KR20210126014A - CRISPR-Cas로 표적화된 핵 RNA 분열 및 폴리아데닐화 - Google Patents

CRISPR-Cas로 표적화된 핵 RNA 분열 및 폴리아데닐화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA를 시각화하거나 조절하기 위한 단백질, 핵산, 시스템 및 방법을 제공한다.

Description

CRISPR-CAS로 표적화된 핵 RNA 절단 및 폴리아데닐화
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019년 1월 14일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/791,971 및 2019년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/877,415에 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체로 참고로 본 명세서에 포함된다.
메신저 및 긴 비코딩 RNA의 전사-후 분열 및 폴리아데닐화는 진핵 핵 내에서 ~ 20 개별 단백질의 수퍼복합체에 의해 조정된다 (Mandel 등, Cell Mol Life Sci, 2008, 65:1099-1122; Xiang 등, Mol Cell Biol, 2014, 34:1894-1910). 폴리아데닐화는 RNA 트랜스크립트 안정성, 핵외수송 및 번역 효율성을 제어하는 데 필수적인 역할을 한다 (Colgan & Manley, Genes Dev, 1997, 11:2755-66; Guhaniyogi & Brewer, Gene, 2001, 265:11-23; Wu & Brewer, Gene, 2012, 500:10-21; Carmody &Wente, J Cell Sci, 2009, 122:1933-37). 모든 인간 RNA 트랜스크립트의 절반 초과가 발달 및 세포 분화 동안 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 겪을 수 있는 다중 폴리아데닐화 신호 서열을 함유한다 (Tian & Manley, Nat Rev Mol Cell Biol, 2017, 18:18-30; Elkon 등, Nat Rev Genet, 2013, 14:496-506). 대안적 분열 및 폴리아데닐화는 유전자 발현의 제어를 위한 중요한 메커니즘이고 3' 말단 처리에서의 결함은 무수한 인간 질환을 일으킬 수 있다 (Chang 등, Endocrinol Metab, 2017, 32:413-21; Curinha 등, Nucleus, 2014, 5:508-19).
따라서, 당업계에서 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 조절하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 있다. 본 발명은 이 요구를 만족시킨다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 (a) 크리스퍼(crisper)-연관 (Cas) 단백질; 및 (b) 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)이다. 일 실시형태에서, dCas13은 서열번호: 47-48, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 분열 또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21이다. 일 실시형태에서, NUDT21은 서열번호: 51-58 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 696-698, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다.
실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두를 조절하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체에게: 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법을 인코딩하는 핵산 분자 및 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하는 방법. 일 실시형태에서, 방법은 시험관내 방법이다. 일 실시형태에서, 방법은 생체내 방법이다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 크리스퍼-연관 (Cas) 단백질; 및 (b) 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)이다. 일 실시형태에서, dCas13은 서열번호: 47-48, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, sfGFP, sfGFP(1-10), sfGFP(1-10)-L-(11) 및 7xS11로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 형광 단백질은 서열번호: 59-66, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 699-701, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다.
실시형태 상에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA를 시각화하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체에게: 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법을 인코딩하는 핵산 분자 및 핵 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것; 및 핵 RNA를 시각화하는 것을 포함하는 방법. 일 실시형태에서, 방법은 시험관내 방법이다. 일 실시형태에서, 방법은 생체내 방법이다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 크리스퍼-연관 (Cas) 단백질; 및 (b) NLS를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas13은 서열번호: 1-46, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 702 또는 이의 변이체의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA의 수를 감소시키거나 핵 RNA를 분열하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게: 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법을 인코딩하는 핵산 분자 및 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 시험관내 방법이다. 일 실시형태에서, 방법은 생체내 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 핵산 분자의 용도를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 RNA와 연관된 질환 또는 장애의 치료에 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 핵산 분자의 용도를 제공한다.
도 1a 및 도 1b를 포함하는 도 1은 촉매적으로 죽은 Cas13 및 인간 폴리아데닐화 복합 인자를 인코딩하는 융합 단백질의 디자인 및 발현을 묘사한다. 도 1a는 촉매적으로 죽은 PspCas13b와 포유류 폴리아데닐화 슈퍼컴플렉스의 구성요소인, CPSF30, WDR33 및 NUDT21 사이의 융합을 인코딩하는 벡터의 다이어그램을 묘사한다. F - 3xFLAG 에피토프; NLS - Ty1 핵 국재화 서열; pA - SV40 폴리아데닐화 서열. 도 1b는 포유류 COS7 세포에서 발현된 dPspCas13b 융합 단백질의 핵 국재화를 검출하는 1차 항-FLAG 항체 및 Alexa488 접합된 2차 항체를 사용한 면역조직화학을 묘사한다. b에서 스케일 바, 10μm.
