JP2007524363A - 変異体水疱性口内炎ウイルスおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウイルス分野に関し、特にウイルスベクターおよびワクチンとして有用な変異体ウイルスに関する。
弱毒化ウイルスまたは複製能力を減少したウイルスが、例えばワクチンもしくはワクチンベクターとして、または遺伝子治療ベクターとして、多くの治療応用のために広く使用されている。弱毒化ウイルスの産生は、代表的には、不自然な宿主を通して野生型ウイルスを繰返し継代することによる偶然の変異の単離を含む。組換えDNA技術および遺伝子工学技術の進歩は、治療剤および予防剤としてウイルスをよりよく開発する道具を提供している。組換え技術は、特異的な変異をウイルスゲノムの選択された領域に導入することを可能にし、そして変異体ウイルスの野生型への復帰を最小化する。
本発明の目的は、変異体ウイルスおよびそれらの使用を提供することである。本発明の局面に従って、感染細胞においてmRNAおよびタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する、変異体ラブドウイルスが提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、mRNAまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
本発明は、感染細胞においてmRNAまたはタンパク質の核への輸送を遮断することを担うタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する、変異体ウイルスを提供する。従って、上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスと比較して核への輸送を遮断する能力が低下しており、インビボで弱毒化される。上記変異体ウイルスは、正常な宿主細胞の抗ウイルス系を、これらの系の効果に対する感受性を残しながら、誘発することができ得る。上記変異体ウイルスは、限定されないが、ワクチンおよびアジュバントとして、ウイルスベクターとして、ならびに悪性細胞または感染細胞の選択的溶解のための細胞溶解剤および細胞傷害剤として、癌および慢性感染の処置のための治療剤を含む広範囲の応用に適切である。
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および化学的用語は、本発明が関する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。標準的なアミノ酸の3文字表記および1文字表記が、本明細書で交互に使用される。
本発明は、感染された宿主細胞においてmRNAまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子の中に、一以上の変異を有する変異体ウイルスを提供する。結果として、上記変異体ウイルスは、核への輸送を遮断する能力が低下し、そしてインビボで弱毒化される。mRNAまたはタンパク質の核への搬出を遮断することは、上記感染細胞内の上記抗ウイルス系を無力にし、かつ、感染細胞が、周辺の細胞を感染から保護し得る機構(即ち、早期警告系)を無力にし、そして最終的には細胞溶解を生じる。本発明の一つの実施形態では、従って、上記変異体ウイルスは、その野生型と比較して低下した細胞溶解性の性質を有する。
本発明に従って、上記変異体ウイルスは、天然に存在する変異体であり得、またはそれらは、遺伝子操作された変異体であり得る。上記変異体ウイルスは、従って、定義された増殖条件または淘汰圧を使用して選択で得られ得、またはそれらは、当該分野で公知の遺伝子工学技術を使用して、特異的に操作された組換えウイルスであり得る。
本発明に従って、上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスと比較した場合、mRNAまたはタンパク質の核への輸送を遮断する低下した能力に特徴づけられる。この能力の損失は、低下した細胞溶解活性を示す上記変異体ウイルスおよび/または上記細胞の抗ウイルス系(野生型ウイルスにより通常遮断されている)を誘発する上記変異体ウイルスを生じ得る。
候補変異体ウイルスは、mRNAもしくはタンパク質の核輸送を遮断する能力の低下または損失についてインビトロでスクリーニングされ得る。例えば、適切な細胞株を候補変異体ウイルスに感染させ得、上記細胞を、収集し得、そして核画分および細胞質画分を、単離し得る。mRNAは、当該分野で周知の技術、例えばRT−PCR、ノーザンブロットまたはマイクロアレイ分析を使用して、これらの画分のそれぞれから単離され、そしてアッセイされ得る。上記核画分および細胞質画分のmRNA含量は、その後、野生型ウイルスおよび/またはモック感染された細胞に関し類似した画分のmRNA含量のような、適切なコントロールと比較され得る。
一度、適切な変異体ウイルスが同定されれば、適切な動物モデルは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して上記変異体ウイルスの効力および毒性を評価するために使用され得る。
本発明の変異体ウイルスは、広い範囲の応用に有用であることは当業者に容易に分かり得る。限定するわけではない実施例が、以下に提供される。
