JP2022520875A - Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を有する対象を治療するために、異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を網膜、例えば網膜のＲＰＥ細胞に送達するウイルスベクターが本明細書において提供される。

Description

関連出願の相互参照及び配列表の組み込み
本出願は、２０１９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，２５７号明細書の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年２月２２日に作成された、１５６，１３３バイト（オペレーティングシステムＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＰＡＴ０５８４６８－ＷＯ－ＰＣＴ ＳＱＬ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症（ＢＣＤ）は、網膜に多数の小さい黄色又は白色の結晶様の脂質沈着物が蓄積し、それに続いて網脈絡膜萎縮及び進行性の視力低下が起こる常染色体劣性疾患である。ＢＣＤの患者は、一般的に、１０代又は２０代で視力の問題を認識し始める。患者は、多くの場合、視力の低下に加えて、夜盲症を経験する。患者は、通常、視野、殆どの場合に周辺視野も失う。色覚も損なわれることがある。

視力の問題は、眼ごとに異なる割合で悪化することがあり、症状の重症度及び進行は、同じ家族内であっても、罹患した患者間で大きく異なる。しかし、ＢＣＤの殆どの患者は、４０歳又は５０歳までに法的に盲目になる。罹患した患者の大部分は、通常、視野の中心にある程度の視力を保持するが、一般的にはぼやけており、処方レンズで矯正することができない。

ＢＣＤは、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる。ヒトの４番染色体の長腕に位置する遺伝子は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２をコードする。シトクロムＰ４５０ファミリーの酵素のメンバーとして、ω－ヒドロキシラーゼは、脂質代謝、具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの多価不飽和脂肪酸の酸化に関与する。少なくとも８０の異なるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異がＢＣＤの患者で同定されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２４：７００－７１１，２０１８）。ＢＣＤを引き起こすＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異は、酵素の機能を低下又は消失させ、脂質分解に影響を及ぼすと考えられている。しかし、それらがどのようにＢＣＤの特異的な徴候及び症状につながるかは、わかっていない。

ＢＣＤは、世界で約６５，０００人が罹患していると推定されている（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ４０９：１８１－１８６，２０１１；及びＭａｔａｆｔｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４：４１６－４２６，２００４）。これは、東アジア系の人々、特に中国及び日本のバックグラウンドを有する人々によくみられる。現在、ＢＣＤに利用可能な治療法はない。

本発明は、一般に、組換えウイルスベクターと、組換えウイルスベクターを使用して、網膜疾患及び失明（例えば、ＢＣＤ）に罹患している対象の網膜（例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）中にタンパク質を発現させる方法とに関する。

本発明は、一態様において、網膜（例えば、ヒト網膜）に異種遺伝子を送達することができるウイルスベクターに関する。本発明は、網膜（例えば、網膜のＲＰＥ細胞）に異種遺伝子を誘導し得るウイルスベクターにも関する。本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）であるウイルスベクターにさらに関する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスベクターは、当技術分野で知られるＡＡＶ血清型、例えば、限定はされないが、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２などの中から選択され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ８血清型である。特定の他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ９血清型である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ２血清型である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ５血清型である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、改変野生型ＡＡＶカプシド配列に由来する新規合成ＡＡＶ血清型である。

一態様では、５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列；及び
（ｖ）３’ＩＴＲ
を含むベクターゲノムを含むウイルスベクターが提供される。

一実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）イントロン；
（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉ）３’ＩＴＲ
を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）調節エレメント；
（ｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉ）３’ＩＴＲ
を含む。

一実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）イントロン；
（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｖ）調節エレメント；
（ｖｉ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉｉ）３’ＩＴＲ
を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、約４．１ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下の長さを含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、約５ｋｂ以下の長さを含む。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ポリＡシグナル配列と３’ＩＴＲとの間に位置するスタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００又は２，５００～３，０００ヌクレオチドの長さである。

一実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、プロモーターは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）特異的プロモーター、例えば、ＰｒｏＡ１８プロモーター、又はＰｒｏＢ４プロモーターであって、例えば、配列番号２、又は配列番号３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ＲＰＥ細胞においてＣＹＰ４Ｖ２の発現を優先的に促進する。

したがって、本発明は、配列番号２の核酸配列、又は前記配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、或いはそのような核酸配列からなる単離された核酸分子を提供する。単離された配列番号２の核酸は、ヒト又はＮＨＰの網膜細胞、例えば、ヒト又はＮＨＰのＲＰＥ細胞において、配列番号２の核酸配列に作動可能に連結された遺伝子を発現させる。

したがって、本発明は、配列番号３の核酸配列又は前記配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、又はそのような核酸配列からなる単離された核酸分子を提供する。配列番号３の単離された核酸は、ヒト又はＮＨＰ網膜細胞、例えばヒト又はＮＨＰ ＲＰＥ細胞において、配列番号３の核酸配列に作動可能に連結された遺伝子を発現させる。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７又は配列番号４９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン又はシミアンウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）ポリＡヌクレオチド配列を含み、例えば配列番号１８又は配列番号１９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２２に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、イントロンは、ヒト成長ホルモン、シミアンウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）又はヒトベータグロビンイントロン配列を含み、例えば配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、調節エレメントは、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）又はウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）配列を含み、例えば配列番号１６又は配列番号１７に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列のすぐ上流に位置するコザック配列を含み、例えば、そのコザック配列は、配列番号１２、配列番号５１、配列番号５２又は配列番号５３のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２。

一実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
ｉ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２。

一実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２。

一実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’方向に、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
ｉ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８、９、２又は５カプシドを含む。一実施形態では、ＡＡＶ８カプシドは、それぞれ配列番号２４、２５及び２６に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８カプシドは、配列番号２３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、配列番号２７に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＡＡＶ２カプシドは、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２カプシドは、配列番号３１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、それぞれ配列番号３６、３７及び３８に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、配列番号３５に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＢＣＤを有する対象の治療に使用するためのものであり、例えばＢＣＤを有する対象の視力の改善に使用するためのものである。

網膜細胞において異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を発現させる方法であって、網膜細胞を本明細書に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法も本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である。

別の態様では、Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症（ＢＣＤ）を有する対象を治療する方法であって、本明細書に記載のウイルスベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、例えば、その組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、方法が提供される。

さらに別の態様では、ＢＣＤを有する対象の視力を改善するか、視覚機能若しくは機能的視覚を改善するか、又は視覚機能若しくは機能的視覚の低下を抑制する方法であって、本明細書に記載のウイルスベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、例えば、その組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、方法が提供される。

一態様では、遺伝子カセットを含む核酸であって、その遺伝子カセットは５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖ）３’ＩＴＲ
を含む核酸が提供される。

一実施形態では、遺伝子カセットを含む核酸は、プラスミドである。

いくつかの実施形態では、遺伝子カセットは、５’から３’方向に、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。

用語「カプシド」は、ウイルス又はウイルスベクターのタンパク質コートを指す。用語「ＡＡＶカプシド」は、合計６０のサブユニットから構成されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のタンパク質コートを指し；各サブユニットは、アミノ酸配列であり、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ＶＰ２又はＶＰ３であり得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ ＫＩ（２００１）Ｃｈａｐｔｅｒ ６９，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。

用語「遺伝子カセット」は、例えば、制限酵素認識部位の１つ以上のセット間に（制限酵素認識部位間にまたがっている必要はない）１つ以上の目的遺伝子又は目的コード配列を保有し、且つそれを発現し得る、ＤＮＡの操作可能な断片を指す。遺伝子カセット又はその一部は、制限酵素を用いて断片を切り出し、これを新しいコンテクスト、例えば新しいプラスミド骨格に連結することにより、（多くの場合にプラスミドベクター中の）１つのＤＮＡ配列から別のＤＮＡ配列に移すことができる。

用語「異種遺伝子」又は「異種ヌクレオチド配列」は、一般に、ウイルス中に天然に存在しない遺伝子又はヌクレオチド配列を指す。代わりに、異種遺伝子又は異種ヌクレオチド配列は、（例えば、ウイルス中で天然に結合していないプロモーターと結合することによって）天然に存在しない環境に置かれたウイルス配列を指し得る。

「末端逆位反復」又は「ＩＴＲ」という用語は、Ｔ形回文構造を形成し得るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又は組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）に存在するヌクレオチド配列のストレッチを指し、野生型ＡＡＶの溶解潜伏ライフサイクルを完了するために必要とされる（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ ＫＩ（２００１）Ｃｈａｐｔｅｒ ６９，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。ｒＡＡＶでは、これらの配列は、ゲノムパッケージング及び第二鎖合成において機能的役割を果たす。

用語「作動可能に連結された」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。一般的には、この用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写可能な配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写可能な配列に隣接している。すなわち、それらは、シス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、転写を増強するコード配列に物理的に隣接しているか又はごく近接して位置している必要はない。

本明細書で使用される場合、用語「配列同一性パーセント」は、任意の所与の問い合わせ配列と対象配列との間の同一性の程度を指す。対象配列は、通常、問い合わせ配列の長さの約８０パーセント～２５０パーセントの長さ、例えば問い合わせ配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５又は１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０パーセントの長さを有する。２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を目的として配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、また比較目的のために非相同配列を無視することができる）。次いで、対応するヌクレオチド位置又はアミノ酸位置におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸残基によって占められている場合、分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド又はアミノ酸「同一性」はヌクレオチド又はアミノ酸「相同性」と均等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

別の実施形態では、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、両方のアミノ酸配列における対応する位置におけるアミノ酸の同じファミリー（例えば、正電荷、負電荷、極性及び非荷電性、疎水性）内のアミノ酸残基の保存の関数として評価することができる（例えば、両方の配列の特定の位置におけるバリン残基に代わるアラニン残基の存在は、高レベルの保存を示すが、両方の配列の特定の位置におけるアスパラギン酸残基に代わるアルギニン残基の存在は、低レベルの保存を示す）。本発明の目的のために、２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスをギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４及びフレームシフトギャップペナルティー５で使用して達成することができる。

用語「プロモーター」とは、作動可能に連結された遺伝子又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を調節する配列を指す。プロモーターは、転写を指示するのに十分な配列並びに効率的な転写に必要なＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子の認識部位を提供し、細胞特異的発現を指示することができる。転写を指示するのに十分な配列に加えて、本発明のプロモーター配列は、転写の調節に関与する他の調節エレメントの配列（例えば、エンハンサー、最小プロモーター、Ｋｏｚａｋ配列及びイントロン）も含み得る。当技術分野で知られており、本明細書に記載のウイルスベクターに有用なプロモーターの例としては、ＰｒｏＡ１８プロモーター（例えば、配列番号２）及びＰｒｏＢ４プロモーター（例えば、配列番号３）などのＲＰＥ特異性プロモーターが挙げられる。さらに、既知の調節エレメントを混合しマッチングさせることによって機能的プロモーターを作製するための標準的な技術が当技術分野で知られている。「トランケート型プロモーター」も、プロモーター断片から、又は既知の調節エレメントの断片を混合し、マッチングすることによって生成することができる。

