CN110546265A - 工程化自然杀伤(nk)细胞及其组合物和方法 - Google Patents

工程化自然杀伤(nk)细胞及其组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供工程化自然杀伤(NK)细胞和产生工程化NK细胞的方法。所述工程化NK细胞和含有所述工程化NK细胞的组合物可用于治疗疾病，如癌症。

Description

工程化自然杀伤(NK)细胞及其组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月9日提交的标题为“ENGINEERED NATURAL KILLER(NK)CELLSAND COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF”的美国临时申请号62/457,098和2017年4月11日提交的标题为“ENGINEERED NATURALKILLER(NK)CELLS AND COMPOSITIONS AND METHODSTHEREOF”的美国临时申请号62/484,350的优先权，其内容通过引用整体并入。
通过引用序列表并入
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2018年2月6日创建的名为776032000140SeqList.txt的文件提供，其大小为12,126字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入。
技术领域
本发明提供工程化自然杀伤(NK)细胞和产生工程化NK细胞的方法。所述工程化NK细胞和含有所述工程化NK细胞的组合物可用于治疗疾病，如癌症。
背景技术
40年前发现NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞而不需要先前的抗原暴露的能力。从那以后，NK细胞被视为基于细胞的癌症疗法的有前景的药剂。大多数癌症在HLA情况下缺乏可鉴定的肿瘤特异性抗原，并且因此不可能屈从于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。由于大范围的癌细胞对NK细胞毒性敏感，因此使用NK细胞的一个主要优点是可采用自然杀伤(NK)细胞的移植在同种异体环境中针对癌细胞，而没有移植物抗宿主疾病的风险。NK细胞的治疗前景受限于难以获得治疗有效量的NK细胞，特别是表现出杀伤恶性肿瘤细胞或感染细胞的细胞毒性效应子功能的NK细胞。因此，需要用于治疗用途的工程化NK细胞。本文提供了满足这种需求的实施方案。
发明内容
本文提供了工程化自然杀伤(NK)细胞，所述工程化NK细胞的FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞表现出增强的免疫反应，包括对于受试者的癌症、微生物感染和/或病毒感染的治疗。还提供了通过给予治疗有效量的所提供工程化NK细胞来治疗受试者的方法。在一些实施方案中，工程化NK细胞可用于增强对给予的治疗抗体(如对抗癌、抗病毒或抗微生物单克隆抗体)的治疗反应。
在一些实施方案中，本文提供了一种工程化NK细胞，其中所述NK细胞被基因工程化为减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。在这些实施方案的一些中，工程化NK细胞包含基因的遗传破坏，其导致所述细胞中FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少。在一些情况下，遗传破坏可导致基因的缺失或突变。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含抑制性核酸，其减少某一基因的表达，从而导致所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少。
在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码FcRγ链的基因的遗传破坏和/或导致工程化NK细胞中FcRγ链表达减少的遗传破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质表达减少的遗传破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质表达减少的遗传破坏。在一些实施方案中，工程化细胞可含有以上遗传破坏中的一种或多种。在一些实施方案中，遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致基因中的过早终止密码子或者基因的开放阅读框的移码。在一些实施方案中，工程化NK细胞中编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的两个等位基因都被破坏。
在一些实施方案中，工程化NK细胞包含靶向NK细胞中的基因的抑制性核酸分子，从而导致FcRγ链的表达减少、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。在一些实施方案中，抑制性核酸干扰或减少编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的表达。在一些实施方案中，抑制性核酸包含RNA干扰剂。在一些实施方案中，抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA。
在此类实施方案的一些中，与未基因工程化的NK细胞中的蛋白质表达相比，工程化NK细胞中FcRγ链、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在任何此类实施方案的一些中，工程化NK细胞中调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少。在这些实施方案的一些中，调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质是转录因子。在一些实施方案中，所述转录因子是PLZF(ZBTB16)或HELIOS(IKZF2)。
在任何此类实施方案的一些中，工程化NK细胞中参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。在一些实施方案中，参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质是FcRγ的下游信号传导分子。在这些实施方案的一些中，所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT-2。
在任何此类实施方案的一些中，工程化NK细胞中FcRγ链的表达减少。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码FcRγ链的基因中的遗传破坏。在这些实施方案的一些中，遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致基因中的过早终止密码子或者基因的开放阅读框的移码。在一些实施方案中，工程化NK细胞的基因组中编码FcRγ链的基因的两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含靶向编码FcRγ链的基因的抑制性核酸分子，从而减少细胞中FcRγ链的表达。在一些实施方案中，抑制性核酸分子包含与编码FcRγ链的基因互补的序列。在一些实施方案中，抑制性核酸包含RNA干扰剂。在一些实施方案中，抑制剂核酸包含siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，工程化NK细胞中FcRγ链的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在任何所提供实施方案的一些中，工程化NK细胞中FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少是永久的、短暂的或可诱导的。在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的表达、活性和/或信号传导相比，FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在所述细胞中表达的FcRγ链的表达在免疫印迹测定中不能检测到。
在任何所述实施方案的一些中，工程化NK细胞来源于从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，受试者是人。
在任何所述实施方案的一些中，工程化NK细胞来源于克隆细胞系。在一些实施方案中，所述克隆细胞系是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
在任何所述实施方案的一些中，CD16在工程化NK细胞的表面上表达。在任何所述实施方案的一些中，工程化NK细胞表达CD3-δ(CD3-zeta，CD3δ)链。在一些实施方案中，表达的CD16和/或CD3δ链是NK细胞内源的。在一些实施方案中，工程化NK细胞被另外地工程化以在NK细胞中表达重组或异源CD16和/或CD3δ链。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含重组或异源CD16基因和/或重组或异源CD3-δ(CD3δ)链。在一些实施方案中，重组或异源CD16包含CD16激活突变。在一些实施方案中，所述CD16激活突变是导致对IgG1的更高亲和力的突变。在一些实施方案中，CD16包含突变158V。在一些实施方案中，CD16包含突变158F。
还提供了工程化NK细胞，所述工程化NK细胞的NK抑制性受体的表面表达减少。在一些实施方案中，任何所提供的具有减少的FcRγ链表达、活性和/或信号传导的工程化NK细胞可另外地具有减少的NK抑制性受体上的表面表达。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码NK抑制性受体的基因的遗传破坏和/或导致NK抑制性受体的表达减少的遗传破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含抑制性核酸，其靶向编码NK抑制性受体的基因和/或导致所述细胞中NK抑制性受体的表达减少。在一些实施方案中，抑制性受体是NKG2A和/或KIR2DL1。在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的表达、活性和/或信号传导相比，抑制性受体(如NKG2A和/或KIR2DL1)的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞相比，当通过CD16刺激时，工程化NK细胞表现出增加的活性。在一些实施方案中，在通过CD16交联的CD16接合(如可在抗体存在下通过抗体的Fc部分与CD16的结合而发生)后观察到增加的活性。
在一些实施方案中，与未经修饰的NK细胞相比，工程化NK细胞的NKp46、NKp30和/或NKp44的表面表达减少。在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，所述细胞中NKp46、NKp30和/或NKp44的表达减少大于或者大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
本文还提供了一种产生工程化NK细胞的方法，其包括对NK细胞进行基因工程化以减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。在这些实施方案的一些中，所述方法包括破坏基因或抑制基因表达，以实现所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少。在一些情况下，遗传破坏可导致基因的缺失或突变。在一些实施方案中，所述方法包括将抑制性核酸引入细胞中，所述抑制性核酸减少某一基因的表达，从而导致所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少。
在一些实施方案中，所述方法包括破坏编码FcRγ链的基因和/或破坏某一基因，从而导致工程化NK细胞中FcRγ链表达减少。在一些实施方案中，所述方法包括破坏编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或破坏某一基因，从而导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质表达减少。在一些实施方案中，所述方法包括破坏编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因和/或破坏某一基因，从而导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质表达减少。在一些实施方案中，破坏所述基因的方法导致将缺失、突变或插入引入基因中。
在一些实施方案中，破坏所述基因的方法包括将已被工程化以靶向所述基因的内切核酸酶引入NK细胞中。在一些实施方案中，内切核酸酶是TAL核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR相关蛋白9(Cas9)或Argonaute。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，其与至少一种指导RNA融合或与其复合，所述至少一种指导RNA与所述基因的靶结构域或区域互补。在一些实施方案中，Cas9是金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9分子。在一些实施方案中，Cas9分子是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9。在一些实施方案中，所述方法包括将靶向NK细胞中编码FcRγ链的基因的内切核酸酶(如Cas9)引入所述细胞中。
在一些实施方案中，抑制基因表达的方法包括将靶向某一基因的抑制性核酸引入所述细胞中，以导致所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少。在一些实施方案中，将靶向一种或多种基因的一种或多种抑制性核酸分子引入所述细胞中，从而导致编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的表达减少。在一些实施方案中，抑制性核酸包含与编码FcRγ链的基因互补的序列。在一些实施方案中，抑制性核酸包含与编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因互补的序列。在一些实施方案中，抑制性核酸包含与编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因互补的序列。在一些实施方案中，抑制性核酸包含RNA干扰剂。在一些实施方案中，所述核酸是siRNA、shRNA或miRNA。
在任何此类实施方案的一些中，进行所述方法以减少NK细胞中调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达。在这些实施方案的一些中，调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质是转录因子。在一些实施方案中，所述转录因子是PLZF(ZBTB16)或HELIOS(IKZF2)。
在任何此类实施方案的一些中，进行所述方法以减少NK细胞中参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达。在一些实施方案中，参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质是FcRγ的下游信号传导分子。在这些实施方案的一些中，所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT-2。
在任何此类实施方案的一些中，进行所述方法以减少NK细胞中FcRγ链的表达。
在任何所述实施方案的一些中，在体外进行所述方法。在任何所述实施方案的一些中，如由从受试者(如从人患者)分离的细胞，离体进行所述方法。在任何所述实施方案的一些中，进行所述方法，使得表达减少是永久的、短暂的或可诱导的。
在一些实施方案中，产生工程化NK细胞的方法包括在获自受试者的原代NK细胞中进行基因工程化，如所述基因表达的破坏或抑制。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，如人。
在一些实施方案中，在破坏基因或抑制其表达之前，所述方法包括(i)从来自哺乳动物受试者的样品分离NK细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人。在这些实施方案的一些中，所述样品包括外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，分离NK细胞包括基于NK细胞标记物的表面表达选择NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞标记物是CD56、CD161、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、2B4、NTB-A、CRACC、DNAM-1、CD69和/或CD25中的一种或多种。在一些实施方案中，所述方法包括通过选择不表达表面CD3，T细胞抗原受体(TCR)和/或表面免疫球蛋白(Ig)B细胞受体的细胞从其他淋巴细胞选择NK细胞。在一些实施方案中，选择或另外地选择NK细胞以具有CD16的表面表达。在一些实施方案中，NK细胞表达CD3δ。
在一些实施方案中，产生工程化NK细胞的方法包括对NK细胞系进行基因工程化。在一些实施方案中，所述细胞系是是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
在一些实施方案中，所述方法包括工程化NK细胞系以表达重组或异源CD16和/或CD3δ。在一些实施方案中，所述方法包括将编码CD16和/或CD3δ的核酸引入NK细胞中。在一些实施方案中，重组或异源CD16含有激活突变。在一些实施方案中，所述激活突变增加CD16对IgG的亲和力。在一些实施方案中，CD16包含158V突变。在一些实施方案中，CD16包含158F突变。
在一些实施方案中，所述方法包括用编码CD16和/或CD3δ基因的核酸以病毒方式转导NK细胞。在一些实施方案中，所述方法包括用编码CD16和/或CD3δ基因的核酸转染NK细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在NK细胞中短暂地、可诱导地或永久地表达CD16或CD3δ。
在一些实施方案中，进行所述方法，使得与未通过本发明方法基因工程化的NK细胞中的表达相比，NK细胞中的FcRγ链表达、信号传导和/或活性减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，FcRIγ衔接蛋白表达水平不能通过免疫印迹测定检测到。