本発明は、本発明の変異体ウイルスのウイルスベクターとしての使用を提供する。ウイルスベクターとして使用される場合、上記変異体ウイルスは、治療的に活性な分子をコードする少なくとも一つの異種核酸配列を取り込むために操作される。上記ウイルスベクターは、細胞を感染するのに使用され得、次いで、異種核酸配列でコードされた治療的に活性な分子を発現する。ウイルスベクターは、治療的に活性な分子をインビボで発現するために、上記異種核酸を被験体の細胞に送達するために使用され得る。
当該分野で公知のように、特定のウイルスは、選択的腫瘍崩壊剤として作用する能力がある。例としては、VSV、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルスH−1およびONYX−015ヒトアデノウイルス(例えば、国際PCT出願WO 01/19380およびWO 00/62735ならびにBell、JC、Lichty BDおよびStojdl D.2003 Cancer Cell 4:7〜11を参照のこと)のような特定の操作されたウイルスが挙げられる。腫瘍細胞増殖を抑制する腫瘍崩壊性ウイルスの効力は、正常細胞と比較して、ウイルス感染に対する腫瘍細胞の特異な感受性に、ある程度、存在する。腫瘍細胞は、増殖阻害またはアポトーシス経路において変異を獲得することにより、正常な対応物より、生存の優位性を得ている。腫瘍の進化の過程で、しばしば選択される一つの欠陥は、インターフェロン(IFN)応答の喪失である。インターフェロンはまた、個体の細胞の抗ウイルス応答の主要な伝達物質であり、このようにインターフェロン媒介性増殖制御プログラムからの逸脱を可能にする変異を獲得した腫瘍細胞は、同時にそれらの生得的な抗ウイルス応答を損なう。
宿主細胞における抗ウイルス系を誘発することができる本発明の変異体ウイルスは、ワクチンアジュバントの理想的な候補である。当該分野で公知のように、多くの抗原が、強くない免疫原性であり、ワクチンとして使用される場合、被験体における強い免疫応答を刺激するためにアジュバントの添加が要求される。本発明は、宿主の抗ウイルス応答を誘発することにより、上記ワクチンの免疫原性を高めるワクチンアジュバントとしての変異体ウイルスの使用を意図している。本発明の一つの実施形態において、上記変異体ウイルスがインターフェロンあるいは他のサイトカインの産生を刺激することにより、ワクチンアジュバントとして作用する。
上記に示されるように、感染した細胞の抗ウイルス系を誘発する本発明の変異体ウイルスは、野生型のウイルスおよび隣接する細胞に感染しようとする他のウイルスの複製を抑制し得る。これらの変異体ウイルスによる細胞の感染は、従って、自己制限的であるだけではなく、復帰変異体の出現に対しても保護する。上記変異体ウイルスは、このように、生産の間または被験体への投与後のいずれかで、調製物中に生じる有毒な復帰変異体に対して防御するウイルスの薬学的調製物の添加剤として使用され得る。
上述のように、本発明の変異体ウイルスによる上記宿主細胞の抗ウイルス系の誘発は、種々のサイトカインの産生を生じる。これらの変異体ウイルスは、従って、サイトカイン放出により緩和され得る疾患または障害、例えば癌、自己免疫疾患ならびに細菌、ウイルスおよび真菌感染の処置に使用され得る。
当該分野で公知のように、HIVおよびHCVのような多くのウイルスは、感染細胞の抗ウイルス系をダウンレギュレートする。ポックスウイルス、BVDV、ブニヤウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルスおよびHPVのような他のウイルスは、それらの複製サイクルの部分として、宿主細胞の上記抗ウイルス系応答を遮断する。結果として、これらのウイルスのうちの一つで感染された細胞は、本発明の変異体ウイルスによる感染に対して増加した感受性を有し得る。上に示すように、抗ウイルス応答を弱体化された細胞において、上記変異体ウイルスはまだ複製可能である。従って、本発明の上記変異体ウイルスは、そのような感染細胞において選択的に複製し、そしてその感染細胞を殺し得る細胞溶解剤として、使用され得る。
本発明は、本発明のウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を、さらに提供する。
本発明は、免疫処置における使用のための本発明の変異体ウイルスを含有するキット、
および被験体への異種の遺伝子の送達のためのベクターとしての使用のための一以上の異種遺伝子を保有する、本発明の変異体ウイルスを含有するキットを提供する。上記変異体ウイルスは、薬学的組成物の形態でキットの中に提供され得る。上記キットの個別の構成成分は、分離した容器または共通の容器に包装され、製薬もしくは生物学的産物の製造、使用もしくは販売を、規制している行政機関により処方される形態での注意書きが、そのような容器と関連し得、その注意書きは、動物もしくはヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売の上記機関による認可を反映しうる。
実施例1:IFN−βシグナル伝達停止における欠陥を有する腫瘍崩壊性VSV株
(材料および方法)
(ウイルス)
VSVの上記インディアナ血清型を、この研究のいたるところで使用し、L929細胞で増殖した。本明細書でAV1(またはMut2)およびAV2(またはMut3)とそれぞれいうT1026R(Desforgesら、2001、Virus Research 76(1):87〜102)、およびTP3(Desforgesら、2001、同書)は、この研究で、そして他でも野生型VSVのインディアナのHR株(Francoeurら、1987、Virology 160(1):236〜45)のIFN誘導変異体であることが示されている。