用語「ＣＹＰ４Ｖ２」は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２を指す。ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子は、第４染色体上に見出され、例えば配列番号１３に示すようなヌクレオチドコード配列を有する。一実施形態では、ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のコドン最適化配列を使用することができる。このようなコドン最適化ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の一例は、配列番号１４に示すようなヌクレオチドコード配列を有する。「ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物」は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。一実施形態では、例示的なヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物は、配列番号１５に示すようなアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１５のアミノ酸配列又はその機能的改変体若しくは断片をコードする。他の種に由来するＣＹＰ４Ｖ２コード配列及びＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物の例は、表２（例えば、配列番号３９～５０）に見出すことができる。「ＣＹＰ４Ｖ２コード配列」、又は「ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ＣＤＳ」、又は「ＣＹＰ４Ｖ２ ＣＤＳ」という用語は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を指す。当業者は、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列がＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物又はその機能的改変体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含み得ることを理解するであろう。一実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１５、４０、４２、４４、４６、４８、５０のアミノ酸配列又はその機能的改変体若しくは断片をコードする。ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、介在調節エレメント（例えば、イントロン、エンハンサー又は他の非コード配列）を含んでも含まなくてもよい。

用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物には、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類などの全ての脊椎動物（例えば、哺乳類及び非哺乳類）が含まれる。注記する場合を除き、用語「患者」又は「対象」は、本明細書では互換的に使用される。

疾患又は障害（例えば、ＢＣＤ）を「治療すること」又はその「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、又は停止させるか、又は減少させることにより、疾患又は障害を改善させることを指す。「治療すること」又は「治療」は、対象によって認識され得ないものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを軽減又は改善することも指し得る。「治療すること」又は「治療」は、身体的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）又はその両方で疾患又は障害を調節することも指し得る。さらに具体的には、ＢＣＤの「治療」は、ＢＣＤを有する対象に視覚機能、機能的視覚、網膜組織及び／又は生活の質の改善又は維持をもたらす作用を意味する。本明細書で使用される場合、「治療」は、ＢＣＤの症状の１つ以上が改善されるか、又はさもなければ有益に改変される方法を意味し得る。本明細書で使用される場合、ＢＣＤの症状の改善は、永続的であるか又は一時的であるかを問わず、持続的であるか又は一過性であるかを問わず、本発明の組成物及び方法による治療に起因又は関連し得る軽減を指す。本明細書で使用される「予防すること又は「予防」は、疾患又は障害の発症、又は進展、又は進行を予防するか又は遅延させることを指す。「予防」は、ＢＣＤに関連する場合、以下に記載するように、視覚機能、機能的視覚、網膜組織、生活の質及び／又はＢＣＤ疾患パラメータの悪化を、ＢＣＤを有し、前記悪化の危険性がある患者において予防するか又は遅延させる作用を意味する。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、当技術分野において知られており、本明細書において以下に記載する。

「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」又は「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、遺伝子送達ビヒクルとして機能し、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）カプシド内に包み込まれた組換えウイルスゲノムを含む非野生型組換えウイルス粒子（例えば、パルボウイルスなど）を指すものとする。特定のタイプのウイルスベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」であり得る。ウイルスベクター内に包み込まれた組換えウイルスゲノムは、本明細書では「ベクターゲノム」とも呼ばれる。

後眼杯のフラットマウントにおけるＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ発現を示す顕微鏡写真である。眼杯をＰＦＡ固定眼から単離し、花弁状に切断し、ｅＧＦＰ蛍光を分析した。 図２Ａ及び図２Ｂは、ｄｄＰＣＲにより測定したＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰのｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。後眼杯（図２Ａ）及び神経網膜（図２Ｂ）の両方のＴＭ０７３に対する発現の倍率変化を示す。各試料について、ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ発現をＲａｂ７対照発現に対して正規化した。

本開示は、選択されたプロモーター、ＡＡＶゲノム及びカプシド血清型の組合せを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）からのＣＹＰ４Ｖ２の発現が、ＢＣＤ、例えばＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に変異（表１）を有する対象に対して強力且つ有効な治療を提供するという発見に部分的に基づいている。したがって、本開示は、網膜へＣＹＰ４Ｖ２コード配列の発現を指示する組換えウイルスベクター、ウイルスベクター組成物、ウイルスベクターの生成に有用なプラスミド、網膜へＣＹＰ４Ｖ２コード配列を送達する方法、網膜のＲＰＥ細胞においてＣＹＰ４Ｖ２コード配列を発現する方法及びこのようなウイルスベクターの使用方法を提供する。

特に指示がない限り、ウイルス遺伝子カセットを保有する組換えプラスミド、パルボウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列を発現するパッケージングプラスミド並びに一過性且つ安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞を用いて組換えパルボウイルス及びｒＡＡＶベクターを構築するために、当業者に知られた標準的な方法を用いることができる。このような技術は、当業者に知られている。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２００７））。

ウイルスベクターが特定のタンパク質又は活性を発現する場合、関連する遺伝子は、天然に見出されるか、又は本明細書に開示される対応する遺伝子と同一である必要はない。タンパク質が機能的である限り、それは、本発明の一態様に従って使用され得る。当業者であれば、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列が機能的ω－ヒドロキシラーゼをコードするか否かを、ヒドロキシラーゼ活性を検出することによって容易に決定し得るであろう。簡潔には、目的タンパク質を脂肪酸及び他の必要な因子と混合し、インキュベートして、ヒドロキシル化反応を生じさせる。その後、ヒドロキシル化脂肪酸を質量分析によって測定することができる。例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３７：２１１９－２１２２，２００９に記載されているような機能的アッセイを参照されたい。しかしながら、天然タンパク質との非常に高い配列同一性が一般に好ましい。例えば、大きい欠失（例えば、約５０を超えるアミノ酸）は、本発明の特定の実施形態によれば、一般に回避すべきである。したがって、当業者であれば、本ウイルスベクター配列が、本明細書に記載される配列と異なり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ウイルスヌクレオチド又はアミノ酸配列は、本明細書中に提供される配列に対して約８０％以上の同一性、例えば本明細書中に提供される配列に対して約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有する。

いくつかの実施形態では、配列変化は、保存的置換である。このような変化としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの疎水性アミノ酸の他のものへの置換；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換及びその逆；グルタミン（Ｑ）のアスパラギン（Ｎ）への置換及びその逆；並びにセリン（Ｓ）のトレオニン（Ｔ）への置換及びその逆が挙げられる。他の置換も、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境及びその役割に応じて保存的であると考えることができる。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、アラニン（Ａ）及びバリン（Ｖ）と同様に、多くの場合に交換可能であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシン及びイソロイシンと交換され得る場合がよくあり、バリンともときに交換され得る。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の大きい特徴がその電荷であり、これらの２つのアミノ酸残基のｐＫの相違が重要ではない位置で多くの場合に交換可能である。さらに他の変化は、特定の環境では「保存的」であると考えることができる（例えば、米国特許出願公開第２０１１０２０１０５２号明細書の表ＩＩＩ；ｐａｇｅｓ １３－１５“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”２ｎｄ Ｅｄ．Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９，１９９２；Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１１８８２－１１８８６，１９９５を参照されたい）。

ウイルスベクター
本発明は、網膜（例えば、ヒト網膜）への異種遺伝子の発現を指示するウイルスベクターに関する。本発明の特定の態様では、発現は、網膜のＲＰＥ細胞に対して優先的に指示される。当技術分野で知られる様々なウイルスベクター（例えば、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス及び組換えバキュロウイルス）は、本発明で使用するために当業者により適合され得る。

特に、本発明のウイルスベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターであり得ると考えられる。ＡＡＶは、効率的な複製を促進するためにヘルパーウイルスを必要とする小さい一本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ ＫＩ（２００１）Ｃｈａｐｔｅｒ ６９，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。ウイルスベクターは、ベクターゲノムとカプシドタンパク質とを含む。ウイルスベクターカプシドは、今日同定されているヒト及び非ヒトＡＡＶ血清型並びに依然として同定されていないＡＡＶ血清型を含む、当技術分野で知られるＡＡＶ血清型のいずれかから提供され得る（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：２９９－３１０，２００５；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：１３９９－１４０６，２００８；米国特許第９，１９３，９５６号明細書；同第９；１８６；４１９号明細書；同第８，６３２，７６４号明細書；同第８，６６３，６２４号明細書；同第８，９２７，５１４号明細書；同第８，６２８，９６６号明細書；同第８，２６３，３９６号明細書；同第８，７３４，８０９号明細書；同第８，８８９，６４１号明細書；同第８，６３２，７６４号明細書；同第８，６９１，９４８号明細書；同第８，２９９，２９５号明細書；同第８，８０２，４４０号明細書；同第８，４４５，２６７号明細書；同第８，９０６，３０７号明細書；同第８，５７４，５８３号明細書；同第８，０６７，０１５号明細書；同第７，５８８，７７２号明細書；同第７，８６７，４８４号明細書；同第８，１６３，５４３号明細書；同第８，２８３，１５１号明細書；同第８，９９９，６７８号明細書；同第７，８９２，８０９号明細書；同第７，９０６，１１１号明細書；同第７，２５９，１５１号明細書；同第７，６２９，３２２号明細書；同第７，２２０，５７７号明細書；同第８，８０２，０８０号明細書；同第７，１９８，９５１号明細書；同第８，３１８，４８０号明細書；同第８，９６２，３３２号明細書；同第７，７９０，４４９号明細書；同第７，２８２，１９９号明細書；同第８，９０６，６７５号明細書；同第８，５２４，４４６号明細書；同第７，７１２，８９３号明細書；同第６，４９１，９０７号明細書；同第８，６３７，２５５号明細書；同第７，１８６，５２２号明細書；同第７，１０５，３４５号明細書；同第６，７５９，２３７号明細書；同第６，９８４，５１７号明細書；同第６，９６２，８１５号明細書；同第７，７４９，４９２号明細書；同第７，２５９，１５１号明細書；及び同第６，１５６，３０３号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０２９５６１４号明細書；同第２０１５／００６５５６２号明細書；同第２０１４／０３６４３３８号明細書；同第２０１３／０３２３２２６号明細書；同第２０１４／０３５９７９９号明細書；同第２０１３／００５９７３２号明細書；同第２０１４／００３７５８５号明細書；同第２０１４／００５６８５４号明細書；同第２０１３／０２９６４０９号明細書；同第２０１４／０３３５０５４号明細書；同第２０１３／０１９５８０１号明細書；同第２０１２／００７０８９９号明細書；同第２０１１／０２７５５２９号明細書；同第２０１１／０１７１２６２号明細書；同第２００９／０２１５８７９号明細書；同第２０１０／０２９７１７７号明細書；同第２０１０／０２０３０８３号明細書；同第２００９／０３１７４１７号明細書；同第２００９／０２０２４９０号明細書；同第２０１２／０２２０４９２号明細書；同第２００６／０２９２１１７号明細書；及び同第２００４／０００２１５９号明細書；欧州特許出願公開第２６９２７３１Ａｌ号明細書；欧州特許第２３８３３４６Ｂｌ号明細書；同第２３５９８６５Ｂｌ号明細書；同第２３５９８６６Ｂｌ号明細書；同第２３５９８６７Ｂｌ号明細書；同第ａｎｄ２３５７０１０Ｂｌ号明細書；同第１７９１８５８Ｂｌ号明細書；同第１６６８１４３Ｂｌ号明細書；同第１６６０６７８Ｂｌ号明細書；同第１６６４３１４Ｂｌ号明細書；同第１４９６９４４Ｂｌ号明細書；同第１４５６３８３Ｂｌ号明細書；同第２３４１０６８Ｂｌ号明細書；同第２３３８９００Ｂｌ号明細書；同第１４５６４１９Ｂｌ号明細書；同第１３１０５７１Ｂｌ号明細書；同第１４５６３８３Ｂｌ号明細書；同第１６３３７７２Ｂｌ号明細書；及び同第１１３５４６８Ｂｌ号明細書；並びに国際公開第２０１４／１２４２８２号パンフレット；同第２０１３／１７００７８号パンフレット；同第２０１４／１６００９２号パンフレット；同第２０１４／１０３９５７号パンフレット；同第２０１４／０５２７８９号パンフレット；同第２０１３／１７４７６０号パンフレット；同第２０１３／１２３５０３号パンフレット；同第２０１１／０３８１８７号パンフレット；同第２００８／１２４０１５号パンフレット；及び同第２００３／０５４１９７号パンフレットを参照されたい）。