还提供了一种产生工程化NK细胞的方法，所述工程化NK细胞的NK抑制性受体的表面表达减少。在一些实施方案中，任何所提供的用于产生具有减少的FcRγ链表达、活性和/或信号传导的工程化NK细胞的方法可另外地包括减少的NK抑制性受体上的表面表达。在一些实施方案中，通过包括破坏编码NK抑制性受体的基因的方法产生此类工程化NK细胞。在一些实施方案中，通过将靶向编码NK抑制性受体的基因的抑制性核酸引入NK细胞中产生此类工程化NK细胞。在一些实施方案中，抑制性受体是NKG2A和/或KIR2DL1。在一些实施方案中，进行此类方法，使得与未通过本发明方法基因工程化的NK细胞中的抑制性受体的表达相比，NK细胞中的NK抑制性受体(如NKG2A和/或KIR2DL1)的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，所提供的产生基因工程化NK细胞的方法可还包括扩增工程化NK细胞的步骤。在一些实施方案中，扩增工程化NK细胞包括在饲养细胞或细胞因子存在下培养或孵育工程化NK细胞。在一些实施方案中，在体外进行工程化NK细胞的扩增。在一些实施方案中，在体内进行工程化NK细胞的扩增。
还提供了通过任何以上方法产生的工程化NK细胞。
本文还提供了包含任何所提供的工程化NK细胞的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的本文提供的工程化NK细胞和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述载体是盐水溶液、右旋糖溶液或5％人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含1x 105个与1x 108个之间的细胞/mL。
在一些实施方案中，所述组合物是冷冻保存组合物和/或包含工程化NK细胞和冷冻保护剂。
这里还提供了包括工程化NK细胞和另外的药剂的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明，例如，给予工程化NK细胞和另外的药剂以治疗疾病的说明。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。在一些实施方案中，所述抗体识别肿瘤相关抗原、病毒抗原、微生物抗原。在一些实施方案中，所述抗体选自抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体和抗CD38抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc结构域。
本文还提供了一种治疗病症的方法，其包括向有需要的个体给予任何所提供的工程化NK细胞。在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物受试者，如人受试者。在一些实施方案中，所述受试者是患有癌症或感染(如病毒感染或微生物感染)的受试者。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体给予1x 108至1x 1010个细胞/m2。
在一些实施方案中，所提供的方法还包括给予另外的药剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。在一些实施方案中，所述抗体识别肿瘤相关抗原、病毒抗原、微生物抗原。在一些实施方案中，所述抗体是抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体或抗CD38抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc结构域。
在一些实施方案中，依次给予另外的药剂和工程化NK细胞。在一些实施方案中，在给予工程化NK细胞之前给予另外的药剂。在一些实施方案中，同时给予另外的药剂和工程化NK细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括给予NK细胞以治疗炎性病症、感染和/或癌症。在一些实施方案中，所述感染是病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，所述癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述个体表达低亲和力FcγRIIIA。在一些实施方案中，所述个体是人。
在一些实施方案中，工程化NK细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，工程化NK细胞对于受试者是自体的。
附图说明
图1描绘了在存在或不存在抗CD20抗体利妥昔单抗的情况下，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中g-NK细胞和常规NK细胞的活性。
具体实施方式
本文提供了工程化自然杀伤(NK)细胞，其被基因工程化为使FcRγ(也称为FcεRIγ)的表达、活性和/或信号传导减少。在一些方面，所提供的工程化NK细胞被基因工程化以敲除(例如通过遗传破坏)或敲低(例如通过基因沉默或抑制)编码FcRγ的基因、编码控制FcRγ表达的蛋白质(如转录因子)的基因、或编码参与FcRγ依赖性信号传导的蛋白质(如FcRγ的下游信号传导分子)的基因。
自然杀伤(NK)细胞是先天性淋巴细胞，其对于通过细胞因子和趋化因子分泌以及细胞毒性颗粒的释放来介导抗病毒和抗癌症免疫是重要的(Vivier等人Science 331(6013):44-49(2011)；Caligiuri,Blood 112(3):461-469(2008)；Roda等人,CancerRes.66(1):517-526(2006))。NK细胞是包含第三大淋巴细胞群体的效应细胞，并且对于宿主针对肿瘤和病原体感染细胞的免疫监测是重要的。
然而，与T和B淋巴细胞不同，NK细胞被认为使用种系编码的激活受体识别靶标的能力仅是有限的(Bottino等人,Curr Top Microbiol Immunol.298:175-182(2006)；Stewart等人,Curr Top Microbiol Immunol.298:1-21(2006))。相反，NK细胞表达激活的Fc受体CD16，其识别IgG包被的靶细胞，从而扩大靶标识别(Ravetch和Bolland,Annu RevImmunol.19:275-290(2001)；Lanier Nat.Immunol.9(5):495-502(2008)；Bryceson和Long,Curr Opin Immunol.20(3):344-352(2008))。在一些情况下，当NK细胞表面上的受体(如CD16)识别与细胞表面结合的IgGl或IgG3抗体时，触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。这触发释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒，从而导致靶细胞死亡。ADCC和抗体依赖性细胞因子/趋化因子产生主要通过NK细胞介导。
在一些情况下，ADCC是治疗性抗体(包括抗癌抗体)的作用机制。尽管通过使用针对癌抗原的抗体在癌症治疗方面取得了重大进展，但患者对此类抗体的反应性却有所不同。此类可变反应的研究典型地集中于这些抗体对肿瘤细胞的直接抑制作用(例如抑制生长因子受体和随后诱导细胞凋亡)，并且这些抗体的体内作用可能更复杂并且可能涉及宿主免疫系统，包括通过ADCC。在一些方面，通过给予NK细胞的细胞疗法可与抗体配合用于治疗和相关目的。
在激活后，NK细胞大量产生细胞因子和趋化因子，并且同时表现出有效的细胞溶解活性。NK细胞的激活可通过NK细胞受体与靶细胞上配体的直接结合而发生，如直接肿瘤细胞杀伤所见，或者通过结合到与带有抗原的细胞结合的抗体的Fc部分，通过Fc受体(CD16；FcγRIII)的交联而发生。几种NK细胞激活受体的表达和信号转导活性需要物理相联的衔接子，其通过基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)来转导信号。在这些衔接子之中，FcRγ和CD3δ链可与CD16和天然细胞毒性受体(NCR)缔合为二硫键连接的同源二聚体或异源二聚体，并且这些链被认为由所有成熟的NK细胞表达。
在一些方面，CD16接合(CD16交联)经由通过CD16相关衔接子链FcRγ或CD3δ中的一种或两种产生的细胞内信号引发NK细胞反应。CD16的触发导致γ或δ链的磷酸化，这进而募集酪氨酸激酶(syk和ZAP-70)，从而引发导致快速和有效效应子功能的信号转导级联。最熟知的效应子功能是释放携带有毒蛋白质的细胞质颗粒，以通过抗体依赖性细胞毒性的过程杀伤附近的靶细胞。CD16交联还导致产生细胞因子和趋化因子，其进而激活并协调一系列免疫反应。
细胞因子和趋化因子的这种释放可在体内在NK细胞的抗癌活性方面起作用。NK细胞还在其细胞质中具有含有穿孔素和蛋白酶(颗粒酶)的小颗粒。当从NK细胞释放时，穿孔素在靶定细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶和相关分子可通过所述孔进入，从而诱导细胞凋亡。NK细胞诱导靶细胞的细胞凋亡而不是坏死的事实是病毒感染的细胞的显著坏死将释放病毒粒子，而细胞凋亡导致细胞内部病毒的破坏。
所提供的工程化NK细胞包括被工程化以具有FcRγ信号传导衔接子的较低活性或表达的细胞。在一些情况下，所述工程化细胞大量地表达信号传导衔接子CD3δ链，但缺乏信号传导衔接子FcRγ链的表达。在一些实施方案中，与表达信号传导衔接子FcRγ链的NK细胞相比，当被如可在抗体存在下发生的CD16的接合激活时，这些工程化NK细胞表现出显著增强的活性。例如，可通过抗体介导的CD16的交联或通过抗体包被的肿瘤细胞激活工程化细胞。还提供了产生所述工程化细胞的方法。所提供的工程化NK细胞和方法解决了与选择或鉴定具有特定表型的NK细胞相关的问题，所述NK细胞可能仅呈现为受试者中总NK细胞的一小部分并且/或者其通常不存在于群体中的所有受试者中。在一些方面，与从受试者直接分离的具有类似表型的NK细胞相比，所提供的实施方案提供了改进的NK细胞疗法，其中NK细胞可以增强的活性工程化，并且还可更容易地以足够量获得以用于治疗用途，包括用于与抗体配合给予。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、以及科学文献和数据库均出于所有目的通过引用整体并入本文至如同指明每个单独的参考文献具体且单独地通过引用并入的相同程度。
为了公开内容的清楚，而不是通过限制的方式，将详细说明划分为以下小节。本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术术语和科学术语或用词旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
如在说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
应理解的是，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含(comprising)”、“组成为(consisting)”方面和实施方案，和“基本上由所述方面和实施方案组成(consistingessentially of)”。
如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，任选取代的基团意指所述基团未取代或被取代。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，如重组产生的，包括其含有免疫球蛋白分子的可变重链和/或轻链区的至少一部分的任何片段，所述片段足以形成抗原结合位点，并且当组装时，足以特异性地结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。典型地，抗体最小限度地包括可变重(VH)链和/或可变轻(VL)链的全部或至少一部分。通常，VH和VL的配对一起形成抗原结合位点，尽管在一些情况下，单个VH或VL结构域足够用于抗原结合。所述抗体还可包括恒定区的全部或一部分。本文提及的抗体包括全长抗体和抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换使用，以指代基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。全长抗体是典型地具有两个全长重链(例如，VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两个全长轻链(VL-CL)以及铰链区的抗体，如通过分泌B细胞的抗体从哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)产生的抗体和合成产生的具有相同结构域的抗体。具体地，完全抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段；双体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)或单链Fab(scFab)；任何以上抗体的抗原结合片段和来自抗体片段的多特异性抗体。出于本文的目的，抗体片段典型地包括足以接合或交联NK细胞表面上的CD16的抗体片段。
术语“自体”是指源自个体自身组织内部或取自个体自身组织的细胞或组织。例如，在NK细胞的自体转移或移植中，供体和受体是同一个人。
术语“同种异体”是指属于或获自相同物种，但在遗传上不同的细胞或组织，并且因此在一些情况下，是免疫学不相容的。典型地，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的受体的细胞。
术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。
提及蛋白质或核酸时，术语“异源”是指源自不同遗传来源的蛋白质或核酸。例如，与细胞异源的蛋白质或核酸源自除在其中表达它的细胞之外的生物或个体。
如本文所用，术语“引入”包括在体外或在体内将DNA引入细胞中的各种方法，此类方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将编码分子的DNA引入细胞中。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体，如腺病毒载体或腺相关载体。
术语“组合物”是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞或抗体)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。所述制剂通常呈允许活性成分(例如抗体)的生物活性有效的形式。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，组合是指两个或更多个项目之间或之中的任何相关联。所述组合可以是两个或更多个单独的项目，如两种组合物或两个集合，可以是其混合物，如两个或更多个项目的单一混合物，或其任何变化。组合的元素通常在功能上相关联或相关。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，其出于包括但不限于治疗用途的目的，任选地包括其他元素，如另外的药剂和所述组合或其元素的使用说明。
如本文所用，术语“治疗(treatment)或治疗(treating)”是指设计用来在临床病理学过程中改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的希望效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状况、消退或者预后改进。例如当与障碍(例如，嗜酸性粒细胞介导的疾病)相关的一种或多种症状得到减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。例如，如果治疗导致提高患有疾病的那些人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、减少疾病复发的频率、减轻疾病的严重性、延缓疾病的发展或进展，和/或延长个体的存活时间，则个体成功地得到“治疗”。
“有效量”是指在必需剂量下且持续必需的时期，至少有效实现所希望或指示效果，包括治疗或预防结果的量。有效量可在一次或多次给予中提供。“治疗有效量”至少是实现特定障碍的可测量改进所需要的细胞的最低剂量。本文的治疗有效量可根据如患者的疾病状态、年龄、性别和重量的因素而变化。治疗有效量还可以是其中治疗上有益的效果超过抗体的任何毒性或有害影响的量。“预防有效量”是指在必需剂量下且持续必需的时期，有效实现所希望预防结果的量。典型地但不是必需地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量可小于治疗有效量。
如本文所用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗目的的“哺乳动物”包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
II.工程化NK细胞
本文提供了一种工程化NK细胞，其被基因工程化为减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。还提供了工程化所述细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括引入遗传破坏或抑制性核酸，所述抑制性核酸破坏基因或抑制基因的表达，从而导致NK细胞中FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少。
在一些实施方案中，工程化NK细胞被基因工程化以直接减少或消除FcRγ链的表达或活性。在一些实施方案中，工程化NK细胞被基因工程化以间接减少或消除FcRγ链的表达或活性，如通过减少或消除调节FcRγ的表达或活性的蛋白质(例如控制FcRγ的表达的转录因子)的表达。在一些实施方案中，工程化NK细胞被基因工程化以减少或消除参与FcRγ的下游信号传导的分子的表达或活性。在一些方面，工程化细胞保留或另外地被工程化以通过CD3δ转导信号，如在CD16接合或交联时。
工程化的目标
在一些实施方案中，NK细胞被基因工程化以减少或消除人FcRγ链蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码FcRγ链的基因或编码调节FcRγ链蛋白的表达或活性的蛋白质的基因的遗传破坏。在一些实施方案中，所述遗传破坏导致基因中的插入、缺失或突变，如开放阅读框内的移码突变和/或过早终止密码子。在一些实施方案中，一个等位基因被破坏。在一些实施方案中，两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含抑制性核酸，如siRNA或其他抑制性核酸分子，其减少编码FcRγ链的基因或编码调节FcRγ链蛋白的表达或活性的蛋白质的基因的表达。
FcRγ链(智人，也称为高亲和力免疫球蛋白γFc受体I)的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号NP_004097.1(GI:4758344)获得，并在以下复制为SEQ ID NO:1。