インターフェロン−αレベルを、Human Interferon−Alpha ELISAキット(PBL Biomedical)を使用して、製造業者の指示に従って細胞培養培地中で測定した。簡単にいうと、100μlの培養培地を感染後48時間で収集し、96ウェルマイクロタイタープレートに、製造業者から供給されたブランクおよび標準と一緒にインキュベートした。サンプルを、製造業者の使用説明書に従って処理をし、次いでDYNEXTMプレートリーダー上、450nmで読取った。
8〜10週齢の雌性マウス(示されている種)を、5群にわけ、1×1010pfu〜1×102pfuまで(ウイルスとマウスの種に依存する)の1対数または1/2対数希釈のウイルスで、示された経路で感染させた。体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫および後肢麻痺について、動物をモニターした。中程度から重篤な罹患を示すマウスをCCASに記載されている医薬品安全性試験実施基準に従って安楽死させた。LD50値をKarber−Spearman法により計算した。
Balb/C PKR−/−マウスは、およそ10pfuのLD100であるWT VSVによる鼻腔内感染に、非常に感受性が高いことが、以前に決定されている(Stojdlら、2000、J.Virol.79:9580〜9585)。3群のマウスを、WT,AV2またはそれらの株の混合物で、鼻腔内点滴により感染させた。マウスを罹患の徴候についてモニターし、重篤な呼吸窮迫または後肢麻痺の徴候時に安楽死させた。
およそ1×106ES−2ヒト卵巣癌細胞をCD−1無胸腺マウスの腹腔窩に注入した。腹水の進展が、細胞注入後15日までに一般に観察される。12日、14日、16日にマウスを、1×109AV2ウイルスまたは1×109pfu当量のUV不活化AV2 VSVを腹腔内注入により処置した。マウスを病的状態についてモニターし、腹水の進展時に安楽死させた。
皮下腫瘍を樹立するために、8〜10週齢のBalb/c雌性マウスの右側腹部を剃毛し、Balb/cマウスと同系の1×106CT26結腸癌細胞(Kashtanら、1992、Surg Oncol 1(3):251〜6)を注入した。これらの腫瘍をそれらがおよそ10mm3に到達する(その時にウイルス処置が開始された)まで進展させた。群の動物に、1、6および12用量の示されたウイルスを隔日に投与した。5×108pfuの各用量を尾静脈注入により投与した。腫瘍を毎日測定し、体積を式1/2(L×W×H)を使用して計算した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫、後肢麻痺についてモニターした。動物を、それらの腫瘍負荷が最終点(750mm3)に到達すると安楽死させた。
8〜10週齢のBalb/c雌性マウスに、3×105CT26細胞(Spechtら、1997、J Exp Med 186(8):1213〜21)を尾静脈注入し、肺腫瘍を樹立した。10日目、12日目、14日目、17日目、19日目、および21日目に、他で記載(Stojdlら、2000、Journal of Virology 74(20):9580〜5)されているように、マウスの群に鼻腔内点滴により5×107pfuの示されたウイルスを投与した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫および後肢麻痺についてモニターした。動物を呼吸窮迫の発症の際に安楽死させ、そしてそれらの肺を、腫瘍進展を確認するために試験した。
各実験において、上記試験細胞株を、96ウェルプレートに、増殖培地(10%FBSを加えたDMEM−F12−HAM)中で、3×104細胞/ウェルで播種した。一晩インキュベート(37℃、5%CO2)した後、培地を吸引して除去し、各ウェルに20μlのウイルス含有培地(α−MEM、無血清)を、10倍の増分で、3×106pfu/ウェル〜3pfu/ウェルまでの範囲で、またはウイルスを含有しない陰性コントロール培地を添加した。試験された各ウイルス用量は、6連で行った。ウイルスを付着させるために60分インキュベートした後に、80μlの増殖培地を各ウェルに添加し、そのプレートをさらに48時間インキュベートした。細胞生存率をCellTitre96TM AQueous MTS試薬(Promega Corp.)(テトラゾリウム化合物(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、内部塩;MTS)および電子カプリング試薬(フェナジンメトスルファート;PMS)の溶液を利用している)を使用して測定した。MTSは、細胞により、組織培養培地に溶解性のホルマザン生成物に生物還元される。ホルマザン生成物の490nmでの吸光度は、96ウェルアッセイプレートから直接測定され得る。ホルマザン生成物の量は、490nmでの吸光度から決定されるように、培養液中の生存細胞の数と直接的に比例する。
