DE60209193T2

DE60209193T2 - Verfahren zur Identifizierung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) Sequenzen sowie Kit zur Ausführung der Methode

Info

Publication number: DE60209193T2
Application number: DE2002609193
Authority: DE
Inventors: Guangping Rosemont Gao; James M. Gladwyne Wilson; Maricio Philadelphia Alvira
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2022-11-13
Also published as: IL227866A; IL161827A0; PL404537A1; IL221602A; US20210285012A1; BRPI0214119B8; DK1310571T3; CN103555677A; PL409838A1; US10308958B2; WO2003042397A3; BRPI0214119B1; NO20131359L; NZ578982A; US8906675B2; CA2945734A1; CA3159060C; US10041090B2; IL234063A; ZA200403360B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei dem adeno-assoziierten Virus (AAV), einem Mitglied der Familie Parvovirus, handelt es sich um ein kleines, icosahedrisches Virus ohne Hülle mit linearen Einzelstrang-DNA-Genomen von 4,7 Kilobasen (kb) bis 6 kb. AAV wird dem Genus Dependovirus zugeordnet, da das Virus als eine Verunreinigung in gereinigten Adenovirus-Stammlösungen entdeckt wurde. Der AAV-Lebenszyklus beinhaltet eine Latenzphase, in der AAV-Genome nach der Infektion stellenspezifisch in Wirtschromosomen integriert werden, sowie eine infektiöse Phase, in der nach einer Infektion mit entweder Adenovirus oder Herpes-Simplex-Virus die integrierten Genome anschließend gerettet, repliziert und in infektiöse Viren verpackt werden. Die Eigenschaften Nichtpathogenität, breites Infektiositätswirtsspektrum, einschließlich nichtteilender Zellen, sowie potentielle stellenspezifische chromosomale Integration machen das AAV zu einem attraktiven Werkzeug für den Gentransfer.
In jüngeren Studien wurde vorgeschlagen, daß AAV-Vektoren das bevorzugte Vehikel für die Gentherapie darstellen können. Bislang konnten sechs unterschiedliche AAV-Serotypen aus dem Menschen oder nichtmenschlichen Primaten (non-humanprimates, NHP) isoliert und gut charakterisiert werden. Unter diesen handelt es sich bei den menschlichen Serotyp 2 um das erste AAV, das als Gentransfervektor entwickelt wurde und das eine breite Anwendung in effizienten Gentransferexperimenten in unterschiedlichen Zielgeweben und Tiermodellen fand. Auf adeno-assoziiertem Virus Typ 1 beruhende Gentherapievektoren sind ebenso bekannt (Xiao et al. J. Virology; May 1999; S. 3994–4008). Zur Zeit finden klinische Versuchsreihen der experimentellen Anwendung von Vektoren auf AAV2-Basis auf gewisse Modelle menschlicher Krankheiten statt, zu denen solche Krankheiten wie etwa zystische Fibrose und Hämophilie B gehören.
Ein allgemeines PCR-Verfahren, das sich zum Nachweis von menschlichen Papillomavirusarten in Hauttumoren und normaler Haut eignet, ist bekannt (Forslund et al. J. of General Virology; 1999 80; S. 2437–2443).
Wünschenswert sind auf AAV beruhende Konstrukte zur Zuführung von Genen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt wird durch die Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung unbekannter AAV-Sequenzen von zellulären DNAs verschiedener Gewebe des Menschen sowie nichtmenschlicher Primaten (NHP) unter Verwendung bioinformatischer Analyse, Genamplifikation auf PCR-Basis und Klonierungstechnologie auf Grundlage der Art der Latenz und Integration der AAVs in Abwesenheit einer Coinfektion mit Helfervirus bereitgestellt, wobei das Verfahren in Anspruch 1 unten definiert ist.
In einem weiteren Aspekt wird durch die Erfindung ein Kit zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt, wobei der Kit in Anspruch 23 unten definiert ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mit der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren gefunden, das die Fähigkeit von adeno-assoziiertem Virus (AAV), in den Zellkern einzudringen sowie in Abwesenheit einer Coinfektion mit Helfervirus in zellulärer DNA zu integrieren und eine latente Infektion zu etablieren, ausnutzt. In diesem Verfahren wird eine auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) beruhende Strategie zum Nachweis und zur Identifizierung von AAV-Sequenzen von DNAs aus aus dem Menschen und nichtmenschlichen Primaten stammenden Geweben ebenso wie aus anderen Quellen genutzt.
Nukleinsäuresequenzen lassen sich gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizieren. Bei einem solchen adeno-assoziierten Virus handelt es sich um den hier mit Serotyp 7 bezeichneten Serotyp (AAV7). Zu weiteren mit dem Verfahren identifizierten neuen adeno-assoziierten Virus-Serotypen gehören AAV10, AAV11 und AAV12.
Zu den besonders wünschenswerten AAV-Fragmenten, die identifiziert werden können, zählen die cap-Proteine, einschließlich vp1, vp2, vp3, die hypervariablen Bereiche, die rep-Proteine, einschließlich rep 78, rep 68, rep 52 und rep 40 sowie die diese Proteine codierenden Sequenzen. Dabei können diese Fragmente jeweils in verschiedenen Vektorsystemen und Wirtszellen leicht verwendet werden. Derartige Fragmente können allein, in Kombination mit anderen AAV-Sequenzen oder -Fragmenten, oder in Kombination mit Elementen aus anderen AAV- und nicht-AAV-Virussequenzen verwendet werden. In einer besonders wünschenswerten Ausführungsform enthält ein Vektor die AAV-cap- und/oder -rep-Sequenzen.
Wie hier beschrieben, werden vergleichende Gegenüberstellungen unter Verwendung eines beliebigen aus einer Vielfalt öffentlich oder kommerziell verfügbarer Multiple Sequence Alignment Programs, wie beispielsweise „Clustal W", zugänglich über Web-Server im Internet, durchgeführt. Als Alternative können auch die Vektor-NTI-Nutzprogramme verwendet werden. Ebenso gibt es eine Reihe von im Fachgebiet bekannten Algorithmen, die zur Messung der Nukleotidsequenzidentität verwendet werden können, einschließlich den in den oben beschriebenen Programmen enthaltenden Algorithmen. Als weiteres Beispiel lassen sich Polynukleotidsequenzen mit Fasta, einem Programm in der GCG Version 6.1, vergleichen. Dabei liefert Fasta vergleichende Gegenüberstellungen und prozentuale Sequenzidentität der Bereiche mit der besten Überlappung zwischen den Abfrage- und Suchsequenzen. So läßt sich beispielsweise eine prozentuale Sequenzidenität zwischen Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Fasta mit seinen Grundeinstellungen (Wortgröße 6 und NOPAM-Faktor für die Scoring-Matrix), wie sie in GCG Version 6.1 vorliegen, bestimmen. Ähnliche Programme stehen für Aminosäuresequenzen zur Verfügung, beispielsweise das Programm „Clustal X". Im allgemeinen werden alle diese Programme mit ihren Grundeinstellungen verwendet, obwohl ein Fachmann diese Einstellungen je nach Bedarf ändern kann. Als Alternative kann der Fachmann einen anderen Algorithmus oder ein anderes Computerprogramm nutzen, der bzw. das wenigstens das Niveau an Identität oder vergleichender Gegenüberstellung bietet wie die oben angegebenen Algorithmen und Programme.
Der Begriff „weitgehende Homologie" oder „weitgehende Ähnlichkeit" in bezug auf eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, deutet an, daß bei einer optimalen Ausrichtung mit entsprechenden Nukleotidinsertionen oder -deletionen zu einer anderen Nukleinsäure (oder ihrem komplementären Strang) eine Nukleotidsequenzidentität in wenigstens etwa 95–99% der aneinander ausgerichteten Sequenzen folgt. Dabei besteht die Homologie vorzugsweise über die gesamte Länge der Sequenz oder ein offenes Leseraster davon oder ein anderes geeignetes Fragment, dessen Länge wenigstens 15 Nukleotide beträgt. Beispiele für geeignete Fragmente sind hier beschrieben.
Der Begriff „weitgehende Homologie" oder „weitgehende Ähnlichkeit" in bezug auf Aminosäuren oder Fragmente davon deutet an, daß bei einer optimalen Ausrichtung mit entsprechenden Aminosäureinsertionen oder -deletionen zu einer anderen Aminosäure eine Aminosäuresequenzidentität in wenigstens etwa 95–99% der aneinander ausgerichteten Sequenzen folgt. Vorzugsweise besteht die Homologie über die gesamte Länge der Sequenz oder ein Protein davon, beispielsweise ein cap-Protein, ein rep-Protein, oder ein Fragment davon, dessen Menge wenigsten 8 Aminosäuren oder noch wünschenswerter wenigstens 15 Aminosäuren beträgt. Beispiele für geeignete Fragmente sind hier beschrieben.
Unter dem Begriff „hochkonserviert" versteht man eine Identität von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 90% und stärker bevorzugt von über 97%. Die Identität wird vom Fachmann durch Zurückgreifen auf Algorithmen und Computerprogramme, die dem Fachmann bekannt sind, leicht ermittelt.
Der Begriff „Prozentsequenzidentität" oder „identisch" im Zusammenhang mit Nukleinsäuresequenzen bezieht sich auf die Reste in den beiden Sequenzen, die bei einer Ausrichtung auf maximale Übereinstimmung identisch sind. Dabei kann die Länge des Sequenzidentitätsvergleichs die gesamte Länge des Genoms, die Gesamtlänge einer gencodierenden Sequenz betragen, oder es wird ein Fragment von wenigsten etwa 500 bis 5000 Nukleotiden gewünscht. Es kann jedoch auch die Identität zwischen kleineren Fragmenten, beispielsweise mit einer Länge von wenigstens etwa 9 Nukleotiden, üblicherweise von wenigstens etwa 20 bis 24 Nukleotiden, wenigstens etwa 28 bis 32 Nukleotiden, wenigstens etwa 36 oder mehr Nukleotiden, gewünscht sein. Auf ähnliche Weise kann „Prozentsequenzidentität" leicht für Aminosäuresequenzen über die gesamte Länge eines Proteins oder ein Fragment davon bestimmt werden. Dabei beträgt die Länge eines Fragments geeigneterweise wenigstens etwa 8 Aminosäuren und kann bis zu 700 Aminosäuren betragen. Beispiele für geeignete Fragmente sind hier beschrieben.
Die AAV-Sequenzen und Fragmente davon eignen sich zur Produktion von rAAV und auch als Antisense-Zuführungsvektoren, Gentherapievektoren oder Impfstoffvektoren.
Wie hier beschrieben eignen sich die die AAV-Capsidproteine enthaltenen Vektoren insbesondere zur Verwendung in Anwendungen, bei denen die neutralisierenden Antikörper die Wirksamkeit anderer Vektoren auf AAV-Serotypbasis ebenso wie anderer Virusvektoren vermindern. Besonders vorteilhaft sind die rAAV-Vektoren bei der nochmaligen Verabreichung von rAAV sowie bei wiederholter Gentherapie.
Die Begriffe „umfassend" und „beinhaltend" sowie deren Varianten, wie sie in der gesamten vorliegenden Beschreibung sowie den Ansprüchen verwendet werden, schließen andere Komponenten, Elemente, ganze Zahlen, Schritte und dergleichen mit ein. Umgekehrt schließen der Begriff „bestehend aus" und seine Varianten andere Komponenten, Elemente, ganze Zahlen, Schritte und dergleichen nicht mit ein.
I. Erfindungsgemäße Verfahren
A. Nachweis von Sequenzen über molekulares Klonieren
In einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Identifizierung von (unbekannten) Zielnukleinsäuresequenzen in einer Probe bereitgestellt. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von Virussequenzen, die in das Chromosom einer Zelle integriert sind, beispielsweise unter anderem von adeno-assoziierten Viren (AAV) und Retroviren.
Bei einer Probe, wie sie hier verwendet wird, handelt es sich um eine beliebige Quelle, die Nukleinsäuren enthält, beispielsweise Gewebe, Gewebekultur, Zellen, Zellkultur, sowie biologische Flüssigkeiten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Urin und Blut. Bei diesen Nukleinsäuresequenzen kann es sich um DNA oder RNA aus Plasmiden, natürliche DNA oder RNA aus einer beliebigen Quelle, einschließlich Bakterien, Hefe, Viren und höheren Organismen, wie beispielsweise Pflanzen oder Tieren, handeln. DNA oder RNA wird aus der Probe mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten Techniken, wie etwa dem von Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory) beschriebenen, extrahiert. Dabei stellt der Ursprung der Probe sowie das Verfahren, mit dem die Nukleinsäuren zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Gegebenenfalls läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren direkt an der Quelle der DNA oder an aus einer Quelle (z.B. durch Extraktion) erhaltenen Nukleinsäuren durchführen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine DNA-haltige Probe einer Amplifikation über die Polymerasekettenreaktion (PCR) unterzogen, wobei ein erster Satz von für einen ersten Bereich doppelsträngiger Nukleinsäuresequenzen spezifischen Primern verwendet wird, wodurch amplifizierte Sequenzen erhalten werden.
Die „Bereiche", wie hier verwendet, sind jeweils auf Grundlage der vergleichenden Gegenüberstellung der Nukleinsäuresequenzen von wenigstens zwei Serotypen (z.B. AAV) oder Stämmen (z.B. Lentiviren) vorgegeben, wobei die Bereiche jeweils aus Sequenzen mit einem hochkonservierten 5'-Ende, einem variablen Mittelstück sowie einem hochkonservierten 3'-Ende zusammengesetzt sind, wobei diese Sequenzen jeweils relativ zu den Sequenzen von wenigstens AAV1–AAV6 konserviert oder variabel sind. Die 5'- und 3'-Enden sind über wenigstens 18 Basenpaare (bp) hochkonserviert. Allerdings können eine oder beide Sequenzen am 5'- oder 3'-Ende über mehr als 18 bp, mehr als 25 bp, mehr als 30 bp oder mehr als 50 bp am 5'-Ende konserviert sein. Im Hinblick auf den variablen Bereich sind keine konservierten Sequenzen erforderlich, und diese Sequenzen können relativ konserviert sein oder weniger als 90, 80 oder 70% Identität zwischen den gegenübergestellten Serotypen oder Stämmen aufweisen.
Die Bereiche können jeweils eine Menge von etwa 100 bp bis etwa 10 Kilobasenpaaren umfassen, vorausgesetzt, daß der erste Bereich eine Länge von wenigstens 250 bp aufweist. Allerdings ist es besonders wünschenswert, daß es sich bei einem der Bereiche um einen „Signaturbereich" handelt, d.h. einen Bereich, der ausreichend einmalig ist, um die amplifizierte Sequenz hinsichtlich ihres Ursprungs von der Zielquelle positiv zu identifizieren. So beträgt in einer Ausführungsform beispielsweise die Länge des ersten Bereichs etwa 250 bp, wobei letzterer ausreichend einmalig unter bekannten AAV-Sequenzen ist, daß er den amplifizierten Bereich hinsichtlich seines AAV-Ursprungs positiv identifiziert. Ferner sind die variablen Sequenzen innerhalb dieses Bereichs ausreichend einmalig, daß sie sich zur Identifizierung des Serotyps, aus dem die amplifizierten Sequenzen stammen, verwenden lassen. Nach ihrer Amplifikation (und ihrem damit erfolgten Nachweis) können die Sequenzen identifiziert werden, indem man eine herkömmliche Restriktionsverdauung sowie einen Vergleich mit Restriktionsverdauungsmustern für diesen Bereich, der durch die vorliegende Erfindung vorgegeben und bereitgestellt wird, in einem der Serotypen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 oder AAV6 oder den von AAV7, AAV10, AAV11, AAV12 oder eines der anderen erfindungsgemäß identifizierten neuen Serotypen durchführt.
Mit der hier bereitgestellten Anleitung kann der Fachmann derartige Bereiche unter anderen integrierten Viren leicht identifizieren, um den leichten Nachweis und die Identifizierung dieser Sequenzen zu gestatten. Anschließend kann ein optimaler Satz generischer Primer, die innerhalb der hochkonservierten Enden lokalisiert sind, konstruiert und auf die effiziente Amplifikation des ausgewählten Bereichs aus Proben getestet werden. Dieser erfindungsgemäße Aspekt läßt sich leicht an einen diagnostischen Kit zum Nachweis des Vorhandenseins der Zielsequenz (z.B. AAV) und zur Identifizierung des AAV-Serotyps anpassen, wobei Standards verwendet werden, die die Restriktionsmuster für die hier beschriebenen oder mit den hier beschriebenen Techniken isolierten AAV-Serotypen beinhalten. So kann beispielsweise die schnelle Identifizierung oder die molekulare Serotypisierung von PCR-Produkten durch Verdauen der PCR-Produkte und Vergleichen der Restriktionsmuster bewerkstelligt werden.
Somit umfaßt in einer Ausführungsform der „Signaturbereich" für AAV etwa bp 2800 bis etwa 3200 von AAV1 [SEQ ID NO:6], sowie entsprechende Basenpaare in AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6. Noch wünschenswerter weist der Bereich etwa 250 bp auf, die innerhalb von bp 2886 bis etwa bp 3143 von AAV1 [SEQ ID NO:6] sowie den entsprechenden Basenpaaren in AAV2 [SEQ ID NO:7], AVV3 [SEQ ID NO8] und anderen AAV-Serotypen lokalisiert sind. Um den schnellen Nachweis von AAV in der Probe zu gestatten, werden Primer eingesetzt, mit denen dieser Signaturbereich spezifisch amplifiziert wird. Allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf die exakten, hier für den AAV-Signaturbereich identifizierten Sequenzen beschränkt, da der Fachmann diesen Bereich leicht ändern kann, damit letzterer ein kürzeres Fragment oder ein längeres Fragment dieses Signaturbereichs umfaßt.