1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT
41 LLYCRLKIQV RKAAITSYEK SDGVYTGLST RNQETYETLK
81 HEKPPQ
FcRγ链的NCBI数据库基因组参考序列是NG_029043.1 RefSeqGene。mRNA参考序列是1.NM_004106.1。
工程化NK细胞可在编码FcRγ信号传导衔接子的基因中含有突变、破坏或缺失，例如FcRγ链基因外显子中的失活突变。突变、破坏或缺失还可能在FcRγ链基因的调节元件中，例如在启动子中。
各种失活突变或缺失还可用于减少FcRγ链的表达。例如，可使用免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)中的突变。在一些实施方案中，工程化NK细胞可包含ITAM基序中的失活突变。在其他实施方案中，FcRγ链的跨膜区可突变以使蛋白质失活。
在一些实施方案中，还可能的是通过增加或减少调节FcRγ链的蛋白质的表达，间接地减少FcRγ链表达或活性。在一些实施方案中，工程化NK细胞被基因工程化以减少或消除调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质(如转录因子，例如PLZF或HELIOS)的表达。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含编码调节FcRγ链蛋白的表达或活性的蛋白质的基因的遗传破坏。在一些实施方案中，所述遗传破坏导致基因中的插入、缺失或突变，如开放阅读框内的移码突变和/或过早终止密码子。在一些实施方案中，一个等位基因被破坏。在一些实施方案中，两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含抑制性核酸，其减少编码调节FcRγ链蛋白的表达或活性的蛋白质(如转录因子，例如PLZF或HELIOS)的基因的表达。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可在促进FcRγ信号传导衔接子转录的基因中含有遗传破坏、缺失或突变。在一些实施方案中，工程化NK细胞可在编码促进FcRγ链转录的转录因子的基因中具有遗传破坏、突变或缺失。例如，工程化NK细胞可在编码PLZF或HELIOS转录因子的基因中具有遗传破坏。在一些实施方案中，PLZF和/或HELIOS的一个等位基因被破坏。在一些实施方案中，PLZF的两个等位基因或HELIOS的两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞含有抑制性核酸分子，如siRNA或其他抑制性核酸分子，其减少促进FcRγ信号传导衔接子转录的基因的表达。在一些实施方案中，工程化NK细胞可具有靶向促进FcRγ链转录的转录因子的抑制性核酸分子，如靶向编码PLZF或HELIOS转录因子的基因的抑制性核酸分子。
PLZF的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号NP_001018011.1获得，并在以下复制为SEQ ID NO:3。NCBI数据库基因组参考序列是NG_012140.1。mRNA参考序列是NM_001018011.1。
MDLTKMGMIQLQNPSHPTGLLCKANQMRLAGTLCDVVIMVDSQEFHAHRTVLACTSKMFEILFHRNSQHYTLDFLSPKTFQQILEYAYTATLQAKAEDLDDLLYAAEILEIEYLEEQCLKMLETIQASDDNDTEATMADGGAEEEEDRKARYLKNIFISKHSSEESGYASVAGQSLPGPMVDQSPSVSTSFGLSAMSPTKAAVDSLMTIGQSLLQGTLQPPAGPEEPTLAGGGRHPGVAEVKTEMMQVDEVPSQDSPGAAESSISGGMGDKVEERGKEGPGTPTRSSVITSARELHYGREESAEQVPPPAEAGQAPTGRPEHPAPPPEKHLGIYSVLPNHKADAVLSMPSSVTSGLHVQPALAVSMDFSTYGGLLPQGFIQRELFSKLGELAVGMKSESRTIGEQCSVCGVELPDNEAVEQHRKLHSGMKTYGCELCGKRFLDSLRLRMHLLAHSAGAKAFVCDQCGAQFSKEDALETHRQTHTGTDMAVFCLLCGKRFQAQSALQQHMEVHAGVRSYICSECNRTFPSHTALKRHLRSHTGDHPYECEFCGSCFRDESTLKSHKRIHTGEKPYECNGCGKKFSLKHQLETHYRVHTGEKPFECKLCHQRSRDYSAMIKHLRTHNGASPYQCTICTEYCPSLSSMQKHMKGHKPEEIPPDWRIEKTYLYLCYV
HELIOS(IKZF2)的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号NP_057344.2(同种型1)和NP_001072994.1(同种型2)获得。NCBI基因标识符是NC_000002.12。所述mRNA参考序列是NM_016260.2(同种型1)NM_001079526.1(同种型2)。所述基因ID是22807。
在一些实施方案中，工程化NK细胞被基因工程化以减少或消除参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含FcRγ链依赖性信号传导的减少。例如，工程化NK细胞可具有参与FcRγ链依赖性信号传导的下游分子的减少表达。例如，Lee和Schlums描述了FcRγ信号传导通路的成员，其可以是修饰和/或缺失的合适靶标(Lee等人,Immunity42:431-42(2015)；Schlums等人Immunity,42:443-56(2015))。在这些实施方案的一些中，所述下游分子包括SYK、DAB2或EAT2。SYK的基因ID是6850。DAB2的NCBI基因ID是1601。DAB2的基因组参考序列是NG_030312.1。DAB2的同种型2的mRNA和蛋白质序列是001244871.1和NP_001231800.1。DAB2的同种型1的mRNA和蛋白质序列是2.NM_001343.3和NP_001334.2。EAT2的NCBI基因ID是175072。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可在编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因中含有遗传破坏、突变或缺失。例如，工程化NK细胞可在编码SYK、DAB2和/或EAT2的基因中具有遗传破坏。在一些实施方案中，SYK、DAB2和/或EAT2的一个等位基因被破坏。在一些实施方案中，SYK的两个等位基因、DAB2的两个等位基因和/或EAT2的两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，工程化NK细胞含有抑制性核酸分子，如siRNA或其他抑制性核酸分子，其减少参与FcRγ链依赖性信号传导的基因的表达。在一些实施方案中，工程化NK细胞可具有靶向信号传导分子的抑制性核酸分子，如靶向编码SYK、DAB2和/或EAT2的基因的抑制性核酸分子。
还提供了工程化NK细胞，其被基因工程化为减少或消除NK抑制性受体的表达。在一些方面，如以上所述被工程化以具有FcRγ链的减少表达、信号传导和/或活性的任何所提供的工程化产物另外地可被工程化以减少或消除NK抑制性受体的表达。在一些情况下，工程化细胞含有编码NK抑制性受体的基因的破坏。在一些实施方案中，工程化细胞含有抑制性核酸分子，如siRNA或其他抑制性核酸分子，其减少编码NK抑制性受体的基因的表达。抑制性NK受体是本领域已知的并且包括NKG2A(也称为KLRC1；NCBI基因ID 3821)和KIR2DL1(NCBI基因ID 3802)。使用本文提供的任何方法，例如使用干扰性RNA或遗传破坏，包括产生终止密码子或移码的基因插入、突变或缺失，可工程化NK细胞以减少抑制性NK受体的表达。
在以上实施方案中，此类工程化NK细胞包括包含由核苷酸取代、缺失或添加产生的遗传破坏的工程化NK细胞。取代、缺失或添加可涉及一种或多种核苷酸。变体可在编码区、非编码区或两者中有所改变。编码区中的改变可产生非保守的氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，所述遗传破坏包含插入、缺失或突变，其导致基因中的过早终止密码子或者基因的开放阅读框的移码。
在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的基因产物的表达相比，工程化细胞中如任何以上所述的特定基因产物的表达减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，工程化细胞中特定基因产物的表达减少到不能检测到的水平。在一些实施方案中，工程化细胞中特定基因产物的表达被完全消除。在这些实施方案的一些中，所述基因是FcRγ链。在其他实施方案中，所述基因可编码调节FcRγ链的蛋白质，如促进FcRγ链的表达的转录因子，如PLZF或HELIOS。在其他实施方案中，所述基因可编码参与FcRγ链介导的信号传导的蛋白质，如下游信号传导分子SYK、DAB2或EAT2。
在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中的基因的表达相比，所提供的工程化NK细胞中FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在这些实施方案的一些中，FcRγ链表达的水平减少到不能使用免疫印迹测定检测到的水平。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可表达CD16(也称为CD16A或FcyRIIIa)。因此，本文提及CD16并不意味着是指糖基磷脂酰肌醇锚定的形式(FcγRIIIB或CD16B)。在这些实施方案的一些中，CD16是人CD16。在人体内或作为糖基磷脂酰肌醇锚定的形式(FcγRIIIB或CD16B)。典型地，所提供的工程化细胞表达多肽锚定的CD16形式，其能够与TCR-CD3复合物的δ链关联。CD16与抗体Fc区结合并引发ADCC。在一些实施方案中，其他Fc受体蛋白的表达在工程化NK细胞中得以维持。
CD16A的基因组序列可在NCBI数据库中以NG_009066.1获得。CD16A的基因ID是2214。CD16的序列信息(包括基因多态性)可以UniProt登录号P08637获得。CD16a的核酸和蛋白质序列是公共可获得的。例如，GenBank登录号NM_000569(SEQ ID NO:1)、NM_001127596、NM_001127595、NM_001127593和NM_001127592公开了示例性人CD16a核酸序列，并且GenBank登录号NP_000560(SEQ ID NO:2)、NP_001121068、NP_001121067、NP_00112065和NP_001121064公开了示例性人CD16a蛋白质序列。本领域普通技术人员可鉴定与本文提供的不同但保留CD16a的至少一种活性(如Fc结合活性)的另外CD16a核酸和氨基酸序列。
CD16最常见的形式是对IgG分子的Fc部分具有相对低的结合亲和力。在一些个体中发现了表现出更高结合亲和力的替代形式。CD16的低亲和力形式和高亲和力形式的不同之处仅在于，多肽链成熟(加工)形式中位置158处的缬氨酸(高亲和力)被苯丙氨酸(低亲和力)取代。CD16(158F)的序列在SEQ ID NO:4中列出(残基158F是粗体并加下划线)。在一些实施方案中，CD16(158F)还包含一种信号肽，其被列出为MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:5)。
CD16 158V(导致F158V的多态性)的序列被称为VAR_003960，并且具有在SEQ IDNO:6中列出的序列(158V多态性以粗体表示并加下划线)。在一些实施方案中，CD16(158V)还包含一种信号肽，其被列出为MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可包含含有激活突变的CD16基因。在实施方案的一些中，所述突变导致对IgG区域的更高亲和力。在这些实施方案的一些中，CD16突变导致CD16对IgG1、IgG2或IgG4的更高亲和力。在一些实施方案中，CD16突变导致CD16对IgG1的更高亲和力。在一些实施方案中，CD16含有158V突变。在一些实施方案中，CD16具有在SEQID NO:6中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6表现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并含有158V多态性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD16中的突变是158F突变。在一些实施方案中，CD16具有在SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4表现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并含有158F多态性的氨基酸序列。
在一些方面，工程化NK细胞可被工程化以表达重组或异源CD16。在一些实施方案中，即使NK细胞可表达CD16，NK细胞也可被工程化以与在不存在基因工程化的情况下由NK的表达相比，进一步表达更高水平的CD16和/或表达CD16的修饰形式。在此类例子中，所述细胞可被工程化以含有核酸，所述核酸包含随后是CD16基因的强或组成型启动子。
工程化NK细胞还可表达其他信号传导衔接子分子。例如，具有除FcRγ之外的ITAM结构域的信号传导分子。在一些实施方案中，工程化NK细胞表达CD3δ衔接子链。在这些实施方案的一些中，CD3δ是人CD3δ。
人CD3δ(智人)的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号ABQ28690.1(GI:146399947)获得，并在以下复制为SEQ ID NO:2。
1 AILQAQLPIT EAQSFGLLDP KLCYLLDGIL FIYGVILTAL
41 FLRVKFSRSA DAPAYQQGQN QLYNELNLGR REEYDVLDKR
81 RG
CD3δ(CD247)的NCBI基因ID是919。
在一些方面，工程化NK细胞可被工程化以表达重组或异源CD3δ。在一些实施方案中，即使NK细胞可表达CD3δ，NK细胞也可被工程化以与在不存在基因工程化的情况下由NK的表达相比，进一步表达更高水平的CD3δ和/或表达CD3δ的修饰形式。在此类例子中，所述细胞可被工程化为含有核酸，所述核酸包含随后是CD3δ基因的强或组成型启动子。在一些实施方案中，工程化细胞可包含具有激活突变的CD3δ基因。在其他实施方案中，工程化NK细胞可在工程化后以更高水平表达CD3δ。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可具有减少的NK细胞表面受体(包括自然细胞毒性受体)表达。与未经修饰的NK细胞相比，工程化NK细胞可具有减少的NKp46、NKp30和/或NKp44表达。在这些实施方案的一些中，细胞表面受体的表达减少大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、10倍、100倍或1000倍。在这些实施方案的一些中，NK细胞表面受体在工程化NK细胞中可能不能检测到。在其他实施方案中，NK细胞可能对NK细胞表面受体(如NKp46、NKp30和/或NKp44)是阴性的。
细胞类型
本领域技术人员将理解，从人组织获得的原代细胞和现有细胞系两者均适用于工程化。例如，在一些实施方案中，工程化NK细胞可来源于从受试者(如人)获得的原代细胞。
原代细胞
原代细胞可使用本文提供的任何方法工程化。根据一些实施方案，包含所述NK细胞的细胞群从来自哺乳动物受试者(如人受试者)的样品获得。所述样品或来源可以是脐带血、骨髓或外周血。
在一些方面，从所述细胞群分离表达一种或多种自然杀伤细胞特异性标记物的自然杀伤细胞。分离和鉴定NK细胞的方法是本领域熟知的，并且包括在Dahlberg等人,Frontiers in Immunology,第6卷第605条第1-18页(2015)中讨论的那些方法。
用于体外分离和大规模扩增NK细胞的技术是已知的。示例性程序描述于美国专利申请公开号2014/0086890中，其通过引用整体并入本文。本领域普通技术人员可鉴定用于扩增NK细胞的另外的方法，例如描述于Childs等人,Hematol.The Education Program2013:234-246,2013中，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，从受试者(如供体受试者或患有肿瘤或过度增殖性疾病的受试者)收集单核细胞。在一些例子中，单核细胞通过单采程序收集。例如通过使用免疫磁珠策略进行阴性耗尽，使单核细胞富集NK细胞。在一些例子中，利用生物素化单克隆抗体的混合物，通过耗尽T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、血小板、巨噬细胞和红细胞的单核细胞样品来富集NK细胞。用与链霉亲和素偶联的磁珠除去样品中的非NK细胞，从而得到富集NK细胞的制剂。用于此方法的示例性可商购获得的试剂盒是UntouchedTM人NK细胞试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。在另一个例子中，例如利用与抗CD56抗体缀合的磁珠(如CD56微珠，Miltenyi Biotec公司,Auburn,CA)，通过阳性选择CD56+NK细胞来富集NK细胞。在其他例子中，将包括阴性耗尽(如T细胞耗尽)随后阳性选择CD56+NK细胞的两步方法用于富集NK细胞。
在一些实施方案中，自然杀伤细胞可被鉴定为表达典型人自然杀伤细胞标记物(如KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD56和CD161)的那些细胞。对于涉及小鼠的研究，可使用典型的小鼠标记物，如NK1.1、CD 122、LY49家族(Ly49A、Ly49C、Ly49D、Ly49E、Ly49F、Ly49G、Ly49H和Ly49I)或NKG2A/C/E来鉴定和/或分离自然杀伤细胞。在一些实施方案中，细胞染色或FACS可用于鉴定表达某一标记物的细胞。
在一些实施方案中，可使用阳性或阴性选择来选择性地富集NK细胞。例如，可通过将细胞混合物暴露于固定的抗CD3抗体并除去未结合细胞来选择不表达CD3的NK细胞。根据本发明的一些实施方案，NK细胞包括CD56+CD3-细胞。根据本发明的一些实施方案，NK细胞包括CD56+CD16+CD3-细胞。
在一个实施方案中，可在分离原代NK细胞之前向受试者给予细胞因子。例如，可在分离原代NK细胞之前向受试者给予IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或CCL5。