도 2a 내지 도 2h를 포함하는 도 2는 포유류 세포에서 RNA 분열 및 폴리아데닐화를 위한 형광 리포터의 설계 및 생성을 묘사한다. 도 2a는 sfGFPapa 리포터 플라스미드의 다이어그램을 묘사한다. 도 2b는 11개 베타 가닥으로 구성된 베타 배럴을 형성하는 녹색 형광 단백질 슈퍼폴더 GFP (sfGFP)를 묘사한다. 11번째 베타 가닥을 제거하면 형광이 사라진다. 도 2c는 sfGFPapa 리포터의 전사 및 11번째 sfGFP 베타 가닥의 코딩 서열을 제거하는 생성된 트랜스크립트의 처리를 묘사한다. 도 2d는 11번째 베타 가닥을 제거하면 포유류 세포에서 형광 신호의 부족을 초래함을 입증한다. 도 2e는 업스트림 폴리아데닐화 서열을 함유하는 sfGFPapa-pA 리포터 플라스미드의 다이어그램을 묘사한다. 도 2f는 sfGFP가 형광을 폐지함이 없이 10번째와 11번째 베타 가닥 사이의 링커 서열에 내성이 있을 수 있음을 묘사하는 개략도이다. 도 2g는 sfGFPapa-pA 리포터의 전사 및 결과적인 트랜스크립트의 처리를 묘사한다. 도 2h는 처리된 트랜스크립트가 sfGFP(1-10)-L-(11) 기능적 오픈 리딩 프레임의 번역으로 인해 강력한 녹색 형광을 유발한다는 것을 입증한다. 도 2d 및 도 2h에서 스케일 바, 100μm.
도 3a 내지 도 3f를 포함하는 도 3은 포유류 세포에서 리포터 mRNA의 CRISPR-Cas13-매개 분열 및 폴리아데닐화를 묘사한다. 도 3a는 sfGFPapa 리포터 작제물의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기 위한 Postscriptr 표적화 전략을 보여주는 다이어그램을 묘사한다. crRNA는 sfGFP의 11번째 베타 가닥의 코딩 서열의 다운스트림에 있는 인트로닉 서열을 표적화하기 위해 설계되었다. 도 3b는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질의 발현을 묘사하고 인트로닉 표적화 crRNA가 24시간 후에 녹색 형광 세포를 초래했음을 입증한다. 도 3c는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질 및 비-표적화 제어 또는 인트로닉 표적화 crRNA를 발현하는 세포에서 증폭된 3'RACE 생성물을 묘사한다. 도 3d 및 도 3e는 crRNA 표적 부위에 대한 5개의 가장 근접한 3'RACE 생성물의 서열을 묘사한다. 3'RACE 서열의 전체 목록에 대해서는 실시예 3을 참고한다. 녹색 밑줄과 소문자 뉴클레오티드는 3' 비-템플릿 뉴클레오티드 첨가를 강조한다. 도 3f는 Postscriptr-매개 분열 및 폴리아데닐화 부위에서의 뉴클레오티드 빈도를 묘사한다.
도 4a 내지 도 4i를 포함하는 도 4는 HEK293T 세포에서 인간 SREBP1의 Postscriptr-매개 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 묘사한다. 도 4a는 SREBP1 성숙 경로의 다이어그램을 묘사한다. 도 4b는 인간 SREBP1 유전자좌가 엑손 7과 엑손 8 사이에 인트로닉 PAS를 함유하고 있으며, 이는 정상 S2P 분열 부위에 인접한 번역을 종결시키는 SREBP1Δ 이소폼의 번역을 초래한다는 것을 묘사한다. 도 4c는 SREP1 서열 및 SREBP1Δ 이소폼 서열을 묘사한다. 도 4d는 Postscriptr-매개 표적화 전략 및 회수된 Postscriptr-유도 분열 트랜스크립트의 서열의 다이어그램을 묘사한다. 도 4e는 Postscriptr-매개 표적화 전략 및 회수된 Postscriptr-유도 폴리아데닐화 트랜스크립트의 서열의 다이어그램을 묘사한다. 도 4f는 예측된 번역 중단을 묘사한다. 도 4g는 비-표적화된 또는 SREBP1-표적화된 crRNA로 표적화된 HEK293T 세포에서 crRNA 표적 서열의 업스트림에 있는 SREBP1 트랜스크립트 수준의 정량적 실시간-PCR (qRT-PCR) 유전자 발현 분석을 묘사한다. 도 4h는 비-표적화된 또는 SREBP1-표적화된 crRNA로 표적화된 HEK293T 세포에서 crRNA 표적 서열에 걸친 SREBP1 트랜스크립트 수준의 정량적 실시간-PCR (qRT-PCR) 유전자 발현 분석을 묘사한다. 도 4i는 비-표적화된 또는 SREBP1-표적화된 crRNA로 표적화된 HEK293T 세포에서 LDLR 유전자의 트랜스크립트 수준의 정량적 실시간-PCR (qRT-PCR) 유전자 발현 분석을 묘사한다.
도 5는 전형적인 포유류 핵 국재화 신호가 dPspCas13b 융합 단백질의 핵 국재화를 촉진하기에 불충분하다는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 1차 항-FLAG 항체 및 2차 Alexa488 접합 2차 항체를 사용하는 면역조직화학을 사용하여 포유류 COS7 세포에서 발현된 dPspCas13b 융합 단백질의 국재화를 검출했다. 융합 단백질은 뉴클레오프라스민 (NPM)으로부터의 NLS, 고전적 SV40 NLS 또는 이분 NLS를 함유하지 않았다. 스케일 바 = 10μm
도 6a 및 도 6b를 포함하는 도 6은 스플라이싱을 억제하는 것이 sfGFP(1-10)-L-(11) 오픈 리딩 프레임의 발현을 촉진한다는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 6a는 sfGFPapa 리포터의 다이어그램과 스플라이싱 억제제 이소깅게틴으로 처리에서 기인한 예측된 전사 및 처리 단계를 묘사한다. 도 6b는 24시간 동안 sfGFPapa 리포터로 일시적으로 형질감염된 COS7 세포를 추가의 24시간 동안 DMSO 또는 이소깅게틴으로 처리한 것을 묘사한다. 이소깅게틴으로 처리된 세포는 검출 가능한 녹색 형광을 초래했다. b에서 스케일 바 = 100μm.
