ES2602610T3

ES2602610T3 - Proteína estructural mutada de un parvovirus

Info

Publication number: ES2602610T3
Application number: ES08758934.7T
Authority: ES
Inventors: Kerstin Lux; Hildegard BÜNING; Luca Perabo; John Nieland; Jorge Boucas; Michael Hallek; Mirko Ritter; Markus HÖRER
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2028-06-02
Also published as: WO2008145400A2; US10822378B2; DK2158211T3; US20130108658A1; US9624274B2; EP2158211A2; EP2158211B1; US20100203083A1; US20180066024A1; WO2008145400A3

Abstract

Una estructura multimérica que comprende una proteína estructural de parvovirus que comprende una inserción de aminoácido en la que la inserción de aminoácido es directamente en el extremo C del aminoácido G453 en la secuencia de AAV-2 o el aminoácido correspondiente de cualquier otro parvovirus, y en la que la proteína estructural con la inserción tiene capacidad de formación de partículas, y en la que la inserción (a) tiene una longitud de 4 a 30 aminoácidos, y/o (b) es un epítopo.

Description

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Sorprendentemente, en el contexto de la presente invención, se encontró que las inserciones directamente en el extremo Cl de G453 de AAV-2 eran superiores o al menos una alternativa válida a I-587.

Como se detalla adicionalmente más adelante, las secuencias de péptidos que han sido satisfactoriamente insertadas después de G453 y que se presentaron sobre la superficie de la cápsida, fueron reconocidas por 5 anticuerpos específicos de péptido y -en el caso de un mutante de direccionamiento -mediaron en la transducción viral. Cuando se alinean secuencias de aminoácidos de diversos parvovirus se ha descubierto de manera sorprendente que G453 de AAV-2 está conservado entre todos los virus adeno-asociados incluidos en el alineamiento y algunos parvovirus más distantemente relacionados tales como FPV, CPV y B19 (véase la Figura 2). Los alineamientos previamente publicados de esta región no revelan este aminoácido conservado (Grifman et al., 2001) 10 Fig. 1, A y B, Bucle III, (Girod et al., 1999) Fig. 1c). Por consiguiente, la invención no se limita a AAV-2, sino que también es aplicable a otros parvovirus como se define más adelante. Secuencias de parvovirus adicionales pueden alinearse fácilmente con el alineamiento proporcionado (Figura 2).

Según la presente invención, la inserción de aminoácido es directamente en el extremo C del aminoácido G453 en la secuencia de AAV-2 o el aminoácido correspondiente de cualquier otro parvovirus. También se desvelan en el 15 presente documento inserciones que pueden hacerse en el sitio de inserción I-453 definido en el presente documento, que es una inserción localizada directamente en el extremo N o C, preferentemente en el extremo C de un aminoácido en la secuencia de 5 aminoácidos del extremo N o C del aminoácido correspondiente a G453 de AAV2, preferentemente 3, más preferentemente 1, especialmente directamente en el extremo N o C, en particular extremo C, del aminoácido correspondiente a G453 de AAV-2. Esto significa que el sitio de inserción I-453 referido en

20 la descripción se corresponde con los aminoácidos enumerados en la Tabla 1. La flecha (▼) indica la posición de los sitios de inserción según las reivindicaciones.

Tabla 1: I-453

Parvovirus: Aminoácido N.º Sec. de aminoácido SEQ ID NO:

AAV-2: G453 NTPSG▼TTTQS SEQ ID NO: 1

AAV-5: G446 NNTGG▼VQFNK SEQ ID NO: 2

AAV-1: G454 QNQSG▼SAQNK SEQ ID NO: 3

AAV-6: G454 QNQSG▼SAQNK SEQ ID NO: 4

AAV-8: G456 QTTGG▼TANTQ SEQ ID NO: 5

AAV-10: G456 QSTGG▼TQGTQ SEQ ID NO: 6

AAV-3b: G454 GTTSG▼TTNQS SEQ ID NO: 7

AAV-7: G456 SNPGG▼TAGNR SEQ ID NO: 8

AAV-4: G445 STTTG▼TTLNA SEQ ID NO: 9

AAV-11: G444 STTSG▼ETLNQ SEQ ID NO: 10

b-AAV: G447 STTSG▼GTLNQ SEO ID NO: 11

FPV: G307 FGDIG▼VQQDK SEQ ID NO: 12

CPV: G271 FGDIG▼VQQDK SEQ ID NO: 13

B19: G268 PDTLG▼GDPKF SEQ ID NO: 14

GPV: Y323 VSATY▼TEGEA SEQ ID NO: 15

MVM: T309 AGTLT▼AQGSR SEQ ID NO: 16

▼ indica el sitio de inserción dentro de I-453 según la presente invención para cada proteína estructural enumerada.

Al igual que el sitio de inserción I-587 previamente conocido, I-453 se encuentra dentro de la región del extremo C 25 de las proteínas CAP que está presente en VP-1, VP-2 y VP-3. Por consiguiente, una inserción de una secuencia codificante de ADN en marco en el gen cap en el sitio correspondiente de I-453 conduce a una inserción de aminoácido respectiva en VP-1, VP-2 y VP-3 (véase la Figura 1).

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ii) un derivado (por ejemplo, un mutante) de un epítopo de linfocito B del tolerógeno que reacciona de forma cruzada con un anticuerpo que se une al epítopo de linfocito B del tolerógeno, iii) un mimótopo de un epítopo de linfocito B del tolerógeno, y/o iv) un parátopo de un epítopo de linfocito B del tolerógeno.

La longitud de un epítopo derivado de tolerógeno normalmente es 4-30, preferentemente 5-20 y lo más preferentemente 5-15 aminoácidos.

El derivado de un epítopo de linfocito B de un tolerógeno puede generarse por una o más sustituciones de aminoácidos, preferentemente una o más sustituciones de aminoácidos conservativas, es decir, sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Ejemplos de tales familias son aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares sin carga, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes, etc. Además, pueden obtenerse derivados por una o más deleción (deleciones) y/o inserción (inserciones) de un único aminoácido.

"Reacción cruzada" o "reaccionar de forma cruzada" de epítopos de linfocitos B con un anticuerpo monoclonal específico significa según la presente invención que la afinidad (KD; véase más adelante) de los epítopos con el anticuerpo está dentro de dos magnitudes, preferentemente dentro de una magnitud cuando se compara el epítopo de linfocito B con su derivado.

Epítopos derivados de tolerógeno dentro de la estructura multimérica que comprende proteínas estructurales mutadas de parvovirus según la presente invención son idénticos, se parecen o imitan estiramientos de antígeno de un tolerógeno que están -en su entorno natural -accesibles al sistema inmunitario, por ejemplo, epítopos de proteína de membrana localizada en la parte extracelular, proteínas del suero, inmunoglobulinas, proteínas de placa. Tales estiramientos de antígeno están preferentemente localizados sobre la superficie de tal proteína dentro del cuerpo de un mamífero, preferentemente un ser humano.