对于表达CD16和CD3δ的那些细胞，富集分离的NK原代细胞也可能是有益的。本领域技术人员将理解，存在许多从存在的群体选择性地富集表达某些标记物的细胞的方法，如荧光细胞分选或使用与固相结合的抗体选择性耗尽表达某些标记物的细胞。
在一些实施方案中，所述方法可在当前良好制造规范(cGMP)下进行或适用于当前良好制造规范(cGMP)。本领域普通技术人员可鉴定可用于制备富集的NK细胞群的其他方法。
在一些实施方案中，富集的NK细胞(典型地>99％CD3阴性和>85％CD56+)在对所述细胞进行基因工程化之前或之后在体外扩增。
在一个非限制性例子中，将富集的NK细胞与辐照的EBV-LCL饲养细胞系(SMI-LCL)在具有10％人AB血清和500IU/ml白细胞介素-2(IL-2)的X-VIVOTM 20培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中培养长达21天。利用此技术，可实现NK细胞在200倍至1000倍范围内的扩增(扩增的NK细胞典型地>99％CD3阴性且>90％CD56+)。在一些例子中，富集的NK细胞的起始群体为约0.8-1.6x 108个总NK细胞，其在2-4周的时间内在体外扩增至1000倍或更多。在使用GMP条件的放大实验中，已扩增了类似数量的NK细胞。在一些例子中，NK细胞在容器(Wilson Wolf,New Brighton,MN)中扩增。100容器支持NK扩增至2.5x 108个NK细胞/kg或更高的剂量。在100容器中培养的NK细胞可以高达4x 106个NK细胞/ml的浓度培养。
在一些实施方案中，通过另外的富集程序(如通过使用免疫磁珠或流动分选)分离的大量NK细胞或NK细胞亚群可在细胞培养基(例如，含有10％人AB血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素和500IU/mL IL-2的Cellgro SCGM无血清培养基(CellGenix,Gaithersburg,MD))中或在含有10％热灭活的人AB血清或10％自体血清的X-VIVOTM 20培养基中生长。
可通过流式细胞术分析未扩增和扩增的NK细胞的标记物(如CD56、CD16、TRAIL、FasL、NKG2D、LFA-1、穿孔素以及颗粒酶A和B)的表达。在一些例子中，在基线时并且在体外扩增后>10天测量一种或多种标记物的表达。铬释放测定可用于评估新鲜和扩增的NK细胞对癌细胞靶标的细胞毒性。本领域普通技术人员可鉴定评估NK细胞群(例如纯度)、生存力和/或活性的其他方法。
在一些实施方案中，来源于受试者的扩增的原代细胞可在基因工程化之前扩增和/或培养。在一些实施方案中，工程化原代细胞可在工程化之后且在给予至患者之前培养和/或扩增。
NK细胞系
在一些实施方案中，可如本文所述工程化NK细胞系。在一些实施方案中，工程化NK细胞包括工程化NK细胞系。在一些方面，工程化细胞系允许产生更大量的细胞而不必扩增来源于受试者的少量NK细胞。工程化细胞系还具有被良好表征的优点。
在一些实施方案中，所述细胞系是克隆细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系来源于患有NK细胞白血病或淋巴瘤的患者。在一些实施方案中，所述NK细胞系包括NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
NK-92是NK样细胞系，其最初从患有大颗粒淋巴瘤的受试者的血液分离，并且随后在细胞培养中增殖。已描述了NK-92细胞系(Gong等人,1994；Klingemann,2002)。NK-92细胞具有为NK细胞特有的CD3-/CD56+表型。它们表达除CD16之外的所有已知NK细胞激活受体，但缺乏除NKG2A/CD94和ILT2/LIR1(以低水平表达)之外的所有已知NK细胞抑制性受体。此外，不同于从血液分离的多克隆NK细胞，NK-92是在类型和细胞表面浓度两个方面以一致性方式表达这些受体的克隆细胞系。类似地，当治疗地给予至人受试者时，NK-92细胞不是免疫原性的并且不引起免疫排斥反应。事实上，NK-92细胞在人体内耐受性良好，对正常组织没有已知的有害影响。
一些现有的细胞系(如NK-92)未自然地表达CD16。在一些实施方案中，本文提供的方法包括工程化NK细胞系(如NK-92)以表达CD16。Klingemann等人也讨论了NK92细胞系的优点。Klingemann等人,Frontiers in Immunology,第7卷,第91条第1-7页(2016)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括工程化细胞系以表达CD3δ。在一些实施方案中，CD16和/或CD3δ可诱导或短暂地表达。在此类实施方案中，所述细胞系未被工程化以异源或重组地表达FcRγ链，或被工程化以减少或消除所述细胞中FcRγ链的表达。
产生工程化NK细胞的方法
本文提供了产生工程化NK细胞的方法，所述工程化NK细胞如所述地被基因工程化以减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。例如，所述方法可包括引入如所述的对编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ信号传导衔接子的表达或活性的蛋白质(例如转录因子，如PLZF或HELIOS)的基因和/或编码参与FcRγ介导的信号传导的蛋白质(例如下游信号传导分子，如SYK、DAP2或EAT2)的基因的遗传破坏。在一些实施方案中，所述方法可包括引入如所述的靶向编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ信号传导衔接子的表达或活性的蛋白质(例如转录因子，如PLZF或HELIOS)的基因和/或编码参与FcRγ介导的信号传导的蛋白质(例如下游信号传导分子，如SYK、DAP2或EAT2)的基因的抑制性核酸分子。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括如通过如上所述或技术人员已知的方法从受试者分离NK细胞，并根据所提供的方法减少所述细胞中FcRγ链表达、活性和/或信号传导的表达。在一些实施方案中，本文提供的方法包括获得NK细胞系(如本文所述的任何NK细胞系)，并根据所提供的方法工程化所述细胞以减少所述细胞中FcRγ表达、活性和/或信号传导的表达。
本领域普通技术人员将理解存在许多方式来减少FcRγ的表达或活性。例如，可降低转录水平。一种减少基因表达(如FcRγ链表达)的方法包括修饰内源基因以减少转录。例如，可缺失、破坏或突变FcRγ链基因。除靶向FcRγRNA、突变或修饰FcRγ基因之外，还可通过影响增加FcRγ基因表达或活性的分子(如调节FcRγ转录的转录因子)来降低FcRγ蛋白水平。在一些实施方案中，可缺失、破坏或突变调节FcRγ链基因的转录或翻译的基因。在这些实施方案的一些中，所述基因是调节FcRγ链基因的表达的转录因子。具体地，抑制正向调节FcRγ表达的转录因子将导致FcRγ表达减少。调节FcRγ转录的转录因子包括HELIOS和PLZF。
本领域普通技术人员将了解，存在许多合适的方法用于破坏FcRγ链基因或其他基因(如本文所述的那些基因)。例如，可缺失整个基因座，如FcRγ基因座。在一些情况下，还适合的是缺失所述基因的一部分，例如外显子或结构域。具体地，可缺失FcRγ的ITAM信号传导结构域。可替代地，所提供的方法还包括将一个或多个氨基酸取代引入基因座(如FcRγ基因座)中，如失活突变。在一些实施方案中，可将终止密码子引入mRNA(如FcRγmRNA)中以产生截短和/或失活形式的表达基因(如FcRγ信号传导衔接子)。在一些实施方案中，还可突变或缺失所述基因(如FcRγ基因)的条件元件，以便减少FcRγ信号传导衔接子的表达、活性和/或信号传导。
在一些实施方案中，可使用位点特异性内切核酸酶在哺乳动物细胞中进行基因破坏。允许位点特异性缺失基因的内切核酸酶是本领域熟知的，并且可包括TAL核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、Cas9和Argonaute。产生工程化、位点特异性内切核酸酶的方法是本领域已知的。可工程化位点特异性内切核酸酶以识别并缺失或修饰特定基因，如FcRγ链基因。
在一个实施方案中，可工程化锌指核酸酶(ZFN)以识别并切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白，其包含与Fokl限制性内切酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。可通过合理的或实验性手段重新设计锌指结构域，以产生与预定DNA序列结合的蛋白质，长度为约或大约18个碱基对。通过将此工程化蛋白质结构域与Fokl核酸酶融合，有可能以基因组水平特异性靶向DNA断裂。ZFN已被广泛使用以在大范围的真核生物中靶向基因添加、去除和取代(综述于S.Durai等人,Nucleic Acids Res 33,5978(2005)中)。
在其他实施方案中，可产生TAL效应核酸酶(TALEN)以切割基因组DNA中的特定位点。像ZFN一样，TALEN包含与Fokl核酸酶结构域融合的工程化、位点特异性DNA结合结构域(综述于Mak等人(2013)Curr Opin Struct Biol.23:93-9中)。然而，在这种情况下，所述DNA结合结构域包含串联排列的TAL效应结构域，其中的每个均特异性识别单个DNA碱基对。由于ZFN和TALEN是异二聚体，因此在细胞中产生单个功能核酸酶需要两种蛋白质单体的共表达，紧凑的TALEN提供了可替代内切核酸酶结构，这避免了二聚化的需要(Beurdeley等人(2013)Nat Commun.4:1762)。紧凑的TALEN包含工程化、位点特异性TAL效应DNA结合结构域，其与来自I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合。与Fokl不同，I-TevI不需要二聚化即产生双链DNA断裂，因此紧凑的TALEN可充当单体。
在一些实施方案中，基于CRISPR/Cas9系统的工程化内切核酸酶也是本领域已知的，并且可在所提供方法中用于工程化细胞(Ran等人(2013)Nat Protoc.8:2281-2308；Mali等人(2013)Nat Methods.10:957-63)。CRISPR内切核酸酶包含两种组分：(1)半胱天冬酶效应核酸酶，典型地是微生物Cas9；和(2)短的“指导RNA”，其将核酸酶导向基因组中感兴趣的位置。在一些实施方案中，指导RNA包含大约20个核苷酸靶向序列。通过在同一细胞中表达多个指导RNA(各自具有不同的靶向序列)，有可能将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点。使用CRISPR-Cas9的方法是本领域熟知的。
在一些方面，指导序列是至少包含与靶多核苷酸序列(如编码FcRγ、PLZF、HELIOS、SYK、DAB2或EAT2的基因)具有足够互补性的序列部分，以与靶序列杂交并引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。典型地，在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”一般是指指导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中在所述靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补性。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些实施方案中，指导序列被选择为降低所述指导序列内的二级结构的程度。可通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定二级结构。
在一些实施方案中，将与指导序列组合(并任选地与其复合)的CRISPR酶(例如Cas9核酸酶)递送至所述细胞。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物，如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
在本发明的一个实施方案中，DNA断裂诱导剂是工程化归巢内切核酸酶(也称为“巨核酸酶”)。归巢内切核酸酶是一组天然存在的核酸酶，其识别通常在植物和真菌基因组中发现的15-40个碱基对的切割位点。它们经常与寄生的DNA元件(如第1组的自剪接内含子和内含子)相关。它们通过在染色体中产生双链断裂，自然地促进宿主基因组中特定位置处的同源重组或基因插入，从而招募细胞的DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95)。归巢内切核酸酶通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cys盒家族和HNH家族。这些家族的特征在于结构基序，其影响催化活性和识别序列。例如，LAGLIDADG家族成员的特征在于具有保守LAGLIDADG基序的一个或两个拷贝(参见Chevalier等人(2001),Nucleic Acids Res.29(18):3757-3774)。具有LAGLIDADG基序的单个拷贝的LAGLIDADG归巢内切核酸酶形成同二聚体，而具有LAGLIDADG基序的两个拷贝的成员被发现为单体。
减少FcRγ链表达、活性和/或信号传导的另一种方法包括将靶向(例如与其互补)靶基因转录物(如FcRγ、PLZF、HELIOS、SYK、DAB2或EAT2基因转录物)的抑制性核酸(如抑制性RNA)引入细胞中，从而减少所述基因产物的表达。例如，所述核酸可靶向FcRγ链mRNA。在其他实施方案中，抑制性核酸可靶向调节FcRγ链基因转录或翻译的基因的mRNA，如转录因子，例如PLZF或HELIOS mRNA。在一些实施方案中，所述核酸靶向编码参与FcRγ介导的信号传导的蛋白质的基因的mRNA，如SYK、DAB2或EAT-2mRNA。
当前公开的主题利用RNAi技术(例如shRNA、siRNA和miRNA分子和核酶)来引起细胞基因的下调，所述过程称为RNA干扰(RNAi)。如本文所用，“RNA干扰”(RNAi)是指由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子、miRNA分子或合成锤头状核酶介导的序列特异性转录后基因沉默过程。一般参见Fire等人,Nature 391:806-811,1998和美国专利号6,506,559。RNA干扰(RNAi)介导的转录后基因沉默过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，其已经进化到阻止外来基因的表达(Fire,Trends Genet 15:358-363,1999)。
在一些实施方案中，可产生包含编码所述RNA的核酸的重组病毒。工程化逆转录病毒载体是本领域普通技术人员已知的。这样的技术人员将容易地理解选择优化重组病毒产生所需的适当病毒和载体组分以用于当前公开的主题所涉及的多种因素，而无需在本文中进一步详细讨论。作为一个非限制性例子，逆转录病毒可被工程化，从而包含编码包含siRNA的shRNA的DNA。
所述基因表达可永久地、短暂地或可诱导地减少。合适的可诱导系统是熟知的，并且包括对重金属、Lac/VP16和四环素阻遏物系统有反应的真核启动子。
在另一方面，例如通过产生具有导致基因失活的缺失、取代或插入的细胞系，永久地减少所述基因的表达可能是有益的。
逆转录病毒系统可用于将cDNA引入NK细胞中。真核细胞转染和原核细胞转化的方法是本领域熟知的。宿主细胞的选择决定了引入感兴趣的多核苷酸的优选技术。将多核苷酸引入生物中还可用离体技术进行，所述离体技术使用体外转染方法，以及针对所述特定生物体的已建立的遗传技术(如果有的话)。
其他载体和包装细胞系已经用于制备NK细胞的遗传修饰变体，并且可在本文中等同地使用。逆转录病毒转导系统也已成功地用于将多种基因转导到NK细胞中。举例来说，这些可替代方法包括但不限于与FLYA13包装细胞结合的p-JET载体(Gerstmayer等人,1999)、基于质粒的kat逆转录病毒转导系统和DFG-hIL-2-neo/CRIP(Nagashima等人,1998)。还可实践将载体电穿孔和“基因枪”引入包装细胞中。pBMN-IRES-EGFP载体与Phoenix-两性包装细胞系的组合使用对于此目的和以下实施例是方便的，因为它提供了Phoenix-两性细胞转染的高效率；Moloney LTR启动子的使用导致高水平的CD16表达；病毒以高滴度产生；NK转导的效率比已经用于转导NK细胞的其他载体有所改进；并且载体提供了足够的空间来容纳CD16 cDNA或可替代插入物。pBMN-IRES-EGFP载体进一步并入用于增强绿色荧光蛋白(EGFP)的基因，其可用作基因表达的内源替代标记物。Phoenix细胞系以游离形式稳定地表达此载体，同时产生其他病毒组分，从而允许所述细胞长时间稳定地产生病毒。
将基因引入细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见，例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质配制品以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一方面，核酸可以与脂质关联。与脂质相关的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关联的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,Mo获得；磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids公司(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或者氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或根据所提供的方法以其他方式工程化所述细胞，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR或“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)。
工程化细胞的特征
与所述基因工程化相关的基因产物的表达可在NK细胞的工程化和/或培养之后或与其结合进行评估。技术人员已知的任何可用程序均可用于检测基因产物，只要所述程序不损伤细胞。例如，可通过流式细胞术检测、鉴定和/或分离NK细胞以用于检测与基因产物表达相关的细胞表面标记物，如与FcRγ表达相关的标记物。通过如所述的基因工程化调节表达的靶标(如FcRγ蛋白)是细胞内蛋白，其不容易被检测，除非所述细胞被处理以允许细胞内蛋白被检测，例如通过固定和透化。
在一些实施方案中，本文提供的方法导致与未基因工程化的NK细胞中基因产物的表达相比，工程化细胞中特定基因产物的表达减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，与未基因工程化的NK细胞中FcRγ链的表达相比，本文提供的方法使FcRγ链表达减少大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在这些实施方案的一些中，FcRγ链表达的水平减少到不能使用免疫印迹测定检测到的水平。
