ES2273498T3 - Proteina estructural de vaa, produccion y uso de la misma. - Google Patents
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Abstract
Proteína estructural de virus adenoasociados (VAA), caracterizada porque la proteína estructural contiene al menos una mutación, que provoca un incremento de la infecciosidad del virus y que se localiza en la superficie del virus, y porque la proteína estructural mutada puede producir partículas.
Description
Proteína estructural de VAA, producción y uso de
la misma.
La presente invención se refiere a una proteína
estructural de un virus adenoasociado (VAA), que contiene al menos
una mutación, que provoca un aumento de la infecciosidad.
El virus VAA pertenece a la familia de los
Parvovirus. Éstos se caracterizan por una cápside icosaédrica no
envuelta con un diámetro que representa desde 18 hasta 30 nm, que
contiene ADN lineal de cadena simple de aproximadamente 5 kb. Para
una multiplicación eficaz de VAA es necesaria una coinfección de la
célula huésped con virus auxiliares, por ejemplo con adenovirus,
herpesvirus o virus Vaccinia. En ausencia de un virus auxiliar el
VAA pasa a un estado latente, pudiendo el genoma del virus
integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped. La
característica de VAA, de integrarse en el genoma de la célula
huésped, lo hace especialmente interesante como vector de
transducción para células de mamíferos. Para las funciones del
vector bastan generalmente ambas secuencias de repetición
terminales invertidas de aproximadamente 145 pb de longitud (ITR:
"Inverted Terminal Repeats", Repeticiones terminales
invertidas). Éstas llevan las señales necesarias "cis" para la
replicación, empaquetamiento e integración en el genoma de la célula
huésped. Para el empaquetamiento en partículas recombinantes de
vector, se transfecta un plásmido de vector, que porta los genes
para proteínas no estructurales (proteínas rep) y para proteínas
estructurales (proteínas cap), en células apropiadas de
empaquetamiento, por ejemplo, las células Hela o 293, que después
se infectan con un adenovirus.
Después de algunos días se obtiene un lisado,
que contiene partículas recombinantes de VAA.
La cápside de VAA se compone de tres proteínas
distintas: VP1, VP2 y VP3, cuyos porcentajes relativos son el 5% de
VP1, el 5% de VP2 y el 90% de VP3. Los genes de la cápside de VAA se
localizan en el extremo terminal derecho del genoma de VAA y se
codifican a través de secuencias superpuestas del mismo marco de
lectura abierto (ORF, Open Reading Frame) utilizando distintos
codones de iniciación. El gen de VP1 contiene la secuencia genética
completa de VP2, que a su vez contiene la secuencia genética
completa de VP3 con una región de extremo
N-terminal específica. El hecho, de que los marcos
de lectura abiertos superpuestos codifican para las tres proteínas
de la cápside de VAA, es responsable de la expresión obligatoria de
todas las proteínas de la cápside, aunque con porcentajes
distintos.
Las masas moleculares de las proteínas de la
cápside son 87 kD para VP1, 73 kD para VP2 y 62 kD para VP3. Las
secuencias de los genes de la cápside se describen por ejemplo en
Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45,
555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro.
Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al.
(1992), J. Virol., 66, 6922-6930 o Rutledge, E. A.
et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319. El mapa
genético y físico del genoma de VAA ha sido descrito, por ejemplo,
por Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy, 5,
793-801.
Además se conocen diferentes serotipos de VAA,
de los cuales el serotipo 2 de VAA (VAA2) humano representa un
vector vírico con propiedades favorables para la terapia génica
somática. Las ventajas esenciales son la ausencia de patogenicidad
para los humanos, la integración estable del ADN viral en el genoma
celular, la capacidad de infectar células no divisorias, la
estabilidad del virión, lo que posibilita la purificación hasta
títulos elevados (10'' partículas por ml), la baja inmunogenicidad
así como la ausencia considerable de genes virales y productos
génicos en el vector recombinante de VAA, que es ventajoso bajo
aspectos de seguridad para el uso en la terapia génica. La
clonación de genes en el vector de VAA se realiza entretanto según
los métodos conocidos en general por el experto, tal como se
describen, por ejemplo, en el documento WO 95/23 867, por Chiorini,
J. A. et al. (1995), Human Gene Therapy, 6,
1531-1541 o por Kotin, R. M. (1994), véase
anteriormente.
En general, el VAA2 tiene, por ejemplo, un
espectro de acción amplio. Se infectan muy eficazmente (al
70-80%) los tejidos epiteliales, tales como líneas
celulares tumorales epiteliales humanas, pero también material
tumoral primario, tal como carcinoma ovárico o cervical o melanoma,
y queratinocitos humanos, mientras que las células hematopoyéticas,
tales como las células linfo-hematopoyéticas se
infectan con una eficacia (el 0,5-5%) de 10 a 100
veces menor (Mass et al. (1998) Human Gene Therapy, 9,
1049-1059). Un motivo para esto podría ser que para
la incorporación de VAA en la célula sea necesaria una interacción
entre el VAA y un receptor de VAA en la superficie de la célula.
Así por ejemplo el receptor de VAA2 primario putativo es una
glicoproteína de membrana celular de 150 kD (Mizukami, H. et
al. (1996), Virology, 217, 124-130) o un
proteoglicano de heparán sulfato (Summerford, C. y Samulski, R. J.
(1998), J. Virol., 72, 1438-1445). Se han
determinado como receptores secundarios posibles: la integrina
_{\alpha}V_{\beta}5 (Summerford et al., (1999) Nature
Medicine 5, 78-82) y el receptor 1 del factor de
crecimiento del fibroblasto humano (Qing et al., (1999)
Nature Medicine 5, 71-77). Estudios de enlace
mostraron entonces que se reduce espesar la densidad de la
superficie de este receptor sobre células que no se infectan
eficazmente mediante VAA2.
Ahora se conoce que pueden introducirse sitios
de unión para receptores en la cápside mediante una modificación
genética de las proteínas de la cápside de retrovirus y adenovirus,
que sólo se expresan en determinadas células y por consiguiente se
ha posibilitado una selección como objetivo mediada por el receptor
de vectores (véase por ejemplo Cosset, F. L. y Russell, S. J.
(1996), Gene Ther., 3, 946-956, Douglas, J. T.
et al. (1996), Nat. Biotechnol., 14,
1574-1578, Krasnykh, V. N. et al. (1996), J.
Virol., 70, 6839-6846, Stevenson, S. C. et
al. (1997), J. Virol., 71, 4782-4790 o Wickham,
T. J. et al. (1996), Nat. Bitotechnol., 14,
1570-1573). En el documento WO 96/00587 se remite
también a proteínas de fusión de la cápside de VAA, que deben
contener antígenos clínicamente relevantes de epítopos heterólogos,
mediante lo cual debe inducirse una respuesta inmunitaria y, que no
deben interferir con la formación de la cápside. Sin embargo la
publicación contiene sólo una indicación general sin datos más
detallados de la viabilidad, especialmente de sitios de inserción
apropiados. Steinbach et al. (1997) (Biol. Abstr. 104, Ref.