野生型(WT)VSV株および変異体VSV株でモック処置または感染のいずれかをされたOVCAR4細胞をPBS中に収集し、ペレット化し、そして250μlの再懸濁緩衝液(10 mM Tris pH7.4、15 mM NaCl,12.5mg MgCl2)に再懸濁した。600μlの溶解緩衝液(25 mM Tris pH7.4、15mM NaCl、12.5mg MgCl2 5% ショ糖および1% NP−40)を添加し、溶解物を4℃10分間、時折ボルテックスしながらインキュベートした。核を、1000×gで3分間の遠心分離により収集した。その上清(細胞質画分)を収集し、−80℃で凍結させ、一方上記ペレット(核画分)を、一度、250μlの溶解緩衝液で洗浄し、そして凍結乾燥した。全RNAを、Qiagen RNeasyTMキット(製造業者の使用説明書に従って;Qiagen、 Mississauga、Canada)を使用して、核画分および細胞質画分の両方から単離し、引き続きLiCl沈降により各サンプルを濃縮した。20μgの各RNAサンプルを製造業者の標準プロトコル(Affymetrix;Santa Clara CA、USA)に従って処理をし、そしてAffymetrix GeneChipTMHuman Genome U133A Array(HG U133A チップ)とハイブリダイズした。各チップは、1500まで目盛をつけられ、各HG U133Aチップ上に存在する100正規化コントロール遺伝子に対して正規化し、それから全ての核サンプルを、各遺伝子基準でモック核サンプルに対して正規化し、そして上記細胞質画分を、対応するモック細胞質サンプルに対して正規化した。データをGenespringTMソフトウエア(Silicon Genetics;Redwood City CA、USA)を使用して分析した。
OVCAR4細胞を10%胎児ウシ血清(Wisent)を補充したRPMI(Wisent)で増殖した。1.0×107細胞を感染の前日に10cmディッシュにプレートした。感染時に、上記培地を除去し、VSVウイルス株あたり5×107pfuの添加の前に、RPMI単独に置き換えた。ウイルス添加後1時間で、培地を除去し、そして実験の残りの期間、10%FBSを補充したRPMI培地に置き換えた。細胞を標準NP−40溶解緩衝液中で溶解し、75μgの全細胞抽出物をSDS−ポリアクリロアミドゲル上で泳動し、示されるように以下の抗体:IRF−7(sc−9083)、IRF−3(sc−9082)、ISG56(Genes Senからの贈り物)、VSV−N(全長インディアナNタンパク質に対するポリクローナル)およびアクチン(sc−8432)でブロッティングをした。
本質的に活性なIRF−7Δ(IRF−7Δ247〜467)の作製は、以前に他で記載されている(Linら、2000、J.Biol.Chem.、275:34320〜34327)。IRF−7Δ247〜467を付加的5’VSVキャップシグナルおよびXho1リンカーを有するFlagエピトープに対する順方向プライマー:
5’−ATCGCTCGAGAACAGATGACTACAAAGACGATGACGACAAG−3’(配列番号7)
およびVSVポリAシグナルおよびNhe1リンカーを有する特異的IRF−7逆方向プライマー−:
5’−ATCGGCTAGCAGTTTTTTTCAGGGATCCAGCTCTAGGTGGGCTGC−3’(配列番号8)
とを一緒に使用して、PCRで増幅した。
感染OVCAR4細胞またはモック感染OVCAR4細胞からの核全RNAおよび細胞質全RNAを、製造業者の使用説明書(RNeasy;Qiagen、Mississauga、Canada)に従って単離した。4μgの全RNAをDNAaseで処理し、そして逆方向転写した。Roche LightcyclerTM(Roche Diagnostics、Laval、Canada)技術を使用して、定量的PCRを、各々からIFN−βおよびヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)標的を増幅するために3連で実施した。各標的アンプリコンに対して作成された標準曲線を基礎にして、交差点を絶対量に変換した。HPRTレベルが、これらの感染の経過期間中変わらないので、IFN−βシグナルを、引き続いてHPRTに対して正規化した。データは示されていない。IFN−βを増幅するために使用したプライマーは以下の通りであった:
センス5’−TTGTGCTTCTCCACTACAGC−3’(配列番号9);
アンチセンス5’−CTGTAAGTCTGTTAATGAAG−3’(配列番号10)および
HPRTプライマー: センス5’−TGACACTGGCAAAACAATGCA−3’(配列番号11);
アンチセンス5’−GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT−3’(配列番号12)。
10%FBSを補充したF12K培地中で培養したA549細胞を、WT VSV株または変異体VSV株(MOI 10、ここでMOIとは感染多重度をいい、感染性ウイルス粒子の細胞に対する比である)で感染した。製造業者の使用説明書に従って、感染後4時間でトリゾール(Invitrogen)を使用してRNAを抽出した。1μgのRNAをオリゴdTプライマーで逆方向転写し、そして5%のRTをTaq PCRで、テンプレートとして使用した。用いたプライマーは以下の通りであった:
Mx順方向プライマー5’−ATGGTTGTTTCCGAAGTGGAC−3’(配列番号13);
Mx逆方向プライマー5’−TTTCTTCAGTTTCAGCACCAG−3’(配列番号14);
VSV N 順方向プライマー5’−ATGTCTGTTACAGTCAAGAGAATC−3’(配列番号15);
VSV N逆方向プライマー5’−TCATTTGTCAAATTCTGACTTAGCATA−3’(配列番号16);
RANTES順方向プライマー5’−TACACCAGTGGCAAGTGCTCCAACCCAG−3’(配列番号17);
RANTES逆方向プライマー5’−GTCTCGAACTCCTGACCTCAAGTGATCC−3’(配列番号18);
βアクチン順方向プライマー5’−ACAATGAGCTGCTGGTGGCT−3’(配列番号19)および