本明細書の開示の目的のために、ＡＡＶは、ウイルス自体及びその誘導体を指す。別段の指示がない限り、この用語は、全てのサブタイプ又は血清型並びに複製能を有する形態及び組換え形態の両方を指す。用語「ＡＡＶ」には、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３Ａ型（ＡＡＶ３Ａ）、ＡＡＶ３Ｂ型（ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類の哺乳類に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳類に感染するＡＡＶを指すなどである。

ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列並びに天然の末端逆位反復（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において知られている。このような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて見出し得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３．１（ＡＡＶ２）、Ｊ０１９０１．１（ＡＡＶ２）、Ｕ４８７０４．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＮＣ＿００１７２９．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ．００１８２９．１（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡ５）、ＡＦ０８５７１６．１（ＡＡＶ－５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５１．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２．１（ＡＡＶ８）ＮＣ００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９．１（ＡＡＶ９）、ＡＡＴ４６３３７（ＡＡＶ１０）及びＡＡＯ８８２０８（ＡＡＶｒｈ１０）を参照されたい。これらの開示は、ＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５－５６４，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：６８２３－６８３３，１９９８；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：１３０９－１３１９，１９９９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：９３９－９４７，１９９９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３９９４－４００３，１９９９；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８－２１７，１９９６；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ５８：９２１－９３６，１９８６；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１８５４－１１８５９，２００２；国際公開第００／２８０６１号パンフレット、同第９９／６１６０１号パンフレット、同第９８／１１２４４号パンフレット；及び米国特許第６，１５６，３０３号明細書を参照されたい。

ウイルスカプシドを他のベクター成分と混合し、マッチングさせて、ハイブリッドシュードタイプウイルスベクターを形成し得、例えば、ウイルスベクターのＩＴＲ及びカプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。一態様では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型由来であり得る一方、カプシドは、例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２又はＡＡＶ５血清型由来である。さらに、当業者は、ベクターカプシドがモザイクカプシド（例えば、異なる血清型由来のカプシドタンパク質の混合物から構成されるカプシド）又はキメラカプシド（例えば、マーカーを生成するため及び／又は組織親和性を変化させるための外来又は関係のないタンパク質配列を含有するカプシドタンパク質）であり得ることを認識するであろう。本発明のウイルスベクターは、ＡＡＶ８カプシド（例えば、配列番号２３によってコードされる配列番号２４、２５及び２６）を含み得ることが考えられる。また、本発明のウイルスベクターは、ＡＡＶ９カプシド（例えば、配列番号２７によってコードされる配列番号２８、２９及び３０）を含み得ることが考えられる。また、本発明のウイルスベクターは、ＡＡＶ２カプシド（例えば、配列番号３１によってコードされる配列番号３２、３３及び３４）を含み得ることが考えられる。さらに、本発明は、ＡＡＶ５カプシド（例えば、配列番号３５によってコードされる配列番号３６、３７及び３８）を含み得ることも考えられる。

一態様では、ＡＡＶは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＶＶ）である。

さらに特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、約４．１ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、例えば約４．２ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．３ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．４ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．５ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．６ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．７ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．８ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．８ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．７ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．６ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．５ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．４ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．３ｋｂ以下、約４．１ｋｂ以上且つ約４．２ｋｂ以下、約４．２ｋｂ以上且つ約４．８ｋｂ以下、約４．３ｋｂ以上且つ約４．７ｋｂ以下、約４．４ｋｂ以上且つ約４．６ｋｂ以下、約４．１ｋｂ、約４．２ｋｂ、約４．３ｋｂ、約４．４ｋｂ、約４．５ｋｂ、約４．６ｋｂ、約４．７ｋｂ、約４．８ｋｂ又は約４．９ｋｂの長さを有する。

特定の態様では、本発明は、５’から３’の方向に、（ｉ）ＰｒｏＡ１８プロモーター及びＰｒｏＢ４プロモーター、並びにその活性断片から選択されるプロモーターと、（ｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２）コード配列を含む組換えヌクレオチド配列を含むベクターゲノム、ベクターゲノム、例えば、一本鎖ベクターゲノムに関連している。

特定の態様では、本発明は、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、（ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、及び（ｖ）３’ＩＴＲを含むベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムに関する。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）イントロン、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、（ｖ）ポリＡシグナル配列、及び（ｖｉ）３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、（ｉｖ）調節エレメント、（ｖ）ポリＡシグナル配列、及び（ｖｉ）３’ＩＴＲを含む。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）イントロン、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列、（ｖ）調節エレメント、（ｖｉ）ポリＡシグナル配列、及び（ｖｉｉ）３’ＩＴＲを含む。ベクターのエレメントは、表２に記載の配列に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有する配列を有し得る。

いくつかの実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、それぞれ約１３０～約１４５ヌクレオチドを含む。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要であり、これらの配列の対称の特徴は、配列にヘアピンを形成する能力を与え、これは、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成を可能にする、いわゆる自己プライミングに寄与する。ＡＡＶ血清型２の５’及び３’ＩＴＲ（例えば、それぞれ配列番号１及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列）が使用され得ることが考えられる。他の態様では、他の好適な血清型由来のＩＴＲは、本明細書に記載されるように、当技術分野で知られる任意のＡＡＶ血清型の中から選択され得、例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ５由来であり得る。これらのＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、既知の又は依然として同定されていないＡＡＶ血清型から、当業者が利用可能な技術を使用して容易に単離され得、例えば、ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）において利用可能であるような公開された配列を参考として、合成又は他の好適な手段によって得ることができる。代わりに、このようなＡＡＶ成分は、学術的、商業的又は公共の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からも単離又は入手することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの５’又は３’ＩＴＲ領域は、例えば、末端分解部位（ｔｒｓ）を欠失／変異させることにより、ΔＩＴＲを形成するように変異され、得られるＡＡＶゲノムは、二量体逆位反復ＤＮＡ分子を形成することによって自己相補的（ｓｃ）になる。一実施形態では、ΔＩＴＲ配列は、配列番号５４を含む。さらなるΔＩＴＲ配列は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３，１０：２１０５－２１１１；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３，１０：２１１２－２１１８；及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１，８：１２４８－１２５４（これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、当技術分野で知られている。

特定の実施形態では、ＲＰＥ特異的プロモーターは網膜のＲＰＥ細胞、例えば、ヒトＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２の発現を優先的に標的化するために使用され得る。ＲＰＥ特異的プロモーターの例としては、ＰｒｏＡ１８プロモーター又はＰｒｏＢ４プロモーターが挙げられる。例えば、ＰｒｏＡ１８プロモーターは、配列番号２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有することができ、ＰｒｏＢ４プロモーターは、配列番号３に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有することができる。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、イントロン配列を含み得る。例えば、イントロンは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）イントロン、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）イントロン又はヒトベータグロビンイントロン、例えばそれぞれ配列番号９、１０又は１１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。

一実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列を含む。ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。特定の一実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列を含む。

さらに、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、適切な転写の開始、終結及びエンハンサー配列、スプライシングシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列；タンパク質の安定性を増強する配列；並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。多数の調節配列が当技術分野で知られており、利用することができる。本発明の調節エレメント配列としては、表２に記載されるもの、例えばＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）調節エレメント（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられ、これらは、それぞれ配列番号１６及び１７に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。

一実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、ポリＡシグナル配列を含む。本発明のポリＡシグナル配列としては、表２に記載されるもの、例えばウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル配列及びシミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）ポリＡシグナル配列が挙げられ、これらは、それぞれ配列番号１８及び１９に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。特定の一実施形態では、ベクターゲノムは、ｂＧＨポリＡシグナル配列を含み、これは、配列番号１８に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。