46570) se ocuparon del ensamblaje in vitro de partículas de
VAA, que anteriormente se expresaron en el sistema de baculovirus.
Se realizan también mutaciones en el gen cap, pero que no deben
llevar a una modificación del tropismo, sino a un constructo de
plásmidos, en el que sólo se expresa una proteína VP,
respectivamente. No se menciona una modificación de la
infecciosidad. Ruffing et al. (1994) (J. Gen. Virol. 75,
3385-3392) intentaron analizar el tropismo natural
de VAA2. Para este fin se introdujeron mutaciones en el extremo
C-terminal de la proteína VP de VAA2, habiéndose
partido de la hipótesis (equivocada debido a datos de partida
falsos), para modificar un motivo RGD. La mutación provocó
únicamente una infecciosidad reducida.
Se conoce una selección indirecta como objetivo
a partir de Bartlett et al. (1999; Nat. Biotechnol. 17,
181-186). A este respecto se usó un anticuerpo
biespecífico, que se dirigía tanto contra la cápside de VAA2 como
contra una célula diana. Sin embargo la cápside vírica ni se unió
covalentemente ni se modificó ni se mutó una proteína de la
cápside. Hasta el momento el único intento de selección directa como
objetivo de VAA2 ha sido llevado a cabo por Yang et al.
(1998; Hum. Gene Ther. 1, 1929-1937). A este
respecto se fusionaron fragmentos de anticuerpos de cadena simple
contra la molécula CD34 con el extremo N-terminal de
VP2, se insertaron directamente en el extremo
N-terminal de VP1. Este método muestra sin embargo
dos inconvenientes claros. Por un lado el título infectante era muy
bajo y por otro lado, debía expresarse conjuntamente la proteína de
fusión para un empaquetamiento exitoso con proteínas de cápside
VP1, VP2 y VP3 no mutadas. Sin embargo, de aquí se obtuvo como
resultado una mezcla de proteínas de cápside de tipo natural y
quiméricas, cuya composición y por tanto la acción no podrían
preverse. Por lo demás también se redujo considerablemente la
eficacia del empaquetamiento y la infecciosidad a través del
receptor de tipo natural en las células HeLa con respecto al tipo
natural.
Por tanto el objetivo de la presente invención
consiste en modificar VAA de tal modo que sea posible una
transferencia de genes más eficaz y más específica que con los
vectores de VAA conocidos.
Sorprendentemente se ha encontrado ahora que las
proteínas de cápside o estructurales pueden modificarse de tal modo
que con ello se provoca un aumento de la infecciosidad.
Por tanto un objeto de la presente invención es
una proteína estructural de VAA, que al menos contiene una
mutación, que provoca un aumento de la infecciosidad y que está
localizada en la superficie del virus, siendo apta la proteína
estructural para la formación de partículas. Mediante el aumento de
la infecciosidad puede conseguirse, por ejemplo, una transferencia
de gen eficaz y específica de tejido poco infectado, tal como por
ejemplo tejido hematopoyético. Con la modificación y especialmente
el aumento en el sentido de esta invención no se entiende ninguna
modificación o aumento general sino una modificación o aumento
específico, es decir con respecto a un tipo de células determinado.
Por consiguiente también están comprendidos por aumento de la
infecciosidad los casos, en los que se reduce la infecciosidad para
células determinadas y se aumenta solamente para otro tipo de
células u otros varios tipos de células.
Según la invención se localiza(n)
la(s) mutación (mutaciones) en la superficie del virus. Para
la determinación de las regiones localizadas en la superficie de
las proteínas estructurales se encontró de manera sorprendente,
según la presente invención, que las estructuras y secuencias CPV y
VAA2 pueden compararse. Por tanto puede recurrirse preferiblemente
a las estructuras cristalinas conocidas de parvovirus tales como de
parvovirus B19 o de CPV (Canine-Parvovirus,
parvovirus canino) e identificarse dominios de proteínas con ayuda
de comparaciones de homología, que son importantes para la
interacción del receptor VAA/VAA y éstas pueden modificarse. Por
tanto según la presente invención, por ejemplo, una comparación
asistida por ordenador entre CPV y VAA2 o parvovirus B19 y VAA2
reproducible, ha conducido sorprendentemente a la identificación de
lazos (loops) en VP3, cuya secuencia varía, es decir que poseen una
homología reducida y que pueden ser responsables del tropismo o la
distinta infecciosidad del virus. Así se tomó la estructura
cristalina conocida de la proteína de cápside de CPV VP2 (por
ejemplo Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211;
Wu y Rossman (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244)
debido a la similitud elevada para el VP3 de VAA2 en la estructura
secundaria de la proteína como patrón, para descubrir las regiones
que se exponen en la superficie de la cápside viral y que son
suficientemente flexibles debido a la secuencia de aminoácidos
local, para superar la inserción de una secuencia de péptidos. A
este respecto se reparó cuidadosamente en que no se seleccionara
ningún elemento de estructura secundaria de la proteína de cápside
de VAA2, que desestabilizara la cápside.
Otra posibilidad para la determinación de las
regiones localizadas en la superficie de las proteínas
estructurales es una comparación de las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican para la cápside de diferentes serotipos de
VAA. Para esto puede recurrirse, por ejemplo, a secuencias de ADN
conocidas de diferentes serotipos VAA, tales como VAA2, VAA3, VAA4
o VAA6, para análisis estructurales de posibles morfologías de
cápside de, por ejemplo, VAA2, pudiéndose evaluar desde el inicio
estructuras terciarias posibles y pudiéndose asignar a las regiones
de cápside internas o externas regiones de secuencias debido, por lo
general, a las propiedades de aminoácidos conocidas. Así pudieron
determinarse, por ejemplo, según la presente invención siete sitios
de inserción posibles en la región VP3 de la cápside de VAA2, que
hicieron posible la inserción, por ejemplo, de un ligando y su
expresión en la superficie del virus (véase más adelante).
En una forma de realización preferida adicional
se localizan la(s) mutación (mutaciones) en el extremo
N-terminal de la proteína estructural, dado que se
encontró, por ejemplo, en el caso de los parvovirus CPV y B19 que
el extremo N-terminal se encuentra en la superficie
celular. A este respecto preferiblemente no se efectúa la mutación
directamente en el extremo N-terminal de VP1 sino
que se efectúa algunos aminoácidos más abajo, en el sentido del
extremo N-terminal.
En otra forma de realización preferida la
mutación provoca una modificación de la interacción del receptor de
la membrana celular - proteína, siendo el receptor de la membrana
celular preferiblemente una glicoproteína de aproximadamente 150 kD
y/o proteoglicano - heparán sulfato, tal como se ha descrito
anteriormente con detalle. Estos dos receptores son supuestamente
receptores primarios, que se complementan con al menos un receptor
secundario (véase más arriba).