Die PCR-Primer werden mit dem Fachmann bekannten Techniken erzeugt. Dabei setzen sich die PCR-Primersätze jeweils aus einem 5'-Primer und einem 3'-Primer zusammen. Siehe beispielsweise Sambrook et al., zitiert hierin. Der Begriff „Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das als Startpunkt für die Synthese fungiert, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primerverlängerungsprodukts induziert wird. Bei dem Primer handelt es sich vorzugsweise um einen Einzelstrang. Allerdings wird bei Verwendung eines Einzelstrang-Primers dieser zur Trennung seiner Stränge behandelt, bevor er zur Herstellung von Verlängerungsprodukten eingesetzt wird. Die Primer können etwa 15 bis 25 oder mehr Nukleotide und vorzugsweise wenigstens 18 Nukleotide aufweisen. Für bestimmte Anwendungen werden allerdings kürzere Nukleotide, beispielsweise 7 bis 15 Nukleotide, benutzt.
Die Primer werden so ausgewählt, daß sie zu den unterschiedlichen Strängen jeder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind, um mit deren entsprechenden Strängen zu hybridisieren. Daher muß die Primersequenz nicht die genaue Sequenz des amplifizierten Bereichs widerspiegeln. So kann beispielsweise ein nichtkomplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei die restliche Primersequenz zum Strang vollständig komplementär ist. Als Alternative können nichtkomplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingefügt werden, vorausgesetzt, daß die Primersequenz mit der Sequenz des zu amplifizierenden Strangs ausreichende Komplementarität aufweist, um damit zu hybridisieren und zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers eine Matrize zu bilden.
Die PCR-Primer für den Signaturbereich beruhen auf den hochkonservierten Sequenzen zweier oder mehr aneinander ausgerichteter Sequenzen (z.B. zweier oder mehrerer AAV-Serotypen). Auf den Primern kann weniger als die exakte Identität zwischen den zwei oder mehreren aneinander ausgerichteten AAV-Serotypen am 5'-Ende oder in der Mitte vorliegen. Jedoch entsprechen die Sequenzen am 3'-Ende der Primer einem Bereich zweier oder mehrerer aneinander ausgerichteter AAV-Serotypen, in dem eine exakte Identität über mindestens 5, vorzugsweise über mindestens 9 Basenpaare, und stärker bevorzugt über mindestens 18 Basenpaare, am 3'-Ende der Primer besteht. Somit setzt sich das 3'-Ende der Primer aus Sequenzen mit einer 100%igen Identität zu den gleichen gegenübergestellten Sequenzen über mindestens 5 Nukleotide zusammen. Es besteht jedoch die Möglichkeit, gegebenenfalls ein, zwei oder mehr degenerierte Nukleotide am 3'-Ende des Primers zu verwenden.
So wurde beispielsweise der Primersatz für den Signaturbereich von AAV auf der Grundlage eines einmaligen Bereichs innerhalb des AAV-Capsids wie folgt konstruiert. Der 5'-Primer basierte auf nt 2867–2891 von AAV2 [SEQ ID NO:7], 5'-GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3'. Der 3'-Primer wurde auf der Grundlage von nt 3096–3122 von AAV2 [SEQ ID NO:7], 5'-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-'3, konstruiert. Allerdings könnte der Fachmann den Primersatz auf der Grundlage der entsprechenden Bereiche von AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 oder auf der Grundlage der hier angegebenen Informationen, AAV7, AAV10, AAV11, AAV12 oder eines anderen neuen AAV leicht konstruiert haben. Darüber hinaus lassen sich noch weitere Primersätze zur Amplifikation dieses Signaturbereichs unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken leicht konstruieren.
B. Isolierung von Zielsequenzen
Wie hier beschrieben wird in der folgenden Erfindung ein erster Primersatz verwendet, mit dem spezifisch der Signaturbereich der Zielsequenz, z.B. eines AAV-Serotyps, amplifiziert wird, um den Nachweis des Ziels zu gestatten. In einer Situation, bei der weitere Sequenzen erwünscht sind, beispielsweise wenn ein neuer AAV-Serotyp identifiziert wird, kann der Signaturbereich verlängert werden. Somit können erfindungsgemäß ferner ein oder mehrere zusätzliche Primersätze benutzt werden.
Dabei werden diese Primersätze geeigneterweise so konstruiert, daß sie entweder den 5'- oder 3'-Primer des ersten Primersatzes und einen zweiten Primer, der für den Primersatz einmalig ist, einschließen, so daß der Primersatz einen 5' oder 3' zum Signaturbereich liegenden Bereich amplifiziert, der in einer Annealing-Reaktion entweder an das 5'-Ende oder das 3'-Ende des Signaturbereichs bindet. So setzt sich beispielsweise ein erster Primersatz aus einem 5'-Primer P1 und einem 3'-Primer P2 zur Amplifikation des Signaturbereichs zusammen. Um den Signaturbereich an seinem 3'-Ende zu verlängern, wird ein zweiter Primersatz aus Primer P1 und einem 3'-Primer P4 zusammengestellt, mit dem der Signaturbereich sowie unmittelbar stromabwärts des Signaturbereichs folgende Sequenzen amplifiziert werden. Um den Signaturbereich an seinem 5'-Ende zu verlängern, wird ein dritter Primersatz aus einem 5'-Primer P5 sowie Primer P2 zusammengestellt, so daß der Signaturbereich sowie diesem unmittelbar stromaufwärts folgende Sequenzen amplifiziert werden. Diese Verlängerungsschritte werden je nach Bedarf oder Wunsch wiederholt (oder gleichzeitig durchgeführt). Anschließend werden die aus diesen Amplifikationsschritten erhaltenen Produkte unter Verwendung herkömmlicher Schritte fusioniert, so daß eine isolierte Sequenz der gewünschten Länge produziert wird.
Wie bei dem Primersatz für den Signaturbereich werden der zweite und der dritte Primersatz so konstruiert, daß ein Bereich mit hochkonservierten Sequenzen unter den aneinander ausgerichteten Sequenzen amplifiziert wird. Die Bezugnahme hier auf den Begriff „zweiter" oder „dritter" Primersatz dient jeweils lediglich der Erörterung und betrifft nicht die Reihenfolge, in der diese Primer zu dem Reaktionsgemisch zugegeben oder zur Amplifikation verwendet werden. Der mit dem zweiten Primersatz amplifizierte Bereich wird so ausgewählt, daß er nach Amplifikation in einer Annealing-Reaktion an seinem 5'-Ende an das 3'-Ende des Signaturbereichs bindet. Auf ähnliche Weise wird der mit dem dritten Primersatz amplifizierte Bereich so ausgewählt, daß er nach Amplifikation in einer Annealing-Reaktion an seinem 3'-Ende an das 5'-Ende des Signaturbereichs bindet. Zusätzliche Primersätze können so konstruiert werden, daß die Bereiche, die damit amplifiziert werden, in einer Annealing-Reaktion entweder an das 5'-Ende oder das 3'-Ende der mit dem zweiten bzw. dritten Primersatz oder mit nachfolgenden Primersätzen gebildeten Verlängerungsprodukte binden.
So wird beispielsweise, wenn es sich bei der Zielsequenz um AAV handelt, ein erster Satz von Primern (P1 und P2) zur Amplifikation des Signaturbereichs aus der Probe verwendet. In einer wünschenswerten Ausführungsform ist dieser Signaturbereich innerhalb des AAV-Capsids lokalisiert. Ein zweiter Satz von Primern (P1 und P4) wird zur Verlängerung des 3'-Endes des Signaturbereichs bis zu einem Ort in der AAV-Sequenz, der unmittelbar vor dem AAV-3'-ITR liegt, verwendet, d.h. es wird ein Verlängerungsprodukt bereitgestellt, das das gesamte 3'-Ende des AAV-Capsids enthält, wenn der Signaturbereich als Anker verwendet wird. In einer Ausführungsform entspricht der Primer P4 nt 4435 bis 4462 von AAV2 [SEQ ID NO:7] bzw. entsprechenden Sequenzen in den anderen AAV-Serotypen. Dies führt zu einer Amplifikation eines Bereichs von ungefähr 1,6 kb, der den 0,25 kb großen Signaturbereich enthält. Ein dritter Satz von Primern (P3 und P2) wird zur Verlängerung des 5'-Endes des Signaturbereichs bis zu einem Ort in den AAV-Sequenzen, der im 3'-Ende der rep-Gene liegt, verwendet, d.h. es wird ein Verlängerungsprodukt bereitgestellt, das das gesamte 5'-Ende des AAV-Capsids enthält, wenn der Signaturbereich als Anker verwendet wird. In einer Ausführungsform entspricht der Primer P3 nt 1384 bis 1409 von AAV2 [SEQ ID NO:7] bzw. entsprechenden Sequenzen in den anderen AAV-Serotypen. Dies führt zu einer Amplifikation eines Bereichs von etwa 1,7 kb, der den 0,25 kb großen Signaturbereich enthält. Gegebenenfalls wird ein vierter Satz von Primern verwendet, um das das gesamte 5'-Ende des AAV-Capsids enthaltende Verlängerungsprodukt weiter zu verlängern, so daß dieses auch die rep-Sequenzen beinhaltet. In einer Ausführungsform entspricht der mit P5 bezeichnete Primer nt 108 bis 133 von AAV2 [SEQ ID NO:7] bzw. entsprechenden Sequenzen in den anderen AAV-Serotypen und wird in Verbindung mit dem Primer P2 verwendet.
Nach Beendigung der gewünschten Anzahl an Verlängerungsschritten werden die verschiedenen Verlängerungsprodukte zur Konstruktion einer intakten Sequenz fusioniert, wobei der Signaturbereich als Anker oder Marker dient. In dem hier angegebenen Beispiel werden AAV-Sequenzen, die zumindest ein intaktes AAV-cap-Gen enthalten, erhalten. Je nach der Anzahl der durchgeführten Verlängerungsschritte können größere Sequenzen erhalten werden.
Die Verlängerungsprodukte werden geeigneterweise mit dem Fachmann bekannten Verfahren zu einer intakten AAV-Sequenz zusammengebaut. So können die Verlängerungsprodukte beispielsweise mit DraIII verdaut werden, wodurch eine Spaltung an der im Signaturbereich lokalisierten DraIII-Stelle erfolgt, so daß Restriktionsfragmente erhalten werden, die religiert werden, so daß Produkte mit (mindestens) einem intakten AAV-cap-Gen bereitgestellt werden. Es können jedoch auch andere geeignete Techniken zum Zusammenbau der Verlängerungsprodukte zu einer intakten Sequenz benutzt werden. Siehe allgemein, Sambrook et al., hierin zitiert.
Als Alternative zu den oben beschriebenen mehreren Verlängerungsschritten ist in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform die direkte Amplifikation eines 3,1 kb großen Fragments vorgesehen, was die Isolierung von Vollängen-cap-Sequenzen gestattet. Zur direkten Amplifikation eines 3,1 kb großen Vollängen-cap-Fragments aus NHP-Gewebe und -Blut-DNAs wurden zwei hochkonservierte Bereiche in AAV-Genomen zur Verwendung in der PCR-Amplifikation großer Fragmente identifiziert. Ein Primer mit einem in der Mitte des rep-Gens lokalisierten konservierten Bereich (AV1ns: 5' GCTGCGTCAACTFFACTGGACCAATGAGAAC 3', nt ist von SEQ ID NO:6) in Kombination mit dem in einem weiteren konservierten Bereich stromabwärts des cap-Gens lokalisierten 3'-Primer (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID NO:7) zur Amplifikation von AAV-Sequenzen, einschließlich des Vollängen-AAV-cap, eingesetzt. Die Produkte werden typischerweise nach der Amplifikation kloniert, und es wird eine Sequenzanalyse mit einer Genauigkeit von ≥ 99,9% durchgeführt. Mit diesem Verfahren wurden von den Erfindern wenigstens 50 Capsid-Klone isoliert, die anschließend charakterisiert wurden. Unter diesen stammten 37 Klone aus Geweben des Rhesusaffen (rh.1–rh.37) 6 Klone aus Javaneraffen (cynomologous macaques; cy.1–cy.6), 2 Klone aus Pavianen (bb.1 und bb.2) sowie 5 Klone aus Schimpansen (ch.1–ch.5). Diese Klone sind an anderer Stelle in der Beschreibung identifiziert, und zwar zusammen mit der Tierspezies, aus der sie identifiziert wurden, sowie den Geweben in demjenigen Tier, in dem diese neuen Sequenzen lokalisiert wurden.
II. Diagnostischer Kit
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein diagnostischer Kit mit der in Anspruch 23 unten angegebenen Bedeutung zum Nachweis des Vorhandenseins eines unbekannten adeno-assoziierten Virus (AAV) in einer Probe bereitgestellt. Ein derartiger Kit kann einen ersten Satz von 5'- und 3'-PCR-Primern enthalten, die für einen Signaturbereich der AAV-Nukleinsäuresequenz spezifisch sind. Alternativ oder zusätzlich kann ein solcher Kit einen ersten Satz aus 5'- und 3'-PCR-Primern enthalten, die für das 3,1 kb große Fragment, das die hier identifizierte Vollängen-AAV-Capsidnukleinsäuresequenz beinhaltet, spezifisch sind (z.B. die Primer AV1ns und AV2cas). Ein erfindungsgemäßer Kit kann gegebenenfalls ferner zwei oder mehr zusätzliche Sätze von 5'- und 3'-Primern, wie hier beschrieben und/oder PCR-Sonden enthalten. Diese Primer bzw. Sonden werden gemäß der vorliegenden Erfindung zur Amplifikation von Signaturbereichen eines jeden AAV-Serotyps, beispielsweise mit quantitativer PCR, verwendet.
Ein derartiger Kit kann ferner ein oder mehrere Restriktionsenzyme, Standards für AAV-Serotypen, durch die deren „Signatur-Restriktionsenzymverdauungsanalysen" bereitgestellt werden, und/oder andere Mittel zur Bestimmung des Serotyps des nachgewiesenen AAV beinhalten.
Darüber hinaus können erfindungsgemäße Kits Anweisungen, eine negative und/oder positive Kontrolle, Behälter, Verdünnungsmittel und Puffer für die Probe, Indikatortafeln für Signaturvergleiche, Einweghandschuhe, Dekontaminationsanweisungen, Stäbchen oder Behälter zum Auftragen sowie Gefäße zur Probenpräparation ebenso wie beliebige gewünschte Reagentien, einschließlich Medien, Waschreagentien und Konzentrationsreagentien beinhalten. Derartige Reagentien können leicht unter den hier beschriebenen Reagentien sowie unter herkömmlichen Konzentrationsreagentien ausgewählt werden. In einer wünschenswerten Ausführungsform handelt es sich bei dem Waschreagenz um eine isotonische Kochsalzlösung, die auf physiologischen pH gepuffert wurde, wie beispielsweise Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS); das Elutionsreagenz ist PBS mit 0,4 M NaCl und den Konzentrationsreagentien und -vorrichtungen. So ist für einen Fachmann beispielsweise erkennbar, daß Reagentien, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder NH₄SO₄ geeignet sind oder daß Vorrichtungen, wie beispielsweise Filtervorrichtungen, z.B. eine Filtervorrichtung mit einer 100-K-Membran, rAAV konzentrieren würden.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Kits eigenen sich zur Durchführung der hier beschriebenen Verfahren sowie zur Untersuchung der Bioverteilung, Epidemiologie, Übertragungsweise neuer AAV-Serotypen beim Menschen und bei NHPs.
Somit gestatten die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits die Identifizierung von Ziel-AAV-Sequenzen, insbesondere integrierten AAV-Sequenzen.
In einem erwähnenswerten Beispiel wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren die Analyse klonierter AAV-Sequenzen durch die Erfinder erleichtert, wobei sich die Heterogenität proviraler Sequenzen zwischen klonierten Fragmenten aus verschiedenen Tieren herausstellte, die sich allesamt von den bekannten 6-AAV-Serotypen unterschieden, wobei die Variation hauptsächlich in hypervariablen Bereichen des Capsidproteins lokalisiert war. Eine überraschende Divergenz von AAV-Sequenzen wurde in Klonen festgestellt, die aus einzelnen Gewebequellen, wie beispielsweise Lymphknoten, aus einem individuellen Rhesusaffen isoliert wurden. Diese Heterogenität läßt sich am besten mit der offensichtlichen Evolution der AAV-Sequenz innerhalb individueller Tiere erklären, die teilweise auf ausgiebige homologe Rekombination zwischen einer begrenzten Anzahl coinfizierender parenteraler Viren zurückzuführen ist. Diese Untersuchungen lassen auf eine Sequenzevolution von weit verstreutem Virus während einer natürlichen AAV-Infektion schließen, die vermutlich zur Ausbildung von Schwärmen von quasi Spezies führt, die sich voneinander in der Anordnung der hypervariablen Capsidbereiche unterscheiden. Dabei handelt es sich hier um das erste Beispiel einer schnellen molekularen Evolution eines DNA-Virus auf eine Weise, von der bislang angenommen wurde, daß sie auf RNA-Viren beschränkt ist.
Es werden Sequenzen mehrerer mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierter neuer AAV-Serotypen sowie die Charakterisierung dieser Serotypen bereitgestellt.
III. Neue AAV-Serotypen
A. Nukleinsäuresequenzen
Es werden Nukleinsäuresequenzen neuer, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierter AAV-Serotypen bereitgestellt. Siehe SEQ ID NO:1, 9–59 und 117–120. Siehe auch sowie das Sequenzprotokoll.
Die Vollängen-Sequenzen, einschließlich AAV-5'-ITRs, Capsid, rep und AAV-3'-ITRs, für den neuen Serotyp AAV7 sind in SEQ ID NO:1 angegeben.