Un "mimótopo" es un epítopo estructural no lineal compuesto de varios aminoácidos derivados de diferentes regiones de la secuencia lineal de la proteína estructural localizada en estrecha vecindad debido a la estructura terciaria global de la cápsida que está específicamente unida por un anticuerpo, o un epítopo lineal que imita a un epítopo discontinuo de la proteína estructural.

Un "parátopo" es el sitio de unión al antígeno que está específicamente unido por un anticuerpo.

El mimótopo o parátopo en el contexto de la presente invención podría consistir en (partes de) la secuencia de péptidos insertada sola o podría estar compuesto de péptido insertado y restos de aminoácidos de partículas del núcleo de parvovirus.

Una "inserción" de (un) aminoácido(s) es en términos generales una inserción de al menos un aminoácido heterólogo en la secuencia de -para la presente invención -una proteína estructural de parvovirus. 'Heterólogo', en este contexto, significa heterólogo en comparación con el virus, del que se deriva la proteína estructural de parvovirus. Los aminoácidos insertados pueden insertarse simplemente entre dos aminoácidos dados de la proteína estructural de parvovirus. Una inserción de aminoácidos también puede ir junto con una deleción de aminoácidos dada de la proteína estructural de parvovirus en el sitio de inserción, conduciendo a una sustitución completa (por ejemplo, 10 aminoácidos dados están sustituidos con 10 o más aminoácidos insertados) o sustitución parcial (por ejemplo, 10 aminoácidos dados están sustituidos con 8 aminoácidos insertados) de aminoácidos de la proteína estructural de parvovirus.

El término "ligante" se refiere a una molécula que se une específicamente a su componente de unión respectivo. Ligantes comúnmente usados son anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales, derivados de anticuerpo tales como anticuerpos monocatenarios o fragmentos de anticuerpos. En principio, pueden usarse todas las clases de anticuerpos, se prefieren anticuerpos IgG. Igualmente pueden usarse fragmentos o multímeros de anticuerpos. Fragmentos comúnmente usados son anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab o (Fab)2. Ejemplos de otros ligantes adecuados son armazones de proteínas tales como anticalinas o lipocalinas (Nygren y Skerra, 2004), receptores o partes de los mismos (por ejemplo, receptores de linfocitos T solubles), alkirina, microcuerpos o aptámeros.

El término "se une específicamente a" significa que dos moléculas A y B, preferentemente proteínas, se unen la una a la otra, generando así el complejo AB con una afinidad (KD = kdis/ kas) de al menos KD = 1x10-5 mol/l, preferentemente 1x10-7 mol/l, más preferentemente 1x10-8 mol/l, especialmente 1x10-9 mol/l.

"Heterólogo", en el contexto de la presente invención, significa una secuencia de péptidos, por ejemplo un epítopo que no está presente sobre la cápsida viral no mutante del parvovirus y/o proteína estructural.

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En una realización especialmente preferida, el conector comprende al menos un extremo N de Cys y al menos un extremo C de Cys de la inserción. Tales cisteínas son capaces de formar un enlace disulfuro para generar un bucle que estabiliza la inserción y así facilita su unión a su anticuerpo, receptor o ligando.

Es otra realización de la presente invención que la proteína estructural de parvovirus comprenda una o más mutación (mutaciones) adicional(es) en un sitio diferente de I-453. Esta/Estas mutación (mutaciones) adicional(es) se selecciona(n) independientemente del grupo que consiste en una mutación puntual, una deleción interna, una deleción terminal, una inserción y una sustitución. En general, el fin de tal mutación adicional puede seleccionarse del mismo grupo de fines que se ha expuesto anteriormente para la inserción en I-453, concretamente para generar una vacuna, para dirigir un vector a una célula/tejido diferente y/o cambiar las propiedades cromatográficas con el fin de purificar las partículas a alta pureza. Por consiguiente, una inserción adicional puede nuevamente ser un epítopo, preferentemente un epítopo de linfocito B o epítopo CTL (como se especifica adicionalmente más adelante), especialmente un epítopo derivado de tolerógeno, una secuencia de direccionamiento que potencia la transducción, preferentemente un ligando para un receptor de elección, o una marca. Para la caracterización de actividad adicional de estas inserciones adicionales se hace referencia a las secciones anteriores que describieron las características para la inserción I-453 que se aplican igualmente para una segunda inserción.

Este péptido adicional puede ser idéntico a la inserción en I-453. Esto se prefiere si es clave que tenga un gran número de péptidos idénticos que se presentan óptimamente sobre la superficie de una partícula, especialmente en casos en los que se requiere reticulación directa del receptor de linfocitos B (BCR) para la sensibilización independiente de linfocitos T de linfocitos B y la rotura la de tolerancia contra auto-antígenos. Una densidad más alta de epítopos de linfocitos B aumenta la verosimilitud de la óptima reticulación de BCR específica de péptido que requiere una distancia definida entre BCRs (por ejemplo, aproximadamente 5-10 nm), y por tanto, epítopos de linfocitos B respectivos que se presentan sobre una cápsida de parvovirus. Además, como se muestra en la presente invención (Figura 5), modificaciones de cápsidas de parvovirus en dos o más sitios diferentes de una en una pueden conducir a una comunicación cruzada conformacional dentro de la estructura de la cápsida que conduce a una presentación mejorada de la secuencia de péptidos insertada. Además, un número más grande de epítopos de linfocitos B insertados disminuye la probabilidad de reacciones inmunitarias no deseadas contra el esqueleto de parvovirus debido a i) enmascaramiento de epi-/mimótopos de linfocitos B de parvovirus naturales y/o ii) ligeros cambios de la cápsida estructural que convierten estos epi-/mimótopos de linfocitos B naturales en menos inmunogénicos.

Por consiguiente, en este caso se prefiere especialmente que el péptido insertado sea un epítopo de linfocito B, incluso más preferido un epítopo derivado de tolerógeno. Proteínas estructurales de parvovirus que presentan un alto número de epítopos sobre la superficie de una partícula/cápsida similar a virus pueden usarse eficientemente para generar respuestas de linfocitos B independientes de linfocitos T e incluso romper la tolerancia. Como se muestra en los Ejemplos 5.4 y 6.2, pueden insertarse epítopos idénticos, respectivamente epítopos de linfocitos B, en dos sitios de inserción diferentes, aquí I-453 y I-587, y están accesibles a ligando soluble, en este caso αVβ3, o βamiloide, respectivamente. Por tanto, es una realización especialmente preferida de la presente invención que un péptido idéntico se inserte en I-453 y I-587 y que este péptido sea un epítopo de linfocito B, lo más preferido un epítopo derivado de tolerógeno. Otra variante de inserción doble preferida es una variante con inserciones en I-453 y I-261.

Sin embargo, el péptido adicional puede ser uno diferente en comparación con el péptido insertado en I-453.

