de una célula, especialmente una célula, que antes era poco accesible para una infección de VAA, tal como por ejemplo una célula hematopoyética, para la dirección genómica, para el diagnóstico, para los estudios de eficacia y/o (en forma de vectores rVAA adecuados) para la terapia génica. Por terapia génica se entiende una forma de terapia, mediante la cual se expresa un gen efector, en la mayoría de los casos una proteína, mediante la introducción de ácidos nucleicos en células. Se diferencian principalmente procedimientos in vitro e in vivo. En los procedimientos in vitro se eliminan células del organismo y se transducen ex vivo con vectores, para posteriormente introducirse de nuevo en el mismo o en otro organismo. En la terapia génica in vivo se aplican por ejemplo para el control de tumores, de manera sistémica (por ejemplo a través de la vía sanguínea) o directamente en el tumor, el tejido o los órganos.

Una ventaja esencial de la presente invención es, que mediante la mutagénesis según la invención de proteínas estructurales de VAA a través de la modificación de las propiedades cromatográficas pueden conseguirse nuevas posibilidades para procedimientos de purificación más específicos esencialmente sin pérdida de la eficacia de empaquetamiento de los vectores VAA recombinantes en la cápsida del virus. Con esto se consiguen las condiciones, para purificar VAA o partículas de VAA para dar títulos más elevados y/o para dar una mayor pureza y de configurar la depuración de una manera más eficaz y más económica. Esto a su vez permite la aplicación a escala industrial de VAA recombinantes para las transformaciones celulares y terapia génicas a escala comercial.

Las siguientes figuras y ejemplos pretenden explicar la invención con más detalle, sin limitarla.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el cromatograma para una muestra de VAA del tipo natural en una pasada a través de una columna de intercambio catiónico POROS 50HS. Se representa el volumen de flujo frente a la conductividad (eje y izquierdo) y frente a la absorción a 280 nm (eje y derecho). Las partículas de VAA se eluyen en las fracciones 12 y 13, lo que de media corresponde a una conductividad de 30 mS/cm (NaCl 300 mM) (véase la raya horizontal
gruesa).

La figura 2 muestra el cromatograma para una muestra de VAA compuesta de partículas de VAA mutadas (inserción del péptido QAGTFALRGDNPQG tras el aminoácido 587; 1-587 según el ejemplo 3) en una pasada a través de una columna de intercambio catiónico POROS 50HS. Se representa el volumen de flujo frente a la conductividad (eje y izquierdo) y frente a la absorción a 280 nm (eje y derecho). Las partículas de VAA modificadas se eluyen en las fracciones 6 y 7, lo que de media corresponde a una conductividad de 22 mS/cm (NaCl 220 mM) (véase la raya horizontal gruesa).

Ejemplos

Ejemplo 1

Por medio de mutagénesis asistida por PCR y cortes con las enzimas de restricción XhoI, BrsBI o HindIII se produjeron las mutaciones siguientes:

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Mutaciones en la VP1

a): Deleción entre los sitios de corte XhoI-XhoI de la VP-1 (\DeltaXho; 62 aminoácidos, AA) (Hermonat et al. (1984) Journal of Viriology 51, 329-339),

b): deleción entre los sitios de corte BsrBI y HindII de la VP-1, que se encuentra dentro de la deleción a) anterior y comprende 29 AA (\DeltaBH);

c): deleción entre BsrBI y HindII. así como la inserción de un ligando (péptido P1) (\DeltaBH+L); y

d): inserción total del ligando (péptido P1) en el sitio de corte BsrBI (B+L).

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Mutaciones en la VP3

a): ins261; YKQIS SQSGA

b): ins381; YLTLN NGSQA

c): ins447; YYLSR TNTPS

d): ins534; EEKFF PQSGV

e): ins573; NPVAT EQYGS

f): ins587; LQRGN RQAAT

g): ins713; NVDFT VDTNG

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(Nomenclatura según el número de aminoácidos (AA) contados tras los AA desde el comienzo del extremo N-terminal en la VP-1 de VAA2, enmarcados en cada caso por 5 aminoácidos de los mismos que se encuentran en el extremo N-terminal y 5 de los mismos que se encuentran en el extremo C-terminal; el AA, tras el cual se ha introducido la inserción, está representado en negrita).