도 7a 및 도 7b를 포함하는 도 7은 CPSP30 또는 WDR33에 대한 dPspCas13b 융합이 sfGFPapa 리포터 mRNA의 분열 및 폴리아데닐화를 촉진하기에 충분하지 않았음을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 7a는 인트로닉-표적화 crRNA를 사용한 dPspCas13b-CPSF30 융합 단백질을 사용하는 sfGFPapa 리포터의 Postscriptr 표적화가 대조군 crRNA에 비해 검출 가능한 녹색 형광을 초래하지 않았음을 묘사한다. 도 7b는 인트로닉-표적화 crRNA를 사용한 dPspCas13b-WDR33 융합 단백질을 사용하는 sfGFPapa 리포터의 Postscriptr 표적화가 대조군 crRNA에 비해 검출 가능한 녹색 형광을 초래하지 않았음을 묘사한다. 여기서 스케일 바 = 100μm
도 8은 인간 SREBP1 트랜스크립트의 Postscriptr-매개 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. PCR은 비-표적화 대조군 또는 SREBP1-표적화 crRNA로 dPspCas13b-NUDT21을 발현하는 세포로부터 3'RACE 생성물을 증폭했다.
도 9a 내지 도 9b를 포함하는 도 9는 Cas13b crRNA 서열 변형이 Postscriptr 활성을 증진시키는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 9a는 CRISPR-Cas13 가이드-RNA는 폴리(T) 서열에 의해 종결되는, 중합효소 III (Pol III) 프로모터로부터의 포유류 세포에서 전형적으로 발현되는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 최근에 단지 4개 T의 스트레치가 U6 프로모터에 의한 작은 RNA의 전체 길이 발현에서 75% 감소를 초래할 수 있음이 밝혀졌다. 도 9b는 다중 Cas13b crRNA가 직접 반복 (DR) 서열을 함유함을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 9c는 DR 서열이 4개 또는 5개 T의 스트레치를 함유함을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 9d는 이들 뉴클레오티드가 루프 영역 내에 속하고 일부 위치는 직접적인 분자 상호작용을 하지 않음을 입증하는 결정 구조를 묘사한다. 9b에서 노란색 하이라이트 9d에서 노란색 화살표. 도 9e는 PspCas13b crRNA의 DR에서 생성 보존적 돌연변이 (T에서 C로)를 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 9f는 sfGFPapa 형광 리포터의 Postscriptr 표적화된 활성화에서 그 상대적인 효과의 결정을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 놀랍게도, 두 돌연변이 T17C 및 T18C는 증진된 Postscriptr 활성을 초래한 반면, 다른 돌연변이 T19C는 비-표적화 (NT) 가이드-RNA에 유사한 감소된 활성을 초래했다.
도 10은 인간, 파리 및 벌레로부터의 NUDT21 단백질의 서열 정렬을 묘사한다.
도 11은 Postscriptr 융합 단백질의 상대적인 활성을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질에 대한 상이한 서열 변형의 영향은 인트로닉 표적화 crRNA에 의해 가이드되는 포유류 세포에서 sfGFPapa 리포터의 활성화를 사용하여 평가되었다. 놀랍게도, NUDT21의 파리 및 벌레 오솔로그는 인간에 비해 비교할 만한 수준의 활성화를 나타냈으며, 이는 종에 걸친 그것의 높은 서열 보존과 폴리아데닐화에서 보존된 역할 때문일 가능성이 높다. 이들 오솔로그는 N-말단에서 다르며, 이는 Postscriptr-매개 활성화에 없어서는 안될뿐만 아니라 증진된 활동을 초래했다. 이는 이들 영역에서 라이신의 아세틸화가 NUDT21 활성을 억제하는 것으로 나타났다는 사실에 기인할 수 있다. NUDT21에 의한 RNA 결합을 방지하는 잔기의 돌연변이 (R63S 및 F103A)는 dCas13에 대한 융합으로서 그 기능에 거의 영향을 나타내지 않았다. 현저하게도, 정상적으로 절대 이량체로 기능하는 NUDT21의 탠덤 이량체는 현저하게 증진된 활성화를 초래했다. 더욱이, dPspCas13 (Δ984-1090)의 C-말단이 잘린 Postscriptr 효소는 유사한 수준의 sfGFPapa 활성화를 나타냈다.
도 12는 근육긴장퇴행위축 유형 1 (DM1)에 대한 분자-유전학적 기초를 입증하는 개략도를 묘사한다. DM1은 진행성 근육 소모, 근긴장, 심장 부정맥 및 인지 기능장애를 특징으로 하는 단일유전자 상염색체 우성 장애이다. DM1은 가장 흔한 성인-발병 근육긴장퇴행위축이고 인간 디스트로피아 미요토니카 프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 비코딩 3' 비번역된 영역에서 CUG 트리뉴클레오티드 반복의 확장 및 발현에서 발생한다. ~ 50 초과 CUG 반복을 갖는 돌연변이체 DMPK mRNA는 독성 핵 RNA 초점을 형성하여 정상적인 DMPK 발현을 방지하고, RNA 결합 단백질의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리의 구성원을 격리함에 의해 대안적 스플라이싱 및 대안적 폴리아데닐화에서 광범위한 결함을 유도한다. DM1에 대해 특정한 승인된 치료법은 없고 CUG RNA 반복을 표적화하는 현재 전략은 DMPK 발현의 손실을 다루지 않는다.