Por lo general puede encontrarse la mutación en
la proteína estructural VP1, VP2 y/o VP3, prefiriéndose la proteína
estructural VP1 y/o la VP3. Además la proteína estructural mutada es
apta también para la formación de partículas, es decir para la
formación de una cápside icosaédrica. Además la proteína estructural
puede derivarse de todos los serotipos de VAA, especialmente de los
serotipos humanos, preferiblemente de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5
y/o VAA6, sobre todo de VAA2, VAA3 y/o VAA6. También pertenecen a
ellos los serotipos derivados de los serotipos mencionados,
especialmente VAA2.
En otra forma de realización preferida
la(s) mutación (mutaciones) representa(n) mutación
(mutaciones) pun-
tual(es), la(s) mutación (mutaciones) de varios aminoácidos, una o varias deleciones y/o una o varias inserciones así como combinaciones de estas mutaciones en la proteína estructural, siendo la inserción preferiblemente la inserción de un ligando de receptor de la membrana celular, un péptido o proteína rep, por ejemplo en forma de un dominio rep, un péptido o proteína inmunosupresora y/o una proteína o péptido con una señal para la síntesis de cadena doble del transgén o del gen foráneo.
tual(es), la(s) mutación (mutaciones) de varios aminoácidos, una o varias deleciones y/o una o varias inserciones así como combinaciones de estas mutaciones en la proteína estructural, siendo la inserción preferiblemente la inserción de un ligando de receptor de la membrana celular, un péptido o proteína rep, por ejemplo en forma de un dominio rep, un péptido o proteína inmunosupresora y/o una proteína o péptido con una señal para la síntesis de cadena doble del transgén o del gen foráneo.
Ejemplos de inserciones son entre otros las
integrinas, citocinas o dominios de unión del receptor de citocinas
o factores de crecimiento, tales como por ejemplo
GM-CSF, IL-2. IL-12,
CD40L, TNF, NGF, PDGF o EGF, de anticuerpos de cadena sencilla que
se unen a los receptores de la superficie celular, denominados
anticuerpos "de cadena sencilla" (scFv), por ejemplo, de los
anticuerpos de cadena sencilla que se unen a los receptores de
superficie CD40, CD40L, B7, CD28 o CD34, o epítopos o sitios de
unión del receptor que, por ejemplo, se reconocen por su parte por
anticuerpos determinados, por ejemplo, anticuerpos monoclonales
anti-CD40L o de sustancias químicas u hormonas, por
ejemplo catecolaminas. Ejemplos adicionales son también los
anticuerpos contra epitópos determinados tales como por ejemplo
"partículas de reconocimiento de células" o partes de
xenobióticos, tales como drogas, que se presentan parcialmente en la
superficie celular de determinadas células.
En una forma de realización preferida se
insertan estructuras que se unen a anticuerpos, tales como por
ejemplo proteína A, proteína G o anticuerpo anti-Fc,
o partes de éstas. A éstas se acoplan a su vez anticuerpos
específicos contra determinadas estructuras de superficie celular
(por ejemplo frente al CD40 en el caso de las células linfáticas o
frente al CD34 en el caso de las células hematopoyéticas). Con esto
se hace posible una utilización casi universal de las sustancias
que contienen la proteína estructural según la invención, dado que
prácticamente podría acoplarse cada anticuerpo, pudiendo tener lugar
entonces la utilización también de manera muy específica.
En el caso de esta selección indirecta como
objetivo puede producirse un vector de selección como objetivo de
VAA universal, que puede cargarse individualmente y según cada
aplicación con anticuerpos distintos, que se dirigen
respectivamente hacia distintos receptores de superficie o moléculas
de superficie específicos de la célula diana y a través de los
cuales se une el virus a la célula diana y a los cuales debe
infectar. Con esto se suprime la clonación individual de distintos
mutantes de VAA para los problemas de selección de objetivo
dirigidos. A este respecto los vectores o los mutantes de cápside
correspondientes según la invención, además de para la utilización
de los anticuerpos más diversos también pueden servir para
determinar receptores de superficie adecuados en las células diana,
que son adecuados para la unión a los virus o para su introducción
en las células, de tal modo que puedan seleccionarse receptores de
selección como objetivo en las células diana de manera rápida y
eficaz.
Especialmente se prefiere insertar el dominio Z
sencillo o múltiple (preferiblemente sencillo) de la proteína A,
especialmente en forma más corta y delecionada, por ejemplo, como la
proteína Z34C (Starovasnik et al., (1997), Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU 16:94, 10080-10085), y a este respecto en
determinadas circunstancias se produjo la deleción de algunos
aminoácidos en el sitio de deleción en la proteína de cápside. El
dominio Z de la proteína A y su inserción sucesiva doble en la
cápside de virus Sindbis se describe en Ohno et al. (1997)
Nat. Biotech. 15, 763-767. La proteína A se une por
cinco dominios independientes a la parte FC de los anticuerpos. El
dominio de unión más fuerte es el dominio Z o el B, de los que son
esenciales para la unión 33 aminoácidos. Esta estructura de unión
puede estabilizarse mediante dos puentes de cisteína (Starovasnik
et al., véase más arriba).
Un ligando especialmente preferido es, por
ejemplo, el péptido P1 (QAGTFALRGDNPQG), que representa un péptido
de 14 aminoácidos de longitud a partir de la secuencia del núcleo de
una cadena alfa de la familia de la laminina. Esta secuencia es
suficiente, por ejemplo, para reconocer un receptor de integrina que
entre otros media en la endocitosis de las partículas virales, por
ejemplo de adenovirus. El péptido P1 se une independientemente de
su conformación (lineal o circular) al receptor de integrina. Según
la presente invención se incorpora la secuencia de ADN codificante
del péptido P1 en el gen que codifica para una proteína estructural
de VAA que, por ejemplo, se encuentra en un plásmido auxiliar. Tras
el empaquetamiento con el plásmido auxiliar mutante se obtiene el
VAA recombinante con P1 en la cápside (rVAA-P1).
Otros ligandos posibles, que se insertan en los
sitios de inserción, son aquellos que solamente se unen a moléculas
de superficie celular a través de su carga, el tipo de la
composición de aminoácidos característica, y/o a través de su
glicosilación y/o fosforilación específica. A este respecto se
entiende como tipo de la composición de aminoácidos característica
el que, por ejemplo, ésta presenta restos aminoácidos que contienen
mayoritariamente grupos hidrófobos, hidrófilos, estéricamente
voluminosos, cargados o amino, ácido carboxílico, SH u OH. Con esto
las células pueden hacerse accesibles a través de un mecanismo
inespecífico para la transfección de VAA. A este respecto, por
ejemplo, muchas moléculas de superficie celular se glicosilan y se
fosforilan específicamente o se cargan negativamente y de este modo
pueden representar, por ejemplo, una diana para un mutante de VAA
con múltiples ligandos de aminoácidos cargados positivamente.