También es posible, que en los cinco AA inmediatamente contiguos, que se encuentran junto al aminoácido marcado en negrita, también se introduzca una inserción, ya que éstas están también dentro de un lazo de la cápsida de VAA-2.

Ejemplo 2

Caracterización de los mutantes de cápsida

Tras llevar a cabo las mutaciones en el genoma VAA-2 y tras el empaquetamiento de los virus mutados con el gen reportero LacZ se determinaron los títulos de los vectores físicos mediante inmunotransferencia en mancha (Dot-Blot) y título de cápsida con el ELISA de anticuerpo A20 y se llevaron a cabo las primeras pruebas de infección sobre células HeLa. Mediante esto pudo averiguarse si las mutaciones alteran la estructura de las proteínas VP o la interacción entre las diversas proteínas VP de tal manera que el empaquetamiento no tiene lugar o se altera
(Tabla 1).

TABLA 1 Eficacia del empaquetamiento de los mutantes de virus producidos

Cepa viral	Título genómico viral	Título de la cápsida
		(ELISA con A20-MAb)
Cápsida de tipo natural	1,10^{12}	1-10^{11}
Mutantes VP-1
\Deltaxho	6,10^{12}	5,10^{10}
\DeltaBH	8,10^{11}	4,10^{9}
\DeltaBH+L	1,10^{13}	5,10^{10}
B+L	3,10^{12}	5,10^{9}
Mutantes VP3
ins261 1	1,10^{10}	< 10^{8}
ins381	3,10^{10}	< 10^{8}
ins447	1,10^{12}	4,10^{10}
ins534	1,10^{10}	< 10^{8}
ins573	3-10^{10}	< 10^{8}
ins587	1,10^{12}	2\cdot10^{10}
ins713	5,10^{10}	< 10^{8}

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Se muestran los títulos genómicos (inmunotransferencia en mancha) y los títulos de cápsida (ELISA de cápsida A20). Las concentraciones se indican en partícula/ml.

Pudo demostrarse para los 4 mutantes VP-1, que las mutaciones no influyen en la eficacia de empaquetamiento y que todos los virus mutados podían empaquetarse con títulos buenos similares así como vectores con cápsida no mutada (10^{11} a 10^{13} partículas geonómicas/ml). También pudieron empaquetarse con éxito los vectores VAA con mutaciones en la zona VP3 (10^{10}-10^{12} partículas genómicas/ml).

Ejemplo 3

Mutación P1 en VP3

En primer lugar se partió de un plásmido pUC-AV2, que se produjo mediante subclonación del fragmento BgIII de 4,8 kb del pAV2 (ATCC37261, ref. 53) en el sitio de corte BamHI del pUC19 (New England BioLabs Inc.). Por medio de la mutagénesis asistida por PCR conocida por el experto, se llevaron a cabo mutaciones en sitios definidos del plásmido. A este respecto se introdujo una secuencia que codifica para P1, un péptido de 14 AA, con la secuencia de AA QAGTFALRGDNPQG, que contiene el motivo de unión RGD de un fragmento de laminina (Aumailly et al. (1990) FEBS Lett. 262, 82-86) tras los nucleótidos 2985, 3543 y 3963. Esto corresponde a una inserción tras los aminoácidos 261, 447 y 587 de la proteína de cápsida VAA2 (nomenclatura según el número de los aminoácidos (AA) contados tras el AA a partir del comienzo del extremo N-terminal en la VP-1 de VAA2). En la PCR posterior se utilizan respectivamente 2 cebadores específicos de mutación y como matriz un plásmido, pCap, que sólo contiene el gen cap y se forma, porque se corta el fragmento EcoRI-BspMI de 2,2 kb del pUC-Av2 y se introduce en el sitio de corte del EcoRI del pUC19. Posteriormente se amplifican en bacterias los productos de la PCR, se secuencian y se subclona el fragmento EcoNI-XcmI de 1,4 kb, que contiene P1 en pUC-AV2, en la que se cortó la secuencia cap correspondiente del tipo natural. Por consiguiente los plásmidos (mutantes) denominados según los sitios de inserción de AA pI-261, pI-381, pI-447 y pI-587 contenían el genoma completo del VAA2. Se denominan las correspondientes proteínas mutadas como I-261, I-381, I-447 e I-587.