如所述基因产物的表达(如FcRγ链表达)可以多种方式测量。例如，RNA表达可通过RNA印迹法、qPCR和FISH测量。蛋白质表达也可例如使用流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学、ELISA等测量。
在一些方面，当被抗体激活时，所提供的工程化NK细胞表现出增强的活性，如可通过抗体介导的CD16交联或通过抗体包被的细胞(例如抗体包被的肿瘤细胞)发生。在一些实施方案中，所提供的工程化NK细胞在抗体或其他含Fc蛋白质存在时特别敏感，并且可用于与给予的单克隆抗体或对肿瘤、病毒或微生物细胞特异的其他含Fc蛋白质组合的方法中。在一些情况下，所提供的工程化NK细胞表现出与g-NK细胞相同或相似的特性或特征，所述g-NK细胞是以少量存在于个体中但仅存在于约三分之一人群中的缺乏FcRγ的NK细胞的特定子集(参见例如公布的专利申请号US2013/0295044；还参见Hwang等人(2012)Int.Immunol.,24:793-802和Lee等人(2015)Cell Immunity,42:431-442))。
在一些实施方案中，在通过CD16交联的CD16接合后观察到增加的活性，如可在抗体存在下通过抗体的Fc部分与CD16的结合和ADCC的引发而发生。在一些实施方案中，增加的活性可通过监测CD3δ链的磷酸化、信号传导分子、CA2+通量、细胞的细胞因子(例如IFN-γ或TNF-α)表达或分泌、工程化细胞的趋化因子(MIP-1α、MIP-1β或RANTES)表达或分泌、脱粒反应、颗粒酶B的表达和/或细胞毒性杀伤反应来确定。许多熟知的测定法中的任一种均可用于评估工程化NK细胞的特性或活性(参见例如Hwang等人(2012)Int.Immunology,24:793-802；公布的专利申请号US2013/0295044)。在一些实施方案中，与相同测定中但不存在CD16交联或接合的工程化NK细胞中的活性相比，CD16交联或接合后工程化NK细胞的活性增加大于或者大于约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
体外测定通常用于评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一个例子中，靶细胞(例如表达适合于被评估抗体的抗原的细胞)装载有指示剂材料(如51Cr)，并且将装载有指示剂的靶细胞用待评价抗体处理。所得细胞暴露于如本文所述的NK效应细胞。靶细胞的裂解是通过将指示剂物质释放到测定上清液中来指示的，其中其浓度可通过合适的方法(如闪烁计数(51Cr)或荧光强度或寿命测定)来测量。同样，功效可通过测量替代指示剂(如NK细胞释放的细胞因子)；NK细胞激活标记物(如CD25、CD69和/或CD95L)的上调；NK细胞转录因子(如NF-AT或NF-κΒ)的激活；或者胱天蛋白酶或靶细胞中其他凋亡标记物的激活来评估。亲代NK细胞(如非基因工程化NK细胞)作为对照，因为它们允许区分ADCC介导的细胞毒性和NK细胞作用于靶细胞的其他细胞溶解作用。
在一些实施方案中，工程化NK细胞能够在个体中维持延长的时间，并因此可减少需要给予细胞以具有治疗效果的次数。在一些实施方案中，本文提供的工程化细胞在给予后维持至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月或至少几个月。
III.包含工程化NK细胞的组合物和试剂盒
本文提供了包含所提供的工程化NK细胞的组合物。所述组合物包括用于给予(如以用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，将工程化细胞与药学上可接受的载体一起配制。
药学上可接受的载体可包括与药物给予相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science andpractice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油类。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。药物载体应是适用于NK细胞的载体，如盐水溶液、右旋糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。
在某些实施方案中，组合物中细胞的数量以治疗有效量提供了工程化NK细胞。在一些实施方案中，所述量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的量。在某些其他实施方案中，治疗有效量是细胞的剂量，其导致相对于未给予本文所述组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，给予所述组合物的患者或动物中癌症的生长或扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，细胞毒性的有效量被定义为能够抑制或减少癌症、病毒和微生物细胞生长的工程化NK细胞的量。在一些实施方案中，所述组合物包含一定剂量的工程化NK细胞，其为从或从约105至约1012个细胞、或约105至约108个细胞、或约106至约1012个细胞、或约108至约1011个细胞、或约109至约1010个细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含大于105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个细胞或者大于约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个细胞。
在一些实施方案中，组合物的体积是至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL，如从或从约10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL，包括端值。在一些实施方案中，所述组合物具有至少或至少约1x 105个细胞/mL、5x 105个细胞/mL、1x 106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案，组合物的细胞密度介于或介于约1x 105个细胞/mL至1x 108个细胞/mL、1x 105个细胞/mL至1x 107个细胞/mL、1x 105个细胞/mL至1x 106个细胞/mL、1x 106个细胞/mL至1x 107个细胞/mL、1x 106个细胞/mL至1x 108个细胞/mL、1x 106个细胞/mL至1x 107个细胞/mL或1x 107个细胞/mL至1x 108个细胞/mL之间，包括端值。
取决于工程化NK细胞的方法，在将NK细胞配制成用于给予的组合物之前，培养NK细胞以使其扩增可能是必要的或希望的。在所述实施方案的一些中，产生包含工程化NK细胞的组合物的方法包括培养或孵育工程化NK细胞，如在向有需要的个体给予NK细胞之前使细胞扩增至治疗有效量。
用于培养和扩增NK细胞的合适方法是已知的。例如，可使用饲养细胞，或在细胞因子存在下培养NK细胞，其增强其生长和/或激活。如本文所用，“培养”包括提供NK细胞维持所需的化学和物理条件(例如温度、气体)以及生长因子。在一个实施方案中，培养NK细胞包括为NK细胞提供增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的例子包括但不限于缓冲液、营养物、血清、维生素和抗生素以及细胞因子和典型地在生长(即培养)培养基中提供的其他生长因子。在一个实施方案中，NK培养基包括包含10％FCS的MEMα或包含5％人血清/FBS替代物(Lifeblood产品)的CellGro SCGM(Cell Genix)。适用于本发明的其他介质包括但不限于Glascow培养基(Gibco Carlsbad Calif.)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich,St Louis Mo.)或DMEM(Sigma-Aldrich,St Louis Mo.)。应注意，许多培养基含有烟酰胺作为维生素补充剂，例如MEMα(8.19μM烟酰胺)、RPMI(8.19μM烟酰胺)、DMEM(32.78μM烟酰胺)和Glascow培养基(16.39μM烟酰胺)。
在一些实施方案中，如对于将细胞引入(或再引入)人受试者的应用，使用无血清配制品(如用于淋巴细胞培养的AIM VTM无血清培养基或MARROWMAXTM骨髓培养基)进行培养。此类培养基配制品和补充剂可从商业来源获得，如Invitrogen(GIBCO)(Carlsbad,Calif.)。培养物可补充有氨基酸、抗生素和/或细胞因子，以促进最佳生存力、增殖、功能和/或存活。
在一些实施方案中，培养包含工程化NK细胞的细胞群在没有饲养层或或饲养细胞的情况下进行。在这些实施方案的一些中，工程化NK细胞可用生长因子培养。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-2和IL-15。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子仅是IL-2。
在一些实施方案中，所提供的组合物包括其中基因工程化NK细胞(如所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导减少的工程化NK细胞)占所述组合物中细胞或所述组合物中NK细胞的至少或至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的那些组合物。
本文还提供了适用于冷冻保存工程化NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含工程化NK细胞和冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于冷冻保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可在给予至患者之前在超低温下保存。工程化NK细胞还可在从哺乳动物受试者分离之后并在基因工程化之前在超低温下保存。例如，可分离淋巴细胞或工程化NK细胞的另一来源，在超低温下储存，并且然后处理以产生工程化NK细胞。可替代地，可分离、处理淋巴细胞或工程化NK细胞的另一来源以产生工程化NK细胞，并且然后在超低温下储存。
一种在超低温下小规模保存的典型方法描述于例如美国专利号6,0168,991中。对于小规模，细胞可通过在预先冷却的5％人白蛋白血清(HAS)中的低密度悬浮液(例如，浓度为约200×106/ml)在超低温下保存。可向HAS溶液中加入等量的20％DMSO。可将混合物的等分试样放入小瓶中，并在约-80℃的超低温室内冷冻过夜。
在一些实施方案中，冷冻保存的NK细胞通过解冻准备用于给予。在一些情况下，NK细胞可在解冻后立即给予至受试者。在这样的实施方案中，所述组合物无需任何进一步处理即可使用。在其他情况下，NK细胞在解冻后被进一步处理，如通过用药学上可接受的载体重悬、用激活剂或刺激剂孵育、或者在给予至受试者之前被激活洗涤并重悬在药学上可接受的缓冲液中。
本文还提供了包括工程化细胞的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本文提供了一种包括工程化细胞和另外的药剂的试剂盒。在一些实施方案中，另外的药剂包含Fc结构域。在一些实施方案中，另外的药剂是Fc融合蛋白或抗体。在一些实施方案中，另外的药剂是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在这些实施方案的一些中，另外的药剂是全长抗体。以下描述示例性抗体。
IV.治疗方法
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中病症的方法，其包括向有需要的个体给予工程化NK细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括向个体给予有效量的工程化细胞。在一些实施方案中，从或从约105至约1012个细胞、或约105至约108个细胞、或约106至约1012个细胞、或约108至约1011个细胞、或约109至约1010个细胞。在一些实施方案中，向所述个体给予包含约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个细胞的组合物。在一些实施方案中，向受试者给予从或从约106至1010个工程化NK细胞/kg。
在一些实施方案中，在分离和工程化NK细胞后不久，向个体给予工程化NK细胞。在一些实施方案中，在分离和工程化1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天内，向个体给予工程化NK细胞。
在其他实施方案中，在如通过上述方法给予和/或工程化之前，通过在培养物中生长来储存或扩增工程化NK细胞。例如，在工程化和/或向个体给予之前，NK细胞可储存大于6、12、18或24个月。
在一些情况下，NK细胞的克隆细胞系来源于癌细胞，并且因此在给予至患者时可能失去控制。在一些实施方案中，可在向受试者给予之前辐照工程化NK细胞(如来自克隆细胞系的那些)，以防止它们失去控制。
工程化NK细胞可通过任何方便的途径给予至受试者，包括肠胃外途径，如皮下、肌肉内、静脉内和/或硬膜外给予途径。
所提供的工程化NK细胞和组合物可用于治疗患有肿瘤或过度增殖性障碍或微生物感染如病毒感染、酵母感染、真菌感染、原生动物感染和/或细菌感染的个体的方法。所公开的用工程化细胞治疗受试者的方法可与治疗性单克隆抗体(如抗肿瘤抗原或抗癌抗体、抗病毒抗体或抗菌抗体)组合。可给予工程化NK细胞以用于治疗动物，如哺乳动物，例如人受试者。
在一些例子中，所述方法包括治疗过度增殖性障碍，如血液恶性肿瘤或实体瘤。可用本文所述组合物治疗的癌症和增殖性障碍类型的例子包括但不限于白血病(例如，成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、威尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、发育不良和增生。癌症的治疗和/或预防包括但不限于减轻与癌症相关的一种或多种症状，抑制或减少癌症的进展，促进癌症的消退和/或促进免疫反应。
在一些例子中，所述方法包括治疗病毒感染，如由体内病毒的存在引起的感染。病毒感染包括慢性或持续性病毒感染，其是能够感染宿主并在证明致命之前在宿主的细胞内长时间(通常为数周、数月或数年)繁殖的病毒感染。可根据本发明治疗的引起慢性感染的病毒包括，例如，人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和麻疹病毒，所有这些均可产生重要的临床疾病。长期感染可能最终导致疾病的诱发，例如在丙型肝炎病毒肝癌的情况下，对患者是致命的。可根据本发明治疗的其他慢性病毒感染包括爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)，以及其他病毒，如可能与肿瘤相关的那些病毒。
可用本文所述的组合物和方法治疗或预防的病毒感染的例子包括但不限于由以下引起的病毒感染：逆转录病毒(例如，I型和II型人T细胞淋巴细胞营养型病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦巴尔病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、角膜病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病病毒和日本脑炎病毒)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘液病毒(例如，仙台病毒以及甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳头病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)。病毒感染的治疗和/或预防包括但不限于减轻与所述感染相关的一种或多种症状，抑制、减少或抑制病毒复制，和/或增强免疫反应。
在一些实施方案中，所述组合物用于治疗酵母或细菌感染的方法。例如，本文所述的组合物和方法可治疗与以下相关的感染：酿脓链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟氏菌、白喉棒状杆菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬结克雷伯氏菌(Klebsiellarhinoscleromotis)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、胎儿弯曲杆菌(弧菌)、空肠弯曲杆菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、迟钝爱德华氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、梅毒螺旋体、梅毒螺旋体、斑点病密螺旋体、奋森氏螺旋体、伯氏疏螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、结核分支杆菌、弓形虫、卡氏肺孢子虫、土拉弗朗西斯菌、流产布氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、支原体属、立克次体、立克次体虫、衣原体属、幽门螺杆菌或其组合。
V.组合疗法
在一些实施方案中，当被抗体或含Fc的蛋白质激活时，当前工程化NK细胞表现出增强的活性。例如，可通过抗体介导的CD16的交联或通过抗体包被的肿瘤细胞激活工程化细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中病症的方法，其包括给予工程化NK细胞和抗体。如取决于个体的特定疾病或病症，本领域普通技术人员可选择适当的治疗性(例如抗癌)单克隆抗体，以与本文所述的工程化NK细胞一起给予至受试者。合适的抗体可包括多克隆、单克隆、片段(如Fab片段)、单链抗体和其他形式的特异性结合分子。