Por tanto, es otra realización de la presente invención que una inserción en la posición I-453 se combine con al menos una inserción de aminoácido adicional en uno o más sitios adicionales. Sitios de inserción adecuados adicionales identificados que usan AAV-2 son muy conocidos en la técnica y se enumeran a modo de ejemplo en la Tabla 3. Sin embargo, debe entenderse que la inserción de aminoácido adicional en uno o más sitio(s) adicional(es) no se limita a aquellas enumeradas a continuación.

Tabla 3: Sitios de inserción adicionales

Sitio de inserción: aminoácido corresp. / secuencia de AAV-2 SEQ ID NO: Referencias

I-1: M1 M1 AADGY SEQ ID NO: 17 (Wu et al., 2000)

I-34: P34 PPPKP34 AERHK SEQ ID NO: 18 (Wu et al., 2000)

I-138: T138 EPVKT138APGKK SEQ ID NO: 19 (Wu et al., 2000, Warrington et al., 2004, Lux et al., 2005)

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I-139: A139 PVKTA139PGKKR SEQ ID NO: 20 (Shi et al., 2001, Shi y Bartlett, 2003, Arnold et al., 2006)

I-161: K161 SGTGK161AGQQP SEQ ID NO: 21 (Shi et al., 2001, Arnold et al., 2006)

I-261: S261 YKQIS261SQSGA SEQ ID NO: 22 (Girod et al., 1999)

I-266: A266 SQSGA266SNDNH SEQ ID NO: 23 (Wu et al., 2000)

I-381: N381 YLTLN381NGSQA SEQ ID NO: 24 (Girod et al., 1999)

I-447: R447 YYLSR447TNTPS SEQ ID NO: 25 (Girod et al., 1999, Wu et al., 2000)

I-448: T448 YLSRT448NTPSG SEQ ID NO: 26 (Grifman et al., 2001)

I-459: R459 TTQSR459LQFSQ SEQ ID NO: 27 (Shi et al., 2001, Arnold et al., 2006)

I-471: R471 ASDIR471DQSRN SEQ ID NO: 28 (Asokan y Samulski, 2006, Moskalenko et al., 2000)

I-520: G520 LVNPG520PAMAS SEQ ID NO: 29 (Shi et al., 2006)

I-534: F534 EEKFF534PQSGV SEQ ID NO: 30 (Girod et al., 1999)

I-570: P570 RTTNP570VATEQ SEQ ID NO: 124 Datos propios

I-573: T573 NPVAT573EQYGS SEQ ID NO: 31 (Girod et al., 1999)

I-584: Q584 STNLQ584RGNRQ SEQ ID NO: 32 (Shi et al., 2001, Shi y Bartlett, 2003, Shi et al., 2006)

I-587: N587 LQRGN587RQAAT SEQ ID NO: 33 (Girod et al., 1999, Shi et al., 2001, Grifman et al., 2001, Ried et al., 2002, Nicklin et al., 2001, Work et al., 2004, White et al., 2004, Arnold et al., 2006, Maheshri et al., 2006, Work et al., 2006)

I-588: R588 QRGNR588QAATA SEQ ID NO: 34 (Shi y Bartlett, 2003, Muller et al., 2003, Waterkamp et al., 2006)

I-591: A591 NRQAA591TADVN SEQ ID NO: 35 (Wu et al., 2000)

I-657: P657 VPANP657STTFS SEQ ID NO: 36

I-664: A664 TFSAA664 KFASF SEQ ID NO: 37 (Wu et al., 2000)

I-713: T713 NVDFT713VDTNG SEQ ID NO: 38

I-716: T716 FTVDT716NGVYS SEQ ID NO: 39 (Maheshri et al., 2006)

I-570 es especialmente adecuado como sitio de inserción que va junto con una deleción de aminoácidos dados de la proteína estructural de parvovirus en el sitio de inserción, conduciendo a una sustitución completa. En este caso, los aminoácidos RTTNPVATEQ pueden estar sustituidos con un péptido o epi-o mimótopo de direccionamiento.

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antígeno T grande o el origen P1 del VEB (virus de Epstein-Barr) y EBNA. Cantidades crecientes del plásmido del gen indicador auto-replicante se co-transfectan con ADN de vehículo tal como ADN de plásmido vacío (por ejemplo, derivados de pUC) que mantiene la cantidad de ADN total constante. En teoría, cada célula transfectada con el plásmido de gen indicador expresará, debido a su auto-replicación, cantidades suficientes de la proteína indicadora que va a detectarse. A alguna relación de vector de gen indicador con respecto a ADN de vehículo, un aumento adicional de plásmido de gen indicador conducirá a un aumento correspondiente en el número de células transfectadas. Por este medio, puede determinarse la cantidad ideal de plásmido de gen indicador auto-replicante, reflejando la cantidad ideal de genomas de vector.

Similarmente, otro sistema de lectura para la detección de células satisfactoriamente transfectadas son métodos tales como PCR in situ para detectar el genoma de plásmido transfectado al nivel de una única célula.

Alternativamente, la biblioteca geno-/fenotípicamente acoplada de viriones de parvovirus puede producirse transduciendo una biblioteca de viriones (no acoplada o parcialmente) en células de producción bajo condiciones adecuadas a una relación de genomas por célula de 5 a 5.000, preferentemente 10 a 1.000, más preferentemente 50 a 300, especialmente aproximadamente 100, y seleccionando condiciones de transducción para que sean independientes de las vías de infección, particularmente mediante captación no específica mediante pinocitosis y/o fagocitosis, produciendo viriones/biblioteca geno-/fenotípicamente acoplados.

Es especialmente relevante para el cribado de proteínas estructurales que tienen insertos de epítopo el método usado para infectar células después de que los viriones de unión se hayan separado de viriones no de unión. Se sabe que una inserción de péptido en el sitio de I-587 de AAV2 frecuentemente destruye (dependiendo de la secuencia del péptido insertado) el motivo de unión de heparina requerido para la eficiente infección del receptor de HSPG que contiene células tales como células HeLa o 293. Ahora se ha encontrado que una inserción en I-453 opcionalmente en combinación con I-587 puede alterar la actividad de transducción de viriones respectivos. Por tanto, métodos de infección simple podrían influir en el método de cribado y conducir solo a mutantes que todavía pueden entrar en células HeLa específicamente mediante el receptor respectivo, en caso de AAV2 mediante proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG). Por tanto, una captación no específica de partícula de virus por la célula de producción puede ser ventajosa. Tal captación no específica puede lograrse sembrando las células de producción sobre viriones de parvovirus inmovilizados. Para este método, los viriones se recubren directamente a un soporte tal como una placa de cultivo de tejido. Alternativamente, primero un anticuerpo específico de cápsida (en el caso de AAV2, por ejemplo, A20) se recubre al soporte y segundo las cápsidas se unen a los anticuerpos recubiertos. La ventaja en el último caso es que el complejo de partícula de anticuerpo/virus, respectivamente la propia partícula de virus, se desprende más eficazmente del soporte y así se internaliza por la célula. Y, lo que es más importante, la introducción de secuencias de péptidos extrañas en I-453 de AAV2 no destruye la afinidad de A20 por la partícula mutante respectiva, ya que los epítopos de A20 están difícilmente afectados, si lo están, por la inserción de péptido. Las células, por ejemplo, células HeLa, se siembran finalmente sobre las cápsidas unidas. Se espera que este procedimiento conduzca a una captación del virus, por ejemplo, AAV, por la célula independiente de la vía infecciosa natural, supuestamente por pinocitosis y/o fagocitosis.