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Ejemplo 4

Producción de partículas VAA2

Se transfectaron células HeLa (una línea celular del epitelio del cuello humana) con los plásmidos según el ejemplo 1, entonces se incubaron aproximadamente durante 20 h y posteriormente se infectaron con el adenovirus de tipo 5. 72 h tras la infección se abrieron las células y se purificaron las partículas VAA2 mediante un gradiente de
CsCl.

Ejemplo 5

Caracterización de los mutantes de cápsidas según el ejemplo 3

En estos ensayos debía determinarse si los mutantes de cápsidas empaquetan el genoma viral y si pueden formar cápsidas completas. Las partículas del VAA2 de los mutantes según el ejemplo 4 se examinaron si el genoma del virus porta partículas y en caso afirmativo cuántas y cuánto ADN estaba empaquetado en los mutantes de cápsida. Para esto se trataron las partículas del virus purificadas (mutantes y tipo natural) según el ejemplo 4 con ADNasa, se sometieron a una inmunotransferencia y se hibridaron con una sonda rep.

El título resultante no mostraba ninguna diferencia cuantitativa o cualitativa en comparación con el tipo natural (véase la tabla 2). Los virus mantuvieron la capacidad para empaquetar el genoma.

Mediante el análisis con microscopio electrónico pudo confirmarse además que también se forma la cápsida.

Por tanto no se llevaron a cabo las mutaciones en zonas que son de importancia para el plegado correcto, la composición de la cápsida o el empaquetamiento del genoma. Las partículas VAA según invención no se ven alteradas en su función.

Para poder detectar si las cápsidas mutadas se forman completamente y que no muestran ninguna antigenicidad modificada, se utilizaron en un experimento adicional anticuerpos A20 monoclonales (A20-Mab) en un ELISA. Los A20-Mab reaccionan de manera específica con cápsidas compuestas en su totalidad por VAA2 del tipo natural (Wistuba et al., (1997), J. Virol. 71, 1341-1352). También aquí se representan los resultados en la tabla 2. A este respecto se muestra que no se altera la formación de cápsidas mediante la inserción en los mutantes I-477 y 1-587, mientras que en I-261 el anticuerpo monoclonal A20 no se une, pero lo que se debe, ya que a pesar de todo se forman las cápsidas según análisis con el microscopio electrónico, a una modificación de la antigenicidad.

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TABLA 2 Eficacia de empaquetamiento y antigenicidad de los mutantes del virus según el ejemplo 3

Cepa viral	Título del genoma viral	ELISA con A20-MAb
Cápsida del tipo natural	8,10^{13}	6,10^{12}
Mutantes
I-261	1,10^{12}	n.m
1-381	1,10^{12}	n.m
1-447	1-10^{13}	8-10^{11}
I-587	4-10^{13}	3,10^{12}

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Se muestran los títulos de los genomas virales (inmunotransferencia en mancha) y el título con el ELISA de cápsida A20. Se indican las concentraciones en partículas/ml. "n.m." quiere decir "no medible".

Ejemplo 6

Comportamiento de elución modificado de los mutantes de cápsida

Se cargaron los VAA recombinantes del tipo natural (en Hepes 20 mM, pH 6,8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM) sobre una columna de intercambio catiónico POROS 20HS de 0,8 ml (Perkin-Elmer, Weiterstadt). Se sometió con la ayuda de un sistema Äkta (Pharmacia) a un gradiente de 30 volúmenes de columna de NaCl de desde 100 hasta 700 mM en Hepes 20 mM de 6,8. Según análisis de inmunotransferencia el VAA se eluía en las fracciones 12 y 13, lo que corresponde a una elución del VAA del tipo natural a 30 mS/cm (= aproximadamente NaCl 300 mM) (véase la
figura 1).