Für andere neue AAV-Serotypen wird das ungefähr 3,1 kb große gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Fragment bereitgestellt. Dieses Fragment enthält für das Vollängen-Capsidprotein codierende Sequenzen sowie die gesamten oder einen Teil der für das rep-Protein codierenden Sequenzen. Zu diesen Sequenzen gehören die nachfolgend identifizierten Klone.
Für noch weitere neue AAV-Serotypen wird der für das Capsidprotein codierende Signaturbereich bereitgestellt. So gehören beispielsweise zu den AAV10-Nukleinsäuresequenzen die in See, SEQ ID NO:117, umfassend 255 Basen, dargestellten Sequenzen. Zu den AAV11-Nukleinsäuresequenzen gehören die in SEQ ID NO:118, umfassend 258 Basen, dargestellten DNA-Sequenzen. Zu den AAV12-Nukleinsäuresequenzen gehören die in SEQ ID NO:119, das aus 255 Basen besteht, dargestellten DNA-Sequenzen. Unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik lassen sich weitere AAV10-, AAV11- und AAV12-Sequenzen leicht identifizieren und für verschiedene Zwecke einsetzen, einschließlich der für AAV7 und die anderen neuen Serotypen hierin beschriebenen Sequenzen.
Zu den neuen, erfindungsgemäßen identifizierten NHP-Sequenzen gehören die in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführten Sequenzen, die durch die Klonnummer identifiziert werden:
Tabelle 1
Ein neuer NHP-Klon wurde durch Spleißen von Capsidfragmenten zweier Adenoviren aus Schimpanse in ein AV2-rep-Konstrukt hergestellt. Dieser neue Klon A3.1 wird auch als Ch.5 bezeichnet [SEQ ID NO:20]. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung zwei menschliche AAV-Sequenzen mit der Bezeichnung H6 [SEQ ID NO:25] und H2 [SEQ ID NO:26].
Die AAV-Nukleinsäuresequenzen umfassen ferner den Strang, der zu den in den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen [SEQ ID NO:1, 9–59, 117–120] bereitgestellten Strängen komplementär ist, Nukleinsäuresequenzen, ebenso wie die den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen [SEQ ID NO:1, 9–59, 117–120] entsprechenden RNA- und cDNA-Sequenzen sowie deren komplementäre Stränge. Ebenso beinhalten die Nukleinsäuresequenzen natürliche Varianten und gentechnisch hergestellte Modifikationen der Sequenzen des Sequenzprotokolls [SEQ ID NO:1, 9–59, 117–120] sowie deren komplementäre Stränge. Zu solchen Modifikationen zählen beispielsweise Markierungen, die im Fachgebiet bekannt sind, Methylierung sowie die Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem degenerierten Nukleotid.
Ferner umfaßt sind Nukleinsäuresequenzen, die mehr als 85%, vorzugsweise wenigstens etwa 90%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 95% und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 98–99% identisch oder homolog zu den erfindungsgemäßen Sequenzen, einschließlich des Sequenzprotokolls [SEQ ID NO:1, 9–59, 117–120], sind. Diese Begriffe besitzen die hier angegebene Bedeutung.
Ebenso umfaßt sind Fragmente der neuen, mit den hier beschriebenen Verfahren identifizierten AAV-Sequenzen. Geeignete Fragmente weisen eine Länge von wenigsten 15 Nukleotiden auf und umfassen funktionelle Fragmente, d.h. Fragmente, die von biologischem Interesse sind. In einer Ausführungsform handelt es sich bei diesen Fragmenten um Fragmente der neuen Sequenzen des Sequenzprotokolls [SEQ ID NO:1, 9–59, 117–120], deren komplementären Stränge, dazu komplementäre cDNA und RNA.
Beispiele für geeignete Fragmente werden im Hinblick auf die Lokalisation dieser Fragmente auf AAV1, AAV2 oder AAV7 bereitgestellt. Allerdings kann der Fachmann unter Verwendung der hier bereitgestellten vergleichenden Gegenüberstellung (erhalten mit dem Programm Clustal W mit Grundeinstellungen) oder ähnlichen Techniken zur Erzeugung einer vergleichenden Gegenüberstellung mit anderen neuen erfindungsgemäßen Serotypen leicht die genauen Nukleotidstart- und -stoppcodons für gewünschte Fragmente identifizieren.
Zu geeigneten Fragmenten gehören beispielsweise die für die drei variablen Proteine (vp) des AAV-Capsids codierenden Sequenzen, bei denen es sich um alternative Spleißvarianten handelt: vp1 [z.B. nt 825 bis 3049 von AAV7, SEQ ID NO:1], vp2 [z.B. nt 1234 bis 3049 von AAV7, SEQ ID NO:1] und vp3 [z.B. nt 1434–3049 von AAV7, SEQ ID NO:1]. Bemerkenswerterweise weist AAV7 ein ungewöhnliches GTG-Startcodon auf. Mit der Ausnahme einiger weniger Haushaltsgene (= house-keeping genes) ist ein solches Startcodon bislang in DNA-Viren nicht bekannt gewesen. Es wurde angenommen, daß die Startcodons für vp1, vp2 und vp3 bei anderen AAV-Serotypen dergestalt sind, daß sie den zellulären Mechanismus der Wirtszelle, in der sie vorliegen, die Produktion von vp1, vp2 bzw. vp3 in einem Verhältnis von 10%:10%:80% gestatten, um einen effizienten Zusammenbau des Virions zu erlauben. Es stellte sich jedoch heraus, daß das AAV7-Virion selbst mit diesem seltenen GTG-Startcodon effizient zusammengebaut wird. Somit erwarten die Erfinder, daß es wünschenswert ist, das Startcodon des vp3 anderer AAV-Serotypen zu verändern, so daß diese dieses seltene GTG-Startcodon enthalten, um die Verpackungseffizienz zu verbessern, die Virionstruktur zu verändern und/oder die Lokalisierung von Epitopen (z.B. neutralisierender Antikörperepitope) anderer AAV-Serotypen zu verändern. Dabei können die Startcodons mit herkömmlichen Techniken, einschließlich z.B. stellengerichteter Mutagenese, verändert werden. Bei den veränderten AAV-Virionen kann es sich um einen beliebigen ausgewählten Serotyp handeln, der sich aus einem vp3 und/oder gegebenenfalls vp1 und/oder vp2 mit zu GTG geänderten Startcodons zusammensetzt.
Zu weiteren geeigneten AAV-Fragmenten gehört ein Fragment mit dem Startcodon für das AAV-Capsidprotein [z.B. nt 468 bis 3090 von AAV7, SEQ ID NO:1, nt 725 bis 3090 von AAV7, SEQ ID NO:1 und entsprechende Bereiche der anderen AAV-Serotypen]. Zu weiteren Fragmenten von AAV7 und den anderen mit den hier beschriebenen Verfahren identifizierten neuen AAV-Serotypen gehören solche, die für die rep-Proteine codieren, einschließlich rep 78 [z.B. Startcodon 334 für AAV7], rep 68 [Startcodon nt 334 für AAV7], rep 52 [Startcodon 1006 für AAV7] und rep 40 [Startcodon 1006 für AAV7]. Andere interessierende Fragmente können die AAV-5'-ITRs (inverted terminal repeats) [nt 1 bis 107 für AAV7]; die AAV-3'-ITRs [nt 4704 bis 4721 für AAV7], P19-Sequenzen, AAV-P40- Sequenzen, die rep-Bindungsstelle sowie die TRS (terminal resolute site) umfassen. Noch weitere geeignete Fragmente sind dem Fachmann leicht ersichtlich.
Zusätzlich zu den in den Figuren und dem Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuresequenzen gibt es Nukleinsäuremoleküle und -sequenzen, die zur Expression der Aminosäuresequenzen, Proteine und Peptide der erfindungsgemäßen AAV-Serotypen vorgesehen sind. Zu diesen gehören Nukleinsäuresequenzen, die für die folgenden neuen AAV-Aminosäuresequenzen codieren: C1 [SEQ ID NO:60], C2 [SEQ ID NO:61], C5 [SEQ ID NO:62], A3-3 [SEQ ID NO:66], A3-7 SEQ ID NO:67], A3-4 [SEQ ID NO:68], A3-5 [SEQ ID NO:69], 3.3b [SEQ ID NO:62], 223.4 [SEQ ID NO:73], 223-5 [SEQ ID NO:74], 223-10 [SEQ ID NO:75], 223-2 [SEQ ID NO:76], 223-7 [SEQ ID NO:77], 223-6 [SEQ ID NO:78], 44-1 [SEQ ID NO:79], 44-5 [SEQ ID NO:80], 44-2 [SEQ ID NO:81], 42-15 [SEQ ID NO:84], 42-8 [SEQ ID NO:85], 42-13 [SEQ ID NO:86], 42-3A [SEQ ID NO:87], 42-4 [SEQ ID NO:88], 42-5A [SEQ ID NO:89], 42-1B [SEQ ID NO:90], 42-5B [SEQ ID NO:91], 43-1 [SEQ ID NO:92], 43-12 [SEQ ID NO:93], 43-5 [SEQ ID NO:94], 43-21 [SEQ ID NO:96], 43-25 [SEQ ID NO:97], 43-20 [SEQ ID NO:99], 24.1 [SEQ ID NO:101], 42.2 [SEQ ID NO:102], 7.2 [SEQ ID NO:103], 27.3 [SEQ ID NO:104], 16.3 [SEQ ID NO:105], 42.10 [SEQ ID NO:106], 42-38 [SEQ ID NO:107], 42-11 [SEQ ID NO:108], F1 [SEQ ID NO:109], F5 [SEQ ID NO:110], F3 [SEQ ID NO:111], 42-6B [SEQ ID NO:112] und/oder 42-12 [SEQ ID NO:113] sowie unter Verwendung dieser Sequenzen und/oder einmaliger Fragmente davon erzeugte künstliche AAV-Serotypen.
Zu künstlichen AAV-Serotypen, wie sie hier verwendet werden, zählt, ohne darauf beschränkt zu sein, AAV mit einem nicht natürlich vorkommenden Capsidprotein. Ein derartiges künstliches Capsid kann mit einer beliebigen geeigneten Technik erzeugt werden, wobei eine neue AAV-Sequenz (z.B. ein Fragment eines vp1-Capsidproteins) in Kombination mit heterologen Sequenzen, die aus einem anderen AAV-Serotyp (bekannt oder neu), nicht unmittelbar folgenden Anteilen des gleichen AAV-Serotyps, aus einer nicht-AAV-Virusquelle oder aus einer nichtviralen Quelle stammen können, eingesetzt wird. Bei einem künstlichen AAV-Serotyp kann es sich, ohne darauf beschränkt zu sein, um ein chimärisches AAV-Capsid, ein rekombinantes AAV-Capsid oder ein „humanisiertes" AAV-Capsid handeln.
B. AAV-Aminosäuresequenzen, -proteine und -peptide
Erfindungsgemäß werden Proteine und Fragmente davon bereitgestellt, die durch die Nukleinsäuresequenzen der hier identifizierten neuen AAV-Serotypen codiert werden, einschließlich z.B. AAV7 [nt 825 bis 3049 von AAV7, SEQ ID NO:1], den anderen hier bereitgestellten neuen Serotypen. Somit lassen sich die Capsidproteine der erfindungsgemäßen neuen Serotypen, einschließlich H6 [SEQ ID NO:25], H2 [SEQ ID NO:26], 42-2 [SEQ ID NO:9], 42-8 [SEQ ID NO:27], 42-15 [SEQ ID NO:28], 42-5b [SEQ ID NO:29], 42-1b [SEQ ID NO:30], 42-13 [SEQ ID NO:31], 42-3a [SEQ ID NO:32], 42-4 [SEQ ID NO:33], 42-5a [SEQ ID NO:34], 42-10 [SEQ ID NO:35], 42-3b [SEQ ID NO:36], 42-11 [SEQ ID NO:37], 42-6b [SEQ ID NO:38], 43-1 [SEQ ID NO:39], 43-5 [SEQ ID NO:40], 43-12 [SEQ ID NO:41], 43-20 [SEQ ID NO:42], 43-21 [SEQ ID NO:43], 43-23 [SEQ ID NO:44], 43-25 [SEQ ID NO:45], 44.1 [SEQ ID NO:47], 44.5 [SEQ ID NO:47], 223.10 [SEQ ID NO:48], 223.2 [SEQ ID NO:49], 223.4 [SEQ ID NO:50], 223.5 [SEQ ID NO:51], 223.6 [SEQ ID NO:52], 223.7 [SEQ ID NO:53], A3.4 [SEQ ID NO:54], A3.5 [SEQ ID NO:55], A3.7 [SEQ ID NO:56], A3.3 [SEQ ID NO:57], 42.12 [SEQ ID NO:58] und 44.2 [SEQ ID NO:59], mit herkömmlichen Techniken aus dem für die oben aufgeführten Klone bereitgestellten offenen Leserastern leicht erzeugen.
Die Sequenzen, Proteine und Fragmente können mit beliebigen Mitteln, einschließlich rekombinanter Produktion, chemischer Synthese oder anderen synthetischen Mitteln, hergestellt werden. Derartige Herstellungsverfahren liegen im Bereich des fachmännischen Wissens.
IV. Produktion von rAAV mit neuen AAV-Capsiden
Neue, Wildtyp-AAV-Serotypen lassen sich erfindungsgemäß identifizieren, wobei die Sequenzen dieser Wildtyp-AAV-Serotypen frei von DNA und/oder Zellmaterial, womit diese Viren in der Natur assoziiert sind, sind. In einem weiteren Aspekt werden durch die vorliegende Erfindung Moleküle bereitgestellt, die die neuen erfindungsgemäßen AAV-Sequenzen, einschließlich Fragmente davon, zur Herstellung von Molekülen, die sich zur Zuführung eines heterologen Gens oder anderen Nukleinsäuresequenzen an eine Zielzelle eignen, nutzen.
In den folgenden Beispielen werden mehrere erfindungsgemäße Aspekte und Ausführungsformen veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1: PCR-Amplifikation, Klonierung und Charakterisierung neuer AAV-Sequenzen
Gewebe von nichtmenschlichen Primaten wurden einem Screening auf AAV-Sequenzen unterzogen, wobei ein PCR-Verfahren auf der Grundlage von Oligonukleotiden zu hochkonservierten Bereichen bekannter AAVs angewendet wurde. Es wurde ein Abschnitt einer AAV-Sequenz, der von bp 2886 bis 3143 von AAV1 [SEQ ID NO:6] reicht, als PCR-Amplifikat ausgewählt, in dem ein hypervariabler Bereich des Capsidproteins (Cap), der für jeden bekannten AAV-Serotyp einmalig ist und der hier als „Signaturbereich" bezeichnet wird, von konservierten Sequenzen flankiert ist. In einer späteren Analyse konnte gezeigt werden, daß dieser Signaturbereich zwischen konservierten Resten lokalisiert ist und den hypervariablen Bereich 3 überspannt.
Eine erste Übersicht über peripheres Blut aus einer Reihe nichtmenschlicher Primatenspezies zeigte nachweisbares AAV in einer Teilmenge von Tieren aus Spezies, wie beispielsweise Rhesusaffen, Javaneraffen, Schimpansen und Pavianen. Allerdings wurden in einigen anderen getesteten Spezies, einschließlich Japanmakaken, Schweinsaffen und Totenkopfaffen, keine AAV-Sequenzen nachgewiesen. Eine ausführlichere Analyse der Vektorverteilung wurde in Geweben von Rhesusaffen von Kolonien der University of Pennsylvania und Tulane durchgeführt, wobei diese Gewebe bei einer Autopsie entnommen wurden. Dies zeigte AAV-Sequenz über eine weite Anordnung von Geweben.
A. Amplifikation eines AAV-Signaturbereichs
DNA-Sequenzen von AAV1–6 sowie von aus Gans und Ente isolierten AAVs wurden unter Verwendung von „Clustal W" mit Grundeinstellungen zueinander ausgerichtet. Sequenzähnlichkeiten zwischen AAVs wurden verglichen.
Im Verlauf der Untersuchung wurde von den Erfindern ein 257 bp großer Bereich von bp 2886 bis bp 3143 von AAV1 [SEQ ID NO:6] sowie der entsprechende Bereich in den Genomen der AAV-2–6-Genome identifiziert. Dieser Bereich ist mit dem AAV-Capsidgen lokalisiert und weist hochkonservierte Sequenzen innerhalb sowohl des 5'- als auch des 3'-Endes auf, wobei die Sequenz in der Mitte relativ variabel ist. Darüber hinaus enthält dieser Bereich eine DraIII-Restriktionsenzymstelle (CACCACGTC, SEQ ID NO:15). Von den Erfindern wurde festgestellt, daß dieser Bereich als spezifische Signatur für alle bekannten Arten von AAV-DNA dient. Mit anderen Worten: nach PCR-Reaktionen, Verdauung mit Endonukleasen, die für die bekannten Serotypen jeweils spezifisch sind, und gelelektrophoretische Analyse lassen sich diese Bereiche zur definitiven Identifizierung von amplifizierter DNA als aus Serotyp 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder einem anderen Serotyp stammend verwenden.
Die Primer wurden konstruiert, verifiziert und die PCR-Bedingungen mit AAV1-, -2- und -5-DNA-Kontrollen optimiert. Die Primer beruhten auf den Sequenzen von AAV2: 5'-Primer, 15: bp 2867–2891 von AAV2 (SEQ ID NO:7) und 3'-Primer, 18as, bp 3095–3121 von AAV (SEQ ID NO:7).