En una forma de realización preferida adicional
se origina(n) la(s) mutación (mutaciones) mediante
inserciones en el sitio de corte XhoI del ácido nucleico que
codifica para VP1 y en otra forma de realización preferida en el
sitio de corte BsrBI del ácido nucleico que codifica para VP1. Otra
forma de realización preferida de la proteína estructural según la
invención se origina mediante una deleción entre los sitios de corte
BsrBI-HindII del ácido nucleico que codifica para
VP1 y una o varias inserciones, preferiblemente en el sitio de la
deleción.
En una forma de realización preferida adicional
de la presente invención se origina(n) la(s) mutación
(mutaciones) mediante una o varias deleciones entre los sitios de
corte de XhoI-XhoI del ácido nucleico que codifica
para VP1, que comprende 62 aminoácidos (Hermonat, P. L. et
al. (1984), J. Virol., 51, 329-339). En una
forma de realización correspondiente y preferida adicional se
encuentra(n) la(s) deleción (deleciones) entre los
sitios de corte BsrBI-HindII del ácido nucleico que
codifica para VP1, que se encuentra dentro de la deleción descrita
anteriormente y que comprende 29 aminoácidos. Esta deleción tiene la
ventaja de que no tiene ningún solapamiento con el gen rep y por
tanto básicamente no influye en el mecanismo de empaquetamiento.
En otra forma de realización preferida se
encuentran una o varias inserciones en la proteína estructural VP3
(Rutledge, E. A et al., (1998) véase más arriba) antes y/o
después de al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de
YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS,
LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG, dado que estos sitios se encuentran en
los sitios expuestos de un lazo, siendo reducido el riesgo de que se
modifique la estructura de VP3.
La(s) mutación (mutaciones)
puntual(es), la(s) mutación (mutaciones) de varios
aminoácidos, la(s) deleción (deleciones) o la(s)
inserción (inserciones) se realiza(n) según los métodos
conocidos, por lo general mediante la deleción e inserción en el
gen que codifica para la proteína estructural. Las deleciones pueden
introducirse, por ejemplo, por medio de mutagénesis asistida por
PCR en los genes de la proteína estructural individuales. Las
inserciones pueden incorporarse según los métodos conocidos, por lo
general, por ejemplo, por medio de hidrólisis mediante nucleasas de
restricción de los genes de proteína estructural correspondientes y
la posterior reacción con ligasa.
Por medio de células adecuadas, que expresan un
receptor seleccionado, por ejemplo, el receptor
laminina-alfa, pero que se infectan difícilmente
con VAA de tipo natural, por ejemplo con VAA2 de tipo natural, puede
comprobarse en una prueba de adhesión
(Valsesia-Wittmann, S. et al. (1994) J.
Virol. 68, 4609-4619) de manera relativamente fácil
una modificación de la infecciosidad de la proteína estructural
mutada según la invención, por ejemplo, la expresión funcional del
péptido P1 en la superficie de VAA. La ventaja de este sistema de
ensayo es que puede determinarse rápidamente, por ejemplo, la
expresión del péptido P1 en la superficie viral mediante una
inspección y cuantitativamente mediante la medición de la densidad
óptica.
Por lo tanto, para la detección rápida de la
expresión de los ligandos insertados en la superficie del virus y
de las modificaciones del tropismo se ha desarrollado, en base al
sistema de laminina/integrina-ligando/receptor, un
modelo de selección como objetivo adecuado. A esto se incorporó en
el gen cap el ácido nucleico que codifica para el péptido P1, ya
descrito, de la manera más arriba detallada, que se une
independientemente de su conformación (lineal o circular) al
receptor de integrina, de tal modo que se obtuvo rVAA con ligandos
P1 en la cápside (rVAA-P1) tras el empaquetamiento
del virus con genoma de VAA2 mutado. Para la realización del sistema
de ensayo se utilizaron dos líneas celulares distintas que pueden
infectarse, por un lado, una mediante VAA2 de tipo natural y que
expresan el receptor VAA2 (receptor de proteoglicano heparán
sulfato, HPR, posiblemente también receptores secundarios (véase
más arriba)), pero no el receptor de integrina para laminina P1
(LP1-R) y, por otro lado, que expresan en su
superficie la LP1-R pero no HPR. Pueden determinarse
líneas celulares adecuadas en estudios de citometría de flujo con
ayuda de anticuerpos anti-HPR y pruebas de adhesión
en laminina-P1.
Estos ensayos mostraron que, por ejemplo, los
mutantes descritos anteriormente infectan las células indicadoras
positivas de receptor laminina-alfa, por ejemplo, la
línea celular M07-Lp1-R con una
eficacia al menos 10 veces superior que el VAA de tipo natural. En
ensayos de competición con péptido P1 soluble también se demostró,
por ejemplo, que se consigue en efecto la infección con
rVAA-P1 mediante los ligandos insertados. Del mismo
modo se transfectó en un ensayo adicional, con un mutante
rVAA-P1 de células B16F10, una línea celular que no
se infecta normalmente mediante VAA de tipo natural, en más de
cuatro órdenes de magnitud de lo que era posible con VAA de tipo
natural.
También otro objeto de la presente invención es
una proteína estructural, según la invención, en forma de una
partícula de VAA, especialmente en forma de una cápside de VAA, dado
que la partícula o la cápside es especialmente adecuada como
soporte de compuestos seleccionados, por ejemplo vectores de
transducción de rVAA.
Objetos adicionales de la presente invención son
un ácido nucleico, preferiblemente un ARN o ADN, especialmente un
ADN de cadena doble, que codifica para una proteína estructural
según la invención.
La presente invención también se refiere a un
célula, preferiblemente una célula de mamífero, por ejemplo una
célula COS, célula HeLa o célula 293, que contiene un ácido nucleico
según la invención. Las células de este tipo son adecuadas para la
producción de partículas recombinantes de VAA.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención es también un procedimiento para la producción de una
proteína estructural según la invención, especialmente para la
producción de una proteína estructural, según la invención, en
forma de una partícula de VAA, cultivándose una célula adecuada, que
contiene un ácido nucleico, que codifica para la proteína
estructural según la invención y que dado el caso se aísla la
proteína estructural expresada. Por ejemplo, la proteína
estructural puede aislarse según la invención en un gradiente de
cloruro de cesio, tal como se describe, por ejemplo, en Chiorini, J.
A. et al. (1995), véase más arriba.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al uso in vitro de la proteína estructural según la invención
para la modificación del tropismo de VAA, para la transformación de
una célula, especialmente de una célula que era muy poco accesible
antes de una infección por VAA, tal como por ejemplo una célula
hematopoyética, para la terapia génica en forma de vectores de rVAA
adecuados, tal como ya se ha descrito anteriormente de manera
detallada, o para la selección genómica objetivo.
También se comprende el uso in vitro de
una proteína estructural según la invención, en el que la mutación
ha provocado una infecciosidad elevada con respecto a las células
determinadas, por ejemplo a través de una B16F10 que dispone de
receptor de integrina, para estudios de eficacia con estas células.