Se aplicó sobre la misma columna de intercambio catiónico POROS 20 HS de 0,8 ml (véase anteriormente) el mutante de cápsida (1-587 según el ejemplo 3) del VAA (el péptido P1 QAGTFALRGDNPQG se inserta tras el aminoácido 587; en PBS, pH 6,8). Se eluyó en sistema Äkta con un gradiente de 30 volúmenes de columna de NaCl 50-1.000 mM en Hepes 20 mM pH 6,8. El mutante de VAA se encontraba según el análisis de inmunotransferencia en las fracciones 6 y 7. Esto corresponde a una elución de aproximadamente 22 ms/cm (= aproximadamente NaCl 220 mM) (véase la figura 2).

Esto muestra que a través de la inserción del péptido QAGTFALRGDNPQG se modifica el comportamiento de elución de las partículas VAA de tal manera, que con el mismo pH las partículas mutadas se eluyen en una concentración salina menor que las partículas del tipo natural. Con esto se desplaza la fracción de virus hacia otras fracciones, en ciertos casos con menos impurezas o que son simplemente más adecuadas. Por tanto es posible modificar las propiedades cromatográficas de las partículas VAA mediante inserciones, deleciones o demás modificaciones de las proteínas de las cápsidas. Especialmente pueden construirse en una variante de la inserción mostrada, cápsidas de mutantes según la invención, por medio de la introducción de aminoácidos que contienen principalmente cargas positivas, por ejemplo en los sitios de inserción mostrados en los ejemplos, que en comparación con el tipo natural (que se eluye en un pico más ancho y con menos impurezas) se eluyen a concentraciones de sal más altas. La afinidad del mutante hacia el material de la columna se refuerza, de manera que la elución no tiene lugar hasta concentraciones de sal altas, o sea en zonas, que habitualmente están menos contaminadas por proteínas foráneas más
pequeñas.

Ejemplo 7

Pruebas de infección con mutantes según el ejemplo 3

Para someter a prueba el tropismo de los mutantes I-261, I-381, I-447 y I-587 de cápsida se infectaron con los virus mutados las líneas celulares Co-115 y B16F10. Se utilizaron las células Co-115 para someter a prueba el tropismo del receptor de tipo natural de los viriones, ya que éstos pueden transducirse con VAA2 de tipo natural y que no se unen al péptido P1. Se utilizó la línea celular B16F10 por los motivos ya mencionados en el ejemplo 9. Tres días tras la infección se examinaron las células mediante medición de inmunofluorescencia con ayuda de un anticuerpo anti-rep para probar si se expresa la proteína rep viral (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319). Se cultivaron las células hasta una confluencia del 70% sobre portaobjetos y se incubaron en un medio libre de suero junto al adenovirus 5 con distintas concentraciones de preparaciones virales según la invención. Tres días más tarde se determinó el título de las preparaciones virales mediante la detección in situ de la síntesis de proteína rep en un ensayo de inmunofluorescencia (título rep). A este respecto se llevó a cabo la coloración de inmunofluorescencia con células infectadas con VAA2 según un método de Wistuba et al. (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol. 69, 5311-5319). Se lavaron los portaobjetos una vez con PBS, se fijaron en metanol (5 min, 4ºC) y posteriormente se trataron con acetona (5 min, 4ºC). Entonces se incubaron las células durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo monoclonal 76-3, que reacciona con proteínas rep del VAA2. Posteriormente se lavó y se incubó durante una hora con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a la rodamina con una dilución de 1:50 en PBS con un 1% de BSA. Se calcularon los títulos a partir de la última dilución limitante de la solución de partida viral, que habían conducido a células de fluorescencia
positiva.

Pudieron detectarse células CO115 rep positivas tras la infección con VAA2 de tipo natural y con los mutantes I-261, I-447 e I-587. En las células Co115 la infectividad de I-261, I-587 y 1-447 era de dos a tres órdenes de magnitud inferior que la del tipo natural (tabla 3). La transfección de las células B16F10 era igual de ineficaz con I-447 que aquella con el virus de tipo natural. En clara oposición a esto pueden detectarse tras infección con I-587 las células B16F10 positivas rep, determinándose el título del virus 1-587 en 1 x 10^{6} Rep-EFU/ml (tabla 3).