βアクチン逆方向プライマー5’−GATGGGCACAGTGTGGGTGA−3’(配列番号20)。
インビボでのVSVの弱毒化は、インタクトなインターフェロン経路に依存する。
感染の間のどの時点で、野生型ウイルスおよび弱毒化されたウイルスが、宿主細胞の抗ウイルス応答を誘導または不活化する能力を分出するかを決定するために、宿主細胞のVSV感染の間に起こる、早期シグナル伝達事象が、最初に樹立される必要があった。ウイルス感染過程の時間にわたるマイクロアレイ分析の使用は、抗ウイルス遺伝子の上記転写活性化に対して直接的に、または間接的につながる、VSV感染により誘発された早期のシグナル伝達事象の検出を可能にするはずである。上記マイクロアレイデータから、VSV感染は、特定の、連続した順で多くの遺伝子のアップレギュレーションを導く。遺伝子は、従って、以下を基礎にして群分けされる:(1)時間経過のアップレギュレーションのそれらの動態および(2)WT感染 対 変異体VSV感染に応答するそれらの誘導パターン。遺伝子のこれらのコホートは、3種の分離した転写波(表1、ならびに図2A,図2Bおよび図2C)に対応するようである。これと一致して、IFN−βサブタイプ,IRF−7サブタイプおよびIFN−αサブタイプは、コホートを分けるために、各々を分離した。他のグループは、刺激の数に応じて、潜在的転写因子IRF−3、NFκBおよびc−JUN/ATF−2は、活性化され、発現を誘導するIFN−βプロモーター上でCBP/p300と一緒に会合することを確立した(Watheletら、1998、Mol.Cell 1:507〜518)。また、IFN−βは、IRF−7およびそれらのプロモーターのISRE要素を含有する他の遺伝子の誘導(Luら、2000、J.Biol.Chem.、275:31805〜31812;ZhangおよびPagano、1997、Mol.Cell Biol.、17:5748〜5757;ZhangおよびPagano、2001、J.Virol.、75:341〜350)を引き起こすISGF3転写複合体の活性化を誘導するよう、オートクリン様式で作用することが公知である。さらに、IRF−7の異所性発現は、ISGF3複合体を形成することができない細胞において、IFN−αの発現に臨界的であることが示された(Satoら、1998、FEBS Lett.、441:106〜110)。IFN−α誘導の帰せられたIRF−7依存性およびIRF−7発現の帰せられたIFN−β依存性は、上述のアレイの遺伝子の動態プロフィールを暗示させるものである。これらの知見に照らしてみて、一般モデルにおいて、IFN−β、IRF−7およびIFN−α1を原型遺伝子と仮定して、これらの遺伝子のコホートは、3種の分離した転写波に対応し得;各々は、その前の転写波に依存し、そして誘発されると思われる(表1、ならびに図2A,図2Bおよび図2C)。
VSV感染に対する早期転写応答のよりよい理解のために、上記WTと「IFN誘導株」間のこれらの応答における差異の理解が必要であった。ウェスタンブロットにより、WTウイルス、AV1ウイルスおよびAV2ウイルスは、同様な動態で、IRF−3リン酸化を誘発する(図2E)。さらに、転写因子IRF−3、NFκBおよびc−JUN/ATF−2により直接、調節された遺伝子のいくつかは、WTウイルス、AV1ウイルスおよびAV2ウイルスに感染した細胞において、同程度にアップレギュレートされていることがわかった(図2A)。例えば、1次応答遺伝子は、3種の全てのウイルスによる感染後、3〜6時間で、しっかりと誘導された(図2A、DおよびE)。一方、IFN−βの産生およびJAK/STAT経路のオートクリン活性化(図2B)を必要とする2次応答遺伝子は、野生型ウイルスおよび弱毒化ウイルスにより、差動的に誘導された(図2Bおよび2EのIRF−7を参照のこと)。WT VSV感染細胞における損なわれたIRF−7産生の結果として、INF−α転写物のように3次応答遺伝子産物は、AV1およびAV2感染細胞では強く発現されたが、野生型VSV感染細胞では誘導されなかった(図2C)。合わせて考えると、これらの結果は、野生型VSVが、そのMタンパク質により図2に示されるように、1次と2次の抗ウイルス転写応答の間の遮断に影響することを示唆している。以前のトランスフェクション実験では、VSV Mタンパク質が、IFN−βの転写を遮断するか(Ferran およびLucas−Lenard、1997、J.Virol.、71:371〜377)、mRNAの核からの搬出を阻害するか(Herら、1997、Science、276:1845〜1848;von Kobbeら、2000、Mol.Cell、6:1243〜1252)、またはJak/Statシグナル伝達に干渉する(Terstegenら、2001、J.Immunol.、167:5209〜5216)かのいずれかが示唆されている。本明細書で記載されている転写物のプロフィール化研究は、後2者のメカニズムのいずれかに一致するが、しかしながら、感染細胞の外因性のインターフェロンによる上記Jak/Stat経路の誘導における障害は、観察されなかった(データは示されていない)。一方、マイクロアレイ分析またはRT−PCR分析は、核画分および細胞質画分における転写物を比較および対比するために使用された場合、野生型ウイルス感染細胞と弱毒化されたウイルス感染細胞との間に明確な差が見られた(図3)。重要なことに、IFN−β mRNAは、3つの全てのウイルスにより核画分に誘導されたが、野生型ウイルス感染細胞においてmRNAの細胞質プールには、著しい程度には見られなかった。