Cabe citar como ejemplos los modelos de tumor y de líneas
celulares, preferiblemente de ratón. Para el uso de éstos puede
recurrirse para el estudio a modelos reales y comparables humanos,
que hasta ahora no eran accesibles, tales como determinadas líneas
celulares de ratón. A este respecto se determina que las células de
ratón pueden infectarse generalmente mucho peor que las células
humanas. Así no son accesibles en el ratón con tumores inducidos
por células de melanoma B16F10 para VAA2 con cápside no mutada. Sin
embargo, precisamente en este caso las proteínas según la invención
permiten estudios de eficacia de VAA2 en éstos y
correspondientemente en otros modelos de tumor en ratones. A este
respecto además resulta que tiene una acción simplificadora el que
las células de ratón en muchos tejidos y tipos de células disponen
del receptor de integrina específico para el péptido P1, que es un
ligando preferido de la proteína estructural mutada según la
invención. Por consiguiente, con los mutantes según la invención
puede construirse, mediante la infecciosidad elevada, para por
ejemplo B16F10 u otras líneas de células tumorales del ratón, que
disponen por ejemplo de este receptor de integrina específico, un
modelo de ensayo más comparable y más realista para los humanos de
lo que se conoce hasta ahora, dado que pueden transducirse los
tumores inducidos así de manera básicamente más eficaz.
El diagnóstico es otro uso in vitro de la
proteína estructural según la invención. Así, por ejemplo, pueden
introducirse anticuerpos según la invención o sustancias que se unen
a anticuerpos con anticuerpos como ligandos, que reconocen y se
unen a determinados epítopos presentes en células, por ejemplo, de
una muestra de sangre, de manera que se origina una señal. Ejemplos
de aplicación serían partes presentes de xenobióticos tales como
drogas o partículas de reconocimiento celular ("cell recognition
particles"), con las que puede determinarse la procedencia de
las células de los tejidos, por ejemplo, en el diagnóstico de
tumores.
Otros objetos de la presente invención se
refieren también a un fármaco o a un procedimiento diagnóstico que
contiene una proteína estructural según la invención, a un ácido
nucleico según la invención o a una célula según la invención y
dado el caso a aditivos y excipientes adecuados, tales como, por
ejemplo, una solución fisiológica de sal común, estabilizantes,
inhibidores de la proteinasa, etc.
Una ventaja esencial de la presente invención es
que puede modificarse la infecciosidad fundamentalmente sin pérdida
de la eficacia de empaquetamiento de los vectores recombinantes de
VAA en la cápside del virus mediante la mutagénesis, según la
invención, de proteínas estructurales de VAA, especialmente
aumentarse la infecciosidad para células poco accesibles, tales
como, por ejemplo, células hematopoyéticas, alrededor de varios
múltiplos. La presente invención es adecuada por tanto, de manera
especial, para una transformación mejorada in vitro así como
también in vivo de determinadas células, por ejemplo para la
terapia génica somática.
Los siguientes ejemplos y dibujos deben explicar
en detalle la invención, sin limitarla.
La figura 1) muestra la detección de P1 en la
superficie de los mutantes de la cápside y del tipo natural bien
por ELISA directo (barras negras) o bien por ELISA indirecto (barras
grises).
La figura 2) muestra la unión de los mutantes de
la cápside o del tipo natural a distintos tipos celulares.
La figura 3) muestra la inhibición de la unión
del mutante de la cápside I-447 a las células
B16F10.
La figura 4) muestra la inhibición de la unión
del mutante de la cápside I-587 a las células
B16F10.
Por medio de mutagénesis inasistida por PCR y
cortes con las enzimas de restricción XhoI, BsrBI o HindIII se
produjeron las mutaciones siguientes:
a) Deleción entre los puntos de corte
XhoI-XhoI de la VP-1 (\DeltaXho;
62 aminoácidos, AA) (Hermonat et al. (1984) Journal of
Virology 51, 329-339),
b) Deleción entre los puntos de corte BsrBI y
HindII de la VP-1, que se encuentra dentro de la
deleción a) anterior y que comprende 29 AA (\DeltaBH);
c) Deleción entre BsrI y HindII, así como
inserción de un ligando (péptido P1)(\DeltaBH+L); y
d) Inserción pura del ligando (péptido P1) en el
sitio de corte BsrBI (B+L).
a) ins447; YYLSR TNTPS (CPV:300)
b) ins534; EEKFF PQSGV (CPV:390)
c) ins573; NPVAT EQYGS (CPV:426)
d) ins587; LQRGN RQAAT (CPV:440)
e) ins713; NVDFT VDTNG (CPV:565) CPV significa
aquí la posición en la cápside de CPV equivalente.
(Nomenclatura según el número de aminoácidos
(AA) contados tras los AA a partir del principio del extremo
N-terminal en la VP1 de VAA2, rodeados
respectivamente de 5 aminoácidos que se encuentran en el extremo
N-terminal con respecto al mismo y 5 que se
encuentran en el extremo C-terminal con respecto al
mismo; el AA, tras el que se introdujo la inserción, se representa
en negrita).
También es posible que en los cinco AA
inmediatamente adyacentes, que se encuentran junto a los AA marcados
en negrita, igualmente se introduzca una inserción, ya que éstos se
encuentran igualmente dentro de un lazo en la cápside de VAA2.
Después de la realización de la mutaciones en el
genoma de VAA2 y del empaquetamiento de los virus mutados con un
gen reportero LacZ se determinaron los títulos de vector físicos
mediante inmunotransferencia en mancha (Dot Blot) y las
concentraciones de cápside con el ELISA de anticuerpo A20 y se
realizaron las primeras pruebas de infección en células HeLa.
Mediante esto pudo determinarse si las mutaciones alteran la
estructura de las proteínas VP o la interacción entre las distintas
proteínas VP de tal manera que el empaquetamiento no tiene lugar o,
respectivamente, se altera la infección de la célula diana (Tabla
1).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se muestran los títulos físicos virales
(inmunotransferencia en mancha (Dot Blot)) y los títulos de cápside
(ELISA de cápside A20). Las concentraciones se indican en
partículas/ml.
Para todos los cuatro mutantes de VP1, que son
vectores recombinantes con transgén de LacZ, pudo demostrarse que
las mutaciones no influyen en la eficacia del empaquetamiento y que
todos los virus mutados pueden empaquetarse con títulos buenos de
manera similar a los vectores con cápside no mutada (\sim10^{12}
partículas/ml). También los vectores de VAA con mutaciones en la
región de VP3 pudieron empaquetarse con éxito con un gen reportero
LacZ (10^{10}-10^{12} partículas
físicas/ml).
Las pruebas de adhesión descritas en detalle más
arriba han demostrado que los mutantes anteriores infectan en al
menos un caso las células indicadoras positivas de receptor de alfa
laminina, por ejemplo, la línea celular
M07-LP1-R con una eficacia al menos
10 veces mayor que el VAA de tipo natural. En ensayos de competición
con péptido de P1 soluble se encontró además que de hecho se medió
la infección por rVAA-P1 por el ligando
insertado.