Para examinar si se estableció una transfección de las células B16F10 mediante el mutante 1-587 específicamente a través de la interacción entre la secuencia P1 sobre la superficie de la cápsida mutada y la superficie del receptor de la integrina sobre la superficie de las células B16F10, se incubaron las células antes de la infección con el virus o bien con el RGDS competidor o bien con el péptido RGES inactivo en concentraciones de 200 \mumol. La adición del péptido RGDS neutralizó la infectividad de 1-587 hacia las células B16F10 (tabla 3), mientras que el péptido de control RGES no tuvo ningún efecto.

TABLA 3 Título viral en la superficie celular

Cepa viral	Título en células CO115	Título en células B16F10
		-RGDS	+RGDS
Cápsida de tipo natural	2,10^{9}	< 1
Mutantes
I-261	7,10^{6}	nd	nd
I-381	n.m.	nd	nd
I-447	1\cdot10^{6}	< 1	nd
I-587	1\cdot10^{7}	1\cdot10^{6}	< 1
rVAA/LacZ	5\cdot10^{7}	< 1	nd
Mutantes
rVAA(I-587)/LacZ	6\cdot10^{5}	5\cdot10^{4}	< 1

Se muestran las títulos de las células CO115 que son vulnerables al tipo natural y las células B16F10 que son resistentes al tipo natural. Se expresan los títulos para I-447 e I-587 como el tipo natural en Rep-EFU/ml y para rVAA/LacZ y rVAA(I-587)/LacZ en LacZ-EFU/ml. A este respecto EFU significa unidades formadoras de expresión (Expressing Forming Unit) y nd significa "no determinado". "n.m" significa "no medible".

Ejemplo 8

Ensayo de infección de los mutantes según el ejemplo 3 con galactosidasa

Se produjeron en un ensayado basado en el ejemplo 6 vectores rVAA con un gen reportero LacZ, que contenían o bien el tipo natural (virión rVAA) o bien I-587 (virión rVAA(I-587)). Se denominaron las preparaciones virales rVAA/LacZ y rVAA(I-587)/LacZ y se usaron para la infección de las células B16F10 o CO115 (controles).

Se sometieron a pruebas las células infectadas tres días tras la infección mediante una coloración X-Gal para determinar la expresión de la \beta-galactosidasa. A este respecto se utilizó la prueba in situ X-Gal para la coloración citoquímica (título Lacz). Tras esto, para someter a prueba la expresión de la \beta-galactosidasa, se lavaron las células una vez con PBS y después se fijaron con glutaraldehído al 1,5%. Posteriormente se trataron las células con X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido), tal como ya describió Chiorini et al. (1995) Hum. Gen. Ther. 6, 1531-1541. Se calcularon los títulos a partir de la última dilución limitante de la solución madre viral, que habían conducido a células productoras de \beta-galactosidasa.

En los controles en las células CO115 ambos viriones eran infecciosos, pero sin embargo rVAA (I-587)/LacZ era dos órdenes de magnitud menos eficaz. En el tipo B16F10 no se encontraron (como era de esperar) tras la infección con rVAA/LacZ células de \beta-galactosidasa positivas. Por el contrario tras la infección con rVAA(I-587)/LacZ se encontraron de manera sorprendente considerablemente muchas células de de \beta-galactosidasa positivas. Se determinó el título de rVAA-(I-587)/LacZ con 5 x 10^{4} LacZ-EFU por ml. Se mejoró la infectividad de los vectores rVAA frente a las células B16F10 en más de cuatro órdenes de magnitud mediante la mutación según la invención (tabla 3).