上記弱毒化VSV株の腫瘍崩壊的性質を評価するために、NCIヒト腫瘍細胞パネル(悪性度のスペクトルからの60細胞株)をWTウイルス、AV1ウイルスまたはAV2ウイルスのいずれかでチャレンジし、材料および方法に記載されているように48時間後の代謝的細胞死をアッセイした。WT VSVが、広い範囲の異なる癌細胞型に感染し、そして殺すことができることは、表2Aから、明らかである。さらに、本発明者らの以前の研究(Stojdl DF、Lichty B、Knowles S、Marius R、Atkins H、Soneberg N、Bell JC 2000 Nature Medicine 6:821〜5)が示すように、試験された癌細胞株の大多数(およそ80%)は、IFN−αまたはIFN−βのいずれかに対する、損なわれた応答を実証している(表2B)。従って、驚くべきことでは無いが、AV1およびAV2は、WT VSVと同じように、おそらく、これらの細胞におけるIFNシグナル伝達の欠陥に起因して、これらの腫瘍細胞株を殺すことに有効であった(表2AおよびB)。
以前に、ヌードマウスにおける異系皮下移植腫瘍のWT VSVによる成功的な処置が報告された(Stojdlら 2000、Nature Medicine 6(7):821〜5)、しかしながら、これらの実験では、外因性のインターフェロンが、上記ウイルス処置から、免疫不全の動物を保護するのに必要であった。上に記載されている結果は、AV1およびAV2が、外因性に投与されたインターフェロンがない場合でさえ、ヌードマウスモデルにおいて、ほとんど毒性なしで、効率的に腫瘍細胞を殺すはずであることを示唆する。ヒト卵巣癌細胞をCD−1マウスの腹腔窩に注入し、12日間増殖をさせた。UV不活化ウイルスを受けた殆どのマウス(14/15)は、処置後15日で、腹水が貯留した(このコホートの残りのマウスは、39日の終点まで到達した)。反対に、腹腔窩に送達した3用量AV2は、マウスの70%の持続性の治癒を提供した(図4A)。注目すべきことに、単回のWT VSVの腹腔内用量が、一様にヌードマウスに致死的であるが、3用量のAV2で処置された動物の一匹も、ウイルス感染の徴候(倦怠、体重減、脱水症状)さえも示さなかった。
上記AV1株およびAV2株を、腫瘍を播種した最初の部位に注入した場合には有効であるが、全身系に送達された弱毒化株の治療効力を決定する必要がある。この目標に向かって、皮下腫瘍を、CT26結腸癌細胞を同系Balb/Cマウスの側腹後方に注入することにより樹立した。腫瘍が触知可能(およそ10mm3)になった後、ウイルスを尾静脈注入により投与した。処置後12日でUV不活化VSVを受けたマウスは、平均腫瘍サイズが750mm3で終点に到達した。反対に、AV2による単回処置は顕著な効力を示し、終点までの時間を殆ど3倍(34日)遅延させた。この処置群の8動物のうちの7匹が、部分応答者であると考えられ、一匹のマウスのみが処置に応答しなかった(表3)。多用量のAV1またはAV2を静脈内に投与した場合、処置の効力は顕著に増加した(図4Bおよび表3)。1動物の例外を除いては、全ての腫瘍は、AV1処置に応答し、3/6のマウスは腫瘍の完全な後退を示した。これらのマウスのうち2匹は、感染後それぞれ8日目および9日目と早期に、完全後退を示した。残りの動物のうちの2匹は、部分応答を示し、コントロールと比較して、腫瘍の進展の殆ど2倍の遅延を示した。全8匹のAV2感染マウスが、処置によく応答し、8匹のうち5匹は、持続的な腫瘍後退であった。事実、処置後7ヶ月でさえも、腫瘍の再増殖の徴候は無かったことは明らかであった。さらに、これらのマウスは処置後7ヶ月に、CT26細胞で再チャレンジした場合、微量のウイルスも検出できず(データは示されていない)、腫瘍が発生せず、これはおそらく腫瘍に対する宿主媒介性の免疫が進展したことを示している。
CT26細胞は、尾静脈に注入した時に、肺の内側が優勢であったが、マウスのいたるところで腫瘍が散在し、3〜4週間で死に到る。4匹のマウスの肺を、腫瘍細胞注入後16日およびUV不活化ウイルスで、処置後4日で試験した(図4)。これらの肺は、腫瘍負荷により通常の大きさの3倍、肺表面の結節として明らかであった。反対に、屠殺時の4日前にAV2の単回の静脈内用量を受けた担癌同腹子は、通常の肺の大きさを有し、明らかな腫瘍結節が殆どなかった。鼻腔内滴注によるAV2投与はまた、静脈内投与および鼻腔内投与の組合せが、最適のように見えるが、顕著な効力を示した(図4D)。
これらの弱毒化ウイルスと以前に報告されたVSVの腫瘍崩壊性バージョンとの主な差異は、感染細胞における変異Mタンパク質のインターフェロン産生を遮断する能力のなさである。VSV Mは、以下を含むいくつかの主要なウイルス機能に必要な多機能タンパク質であることが示されている:出芽(Jayakarら、2000、J.Virol、74:9818〜9827)、ウイルス粒子集合(Newcombら、1982、J.Virol、41:1055〜1062)、細胞変性効果(Blondelら、1990、J.Virol、64:1716〜1725)および宿主遺伝子発現の阻害(Lylesら、1996、Virology 225:172〜180)。後者の性質は、Mが宿主RNAポリメラーゼ活性を遮断(Yuanら、2001、J.Virol、75:4453〜4458)またはタンパク質およびmRNAの両方の宿主の核の中へおよび中からの核輸送を阻害(Herら、1997、同上;von Kobbeら、2000、同上)する能力に起因するとされている。ウイルス感染を使用して本明細書で示されている結果は、核輸送の遮断が主要な機序であり、この機序により野生型VSV株が、宿主の抗ウイルス応答を軽減してしまうということと一致する。感染細胞の転写物の本分析は、宿主細胞転写の阻害におけるMタンパク質の役割を支持する証拠は殆ど提供せず、しかしVSV感染は、むしろ抗ウイルス遺伝子のIRF−3媒介性の刺激、引き続き感染細胞の核からの1次応答転写物輸送のMタンパク質媒介性の遮断を誘発することを示す。この研究と特に関係するのは、Dahlbergのグループの研究(Petersenら、2000、Mol.Cell.Biol.、20:8590〜8601)およびトランスフェクション研究で、Mタンパク質が核孔タンパク質と関連し得、mRNA搬出を遮断させ得ることを示した他の研究(von Kobbeら、2000、同書)である。