したがって、一態様では、本発明は、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｉｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、及び（ｖ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含むベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムに関連している。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）イントロン（例えば、配列番号９、１０又は１１）、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、及び（ｖｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｉｖ）調節エレメント（例えば、配列番号１６又は１７）、（ｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、及び（ｖｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）イントロン（例えば、配列番号９、１０又は１１）、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｖ）調節エレメント（例えば、配列番号１５又は１７）、（ｖｉ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、及び（ｖｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、スタッファーポリヌクレオチド配列をさらに含み得る。スタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクターの機能又は活性を妨げないように、ベクター配列の任意の所望の位置に位置させることができる。一態様では、スタッファーポリヌクレオチド配列は、ポリＡシグナル配列と３’ＩＴＲとの間に位置する。一般的に、スタッファーポリヌクレオチド配列は、不活性又は無害であり、機能も活性も有さない。種々の特定の態様では、スタッファーポリヌクレオチド配列は、細菌ポリヌクレオチド配列ではなく；スタッファーポリヌクレオチド配列は、タンパク質又はペプチドをコードする配列ではなく；またスタッファーポリヌクレオチド配列は、ＩＴＲ配列、プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列及びポリＡシグナル配列と異なる。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、配列番号２０又は２１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。種々のさらなる態様では、スタッファーポリヌクレオチド配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００又は２，５００～３，０００ヌクレオチドの長さである。

したがって、特定の実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｉｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、（ｖ）スタッファー配列（例えば、配列番号２０又は２１）、及び（ｖｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）イントロン（例えば、配列番号９、１０又は１１）、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、（ｖｉ）スタッファー配列（例えば、配列番号２０又は２１）、及び（ｖｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｉｖ）調節エレメント（例えば、配列番号１６又は１７）、（ｖ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、（ｖｉ）スタッファー配列（例えば、配列番号２０又は２１）、及び（ｖｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。本発明の特定の態様では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、（ｉ）５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１）、（ｉｉ）プロモーター（例えば、配列番号２又は３）、（ｉｉｉ）イントロン（例えば、配列番号９、１０又は１１）、（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９）、（ｖ）調節エレメント（例えば、配列番号１６又は１７）、（ｖｉ）ポリＡシグナル配列（例えば、配列番号１８又は１９）、（ｖｉｉ）スタッファー配列（例えば、配列番号２０又は２１）、及び（ｖｉｉｉ）３’ＩＴＲ（例えば、配列番号２２）を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、コザック配列も含み得る。コザック配列は、真核生物のｍＲＮＡに存在し、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ配列を有し、翻訳プロセスの開始に関与する配列である。コザック配列は、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列のすぐ上流に位置し得る。いくつかの実施形態では、コザック配列は、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１２）である。代わりに、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号５１）、ＧＡＣＡＣＣ（配列番号５２）又はＧＣＣＡＣＧ（配列番号５３）のコザック配列を含む。

本発明の特定の態様では、ウイルスベクターは、例えば、配列番号２３に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、それぞれ配列番号２４、２５及び２６に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ８カプシド並びに５’から３’の方向に、ヌクレオチド配列の以下のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターゲノムを含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ８カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の部分組合せを含み得る。

本発明のウイルスベクターは、例えば、配列番号２７に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ９カプシド並びに５’から３’の方向に、ヌクレオチド配列の以下のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターゲノムを含み得ることも考えられる：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の部分組合せを含み得る。

本発明の特定の態様では、ウイルスベクターは、例えば、配列番号３１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ２カプシド並びに５’から３’の方向に、ヌクレオチド配列の以下のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターゲノムを含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ２カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の部分組合せを含み得る。

本発明の特定の態様では、ウイルスベクターは、例えば、配列番号３５に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、それぞれ配列番号３６、３７及び３８に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ５カプシド並びに５’から３’の方向に、ヌクレオチド配列の以下のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターゲノムを含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の部分組合せを含み得る。

ウイルスベクターを生成する方法は、当技術分野でよく知られており、当業者が、表４に記載されるウイルスベクターを含む本発明のウイルスベクターを生成することを可能にするであろう（例えば、米国特許第７，４６５，５８３号明細書を参照されたい）。一般に、ｒＡＡＶベクターを作製する方法は、本発明のウイルスベクターの作製に適用可能であり、これらの方法の主な相違は、包み込まれる遺伝子エレメントの構造である。本発明によるウイルスベクターを作製するために、表３に記載される遺伝子エレメントの配列を使用して、カプシド化ウイルスゲノムを作製し得る。

表２に記載される遺伝子エレメントは、環状プラスミド又はウイルスゲノム、例えば一本鎖又は自己相補的ウイルスゲノムと関連しているが、当業者であれば、ＤＮＡ基質が、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バー・ウイルスベクター、ＡＡＶベクター、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど）（これらに限定されない）を含む、当技術分野で知られる任意の形態で提供され得ることを理解するであろう。代わりに、本明細書中に記載されるウイルスベクターを作製するために必要な表２中の遺伝子エレメントは、パッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。

本発明によるウイルスベクター粒子は、当技術分野で知られる任意の方法によって複製されパッケージングされる配列を許容細胞又はパッケージング細胞に導入することによって作製され得、これらの用語は、当技術分野で理解されている通りである（例えば、「許容」細胞は、ウイルスによって感染又は形質導入され得；「パッケージング」細胞は、ヘルパー機能を提供する安定に形質転換された細胞である）。

一実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２ウイルスベクターを作製する方法であって、パルボウイルス複製を許容する細胞に、（ａ）本発明のベクターゲノムを生成する遺伝子エレメントを含むヌクレオチド化合物（下記に詳細に又は表２に記載）、（ｂ）ベクターゲノムを生成するために、（ａ）のベクターゲノム配列を複製するのに十分なヌクレオチド配列、（ｃ）パルボウィルスカプシド内にベクターゲノムをパッケージするのに十分なヌクレオチド配列を、パルボウィルスカプシド内にカプシド化されたベクターゲノムを含むウイルスベクターが細胞内に十分に作製される条件下で提供することを含む方法が提供される。好ましくは、パルボウイルス複製及び／又はカプシドコード配列は、ＡＡＶ配列である。

複製及びパッケージングのために、以下に記載される遺伝子カセットを有するヌクレオチド配列を細胞宿主に導入する任意の方法が使用され得、このような方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、線状ポリエチレンイミンポリマー沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性又はアニオン性リポソーム及び核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されるウイルスベクターは、例えば、トリプルトランスフェクション又はバキュロウイルス媒介ウイルス産生など、当分野で知られた方法を使用して作成され得る。当技術分野で知られた任意の好適な許容細胞又はパッケージング細胞は、ベクターを産生するために使用され得る。哺乳類の細胞が好ましい。また、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス相補性パッケージング細胞株、例えば２９３細胞又は他のＥ１ａトランス相補性細胞も好ましい。また、当技術分野で知られているＤＮＡ修復に欠陥のある哺乳類細胞又は細胞系も、これらの細胞系は本明細書に記載のプラスミドに導入された変異を補正する能力が損なわれているために好ましい。

遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子のいくつか又は全てを含み得る。しかし、カプシド及び／又はＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクターを細胞に導入することにより、ｃａｐ及びｒｅｐ機能のいくつか又は全てがトランスで提供されることが好ましい。遺伝子カセットは、カプシド又はＲｅｐタンパク質をコードしないことが最も好ましい。代わりに、安定に形質転換されてｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子を発現するパッケージング細胞株が使用される（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：２３５３－２３６２，１９９８；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：７０２４－７０３１，１９９８；米国特許第５，８３７，４８４号明細書；国際公開第９８／２７２０７号パンフレット；米国特許第５，６５８，７８５号明細書；国際公開第９６／１７９４７号パンフレットを参照されたい）。

さらに、新しいウイルス粒子を増殖させるために、ヘルパーウイルス機能がウイルスベクターに提供されることが好ましい。アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスは、いずれもＡＡＶのヘルパーウイルスとしての役割を果たし得る。例えば、Ｂｅｒｎａｒｄ Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（３ｄ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。例示的ヘルパーウイルスとしては、単純ヘルペス（ＨＳＶ）水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス及びエプスタイン・バー・ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。感染多重度（ＭＯＩ）及び感染期間は、使用するウイルスの種類及び使用するパッケージング細胞株に依存するであろう。任意の好適なヘルパーベクターが使用され得る。ヘルパーベクターは、例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４，１９９８に記載されるように、プラスミドであることが好ましい。ベクターは、上述のように、当技術分野で知られた任意の好適な方法によってパッケージング細胞に導入することができる。

汚染性ヘルパーウイルスを含まないベクターストックは、当技術分野で知られる任意の方法によって得ることができる。例えば、組換え一本鎖又は自己相補性ウイルス及びヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別され得る。ウイルスは、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスからも分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：９７３－９８５，１９９９）。好ましくは、汚染性ヘルパーウイルスが複製能力を有さないように、欠失した複製欠損ヘルパーウイルスが使用される。さらに別の方法として、二重ウイルスのパッケージングを仲介するためには、アデノウイルスの早期遺伝子発現のみが必要であるため、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを利用し得る。後期遺伝子発現に欠陥のあるアデノウイルス変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

ヘルパー機能を提供するための１つの方法は、効率的なＡＡＶ産生に必要なヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドを使用する（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：１２９５－１２９７，１９９７；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４－２２３２，１９９８）。アデノウイルスミニプラスミドで得られるｒＡＡＶ力価は、野生型アデノウイルス感染の従来の方法で得られる力価の４０倍である（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４－２２３２，１９９８）。この方法では、アデノウイルスと同時トランスフェクションする必要がない（Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：７１６９－７１７７，１９９４；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：１３２９－１３４１，１９９５；Ｔｒｅｍｐｅ ａｎｄ Ｙａｎｇ，（１９９３），ｉｎ，Ｆｉｆｔｈ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｒｉｖｅｒ，ＦＬ）。

以下に限定されないが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を別々の発現カセット上に分割して、複製能力のあるＡＡＶの生成を防止する方法（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：６８１６－６８２２，１９９７を参照されたい）、パッケージング細胞株を使用する方法（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：２３５３－２３６２，１９９８；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７２：７０２４－７０３１，１９９８；米国特許第５，８３７，４８４号明細書；国際公開第９８／２７２０７号パンフレット；米国特許第５，６５８，７８５号明細書；国際公開第９６／１７９４７号パンフレットを参照されたい）及び他のヘルパーウイルスを含まないシステム（例えば、米国特許第５，９４５，３３５号明細書を参照されたい）を含む、ｒＡＡＶストックを作製する他の方法が記載されている。

ヘルペスウイルスは、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとしても使用され得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、よりスケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：９８６－９９３，１９９９及び国際公開第００／１７３７７号パンフレット）。