Ab可还包括人源化或人Ab。非人Ab的人源化形式是嵌合Ig、Ig链或片段(如Ab的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合亚序列)，其含有来源于非人Ig的最小序列。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc结构域。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实现(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；Verhoeyen等人,1988)。此类“人源化”Ab是嵌合Ab(1989)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化Ab典型地是人Ab，其中一些CDR残基和可能一些Fc残基被来自啮齿动物Ab中的类似位点的残基取代。人源化Ab包括人Ig(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所希望特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，相应的非人残基替代人Ig的Fv框架残基。人源化抗体可包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个(并且典型地两个)可变结构域的基本上全部，其中大多数(如果不是全部)CDR区与非人Ig的CDR区对应并且大多数(如果不是全部)FR区是人Ig共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含Ig恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人Ig恒定区(Jones等人,1986；Presta,1992；Riechmann等人,1988)。
人Ab还可使用各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,1991；Marks等人,1991)和人mAb的制备(Boerner等人,1991；Reisfeld和Sell,1985)。类似地，可利用在其中内源Ig基因已经部分或完全失活的转基因动物中引入人Ig基因来合成人Ab。在挑战后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与人观察到的相似，包括基因重排、组装和抗体库(1997a；1997b；1997c；1997d；1997；1997；Fishwild等人,1996；1997；1997；2001；1996；1997；1997；1997；Lonberg和Huszar,1995；Lonberg等人,1994；Marks等人,1992；1997；1997；1997)。
具体地，本发明的细胞可通过与识别肿瘤相关抗原的抗体一起给予来靶向肿瘤。本领域普通技术人员将理解，本发明的工程化NK细胞适合与识别肿瘤相关抗原的多种抗体一起使用。肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、散射因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、多配体蛋白聚糖(Syndecan)1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或腱生蛋白(tenascin)。在一些情况下，所述抗体是抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体和抗CD38抗体。示例性抗体包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿洛珠单抗、阿仑珠单抗、达雷木单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、ublituximab、ocaratuzumab。可选择对所选择癌症类型具有特异性的抗体，并且包括批准用于治疗癌症的任何抗体。例子包括乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin)、淋巴瘤的利妥昔单(Rituxan)和头颈部鳞状细胞癌的西妥昔单抗(Erbitux)。技术人员熟悉能够结合特定肿瘤或疾病抗原的经FDA批准的单克隆抗体，其中任一种均可根据所提供的治疗肿瘤或疾病的方法使用。
可依次或同时给予工程化NK细胞和另外的药剂。在一些实施方案中，可在给予工程化NK细胞之前给予另外的药剂。在一些实施方案中，可在给予NK细胞之后给予另外的药剂。例如，可将工程化NK细胞与对所选择癌症类型具有特异性的抗体同时给予。可替代地，可在与给予对所选择癌症类型具有特异性的抗体的时间不同的选择时间给予工程化NK细胞。
在特定例子中，在工程化NK细胞群之前、之后或基本上同时向受试者给予有效剂量的抗体。在一些例子中，向受试者给予约0.1mg/kg至约100mg/kg的抗体(如约0.5-10mg/kg、约1-20mg/kg、约10-50mg/kg、约20-100mg/kg，例如约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约16mg/kg、约20mg/kg、约24mg/kg、约36mg/kg、约48mg/kg、约60mg/kg、约75mg/kg或约100mg/kg)。考虑到特定抗体、特定疾病或病症(例如肿瘤或其他障碍)、受试者的一般状况、受试者正在接受或先前已经接受的任何另外治疗以及其他相关因素，可由熟练的临床医生选择抗体的有效量。还向受试者给予本文所述的修饰的NK细胞群。抗体和修饰的NK细胞群典型地两者均是非肠道给予的，例如静脉内给予的；然而，还可使用对肿瘤或肿瘤附近的注射或输注(局部给予)或对腹膜腔的给予。本领域技术人员可确定适当的给予途径。
还可将工程化NK细胞与抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂同时给予，或依次给予。在本发明的一些实施方案中，可将工程化细胞与细胞因子和/或生长因子组合给予至个体。根据本发明的一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。在一些实施方案中，依次给予工程化NK细胞和细胞因子或生长因子。例如，可首先给予工程化NK细胞，随后给予细胞因子和/或生长因子。在一些实施方案中，将工程化NK细胞与细胞因子或生长因子同时给予。
在一些实施方案中，向受试者给予一种或多种细胞因子(如IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-12)以支持NK细胞的存活和/或生长。可在NK细胞之前、之后或基本上同时给予所述一种或多种细胞因子。在一些例子中，可在NK细胞之后给予所述一种或多种细胞因子。在一个特定例子中，在给予NK细胞的约1-8小时内(如约1-4小时、约2-6小时、约4-6小时或约5-8小时内)向受试者给予所述一种或多种细胞因子。
在一些实施方案中，所提供的方法还可包括与化学治疗剂组合向个体给予工程化NK细胞。在一些实施方案中，所述化学治疗剂可包括环磷酰胺、氟达拉滨、甲基泼尼松。在一些实施方案中，所述化学治疗剂选自：沙利度胺、顺铂(顺式-DDP)、奥沙利铂、卡铂、蒽二酮、米托蒽醌；羟基脲、甲基肼衍生物、甲基苄肼(N-甲基肼，MM)、肾上腺皮质抑制剂、米托坦(.omicron.,.rho.'-DDD)、氨鲁米特、RXR激动剂、贝沙罗汀、酪氨酸激酶抑制剂、伊马替尼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-肌溶素)、苯丁酸氮芥、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、六甲基三聚氰胺、噻替帕、白消安、卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNTJ)、洛莫司汀(CCNU)、链脲霉素(脲佐菌素)、DNA合成拮抗剂、雌莫司汀磷酸盐、三嗪、达卡巴嗪(OTIC，二甲基三叠氮基咪唑甲酰胺)、替莫唑胺、叶酸类似物、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、嘧啶类似物、氟尿嘧啶(fiuorouracin)(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，5-FU，5FTJ)、氟尿苷(氟脱氧>'尿苷，FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、吉西他滨、嘌呤类似物、巯基嘌呤(6-巯基嘌呤，6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)、喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素，脱氧助间型霉素)、克拉屈滨和氟达拉滨、拓扑异构酶抑制剂、安吖啶、长春花生物碱、长春碱(VLB)、长春新碱、紫杉烷、紫杉醇，结合蛋白的紫杉醇(Abraxane(R))、多西紫杉醇(Taxotere(R))；表鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、放线菌素D(放线菌素D)、道诺霉素(柔红霉素、红比霉素)、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星、布舍瑞林、肾上腺皮质激素、泼尼松、孕激素、己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、甲地孕酮、己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、阿那曲唑；丙酸睾酮、氟甲睾酮、氟他胺、比卡鲁胺和亮丙瑞林。
在一些实施方案中，所述癌症药物是沙利度胺或其衍生物。在一些实施方案中，所述癌症药物选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。在某些实施方案中，所述癌症药物选自紫杉醇、Abraxane(R)和Taxotere(R)。在一个实施方案中，所述化学治疗剂选自天冬酰胺酶、贝伐单抗、博来霉素、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲、链脲霉素和6-巯基嘌呤、环磷酰胺、紫杉醇和吉西他滨。
VI.示例性实施方案
本文所提供的实施方案为：
1.一种工程化自然杀伤(NK)细胞，其中所述NK细胞被基因工程化为减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。
2.根据实施方案1的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含：
编码FcRγ链的基因的遗传破坏和/或导致所述工程化NK细胞中FcRγ链表达减少的遗传破坏；
编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质表达减少的遗传破坏；和/或
编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质表达减少的遗传破坏。
3.根据实施方案2的工程化NK细胞，其中所述遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致所述基因中的过早终止密码子或者所述基因的开放阅读框的移码。
4.根据实施方案2或实施方案3的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的两个等位基因都被破坏。
5.根据实施方案1的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含靶向所述NK细胞中的基因的抑制性核酸分子，从而导致FcRγ链的表达减少、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。
6.根据实施方案2-5中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的蛋白质表达相比，FcRγ链、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
7.根据实施方案2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少，并且所述蛋白质是转录因子。
8.根据实施方案7的工程化NK细胞，其中所述转录因子是PLZF(ZBTB16)或HELIOS(IKZF2)。
9.根据实施方案2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少，并且所述蛋白质是下游信号传导分子。
10.根据实施方案9的工程化NK细胞，其中所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT-2。
11.根据实施方案2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化细胞中FcRγ链的表达减少。
12.一种工程化NK细胞，其在编码FcRγ链的基因中包含遗传破坏，其中所述细胞中FcRγ的表达减少。
13.根据实施方案12的工程化NK细胞，其中所述遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致所述基因中的过早终止密码子或者所述基因的开放阅读框的移码。
14.根据实施方案12或实施方案13的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞的基因组中编码FcRγ链的基因的两个等位基因都被破坏。
15.根据实施方案1、5或6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含靶向编码FcRγ链的基因的抑制性核酸分子。
16.根据实施方案15的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸分子包含与编码FcRγ链的基因互补的序列。
17.根据实施方案11-16中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，FcRγ链的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
18.根据实施方案5-6和15-17中任一项的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸包含RNA干扰剂。
19.根据实施方案5-6和15-18中任一项的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA。
20.根据实施方案1-19中任一项的工程化NK细胞，其中FcRγ的表达、活性和/或信号传导减少是永久的、短暂的或可诱导的。
21.根据实施方案1-20中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达、活性和/或信号传导相比，FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
22.根据实施方案1-21中任一项的工程化NK细胞，其中在所述细胞中表达的FcRγ链的表达在免疫印迹测定中不能检测到。
23.根据实施方案1-22中任一项的工程化NK细胞，其中CD16在所述工程化NK细胞的表面上表达。
24.根据实施方案1-23中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞表达CD3-δ(CD3δ)链。
25.根据实施方案1-24中任一项的工程化NK细胞，其来源于从受试者获得的原代细胞。
26.根据实施方案25的工程化NK细胞，其中所述受试者是人。
27.根据实施方案1-24中任一项的工程化NK细胞，其来源于克隆细胞系。
28.根据实施方案27的工程化NK细胞，其中所述克隆细胞系是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
29.根据实施方案1-28中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含重组或异源CD16基因和/或重组或异源CD3-δ(CD3δ)链。
30.根据实施方案29的工程化NK细胞，其中所述CD16包含CD16激活突变、导致对IgG1的更高亲和力的突变、158V突变和/或158F突变。
31.根据实施方案1-30中任一项的工程化细胞，其中与未经修饰的NK细胞相比，当通过CD16刺激时，所述工程化NK细胞表现出增加的活性。
32.根据实施方案1-31中任一项的工程化NK细胞，其中与未经修饰的NK细胞相比，所述工程化NK细胞的NKp46、NKp30和/或NKp44的表面表达减少。
33.一种产生工程化NK细胞的方法，其包括对NK细胞进行基因工程化以减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。
34.根据实施方案33的方法，其中减少表达包括：
在所述NK细胞中破坏或抑制编码FcRγ链的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致FcRγ链的表达减少；
在所述NK细胞中破坏或抑制编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少；和/或
在所述NK细胞中破坏或抑制编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。
35.根据实施方案33或实施方案34的方法，其包括在所述NK细胞中引入缺失、突变或插入。
36.根据实施方案33-35中任一项的方法，其中所述基因编码FcRγ链。
37.根据实施方案33-35中任一项的方法，其中所述基因编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质，所述蛋白质是转录因子。
38.根据实施方案37的方法，其中所述转录因子是PLZF或HELIOS。
39.根据实施方案33-35中任一项的方法，其中所述基因编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质，所述蛋白质是下游信号传导分子。
40.根据实施方案38的方法，其中所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT2。
41.根据实施方案33-40中任一项的方法，其中所述基因的破坏或抑制通过在允许破坏或抑制所述基因的条件下在所述NK细胞中引入靶向所述基因的内切核酸酶来实现。
42.根据实施方案41的方法，其中所述内切核酸酶选自TAL核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、Cas9和Argonaute。
43.根据实施方案33-40中任一项的方法，其中破坏或抑制通过在导致抑制所述基因的条件下在所述NK细胞中引入靶向所述基因的抑制性核酸来实现。
44.根据实施方案43的方法，其中所述抑制性核酸分子包含与编码FcRγ链的基因互补的序列。
45.根据实施方案43或实施方案44的方法，其中所述抑制性核酸包含RNA干扰剂。
46.根据实施方案43-45中任一项的方法，其中所述核酸是siRNA、shRNA或miRNA。
47.根据实施方案33-46中任一项的方法，其中所述表达减少是永久的、短暂的或可诱导的。
48.根据实施方案33-47中任一项的方法，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
49.根据实施方案33-48中任一项的方法，其中所述FcRγ链表达水平不能通过免疫印迹测定检测到。
50.根据实施方案33-49中任一项的方法，其包括在所述基因工程化之前，从人受试者分离所述NK细胞。
51.根据实施方案50的方法，其包括从外周血单核细胞(PBMC)分离所述NK细胞。