一連の組換えウイルスを、インターフェロン誘発変異体の産生に有用な変異体の範囲を試験するために、構築した。この目的のために、プラスミドpXN−1(Schnell MJ、Buonocore L、Whitt MAおよびRose JK(1996)J.Virology 4、2318〜2323)からN遺伝子,G遺伝子およびL遺伝子ならびにAV1からのP遺伝子およびM遺伝子を含有するキメラウイルス骨格を作った。それらのM遺伝子のみが異なる一連のウイルスを作製した後、添付図(図6および図7)に示すように、M遺伝子改変体を順に置換して産生した。例えば、XNDG M4は、pXN−1からの上記N遺伝子,G遺伝子およびL遺伝子、AV1からのP遺伝子ならびにメチオニン51が欠失しているM遺伝子を含有している。XNDG M5は、メチオニン51、アスパラギン酸52、スレオニン53およびヒスチジン54と4つのアミノ酸の欠失を有するM遺伝子(図7)を有する。表4(以下)に本発明者らが示すように、これらの2種の変異体は、メチオニン51がアルギニンに変換された(すなわちM51R)天然に存在する変異体(Mut2もしくはAV1)として、3種の腫瘍形成性のヒト細胞株を殺すことに等しく有効である。XNDG M4およびXNDG M5は、欠失変異体であるので、これらの組換えウイルスが、本来のメチオニン51の遺伝子型に復帰するのは、ずっと難しい。さらに、操作された上記ウイルスは、依然、効果的に腫瘍細胞を殺すことができるが、それらはインターフェロン応答性細胞上で小さいプラークを形成し、これらのウイルスがインターフェロンに応答し得る細胞での増殖のために弱毒化されていることを示している(図8)。
緑色蛍光タンパク質(GFP)のアミノ末端と融合する場合、VSVマトリックス(M)タンパク質のアミノ末端(アミノM+72−GFP−N1)は、この融合タンパク質をミトコンドリアに標的化する(図9および図10)。VSVインディアナ株のMの最初の72のアミノ酸は、GFPを標的化することができる。メチオニン33(M33)で開始する融合タンパク質はまた、GFPをミトコンドリアに標的化することができるが、最初の50アミノ酸のみではできない。メチオニン51(M51)は、必要ではない。GFPのC末端で融合する場合、これらの配列は、上記融合タンパク質をミトコンドリアに標的化せず、従って、これらの配列は、この標的化を達成するために組換えタンパク質のアミノ末端でなければならない。
本研究は、全身投与された変異体VSV(ΔM51)が、VSVの致死的頭蓋内投与に対して保護し得ることを実証する。
本研究で示されたデータは、変異体VSVに感染された細胞が、IFN−αおよびIFN−βを分泌し、WT VSVに感染されたそれらの細胞は、IFN−αおよびIFN−βを分泌しないか、または産生しても非常に僅かな量であったことを実証する。
OVCAR4細胞、CAKI−1細胞およびHOP62細胞をWT VSV株または変異体VSV株のいずれかに感染(MOI 10 pfu)させた。感染後10時間で、その感染細胞についてELISAでIFN−βの産生をアッセイした。AV1感染細胞およびAV2感染細胞は、分泌IFN−βを産生するが、WT VSV感染細胞は産生しなかった。上記ELISAを、市販のヒトIFN−β検出キット(TFB INC;東京 日本)を使用して実施した。本研究の結果を、図18に図示する。
マウスInterferon−Alpha ELISAキット(PBL Biomedical)を使用して、マウス血清のIFN−βレベルをアッセイした。雌性Balb/C(10週齢;Charles River)をPBSまたはPBSで希釈した1×108 pfuのWT GFPもしくは1×108 pfuのAV3 GFP(ここで、AV3は、メチオニン51が完全に欠失している、VSVの操作されたバージョンである)を静脈内に、注入した。感染後示された時間に、血液を各マウスの伏在静脈からヘパリン化した試験管に収集し、遠心分離をして、血清を得た。各サンプルについて、5μlの血清を95μlのPBSに希釈して製造業者の使用説明書に従ってアッセイした。下の表5に提供した上記結果は、ΔM51変異体に感染させたマウスは、WT VSVに感染させたマウスよりも早く、かつ多くの量のIFN−αを産生したことを実証する。上記未処置のマウスは検出できる量のIFN−αを産生しなかった。
ΔM51−VSVによるマウスのインビボ処置は、担癌VSV未処置マウスからの脾臓細胞による溶解と比較して、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介性のCT26腫瘍細胞標的の溶解を、劇的に増強することが分かった。