要約すると、複製及びパッケージングされる遺伝子カセット、パルボウイルスｃａｐ遺伝子、適切なパルボウイルスｒｅｐ遺伝子及び（好ましくは）ヘルパー機能は、ベクターゲノムを担持するｒＡＡＶ粒子を産生するために細胞（例えば、許容細胞又はパッケージング細胞）に提供される。遺伝子カセット、及び／又はパッケージングベクター、及び／又は安定に形質転換されたパッケージング細胞によってコードされるｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の組み合わされた発現は、ウイルスベクターカプシドが本発明によるウイルスベクターゲノムをパッケージするウイルスベクター粒子の産生をもたらす。ウイルスベクター、例えば一本鎖ウイルスベクターは、細胞内で集合することができ、当業者に知られており、実施例に記載される任意の方法によって回収され得る。例えば、ウイルスベクターは、標準的なＣｓＣｌ遠心分離法（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １：１４１２－１４２８，２００６）、イオジキサノール遠心分離法又は当業者に知られる様々なカラムクロマトグラフィー法（例えば、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９－１２７１，２０１０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１８８８－１８９６， ２００９；及びＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５１－１２５７，２０１０を参照されたい）によって精製され得る。

本明細書中に開示される試薬及び方法は、本発明のウイルスベクターの高力価ストックを好ましくは実質的に野生型の力価で作製するために使用され得る。また、パルボウイルスストックは、約１０^１０ｖｇ／ｍＬ～約１０^１３ｖｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも又は約１０^１０ｖｇ／ｍＬ、６．６×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１０^１３ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ又はそれを超える力価を有することが好ましい。

ウイルスベクターの生成に使用するための核酸
本発明は、ウイルスベクターの生成に有用な核酸にも関する。本発明の特定の態様では、ウイルスベクターの生成に有用な核酸は、プラスミドの形態であり得る。ウイルスベクタープラスミドとも呼ばれるウイルスベクターの生成に有用なプラスミドは、遺伝子カセットを含むことができる。ウイルスベクタープラスミドの遺伝子カセットは、少なくともプロモーター、異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子、ポリＡシグナル配列及び５’及び３’ＩＴＲを含む。

異種遺伝子及び他のエレメントの組成は、得られるベクターの用途に依存する。例えば、異種遺伝子配列の１つのタイプは、レポーター配列を含み、これは、発現されると、検出可能なシグナルを生成する。このようなレポーター配列としては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質及びそれに対する高親和性抗体が存在するか、又は従来の手段によって産生され得る、当技術分野でよく知られた他のものを含む膜結合タンパク質並びにとりわけヘマグルチニン又はＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、レポーター配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。レポーター配列がＧＦＰ又はルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターにおける色又は光の生成によって視覚的に測定され得る。

異種遺伝子配列は、それらの発現を駆動するエレメントと関連する場合、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ又は他の分光アッセイ、蛍光活性化セルソーティングアッセイ並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む免疫アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。

異種遺伝子は、生物学及び医学において有用な産物、例えばタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体又は触媒ＲＮＡをコードする非マーカー配列であり得る。望ましいＲＮＡ分子としては、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが挙げられる。有用なＲＮＡ配列の一例は、治療動物における標的ヌクレオチド配列の発現を阻害又は消滅させる配列である。

また、異種遺伝子を用いて、遺伝子欠損を修復又は改善することもできる。このような遺伝子欠損としては、正常な遺伝子が正常レベルよりも低いレベルで発現される欠損又は機能的な遺伝子産物が発現されない欠損が挙げられる。本発明では、異種遺伝子配列がＣＹＰ４Ｖ２コード配列であり得ることが考えられる。表２にＣＹＰ４Ｖ２コード配列の例、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７及び４９を示す。

本発明の一態様は、５’から３’の方向に、以下のヌクレオチド配列のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを含む核酸に関する：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、遺伝子カセットは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子カセットを含む核酸は、プラスミドであり得る。

表２のエレメントを組み込む方法は、当技術分野でよく知られており、当業者が、本明細書に記載の方法を用いて本発明の核酸及びプラスミドを生成することを可能にするであろう。

医薬組成物
一態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明のウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。組成物は、ＢＣＤの治療又は予防に好適な１種以上の他の治療剤をさらに含有することができる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合性がある溶媒、界面活性剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られる種々の方法によって投与することができる。投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。投与は、網膜下であることが好ましい。薬学的に許容される担体は、網膜下、硝子体内、静脈内、皮下又は局所投与に適していなければならない。

組成物は、無菌であり且つ流動性がなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、且つ界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。一実施形態では、組成物は、ｐＨが約６．５～８．０、例えばｐＨ６．５～７．５及びｐＨ６．５～７．０の、界面活性剤として１×ＰＢＳ及び０．００１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ－６８を有する緩衝液を含むことができる。

本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られており、且つ日常的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０ｔｈ ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。一般的に、本発明の医薬組成物では、治療に効果的な用量又は有効な用量のウイルスベクターが使用される。ウイルスベクターは、当業者に知られた従来の方法により、薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。投薬レジメンは最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回ボーラス投与であり得るか、数回の用量を経時的に投与し得るか、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させ得る。投与の容易さ及び用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療対象の単位用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物及び投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効な量の活性成分を得るように変化させることができる。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康及び病歴などの因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存する。

医師又は獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルより低いレベルにおいて、医薬組成物で使用される本発明のウイルスベクターの用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般に、本明細書に記載されるようなＢＣＤの治療に有効な本発明の組成物の用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物及び治療が予防的であるか治療的であるかを含む様々な因子に応じて変化する。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために漸増する必要がある。ウイルスベクターを網膜下投与する場合、用量は、約１×１０^８ベクターゲノム（ｖｇ）／眼～約１×１０^１２ｖｇ／眼の範囲であり得る。例えば、用量は、約１×１０^８ｖｇ／眼、２．５×１０^８ｖｇ／眼、５×１０^８ｖｇ／眼、７．５×１０^８ｖｇ／眼、１×１０^９ｖｇ／眼、２．５×１０^９ｖｇ／眼、５×１０^９ｖｇ／眼、７．５×１０^９ｖｇ／眼、１×１０^１０ｖｇ／眼、２．５×１０^１０ｖｇ／眼、５×１０^１０ｖｇ／眼、７．５×１０^１０ｖｇ／眼、１×１０^１１ｖｇ／眼、２×１０^１１ｖｇ／眼、２．５×１０^１１ｖｇ／眼、５×１０^１１ｖｇ／眼、７．５×１０^１１ｖｇ／眼又は１×１０^１２ｖｇ／眼以上であり得る。

本明細書に記載されるウイルスベクターは、主に１つの眼当たり１回の用量として使用され、以前の投与でカバーされていない網膜の領域を治療するための反復投与の可能性を伴う。投与量は、治療が予防的であるか治療的であるかによって変化し得る。

上記の個々のセクション及び実施形態で言及された本発明の様々な特徴及び実施形態は、必要に応じて、他のセクション及び実施形態に必要な変更を適宜加えて適用される。したがって、１つのセクション又は実施形態で指定された特徴は、必要に応じて、他のセクション又は実施形態で指定された特徴と組み合わせることができる。

治療用途
本明細書に記載されるウイルスベクターは、それを必要とする対象に本発明のウイルスベクターを有効量投与することにより、眼関連疾患の治療にとって治療的に有用な濃度で使用され得る。例えば、ウイルスベクターは、例えば、配列番号２３に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、それぞれ配列番号２４、２５及び２６に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ８カプシド並びに５’から３’の方向に、ヌクレオチド配列の以下のセットの１つに対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターゲノムを含む：
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、配列番号１、２、１４、１８及び２２；配列番号１、２、９、１４、１８及び２２；配列番号１、２、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、２、９、１４、１６、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１８及び２２；配列番号１、３、９、１４、１８及び２２；配列番号１、３、１４、１６、１８及び２２；又は配列番号１、３、９、１４、１６、１８及び２２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の他の実施形態では、ＡＡＶ８カプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の部分組合せを含み得る。

治療を必要とする対象には、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に１つ以上の変異（例えば、表１）を有する者が含まれ得る。より具体的には、本発明は、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列配列（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、例えば配列番号１５をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、ＢＣＤを治療する方法を提供する。いくつかの態様では、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、例えば配列番号１５をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、ＢＣＤを有する対象の視力を改善する方法が本明細書において提供される。いくつかの態様では、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、例えば配列番号１５をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、ＢＣＤを有する対象における視力の低下を予防する方法が本明細書において提供される。特定の態様では、本発明は、対象のＢＣＤの治療に使用するためのＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含むウイルスベクターを提供する。一実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、当業者に知られた方法を用いて網膜下又は硝子体内に投与することができる。一実施形態では、本方法は、対象がＢＣＤに関連する１つ以上のＣＹＰ４Ｖ２変異（例えば、表１を参照されたい）を有するか否かを決定するために、対象の遺伝子型決定すること及び本明細書に記載されるウイルスベクターを投与することにより、ＢＣＤについてＢＣＤに関連する１つ以上のＣＹＰ４Ｖ２変異を有する対象を治療することを含み得る。特定の実施形態では、ＢＣＤを治療する方法で使用するために本明細書で提供されるウイルスベクターは、プロモーター、例えばＰｒｏＡ１８又はＰｒｏＢ４プロモーターに作動可能に連結されたＣＹＰ４Ｖ２コード配列配列（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、例えば配列番号１５をコードするヌクレオチド配列）を含む。

組換えＡＡＶの使用は、網膜疾患の治療に適しており且つ安全であることが示されている。例えば、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５８：２２３１－２２３９，２００８；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５：１１９１－１１９２，２００８；Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９：９７９－９９０，２００８；Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５８：２２４０－２２４８，２００８；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３８８：６６１－６７２，２０１６；及びＲｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３９０：８４９－８６０，２０１７を参照されたい。本明細書に記載されるウイルスベクターは、とりわけ、ＢＣＤの進行を治療且つ予防し、視力の喪失を減少させるために使用され得る。

本発明は、本発明のウイルスベクターを、それを必要とする対象、例えばＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に１つ以上の変異（例えば、表１）を有する対象に投与することにより、ＲＰＥ細胞においてＣＹＰ４Ｖ２コード配列を発現させる方法にも関する。本発明は、それを必要とする対象の網膜のＲＰＥ細胞においてＣＹＰ４Ｖ２コード配列を発現させる際に使用するための本発明のウイルスベクターにも関する。本発明は、ＢＣＤを有する対象の網膜、特に網膜中のＲＰＥ細胞に、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を送達及び発現させる方法も意図する。ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を、それを必要とする対象に、対象の網膜及び／又はＲＰＥ細胞を本明細書に記載のウイルスベクターと接触させる（例えば、網膜下又は硝子体内に投与する）ことによって送達することが考えられる。代わりに、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを対象に投与することにより、対象に送達される。