도 13a 내지 도 13d를 포함하는 도 13은 인간 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 대안적 분열 및 폴리아데닐화로 DM1의 치료적 교정을 묘사한다. RNA의 대안적 폴리아데닐화 (APA)는 발달 및 질환 동안 유전자 발현을 제어하는 중요한 조절 메커니즘이다. 최근 딥 시퀀싱은 일부 DMPK 트랜스크립트가 CUG 확장의 부위의 업스트림 위치에서 대안적으로 분열되고 폴리아데닐화될 수 있음을 밝혀냈으며, 이는 APA를 조작하는 것이 DMPK 발현을 보존하는 동시에 다운스트림 독성 반복 RNA의 전사를 방지하는 양자에 유용한 접근법이 될 수 있음을 시사한다. 도 13a는 Postscriptr의 개략도를 묘사한다. 도 13b는 Postscriptr가 CRISPR-Cas13의 프로그래밍 가능한 RNA-표적화 능력을 포유류 폴리아데닐화 인자와 결합하여 RNA 트랜스크립트의 부위-특이적 분열 및 폴리아데닐화를 유도한다는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 13c는 Postscriptr가 CUG 반복 확장의 부위의 업스트림에서 내인성 인간 DMPK 트랜스크립트의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 강력하게 유도할 수 있음을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 13d는 Postscriptr에 의한 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 대안적 폴리아데닐화가 DMPK 발현을 구제하고 다운스트림 독성 CUG 반복 RNA의 전사를 방지하는 둘 모두를 할 수 있음을 입증하는 실험 결과를 묘사한다.
도 14a 내지 도 14c를 포함하는 도 14는 DM1의 분자 기원을 묘사한다. 도 14a는 근육긴장퇴행위축 유형 1 (DM1)은 인간 DMPK 유전자의 3' UTR에서 미세위성 CTG 반복 확장으로부터 유래한다는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 14b는 DMPK CUGexp RNA가 핵 초점에서 유지되는 안정한 헤어핀을 형성하며, 따라서 정상적인 DMPK 유전자 발현을 방지하고 RNA 결합 단백질의 MBNL 패밀리를 격리하는 것을 묘사한다. 도 14c는 핵 초점이 대안적 스플라이싱 및 폴리아데닐화에서 광범위한 결함을 초래함을 입증하는 개략도를 묘사한다.
도 15a 내지 도 15c를 포함하는 도 15는 대안적 폴리아데닐화를 입증하는 개략도를 도시한다. 도 15a는 인간 전사체의 딥 시퀀싱이 모든 유전자의 절반 초과가 인트로닉, 근위 또는 원위 폴리아데닐화 신호 (PAS)에서 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 겪는다는 것을 밝혀냈다는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 15b는 ~ 20개 단백질의 슈퍼컴플렉스가 3' 말단 처리 및 전사 종결을 조정하는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. CFIm 및 CPSF 하위 복합체의 RNA 결합 구성요소는 분열 및 폴리아데닐화의 부위를 특정하는 pre-RNA 트랜스크립트에서 RNA 모티프를 인식한다. 도 15c는 CRISPR-Cas13을 사용한 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분한 Postscriptr로 명명된, 본 명세서에 기술된 신규한 RNA 편집 기술을 입증하는 개략도를 묘사한다.
도 16a 및 도 16b를 포함하는 도 16은 dCas13 융합 단백질의 핵 국재화가 고유한 NLS를 필요로한다는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 16a는 촉매적으로 죽은 PspCas13b와 NUDT21 사이의 융합을 인코딩하는 벡터의 개략도를 묘사한다. 도 16b는 포유류 분열 및 폴리아데닐화가 핵에서 발생함을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 효모 레트로트랜스포존 Ty1로부터 비-고전적 핵 국재화 신호 (NLS)는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질의 핵 국재화에 필수적이다.
도 17a 및 도 17b를 포함하는 도 17은 RNA의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 17a는 sfGFPapa 리포터 작제물의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기 위한 Postscriptr 표적화 전략을 나타내는 개략도를 묘사한다. crRNA는 sfGFP의 11번째 베타 가닥의 코딩 서열의 다운스트림에 있는 인트로닉 서열을 표적화하기 위해 설계되었다. 도 17b는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질의 발현 및 24시간 후 녹색 형광 세포를 생성한 인트로닉 표적화 crRNA를 묘사한다.
도 18a 및 도 18b를 포함하는 도 18은 내인성 인간 DMPK 트랜스크립트의 Postscriptr 편집을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 18a는 DMPK 정지 코돈의 다운스트림 및 CUGexp 부위의 업스트림 위치에서 DMPK 3' UTR을 표적화하는 가이드-RNA의 디자인을 묘사한다. 도 18b는 Postscriptr가 근위 PAS의 이용을 촉진하고 원위 엑손의 보유로 표시되는, 전장 DMPK 단백질 코딩 서열로 원위 PAS의 발현을 감소시켰음을 밝히는 HEK293T 세포에서 DMPK 트랜스크립트의 Postscriptr 편집을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 따라서, 이 전략은 DMPK 발현을 촉진하고 CUGexp RNA의 다운스트림 발현을 방지하는 메커니즘을 제공할 수 있었다.