Zelluläre DNAs aus unterschiedlichen Geweben, einschließlich Blut, Gehirn, Leber, Lunge, Hoden usw., verschiedener Rhesusaffen wurden unter Einsatz der oben beschriebenen Strategie untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß DNAs aus unterschiedlichen Geweben dieser Affen zu starken PCR-Amplifikationen führten. Weitere Restriktionsanalysen von PCR-Produkten deuteten darauf hin, daß diese von AAV-Sequenzen, die sich von allen veröffentlichten AAV-Sequenzen unterschieden, amplifiziert wurden.
PCR-Produkte (mit einer Größe von etwa 255 bp) von DNAs verschiedener Affengewebe wurden kloniert und sequenziert. Eine bioinformatische Untersuchung dieser neuen AAV-Sequenzen deutete an, daß es sich dabei um neue AAV-Sequenzen des Capsidgens handelt, die voneinander verschieden sind. Eine vergleichende Gegenüberstellung mehrerer Sequenzen wurde mit dem Programm Cluster w (1.81) durchgeführt. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen den Signaturbereichen der Genome von AAV 1–7 sowie AAV 10–12 ist nachfolgend aufgeführt.
Tabelle 1. Sequenzen zur Analyse
Tabelle 3. Paarweise Gegenüberstellung (prozentuale Identität)
Über 300 neue AAV-Serotypsequenzen enthaltende Klone wurden isoliert und sequenziert, wobei die Sequenzen den ausgewählten 257 bp großen Bereich überspannen. Die bioinformatische Analyse dieser mehr als 300 Klone läßt darauf schließen, daß dieser 257 bp große Bereich dahingehend kritisch ist, als daß er als guter Markie rungspunkt oder als Signatursequenz zur schnellen Isolierung und Identifizierung eines neuen AAV-Serotyps dient.
B. Verwendung des Signaturbereichs zur PCR-Amplifikation
Der 257 bp große Signaturbereich wurde als PCR-Anker zur Verlängerung von PCR-Amplifikationen in 5'-Richtung des Genoms zur Überdeckung des Übergangsbereichs der rep- und cap-Gene (1398 bp–3143 bp, SEQ ID NO:6) sowie in 3'-Richtung des Genoms zur Erhaltung der gesamten cap-Gensequenz (2866 bp–4600 bp, SEQ ID NO:6) verwendet. Die PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung der Standardbedingungen, einschließlich Denaturierung bei 95°C für 0,5–1 min Annealing bei 60–65°C für 0,5–1 min und Verlängerung bei 72°C für 1 min pro kb, mit einer Gesamtzahl von Amplifikationszyklen im Bereich von 28 bis 42 durchgeführt.
Unter Verwendung der wie in „A" aneinander ausgerichteten Sequenzen wurden zwei weitere relativ konservierte Bereiche in der im 3'-Ende der rep-Gene und 5' zum 257 bp großen Bereich lokalisierten Sequenz sowie in der Sequenz stromabwärts des 257 bp großen Fragments, jedoch vor dem AAV-3'-ITR identifiziert. Zwei neue Primersätze wurden konstruiert und die PCR-Bedingungen auf die Gewinnung des gesamten Capsids und einen Teil der rep-Sequenzen neuer AAV-Serotypen hin optimiert. Insbesondere handelte es sich für die 5'-Amplifikation bei dem 5'-Primer (AV1Ns) um GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC [nt 1398–1423 von AAV1, SEQ ID NO:6] und bei dem 3'-Primer um 18as (oben identifiziert). Für die 3'-Amplifikation handelte es sich bei dem 5'-Primer um 1s (oben identifiziert) und bei dem 3'-Primer um AV2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 4435–4462 von AAV2, SEQ ID NO:7].
In diesen PCR-Amplifikationen wurde der 257 bp große Bereich als PCR-Anker und Markierungspunkt zur Erzeugung überlappender Fragmente verwendet, so daß ein vollständiges Capsidgen durch Fusion an der DraIII-Stelle im Signaturbereich nach der Amplifikation der wie hier beschrieben erhaltenen 5'- und 3'-Verlängerungsfragmente konstruiert wurde. Insbesondere wurden zur Erzeugung des intakten AAV7-cap-Gens die drei Amplifikationsprodukte, nämlich (a) die Sequenzen des Signaturbereichs, (b) die Sequenzen der 5'-Verlängerung und (c) die Sequenzen der 3'-Verlängerung, in ein pCR4-Topo-Plasmidgrundgerüst [Invitrogen] nach den Anweisungen des Herstellers kloniert. Anschließend wurden die Plasmide mit DraIII verdaut und unter Bildung eines intakten cap-Gens rekombiniert.
Im Verlauf dieser Arbeiten wurden etwa 80% der Capsidsequenzen von AAV7 und AAV8 isoliert und analysiert. Ein weiterer neuer Serotyp, AAV9, wurde ebenso in Affe Nr. 2 entdeckt.
Unter Verwendung der oben beschriebenen PCR-Bedingungen wird der verbliebene Anteil der rep-Gensequenz für AAV7 mit den Primern, die bp 108 bis bp 1461 des AAV-Genoms (berechnet unter Bezug auf die Numerierung von AAV2, SEQ ID NO:7) amplifizieren, isoliert und kloniert. Dieser Klon wird zur Konstruktion eines vollständigen AAV7-Genoms ohne ITRs sequenziert.
C. Direkte Amplifikation des 3,1 kb großen Cap-Fragments
Zur direkten Amplifikation eines 3,1 kb großen Vollängen-cap-Fragments aus NHP-Gewebe- und -Blut-DNAs wurden zwei weitere hochkonservierte Bereiche in AAV-Genomen zur Verwendung in der PCR-Amplifikation großer Fragmente identifiziert. Zur Amplifikation von Vollängen-cap-Fragmenten wurde ein Primer in einem in der Mitte des rep-Gens lokalisierten konservierten Bereich (AV1ns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt 1398–1423 von SEQ ID NO:6) in Kombination mit dem in einem weiteren konservierten Bereich stromabwärts des cap-Gens lokalisierten 3'-Primer (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID NO:7) ausgewählt. Die PCR-Produkte wurden nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) Topo-kloniert, und es wurde eine Sequenzanalyse von Qiagengenomics (Qiagengenomics, Seattle, WA) mit einer Genauigkeit von ≥ 99,9% durchgeführt. Insgesamt wurden 50 Capsid-Klone isoliert und charakterisiert. Unter diesen stammten 37 Klone aus Geweben des Rhesusaffen (rh.1–rh.37), 6 Klone aus Javaneraffen (cynomologous macaques; cy.1–cy.6), 2 Klone aus Pavianen (bb.1 und bb.2) sowie 5 Klone aus Schimpansen (ch.1–ch.5).
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß es sich bei der Sequenzverschiedenheit innerhalb der neuen AAV-Familie nicht um ein Artifakt der PCR handelte, wie beispielsweise ein durch PCR vermitteltes Genspleißen durch überlappende Verlängerung zwischen unterschiedlichen DNA-Teilmatrizen mit homologen Sequenzen, oder um das Ergebnis des Rekombinationsprozesses in Bakterien, wurde eine Reihe von Experimenten unter identischen Bedingungen für die VP1-Amplifikation unter Verwendung zellulärer Gesamt-DNAs durchgeführt. Dabei wurden zunächst intakte AAV7- und AAV8-Plasmide im gleichen Molverhältnis gemischt und anschließend davon Verdünnungsreihen hergestellt. Die in Verdünnungsreihen verdünnten Gemische wurden als Matrizen für die PCR-Amplifikation von 3,1 kb großen VP1-Fragmenten mit Universalprimern und PCR-Bedingungen, die mit denen für DNA-Amplifikationen verwendeten Bedingungen identisch waren, verwendet, um zu sehen, ob eventuelle Hybrid-PCR-Produkte erzeugt wurden. Das Gemisch wurde in Bakterien und isolierte Transformanden transformiert, um nach Hybridklonen zu suchen, die möglicherweise aus dem Rekombinationsprozeß in Bakterienzellen hervorgegangen waren. In einem anderen Experiment wurden AAV7- und AAV8-Plasmide mit Msp I, Ava I und Hae I, die jeweils beide Genome mehre re Male an unterschiedlichen Stellen schneiden, restriktionsverdaut, die Verdauungen in unterschiedlichen Kombinationen gemischt und für die PCR-Amplifikation von VP1-Fragmenten unter den gleichen Bedingungen verwendet, um zu testen, ob eventuelle PCR-Produkte über die überlappende Sequenzverlängerung von AAV-Teilsequenzen erzeugt werden könnten. In einem weiteren Experiment wurde ein Gemisch aus dem 1,5 kb großen gelgereinigten 5'-AAV7-VP1-Fragment und dem 1,7 kb großen 3'-AAV8-VP1-Fragment mit Überlappung im Signaturbereich in einer Verdünnungsreihe verdünnt und zur PCR-Amplifikation in Gegenwart bzw. Abwesenheit von 200 ng aus einer AffenZellinie extrahierter zellulärer DNA, die nach TaqMan-Analyse frei von AAV-Sequenzen war, verwendet. Keines dieser Experimente demonstrierte eine effiziente PCR-vermittelte Produktion überlappender Sequenzen unter den Bedingungen der genomischen DNA-Cap-Amplifikation (Daten nicht gezeigt). Zur weiteren Bestätigung wurden 3 Paare von Primern, die an unterschiedlichen HVRs lokalisiert und zu den Varianten von Klon 42s aus Rhesusaffe F953 sequenzspezifisch waren, in unterschiedlichen Kombinationen konstruiert, um kürzere Fragmente von MLN (mesenteric lymph node)-DNA aus F953, aus dem Klon 42s isoliert worden war, zu amplifizieren. Dabei wurden alle in Vollängen-Cap-Klonen identifizierte Sequenzvariationen in diesen kurzen Fragmenten gefunden (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 2: Adeno-assoziierte Viren durchlaufen eine wesentliche Evolution in Primaten im Verlauf natürlicher Infektionen
Die Sequenzanalyse ausgewählter AAV-Isolate zeigte Divergenz über das gesamte Genom, die hauptsächlich in hypervariablen Bereichen der Capsidproteine konzentriert ist. Epidemiologische Daten deuten darauf hin, daß alle bekannten Serotypen in Primaten endemisch sind, obwohl die Isolierung klinischer Isolate auf AAV2 und AAV3 von analen und Rachenabstrichen aus Kleinkin dern sowie AAV5 aus einer menschlichen kondylomatösen Warze beschränkt war. Keine bekannten klinischen Folgeerscheinungen wurde mit der AAV-Infektion in Zusammenhang gebracht.
In einem Versuch zum besseren Verständnis der Biologie von AAV wurden nichtmenschliche Primaten als Modelle zur Charakterisierung der Folgeerscheinungen natürlicher Infektionen verwendet. Dabei wurden Gewebe aus nichtmenschlichen Primaten einem Screening auf AAV-Sequenzen unter Verwendung des erfindungsgemäßes PCR-Verfahrens auf der Grundlage von Oligonukleotiden zu hochkonservierten Bereichen bekannter AAVs unterzogen (siehe Beispiel 1). Ein AAV-Sequenzabschnitt, der 2886 bis 3143 bp von AAV [SEQ ID NO:6] umfaßt, wurde als PCR-Amplifikat ausgewählt, in dem konservierte Sequenzen von einem hypervariablen Bereich flankiert sind, der für jeden bekannten AAV-Serotyp einmalig ist und hier als „Signaturbereich" bezeichnet wird.
Eine erste Übersicht über peripheres Blut aus einer Reihe nichtmenschlicher Primatenspezies einschließlich Rhesusaffen, Javaneraffen, Schimpansen und Pavianen, zeigte nachweisbares AAV in einer Teilmenge von Tieren aus allen Spezies. Eine ausführlichere Analyse der Vektorverteilung wurde in Geweben von Rhesusaffen von Kolonien der University of Pennsylvania und Tulane durchgeführt, wobei diese Gewebe bei einer Autopsie entnommen wurden. Dies zeigte AAV-Sequenz über eine weite Anordnung von Geweben.
Die amplifizierten Signatursequenzen wurden in Plasmide subkloniert, wobei individuelle Transformanden einer Sequenzanalyse unterzogen wurden. Dies zeigte eine beträchtliche Variation in der Nukleotidsequenz von aus unterschiedlichen Tieren stammenden Klonen. Die Variation in der Signatursequenz wurde auch in Klonen beobachtet, die innerhalb individueller Tiere erhalten wurden. Aus zwei Tieren, in denen einmalige Signaturse quenzen identifiziert wurden, geerntete Gewebe (d.h. Colon aus 98E044 und Herz aus 98E056) wurden weiter charakterisiert, indem die mit PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden zu hochkonservierten Sequenzen amplifizierte Sequenz verlängert wurde. Auf diese Weise wurden vollständige provirale Strukturen für Virusgenome aus beiden Geweben, wie hier beschrieben, rekonstruiert. Diese Proviren unterscheiden sich von den anderen bekannten AAVs, wobei die größte Sequenzdivergenz in Bereichen des Cap-Gens beobachtet wird.
Es wurden zusätzliche Experimente durchgeführt, durch die bestätigt wurde, daß im nichtmenschlichen Primatengewebe residierende AAV-Sequenzen provirale Genome von infektiösem Virus darstellten, der gerettet werden und Virionen ausbilden kann. Genomische DNA aus Lebergewebe von Tier 98E056, in der AAV8-Signatursequenz nachgewiesen wurde, wurde mit einer Endonuklease verdaut, die keine Stelle in der AAV-Sequenz aufweist, und in 293-Zellen mit einem Plasmid, das ein E1-deletiertes Genom von menschlichem Adenovirus-Serotyp 5 als Quelle von Helferfunktionen enthält, transfiziert. Das erhaltene Lysat wurde einmal auf 293-Zellen passagiert, und das Lysat wurde gewonnen und auf das Vorhandensein von AAV-Cap-Proteinen unter Verwendung eines breit reagierenden polyklonalen Antikörpers gegen Cap-Proteine sowie auf das Vorhandensein und die Häufigkeit von DNA-Sequenzen aus dem PCR-amplifizierten AAV-Provirus, von dem AAV8 abgeleitet wurde, analysiert. Die Transfektion von Endonukleaserestriktion-behandelter Herz-DNA und dem Adenovirus-Helferplasmid ergab große Mengen an AAV8-Virus, wie durch den Nachweis von Cap-Proteinen mittels Western-Blot-Analyse und das Vorhandensein von 10⁴ AAV8-Vektorgenomen pro 293-Zelle demonstriert wurde. Aus einer Präpäration im Großmaßstab wurden Lysate hergestellt, und das AAV wurde durch Cäsiumsedimentation gereinigt. Die gereinigte Präpäration zeigte 26 nm große icosahedrische Strukturen, die denen des AAV-Serotyps 2 gleichen. Die Transfektion mit dem Adenovirushelfer al lein produzierte keine AAV-Proteine oder -Genome, was eine Kontamination als Quelle des geretteten AAV ausschließt.
Zur weiteren Charakterisierung der Variation von AAV-Signatursequenz zwischen Tieren und innerhalb eines Tiers wurden ausgewählte Gewebe einer ausgedehnten PCR unterzogen, um die gesamten offenen Cap-Leseraster zu amplifizieren.
Die erhaltenen Fragmente wurden in Bakterienplasmide kloniert, und individuelle Transformanden wurden isoliert und vollständig sequenziert. Diese Analyse wurde mit mesenterischen Lymphknoten aus drei Rhesusaffen (Tulane/V223 – 6 Klone; Tulane/T612 – 7 Klone; Tulane/F953 – 14 Klone), Leber aus zwei Rhesusaffen (Tulane/V251 – 3 Klone; Penn/00E033 – 3 Klone), Milz aus einem Rhesusaffen (Penn/97E043 – 3 Klone), Herz aus einem Rhesusaffen (IHGT/98E046 – 1 Klon) sowie peripherem Blut aus einem Schimpansen (New Iberia/X133 – 5 Klone), sechs Javaneraffen (Charles River/A1378, A3099, A3388, A3442, A2821, A3242 – insgesamt 6 Klone) und einem Pavian (SFRB/8644 – 2 Klone) durchgeführt. Von den 50 sequenzierten Klonen aus 15 unterschiedlichen Tieren wurden 30 als nichtredundant, bezogen auf das Auffinden von wenigstens 7 Aminosäureunterschieden zueinander, betrachtet. Die nichtredundanten VP1-Klone sind in der Reihenfolge, in der sie isoliert wurden, numeriert, wobei eine Vorsilbe die Spezies des nichtmenschlichen Primaten, aus dem sie stammten, andeutet. Die Strukturverwandtschaften zwischen diesen 30 nichtredundanten Klonen und den zuvor beschriebenen acht AAV-Serotypen wurden unter Verwendung des Programms Splits Tree [Hudson, D. H. Splits Tree: analyzing and visualizing evolutionary data. Bioinformatics 14, 68–73 (1998)] unter Einsatz des „split decomposition"-Verfahrens bestimmt. Durch die Analyse wird die Homoplasie zwischen einem Satz von Sequenzen in einem baumähnlichen Netzwerk anstelle eines verzweigten Baums dargestellt. Der Vorteil besteht darin, den Nachweis von Gruppierungen, die das Ergebnis von Konvergenz sind, zu ermöglichen und phylogenetische Verwandtschaften aufzuzeigen, selbst wenn diese durch Parallelereignisse verzerrt sind. Zur Aufklärung der AAV-Evolution ist eine umfangreiche phylogenetische Forschung erforderlich, wohingegen hier lediglich die unterschiedlichen Klone nach ihrer Sequenzähnlichkeit gruppiert werden sollen.