En primer lugar se partió de un plásmido
pUC-AV2, que se produjo mediante la subclonación del
fragmento BglII de 4,8 kb del pAV2 (ATCC 37261, ref. 53) en el
sitio de corte BamHI del pUC19 (New England BioLabs Inc.). Por
medio de la mutagénesis asistida por PCR, conocida por el experto,
se llevaron a cabo mutaciones en sitios definidos del plásmido. A
este respecto se introdujo una secuencia que codifica para P1 un
péptido de 14 AA, con la secuencia de AA QAGTFALRGDNPQG, que
contiene el motivo de unión RGD de un fragmento de laminina
(Aumailly et al. (1990) FEBS Lett. 262,
82-86) tras los nucleótidos 3543, 3804, 3921 y 3963.
Esto corresponde a una inserción tras los aminoácidos 447, 534, 573
y 587 de la proteína de la cápside VAA2 (nomenclatura según el
número de los aminoácidos (AA) contados tras el AA a partir del
comienzo del extremo N-terminal en la
VP-1 de VAA2). En la PCR posterior se utilizaron,
respectivamente, dos cebadores específicos de mutación y como
matriz un plásmido, pCap, que sólo contiene el gen cap y que se
forma porque se corta el fragmento EcoRI-BspMI de
2,2 kb del pUC-Av2 y se introduce en el sitio de
corte EcoRI del pUC19. Posteriormente se amplifican en bacterias
los productos de la PCR, se secuencian y se subclona el fragmento
EcoNI-XcmI de 1,4 kb, que contiene P1 en
pUC-AV2, en la que se cortó la secuencia cap
correspondiente del tipo natural. Por consiguiente, los plásmidos
(mutantes) denominados según los sitios de inserción de AA
pI-447, pI-534,
pI-573 y pI-587 contenían el
genoma completo del VAA2.
Se transfectaron células HeLa (una línea celular
del epitelio cervical humana) con los plásmidos, a continuación se
incubaron aproximadamente durante 20 h y posteriormente se
infectaron con el adenovirus de tipo 5. 72 h tras la infección se
abrieron las células y se purificaron las partículas VAA2 mediante
un gradiente de CsCl.
En estos ensayos debía determinarse si los
mutantes de cápside empaquetan el genoma viral y si pueden formar
cápsides completas. Las partículas del VAA2 de los mutantes según el
ejemplo 5 se examinaron en primer lugar para determinar si el
genoma del virus porta partículas y en caso afirmativo cuántas y
cuánto ADN estaba empaquetado en los mutantes de cápside. Para esto
se trataron los virus purificados (mutantes y del tipo natural)
según el ejemplo 6, con ADNasa, se sometieron a una
inmunotransferencia y se hibridaron con una sonda rep. Los títulos
representados en la tabla 2 son títulos de partículas de VAA2 con
cápside y gen de tipo natural mutados, que lleva la correspondiente
inserción del ligando, en contraposición con la tabla 1, que muestra
los títulos de mutantes de VAA2 con el gen reportero LacZ
(transgén).
El título resultante de ahí no mostraba ninguna
diferencia cualitativa en comparación con el tipo natural, incluso
cuando las diferencias cuantitativas pueden verse, pero que a su vez
son tan pequeñas que ninguna puede ser eliminada funcionalmente
mediante las mutaciones para el empaquetamiento de dominios
esenciales (véase la tabla 2).
A partir de estos resultados no pudo recogerse
aún ninguna información sobre la conformación de la cápside. En un
experimento adicional se utilizaron anticuerpos A20 monoclonales A20
(A20-Mab) en un ELISA. Los A20-Mab
reaccionan de manera específica sólo con cápsides compuestas en su
totalidad por VAA2, no con proteínas de la cápside libres (Wistuba
et al., (1997), J. Virol. 71, 1341-1352).
También aquí se representan los resultados en la tabla 2. El título
resultante de ahí nuevamente no muestra ninguna diferencia
cualitativa o cuantitativa decisiva en comparación con el tipo
natural. Esto muestra que se efectuaron las inserciones en lazos
estructuralmente irrelevantes, sin que la inserción de P1 allí
hubiera desencadenado una modificación. En vista de su capacidad de
construir partículas que contienen ADN, las mutaciones podían
dividirse en dos grupos (tabla 2): en un grupo (mutantes
1-447 e I-587) la capacidad para la
formación de partículas que contienen ADN se correspondía con la
del tipo natural VAA2. En el segundo grupo esta capacidad era de dos
órdenes de magnitud inferior (Mutantes 1-534 y
1-573). Estos resultados pudieron confirmarse
mediante análisis de microscopía electrónica.
Se muestran los títulos físicos de virus
(inmunotransferencia en mancha (Dot-Blot)) y el
título de la cápside (ELISA de cápside A20). Las concentraciones se
indican en partículas/ml.
Posteriormente se analizó si P1 está expuesta
sobre la superficie de la cápside. Con este fin se realizaron dos
ELISA distintos con anticuerpos policlonales de
anti-P1. En un ELISA denominado "directo" se
recubrieron las placas del ELISA directamente con las partículas de
virus en PBS durante la noche, se bloquearon y se incubaron con el
anticuerpo policlonal de anti-P1. Los controles
fueron PBS (negativo) y un fragmento de laminina (positivo). En la
prueba indirecta se recubrieron primero las placas con A20Mab, a
continuación se añadieron las partículas de virus y posteriormente
el anticuerpo policlonal anti-PI. En la prueba
directa, en cambio, 1-447 y 1-587
mostraron una reacción muy clara, pero I-534 y
1-573 en cambio no mostraron ninguna reacción. En
la prueba indirecta 1-447, 1-587 e
I-573 mostraron un reacción muy clara,
1-534 en cambio no mostró ninguna reacción (véase
la figura 1).
La unión de los mutantes al receptor de
integrina se determinó mediante una prueba de adhesividad celular,
adaptándose ésta a preparaciones virales (Aumailly et al.,
véase más arriba; Valsesia-Wittmann (1994); J.
Virol. 68, 4609-4619). Se recubrieron 1 x 10^{9}
partículas virales en 100 \mul de PBS directamente en microplacas
de 96 pocillos y se bloquearon con PBS, que contenía BSA al 1%. Se
recubrieron los controles con un fragmento de laminina con una
concentración de 40 \mug/ml (control positivo) o con BSA (10
mg/ml; control negativo). Se añadieron 1 x 10^{15} células por
100 \mul a los pocillos recubiertos. Éstos se incubaron durante
30 minutos a 37ºC en un incubador humedecido con agua, para que se
adhirieran. Al final del tiempo de adhesión se lavaron los pocillos
dos veces con PBS, para eliminar las células no adheridas. Se
fijaron las células adheridas con etanol al 100% durante 10
minutos, se tiñeron con violeta cristal y se cuantificaron mediante
un lector ELISA a 570 nm. Esta vez se eligieron células B16F10 y
líneas celulares RN22, puesto que éstas expresan integrinas
específicas de P1 en su superficie y son resistentes a las
infecciones de VAA2 (Maass, G. et al. (1998) Hum. Gen.