52.根据实施方案50或51的方法，其中分离所述NK细胞包括使用NK细胞标记物从PBMC选择NK细胞。
53.根据实施方案52的方法，其中所述NK细胞标记物是CD56、Cd161、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44和/或NKp46。
54.根据实施方案50-53中任一项的方法，其还包括选择表达CD16和/或CD3δ的NK细胞。
55.根据实施方案50-54中任一项的方法，其还包括选择不表达表面CD3的NK细胞。
56.根据实施方案33-49中任一项的方法，其中所述NK细胞是NK细胞系。
57.根据实施方案56的方法，其中所述细胞系是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
58.根据实施方案56或实施方案57的方法，其还包括工程化所述NK细胞系以表达重组或异源CD16和/或CD3δ。
59.根据实施方案58的方法，其包括在所述NK细胞中引入编码所述CD16和/或CD3δ的核酸。
60.根据实施方案58或实施方案59的方法，其中所述CD16基因含有激活突变和/或增加CD16对IgG的亲和力的突变。
61.根据实施方案58-60中任一项的方法，其中所述CD16包含为158V的突变。
62.根据实施方案58-60中任一项的方法，其中所述CD16包含为158F的突变。
63.根据实施方案58-62中任一项的方法，其包括用编码所述CD16和/或CD3δ的核酸以病毒方式转导所述NK细胞。
64.根据实施方案58-62中任一项的方法，其包括用编码所述CD16和/或CD3δ的核酸转染所述NK细胞。
65.根据实施方案58-64中任一项的方法，其包括在所述NK细胞中短暂地、可诱导地或永久地表达CD16或CD3δ。
66.根据实施方案33-65中任一项的方法，其还包括培养或扩增所述工程化NK细胞。
67.根据实施方案66的方法，其包括用饲养细胞培养所述工程化NK细胞。
68.根据实施方案66或实施方案67的方法，其包括用细胞因子培养所述工程化NK细胞。
69.一种工程化NK细胞，其通过根据实施方案33-68中任一项的方法产生。
70.一种组合物，其包含有效量的根据实施方案1-32或69中任一项的工程化NK细胞。
71.根据实施方案70的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
72.根据实施方案71的组合物，其中所述载体是盐水溶液、右旋糖溶液或5％人血清白蛋白。
73.根据实施方案70-72中任一项的组合物，其中所述组合物包含1x 105个与1x108个之间的细胞/mL。
74.根据实施方案70-73中任一项的组合物，其包含冷冻保护剂。
75.一种试剂盒，其包括根据实施方案1-32或69中任一项的工程化细胞或根据实施方案70-74中任一项的组合物以及用于治疗疾病的另外的药剂。
76.根据实施方案75的试剂盒，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。
77.根据实施方案76的试剂盒，其中所述抗体识别或特异性地结合肿瘤相关抗原。
78.根据实施方案77的试剂盒，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、散射因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、多配体蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或腱生蛋白。
79.根据实施方案76-78中任一项的试剂盒，其中所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。
80.一种治疗病症的方法，其包括向有需要的个体给予根据实施方案1-32或69中任一项的工程化NK细胞或根据实施方案70-74中任一项的组合物。
81.根据实施方案80的方法，其中在给予所述工程化NK细胞之前，通过根据实施方案33-68中任一项的方法产生所述工程化NK细胞。
82.根据实施方案80或实施方案81的方法，其包括向所述个体给予从或从约1x108至1x 1010个细胞/m2，或给予从或从约1x 106至1x 1010个NK细胞/kg。
83.根据实施方案80-82中任一项的方法，其还包括给予另外的药剂。
84.根据实施方案83的方法，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。
85.根据实施方案84的方法，其中所述抗体识别肿瘤相关抗原。
86.根据实施方案84或实施方案85的方法，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、散射因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、多配体蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或腱生蛋白。
87.根据实施方案84-86中任一项的方法，其中所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。
88.根据实施方案83-87中任一项的方法，其中依次给予所述另外的药剂和所述工程化NK细胞。
89.根据实施方案88的方法，其中在给予所述工程化NK细胞之前给予所述另外的药剂。
90.根据实施方案83-87中任一项的方法，其中同时给予所述另外的药剂和所述工程化NK细胞。
91.根据实施方案80-90中任一项的方法，其中所述病症选自炎性病症、感染和癌症。
92.根据实施方案91的方法，其中所述感染是病毒感染或细菌感染。
93.根据实施方案92的方法，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
94.根据实施方案92的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
95.根据实施方案80-94中任一项的方法，其中所述个体是人。
96.根据实施方案80-95中任一项的方法，其中所述工程化NK细胞对于所述个体是同种异体的。
97.根据实施方案80-95中任一项的方法，其中所述工程化NK细胞对于受试者是自体的。
98.根据实施方案1-32中任一项的工程化NK细胞，其中所述细胞被基因工程化为减少NK抑制性受体的表达。
99.根据实施方案98的工程化NK细胞，其中：
所述细胞包含编码NK抑制性受体的基因的遗传破坏和/或导致NK抑制性受体的表达减少的遗传破坏；或者
所述细胞包含抑制性核酸，所述抑制性核酸靶向编码NK抑制性受体的基因和/或减少NK抑制性受体的表达。
100.根据实施方案98或实施方案99的工程化NK细胞，其中所述抑制性受体是NKG2A或KIR2DL1。
101.根据实施方案32-68中任一项的方法，其还包括对所述NK细胞进行基因工程化以减少抑制性受体的表达或活性。
102.根据实施方案101的方法，其中减少表达或活性包括破坏编码所述NK抑制性受体的基因或抑制其表达，或者破坏某一基因或抑制其表达而导致所述NK抑制性受体的表达减少。
103.根据实施方案102的方法，其中所述抑制性受体是NKG2A或KIR2DL1。
VII.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：扩增的G-NK细胞和常规NK细胞的细胞杀伤力的评估
获得来自健康人供体的25x 106个外周血单核细胞(PBMC)，并基于某些细胞表面表型，使用荧光激活的细胞分选来富集约2x 105个FcRγ缺陷型(g–NK)细胞。通过混合0.5mL(1x 106个)饲养细胞(用10ng/mL OKT3刺激的辐照的自体PBMC)与0.5mL(2x 105个)分选的g-NK细胞，使G-NK细胞在14天内扩增250倍。每2天用10ng/mL IL-2加标扩增，并在第7天，将正在扩增的g-NK细胞用辐照的饲养细胞(用10ng/mL OKT3预活化)以5:1饲养细胞:g-NK细胞比率重新饲养。还获得常规NK细胞并进行扩增。
为了评估扩增的g-NK细胞的抗体引导的活性，在存在或不存在抗CD20抗体利妥昔单抗(5μg/mL)的情况下，将富集的g-NK细胞的系列稀释液(E/T比率范围从50:1至1:1)与51Cr标记的Raji淋巴瘤细胞在96孔板中孵育在孵育4小时后，通过测定每孔51Cr活性来评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。如图1所示，结果显示，当与利妥昔单抗和Raji淋巴瘤细胞共培养时，g-NK细胞表现出比常规的NK细胞更高的介导ADCC的能力。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对工程化细胞、组合物和方法的各种修改将变得清楚。可在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列表
<110> 因达普塔治疗公司
<120> 工程化自然杀伤（NK）细胞及其组合物和方法
<130> 776032000140
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> 62/457,098
<151> 2017-02-09
<150> 62/484,350
<151> 2017-04-11
<160> 6
<170> FastSEQ Windows 4.0版
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 高亲和力免疫球蛋白γFc受体I
<300>
<308> NCBI NP-004097.1
<309> 2017-12-27
<400> 1
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85
<210> 2
<211> 82
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3ζ
<300>
<308> NCBI ABQ28690.1
<309> 2016-07-23
<400> 2
Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile
20 25 30
Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
50 55 60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65 70 75 80
Arg Gly
<210> 3
<211> 673
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> PLZF
<300>
<308> NCBI NP_001018011.1
<309> 2017-12-28
<400> 3
Met Asp Leu Thr Lys Met Gly Met Ile Gln Leu Gln Asn Pro Ser His
1 5 10 15
Pro Thr Gly Leu Leu Cys Lys Ala Asn Gln Met Arg Leu Ala Gly Thr
20 25 30
Leu Cys Asp Val Val Ile Met Val Asp Ser Gln Glu Phe His Ala His
35 40 45
Arg Thr Val Leu Ala Cys Thr Ser Lys Met Phe Glu Ile Leu Phe His
50 55 60
Arg Asn Ser Gln His Tyr Thr Leu Asp Phe Leu Ser Pro Lys Thr Phe
65 70 75 80
Gln Gln Ile Leu Glu Tyr Ala Tyr Thr Ala Thr Leu Gln Ala Lys Ala
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Glu Asp Leu Asp Asp Leu Leu Tyr Ala Ala Glu Ile Leu Glu Ile Glu
100 105 110
Tyr Leu Glu Glu Gln Cys Leu Lys Met Leu Glu Thr Ile Gln Ala Ser
115 120 125
Asp Asp Asn Asp Thr Glu Ala Thr Met Ala Asp Gly Gly Ala Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Asp Arg Lys Ala Arg Tyr Leu Lys Asn Ile Phe Ile Ser Lys
145 150 155 160
His Ser Ser Glu Glu Ser Gly Tyr Ala Ser Val Ala Gly Gln Ser Leu
165 170 175
Pro Gly Pro Met Val Asp Gln Ser Pro Ser Val Ser Thr Ser Phe Gly
180 185 190
Leu Ser Ala Met Ser Pro Thr Lys Ala Ala Val Asp Ser Leu Met Thr
195 200 205
Ile Gly Gln Ser Leu Leu Gln Gly Thr Leu Gln Pro Pro Ala Gly Pro
210 215 220
Glu Glu Pro Thr Leu Ala Gly Gly Gly Arg His Pro Gly Val Ala Glu
225 230 235 240
Val Lys Thr Glu Met Met Gln Val Asp Glu Val Pro Ser Gln Asp Ser
245 250 255
Pro Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ile Ser Gly Gly Met Gly Asp Lys Val
260 265 270
Glu Glu Arg Gly Lys Glu Gly Pro Gly Thr Pro Thr Arg Ser Ser Val
275 280 285
Ile Thr Ser Ala Arg Glu Leu His Tyr Gly Arg Glu Glu Ser Ala Glu
290 295 300
Gln Val Pro Pro Pro Ala Glu Ala Gly Gln Ala Pro Thr Gly Arg Pro
305 310 315 320
Glu His Pro Ala Pro Pro Pro Glu Lys His Leu Gly Ile Tyr Ser Val
325 330 335
Leu Pro Asn His Lys Ala Asp Ala Val Leu Ser Met Pro Ser Ser Val
340 345 350
Thr Ser Gly Leu His Val Gln Pro Ala Leu Ala Val Ser Met Asp Phe
355 360 365
Ser Thr Tyr Gly Gly Leu Leu Pro Gln Gly Phe Ile Gln Arg Glu Leu
370 375 380
Phe Ser Lys Leu Gly Glu Leu Ala Val Gly Met Lys Ser Glu Ser Arg
385 390 395 400
Thr Ile Gly Glu Gln Cys Ser Val Cys Gly Val Glu Leu Pro Asp Asn
405 410 415
Glu Ala Val Glu Gln His Arg Lys Leu His Ser Gly Met Lys Thr Tyr
420 425 430
Gly Cys Glu Leu Cys Gly Lys Arg Phe Leu Asp Ser Leu Arg Leu Arg
435 440 445
Met His Leu Leu Ala His Ser Ala Gly Ala Lys Ala Phe Val Cys Asp
450 455 460
Gln Cys Gly Ala Gln Phe Ser Lys Glu Asp Ala Leu Glu Thr His Arg
465 470 475 480
Gln Thr His Thr Gly Thr Asp Met Ala Val Phe Cys Leu Leu Cys Gly
485 490 495
Lys Arg Phe Gln Ala Gln Ser Ala Leu Gln Gln His Met Glu Val His
500 505 510
Ala Gly Val Arg Ser Tyr Ile Cys Ser Glu Cys Asn Arg Thr Phe Pro
515 520 525
Ser His Thr Ala Leu Lys Arg His Leu Arg Ser His Thr Gly Asp His
530 535 540
Pro Tyr Glu Cys Glu Phe Cys Gly Ser Cys Phe Arg Asp Glu Ser Thr
545 550 555 560
Leu Lys Ser His Lys Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys
565 570 575
Asn Gly Cys Gly Lys Lys Phe Ser Leu Lys His Gln Leu Glu Thr His
580 585 590
Tyr Arg Val His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Glu Cys Lys Leu Cys His
595 600 605
Gln Arg Ser Arg Asp Tyr Ser Ala Met Ile Lys His Leu Arg Thr His
610 615 620
Asn Gly Ala Ser Pro Tyr Gln Cys Thr Ile Cys Thr Glu Tyr Cys Pro
625 630 635 640
Ser Leu Ser Ser Met Gln Lys His Met Lys Gly His Lys Pro Glu Glu
645 650 655
Ile Pro Pro Asp Trp Arg Ile Glu Lys Thr Tyr Leu Tyr Leu Cys Tyr
660 665 670
Val
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD16 (158F)
<400> 4
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
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Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
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Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