Zur Bestätigung, daß die neuen VP1-Sequenzen aus infektiösen Virusgenomen stammten, wurde zelluläre DNA aus Geweben mit einer großen Menge an Virus-DNA mit einer Endonuklease restriktionsverdaut, die nicht innerhalb des AAV spalten sollte und in 293-Zellen transfiziert, wonach eine Infektion mit Adenovirus erfolgte. Dies führte zur Rettung und Amplifikation von AAV-Genomen aus der DNA von Geweben aus zwei unterschiedlichen Tieren (Daten nicht gezeigt).
VP1-Sequenzen der neuen AAVs wurden weiter im Hinblick auf die Beschaffenheit und Lokalisierung der Aminosäuresequenzvariation charakterisiert. Dabei wurden alle 30 VP1-Klone, von denen gezeigt werden konnte, daß sie sich voneinander um mehr als 1% Aminosäuresequenz unterscheiden, aneinander ausgerichtet und hinsichtlich der Variation an jedem Rest bewertet. Ein zur Bestimmung von Zonen mit Sequenzdivergenz entwickelter Algorithmus ergab 12 hypervariable Bereiche (hyper variable regions, HVR), von denen 5 überlappen oder Teil der 4 zuvor beschriebenen variablen Bereiche sind [Kotin, oben zitiert; Rutledge, oben zitiert]. Die dreifachproximalen Spitzenwerte enthalten die höchste Variabilität (HVR5–10). Interessanterweise zeigen die an der 2- und 5-zähligen Achse lokalisierten Schleifen („loops") ebenso starke Variation. Die HVRs 1 und 2 liegen im N-terminalen Anteil des Capsid-Proteins, der in der Röntgenstruktur nicht aufgelöst ist, was darauf schließen läßt, daß der N-Terminus des VP1-Proteins auf der Oberfläche des Virions exponiert ist.
Zur Quantifizierung der AAV-Sequenzen aus Geweben von 21 Rhesusaffen wurde Echtzeit-PCR mit Primern und Sonden zu hochkonservierten Bereichen von Rep (ein Satz) und Cap (zwei Sätze) bekannter AAVs verwendet. Dabei stellt jeder Datenpunkt die Analyse von Gewebe-DNA aus einem individuellen Tier dar. Dies bestätigte die weite Verbreitung von AAV-Sequenzen, obwohl sich die quantitative Verteilung zwischen individuellen Tieren unterschied. Der Ursprung der Tiere sowie deren Vorgeschichte oder Behandlungen schienen die Verteilung der AAV-Sequenzen in Rhesusaffen nicht zu beeinflussen. Die zur Quantifizierung von AAV verwendeten drei unterschiedlichen Sätze von Primern und Sonden ergaben übereinstimmende Ergebnisse. Die höchsten AAV-Niveaus fanden sich durchgehend in mesenterischen Lymphknoten mit einem Durchschnitt von 0,01 Kopien pro diploides Genom bei 13 Tieren, die positiv waren. Leber und Milz enthielten ebenso große Mengen an Virus-DNA. Es gab Beispiele für sehr hohen AAV, wie beispielsweise im Herz des Rhesusaffen 98E056, der Milz des Rhesusaffen 97E043 und der Leber des Rhesusaffen RQ4407, die 1,5, 3 bzw. 20 Kopien der AAV-Sequenz pro diploides Genom zeigten. Relativ geringe Niveaus an Virus-DNA wurden in peripheren mononuklearen Blutzellen festgestellt, was darauf schließen läßt, daß die Daten im Gewebe nicht auf darin vorhandene Blutbestandteile zurückzuführen sind (Daten nicht gezeigt). Es sollte angemerkt werden, daß mit diesem Verfahren nicht notwendigerweise alle in nichtmenschlichen Primaten residierende AAVs erfaßt würden, da der Nachweis eine hohe Homologie zu sowohl den Oligonukleotiden als auch der Echtzeit-PCR-Sonde verlangt. Gewebe aus Tieren mit großen Mengen an AAV-DNA wurde weiter mit den DNA-Hybridisierungstechniken auf den molekularen Zustand der DNA sowie mit in-situ-Hybridisierung auf deren zelluläre Verteilung analysiert.
Die in aus unterschiedlichen Tieren isolierten proviralen AAV-Fragmenten sowie innerhalb von Geweben der gleichen Tiere gezeigte Art von Sequenzvariation erinnert an die Evolution, die bei vielen RNA-Viren während Pandemien oder sogar bei der Infektion eines Individuums auftritt. In einigen Situationen wurde die Idee eines Wildtyp-Virus durch die Existenz von Schwärmen von Quasispezies ersetzt, die sich als Ergebnis der schnellen Replikation und von Mutationen in Gegenwart von Selektionsdruck entwickeln. Ein Beispiel dafür ist die Infektion mit HIV, der als Reaktion auf immunologischen und pharmakologischen Druck evolviert. Mehrere Mechanismen tragen zur hohen Mutationsrate in RNA-Viren bei, einschließlich geringe Treue („fidelity") und das Fehlen einer Korrekturlesekapazität („proof reading") der reversen Transkriptase sowie nichthomologe und homologe Rekombination.
Hinweise auf die Ausbildung von AAV-Quasispezies wurden in der vorliegenden Arbeit durch die systematische Sequenzierung mehrerer klonierter proviraler Fragmente dargestellt. Tatsächlich konnten identische Sequenzen in keinen zwischen oder innerhalb von Tieren isolierten verlängerten Klonen gefunden werden. Ein wichtiger Mechanismus für diese Sequenzevolution scheint eine hohe Rate homologer Rekombination zwischen einer eher begrenzten Anzahl parenteraler Viren zu sein. Das Endergebnis dabei ist ein starker Austausch hypervariabler Bereiche des Cap-Proteins, was zu einer Anordnung von Chimären führt, die unterschiedliche Tropismen und serologische Spezifitäten (d.h. die Fähigkeit, immunologischen Reaktionen zu entkommen, vor allem, wenn diese sich auf neutralisierende Antikörper bezieht) aufweisen könnten. Mechanismen, mit denen eine homologe Rekombination stattfinden könnte, sind unklar. Eine Möglichkeit besteht darin, daß +- und –-Stränge unterschiedlicher Einzelstrang-AAV-Genome während der Replikation eine Annealing-Reaktion eingehen, wie im Verlauf der hohen Multiplizität von Infektionen mit AAV-Rekombinanten beschrieben wurde. Es ist unklar, ob andere Mechanismen zur Sequenzevolution in AAV- Infektionen beitragen. Die Mutationsgesamtrate, die während der AAV-Replikation auftritt, scheint relativ niedrig zu sein, wobei die Daten nicht auf hohe Häufigkeiten von Replikationsfehlern schließen lassen. Allerdings wurden wesentliche Umordnungen des AAV-Genoms während der lytischen Infektion beschrieben, was zur Ausbildung defekter störender Partikel führte. Unabhängig von den Mechanismen, die zur Sequenzdivergenz führen, verblieben mit einigen wenigen Ausnahmen vp1-Strukturen der Quasispezies intakt, ohne Rasterverschiebungen oder Unsinnmutationen, was darauf schließen läßt, daß die kompetetive Selektion von Viren mit dem günstigsten Fitnessprofil zur Populationsdynamik beiträgt.
Diese Untersuchungen besitzen Auswirkungen auf mehrere Bereiche der Biologie und Medizin. Das Konzept der schnellen Virusevolution, von dem bislang angenommen wurde, daß es eine auf RNA-Viren beschränkte Eigenschaft ist, sollte bei DNA-Viren, die traditionell mit serologischen Tests charakterisiert wurden, in Betracht gezogen werden. Im Hinblick auf Parvoviren ist es wichtig, ein neues Verfahren zur Beschreibung von Virusisolaten zu entwickeln, mit dem die Komplexität von dessen Struktur und Biologie erfaßt wird, wie etwa für HIV, wobei diese als allgemeine Familien mit ähnlicher Struktur und Funktion unter dem Namen Clades klassifiziert sind. Eine alternative Strategie besteht in der Fortsetzung der Klassifizierung von Isolaten im Hinblick auf serologische Spezifität und der Entwicklung von Kriterien zur Beschreibung von Varianten innerhalb von serologischen Gruppen.
Beispiel 3. Vektorologie rekombinanter, mit AAV2-ITRs versehener AAV-Genome unter Verwendung chimärischer Plasmide mit AAV2-rep und neuen AAV-cap-Genen für serologische und Gentransferuntersuchungen in unterschiedlichen Tiermodellen.
Chimärische Verpackungskonstrukte werden durch Fusionierung von AAV2-rep mit cap-Sequenzen neuer AAV-Serotypen erzeugt. Diese chimärischen Verpackungskonstrukte werden zunächst zur Pseudotypisierung rekombinanter AAV-Genome, die AAV2-ITRs tragen, durch Dreifach-Transfektion in 293-Zellen unter Verwendung des Helferplasmids Ad5 eingesetzt. Diese pseudotypisierten Vektoren werden zur Leistungsbeurteilung in serologischen Untersuchungen auf Transduktionsbasis und zur Beurteilung der Gentransfereffizienz neuer AAV-Serotypen in unterschiedlichen Tiermodellen, einschließlich NHP und Nagern, verwendet, bevor intakte und infektiöse Viren dieser neuen Serotypen isoliert werden.
A. pAAV2GFP
Das AAV2-Plasmid, welches die AAV2-ITRs sowie unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters exprimiertes grünfluoreszierendes Protein enthält. Dieses Plasmid enthält die folgenden Elemente: Die AAV2-ITRs, einen CMV-Promoter und die für GFP codierenden Sequenzen.
B. Klonierung des trans-Plasmids
Zur Konstruktion des chimärischen trans-Plasmids zur Herstellung rekombinanter pseudotypisierter AAV7-Vektoren wurde das Plasmid p5E18 (Xiao et al., 1999, J. Virol 73: 3994–4003) mit Xho I teilverdaut, so daß das Plasmid nur an der Xho I-Stelle in Position bp 3169 linearisiert wurde. Die Xho I-Schnittenden wurden dann aufgefüllt und zurückligiert. Dieses modifizierte p5E18-Plasmid wurde mit Xba I und Xho I in einer kompletten Verdauung restriktionsverdaut, um die AAV2-cap-Gensequenz zu entfernen, und gegen ein 2267 bp großes Spe I/Xho I-Fragment mit dem AAV7-cap-Gen, das aus dem Plasmid pCRAAV7 6 – 5 + 15 – 4 isoliert wurde, ausgetauscht.
Das erhaltene Plasmid enthält die AAV2-rep-Sequenzen für Rep78/68 unter der Kontrolle des AAV2-P5-Promoters sowie die AAV2-rep-Sequenzen für Rep52/40 unter der Kontrolle des AAV2-P19-Promoters. Die AAV7-Capsidsequenzen stehen unter der Kontrolle des AAV2-P40-Promoters, der innerhalb der Rep-Sequenzen lokalisiert ist. Dieses Plasmid enthält ferner einen Spacer 5' vom rep-ORF.
C. Produktion von pseudotypisiertem rAAV
Die rAAV-Partikel (AAV2-Vektor in AAV7-Capsid) werden mit einem adenovirusfreien Verfahren erzeugt. Dazu wurden, kurz gesagt, das cis-Plasmid (pAAV2.1-lacZ-Plasmid mit AAV2-ITRs) und das trans-Plasmid pCRAAC7 6 – 5 + 15 – 4 (mit dem AAV2-rep und AAV7-cap) bzw. ein Helferplasmid gleichzeitig in 293-Zellen in einem Verhältnis von 1:1:2 durch Calciumphosphatpräzipitation cotransfiziert.
Zur Konstruktion der pAd-Helferplasmide wurde das Plasmid pBG 10 von der Firma Microbix (Kanada) bezogen. Ein L2 und L3 enthaltendes Rsr II-Fragment wurde aus pBHG 10 deletiert, was zu einem ersten Helferplasmid, pAdΔF13, führte. Das Plasmid AdΔF1 wurde durch Klonierung eines Asp 700/Sal I-Fragments mit einer Pme I/Sgf I-Deletion, Isolierung aus pBHG 10, in Bluescript konstruiert. MLP, L2, L2 und L3 wurden in pAdΔF1 deletiert. Über weitere Deletionen eines 2,3 kb großen Nru I-Fragments und anschließend eines 0,5 kb großen Rsr II/Nru I-Fragments wurden die Helferplasmide pAdΔF5 bzw. pAdΔF6 erzeugt. Das Helferplasmid mit dem Namen pΔF6 stellt die wesentlichen Helferfunktionen von E2a und E4-ORF 6 bereit, die von der E1 exprimierenden Helferzelle nicht bereitgestellt werden, wobei darin jedoch adenovirale Capsidproteine und funktionelle E1-Bereiche deletiert sind.
Typischerweise wurden 50 μg DNA (cis:trans:Helfer) auf eine 150-mm-Gewebekulturschale transfiziert. Die 293-Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion geern tet, mit Ultraschall aufgeschlossen und mit 0,5% Natriumdesoxicholat behandelt (10 min bei 37°C). Die Zellysate wurden dann zwei Runden eines CsCl-Gradienten unterzogen. Die rAAV-Vektor enthaltenden Spitzenfraktionen werden gesammelt, vereinigt und gegen PBS dialysiert.
Beispiel 4: Erzeugung intakte neue AAV-Serotypen tragender infektiöser Klone zur Untersuchung der grundlegenden Virologie in aus dem Menschen und NHP stammenden Zellinien und Beurteilung der Pathogenese neuer AAV-Serotypen in NHP und anderen Tiermodellen.
Zur Erreichung dieses Ziels wird das Genom-„Walker"-System eingesetzt, so daß 5'- und 3'-terminale Sequenzen (ITRs) sowie eine vollständige Konstruktion von intakte neue AAV-Serotypgenome enthaltenden Klonen erhalten werden.
Kurz gesagt werden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Universal Genome Walker Kit [Clontech] genomische DNAs aus Affengeweben oder Zellinien, die als positiv für das Vorhandensein von AAV7-Sequenz identifiziert werden, mit den Endonukleasen Dra I, EcoR V, Pvu II und Stu I verdaut und in den Genome Walker Adapter ligiert, so daß vier individuelle Genome Walker Libraries (GWLs) erzeugt werden. Mit DNAs aus GWLs als Matrizen werden AAV7- und benachbarte genomische Sequenzen mit dem Adapter-Primer 1 (AP 1, im Kit enthalten) und einem AAV7-spezifischen Primer 1 PCR-amplifiziert, woraufhin eine nested-PCR unter Verwendung des Adapter-Primers 2 (AP 2) und eines weiteren AAV7-spezifischen Primers 2, die beide jeweils innerhalb des ersten Satzes von Primern liegen, erfolgt. Die Haupt-PCR-Produkte aus der nested-PCR werden kloniert und durch Sequenzanalyse charakterisiert.
In diesem Experiment werden die das 257 bp große oder ein anderes Signaturfragment eines generischen AAV- Genoms abdeckenden Primer zur PCR-Amplifikation von aus aus dem Menschen und NHP stammenden Zellinien extrahierten zellulären DNAs verwendet, um latente AAV-Sequenzen zu identifizieren und charakterisieren. Die identifizierten latenten AAV-Genome werden aus den positiven Zellinien unter Verwendung von Adenovirus-Helfern unterschiedlicher Spezies und Stämme gerettet.
Zur Isolierung infektiöser AAV-Klone aus aus NHP stammenden Zellinien wird eine gewünschte Zellinie von der ATCC bezogen und einem PCR-Screening unterzogen, um das 257 bp große Amplifikat, d.h. den erfindungsgemäßen Signaturbereich, zu identifizieren. Das 257 bp große PCR-Produkt wird kloniert und durch Sequenzeanalyse serotypisiert. Für diese, die AAV7-Sequenz enthaltenden Zellinien werden die Zellen mit SV-15, einem von der ATCC erworbenen Affen-Adenovirus, menschlichem Ad5 infiziert oder mit einem die menschlichen Ad-Gene, die für AAV-Helferfunktionen verantwortlich sind, beherbergenden Plasmidkonstrukt transfiziert. 48 Stunden nach der Infektion bzw. Transfektion werden die Zellen geerntet und Hirt-DNA zur Klonierung des AAV7-Genoms nach Xiao et al., 1999, J. Virol, 73: 3994–4003 präpariert.
Beispiel 5 – Herstellung von AAV-Vektoren
Zur Herstellung von mit AAV1-, AAV5- und AAV8-Capsidproteinen verpackten AAV2-Vektoren wurde eine Pseudotypisierungsstrategie, ähnlich wie die in Beispiel 3 für AAV1/7, eingesetzt. Kurz gesagt, wurden mit AAV2-ITRs versehene rekombinante AAV-Genome durch Dreifachtransfektion von 293-Zellen mit cis-Plasmid, Adenovirus-Helferplasmid und einem chimärischen Verpackungskonstrukt, bei dem das AAV2-rep-Gen mit cap-Genen neuer AAV-Serotypen fusioniert ist, verpackt. Zur Erzeugung der chimärischen Verpackungskonstrukte wurde die Xho I-Stelle des p5E18-Plasmids bei bp 3169 ablatiert und das modifizierte Plasmid mit Xba I und Xho I vollständig restriktionsverdaut, um das AAV2-cap-Gen zu entfernen und es durch ein 2267 bp großes Spe I/Xho I-Fragment mit dem AAV8-cap-Gen [Xiao, W., et al., (1999) J Virol 73, 3994–4003] zu ersetzen. Eine ähnliche Klonierungsstrategie wurde für die Erzeugung chimärischer Verpackungsplasmide von AAV2/1 und AAV2/5 verwendet. Alle rekombinanten Vektoren wurden mit dem Standard-CsCl₂-Sedimentationsverfahren gereinigt, mit Ausnahme von AAV2/2, das mit einer Ein-Schritt-Heparinchromatographie gereinigt wurde.