Ther., 9, 1049-1059; Aumailly et al., véase
anteriormente). Dos de las mutaciones, 1-447 y
1-587 se unieron con una efectividad elevada de
manera similar tanto a células B16F10 como RN22. En clara
contraposición a esto no se encontró ninguna unión del tipo natural
VAA2 y de los mutantes 1-534 y 1-573
a estas células (figura 2).
En una prueba de inhibición se mezclaron células
con RGDS o RGES, péptidos sintéticos solubles con concentración
variable, (1-250 \mumol), antes de aplicarlas en
las placas. Este ensayo se realizó para someter a prueba la
especificidad de la unión de los mutantes I-447 y
1-587 a células B16F10. Por lo tanto, las pruebas de
adhesión celular se realizaron en presencia de un péptido (RGDS)
competidor por sitios de unión, que corresponde a los sitios
activos de P1 y en presencia de un péptido RGES inactivo. Pudo
conseguirse la unión de ambas mutaciones 1-447 y
I-587 a células B16F10 con 30 \mumol del péptido
RGDS con una efectividad del 50%, mientras que el propio péptido
RGES era inactivo a concentraciones superiores. A una concentración
de 250 \mumol, el péptido RGDS impedía por completo la unión del
virus a células B16F10 (figuras 3 y 4). Se consiguieron resultados
similares con células RN22.
Para someter a prueba el tropismo de los
mutantes de cápside 1-447 y 1-587,
se infectaron con los virus mutados las líneas celulares
Co-115 y B16F10. Se utilizaron las células
Co-115 para someter a prueba el tropismo del
receptor de tipo natural de los viriones, ya que éstos pueden
transducirse con VAA2 de tipo natural y no se unen al péptido P1.
Se utilizó la línea celular B16F10 por los motivos ya mencionados en
el ejemplo 9. Tres días después de la infección se examinaron las
células mediante medición de inmunofluorescencia con ayuda de un
anticuerpo anti-rep para determinar si se expresa la
proteína rep viral (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71,
1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol.
69, 5311-5319). Se cultivaron las células hasta una
confluencia del 70% sobre portaobjetos y se incubaron en un medio
libre de suero junto al adenovirus 5 con distintas concentraciones
de preparaciones virales según la invención. Tres días más tarde se
determinaron los títulos de las preparaciones virales mediante la
detección in situ de la síntesis de proteína rep en un
ensayo de inmunofluorescencia (título rep).
A este respecto se realizó la tinción de
inmunofluorescencia con células infectadas con VAA2 según un método
de Wistuba et al. (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71,
1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol.
69, 5311-5319). Se lavaron los portaobjetos una vez
con PBS, se fijaron en metanol (5 min, 4ºC) y posteriormente se
trataron con acetona (5 min, 4ºC). Entonces se incubaron las células
durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo
monoclonal 76-3, que reacciona con proteínas rep del
VAA2. Posteriormente se lavó y se incubó durante una hora con un
anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a la
rodamina con una dilución de 1:50 en PBS con un 1% de BSA. Se
calcularon los títulos a partir de la última dilución limitante de
la solución madre viral, que habían conducido a células de
fluorescencia positiva.
Pudieron detectarse células CO115 rep positivas
tras la infección con VAA2 de tipo natural y con los dos mutantes
I-447 y 1-587. En las células Co115
la infecciosidad de 1-587 y 1-447
era de dos a tres órdenes de magnitud inferior que la del tipo
natural (tabla 3). La transfección de las células B16F10 era igual
de ineficaz con 1-447 que aquella con el virus de
tipo natural (tabla 3). En clara oposición a esto pueden detectarse
tras la infección con I-587 las células B16F10 rep
positivas, determinándose el título del virus 1-587
en 1 x 10^{6} Rep-EFU/ml (tabla 3).
Para examinar si se medió la transfección de las
células B16F10 por el mutante I-587 específicamente
a través de la interacción entre la secuencia P1 sobre la superficie
de la cápside mutada y el receptor de la integrina sobre la
superficie de las células B16F10, se incubaron las células antes de
la infección con el virus o bien con el RGDS competidor o bien con
el péptido RGES inactivo a concentraciones de 200 \mumol. La
adición del péptido RGDS neutralizó la infecciosidad de
1-587 hacia las células B16F10 (tabla 3), mientras
que el péptido de control RGES no tuvo ningún efecto.
Se muestran los títulos de las células CO115 que
son vulnerables al tipo natural y las células B16F10 que son
resistentes al tipo natural. Se expresan los títulos para
I-447 y 1-587 como el tipo natural
en Rep-EFU/ml y para rVAA/LacZ y
rVAA(I-587)/LacZ en
LacZ-EFU/ml. A este respecto EFU significa unidades
formadoras de expresión (Expressing Forming Unit) y nd significa
"no determinado".
En un ensayo complementario, para descartar, que
la infección de células B16F10 mediante el mutante
1-587 se mediara adicionalmente por el receptor
primario proteoglicano de heparán sulfato, se realizó una prueba de
competición con heparina, un receptor analógico. En las células
B16F10 no pudo comprobarse ningún cambio del título infeccioso tras
la adición de heparina, o sea de la infectividad de
1-587. En contraposición a esto, pudo bloquearse
por completo la infección de células CO155 a partir de suplementos
de heparina de medio de infección de 50 \mug/ml. De esto resulta
que la infección tiene lugar independientemente del proteoglicano
de heparán sulfato a través de ligandos de P1 y del receptor de
integrina.
En un ensayo adicional basado en el ejemplo 10
se produjeron vectores rVAA con un gen reportero LacZ, que
contenían o bien el tipo natural (virión rVAA) o bien
I-587 (virión rVAA(I-587)).
Se denominaron las preparaciones virales rVAA/LacZ y
rVAA(I-587)/LacZ y se usaron para la
infección de las células B16F10 o CO115 (controles).
Se sometieron a pruebas las células infectadas
tres días después de la infección mediante una tinción
X-Gal para determinar la expresión de la
\beta-galactosidasa. A este respecto se utilizó
la prueba in situ X-Gal para la tinción
citoquímica (título Lacz). Tras esto, para someter a prueba la
expresión de la \beta-galactosidasa, se lavaron
las células una vez con PBS y después se fijaron con glutaraldehído
al 1,5%. Posteriormente se trataron las células con
X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido),
tal como ya describió Chiorini et al. (1995) Hum. Gen. Ther.
6, 1531-1541. Se calcularon los títulos a partir de
la última dilución limitante de la solución madre viral, que habían
conducido a células productoras de
\beta-galactosidasa.