도 19a 내지 도 19d를 포함하는 도 19는 dCas13으로 CUG 반복 RNA 초점을 표적화하는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 19a는 dCas13 아세포 국재화를 시각화하기 위해 eGFP의 dPspCas13b로의 융합의 개략도를 묘사한다. 이 작제물은 HiLightr 녹색으로 명명된다. 도 19b는 핵 초점을 유도하기 위해 사용되었던, 인간 DMPK 엑손 11-15의 맥락에서 960 CUG 반복을 함유하는 발현 플라스미드인, DT960을 묘사한다. 도 19c는 CAGx9 가이드-RNA의 실험 개략도를 묘사한다. 도 19d는 안티센스 CAGx9 가이드-RNA로 표적화될 때 RNA 초점에 mCherry-MBNL1과 공-국재화되었지만 비-표적화 가이드-RNA를 사용할 때 국재화되지 않은 채로 남아있는 HiLightr 녹색을 입증하는 실험 결과를 묘사한다.
도 20a 및 도 20b를 포함하는 도 20은 CUGexp RNA가 mRNA 발현을 방지하는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 20a는 12개 CUG 반복 (pGL3P-DT12a) 또는 960 CUG 반복 (pGL3P-DT960) 중 어느 하나를 갖는 인간 DMPK 3' UTR을 함유하는 루시퍼라제 발현 벡터를 묘사한다. 도 20b는 960 CUG 반복의 존재는 COS7 세포에서 발현될 때 루시퍼라제 활성에서 90% 감소를 초래했다는 것을 입증하는 실험 결과를 묘사한다.
도 21a 내지 도 21d를 포함하는 도 21은 유도성 DM1 마우스 모델을 묘사한다. 인간 DMPK 엑손 11-15의 맥락에서 960 CUG 확장 RNA를 발현하는 DM1의 유도성 인간화된 마우스 모델이 사용된다. 도 21a는 이식유전자를 골격근 특이적 rtTA 이식유전자로 가교시키는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 21b는 이식유전자 발현이 독시사이클린 (dox)에 의해 유도될 수 있다는 것을 입증하는 개략도를 묘사한다. 도 21c는 렌티바이러스 벡터에 인코딩된 Postscriptr 편집 구성요소를 묘사한다. 도 21d는 렌티바이러스 벡터가 dox를 수반하는 출생후 발달 동안 전달되는 렌티바이러스 입자를 생성하는데 사용됨을 묘사한다. CUG 인코딩된 트랜스크립트의 Postscriptr 편집은 DM1의 Postscriptr 완화의 효과를 모델링하는 데 사용된다.
도 22a 내지 도 22d를 포함하는 도 22는 독성 RNA 초점의 시각화를 위한 강력한 핵 국재화된 CRISPR-Cas13 융합 단백질의 발달을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 22a는 N-말단 3xFLAG 및 Ty1 NLS 및 C-말단 eGFP를 인코딩하는 촉매적으로 죽은 PspCas13b (dPspCas13b)의 디자인을 묘사한다. F - 3xFLAG 에피토프; NLS - Ty1 핵 국재화 서열; pA - SV40 폴리아데닐화 서열. 도 22b는 960 CTG 반복 확장을 갖는 인간 DMPK (엑손 11-15)의 C-말단 게놈 단편을 인코딩하는 DT960 벡터의 구성요소를 묘사하는 다이어그램을 묘사한다. 도 22c는 CAGx9 crRNA의 디자인 및 CUGexp RNA로 그 예측된 표적화를 묘사한다. 도 22d는 CUGexp RNA를 발현하는 COS7 세포에서 비-표적화 또는 CAGx9 crRNA 중 어느 하나로 표적화된 hilightR 녹색의 세포 국재화를 보여주는 대표적인 이미지를 묘사한다. 스케일 바, 10μm.
도 23a 및 도 23b를 포함하는 도 23은 CUG exp 초점 및 MBNL1로 hilightR 녹색의 공-국재화를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 23a는 CAGx9 crRNA로 표적화될 때 FISH를 사용하여 검출된 CUGexp RNA로 공-국재화된 hilightR 적색를 검출하기 위해 항-FLAG 항체를 사용한 면역조직화학이 사용되었다는 것을 묘사한다. 도 23b는 비-표적화 crRNA가 아닌 CAGx9 crRNA로 표적화될 때 CUGexp RNA 초점을 발현하는 COS7 세포에서 mCherry-MBNL1로 공-국재화된 HilightR 녹색을 묘사한다. 스케일 바, 10μm.
도 24a 및 도 24b를 포함하는 도 24는 CRISPR-Cas13에 의한 독성 RNA 초점의 분해를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 24a는 Ty1 NLS (eraseR)를 인코딩하는 활성 PspCas13b의 공-발현이 mCherry-MBNL1에 의해 검출된, 3개 프레임 모두에서 표적 서열로 설계된 CAG crRNA로 표적화될 때, CUGexp RNA를 발현하는 세포에서 RNA 초점의 수를 상당히 감소시켰다는 것을 묘사한다. 도 24b는 수에서 상당하게 감소하고 희미하게 보이는, mCherry-MBNL1에 의해 검출된 초점을 보여주는 eraseR에 의해 표적화된 세포의 대표적인 현미경 사진을 묘사한다. 스케일 바, 10μm. ** = p-값 < 0.01, *** = p-값 < 0.001, **** = p-값 < 0.0001.