いくつかの態様では、本発明は、ＢＣＤを有する対象の網膜を本発明のウイルスベクターと接触させることにより、対象の網膜のＲＰＥ細胞においてＣＹＰ４Ｖ２コード配列を発現させる方法をさらに含む。特定の態様では、対象の網膜のＲＰＥ細胞に本発明のウイルスベクターを接触させる。

ＢＣＤなどの眼疾患の治療及び／又は予防は、視覚機能、機能的視覚、網膜組織及び／又は生活の質に臨床的に関連する測定値を用いて、眼科医、検眼士又はヘルスケアの専門家が決定できる。ＢＣＤの治療は、視覚機能、機能的視覚、網膜組織及び／又は生活の質を改善又は維持することが意図される任意の行動（例えば、本明細書に記載されるウイルスベクターの投与）を意味する。さらに、ＢＣＤに関連する予防とは、本明細書で定義されるように、視覚機能、機能的視覚、網膜組織及び／又はＢＣＤ表現型の悪化を、網膜における黄色又は白色の結晶様沈着物の数及び／又はサイズの減少など、前記悪化のリスクがある対象において抑制、予防又は遅延させる任意の行動（例えば、本明細書に記載されるウイルスベクターの投与）を意味する。

視覚機能には、例えば、視力、低照度での視力、視野、中心視野、周辺視野、コントラスト感受性、暗順応、光ストレス回復、色識別、読み取り速度、補助装置（例えば、大きい書体、拡大装置、望遠鏡）への依存、顔認識、自動車の操作の習熟度、日常生活の１つ以上の活動を実行する能力及び／又は視覚機能に関連する患者が報告した満足度が含まれ得る。したがって、特定の実施形態では、ＢＣＤの治療は、対象が予め指定された程度の暗順応に至るまでの時間の１０％、２０％又は３０％以上の増加の少なくとも１０％、２０％又は３０％の減少又は欠如を有する場合に始まると言うことができる。さらに、ＢＣＤの治療は、対象が若い年齢で早期の重度の夜盲症及び遅い暗順応を示し、その後、視力、視野及び色覚の進行性の喪失が起こり、資格のあるヘルスケア専門家、例えば眼科医及び検眼士によって法的盲に至ったと決定された場合に始まると言うことができる。

視覚機能の例示的な尺度としては、スネレン視力、ＥＴＤＲＳ視力、低輝度視力、アムスラーグリッド、ゴールドマン視野、標準的自動視野測定、マイクロペリメトリー、ペリーロブソンチャート、スキルカード、石原カラープレート、ファーンスワースＤ１５又はＤ１００カラーテスト、標準網膜電図、多焦点網膜電図、読む速度の有効性が認められた試験、顔認識、運転シミュレーション及び患者が報告した満足度が挙げられる。したがって、ＢＣＤの治療は、ＥＴＤＲＳスケールで２本以上の線（又は１０文字）の獲得又は視認喪失がないことよって達成されると言うことができる。さらに、特定の態様では、ＢＣＤの治療は、例えば、網膜電図によって測定される網膜機能の喪失の改善又は遅延；例えば、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）によって測定される網膜構造の進行の改善又は遅延；例えば、種々の照度での迷路による、歩行ナビゲーション喪失の改善又は遅延；及び／或いは読む速度（１分当たりの単語数）の１０％、２０％若しくは３０％の増加又は少なくとも１０％、２０％若しくは３０％の減少がなくなったときに始まると言うことができる。さらに、いくつかの態様では、ＢＣＤの治療は、対象が、石原テストで正しく特定されたプレート又はファーンスワーステストで正しく並べられたディスクの割合において、少なくとも２０％の増加又は２０％の減少の欠如を示す場合に始まると言うことができる。したがって、ＢＣＤの治療は、例えば、暗順応速度の改善、視力の改善又は視力喪失速度を遅くすることによって決定することができる。

治療又は予防され得る網膜組織の望ましくない態様には、例えば、網膜における脂質の小さい黄色又は白色の結晶様沈着物の蓄積、網膜萎縮、網膜色素上皮萎縮、網膜血管の狭窄、色素凝集及び網膜下液が含まれる。網膜組織を評価する例示的な手段としては、眼底検査、眼底撮影、蛍光眼底血管造影、インドシアニングリーン蛍光造影、ＯＣＴ、スペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー、走査レーザー検眼鏡、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生検、剖検及び免疫組織化学が挙げられる。したがって、本明細書に記載されるウイルスベクターは、例えば、網膜萎縮の進行速度の減少並びに／又は網膜における黄色若しくは白色の結晶様沈着物の数及び／若しくはサイズの減少によって決定される対象のＢＣＤの治療に使用され得る。

ＢＣＤの治療は、例えば、生活の質の改善又は維持によっても決定され得る。当業者は、生活の質が多くの様々な試験、例えば国立眼病研究所ＮＥＩ－ＶＦＱ２５アンケート調査（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＮＥＩ－ＶＦＱ２５ ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）によって決定され得ることを理解するであろう。

本発明の治療薬で治療される対象には、ビタミン及びミネラル製剤、低視力補助具、盲導犬又は低視力患者を補助することが知られている他の装置など、網膜ジストロフィーに有効であることが知られている他の治療薬又は装置を施すこともできる。

現在、ＢＣＤの治療に承認された他の治療剤は、存在しない。他の新しい治療法が出現すれば、本発明の組成物及び新しい治療法は、臨床的に必要であれば順に又は同時に連続して投与することができる。

以下は、本発明の例示的な実施形態である。

１．５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列；及び
（ｖ）３’ＩＴＲ
を含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。

２．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）イントロン；
（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉ）３’ＩＴＲ
を含む、実施形態１のウイルスベクター。

３．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）調節エレメント；
（ｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉ）３’ＩＴＲ
を含む、実施形態１のウイルスベクター。

４．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）イントロン；
（ｉｖ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｖ）調節エレメント；
（ｖｉ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖｉｉ）３’ＩＴＲ
を含む、実施形態１のウイルスベクター。

５．ベクターゲノムは、約４．１ｋｂ以上且つ約４．９ｋｂ未満の長さを含む、実施形態１～４のいずれか１つのウイルスベクター。

６．ベクターゲノムは、ポリＡシグナル配列と３’ＩＴＲとの間に配置されたスタッファー配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つのウイルスベクター。

７．スタッファー配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００又は２，５００～３，０００ヌクレオチドの長さである、実施形態６のウイルスベクター。

８．５’ＩＴＲは、配列番号１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つのウイルスベクター。

９．プロモーターは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）特異的プロモーターである、実施形態１～８のいずれか１つのウイルスベクター。

１０．プロモーターは、ＰｒｏＡ１８プロモーター又はＰｒｏＢ４プロモーターである、実施形態９のウイルスベクター。

１１．プロモーターは、配列番号２又は配列番号３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、且つＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２の発現を促進する、実施形態１０のウイルスベクター。

１２．ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７又は配列番号４９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つのウイルスベクター。

１３．ポリＡシグナル配列は、ウシ成長ホルモン又はシミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）ポリＡヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１２のいずれか１つのウイルスベクター。

１４．ポリＡシグナル配列は、配列番号１８又は配列番号１９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１３のウイルスベクター。

１５．３’ＩＴＲは、配列番号２２に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つのウイルスベクター。

１６．イントロンは、ヒト成長ホルモン、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）又はヒトベータグロビンイントロン配列を含む、実施形態２及び４のいずれか１つのウイルスベクター。

１７．イントロンは、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１６のウイルスベクター。

１８．調節エレメントは、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）又はウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）配列を含む、実施形態３及び４のいずれか１つのウイルスベクター。

１９．調節エレメントは、配列番号１６又は配列番号１７に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１８のウイルスベクター。

２０．ベクターゲノムは、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列のすぐ上流に位置するコザック配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つのウイルスベクター。

２１．コザック配列は、配列番号１２、配列番号５１、配列番号５２又は配列番号５３のヌクレオチド配列を含む、実施形態２０のウイルスベクター。

２２．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１のウイルスベクター。

２３．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態２のウイルスベクター。

２４．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態３のウイルスベクター。

２５．ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態４のウイルスベクター。

２６．ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８、９、２又は５カプシドを含む、実施形態１～２５のいずれか１つのウイルスベクター。

２７．ＡＡＶ８カプシドは、それぞれ配列番号２４、２５及び２６に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む、実施形態２６のウイルスベクター。

２８．ＡＡＶ８カプシドは、配列番号２３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２６のウイルスベクター。

２９．ＡＡＶ９カプシドは、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載のウイルスベクター。

３０．ＡＡＶ９カプシドは、配列番号２７に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２６のウイルスベクター。

３１．ＡＡＶ２カプシドは、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載のウイルスベクター。

３２．ＡＡＶ２カプシドは、配列番号３１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２６のウイルスベクター。

３３．ＡＡＶ５カプシドは、それぞれ配列番号３６、３７及び３８に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載のウイルスベクター。

３４．ＡＡＶ５カプシドは、配列番号３５に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２６のウイルスベクター。

３５．実施形態１～３４のいずれかのウイルスベクターを含む組成物。

３６．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態３５の組成物。

３７．網膜細胞において異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を発現させる方法であって、網膜細胞を実施形態１～３６のいずれかのウイルスベクターと接触させることを含む方法。

３８．網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である、実施形態３７の方法。

３９．Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症（ＢＣＤ）を有する対象を治療する方法であって、実施形態３６の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。

４０．ＢＣＤを有する対象の視力を改善するか、視覚機能若しくは機能的視覚を改善するか、又は視覚機能若しくは機能的視覚の低下を抑制する方法であって、実施形態３６の組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。

４１．ＢＣＤを有する対象の治療に使用するための、実施形態３６の組成物。

４２．ＢＣＤを有する対象における視力の改善に使用するための、実施形態３６の組成物。

４３．遺伝子カセットを含む核酸であって、遺伝子カセットは、５’から３’方向に、
（ｉ）５’ＩＴＲ；
（ｉｉ）プロモーター；
（ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ポリＡシグナル配列；及び
（ｖ）３’ＩＴＲ
を含む核酸。

４４．核酸は、プラスミドである、実施形態４３の核酸。

４５．遺伝子カセットは、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態４３の核酸。

４６．ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターゲノムを含むウイルスベクターであって、プロモーターはＰｒｏＡ１８プロモーターであるウイルスベクター。

４７．ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターゲノムを含むウイルスベクターであって、プロモーターは、ＰｒｏＢ４プロモーターである、ウイルスベクター。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の変形形態は、当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に包含される。