Alternativamente o adicionalmente, la etapa de selección puede llevarse a cabo sobre células que expresan un receptor específico para un ligante de elección que se usa para seleccionar la variante parvoviral deseada. Por ejemplo, pueden usarse células que expresan el FcγRI que es específico para cualquier ligante que comprende una parte Fc de un anticuerpo. Para este ejemplo, tales células que expresan FcγRI pueden transducirse con un conjunto de bibliotecas de parvovirus. Primero, puede realizarse una selección negativa para evitar la selección no específica de candidatos parvovirales que por ellos mismos son capaces de transducir células independientemente de una interacción de un ligante con el FcγRI. Por tanto, las células que expresan FcγRI se incuban con el conjunto de bibliotecas. El sobrenadante (conjunto de parvovirus que no es capaz de transducir las células) se recoge y posteriormente se incuba con el ligante de elección (por ejemplo, anticuerpo de selección) para realizar la selección positiva. En la selección positiva, los parvovirus decorados con el ligante serán capaces de transducir células que expresan FcγRI mediante el acoplamiento del ligante al FcγRI sobre la superficie de las células. Las células transducidas pueden posteriormente usarse para amplificar las partículas en presencia del ligante, suponiendo que el tráfico intracelular no esté alterado dentro de las células.

En otra realización preferida, puede obtenerse una biblioteca geno-/fenotípicamente acoplada de viriones de parvovirus por un método donde viriones seleccionados son específicamente captados por células de producción. En este caso, la biblioteca de viriones de parvovirus se produce transduciendo la biblioteca en células de producción bajo condiciones adecuadas a una relación de genomas por célula de 10 a 10.000, preferentemente 50 a 5.000, más preferentemente 100 a 3.000, especialmente aproximadamente 1.000, en la que las condiciones de transducción están seleccionadas para ser dependientes de las vías de infección, particularmente mediante la unión específica de receptor, produciendo viriones/biblioteca geno-/fenotípicamente acopladas. Con el fin de lograr tal captación específica de receptor, los viriones de la biblioteca son preferentemente no inmovilizados, pero se añaden a las células en suspensión, mientras que tanto las células como los viriones pueden estar en suspensión o las células se inmovilizan y se añaden viriones en suspensión. Por tanto, la transfección de las células es básicamente dependiente de la vía de infección del virus.

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Enfermedad: diana/antígeno de anticuerpo

Diabetes juvenil dependiente de insulina: Células de los islotes pancreáticos

Anemia perniciosa: Células parietales gástricas

Enfermedad de Addison: Células suprarrenales

Hipoparatiroidismo idiopático: Células de la paratiroides

Infertilidad espontánea: Esperma

Fallo ovárico prematuro: Células intersticiales, células del cuerpo lúteo

Pénfigo: Sustancia de piel intercelular

Cirrosis biliar primaria: Mitocondrias

Anemia hemolítica autoinmune: Eritrocitos

Púrpura trombocitopénica idiopática: Plaquetas

Neutropenia idiopática: Neutrófilos

Vitiligo: Melanocitos

Osteosclerosis y enfermedad de Meniere: Colágeno tipo II

Hepatitis activa crónica: Núcleos de hepatocitos

Síndrome de Goodpasture: Membranas basales

Artritis reumatoide: Gamma globulina, antígenos relacionados con el virus, IL-6, IL-17, TNF-α

Síndrome de Sjögren: Núcleos y centrómeros

Lupus eritematoso sistémico: Núcleos, ADN, ARN, eritrocitos, etc.

Esclerodermia: Núcleos y centrómeros

Polimiositis: Núcleos, ARN

Enfermedades autoinmunitarias preferidas son asma, diabetes juvenil dependiente de insulina (diabetes tipo 1) y artritis reumatoide. Por tanto, antígenos preferidos son los antígenos correspondientes de receptores beta-2 adrenérgicos, células de los islotes pancreáticos, gamma globulina E, antígenos relacionados con virus, IL-6, IL-17 y TNF-α.

Ejemplos de enfermedades tumorales que son especialmente adecuadas para la presente invención se enumeran en la Tabla 6.

Tabla 6: Enfermedades tumorales y dianas/antígenos de anticuerpo adecuados

Enfermedad: diana/antígeno de anticuerpo

Melanoma: HMW MAA (= antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular), BAGE, GAGE, MAGE-3, Melan A, MART-1, NY ESO, gp 100, tirosinasa

Cáncer de colon: CA125, EGFR

Glioblastoma multiforme (GBM): CA125, IL13R

Cáncer de mama: Her2/NEU

Cáncer de ovario: molécula de adhesión a células L1

diversos cánceres (por ejemplo, para cáncer de colon, carcinoma de células pulmonares pequeñas): VEGF

linfoma de linfocitos B, por ejemplo, linfoma no Hodgkin: CD20

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Ejemplos de enfermedades alérgicas son asma, especialmente asma atópica, y todos los tipos de alergias. Los antígenos diana preferidos para la vacunación contra enfermedades alérgicas son IgE, IL-9 y IL-13, especialmente IgE.

Un ejemplo de una enfermedad metabólica es un trastorno en el metabolismo del colesterol (por ejemplo, aterosclerosis), un antígeno diana preferido es CETP.

Ejemplos de enfermedades inflamatorias que son especialmente adecuadas para la presente invención se enumeran en la Tabla 7.

Tabla 7: Enfermedades inflamatorias y dianas/antígenos de anticuerpo adecuados

Enfermedad

EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica)

OA (osteoartritis)

Artritis reumatoide

Polimialgia reumática

Artritis gotosa, gota, pseudogota

Aterosclerosis

Enfermedad de Crohn (enfermedad inflamatoria del intestino)

Tendinitis del hombro, bursitis

Colitis

Esclerosis múltiple

Lupus eritematoso sistémico

Psoriasis

Diabetes juvenil

Diabetes mellitus tipo I (diabetes resistente a insulina)

Hipotiroidismo

Síndrome de fatiga crónica

Enfermedad de Kawasaki

Enfermedad cardiovascular

Pericarditis

Adenopatía linfática

Fenómeno de Raynaud

Sarcoidosis

Síndrome de Sjögren

Espondiloartropatías

Vasculitis

Esclerodermia

Síndrome de Goodpasture

Granulomatosis de Wegener

temporal = arteritis de células gigantes

Celiaquía

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Enfermedad

Hepatitis autoinmune

Enfermedad de Graves

Enfermedad de injerto frente al huésped

Antígenos diana preferidos son TNF-α, CD20, IL-6 y IL-17.