도 25a 내지 도 25c를 포함하는 도 25는 COS7 세포에서 유도된 CUGexp RNA 초점의 검출을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 25a는 CAG 반복 안티센스 프로브로 FISH를 사용하여 검출된 바와 같이 960 카피의 CUG 반복 유도된 RNA 초점을 발현하는 COS7 세포를 묘사한다. AF488 - Alexa Fluor 488. 도 25b는 mCherry-MBNL1 융합 단백질을 사용하여 검출된 바와 같이 CUGexp RNA의 발현이 초점에 대한 MBNL1의 국재화를 유도한다는 것을 묘사한다. 도 25c는 CUGexp RNA를 발현하는 COS7 세포에서 비-표적화 또는 CAGx9 crRNA 중 어느 하나에 의해 가이드된 dPspCas13b-mCherry (hilightR 적색)의 국재화를 묘사한다. 스케일 바, 10μm.
도 26은 스플라이싱 반점과 hilightR 녹색의 공-국재화를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 이전 보고서와 일치하여, CAGx9 crRNA로 표적화된 hilightR 녹색에 의해 표시된 CUGexp RNA 초점은, 항-SC-35 항체를 사용하여 검출된 바와 같이, 스플라이싱 반점과 공-국재화했다. 스케일 바, 10μm.
도 27은 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)이 CUGexp RNA 초점의 수를 현저하게 감소시키지 않음을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. CAGx9 crRNA로 표적화된 dPspCas13b의 발현은 mCherry-MBNL1에 의해 검출된 바와 같이 세포당 CUGexp RNA 초점의 수를 현저하게 감소시키지 않는다. ns -유의하지 않음.
도 28a 내지 도 28d를 포함하는 도 28은 CRISPR-Cas13에 의한 DM1의 치료적 조절을 입증하는 다이어그램을 묘사한다. 도 28a는 근육긴장퇴행위축 유형 1이 인간 DMPK 유전자의 3' 비코딩 UTR에서 CUG 반복의 확장 및 발현에 의해 야기된다는 것을 묘사한다. 이 CUG 확장은 RNA 결합 단백질의 MBNL 패밀리를 결합하고 격리하는 안정적인 헤어핀 구조를 형성하여, 대안적 스플라이싱 및 폴리아데닐화에서 광범위한 결함을 초래한다. 도 28b는 CUG 반복이 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 의해 유도된 분열에 저항성이지만, ASO는 MBNL1 단백질의 결합을 차단하는데 성공적으로 사용되었다는 것을 묘사한다. 그러나, 치료학적으로 유효한 수준의 ASO를 인간 조직에 전달하기 위한 많은 과제가 남아 있다. 도 28c는 crRNA 또는 잠재적으로 crRNA 단독에 의한 dCas13 가이드의 특이적 결합이 MBNL 단백질을 차단하고 스플라이싱 및 폴리아데닐화 결함을 구제하거나, 형광 단백질과 조합될 때 CUG 반복 RNA 초점을 강조하는 역할을 할 수 있다는 것을 도시한다. 도 28d는 촉매적으로 활성 Cas13을 사용하여 CUG 반복 RNA를 분열하고 분해하여 MBNL 격리뿐만 아니라 독성 펩티드의 RAN 의존성 번역과 같은 다른 잠재적인 CUG 반복-유발 병리를 방지할 수 있음을 묘사한다.
도 29는 근육긴장퇴행위축 유형 1 (DM1)이 8,000명 중 1명의 개체에서 발생하는 유전된 다중-시스템, 점진적으로 쇠약해지는 질환이고, 특정 모집단에서 500명 중 1명 정도로 높은 발병률로 심장 합병증이 DM1 환자의 ~ 80%에서 전개하고 주요 사망의 원인이다는 것을 보여주는 개략도를 묘사한다. DM1은 인간 디스트로피아 미요토니카 프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 비코딩 3' 비번역 영역에서 CUG 트리뉴클레오티드 반복의 확장 및 발현에서 발생한다. ~ 50 초과 CUG 반복을 갖는 돌연변이체 DMPK mRNA는 독성 핵 RNA 초점을 형성하며, 이는 정상적인 DMPK 발현을 방지하고, RNA 결합 단백질의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리의 구성원을 격리함에 의해 대안적 스플라이싱에서 광범위한 결함을 유도한다. DM1 병인의 기초가 되는 다수의 파괴된 근육 유전자로 인해, 환자는 종종 심방 및 심실 부정맥, 확장된 심근병증 및 심근 섬유증을 포함한 다양한 임상적 심장 표현형을 나타낸다. RNA 결합 CRISPR-Cas13은 강력한 비-고전적인 핵 국재화 신호 (hilightR 및 eraseR)로 국재화될 때 세포에서 독성 핵 RNA 초점을 시각화하고 분해하는데 사용될 수 있다.
도 30a 내지 도 30e를 포함하는 도 30은 DM1의 마우스 모델에서 심장 기능의 치료적 구조를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 30a는 CUG960 심장 DM1 마우스 모델의 생성을 묘사한다. 도 30b는 CUG960 심장 DM1 마우스 모델의 생성을 묘사한다. 도 30c는 eraseR AAV 작제물의 다이어그램을 묘사한다. 도 30d는 AAV9를 사용한 심장-특이적 유전자 전달 및 발현을 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 30e는 DM1 심장에서 세포 및 전기적 이상의 CUGexp RNA 반전을 표적화하는 eraseR AAV의 전달을 묘사한다.