実施例１：ＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドの構築
１．１．ＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドのクローニング：
個々のプラスミドエレメントのヌクレオチド配列を表２に記載する。配列は、合成されるか又は商業的に購入された。表３は、構築された各プラスミドに存在するエレメントを記載する。標準的な分子生物学的クローニング技術を用いて、表３に記載のプラスミドを作製した。カナマイシン耐性を有するプラスミド骨格を骨格及び出発物質として使用した。個々の配列エレメントを制限酵素部位にクローニングするか、又は平滑末端クローニングを用いてクローニングした。

プラスミド骨格に含まれる抗生物質耐性遺伝子カセットは、ＡＡＶベクターの産生において役割を果たさないため、当業者は、代替のプラスミド骨格及び／又は抗生物質耐性遺伝子カセットを使用して、同じウイルスベクターを産生し得る。

１．２．ｒＡＡＶベクターを産生するためのトリプルプラスミドトランスフェクション：
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスベクターを、トリプルトランスフェクション法によって作製した。トリプルトランスフェクションの方法は、当技術分野で知られている（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：１２９５－１２９７，１９９７）。簡潔には、ＡＡＶ－ＩＴＲ含有プラスミド（表３に記載）、ＡＡＶ－ＲｅｐＣａｐ含有プラスミド（Ｒｅｐ２及びＣａｐ８を有する）及びアデノ－ヘルパープラスミド（ＡＡＶ複製サイクルの完了を補助する遺伝子を有する）を２９３個の細胞に同時トランスフェクトした。細胞を４日間培養した。培養期間の終わりに、細胞を溶解し、培養上清及び細胞溶解物中のベクターを、ＡＶＢセファロースアフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。当業者は、標準的なＣｓＣｌ勾配遠心法（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １：１４１２－１４２８，２００６に基づく方法）も使用され得ることを理解するであろう。

代わりに、上記の細胞トランスフェクション及び培養方法により、ＧＭＰ様ｒＡＡＶベクターを作製することができる。次いで、収集した細胞培養材料を、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９－１２７１，２０１０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１８８８－１８９６，２００９；及びＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５１－１２５７，２０１０によって記載された方法に基づくカラムクロマトグラフィーによって処理する。

実施例２：ｈＧＨイントロン、ｂＧＨポリＡシグナル配列及びＨＰＲＥの包含はｅＧＦＰの発現増強を提供する
ＨＰＲＥの有無にかかわらず、異なるイントロン、異なるポリＡシグナル配列を含み、ＨＰＲＥを含むか又は含まない、異なるエレメントを含有する、ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰを発現するＡＡＶ８ベクターを、網膜における最適な遺伝子発現のための最良の組み合わせを決定するために設計した。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｅＧＦＰに融合したチャネルロドプシン（ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ）を発現し、異なるエレメント、例えば異なるイントロン（例えば、ｈＧＨイントロン及びＳＶ４０イントロン）、ポリＡシグナル配列（例えば、ｂＧＨポリＡシグナル配列及びＳＶ４０ポリＡシグナル配列）を含み、ＨＰＲＥを含むか又は含まない１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８ベクターを網膜下に注入した。４週間後、眼をマウスから採取し、いくつかを４℃で一晩、１ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定液で固定し、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に置いた。次に、これらの眼をペーパータオルで乾燥させ、３５ｍｍ皿に移した。眼の外側から外来組織並びに角膜及び水晶体を除去し、次いで眼杯を１ｍｌのＰＢＳに浸漬した。次いで、網膜を眼杯から取り出し、両方を花弁状に切断し、スライド上に載せた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを用いてｅＧＦＰ蛍光像を得た。蛍光像は、全て２．５倍の倍率及び同じ露光時間で撮像した。

他の採取した眼を神経網膜と後眼杯とに分離し、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の分析のために凍結した。簡単に述べると、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて組織試料からＲＮＡを単離し、次いで２００ｎｇのＲＮＡを使用し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを生成した。各試料について１ｎｇのｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘに添加し、ｅＧＦＰ（Ｍｒ０４０９７２２９＿ｍｒ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を認識するプライマー及びプローブ並びにマウスＲａｂ７（Ｍｍ００７８４３１８＿ｓＨ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各反応に添加した。ｄｄＰＣＲは、製造業者のプロトコル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に従って行った。各試料について、ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ発現をＲａｂ７対照発現に対して正規化した。

結果及び結論
５つの異なるＡＡＶ８ベクターを構築し、マウスの網膜下に注入した。注入の４週間後、マウスから眼を採取し、ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ発現をフラットマウント及びｄｄＰＣＲの両方によって試験した。後眼杯のフラットマウントは、ｈＧＨイントロンを含むベクターを注入した眼においてｅＧＦＰ蛍光が最も高かったことを示した（図１）。また、ｂＧＨポリＡシグナル配列の包含は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列を有する同じベクターと比較してわずかに高い蛍光を示した（ＡＡＶ８－ＴＭ０７８対ＡＡＶ８－ＴＭ０７３）。

ＣｈＲ２ｄ－ｅＧＦＰ発現レベルをより定量的に分析するために、分離した神経網膜及び後眼杯試料から単離したｍＲＮＡについてｄｄＰＣＲを行った。結果は、後眼杯において、発現がＨＰＲＥ（ＡＡＶ８－ＴＭ０７５）の添加によって最も有意に増強されたことを示した（図２Ａ）。また、ｂＧＨポリＡシグナル配列を含むベクターは、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列を含むそれぞれのベクターと比較してより高い発現を示した（ＡＡＶ８－ＴＭ０７８をＡＡＶ８－ＴＭ０７３及びＡＡＶ８－ＴＭ０７９をＡＡＶ８－ＴＭ０７４と比較されたい）。神経網膜において、ＨＰＲＥの添加は、再びｅＧＦＰ（ＡＡＶ８－ＴＭ０７５）の発現レベルの増強をもたらしたが、発現の最大の増加は、ｂＧＨポリＡシグナル配列（ＡＡＶ８－ＴＭ０７８及びＡＡＶ８－ＴＭ０７９）の添加から観察された（図２Ｂ）。

まとめると、これらの結果は、網膜における遺伝子発現のための最適な発現カセットがｈＧＨイントロン、ｂＧＨポリＡシグナル配列及びＨＰＲＥエレメントを含み得ることを示している。したがって、これらのエレメントの１つ、２つ又は３つ全てを含むベクターをＢＣＤの治療のためのＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡの送達のために構築した。

実施例３：Ｃｙｐ４ｖ３ノックアウトマウスの網膜下へのＡＡＶ－ＣＹＰ４Ｖ２ベクターの注入は、疾患の進行を抑制する。
Ｃｙｐ４ｖ３は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２のマウスオルソログである（８２％の同一性）。Ｃｙｐ４ｖ３遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてノックアウトし、Ｃｙｐ４ｖ３ノックアウトマウスにＣＹＰ４Ｖ２を発現するＡＡＶベクターを約１×１０^９ｖｇ／眼で注入する。注入後、異なる時点でマウスを眼底撮影及び光コヒーレンストモグラフィーにより検査し、網膜に存在する結晶性沈着物の数及びサイズを測定する。さらに、マウスを視覚機能（例えば、視力、暗順応）及び機能的視覚（例えば、運動性試験）について評価する。対照注入眼（ＡＡＶ－ｅＧＦＰベクター）と比較して、ＣＹＰ４Ｖ２を発現するベクターを注入した眼は、結晶性沈着物の数及び／若しくはサイズの減少並びに／又は視覚機能及び／又は機能的視覚の改善を示し、ＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２の発現の成功及びＣＹＰ４Ｖ２タンパク質機能の回復を実証する。

実施例４：ＡＡＶ－ＰｒｏＡ１８又はＡＡＶ－ＰｒｏＢ４ベクターの非ヒト霊長類の網膜下への注入は、ＲＰＥ細胞における遺伝子発現をもたらす
合成プロモーター配列を、ＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ／ＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ制限部位を含む短いフランクを有するＧＥＮＥＷＩＺによって化学的に合成した。ＥＦ１ａ又はｈＲＯプロモーターを置換するｐＡＡＶ－ＥＦ１ａ－ＣａｔＣｈ－ＧＦＰに適切な制限部位組合せを用いて、ＰｒｏＢ１８及びＰｒｏＢ４プロモーター配列をサブクローニングした。ｐＡＡＶ－ＥＦ１ａ－ＣａｔＣｈ－ＧＦＰプラスミドはアダプターＰＣＲ法及びｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＣａｔＣｈ－ＧＦＰを用いたＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキットにより構築した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、分岐ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＡＡＶトランスジェンプラズミド、選択したカプシド（ＢＰ２）に対するＡＡＶ Ｒｅｐ２及びＣａｐ蛋白質をコードするＡＡＶヘルパープラスミド及びアデノウイルス遺伝子を保有するｐＨＧＴ１－Ａｄｅｎｏ１ヘルパープラスミドで同時トランスフェクトした。直径１５ｃｍの１つの細胞培養皿は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の８０％コンフルエンスでプラスミド混合物を同時トランスフェクトした。７μｇのＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、７μｇのＲｅｐ２及びＣａｐをコードするプラスミド、２０μｇのＡＡＶヘルパープラスミド及び６．８μＭのポリエチレンイミン（５ｍｌのＤＭＥＭ中）に含有する細胞トランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベートした後、１０ｍｌのＤＭＥＭを含有する細胞培養皿に加えた。トランスフェクションの６０時間後、細胞を回収し、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのトリス－ＨＣｌを含有する緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細胞を、凍結融解サイクルを繰り返すことによって溶解し、ＭｇＣｌ２を添加し、１ｍＭの最終濃度とした。プラスミド及びゲノムＤＮＡを、３７℃で１０分間、２５０Ｕｍｌ－１のターボヌクレアーゼで処理することによって除去した。４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離することにより、細胞残屑を除去した。ＡＡＶ粒子を精製し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ １００ Ｋカラム（カタログ番号ＵＦＣ９１０００８；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。プロテアーゼＫを用いてＡＡＶ粒子を変性させた後、ＴａｑＭａｎ逆転写ＰＣＲによってカプシド化されたウイルスＤＮＡを定量した。力価は、１ｍｌ当たりのゲノムコピーとして計算した。

マウスにおけるＡＡＶ投与のために、２．５％イソフルランで麻酔したマウスに眼注入を行った。水晶体付近の強膜に鋭い３０－Ｇ針で小さい切開を入れ、この切開を通して、マイクロマニピュレーターに保持した鈍い５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、２μｌのＡＡＶ懸濁液を網膜下／硝子体内空間に注入した。