Ejemplos de enfermedades en oftalmología son degeneración macular senil (AMD) y retinopatía diabética, una diana preferida en estas indicaciones es VEGF.

Otras enfermedades preferidas son enfermedad de Alzheimer con el antígeno diana β-amiloide.

La proteína estructural mutada de parvovirus según la presente invención puede ser especialmente útil para la fabricación de un medicamento para romper la tolerancia inmunitaria.

En el contexto de los usos de la invención, las características de la proteína estructural mutada de parvovirus son como se han definido anteriormente.

En una realización preferida, la enfermedad no es una enfermedad infecciosa, que significa una enfermedad producida por un virus, una bacteria, un hongo o un parásito eucariota.

En otra realización, la proteína estructural mutada de parvovirus no se usa para preparar un vector que se usa en terapia génica.

Una realización preferida de la presente invención es una proteína estructural de un parvovirus como se ha definido adicionalmente anteriormente que comprende un epi-/mimótopo antiidiotípico de un anticuerpo anti-IgE, y/o un epi/mimótopo de IgE. Vacunas preferidas son las siguientes:

Vacunas para el tratamiento de asma y enfermedades alérgicas

El asma atópica y la rinitis alérgica se producen por respuestas inmunitarias adversas, tipificadas por IgE, contra proteínas ambientales por lo demás inocuas, los alérgenos. En individuos sensibilizados, IgE específica de alérgeno se localiza en tejidos uniéndose al receptor de alta afinidad para IgE, FcεRI, expresado por mastocitos en diversos tejidos y basófilos, además de eosinófilos en la sangre. Encuentros posteriores con el alérgeno producen la reticulación de IgE/FcεRI, que desencadena la desgranulación de células efectoras y la liberación de tanto mediadores previamente formados (histamina, enzimas proteolíticas y proteoglicanos) como mediadores sintetizados de novo (prostaglandina D2, leucotrienos y citocinas). Juntos, estos mediadores son responsables de las manifestaciones clínicas de reacciones alérgicas, que incluyen fiebre del heno, asma y eccema, además de reacciones anafilácticas potencialmente mortales. La terapia estándar incluye corticosteroides inhalados (ICS), dipropionato de beclometasona (BDP), β-agonistas de acción prolongada (LABA) y antagonistas de receptores del leucotrieno (LTRAs).

La región de unión al receptor de IgE humana se mapeó previamente con la región del extremo N del dominio CH3 (Helm et al., 1988, Helm et al., 1989). Se han realizado estudios de mutagénesis dirigida al sitio para identificar los restos de aminoácidos implicados directamente en la interacción en tanto IgE (Presta et al., 1994) como FcεRI (Cook et al., 1997). Además, la estructura cristalina del complejo humano de IgE-FcεRIα se resolvió recientemente por Garman y colaboradores (Garman et al., 2000). Las regiones de aminoácido que participan en la unión al receptor están localizadas en tres bucles y se extienden sobre la mayoría del dominio Cε3 (Pro-364, Arg-365, Arg-408, Ser411, Lys-415, Glu-452, Arg-465 y Met-469). La unión está mediada principalmente por interacción electrostática.

La terapia anti-IgE se basa en anticuerpos que se unen a la región Cε3 del dominio diana de unión al receptor de IgE, previniendo así la unión de IgE al receptor FcεRI y, por tanto, previniendo la sensibilización de mastocitos y basófilos. Sin embargo, aunque el 99 % de IgE libre se neutralizó por el anticuerpo anti-IgE, la terapia todavía fracasaría debido a que las pocas moléculas de IgE restantes serían suficientes para sensibilizar las células respectivas. Se proporciona eficacia terapéutica mediante acciones adicionales: la expresión de FcεRI está regulada por el nivel de IgE libre, de una forma que niveles reducidos de IgE libre conducen a densidades reducidas de FcεRI sobre basófilos y mastocitos y sensibilidades reducidas. Y, el anti-IgE puede conducir a la regulación por disminución de la producción de IgE por eliminación o regulación por disminución de linfocitos B que expresan IgE, quizás por reticulación de IgE unido a la membrana y causando apoptosis, anergia o lo más probablemente también por citólisis mediada por el complemento y mediada por célula. El último mecanismo no fue, sin embargo,

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Vacunas para el tratamiento de aterosclerosis

La aterosclerosis es una enfermedad que afecta a los vasos sanguíneos arteriales. Es una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, debido en gran parte a la acumulación de glóbulos blancos de macrófagos y promovida por las lipoproteínas (proteínas plasmáticas que llevan colesterol y triglicéridos) de baja densidad (especialmente de partícula pequeña) sin eliminación adecuada de grasas y colesterol de los macrófagos por lipoproteínas de alta densidad (HDL) funcionales. Se denomina comúnmente un "endurecimiento" u "obstrucción" de las arterias. Se produce por la formación de múltiples placas dentro de las arterias. Hay una fuerte relación inversa entre la concentración plasmática de colesterol en HDL (HDL-C) y el desarrollo de enfermedad cardíaca coronaria (CHD). La concentración plasmática de HDL-C es un poderoso factor pronóstico de CHD. Aunque el 33 % de los pacientes con CHD tienen bajos niveles en plasma de HDL-C como su anomalía lipídica primaria, actualmente no hay terapia eficaz para aumentar la concentración plasmática de HDL-C. La dieta y el ejercicio moderado son ineficaces, las estatinas solo proporcionan un modesto aumento del 5 % al 7 % en HDL-C, y la niacina tiene efectos secundarios y perfiles de cumplimiento que limitan su uso.

Un enfoque terapéutico que se ha sugerido para aumentar las concentraciones de HDL-C en plasma es la inhibición de la actividad de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP). CETP es una glucoproteína plasmática de 74 kDa que facilita la transferencia de lípidos y fosfolípidos neutros entre lipoproteínas y contribuye a la regulación de la concentración plasmática de HDL-C. CETP funciona en el plasma para reducir la concentración de HDL-C moviendo los ésteres de colesterilo de HDLs a VLDLs y LDLs (Rittershaus et al., 2000).

Por consiguiente, es otra realización de la invención proporcionar proteínas estructurales de parvovirus, especialmente AAV, que contienen epítopos o mimótopos de CETP en el sitio de inserción I-453 que pueden usarse como vacuna para el tratamiento de aterosclerosis. Preferentemente, el epítopo o mimótopo se inserta en I-453 y al menos un sitio de inserción adicional, preferentemente I-261, I-534, I-570, I-573 o I-587, especialmente en I-453 y I587, preferentemente de AAV1, AAV2 o AAV-6. Epítopos o mimótopos adecuados son los péptidos derivados de CETP humana hTP10, hTP11, hTP12, hTP13, hTP18 y hTP20, hRitsch-1, hRitsch-2, hRitsch-3, hCETP-intern y hCETP C-Term.