도 31a 내지 도 31d를 포함하는 도 31은 Postscriptr를 사용한 칼시뉴린 시그널링의 활성화를 입증하는 실험 결과를 묘사한다. 도 31a는 칼시뉴린이 칼슘 시그널링의 부재에서 C-말단 자가억제성 도메인에 의해 자가-억제되는 Ca2+/칼모듈린 활성화된 단백질 포스파타제임을 나타내는 개략도를 묘사한다. 도 31a는 활성화시 칼시뉴린이 NFAT 전사 인자를 탈인산화하여, NFAT 표적 유전자의 핵 진입 및 활성화를 허용하는 것을 나타내는 개략도를 묘사한다. 도 31a는 C-말단 자가-억제성 도메인을 결하는 칼시뉴린 촉매 도메인의 N-말단 단편의 발현을 허용하기 위해 칼시뉴린 (PPP3CB) 유전자의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 유도하는 가이드-RNA의 설계를 나타내는 개략도를 묘사한다. 도 31a는 PPP3CB 유전자를 표적화하는 마우스 섬유아세포에서 Postscriptr 발현이 NFAT-GFP 리포터 유전자의 핵 국재화를 초래했으며, 이는 정상적으로 세포질에 유지되고 비-표적화 가이드-RNA의 영향을 받지 않았다는 것을 묘사한다.
도 32a 내지 도 32d를 포함하는 도 32는 dCas13으로 RNA 시각화 및 융합 단백질 국재화를 증진시키기 위한 전략을 묘사한다. 도 32a는 세포에서 핵 RNA 반복 초점의 특정 시각화에 사용될 수 있는 촉매적으로 비활성 Cas13 (dCas13)에 대한 단일 녹색 형광 단백질 (GFP)의 융합을 묘사하는 개략도를 묘사한다. 도 32a는 형광 단백질 (예를 들어, GFP, 슈퍼폴더 GFP 또는 슈퍼폴더 체리)에 내재한 형광 상보성이 형광 단백질을 dCas13에 재구성하기 위해 (예를 들어, 보체 쌍 sfGFP 1-10 및 sfGFP11) 이용될 수 있다는 것을 묘사하는 개략도를 묘사한다. 도 32c는 작은 비-형광 구성요소의 탠덤 어셈블리가 dCas13 표적화된 RNA의 신호 대 노이즈 비를 증가시킬 가능성이 있는 dCas13에 대한 형광 단백질의 큰 탠덤 배열을 재구성하는데 사용될 수 있다는 것을 묘사하는 개략도를 묘사한다. 도 32a는 이 접근법이 상보적 형광 융합 단백질 (예를 들어, sfGFP1-10)에 대한 융합으로 공-발현될 때 융합 단백질 (단백질 'X')을 표적화하는데 유사하게 유용할 수 있다는 것을 묘사하는 개략도를 묘사한다.
도 33a 내지 도 33c를 포함하는 도 33은 Postscriptr RNA 편집의 구조-기능 분석을 묘사한다. 도 33a는 Cas13b (6DTD) 및 NUDT21 (3MDG)의 고해상도 결정 구조를 사용한 dCas13b-NUDT21 융합 단백질 및 crRNA의 구조적 모델링을 묘사한다. 도 33b는 NUDT21이 N 및 C-말단의 밀접한 근접성에 기인하여 dCas13b에 융합된 탠덤 이량체 (dCas13b-tdNUDT21)로 발현될 수 있는 천연 동종이량체를 형성함을 입증하는 결과를 묘사한다. 도 33c는 표적 RNA에 대한 안티-센스 혼성화된 dCas13b-NUDT21 융합 단백질의 구조적 배향을 묘사하는 모델을 묘사한다. NUDT21의 배향은 Postscriptr-유도된 RNA 분열 및 폴리아데닐화의 관찰된 위치와 일치하는, 표적 RNA 상에 crRNA 표적 서열에 대해 3'에 발생할 것으로 예측된다.
일 양태에서, 본 발명은 CRISPR-Cas에 의한 RNA 트랜스크립트의 표적화된 RNA 분열 및 폴리아데닐화를 허용하는 신규한 융합 단백질의 개발에 기초한다. 본 명세서에서 Postscriptr로 명명된 이 융합 단백질은 Cas 단백질, 핵 국재화 신호 (NLS) 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 예컨대 NUDT21을 포함한다. Cas13에서 돌연변이는 촉매적으로 죽은 효소 (dCas)를 생성하지만 RNA 결합 친화성을 유지한다. 따라서, dCas13과 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질의 융합은 표적화된 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 허용한다. Poscripter는 유전자 발현의 비-게놈 조작을 가능하게 하여, 기본적인 연구와 치료적 응용 둘 모두에 유용하다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 융합 단백질은 Cas 단백질 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 725-727 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표적화된 핵 RNA 분열 및 분해를 허용하는 신규한 융합 단백질의 놀라운 개발에 기초한다. 본 명세서에서 EraseR로 명명된 이 융합 단백질은 Cas 단백질 및 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다. CRISPR-Cas13 시스템은 RNA에만 결합하고 특정 엔도리보뉴클레아제로 기능하여 표적 RNA를 분열하여 DNA-결합 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제와 관련된 생식계열 편집의 위험을 우회한다. 그러나, 그 크기가 크고 고유한 국재화 신호를 결하기 때문에, Cas13 융합 단백질은 포유류 핵에 비효율적으로 국재화된다. EraseR 융합 단백질은 효율적이고 효과적으로 핵으로 전달되어 표적화된 핵 RNA 분열 및 분해를 허용한다. 따라서, EraseR은 유전자 발현의 비-게놈 조작을 허용하여, 기본적 연구 및 치료 응용 둘 모두에 유용하다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA의 수를 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 융합 단백질은 Cas 단백질 및 NLS를 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산분자는 서열번호: 723 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 핵 RNA의 특정한 시각화를 가능하게 하는 신규한 융합 단백질의 놀라운 개발에 기초한다. 본 명세서에서 HilightR로 명명된 이 융합 단백질은 Cas 단백질과 형광 단백질을 포함한다. Cas13에서 돌연변이는 촉매적으로 죽은 효소 (dCas)를 생성하지만 RNA 결합 친화성을 유지한다. 따라서, dCas13과 형광 단백질의 융합은 RNA의 표적화된 시각화를 허용한다. 따라서, HilightR은 핵 RNA를 포함한 RNA의 시각화를 허용한다.