En los controles en las células CO115 ambos
viriones eran infecciosos, pero sin embargo rVAA
(I-587)/LacZ era dos órdenes de magnitud menos
eficaz. En el tipo B16F10 no se encontraron (como era de esperar)
tras la infección con rVAA/LacZ células de
\beta-galactosidasa positivas. Por el contrario
tras la infección con rVAA(I-587)/LacZ se
encontraron de manera sorprendente considerablemente muchas células
de \beta-galactosidasa positivas. Se determinó el
título de rVAA-(I-587)/LacZ con 5 x 10^{4}
LacZ-EFU por ml. Se mejoró la infecciosidad de los
vectores rVAA con respecto a las células B16F10 en más de cuatro
órdenes de magnitud mediante la mutación según la invención
(tabla 3).
(tabla 3).
Se realizó una prueba de competición con
heparina, un análogo del receptor, en un ensayo complementario,
para descartar, que la infección de células B16F10 mediante el
mutante 1-587 se mediara adicionalmente mediante el
receptor primario proteoglicano de heparán sulfato. En las células
B16F10 no pudo comprobarse ningún cambio del título infeccioso, o
sea de la infecciosidad de 1-587, tras la dosis de
heparina. En contraposición a este respecto, pudo bloquearse por
completo la infección de células CO155 a partir de suplementos de
heparina de medio de infección de 50\mug/ml. De esto resulta que
la infección tiene lugar independientemente del proteglicano de
heparán sulfato a través de ligandos de P1 y del receptor de
integrina.
Se efectuaron distintas mutaciones en la VP3 en
los sitios mencionados allí, de manera análoga al ejemplo 5,
insertándose una secuencia que codifica para el dominio Z34C de la
proteína A (Starovasnik 1997 véase más arriba) tras los nucleótidos
3543, 3804, 3921 y 3963. A este respecto se produjo la deleción de
uno o varios aminoácidos que se encuentran en los sitios de
inserción, respectivamente, para evitar problemas por inserciones
demasiado largas. La producción de los mutantes tiene lugar tal como
ya se explicó en el ejemplo 5. Posteriormente se produjeron las
partículas VAA2 correspondientes según una forma de proceder
idéntica como en el ejemplo 6.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MediGene AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Lochhamer StraBe 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- POBLACIÓN: 82152 Planegg/Martinsried
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO FEDERADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 82152
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN: Proteína estructural de VAA, producción y uso de la misma
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word 6.0
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: CADENA SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipQAGTFALRGD NPQG
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYKQISSQSGA
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYLTLNNGSQA
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYYLSRTNTPS
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipEEKFFPQSGV
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNPVATEQYGS
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipLQRGNRQAAT
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Secuencia de aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DEL FRAGMENTO: fragmento interior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNVDFTVDTNG
\hfill10
Claims (22)
1. Proteína estructural de virus adenoasociados
(VAA), caracterizada porque la proteína estructural contiene
al menos una mutación, que provoca un incremento de la infecciosidad
del virus y que se localiza en la superficie del virus, y porque la
proteína estructural mutada puede producir partículas.
2. Proteína estructural según la reivindicación
1, caracterizada porque la(s) mutación (mutaciones) es
(están) localizada(s) en el extremo
N-terminal de la proteína estructural.
3. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la proteína
estructural mutada provoca una modificación de la interacción
proteína-receptor de membrana celular.
4. Proteína estructural según la reivindicación
3, caracterizada porque el receptor de membrana celular es
una glicoproteína de aproximadamente 150 kD y/o un proteoglicano de
heparán sulfato.
5. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque ésta se
selecciona de VP1 mutada, VP2 mutada y/o VP3 mutada.
6. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque ésta proviene de
VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6.
7. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la(s)
mutación (mutaciones) es una (son) mutación(es)
puntual(es), la(s) mutación (mutaciones) de varios
aminoácidos, una o varias deleciones y/o una o varias inserciones o
es una combinación de estas mutaciones.
8. Proteína estructural según la reivindicación
7, caracterizada porque la inserción es un ligando de
receptor de membrana celular, un péptido o proteína rep, una
proteína inmunosupresora o un péptido inmunosupresor y/o una
proteína o un péptido con una señal para la síntesis de cadena doble
del gen foráneo.
9. Proteína estructural según la reivindicación
8, caracterizada porque el ligando se selecciona de una
integrina, de una citocina o de un dominio de unión a un receptor de
una citocina, integrina o factor de crecimiento, un anticuerpo de
cadena simple que se une a un receptor de la superficie celular, un
anticuerpo contra las estructuras de la superficie celular, una
estructura que se une a anticuerpos o un epítopo así como de
ligandos, que se unen a través de su carga, el tipo de composición
de los aminoácidos y/o a través de la glicosilación específica y/o
fosforilación a moléculas de la superficie celular.
10. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque la(s)
mutación (mutaciones) se provoca(n) mediante una o varias
inserciones en el sitio de corte XhoI del ácido nucleico que
codifica para VP1.
11. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque la(s)
mutación (mutaciones) se provoca(n) mediante una o varias
inserciones en el sitio de corte BsrBI del ácido nucleico que
codifica para VP1.
12. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque la(s)
mutación (mutaciones) se provoca(n) mediante una o más
deleciones entre los sitios de corte BsrBI-HindII
del ácido nucleico que codifica para VP1 y una o varias inserciones,
codificándose el fragmento BsrBI-HindII para 29
aminoácidos.
13. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque una o varias
inserciones está(n) localizada(s) en VP3 delante de al menos
un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN
NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT
VDTNG.
14. Proteína estructural según la reivindicación
7, caracterizada porque la mutación se provoca mediante una o
varias deleciones entre los sitios de corte
XhoI-XhoI del ácido nucleico que codifica para
VP1.
15. Proteína estructural según la reivindicación
7, caracterizada porque la mutación se provoca mediante una o
varias deleciones entre los sitios de corte
BsrBI-HindII del ácido nucleico que codifica para
VP1.
16. Proteína estructural según una de las
reivindicaciones 1 a 15 en forma de una partícula de VAA,
particularmente en forma de una cápside de VAA.
17. Ácido nucleico, que codifica para una
proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Célula aislada, que contiene un ácido
nucleico según la reivindicación 17.
19. Procedimiento para la producción de una
proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado porque se cultiva una célula según la
reivindicación 18 y dado el caso se aisla la proteína estructural
expresada.
20. Fármaco, que contiene una proteína
estructural según una de las reivindicaciones 1 a 16, un ácido
nucleico según la reivindicación 17 y/o una célula según la
reivindicación 18.
21. Procedimiento diagnóstico, que contiene una
proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 16, un
ácido nucleico según la reivindicación 17 y/o una célula según la
reivindicación 18.
22. Uso in vitro de una proteína
estructural según una de las reivindicaciones 1 a 16 para la
modificación del tropismo de VAA, para la transformación de una
célula, para el diagnóstico, para ensayos de eficacia y/o para la
selección genómica como objetivo.
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