La presente invención se refiere además a novedosos epítopos de linfocitos B de CETP hTP10, hTP11, hTP12, hTP13, hTP18, hTP20, hRitsch-1, hRitsch-2, hRitsch-3, hCETP-intern y hCETP C-Term y/o a una variante funcionalmente activa de los mismos.

Vacunas para el tratamiento de enfermedades tumorales

Terapias de anticuerpos tales como HERCEPTIN®, AVASTIN®, ERBITUX®, OMNITARG®, RITUXAN®, CAMPATH®, ZEVALIN®, MYLOTARG®, BEXXAR® o Panitumumab desempeñan una función cada vez mayor en la lucha contra diversos tipos de enfermedades tumorales. Estos anticuerpos se unen específicamente a epítopos de factores causando el crecimiento celular no controlado, tal como receptores del factor de crecimiento o factores de crecimiento. Por consiguiente, es otra realización de la presente invención proporcionar proteínas estructurales de parvovirus, especialmente AAV, que contienen epítopos de tales factores que causan el crecimiento celular no controlado.

HER2/neu (también conocido como ErbB-2, ERBB2) es una proteína que da agresividad más alta en cánceres de mama. Es un miembro de la familia de proteínas ErbB, más comúnmente conocido como la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico. HER2/neu también se ha designado CD340. HER2/neu es notable por su función en la patogénesis del cáncer de mama y como diana de tratamiento. Es una tirosina cinasa de receptor unida a la superficie de la membrana celular y normalmente participa en las vías de transducción de señales que conducen al crecimiento y la diferenciación celular. Aproximadamente el 25-35 por ciento de los cánceres de mama tienen amplificación del gen HER2/neu o expresión en exceso de su producto de proteína. La expresión en exceso también se produce en otro cáncer, tal como cáncer de ovario y cáncer de estómago. Clínicamente, HER2/neu es importante como la diana del anticuerpo monoclonal trastuzumab (comercializado como HERCEPTIN®).

En cuanto a un enfoque de vacunación activa, se ha mostrado que la secuencia del epítopo QMWAPQWGPD (SEQ ID NO: 123) presentada en una forma circular induce anticuerpos policlonales con eficacia terapéutica. Por tanto, puede generarse una vacuna de Her2/NEU-AAV por inserción de este péptido en AAV usando secuencias adaptadoras adecuadas (Riemer et al., 2007).

Por consiguiente, realizaciones especialmente preferidas de la invención son proteínas estructurales de parvovirus, especialmente AAV, que contienen epítopos o mimótopos de antígenos de tumor, preferentemente HER2/neu, especialmente el epítopo descrito por Riemer, en I-453, preferentemente epítopos o mimótopos conocidos. En el contexto de la presente invención, un epítopo de linfocito B de HER2/neu puede insertarse en una cápsida de parvovirus y presentarse sobre la superficie de la cápsida. En una realización preferida, el epítopo de linfocito B es un epítopo humano. Preferentemente se inserta en I-453 y al menos un sitio de inserción adicional, preferentemente

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pCI-VP2-∆Not-I587-reV 5'-CTG CGG TAG CTG CTT GGC GCG CC TT GCG GCC GCG TTG CCT CTC TGG AGG TTG G-3'. (SEQ ID NO: 71)

Se realizó mutagénesis específica de sitio usando el kit QUIKCHANGE II SITE-DIRECTED MUTAGENESIS 5 (STRATAGENE) según las instrucciones del fabricante. El vector resultante se denomina pCIVP2-I587-NotI-AscI.

2.2. Clonación de secuencias de epítopo en pCIVP2-I587-NotI-AscI

Para clonar una secuencia de epítopo de CETP en pCIVP2-I587-NotI-AscI se diseñaron oligonucleótidos sentido y antisentido que codificaban el epítopo de CETP con una secuencia de adaptador de alanina corto o largo y contenían extensiones del sitio 5'. La extensión del sitio 5' de los oligonucleótidos se diseñó de manera que la 10 hibridación de los oligonucleótidos sentido y antisentido produjera un ADNbc con nucleótidos protuberantes del sitio 5' y sitio 3' compatibles con nucleótidos protuberantes generados por restricción de NotI y AscI del plásmido pCIVP2-I587-NotI-AscI. Las secuencias de los oligonucleótidos y la secuencia del epítopo de CETP codificada que incluye los adaptadores de alanina se resumen en la Tabla 9. La secuencia del epítopo de CETP insertada está flanqueada por un adaptador de alanina corto o largo según el siguiente esquema (Xn representa la secuencia del epítopo de

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adaptador de Ala corto: (A)3-Xn-(A)2 (A corto) adaptador de Ala largo: (A)5-Xn-(A)5 (A largo) adaptador de Gly largo: (A)3-(G)5-Xn-(G)5-(A)2 (G largo)

Tabla 9: Oligonucleótidos usados para clonar secuencias de epítopo en la posición I-587

Nombre / sec. de péptido: Tipo Oligonucleótido sentido Oligonucleótido antisentido Adaptador

CETP-intern CDAGSVRTNAPD SEQ ID NO: 60: Epítopo imagen25 imagen26 A corto

A largo

β-amiloide DAEFRHDSG SEQ ID NO: 65: Epítopo G largo

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Se hibridaron los oligonucleótidos sentido y antisentido como se ha descrito anteriormente (1.2). Para clonar los oligonucleótidos hibridados en pCIVP2-I587-NotI-AscI, el vector se linealizó por restricción con NotI y AscI y la reacción de clonación se realizó usando el kit Rapid DNA Ligation (Roche). Brevemente, los oligonucleótidos hibridados se diluyeron 10 veces en 1x tampón de dilución de ADN y se incubaron durante 5 min a 50 ºC. Se usaron

25 100 ng de estos oligonucleótidos hibridados y 50 ng del vector linealizado pCIVP2-I587-NotI-AscI en la reacción de ligación, que se realizó según las instrucciones del fabricante del kit Rapid DNA Ligation (Roche). Se transformaron XL1 blue de E. coli con una alícuota de la reacción de ligación y se sembraron en placas de agar LB-Amp. Se prepararon plásmidos según procedimientos convencionales y se analizaron por secuenciación.

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2.3. Subclonación de epítopos de pCIVP2 en pUCAV2 en la posición I-587

Para la producción de partículas de AAV recombinantes que llevan la inserción del epítopo de CETP en la posición I587, el fragmento BsiWI/XmaI de pCI-VP2-587-NotI-AscI que codifica un fragmento de VP-2 que contiene el epítopo

o mimótopo en la posición I-587 se subclonó en pUCAV2, que se modificó como se ha descrito anteriormente (1.3). El pUCAV2 modificado se denomina pUCAV2-Agel. Se linealizó pUCAV2-Agel con BsiWI y Agel y se unió con el fragmento BsiWI/XmaI de pCI-VP2-587-NotI-AscI que codifica el fragmento de VP-2 que contiene el epítopo de CETP en la posición I-587.