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Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
225 230 235
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD16 (158F) 信号肽
<400> 5
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD16 (158V)
<400> 6
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
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Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
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His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
195 200 205
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
210 215 220
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
225 230 235

Claims (103)

1.一种工程化自然杀伤(NK)细胞，其中所述NK细胞被基因工程化为减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。
2.根据权利要求1的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含：
编码FcRγ链的基因的遗传破坏和/或导致所述工程化NK细胞中FcRγ链表达减少的遗传破坏；
编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质表达减少的遗传破坏；和/或
编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的遗传破坏和/或导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质表达减少的遗传破坏。
3.根据权利要求2的工程化NK细胞，其中所述遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致所述基因中的过早终止密码子或者所述基因的开放阅读框的移码。
4.根据权利要求2或权利要求3的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中编码FcRγ链的基因、编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因的两个等位基因都被破坏。
5.根据权利要求1的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含靶向所述NK细胞中的基因的抑制性核酸分子，从而导致FcRγ链的表达减少、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。
6.根据权利要求2-5中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的蛋白质表达相比，FcRγ链、调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质和/或参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
7.根据权利要求2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少，并且所述蛋白质是转录因子。
8.根据权利要求7的工程化NK细胞，其中所述转录因子是PLZF(ZBTB16)或HELIOS(IKZF2)。
9.根据权利要求2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞中参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少，并且所述蛋白质是下游信号传导分子。
10.根据权利要求9的工程化NK细胞，其中所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT-2。
11.根据权利要求2-6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化细胞中FcRγ链的表达减少。
12.一种工程化NK细胞，其在编码FcRγ链的基因中包含遗传破坏，其中所述细胞中FcRγ的表达减少。
13.根据权利要求12的工程化NK细胞，其中所述遗传破坏包括缺失、突变和/或插入，从而导致所述基因中的过早终止密码子或者所述基因的开放阅读框的移码。
14.根据权利要求12或权利要求13的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞的基因组中编码FcRγ链的基因的两个等位基因都被破坏。
15.根据权利要求1、5或6中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含靶向编码FcRγ链的基因的抑制性核酸分子。
16.根据权利要求15的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸分子包含与所述编码FcRγ链的基因互补的序列。
17.根据权利要求11-16中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，FcRγ链的表达减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
18.根据权利要求5-6和15-17中任一项的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸包含RNA干扰剂。
19.根据权利要求5-6和15-18中任一项的工程化NK细胞，其中所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA。
20.根据权利要求1-19中任一项的工程化NK细胞，其中FcRγ的表达、活性和/或信号传导减少是永久的、短暂的或可诱导的。
21.根据权利要求1-20中任一项的工程化NK细胞，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达、活性和/或信号传导相比，FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
22.根据权利要求1-21中任一项的工程化NK细胞，其中在所述细胞中表达的FcRγ链的表达在免疫印迹测定中不能检测到。
23.根据权利要求1-22中任一项的工程化NK细胞，其中CD16在所述工程化NK细胞的表面上表达。
24.根据权利要求1-23中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞表达CD3-δ(CD3δ)链。
25.根据权利要求1-24中任一项的工程化NK细胞，其来源于从受试者获得的原代细胞。
26.根据权利要求25的工程化NK细胞，其中所述受试者是人。
27.根据权利要求1-24中任一项的工程化NK细胞，其来源于克隆细胞系。
28.根据权利要求27的工程化NK细胞，其中所述克隆细胞系是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
29.根据权利要求1-28中任一项的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞包含重组或异源CD16基因和/或重组或异源CD3-δ(CD3δ)链。
30.根据权利要求29的工程化NK细胞，其中所述CD16包含CD16激活突变、导致对IgG1的更高亲和力的突变、158V突变和/或158F突变。
31.根据权利要求1-30中任一项的工程化细胞，其中与未经修饰的NK细胞相比，当通过CD16刺激时，所述工程化NK细胞表现出增加的活性。
32.根据权利要求1-31中任一项的工程化NK细胞，其中与未经修饰的NK细胞相比，所述工程化NK细胞的NKp46、NKp30和/或NKp44的表面表达减少。
33.一种产生工程化NK细胞的方法，其包括对NK细胞进行基因工程化以减少所述细胞中的FcRγ链表达、活性和/或信号传导。
34.根据权利要求33的方法，其中减少表达包括：
在所述NK细胞中破坏或抑制编码FcRγ链的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致FcRγ链的表达减少；
在所述NK细胞中破坏或抑制编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质的表达减少；和/或
在所述NK细胞中破坏或抑制编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的基因和/或破坏或抑制某一基因，从而导致参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质的表达减少。
35.根据权利要求33或权利要求34的方法，其包括在所述基因中引入缺失、突变或插入。
36.根据权利要求33-35中任一项的方法，其中所述基因编码FcRγ链。
37.根据权利要求33-35中任一项的方法，其中所述基因编码调节FcRγ链的表达或活性的蛋白质，所述蛋白质是转录因子。
38.根据权利要求37的方法，其中所述转录因子是PLZF或HELIOS。
39.根据权利要求33-35中任一项的方法，其中所述基因编码参与FcRγ链依赖性信号传导的蛋白质，所述蛋白质是下游信号传导分子。
40.根据权利要求38的方法，其中所述下游信号传导分子是SYK、DAB2或EAT2。
41.根据权利要求33-40中任一项的方法，其中所述基因的破坏或抑制通过在允许破坏或抑制所述基因的条件下在所述NK细胞中引入靶向所述基因的内切核酸酶来实现。
42.根据权利要求41的方法，其中所述内切核酸酶选自TAL核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、Cas9和Argonaute。
43.根据权利要求33-40中任一项的方法，其中破坏或抑制通过在导致抑制所述基因的条件下在所述NK细胞中引入靶向所述基因的抑制性核酸来实现。
44.根据权利要求43的方法，其中所述抑制性核酸分子包含与所述编码FcRγ链的基因互补的序列。
45.根据权利要求43或权利要求44的方法，其中所述抑制性核酸包含RNA干扰剂。
46.根据权利要求43-45中任一项的方法，其中所述核酸是siRNA、shRNA或miRNA。
47.根据权利要求33-46中任一项的方法，其中所述表达减少是永久的、短暂的或可诱导的。
48.根据权利要求33-47中任一项的方法，其中与未基因工程化的NK细胞中的表达相比，FcRγ链的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
49.根据权利要求33-48中任一项的方法，其中所述FcRγ链表达水平不能通过免疫印迹测定检测到。
50.根据权利要求33-49中任一项的方法，其包括在所述基因工程化之前，从人受试者分离所述NK细胞。
51.根据权利要求50的方法，其包括从外周血单核细胞(PBMC)分离所述NK细胞。
52.根据权利要求50或51的方法，其中分离所述NK细胞包括使用NK细胞标记物从PBMC选择NK细胞。
53.根据权利要求52的方法，其中所述NK细胞标记物是CD56、Cd161、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44和/或NKp46。
54.根据权利要求50-53中任一项的方法，其还包括选择表达CD16和/或CD3δ的NK细胞。
55.根据权利要求50-54中任一项的方法，其还包括选择不表达表面CD3的NK细胞。
56.根据权利要求33-49中任一项的方法，其中所述NK细胞是NK细胞系。
57.根据权利要求56的方法，其中所述细胞系是NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
58.根据权利要求56或权利要求57的方法，其还包括工程化所述NK细胞系以表达重组或异源CD16和/或CD3δ。
59.根据权利要求58的方法，其包括在所述NK细胞中引入编码所述CD16和/或CD3δ的核酸。
60.根据权利要求58或权利要求59的方法，其中所述CD16基因含有激活突变和/或增加CD16对IgG的亲和力的突变。
61.根据权利要求58-60中任一项的方法，其中所述CD16包含为158V的突变。
62.根据权利要求58-60中任一项的方法，其中CD16包含为158F的突变。
63.根据权利要求58-62中任一项的方法，其包括用编码所述CD16和/或CD3δ的核酸以病毒方式转导所述NK细胞。
64.根据权利要求58-62中任一项的方法，其包括用编码所述CD16和/或CD3δ的核酸转染所述NK细胞。
65.根据权利要求58-64中任一项的方法，其包括在所述NK细胞中短暂地、可诱导地或永久地表达CD16或CD3δ。
66.根据权利要求33-65中任一项的方法，其还包括培养或扩增所述工程化NK细胞。
67.根据权利要求66的方法，其包括用饲养细胞培养所述工程化NK细胞。
68.根据权利要求66或权利要求67的方法，其包括用细胞因子培养所述工程化NK细胞。
69.一种工程化NK细胞，其通过根据权利要求33-68中任一项的方法产生。
70.一种组合物，其包含有效量的根据权利要求1-32或69中任一项的工程化NK细胞。
71.根据权利要求70的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
72.根据权利要求71的组合物，其中所述载体是盐水溶液、右旋糖溶液或5％人血清白蛋白。
73.根据权利要求70-72中任一项的组合物，其中所述组合物包含1 x 105个与1 x 108个之间的细胞/mL。
74.根据权利要求70-73中任一项的组合物，其包含冷冻保护剂。
75.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-32或69中任一项的工程化细胞或根据权利要求70-74中任一项的组合物以及用于治疗疾病的另外的药剂。
76.根据权利要求75的试剂盒，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。
77.根据权利要求76的试剂盒，其中所述抗体识别或特异性地结合肿瘤相关抗原。
78.根据权利要求77的试剂盒，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、散射因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、多配体蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或腱生蛋白。
79.根据权利要求76-78中任一项的试剂盒，其中所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。
80.一种治疗病症的方法，其包括向有需要的个体给予根据权利要求1-32或69中任一项的工程化NK细胞或根据权利要求70-74中任一项的组合物。
81.根据权利要求80的方法，其中在给予所述工程化NK细胞之前，通过根据权利要求33-68中任一项的方法产生所述工程化NK细胞。
82.根据权利要求80或权利要求81的方法，其包括向所述个体给予从或从约1 x 108至1x 1010个细胞/m2，或给予从或从约1 x 106至1 x 1010个NK细胞/kg。
83.根据权利要求80-82中任一项的方法，其还包括给予另外的药剂。
84.根据权利要求83的方法，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。
85.根据权利要求84的方法，其中所述抗体识别肿瘤相关抗原。
86.根据权利要求84或权利要求85的方法，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、散射因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、多配体蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或腱生蛋白。
87.根据权利要求84-86中任一项的方法，其中所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。
88.根据权利要求83-87中任一项的方法，其中依次给予所述另外的药剂和所述工程化NK细胞。
89.根据权利要求88的方法，其中在给予所述工程化NK细胞之前给予所述另外的药剂。
90.根据权利要求83-87中任一项的方法，其中同时给予所述另外的药剂和所述工程化NK细胞。
91.根据权利要求80-90中任一项的方法，其中所述病症选自炎性病症、感染和癌症。
92.根据权利要求91的方法，其中所述感染是病毒感染或细菌感染。
93.根据权利要求92的方法，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
94.根据权利要求92的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
95.根据权利要求80-94中任一项的方法，其中所述个体是人。
96.根据权利要求80-95中任一项的方法，其中所述工程化NK细胞对于所述个体是同种异体的。
97.根据权利要求80-95中任一项的方法，其中所述工程化NK细胞对于所述受试者是自体的。
98.根据权利要求1-32中任一项的工程化NK细胞，其中所述细胞被基因工程化为减少NK抑制性受体的表达。
99.根据权利要求98的工程化NK细胞，其中：
所述细胞包含编码NK抑制性受体的基因的遗传破坏和/或导致NK抑制性受体的表达减少的遗传破坏；或者
所述细胞包含抑制性核酸，所述抑制性核酸靶向编码NK抑制性受体的基因和/或减少NK抑制性受体的表达。
100.根据权利要求98或权利要求99的工程化NK细胞，其中所述抑制性受体是NKG2A或KIR2DL1。
101.根据权利要求32-68中任一项的方法，其还包括对所述NK细胞进行基因工程化以减少抑制性受体的表达或活性。
102.根据权利要求101的方法，其中减少表达或活性包括破坏编码所述NK抑制性受体的基因或抑制其表达，或者破坏某一基因或抑制其表达而导致所述NK抑制性受体的表达减少。
103.根据权利要求102的方法，其中所述抑制性受体是NKG2A或KIR2DL1。
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