GC(Genome Copy)-Titer der AAV-Vektoren wurden mit der TaqMan-Analyse bestimmt, wobei Sonden und Primer, die auf den SV40-Poly-A-Bereich abzielen, wie zuvor beschrieben [Gao, G., et al. (2000) Hum Gene Ther 11, 2079–91], verwendet wurden.
Für jeden Serotyp wurden Vektoren jeweils für eine Reihe von in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen konstruiert. Dabei wurden acht unterschiedliche Transgenkassetten in die Vektoren eingebaut und rekombinante Virionen für jeden Serotyp produziert. Die Gewinnung von Virus auf Grundlage genomischer Kopien ist in der Tabelle 4 unten zusammengefaßt. Für jeden Serotyp ergaben sich hohe Vektorausbeuten, wobei keine beständigen Unterschiede zwischen Serotypen vorlagen. Bei den in der Tabelle dargestellten Daten handelt es sich um mittlere Genomkopienausbeuten mit Standardabweichung × 10¹³ mehrerer Produktionschargen von 50 Transfektionsplatten (150 mm).
Tabelle 4. Produktion rekombinanter Vektoren
Beispiel 6 – Serologische Analyse pseudotypisierter Vektoren
C57BL/6-Mäuse wurden mit Vektoren unterschiedlicher Serotypen der AAVCBA1AT-Vektoren intramuskulär (5 × 10¹¹ GC) injiziert und Serumproben 34 Tage später gesammelt. Zum Testen der Neutralisierungs- und Kreuzneutralisierungsaktivität von Seren gegenüber jedem AAV-Serotyp wurden Seren in einem neutralisierenden Antikörpertest auf Transduktionsbasis analysiert [Gao, G. P., et al., (1996) J Virol 70, 8934–43]. Insbesondere wurde dabei das Vorhandensein neutralisierender Antikörper bestimmt, indem die Fähigkeit von Serum zur Hemmung der Transduktion von 84-31-Zellen durch Reporterviren (AAVCMVEGFP) unterschiedlicher Serotypen beurteilt wurde. Speziell wurde das Reportervirus AAVCMVEGFP eines jeden Serotyps [bei einer MOI (Multiplicity of Infection), die zu einer Transduktion von 90% Indikatorzellen führte] mit hitzeinaktiviertem Serum aus Tieren, die unterschiedliche AAV-Serotypen erhalten hatten, oder von naiven Mäusen vorinkubiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wurden Viren je nach dem Virusserotyp für 48 oder 72 Stunden zu 84-31-Zellen in 96-Loch-Platten gegeben. Die GFP-Expression wurde mit Fluorolmagin (Molecular Dynamics) gemessen und mit Image Quant Software quantifiziert. Neutralisierende Antikörpertiter wurden in Form der höchsten Serumverdünnung angegeben, die die Transduktion auf weniger als 50% hemmte.
Die Verfügbarkeit GFP exprimierender Vektoren vereinfachte die Entwicklung eines Tests für neutralisierende Antikörper, der auf der Hemmung der Transduktion in eine permissiven Zellinie (d.h. E4 aus Ad5 stabil exprimierende 293-Zellen) beruhte. Seren gegen ausgewählte AAV-Serotypen wurden durch intramuskuläre Injektion der rekombinanten Viren erzeugt. Die Neutralisierung der AAV-Transduktion durch 1:20- und 1:80-Verdünnungen der Antiseren wurde bewertet (siehe Tabelle 5 unten). Antiseren gegen AAV1, AAV2, AAV5 und AAV8 neutralisierten die Transduktion des Serotyps, gegen den das Antiserum erzeugt worden war (AAV5 und AAV8 in einem geringeren Ausmaß als AAV1 und AAV2), jedoch nicht gegen den anderen Serotyp (d.h. es gab keinen Hinweis auf eine Kreuzneutralisierung, was darauf schließen läßt, daß es sich bei AAV8 um einen wirklich einmaligen Serotyp handelt).
Tabelle 5. Serologische Analyse neuer AAV-Serotypen.
Menschliche Seren aus 52 normalen Untersuchungspersonen wurden einem Screening auf die Neutralisierung gegen ausgewählte Serotypen unterzogen. Dabei stellte sich heraus, daß keine Serumprobe AAV2/7 und AAV2/8 neutralisierte, während AAV2/2- und AAV2/1-Vektoren in 20% bzw. 10% der Seren neutralisiert wurden. Eine vereinigte Fraktion von menschlichem IgG, die eine Sammlung von 60.000 individuellen Proben darstellt, führte nicht zu einer Neutralisierung von AAV2/7 und AAV2/8, wohingegen AAV2/2- und AAV2/1-Vektoren bei 1/1280 bzw. 1/640 entsprechenden Serumtitern neutralisiert wurden.
Beispiel 7 – In-vivo-Bewertung unterschiedlicher Serotypen von AAV-Vektoren
In dieser Untersuchung wurden sieben rekombinante AAV-Genome, AAV2CBhAIAT, AAV2AIbhAIAt, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ und AAV2TBGLacZ mit Capsidproteinen unterschiedlicher Serotypen verpackt. In allen sieben Konstrukten wurden Minigenkassetten mit AAV2-ITRs flankiert. Als Reportergene wurden cDNAs von menschlichem α-Antitrypsin (AIAT) [Xiao, W., et al., (1999) J Virol 73, 3994–4003], der β-Untereinheit des choriogonadotropen Hormons (CG) aus Rhesusaffe [Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2, 657–9], des Faktors IX aus Hund [Wang, L., et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 11563–6] sowie bakterielle β-Glactosidasegene (d.h. LacZ) verwendet. Für den auf die Leber gerichteten Gentransfer wurde entweder der Maus-Albumingenpromoter (Alb) [Xiao, W. (1999), oben zitiert] oder der Genpromoter des menschlichen thyroidhormonbindenden Globolins (TBG) [Wang (1997), oben zitiert] zur Steuerung der leberspezifischen Expression von Reportergenen verwendet. In auf den Muskel gerichteten Gentransferexperimenten wurde zur direkten Expression von Reportern entweder der frühe Cytomegaloviruspromoter (CMV) oder der β-Aktin-Promoter aus Huhn mit CMV-Enhancer (CB) eingesetzt.
Für den auf Muskel gerichteten Gentransfer wurden Vektoren in den rechten Tibialis anterior 4–6 Wochen alter NCR-Nacktmäuse oder C57BL/6-Mäuse (Taconic, Germantown, NY) injiziert. Bei den auf die Leber gerichteten Gentransferuntersuchungen wurden Vektoren intraportal in 7 bis 9 Wochen alte NCR-Nacktmäuse oder C57BL/6-Mäuse (Taconic, Germantown, NY) infundiert. Serumproben wurden intraobital zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Vektorapplikation gesammelt. Muskel- und Lebergewebe wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten für den Gefrierschnitt und die histochemische Xgal-Anfärbung von Tieren, die die LacZ-Vektoren erhalten hatten, geerntet. Für das Reapplikationsexperiment erhielten C56BL/6-Mäuse zunächst AAV2/1-, -2/2-, -2/5-, -2/7- und -2/8CBAIAT-Vektoren intramuskulär und wurden dann 7 Wochen auf A1AT-Genexpression verfolgt. Die Tiere wurden dann intraportal mit AAV2/8TBGcFIX behandelt und auf cFIX-Genexpression untersucht.
Zur Quantifizierung der Serumspiegel der Proteine hA1AT, rhCG und cFIX wurden, wie zuvor beschrieben, Tests auf ELISA-Basis durchgeführt [Gao, G. P., et al., (1996) J Virol 70, 8934–43; Zoltick, P. W. & Wilson, J. M. (2000) Mol Ther 2, 657–9; Wang L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11563–6]. Die Experimente wurden beendet, indem die Tiere zum ernten von Muskel- und Lebergeweben zur DNA-Extraktion und quantitativen Anaylse genomischer Kopien von in Zielgeweben vorhandenen Vektoren mittels TaqMan unter Verwendung des gleichen Satzes von Primern und Sonden wie bei der Titration der Vektorpräparationen getötet wurden [Zhang, Y., et al., (2001) Mol Ther 3, 697–707].
Die Leistung von auf den neuen Serotypen beruhenden Vektoren wurde in Mausmodellen des Muskel- und Leber-gerichteten Gentransfers bewertet und mit auf den bekannten Serotypen AAV1, AAV2 und AAV5 beruhenden Vektoren verglichen. Zur Quantifizierung relativer Transduktionseffizienzen zwischen unterschiedlichen Serotypen über die ELISA-Analyse von Seren wurden setzernierte Proteine (alpha-antitrypsin (A1AT) und chorionisches Gonadotropin (CG)) exprimierende Vektoren verwendet. Die zelluläre Verteilung der Transduktion innerhalb des Zielorgans wurde unter Verwendung von LacZ exprimierenden Vektoren und X-gal-Histochemie analysiert.
Die Leistung von AAV-Vektoren im Skelettmuskel wurde nach direkter Injektion in die tibialis-Anteriormuskeln analysiert. Die Vektoren enthielten das gleiche Genom auf AAV2-Basis, wobei das „immediate early" CMV-Gen oder ein durch CMV verstärkter β-Aktin-Promoter die Expression des Transgens steuerte. Frühere Untersuchungen deuteten darauf hin, daß immunkompetente C57BL/6-Mäuse begrenzte humorale Reaktionen auf das menschliche A1AT-Protein zeigen, wenn dieses von AAV-Vektoren exprimiert wird [Xiao W., et al., (1999) J Virol 73, 3994–4003].
Bei jedem Stamm produziert AAV2/1-Vektor die höchsten Niveaus an A1AT und AAV2/2-Vektor die niedrigsten, wobei AAV2/7- und AAV2/8-Vektoren mittlere Expressionsniveaus zeigten. CG-Spitzenniveaus an Tag 28 nach der Injektion von nu/nu-NCR-Mäusen zeigten die höchsten Niveaus von AAV2/7 und die niedrigsten von AAV2/2, wobei AAV2/8 und AAV2/1 dazwischen lagen. Die Injektion von AAV2/1- und AAV2/7-lacZ-Vektoren führte zur Genexpression an den Injektionsstellen in allen Muskelfasern, wobei wesentlich weniger lacZ-positive Fasern mit AAV2/2- und AAV2/8-Vektoren beobachtet wurden. Diese Daten deuten an, daß die Transduktionseffizienz mit AAV2/7-Vektoren im Skelettmuskel ähnlich wie die mit AAV2/1 erzielte ist, wobei es sich um den effizientesten der zuvor beschriebenen Serotypen in Skelettmuskeln handelt [Xiao, W. (1999), oben zitiert; Chao, H., et al., (2001) Mol Ther 4, 217–22; Chao, H., et al., (2000) Mol Ther 2, 619–23).
Ähnliche Mausmodelle wurden zur Bewertung des auf die Leber gerichteten Gentransfers verwendet. Identische Vektordosen bezogen auf Genomkopien wurden in die Pfortadern von Mäusen infundiert, die anschließend auf die Expression des Transgens analysiert wurden. Jeder Vektor enthielt ein Genom auf AAV2-Basis, wobei zuvor beschriebene leberspezifische Promotoren (d.h. Albumin oder Thyroidhormon bindendes Globulin) zur Steuerung der Expression des Transgens verwendet wurden. Insbesondere wurden CMVCG- und TBGCG-Minigenkassetten für den auf den Muskel bzw. die Leber gerichteten Gentransfer verwendet. rhCG-Spiegel wurden als relative Einheiten definiert (RU × 10³). Die Daten stammten aus Testreihen von am Tag 28 nach Vektorapplikation gesammelten Serumproben (vier Tiere pro Gruppe). Wie in Tabelle 3 gezeigt, stimmten die Auswirkungen von Capsidproteinen auf die Effizienz der Transduktion von A1AT-Vektoren in nu/nu- und C57BL/6-Mäusen sowie von CG-Vektoren in C57BL/6-Mäusen überein (siehe Tabelle 6). Tabelle 6. Expression der β-Einheit von Chorion Gonadotropin aus Rhesusaffen (rhCG)

* In diesem Experiment nicht bestimmt.

In allen Fällen ergaben AAV2/8-Vektoren die höchsten Niveaus an Transgenexpression, die 16 bis 110 mal größer als die mit AAV2/2-Vektoren erzielte Expression war; die Expression von AAV2/5- und AAV2/7-Vektoren wies einen mittleren Wert auf, wobei AAV2/7 höher als AAV2/5 lag. Die Analyse von X-Gal-gefärbten Leberschnitten von Tieren, die die entsprechenden lacZ-Vektoren erhalten hatten, zeigte eine Korrelation zwischen der Anzahl transduzierter Zellen und den Gesamtniveaus der Transgenexpression. Aus Lebern von C57BL/6-Mäusen, die die A1AT-Vektoren erhalten hatten, extrahierte DNAs wurden auf die Menge an Vektor-DNA unter Verwendung von Echtzeit-PCR-Technologie analysiert.
Die Menge an in der Leber 56 Tage nach der Injektion gefundener Vektor-DNA korrelierte mit den Niveaus der Transgenexpression (siehe Tabelle 7). Für dieses Experiment wurde ein Satz von Sonde und Primern, die auf den SV40-polyA-Bereich des Vektorgenoms abzielen, für die TaqMan-PCR verwendet. Bei den gezeigten Werten handelte es sich um Mittelwerte von drei individuellen Tieren mit Standardabweichungen. Die Tiere wurden am Tag 56 getötet, um Lebergewebe für die DNA-Extraktion zu ernten. Diese Untersuchungen deuten an, daß AAV8 der effizienteste Vektor für den auf die Leber gerichteten Gentransfer ist, und zwar aufgrund einer erhöhten Anzahl transduzierter Hepatocyten. Tabelle 7. Echtzeit-PCR-Analyse für die Menge an AAV-Vektoren in der Leber von nu/nu-Maus nach Injektion von 1 × 10¹¹ Genomkopien Vektor

AAV-Vektoren/Dosis Genomkopien pro Zelle

AAV2/1A1bA1AT 0,6 ± 0,36

AAV2A1bA1AT 0,003 ± 0,001

AAV2/5A1bA1AT 0,83 ± 0,64

AAV2/7A1bA1AT 2,2 ± 1,7

AAV2/8A1bA1AT 18 ± 11
Die oben beschriebenen serologischen Daten lassen darauf schließen, daß AAV2/8-Vektor nach der Immunisierung mit den anderen Serotypen nicht in vivo neutralisiert werden sollte. C57BL/6-Mäuse erhielten 56 Tage, nachdem sie intramuskuläre Injektionen von A1AT-Vektoren unterschiedlicher Serotypen erhalten hatten, intraportale Injektionen von Faktor IX aus Hund exprimierendem AAV2/8-Vektor (10¹¹ Genomkopien). 14 Tage nach der Infusion von AAV2/8 in naive Tiere (17 ± 2 μg/ml, n = 4) wurden hohe Faktor-IX-Expressionsniveaus erhalten, die sich nicht signifikant von denen, die in mit AAV2/1 (31 ± 23 μg/ml, n = 4), AAV2/2 (16 μg/ml, n = 2) und AAV2/7 (12 μg/ml, n = 2) immunisierten Tieren beobachtet wurden, unterschieden. Dies steht im Gegensatz zu dem, was in mit AAV2/8 immunisierten Tieren beobachtet wurde, die mit dem AAV2/8-Faktor-IX-Vektor infundiert worden waren und bei denen kein nachweisbarer Faktor IX beobachtet wurde (< 0,1 μg/ml, n = 4).
Mit Oligonukleotiden zu konservierten Bereichen des Cap-Gens wurden Sequenzen aus Rhesusaffen amplifiziert, die einmalige AAVs repräsentierten. Identische Cap-Signatursequenzen wurden in mehreren Geweben aus Rhesusaffen, abgeleitet von wenigstens zwei unterschiedlichen Kolonien, gefunden. Offene Leseraster für Volllängen-Rep und -Cap wurden aus Einzelquellen isoliert und sequenziert. Lediglich die offenen Cap-Leseraster der neuen AAVs wurden benötigt, um deren Potential als Vektoren zu bewerten, da Vektoren mit den AAV7- oder AAV8-Capsiden unter Verwendung der ITRs und Rep aus AAV2 erzeugt wurden. Dadurch vereinfacht sich auch der Vergleich unterschiedlicher Vektoren, da das eigentliche Vektorgenom zwischen unterschiedlichen Vektorserotypen identisch ist. In der Tat gab es zwischen Serotypen keine Unterschiede bei den Ausbeuten an rekombinanten Vektoren, die unter Verwendung dieses Ansatzes erzeugt wurden.
Auf AAV7 und AAV8 beruhende Vektoren scheinen immunologisch verschieden zu sein (d.h. sie werden von gegen andere Serotypen erzeugten Antikörpern nicht neutralisiert). Weiterhin wird die Transduktion durch AAV7- und AA8-Vektoren von Seren aus dem Menschen nicht neutralisiert, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber den sich zur Zeit in der Entwicklung befindenden, aus dem Menschen abgeleiteten AAVs darstellt, für die ein signifikanter Teil der Bevölkerung eine bereits existierende neutralisierende Immunität aufweist [Chirmule, N., et al., (1999) Gene Ther 6, 1574–83].