3. Producción y purificación de variantes de AAV

3.1. Plásmido colaborador AdV

Se usó un plásmido colaborador AdV que codifica E2, E4 y VAI-VAII de AdV para la fabricación de AAV en células HEK 293-T. Se construyó el plásmido colaborador pUCAdvE2/E4-VAI-VAII subclonando el fragmento de restricción BamHI que codifica el adenovirus E2 y E4-ORF6 de pAdEasy-1 en el sitio BamHI de pUC19. El plásmido resultante se denomina pUCAdVE2/E4. El fragmento VAI-VAII de pAdvantage se amplificó por PCR usando los cebadores

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se clonó en pTOPO y entonces se subclonó en el sitio XbaI de pUCAdvE2/E4. El plásmido resultante pUCAdvE2/E4-VAI-VAII se evaluó en experimentos de co-transfección para la producción de AAV como se describe más adelante. Se analizó la formación de partículas de AAV usando ELISA de A20.

3.2. Producción de variantes de AAV por co-transfección de células HEK 293-T

Para la producción de partículas de AAV se co-transfectaron células HEK 293-T con el plásmido de vector pUCAV2 que contenía el epítopo subclonado (en I-453 y/o I-587) y el plásmido colaborador pUCAdV (descrito anteriormente).

Para la co-transfección, se sembraron 7,5x106 células 293-T en cada placa de cultivo celular de 015 cm en un volumen total de 17,5 ml de medio (DMEM que contiene 10 % de FCS, L-Gln 5 mM y ABAM) 24 h antes de la transfección y se cultivaron a 37 ºC, 5 % de CO2 en una atmósfera humidificada. Para la co-transfección del plásmido de vector pUCAV2 que contiene el epítopo (en I-453 o I-587) y pUCAdV se eligió una relación molar de los plásmidos de 1:1. Para la transfección con fosfato de calcio de una placa de cultivo con células 293-T usando el protocolo de transfección con fosfato de calcio como se ha desvelado en el documento US 2004/0053410, se mezclaron 12,0 µg de pUCAV2 (que contiene el epítopo en I-453 o I-587) y 24,0 µg de pUCAdV en 875 µl de CaCl2 270 mM. En resumen, se añadieron 875 µl de 2x BBS (BES 50 mM (pH 6,95), NaCl 280 mM y Na2HPO4 1,5 mM) a la mezcla y la solución resultante se mezcló cuidadosamente por pipeteado. La solución se incubó durante 20 min a temperatura ambiente y a continuación se añadió gota a gota a la placa de cultivo celular. Las células se incubaron a 35 ºC, 3 % de CO2 en una atmósfera humidificada durante 18 h. Después de 18 h a 35 ºC y 3 % de CO2, las células se cultivaron durante 3 d adicionales a 37 ºC, 5 % de CO2 en una atmósfera humidificada.

Se recogieron las células 293-T con un filtro de células, se transfirieron a tubos de plástico de 50 ml (Falcon) y se centrifugaron a 3000 g a 4 ºC durante 10 min. El sedimento de células se resuspendió en 1,0 ml de tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 8,5) y se sometió a tres rondas de ciclos de congelación y descongelación. El lisado se trató con 100 U/ml de benzonasa (MERCK) a 37 ºC durante 30 min. El lisado celular se aclaró por dos etapas de centrifugación (3700 g, 4 ºC, 20 min) y el sobrenadante que contenía AAV se usó para más purificación.

Se determinó el título de cápsidas de AAV del lisado usando un ELISA comercialmente disponible (ELISA de valoración de AAV, PROGEN).

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Las siguientes secuencias, que son homólogas a las secuencias de citocina murinas correspondientes, pueden integrarse en la cápsida de AAV2 en la posición I-453 según los métodos descritos anteriormente:

Tabla 14: Epítopos derivados de citocina humana en I-453

Citocina: epítopo murino epítopo humano

TNF-α V1: SSQNSSDKPVAHVVANHQVE SEQ ID NO: 142 SSRTPSDKPVAHWANPQAE SEQ ID NO: 116

TNF-α V2: SQNSSDKPVAHWANH SEQ ID NO: 151 SRTPSDKPVAHWANP SEQ ID NO: 117

TNF-α V3: SSQNSSDKP SEQ ID NO: 152 SSRTPSDKP SEQ ID NO: 118

IL-17 V1: NAEGKLDHHMNSVL SEQ ID NO: 143 NADGNVDYHMNSVP SEQ ID NO: 119

IL-17 V2: EGKLDHHMNSV SEQ ID NO: 153 DGNVDYHMNSV SEQ ID NO: 120

IL-6 V1: KSLEEFLKVTLRSTRQ SEQ ID NO: 154 RSFKEFLQSSLRALRQ SEQ ID NO: 121

IL-6 V2: LEEFLKVTLRS SEQ ID NO: 144 FKEFLQSSLRA SEQ ID NO: 122

7.4. Inserción de epítopos de citocina en la cápsida de AAV2 en la posición I-453 y I-587

Usando la estrategia de clonación descrita anteriormente, pueden generarse las siguientes variantes de AAV que llevan diferentes epítopos de citocina en la posición I-453 y I-587 (vacunas bivalentes):

Tabla 15: Variantes de inserción doble para epítopos derivados de citocina

combinación: Epítopo en I-453 Epítopo en I-587

TNF-α / IL-17: mTNFα-V1 SSQNSSDKPVAHVVANHQVE SEQ ID NO: 142 mIL-17-V1 NAEGKLDHHMNSVL SEQ ID NO: 143

TNF-α / IL-6: mTNFα-V1 SSQNSSDKPVAHVVANHQVE SEQ ID NO: 142 mIL-6-V2 LEEFLKVTLRS SEQ ID NO: 144

IL-17 / TNF-α: mIL-17-V1 NAEGKLDHHMNSVL SEQ ID NO: 143 mTNFα-V1 SSQNSSDKPVAHVVANHQVE SEQ ID NO: 142

IL-6/ TNF-α: mIL-6-V2 LEEFLKVTLRS SEQ ID NO: 144 mTNFα-V1 SSQNSSDKPVAHVVANHQVE SEQ ID NO: 142

IL-17 / IL-6: mIL-17-V1 NAEGKLDHHMNSVL SEQ ID NO: 143 mIL-6-V2 LEEFLKVTLRS SEQ ID NO: 144

IL-6 / IL-17: mIL-6-V2 LEEFLKVTLRS SEQ ID NO: 144 mIL-17-V1 NAEGKLDHHMNSVL SEQ ID NO: 143

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8. Inmunización de conejos con vacunas basadas en AAV