<110> MediGene Sociedad Anónima

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<120> proteína estructural de virus adenoasociados con propiedades cromatográficas modificadas, su producción

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\hskip-.1em\dddseqskip

y uso

\hfill

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<140> 199 33 719.5-41

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<141> 17.07.1999

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<160> 18

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<170> Microsoft Word 97

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

Gln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Arg Gly Asp Asn Pro Gln Gly

\hfill

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

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<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

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<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Asn Pro Val Ala Thr

\hfill

5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

Glu Gln Tyr Gly Ser

\hfill

5

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<210> 8

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> virus adenoasociado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

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<400> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser

\hfill

10

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<210> 15

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> VP3 mutada de virus adenoasociado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly

\hfill

10

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<210> 17

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

Arg Gly Asp Ser

\hfill

4

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<210> 18

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> secuencia sintética

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<220>

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<223> péptido de laminita mutado

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<400> 18

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Arg Gly Glu Ser

\hfill

4

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Claims

1. Uso de una proteína estructural de virus adenoasociados (VAA) para la purificación de VAA y/o partículas de VAA, caracterizado porque la proteína estructural contiene al menos una mutación en forma de una inserción, que produce una modificación de las propiedades cromatográficas del virus y que se sitúa tras al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG.

2. Uso de una proteína estructural según la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación de las propiedades cromatográficas posibilita una mejora de la purificación, especialmente un enriquecimiento del virus, preferiblemente de la partícula del virus, hasta títulos más elevados, una purificación hasta una mayor pureza y/o una purificación más eficaz.

3. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la mutación no produce una disminución notable de la infectividad del virus.

4. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína estructural puede formar partículas.

5. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína estructural aumenta la estabilidad térmica.

6. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se selecciona de la VP1 mutada, VP2 mutada y/o VP3 mutada.

7. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se derivada de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6 así como otros serotipos de VAA derivados de éstos, especialmente de VAA2.

8. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se insertan aminoácidos de una secuencia funcional, que preferiblemente son adecuados para la cromatografía de afinidad.

9. Uso de una proteína estructural según la reivindicación 8, caracterizado porque se selecciona la secuencia de aminoácidos insertada de un ligando de un receptor o del receptor de un ligando, de un anticuerpo o parte de un anticuerpo, especialmente de un epítopo de un anticuerpo, de un antígeno, o de un epítopo de un antígeno, de una hormona, de un receptor de una hormona, de una enzima, de un sustrato enzimático, de una lectina, de un aminoácido portador de azúcares, especialmente de un péptido rico en histidina (His-Tag), de un péptido con múltiples cargas, de glutatión-S-transferasa (GST-Tag), de una parte F_{c} de un anticuerpo, de un dominio de unión a inmunoglobulina, por ejemplo proteína A o proteína G o parte de las mismas, de una lecitina, de un sitio de unión a ácidos nucleicos, de un sitio de unión a heparina, de un ligando específico, de un receptor específico, de una integrina, de una citocina o de un dominio de unión al receptor de una citocina, integrina o factor de crecimiento, de un anticuerpo de cadena sencilla que se une a un receptor de la superficie celular, de un anticuerpo contra estructuras de la superficie celular, de un epítopo y/o de una estructura que se une a anticuerpos.

10. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque se inserta un péptido, que tiene la secuencia QAGTFALRGDNPQG.

11. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína estructural contiene al menos una mutación adicional.

12. Uso de una proteína estructural según la reivindicación 11, caracterizado porque la(s) mutación(ones) adicional(es) producen una modificación de la infectividad del virus.

13. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque la(s) muta-
ción(ones) adicional(es) producen una disminución de la antigenicidad del virus.

14. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la(s) muta-
ción(ones) adicional(es) es (son) una (o varias) deleción(ones), una (o varias) inserción(ones) o una combinación de las modificaciones mencionadas.

15. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la inserción es un ligando del receptor de la membrana celular, una proteína o péptido rep, una proteína o péptido inmunosupresor y/o una proteína o péptido con una señal para la síntesis de la doble cadena del gen foráneo.

16. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la inserción se selecciona de una integrina, de una citocina o de un dominio de unión al receptor de una citocina, integrina o factor de crecimiento, de un anticuerpo de cadena sencilla que se une a un receptor de la superficie celular, de un anticuerpo contra estructuras de la superficie celular, de una estructura de unión a anticuerpos o de un epítopo.

17. Uso de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 16 en forma de una partícula de VAA, especialmente en forma de una cápsida de VAA.