Der Tropismus eines jeden neuen Vektors begünstigt in-vivo-Applikationen. AAV2/7-Vektoren scheinen Skelettmuskel genauso effizient wie AAV2/1 zu transduzieren, wobei es sich bei letzterem um den Serotyp handelt, der von den bislang getesteten Primaten-AAVs das höchste Transduktionsniveau in Skelettmuskel verleiht [Xiao, W., oben zitiert; Chou (2001), oben zitiert und Chou (2000) oben zitiert]. Bedeutenderweise liefert AAV2/8 einen wesentlichen Vorteil gegenüber den anderen Serotypen hinsichtlich der Effizienz des Gentransfers zur Leber, der bislang hinsichtlich der Anzahl an stabil transduzierten Hepatocyten relativ enttäuschend war. AAV2/8 erzielte durchgehend eine 10- bis 100fache Verbesserung bei der Gentransfereffizienz im Vergleich mit den anderen Vektoren. Die Grundlage für die verbesserte Effizienz von AAV2/8 ist unklar, doch wird vermutet, daß sie an der Aufnahme über einen unterschiedlichen Rezeptor liegt, der aktiver auf der basolateralen Oberfläche für Hepatocyten ist. Diese verbesserte Effizienz eignet sich gut zur Entwicklung eines auf die Leber gerichteten Gentransfers, bei dem die Anzahl an transduzierten Zellen kritisch ist, wie beispielsweise bei Störungen des Harnstoffzyklus und familiärer Hypercholesterolemie.
Somit wird durch die vorliegende Erfindung ein neuer Ansatz zur Isolierung neuer AAVs auf Grundlage einer PCR-Gewinnung genomischer Sequenzen bereitgestellt. Die amplifizierten Sequenzen wurden leicht in Vektoren eingebaut und in Tieren getestet. Das Fehlen einer bereits existierenden Immunität gegen AAV7 und der günstige Tropismus der Vektoren für Muskeln deutet an, daß sich AAV7 zur Verwendung als Vektor bei der Gentherapie beim Menschen und anderen in-vivo-Applikationen eignet. In ähnlicher Weise führen das Fehlen einer bereits existierenden Immunität gegen die erfindungsgemäßen AAV-Serotypen sowie deren Tropismen zu einer Eignung dieser Serotypen bei der Zuführung therapeutischer Moleküle und anderer nützlicher Moleküle.
Beispiel 9 – Gewebetropismusuntersuchungen
Beim Entwurf eines funktionellen Sreening-Schemas mit hohem Durchsatz für neue AAV-Konstrukte wurde ein nicht-gewebespezifischer und hochaktiver Promotor, der CB-Promotor (CMV-verstärkter β-Actin-Promotor aus Huhn) zur Steuerung eines leicht nachweisbaren und quantifizierbaren Reportergens, des menschlichen α-Antitrypsin-Gens, ausgewählt. Somit braucht lediglich ein Vektor für jeden neuen AAV-Klon für Gentransferuntersuchungen, die auf drei unterschiedliche Gewebe, Leber, Lunge und Muskel, abzielen zum Screening auf den Gewebetropismus eines bestimmten AAV-Konstrukts hergestellt werden. In der folgenden Tabelle sind in den Gewebetropismusuntersuchungen von vier neuen AAV-Vektoren erzeugte Daten (AAVCBA1AT) zusammengefaßt, wobei sich herausstellte, daß ein neuer AAV-Capsid-Klon 44.2, in allen drei Geweben ein sehr potentes Gentransfervehikel darstellt, wobei er einen großen Vorsprung insbesondere im Lungengewebe aufwies. In Tabelle 8 sind am Tag 14 der Untersuchung erhaltene Daten e/(in μg A1AT/ml Serum) aufgeführt.
Tabelle 8
Anschließend wurden eine Reihe weiterer Experimente durchgeführt, um den besseren Tropismus von AAV 44.2 in Lungengewebe zu bestätigen. Zunächst trug AAV-Vektor CC10hA1AT-Minigen für lungenspezifische Expression, wurden mit Capsiden neuer AAVs pseudotypisiert, wurden immundefizienten Tieren (NCR-Nacktmäusen) in gleichem Volumen (jeweils 50 μl der ursprünglichen Präparationen ohne Vedünnung) über intratracheale Injektionen, wie in der folgenden Tabelle aufgeführt, gegeben. In Tabelle 9, jeweils 50 μl ursprüngliche Präparation pro Maus, NCR Nude, Nachweisgrenze ≥ 0,033 μg/ml, Tag 28.
Tabelle 9
Die Vektoren wurden auch immunkompetenten Tieren (C57BL/6) mit gleicher Anzahl an Genomkopien (1 × 10¹¹ GC), wie in Tabelle 10 gezeigt, verabreicht. (1 × 10¹¹ GC pro Tier, C57BL/6, Tag 14, Nachweisgrenze ≥ 0,033 μg/ml)
Tabelle 10
Die Daten aus beiden Experimenten bestätigten den hervorragenden Tropismus von Klon 44.2 beim auf die Lunge gerichteten Gentransfer.
Interessanterweise war die Leistung des Klons 44.2 beim auf die Leber beziehungsweise den Muskel gerichteten Gentransfer ebenso herausragend, fast so gut wie die des besten Leber-Transduktors, AAV8 bzw. des besten Muskel-Transduktors, AAV1, was darauf schließen läßt, daß dieses neue AAV eine gewisse faszinierende biologische Signifikanz aufweist.
Zur Untersuchung der serologischen Eigenschaften dieser neuen AAVs wurden pseudotypisierte AAVGFP-Vektoren zur Immunisierung von Kaninchen und in-vitro-Transduktion von 84-31-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Antiseren gegen unterschiedliche Capside erzeugt. Die Daten sind nachfolgend zusammengefaßt:
Tabelle 11a. Kreuz-NAB-Test in 8431-Zellen und Adenovirus(Adv)-Coinfektion Infektion in 8431-Zellen (coinfiziert mit Adv) mit:
Tabelle 11b. Kreuz-NAB-Test in 8431-Zellen und Adv-Coinfektion Infektion in 8431-Zellen (coinfiziert mit Adv) mit:
Tabelle 12
Tabelle 13a. Infektion in 8431-Zellen (coinfiziert mit Adv) mit GFP
Beispiel 10 – Mausmodell für familiäre Hypercholesterolemie
Das folgende Experiment zeigt, daß das erfindungsgemäße AAV2/7-Konstrukt den LDL-Rezeptor zuführt und LDL-Rezeptor in einer Menge exprimiert, die zur Reduzierung der Plasmaspiegel von Cholesterin und Triglyceriden in Tiermodellen der familiären Hypercholesterolemie ausreicht.
A. Vektorkonstruktion
Mit AAV7- oder AAV8-Capsidproteinen verpackte AAV-Vektoren wurden unter Verwendung einer Pseudotypisierungsstrategie [Hildinger M, et al., J. Virol 2001; 75: 6199–6203] konstruiert. Dabei wurden rekombinante AAV-Genome mit AAV2-ITR (inverted terminal repeats) durch dreifachtransfektion von 293-Zellen mit dem cis-Plasmid, dem Adenovirus-Helferplasmid und einem chimärischen Verpackungskonstrukt, einer Fusion der Capside der neuen AAV-Serotypen mit dem Rep-Gen von AAV2, verpackt. Das chimärische Verpackungsplasmid wurde wie zuvor beschrieben [Hildinger et al., oben zitiert] konstruiert. Die rekombinanten Vektoren wurden über das Standard-CsCl₂-Sedimentationsverfahren gereinigt. Zur Bestimmung der Ausbeute wurde eine Taqman (Applied Biosystems)-Analyse durchgeführt, wobei auf den SV40-poly(A)-Bereich der Vektoren [Gao GP, et al., Hum Gene Ther. 2000 Okt. 10; 11 (15): 2079–91] zielende Sonden und Primer verwendet wurden. Die erhaltenen Vektoren exprimieren das Transgen unter der Kontrolle des Genpromoters des menschlichen thyroidhormonbindenden Globulins (TBG).
B. Tiere
Mäuse mit LDL-Rezeptormangel auf dem C57BI/6-Hintergrund wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) erworben und als Züchtungskolonie gehalten. Die Mäuse hatten unbeschränkten Zugang zu Wasser und erhielten eine „Western Diet" mit hohem Fettanteil (hoher Prozentanteil Cholesterin), mit der 3 Wochen vor der Vektorinjektion begonnen wurde. Sowohl an Tag –7 als auch an Tag 0 wurde über retroorbitales Bluten Blut entnommen und das Lipidprofil analysiert. Die Mäuse wurden willkürlich in sieben Gruppen aufgeteilt. Der Vektor wurde über eine intraportale Injektion, wie zuvor beschrieben [Chen SJ et al., Mol Therapy 2000; 2 (3), 256–261], injiziert. Kurz gesagt wurden die Mäuse mit Ketamin und Xylazin betäubt. Es wurde ein Bauchschnitt durchgeführt und die Pfortader freigelegt. Mit einer 30 g-Nadel wurde die entsprechende, in 100 μl PBS verdünnte Vektordosis direkt in die Pfortader injiziert. Auf die Injektionsstelle wurde ein Druck ausgeübt, um das Stoppen der Blutung sicherzustellen. Die Wunde in der Haut wurde verschlossen und verbunden, und die Mäuse wurden über den folgenden Tag sorgfältig beobachtet. Am Tag 14 nach dem auf die Leber gerichteten Gentransfer wurde mit wöchentlichen Blutabnahmen begonnen, um Blutlipide zu messen. Zum Zeitpunkt von Woche 6 bzw. Woche 12 nach der Vektorinjektion wurden jeweils 2 Tiere jeder Gruppe getötet, um die atherosklerotische Plaquegröße ebenso wie die Rezeptorexpression zu untersuchen. Die verbliebenen Mäuse wurden in Woche 20 für Plaquemessungen und zur Bestimmung der Transgenexpression getötet.
Tabelle 14
C. Serum Lipoprotein- und Leberfunktionsanaylse
Nach einer 6stündigen Fastenperiode wurden Blutproben aus dem Retroorbitalen Plexus entnommen. Das Serum wurde vom Plasma durch Zentrifugation getrennt. Die Menge an Plasma Lipoproteinen und Leber-Transaminasen im Serum wurde unter Verwendung eines Analyseautomaten für die klinische Chemie (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassermann) nachgewiesen.
D. Nachweis der Transgenexpression
Die LDL-Rezeptorexpression wurde mittels Immunfluoreszenzanfärbung und Western-Blotting analysiert. Für den Western-Blott wurde gefrorenes Lebergewebe mit Lysepuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 130 mM NaCl, 1% Triton x 100, Proteinaseinhibitor (komplett, EDTA-frei, Roche, Mannheim, Deutschland) homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. 40 μg Protein wurden auf 4–15%igen Tris-HCl Ready Gels (Biorad, Hercules, CA) aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran (Invitrogen) übertragen. Zur Erzeugung von Anti-hLDL-Rezeptor Antikörpern wurde ein Kaninchen intravenös mit einer AdhLDLr-Präparation (1 × 10¹³ GC) injiziert. 4 Wochen später wurde das Kaninchenserum gewonnen und für den Western-Blott verwendet. Dabei wurde eine 1:100-Verbindung des Serums als primärer Antikörper und anschließend ein HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG verwendet sowie ein ECL-Chemilumineszenznachweis (ECL Western Blot Detection Kit, Amersham, Arlington Heights, IL) durchgeführt.
E. Immuncytochemie
Zur Bestimmung der LDL-Rezeptorexpression in gefrorenen Leberschnitten wurden Immunhistochemieanalysen durchgeführt. Dabei wurden 10 μm-Cryostat-Schnitte entweder nicht fixiert oder 5 Minuten in Aceton fixiert. Es wurde über einen einstündigen Inkubationszeitraum mit 10% Ziegenserum blockiert. Die Schnitte wurden dann eine Stunde mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert. Ein polyklonaler Anti-Mensch-LDL-Antikörper aus Kaninchen (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt verwendet. Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen und mit 1:100-verdünntem Fluoreszein-Ziege-Antikaninchen-IgG (Sigma, St Louis, MO) inkubiert. Schließlich wurden die Proben unter dem Nikon Microphot-FXA-Fluoreszenzmikroskop untersucht. In allen Fällen erfolgte nach jeder Inkubation ein ausgiebiges Waschen mit PBS. Negative Kontrollen bestanden aus einer Vorinkubation mit PBS, Weglassen des primären Antikörpers und Substitution des primären Antikörpers durch einen nichtimmunen Kontrollantikörper vom gleichen Isotyp. Die drei oben erwähnten Arten von Kontrollen wurden für jedes Experiment am gleichen Tag durchgeführt.
F. Gentransfereffizienz
Lebergewebe wurde nach dem Töten der Mäuse zu den vorgesehenen Zeitpunkten gewonnen. Das Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei –80°C gelagert. DNA wurde aus dem Lebergewebe mit einem QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Deutschland) gemäß der Vorschrift des Herstellers extrahiert. Genomkopien von AAV-Vektoren im Lebergewebe wurden mit der Taqman-Analyse unter Verwendung von Sonden und Primern gegen den SV40-poly-(A)-Schwanz wie oben beschrieben analysiert.
G. Messung von atherosklerotischen Plaques
Zur Quantifizierung der atherosklerotischen Plaques in der Mausaorta wurden die Mäuse betäubt (10% Ketamin und Xylazin, I. P.), der Brustraum geöffnet und das Arteriensystem mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung durch den linken Ventrikel hindurch perfungiert. Die Aorta wurde anschließend sorgfältig herauspräpariert, entlang der ventralen Mittellinie vom Aortenbogen bis hinunter zu den A. femoralis aufgeschlitzt und in Formalin fixiert. Die lipidreichen atherosklerotischen Plaques wurden mit Sudan IV (Sigma, Deutschland) angefärbt und die Aorta auf einer schwarzen Wachsoberfläche flach abgesteckt. Die Bildaufnahme erfolgte mit einer DXC-960-MG-Farbvideokamera von Sony. Die Zone des Plaques ebenso wie die vollständige aorte Oberfläche wurde mit Phase 3 Imaging Systems (Media Cybernetics) bestimmt.
H. Clearance von I¹²⁵ LDL
Pro experimenteller Gruppe wurden jeweils zwei Tiere getestet. Ein Bolus von I¹²⁵-markierten LDL (großzügigerweise von Dan Rader, U Penn, zur Verfügung gestellt) wurde langsam über die Schwanzvene über einen Zeitraum von 30 s infundiert (1.000.000 counts von [I¹²⁵]-LDL, verdünnt in 100 μl sterilem PBS/Tier). Zu den Zeitpunkten 3 Min., 30 Min., 1,5 h, 3 h, 6 h nach der Injektion wurde eine Blutprobe über den retroorbitalen Plexus entnommen. Das Plasma wurde vom Vollblut getrennt und 10 μl davon im Gamma-Zähler gezählt. Schließlich wurde aus den Lipoprotein-Clearance-Daten die FCR (fractional catabolic rate) berechnet.
I. Analyse der Lipidanreicherung in der Leber
Zur Bestimmung der Lipidanreicherung wurde eine Anfärbung gefrorener Leberschnitte mit Oil Red durchgeführt. Die gefrorenen Leberschnitte wurden dabei kurz in destilliertem Wasser gespült und anschließend 2 Minuten in absolutem Propylenglykol inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend in Oil-Red-Lösung (0,5% in Propylenglykol) 16 Stunden angefärbt und anschließend mit Mayer's Hämatoxylinlösung 30 Sekunden gegengefärbt und in angewärmter Glyceringeelelösung aufgezogen.
Zur Quantifizierung des Cholesterin- und Triglyceridgehalts der Leber wurden Leberschnitte homogenisiert und über Nacht in Chloroform/Methanol (2:1) inkubiert. Nach Zugabe von 0,05% H₂SO₄ und 10minütiger Zentrifugation wurde jeweils die untere Schicht jeder Probe gesammelt, in zwei Portionen aufgeteilt und unter Stickstoff getrocknet. Zur Cholesterinmessung wurden die getrockneten Lipide der ersten Portion in 1% Triton X-100 in Chloroform gelöst. Nach vollständiger Lösung wurde die Lösung unter Stickstoff getrocknet. Nach Lösen der Lipide in ddH₂O und 30minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Gesamtcholesterinkonzentration mit einem Total Cholesterol Kit (Wako Diagnostics) gemessen. Bei der zweiten Portion wurden die getrockneten Lipide in alkoholischen KOH gelöst und 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Anschließend wurde 1 M MgCl2 zugegeben und danach 10 Minuten auf Eis inkubiert sowie 30 Minuten bei 14.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde schließlich auf Triglyceride analysiert (Wako Diagnostics).
Alle in einem AAV2/8- oder AAV2/7-Capsid pseudotypisierten Vektoren reduzierten Gesamtcholesterol, LDL und Triglyceride im Vergleich mit der Kontrolle. Diese Testvektoren korrigierten ebenso den Phänotyp der Hypercholesterolemie auf eine dosisabhängig Weise. Beim ersten Test (2 Monate) wurde in behandelten Mäusen eine Verringerung der Plaquezone bei den AAV2/8- und AAV2/7-Mäusen beobachtet, wobei festgestellt wurde, daß der Effekt über die Länge des Experiments (6 Monate) anhielt.
Beispiel 10 – Funktionelle Expression von Faktor IX und Korrektur von Hämophilie
A. Knock-out-Mäuse
Die funktionelle Expression des Faktors IX (FIX) aus Hund wurde in Hämophilie-B-Mäusen beurteilt. Dabei wurden Vektoren mit Capsiden von AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 oder AAV8 zur Zuführung von AAV2 5' ITR-leberspezifischer Promotor [LSP] – Hund-FIX – WPRE (woodchuck hepatitis post-regulatory element) – AAV2 3' ITR konstruiert. Die Vektoren wurden wie bei Wang et al, 2000, Molecular Therapy 2: 154–158) unter Verwendung der entsprechenden Capside konstruiert.
Knock-out-Mäuse wurden wie bei Wang et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11563–11566 beschrieben erzeugt. Dieses Modell ähnelt stark den Phänotypen der Hämopholie B im Menschen.