非ヒト霊長類におけるＡＡＶ投与のために、５０マイクロリットルのＡＡＶ粒子懸濁液を眼科医及び中国のＫｕｎｍｉｎｇの第三者契約者と共同して網膜下に注入した。３ヶ月後、単離した眼杯をＰＢＳ中４％のＰＦＡ中で一晩固定し、続いてＰＢＳ中、４Ｃで洗浄工程を行った。固定した眼杯を受けた後、感染した網膜領域を切除し、１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで室温にて１時間処理した。３％ＮＤＳ、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中、室温で５日間、モノクローナルラット抗ＧＦＰ Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：５００）及びポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：１：２００）で処理した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６３３及びＨｏｅｃｈｓｔでの処理を２時間行った。切片を洗浄し、ガラススライド上にＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）でマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を用いて撮像した。

以下の表４及び表５は、マウス及びＮＨＰ網膜細胞における発現を駆動する合成プロモーターＰｒｏＡ１８及びＰｒｏＢ４の能力を要約する。ＰｒｏＡ１８とＰｒｏＢ４はともに、ＮＨＰのＲＰＥ細胞において遺伝子発現を導く。

実施例５：ＲＰＥ細胞を標的とするための最良のカプシド血清型を決定するためのＡＡＶベクターのカニクイザルの網膜下への注入。
ＣＭＶプロモーターからＧＦＰを発現するＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９ベクターを１眼当たり１×１０^１１ｖｇの用量でカニクイザルの網膜下に注入した。注入の４週間後、サルの眼におけるＧＦＰ発現を、生存時、眼底自家蛍光撮像により、また採取後に免疫組織化学により調べた。さらに、ＧＦＰ ｍＲＮＡ及びＡＡＶゲノムＤＮＡのレベル及び局在をインサイチューハイブリダイゼーションにより評価した。

試験した４つの血清型は、全てが光受容体及びＲＰＥ細胞におけるＧＦＰ発現を促進した。発現は、注入部位の近くで観察され、末梢領域への広がりの程度は様々であった。ＧＦＰ発現は、試験したいずれの血清型についても視神経又は脳切片で検出されなかった。

実施例６：ＲＰＥ特異的発現の最良のプロモーターを決定するためのカニクイザルの網膜下へのＡＡＶベクターの注入。
ＲＰＥ特異的プロモーターからＧＦＰを発現するＡＡＶベクターをカニクイザルの網膜下に１眼当たり１×１０^１１ｖｇの用量で注入する。ＲＰＥ特異的プロモーターには、ＰｒｏＡ１８及びＰｒｏＢ４が含まれる。注入の４週間後、サルの眼におけるＧＦＰ発現を、生存時、眼底自家蛍光撮像により、また採取後に免疫組織化学により調べる。さらに、ＧＦＰ ｍＲＮＡ及びＡＡＶゲノムＤＮＡのレベル及び局在をインサイチューハイブリダイゼーションにより評価する。２つの異なるプロモーターは、いずれもＲＰＥ特異的ＧＦＰ発現を示すが、発現レベルは、可変である。

実施例７：ヒト網膜組織におけるＡＡＶ駆動遺伝子発現
ヒト網膜組織を除核したヒト眼球から用意し、そこから網膜を、細いはさみを用いて切出す。ＲＰＥ特異的プロモーターからＧＦＰを発現するＡＡＶベクターをヒト網膜組織と共にインキュベートする。ＲＰＥ特異的プロモーターには、ＰｒｏＡ１８及びＰｒｏＢ４が含まれる。ＡＡＶ誘導ＧＦＰ発現をウイルス投与の６～８週後に調べる。注入６週間後、ヒト網膜組織におけるＧＦＰ発現を免疫蛍光及び撮像により調べる。２つの異なるプロモーターは、いずれもＲＰＥ特異的ＧＦＰ発現を示す。

実施例８：ＮＨＰ及びヒト組織におけるＰｒｏＡ１８又はＰｒｏＢ４プロモーター下のＣＹＰ４Ｖ２のＡＡＶ駆動性発現
ＰｒｏＡ１８又はＰｒｏＢ４プロモーター下でヒトＣＹＰ４Ｖ２を発現するＡＡＶベクター（「ＡＡＶ－ＰｒｏＡ１８－ＣＹＰ４Ｖ２ベクター」又は「ＡＡＶ－ＰｒｏＢ４－ＣＹＰ４Ｖ２ベクター」）を、実施例７に記載のように、ヒト網膜組織と共にインキュベートする。ウイルス投与の６～８週間後、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子発現を調べる。注入の６週間後、ヒト網膜組織におけるＣＹＰ４Ｖ２発現が検出される。

ＡＡＶ－ＰｒｏＡ１８－ＣＹＰ４Ｖ２ベクター又はＡＡＶ－ＰｒｏＢ４－ＣＹＰ４Ｖ２ベクターは、カニクイザルの網膜下に１眼当たり１×１０^１１ｖｇの用量で注入する。注入４週間後、サルの眼におけるＣＹＰ４Ｖ２発現を採取後に免疫組織化学により調べる。さらに、ＣＹＰ４Ｖ２ ｍＲＮＡ及びＡＡＶゲノムＤＮＡのレベル及び局在をインサイチューハイブリダイゼーションにより評価する。ＰｒｏＡ１８及びＰｒｏＢ４プロモーターは、サルの眼において、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のＲＰＥ特異的発現を誘導する。

本開示を詳細に記載してきたが、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変更形態、変形形態及び均等の態様が可能であることが明らかであろう。さらに、本開示における全ての実施例は、非限定的な実施例として提供されていることが理解されるべきである。例えば、全ての特許、公開された特許出願及び非特許刊行物を含む、本明細書中に引用されたいかなる参照文献もその全体が参照により援用される。

関連出願の相互参照及び配列表の組み込み
本出願は、２０１９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，２５７号明細書の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年７月３０日に作成された、１４０，８２７バイト（オペレーティングシステムＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＰＡＴ０５８４６８－ＷＯ－ＰＣＴ ＳＱＬ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、コザック配列も含み得る。コザック配列は、真核生物のｍＲＮＡに存在し、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ配列（配列番号５５）を有し、翻訳プロセスの開始に関与する配列である。コザック配列は、ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列のすぐ上流に位置し得る。いくつかの実施形態では、コザック配列は、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１２）である。代わりに、ベクターゲノム、例えば一本鎖ベクターゲノムは、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号５１）、ＧＡＣＡＣＣ（配列番号５２）又はＧＣＣＡＣＧ（配列番号５３）のコザック配列を含む。

Claims (20)

1. ５’から３’の方向に、
   （ｉ）５’ＩＴＲ；
   （ｉｉ）プロモーター；
   （ｉｉｉ）ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む組換えヌクレオチド配列；
   （ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列；及び
   （ｖ）３’ＩＴＲ
   を含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。
2. 前記プロモーターは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）特異的プロモーターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
3. 前記プロモーターは、ＰｒｏＡ１８プロモーターである、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
4. 前記プロモーターは、配列番号２に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
5. 前記プロモーターは、ＰｒｏＢ４プロモーターである、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
6. 前記プロモーターは、配列番号３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
7. 前記ベクターゲノムは、前記ポリＡシグナル配列と前記３’ＩＴＲとの間に配置されたスタッファー配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
8. 前記５’ＩＴＲは、配列番号１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
9. 前記ＣＹＰ４Ｖ２コード配列は、配列番号１３、１４、３９、４１、４３、４５、４７又は４９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
10. ポリＡシグナルは、配列番号１８又は１９に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
11. 配列番号９、１０又は１１に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むイントロン配列をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
12. １）Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）若しくはウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）配列を含む調節エレメント、及び／又は２）前記ＣＹＰ４Ｖ２コード配列を含む前記組換えヌクレオチド配列のすぐ上流に位置するコザック配列をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
13. 前記ベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
    ｉ）配列番号１、２、１３、１８、及び２２；
    ｉｉ）配列番号１、３、１３、１８、及び２２；
    ｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１８、及び２２；
    ｉｖ）配列番号１、３、１４、１８、及び２２；
    ｖ）配列番号１、２、１３、１９、及び２２；
    ｖｉ）配列番号１、３、１３、１９、及び２２；
    ｖｉｉ）配列番号１、２、１４、１９、及び２２；
    ｖｉｉｉ）配列番号１、３、１４、１９、及び２２；
    ｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１８、及び２２；
    ｘ）配列番号１、３、９、１３、１８、及び２２；
    ｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１８、及び２２；
    ｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１８、及び２２；
    ｘｉｉｉ）配列番号１、２、９、１３、１９、及び２２；
    ｘｉｖ）配列番号１、３、９、１３、１９、及び２２；
    ｘｖ）配列番号１、２、９、１４、１９、及び２２；
    ｘｖｉ）配列番号１、３、９、１４、１９、及び２２；
    ｘｖｉｉ）配列番号１、２、１３、１６、１８、及び２２；
    ｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１８、及び２２；
    ｘｉｘ）配列番号１、２、１４、１６、１８、及び２２；
    ｘｘ）配列番号１、３、１４、１６、１８、及び２２；
    ｘｘｉ）配列番号１、２、１３、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｉｉ）配列番号１、３、１３、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｉｉｉ）配列番号１、２、１４、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｉｖ）配列番号１、３、１４、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｖ）配列番号１、２、９、１３、１６、１８、及び２２；
    ｘｘｖｉ）配列番号１、３、９、１３、１６、１８、及び２２；
    ｘｘｖｉｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１８、及び２２；
    ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１８、及び２２；
    ｘｘｉｘ）配列番号１、２、９、１３、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｘ）配列番号１、３、９、１３、１６、１９、及び２２；
    ｘｘｘｉ）配列番号１、２、９、１４、１６、１９、及び２２；並びに
    ｘｘｘｉｉ）配列番号１、３、９、１４、１６、１９、及び２２
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
14. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８、９、２又は５カプシドをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
15. １）それぞれ配列番号２８、２９及び３０に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ９カプシド；又は２）配列番号２７に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶ９カプシドをさらに含む、請求項１４に記載のウイルスベクター。
16. １）それぞれ配列番号２４、２５及び２６に対して約９０％以上の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ８カプシド；又は２）配列番号２３に対して約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶ８カプシドをさらに含む、請求項１４に記載のウイルスベクター。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む組成物。
18. 網膜細胞において異種ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を発現させる方法であって、前記網膜細胞を請求項１～１６のいずれか一項に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法。
19. Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症（ＢＣＤ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１７に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
20. ＢＣＤを有する対象の視力を改善するか、視覚機能若しくは機能的視覚を改善するか、又は視覚機能若しくは機能的視覚の低下を抑制する方法であって、請求項１７に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
    

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