8.1. Producción y purificación de vacunas basadas en AAV2 para experimentos de inmunización

Para la producción de partículas de AAV se co-transfectaron células HEK 293-T con el plásmido de vector pUCAV2 que contiene el epítopo subclonado (en I-453 y/o I-587) y el plásmido colaborador pUCAdV como se ha descrito anteriormente. Para la producción a gran escala se sembraron 30 -60 placas de cultivo celular de 015 cm con 7,5x106 células 293-T y se cultivaron a 37 ºC, 5 % de CO2 en una atmósfera humidificada. La co-transfección de las células con el plásmido de vector pUCAV2 que contiene el epítopo (en I-453 o I-587) y pUCAdV se realizó como se ha descrito anteriormente. 72 h después de la transfección, se recogieron las células 293-T y el medio y se centrifugaron a 3000 g a 4 ºC durante 15 min. El sedimento de células se resuspendió en 15 -30 ml de tampón de lisis (HEPES 50 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 2,5 mM; pH 6,8) y se sometió a tres rondas de ciclos de congelación y descongelación. El sobrenadante de cultivo celular aclarado se concentró por TFF (filtración de flujo tangencial) usando el sistema SARTOFLOW® Slice 200 Benchtop Cross-flow usando un casete SARTOCON® Slice 200 (membrana Hydrosart). El concentrado de TFF del sobrenadante de cultivo celular (aproximadamente 35 ml) se reunió con el lisado en bruto aclarado y posteriormente se trató con 1667 U/ml de benzonasa (MERCK) a 37 ºC durante 2 h -4 h. Después del tratamiento con benzonasa, el conjunto de lisado en bruto y el concentrado de TFF se centrifugó a 3600 g durante 5 min a 4 ºC. El sobrenadante que contenía AAV se separó mediante una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se realizó SEC usando una columna XK50/20 rellena con perlas de resina SUPERDEX 200® y tampón de electroforesis de SEC (HEPES 50 mM, NaCl 400 mM, MgCl2 2,5 mM; pH 6,8). Las fracciones de SEC se analizaron por ELISA de AAV2. Se reunieron las fracciones que contenían AAV y se sometieron a centrifugación en gradiente de iodixanol. Se dispusieron en capas soluciones de iodixanol de diferentes concentraciones debajo de la fracción de SEC que contenía el conjunto de virus en tubos de centrifugación QUICKSEAL® (25 x 89 mm; BECKMAN). Mediante esto se creó un gradiente de iodixanol compuesto de 4,0 ml de 60 % en el fondo, 5,0 ml 40 %, 4,0 ml 25 % y 5,5 ml 15 % de iodixanol con la solución de virus encima. El gradiente se centrifugó usando un rotor de ángulo fijo (rotor Ti 70.1, BECKMAN) a 65000 rpm durante 1 h a 18 ºC. La fase de 40 % que contenía las partículas de AAV se extrajo entonces con una cánula perforando el tubo debajo de la fase del 40 % y dejando que la solución goteara en tubos de recogida. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,5 ml hasta que se llegó a la fase del 25 %. El título de cápsidas de AAV de las fracciones se determinó usando un ELISA comercialmente disponible (ELISA de valoración de AAV, PROGEN). La pureza de las fracciones que contenían AAV se determinó por SDS-PAGE y posterior tinción con Coomassie coloidal. Se reunieron fracciones con alta pureza de partículas de AAV y el título de cápsidas del conjunto final se determinó por ELISA de valoración de AAV2.

8.2. Rotura de la auto-tolerancia por vacunas basadas en AAV

Se generó un panel de vacunas basadas en AAV que llevan epítopos derivados de CETP de conejo como se ha descrito anteriormente. Se compararon las vacunas de CETP basadas en AAV con las vacunas de péptido correspondientes que contenían el mismo epítopo acoplado a LPH (hemocianina de Limulus polyphemus) como proteína transportadora. Los péptidos se sintetizaron químicamente con un resto de cisteína del extremo C o N que se usó para acoplar los péptidos a LPH. La síntesis y acoplamiento de los péptidos se realizó por BIOGENES (Berlín, Alemania).

Las vacunas descritas en la Tabla 16 se usaron para la inmunización de conejos:

Tabla 16: Vacunas usadas para la inmunización de conejos

Nombre de la vacuna: Vehículo de vacuna Sitio de inserción Epítopo Dosis (µg)

V-TP11: AAV2 I-587 SLTGDEFKKVLET SEQ ID NO: 97 10,9

AAV-TP12: AAV2 I-587 REAVAYRFEED SEQ ID NO: 98 14,1

AAV-TP13: AAV2 I-587 INPEIITLDG SEQ ID NO: 99 13,3

AAV-TP18: AAV2 I-587 DISVTGAPVITATYL SEQ ID NO: 100 7,2

LPH-TP11: LPH N/A CSLTGDEFKKVLET SEQ ID NO: 155 véase el texto

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Tabla 18: Título medio de anti-IgE de inmunizaciones con vacunas de IgE basadas en AAV frente a LPH

Vacuna: Título anti-IgE 1º Refuerzo Título anti-IgE 2º Refuerzo Título anti-IgE 3º Refuerzo

AAV-Kricek: 4750 20150 25460

AAV-Kricek*: n.d. 7950 27000

AAV-3DEpi3*: 5000 18200 30140

AAV-Bind2: 575 3075 7750

AAV-Flex: 17200 40300 38100

LPH-Kricek: n.d. 1300 400

LPH-3DEpi3: 705 1400 1600

LPH-Flex: 15000 14000 23250

LPH-Bind2: 0 0 0

* se usaron vacunas basadas en AAV para la inmunización de sensibilización y la 1ª de refuerzo; se realizaron la 2ª y 3ª inmunización de refuerzo con el péptido acoplado a LPH correspondiente

De forma interesante, la vacunación de conejos con LPH-Kricek, LPH-3DEpi3 o LPH-Bind2 dejó de inducir niveles significativos de anticuerpos contra IgE humana. Las propiedades inmunogénicas de las vacunas basadas en péptido se reflejan por los altos títulos de anticuerpos específicos de péptido inducidos por las vacunas de péptido (datos no mostrados). Sin embargo, estos anticuerpos no muestran reacción o solo una débil reacción con IgE humana nativa. Solo LPH-Flex indujo títulos razonablemente altos de anticuerpos específicos para IgE humana nativa. Esto es en clara contraposición a los resultados obtenidos con las vacunas basadas en AAV correspondientes como AAV-Kricek (Figura 14) que generan títulos de anticuerpos específicos de IgE humana considerablemente más altos en comparación con las construcciones de fusión de LPH correspondientes. Esto indica que la conformación fija de los epítopos de IgE correspondientes en la cápsida de AAV2 se parece a la estructura de la secuencia dentro de la molécula de IgE de una mejor forma que los péptidos acoplados a LPH. Debe observarse que la generación de anticuerpos anti-IgE humana en este modelo animal con conejos no vence la tolerancia del sistema inmunitario a auto-antígenos.

Bibliografía

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Claims

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