Vektoren unterschiedlicher Serotypen (AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 und AAV8) wurden in Form einer einzelnen intraportalen Injektion in die Leber erwachsener C57BI/6-Blutermäuse in einer Dosis von 1 × 10¹¹ GC/Maus für die fünf verschiedenen Serotypen zugeführt, wobei eine Gruppe einen AAV8-Vektor mit einer geringeren Dosis, 1 × 10¹⁰ GC/Maus, erhielt. Die Kontrollgruppe wurde mit 1 × 10¹¹ GC AAV2/8 TBG LacZ3 injiziert. Jede Gruppe enthält 5–10 männliche und weibliche Mäuse. Die Mäuse wurden nach der Vektorverabreichung alle zwei Wochen geblutet.
1. ELISA
Die Hund-FIX-Konzentration im Mausplasma wurde mit einem für den Faktor IX aus Hund spezifischen ELISA-Test bestimmt, der im wesentlichen wie von Axelrod et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5173–5177 beschrieben mit Modifikationen durchgeführt wurde. Als primärer Antikörper wurde Schaf-Anti-Hund-Faktor IX (Enzyme Research Laboratories) und als sekundärer Antikörper Kaninchen-Anti-Hund-Faktor IX (Enzyme Research Laboratories) verwendet. Erstmals zwei Wochen nach der Injektion konnten für alle Testvektoren erhöhte cFIX-Plasmaspiegel nachgewiesen werden. Die erhöhten Spiegel blieben auf therapeutischen Niveaus über die Länge des Experiments, d.h. bis zu 12 Wochen, bestehen. Als therapeutische Niveaus werden Spiegel betrachtet, die 5% der Normalspiegel betragen, d.h. bei etwa 250 ng/ml.
Die höchsten Expressionsniveaus wurden für die AAV2/8- (bei 10¹¹) und AAV2/7-Konstrukte beobachtet, wobei cFIX-Spiegel konstant auf Superphysiologieniveaus lagen (10fach höher als der Normalspiegel). Die Expressionsniveaus für AAV2/8 (10¹¹) lagen ungefähr 10mal höher als die für AAV2/2 und AAV2/8 beobachteten (10¹⁰). Die niedrigsten Expressionsniveaus, die allerdings immer noch über dem therapeutischen Bereich lagen, wurden für AAV2/5 beobachtet.
2. aPPT(activated partial thromboplastin time)-in-vitro-Test
Die funktionelle Faktor-IX-Aktivität im Plasma der FIX-Knock-out-Mäuse wurde mit einem aPPT(activated partial thromboplastin time)-in-vitro-Test bestimmt. Maus-Blutproben wurden aus dem retroorbitalen Plexus in 1/10 Volumenzitratpuffer gesammelt. Der aPPT-test wurde wie von Wang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11563–11566 beschrieben durchgeführt.
Die Gerinnungszeiten von aPPT auf Plasmaproben aller vektorinjizierten Mäuse lagen im Normalbereich (ungefähr 60 s) bei der Messung zwei Wochen nach der Injektion, wobei Dauergerinnnungszeiten über den gesamten Untersuchungszeitraum (12 Wochen) im Normalbereich lagen oder kürzer als der Normalbereich waren.
Die kürzesten Dauergerinnungszeiten wurden in den Tieren, die AAV2/8 (10¹¹) und AAV2/7 erhalten hatten, beobachtet. Mit Woche 12 induzierte auch AAV2/2 Gerinnungszeiten, die ähnlich wie die für AAV2/8 und AAV2/7 waren. Allerdings wurde diese kürzere Gerinnungszeit für AAV2/2 nicht bis Woche 12 beobachtet, während kürzere Gerinnungszeiten (im Bereich von 25–40 s) mit Beginn von Woche 2 für AAV2/8 und AAV2/7 beobachtet wurden.
Zur Zeit wird die immunhistochemische Anfärbung der aus einigen der behandelten Mäuse entnommenen Lebergewebe durchgeführt. Dabei werden etwa 70–80% der Hepatozyten in der mit AAV2/8.cFIX-Vektor injizierten Maus positiv für Hund-FIX angefärbt.
B. Hämophilie-B-Hunde
Hunde, die in der katalytischen Domäne des F.IX-Gens eine Punktmutation, die auf Grundlage von Modelluntersuchungen das Protein instabil zu machen scheint, aufweisen, leiden an Hämophilie B [Evans et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10095–10099). Eine Kolonie solcher Hunde wurde über mehr als zwei Jahrzente an der University of North Carolina, Chapel Hill gehalten. Die homöostatischen Parameter dieser Hunde sind gut beschrieben und umfassen die Abwesenheit von Plasma-F.IX-Antigenen, Vollblut-Gerinnungszeiten über 60 Minuten, wohingegen normale Hunde Zeiten von 6–8 Minuten aufweisen, sowie eine verlängerte aktivierte partielle Thromboplastinzeit von 50–80 Sekunden, wohingegen normale Hunde Zeiten von 13–28 Sekunden aufweisen. Bei diesen Hunden treten immer wiederkehrend spontane Blutungen auf. Typischerweise werden signifikante Blutungsepisoden erfolgreich durch eine einzige intravenöse Infusion von 10 ml/kg normalem Hundeplasma behandelt; gelegentlich werden zur Kontrolle der Blutung wiederholte Infusionen benötigt.
Vier Hunde werden intraportal mit AAV.cFIX gemäß nachfolgendem Plan injiziert. Dabei erhält ein erster Hund eine Einzelinjektion mit AAV2/2.cFIX mit einer Dosis von 3,7 × 10¹¹ Genomkopien (GC)/kg. Ein zweiter Hund erhält eine erste Injektion von AAV2/2.cFIX (2,8 × 10¹¹ GC/kg) und anschließend eine zweite Injektion mit AAV2/7.cFIX (2,3 × 10¹³ GC/kg) an Tag 1180. Ein dritter Hund erhält eine Einzelinjektion mit AAV2/2.cFIX mit einer Dosis von 4,6 × 10¹² GC/kg. Der vierte Hund erhält eine Injektion mit AAV2/2.cFIX (2,8 × 10¹² GC/kg) sowie am Tag 99,5 eine Injektion mit AAV2/7.cFIX (5 × 10¹² GC/kg).
Die Abdomen der Bluterhunde werden unter Vollnarkose aseptisch und chirurgisch geöffnet, wobei eine Einzelinfusion von Vektor in die Portvene verabreicht wird. Die Tiere werden im perioperativen Zeitraum durch intravenöse Verabreichung von normalem Hundeplasma vor Blutung geschützt. Der Hund wird ruhig gestellt, zur Einleitung der Vollnarkose intubiert und das Abdomen rasiert und Vorbereitet. Nach Öffnung des Abdomens wird die Milz in das Operationsfeld geführt. Die Milzvene wird lokalisiert und ein Faden locker neben einem kleinen distalen Einschnitt in der Vene plaziert. Eine Nadel wird schnell in die Vene eingeführt, anschließend wird der Faden gelockert und eine 5F-Kanüle zu einer intravenösen Stelle in der Nähe der Portvenenabzweigung geführt. Nach Sicherung der Hemostase und Aufblasen des Katheterballons wird ungefähr 5,0 ml in PBS verdünnter Vektor über ein 5-Minuten-Intervall in die Portvene infundiert. Der Vektorinfusion folgt eine Infusion mit 5,0 ml Kochsalzlösung. Anschließend wird die Luft aus dem Ballon entfernt, die Kanüle entfernt und die venöse Hemostase gesichert. Anschließend wird die Milz zurückgelegt, blutende Gefäße werden kauterisiert, und die Operationswunde wird verschlossen. Das Tier, das den chirurgischen Eingriff gut überstanden hat, wird extubiert. Blutproben werden wie beschrieben analysiert [Wang et al., 2000, Molecular Therapy 2: 154–158].
Eine Korrektur oder Teilkorrektur zeigende Ergebnisse werden für AAV2/7 erwartet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung unbekannter Sequenzen von adeno-assoziiertem Virus (AAV) in einer Probe, von der man annimmt, daß sie von einer latenten Infektion herrührendes AAV enthält, wobei man in den folgenden Verfahrenschritten (a) die DNA-haltige Probe einer Amplifikation über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines ersten Primersatzes, mit dem spezifisch ein mindestens 250 Bp AAV-Capsid-Nukleinsäuresequenzen umfassender erster AAV-Bereich amplifiziert wird, wobei dieser erste Bereich eine an ihrem 5'-Ende von mindestens 18 Basenpaaren hochkonservierter Sequenz und an ihrem 3'-Ende von mindestens 18 Basenpaaren hochkonservierter Sequenz flankierte variable Sequenz aufweist, wobei die Basenpaare relativ zu einer vergleichenden Anordnung von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 hochkonserviert sind, aussetzt, (b) gegebenenfalls die DNA einer weiteren Amplifikation unter Verwendung eines zweiten Primersatzes, mit dem spezifisch ein zweiter Bereich, der den ersten Bereich von AAV-Sequenzen sowie 5' zum ersten Bereich liegende Sequenzen umfaßt, amplifiziert wird, aussetzt, so daß 5'-AAV-Verlängerungssequenzen, die in einer Annealing-Reaktion an das 5'-Ende der mit den Primern für den ersten Bereich amplifizierten AAV-Sequenzen binden, erhalten werden, (c) gegebenenfalls die DNA einer weiteren Amplifikation unter Verwendung eines dritten Primersatzes, mit dem spezifisch ein dritter Bereich, der den ersten Bereich von AAV-Sequenzen sowie 3' zum ersten Bereich liegende Sequenzen umfaßt, amplifiziert wird, aussetzt, so daß 3'-AAV-Verlängerungssequenzen, die in einer Annealing-Reaktion an das 3'-Ende der mit den Primern für den ersten Bereich amplifizierten AAV-Sequenzen binden, erhalten werden, wobei der zweite und der dritte Bereich jeweils auf der Grundlage der vergleichenden Anordnung der Nukleinsäuresequenzen von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 vorbestimmt sind und die Bereiche relativ zu den Sequenzen von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 jeweils am 5'-Ende der Sequenzen des Bereichs über mindestens 18 Basenpaare hochkonservierte Nukleinsäuresequenzen, in der Mitte gegebenenfalls variable Sequenzen und am 3'-Ende über mindestens 18 Basenpaare hochkonservierte Sequenzen umfassen und die Primersätze jeweils aus einem 5'-Primer und einem 3'-Primer bestehen, das Vorhandensein amplifizierter Sequenzen das Vorhandensein eines AAV in der Probe anzeigt, und ein Vergleich der Unterschiede zwischen den amplifizierten Sequenzen und den Sequenzen von AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 das Vorhandensein eines unbekannten AAV anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vergleich den Schritt des Vergleichens von Restriktionsenzymmustern für die amplifizierten Sequenzen mit Restriktionsenzymmustern von AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (a) das Capsid-Gen in voller Länge amplifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die amplifizierten Sequenzen das AAV-Capsid-Gen und das AAV-rep-Gen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA aus Zellen, Zellkultur, Gewebe, Gewebekultur oder biologischen Flüssigkeiten extrahiert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der erste Bereich über mindestens etwa 25 Basenpaare am 5'-Ende oder/und am 3'-Ende des Bereichs hochkonserviert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der erste Bereich über mindestens etwa 30 Basenpaare am 5'-Ende oder/und am 3'-Ende des Bereichs hochkonserviert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die hochkonservierten Sequenzen des ersten Bereichs unter den vergleichend angeordneten AAVs eine Identität von mindestens 80% am 5'-Ende oder/und am 3'-Ende des Bereichs aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die hochkonservierten Sequenzen des ersten Bereichs unter den vergleichend angeordneten AAVs eine Identität von mindestens 90% am 5'-Ende oder/und am 3'-Ende des Bereichs aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die variablen Sequenzen in der Mitte des ersten Bereichs unter den vergleichend angeordneten AAVs eine Identität von weniger als 70% aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der erste Bereich von etwa Bp 2800 bis etwa 3200 von AAV1, SEQ ID NO:6, und den entsprechenden Basenpaaren in anderen AAV reicht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem ersten Bereich um 257 Bp handelt, die von Bp 2886 bis etwa 3143 von AAV1, SEQ ID NO:6, und den entsprechenden Basenpaaren in anderen AAV reichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den Primern um AV1ns mit der Sequenz der Nukleotide 1398 bis 1423 der SEQ ID NO:6 sowie um AV2cas mit der Sequenz der SEQ ID NO:7 handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der erste Primersatz die Isolierung von Capsidsequenzen in voller Länge von adeno-assoziiertem Virus aus einer Probe gestattet, wobei der erste Primersatz einen auf einen in der Mitte eines AAV-rep-Gens liegenden Bereich auf der Grundlage eines vorbestimmten konservierten Bereichs gerichteten 5'-Primer sowie einen auf einen stromabwärts von einem AAV-cap-Gen liegenden Bereich auf der Grundlage eines vorbestimmten konservierten Bereichs von AAV gerichteten 3'-Primer umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Probe in das Chromosom integriertes AAV umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Probe menschliches Gewebe umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Probe provirale AAV-Sequenzen enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei es sich bei dem ersten Bereich um einen Signaturbereich handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Basenpaare der hochkonservierten Sequenzen relativ zu einer vergleichenden Anordnung von AAV 1, 2, 3, 4, 5 und 6 und aus Gans und Ente isolierten AAV hochkonserviert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei es sich bei der variablen Sequenz um eine hypervariable Sequenz handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der erste Bereich eine Länge von bis zu 10 Kilobasenpaaren umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der erste Bereich ein die cap-Sequenz in voller Länge umfassendes Fragment von 3,1 Kilobasenpaaren umfaßt.
Kit zum Nachweis des Vorhandenseins eines unbekannten adeno-assoziierten Virus (AAV) in einer Probe aus zellulärer DNA, von der man annimmt, daß sie eine latente AAV-Infektion enthält, wobei der Kit umfaßt: (a) einen ersten Primersatz, mit dem spezifisch ein 250 Bp AAV-Capsid-Nukleinsäuresequenzen umfassender erster AAV-Bereich amplifiziert wird, wobei dieser erste Bereich an seinem 5'-Ende mindestens 18 Basenpaare hochkonservierter Sequenz, eine variable Sequenz und an seinem 3'-Ende mindestens 18 Basenpaare hochkonservierter Sequenz aufweist, wobei die Basenpaare relativ zu einer vergleichenden Anordnung von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 hochkonserviert sind, (b) gegebenenfalls einen für einen zweiten Bereich der AAV-Nukleinsäuresequenzen, der den ersten Bereich von AAV-Sequenzen sowie 5' zum ersten Bereich liegende Sequenzen umfaßt, spezifischen zweiten Primersatz, so daß 5'-AAV-Verlängerungssequenzen, die in einer Annealing-Reaktion an das 5'-Ende der mit den Primern für den ersten Bereich amplifizierten AAV-Sequenzen binden, erhalten werden, (c) gegebenenfalls einen dritten Primersatz, mit dem spezifisch ein dritter Bereich, der den ersten Bereich von AAV-Sequenzen sowie 3' zum ersten Bereich liegende Sequenzen umfaßt, amplifiziert wird, so daß 3'-AAV-Verlängerungssequenzen, die in einer Annealing-Reaktion an das 3'-Ende der mit den Primern für den ersten Bereich amplifizierten AAV-Sequenzen binden, erhalten werden, wobei der zweite und der dritte Bereich jeweils auf der Grundlage der vergleichenden Anordnung der Nukleinsäuresequenzen von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 vorbestimmt sind und die Bereiche relativ zu den Sequenzen von mindestens AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6 jeweils am 5'-Ende der Sequenzen des Bereichs über mindestens 18 Basenpaare hochkonservierte Nukleinsäuresequenzen, in der Mitte gegebenenfalls variable Sequenzen und am 3'-Ende über mindestens 18 Basenpaare hochkonservierte Sequenzen umfassen, die Primersätze jeweils aus einem 5'-Primer und einem 3'-Primer bestehen, wobei jeder Primer mindestens 15 zur hochkonservierten Sequenz des jeweils anderen Primers komplementäre Nukleotide umfaßt und an seinem 3'-Ende über mindestens 5 Basenpaare eine genaue Identität mit der hochkonservierten Sequenz des jeweils anderen Primers aufweist.
Kit nach Anspruch 23, wobei der 5'-Primer und/oder der 3'-Primer mindestens 18 Nukleotide umfaßt.
Kit nach Anspruch 24, wobei der 5'-Primer und/oder der 3'-Primer mindestens 25 Nukleotide umfaßt.
Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei der 5'-Primer und/oder der 3'-Primer an seinem 3'-Ende mindestens 9 Basenpaare genauer Identität umfaßt.
Kit nach Anspruch 26, wobei der 5'-Primer und/oder der 3'-Primer an seinem 3'-Ende mindestens 18 Basenpaare genauer Identität umfaßt.
Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei der erste Primersatz die Isolierung von Capsidsequenzen in voller Länge von adeno-assoziiertem Virus aus einer Probe gestattet, wobei der erste Primersatz einen auf einen in der Mitte eines AAV-rep-Gens liegenden Bereich auf der Grundlage eines vorbestimmten konservierten Bereichs von AAV gerichteten 5'-Primer sowie einen auf einen stromabwärts von einem AAV-cap-Gen liegenden Bereich auf der Grundlage eines vorbestimmten konservierten Bereichs von AAV gerichteten 5'-Primer umfaßt.
Kit nach Anspruch 23, wobei der 5'-Primer eine GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC umfassende Sequenz aufweist, die Nt 1398 bis 1423 der SEQ ID NO:6 entspricht.
Kit nach Anspruch 23, wobei der 3'-Primer eine CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGR umfassende Sequenz aufweist, die den zu 4462-4435 der SEQ ID NO:7 komplementären Nukleotiden entspricht.
Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 30, wobei die Probe in das Chromosom integriertes AAV umfaßt.