変異体VSVの腫瘍に対する効果を研究するために、皮下CT26腫瘍を持つBalb/cマウスを、静脈内にΔM51 VSV GFPで処置した。2、5または8日後、上記マウスを安楽死させ、腫瘍を素早く凍結し、後で切片(5μm)を作製し、VSV、活性カスパーゼ3および全白血球マーカーであるCD45のための免疫組織化学染色を行った。標準的技術を、本研究で使用した。上記染色切片の写真を図20に示す。陽性染色は褐色で、一方、全ての核をヘマトキシリンで青に対比染色した。H&E染色は、腫瘍の形態を示している(H&E染色は、その腫瘍の全体的な構造を示す非特異的染色である)。
Claims (20)
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、変異体ラブドウイルス。
- 前記一以上の変異が基質(M)タンパク質をコードする遺伝子に存在する、請求項1に記載の変異体ラブドウイルス。
- 変異体水疱性口内炎ウイルス(VSV)である、請求項2に記載の変異体ラブドウイルス。
- 前記一以上の変異が、M51R、M51A、M51〜54A、ΔM51、ΔM51〜54、ΔM51〜M57、V221F、S226R、ΔV221〜S226,M51X,V221X、S226X、またはそれらの組合せである、請求項3に記載の変異体VSV。
- 前記一以上の変異が、M51R/V221F;M51A/V221F;M51〜54A/V221F;ΔM51/V221F;ΔM51〜54/V221F;ΔM51〜57/V221F;M51R/S226R;M51A/S226R;M51〜54A/S226R;ΔM51/S226R;ΔM51〜54/S226R:およびΔM51〜57/S226Rの群から選択される二重の変異である、請求項3に記載の変異体VSV。
- 前記一以上の変異が、M51R/V221F/S226R;M51A/V221F/S226R;M51〜54A/V221F/S226R;ΔM51/V221F/S226R;ΔM51〜54/V221F/S226R;およびΔM51〜57/V221F/S226Rの群から選択される三重の変異である、請求項3に記載の変異体VSV。
- 前記一以上の変異が、さらに宿主細胞のミトコンドリアとMタンパク質の相互作用を調節する結果となる、請求項1、2または3のいずれか1項に記載の変異体ラブドウイルス。
- 前記変異体ラブドウイルスが、感染細胞における一以上のサイトカインの産生を誘発することができる、請求項1、2または3のいずれか1項に記載の変異体ラブドウイルス。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを含有するウイルスベクターであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ウイルスベクター。
- 異種の核酸をさらに含む、請求項5に記載のウイルスベクター。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子および一以上の抗原をコードする異種の核酸に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを含むワクチンベクターであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ワクチンベクター。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンアジュバンドであって、該変異体ラブドウイルスが、感染細胞で一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ワクチンアジュバンド。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアを含有する選択的腫瘍崩壊剤であって該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、選択的腫瘍崩壊剤。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、薬学的組成物。
- 感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、薬学的に受容可能なキャリアを含有する免疫原性組成物であって、該変異体ラブドウイルスが、感染細胞で一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、免疫原性組成物。
- 該調製物から生じる有害の復帰変異体から保護するためのウイルスの薬学的調製物用の添加剤としての、請求項8に記載の変異体ラブドウイルスの使用。
- サイトカインの放出により軽減され得る、疾患または障害の処置における、請求項8に記載の変異体ラブドウイルスの使用。
- 前記疾患または障害が、癌、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染である、請求項17に記載の使用。
- 前記異種核酸が必要な被験体に、該異種核酸を送達するための請求項10に記載のウイルスベクターの使用。
- 一以上の容器ならびに
感染細胞においてmRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルス
を備えるキットであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、mRNAもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、キット。
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