CRISPR-Cas13 시스템은 RNA에만 결합하고 특정한 엔도리보뉴클레아제로 기능하여 표적 RNA를 분열하여, DNA-결합 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제와 관련된 생식계열 편집의 위험을 우회한다. 그러나, 그 크기가 크고 고유한 국재화 신호의 결여에 기인하여, Cas13 융합 단백질은 포유류 핵에 비효율적으로 국재화된다. EraseR 융합 단백질은 효율적이고 효과적으로 핵으로 전달되어 표적화된 핵 RNA 분열 및 분해를 허용한다. 따라서, EraseR은 유전자 발현의 비-게놈 조작을 허용하여, 기본적 연구 및 치료 응용 둘 모두에 유용하다.
일 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 융합 단백질은 Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 형광 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 699-701 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 융합 단백질은 Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 형광 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 728-730 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법과 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험실 절차는 당업계에 잘-알려져 있고 일반적으로 이용되는 것이다.
핵산 및 펩티드 합성에 대해 표준 기술이 사용된다. 기술 및 절차는 일반적으로 당업계의 통상적인 방법 및 다양한 일반 참고문헌 (예를 들어, Sambrook 및 Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 및 Ausubel 등, 2012, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)에 따라 수행되며, 그것은 이 문서 전반에 걸쳐서 제공된다.
본 명세서에 사용된 명명법 및 아래에 기술된 분석 화학 및 유기 합성에서 사용되는 실험실 절차는 당업계에 잘-알려지고 일반적으로 이용되는 것들이다. 화학적 합성 및 화학적 분석에 대해 표준 기술 또는 그 변형이 사용된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 용어는 (특히 청구항의 맥락에서) 본 명세서에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야한다.
양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용된 "약"은 명시된 값에서 ±20%, 또는 ±10%, 또는 ±5%, 또는 ±1%, ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미하는데, 그러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다.
"안티센스"는 특히 단백질을 인코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 비-코딩 가닥의 핵산 서열, 또는 비-코딩 가닥에 실질적으로 상동인 서열을 지칭한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 안티센스 서열은 단백질을 인코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 서열에 상보적이다. 안티센스 서열이 DNA 분자의 코딩 가닥의 코딩 부분에만 상보적일 필요는 없다. 안티센스 서열은 단백질을 인코딩하는 DNA 분자의 코딩 가닥 상에 특정된 조절 서열에 상보적일 수 있으며, 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 제어한다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화되는 동물의 건강 상태이다.
반대로, 동물에서의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만 장애가 없을 때 보다 동물의 건강 상태가 덜 호의적인 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면, 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 더 감소시키는 것은 아니다.
질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 중증도, 환자가 그러한 징후 또는 증상을 경험하는 빈도 또는 둘 모두가 감소되면, 질환 또는 장애는 "완화"된다.
"인코딩"은 정의된 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 서열 또는 정의된 아미노산의 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 역할을 하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특정한 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하면 유전자가 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동등하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인, 코딩 가닥과 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 본 명세서에 기재된 방법에 순응하는 시험관내 또는 생체내에 관계없이 임의의 동물 또는 세포를 지칭한다. 일 실시형태에서, 대상체는 척추 동물 및 무척추 동물을 포함한다. 무척추 동물은 노랑초파리 (Drosophila melanogaster) 및 예쁜꼬마선충 (Caenorhabditis elegans)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 척추 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 영장류는 침팬지, 사이노몰로지 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크 (예를 들어, 붉은털원숭이)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드척, 흰족제비, 토끼 및 햄스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가축 및 게임 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종 (예를 들어, 집 고양이), 개 종 (예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류 종 (예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 물고기 (예를 들어, 제브라피시, 송어, 메기 및 연어)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유류, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다. 특정 비-제한적 실시형태에서, 환자, 대상체 또는 개인은 인간이다.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플에서 특정 항원을 인식하지만 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차-종 반응성이 그 자체로 항체의 분류를 특정하게 변경하지는 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 다른 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체로 항체의 분류를 특정하게 변경하지는 않는다.
일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2 화학 종의 상호작용과 관련하여 사용되어 상호작용이 화학 종에 대한 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미할 수 있다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A (또는 유리, 비표지된 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자의 코딩 가닥의 뉴클레오티드 잔기 및, 각각 유전자의 전사에 의해 생성된 mRNA 분자의 코딩 영역과 상동성이거나 상보적인 유전자의 비-코딩 가닥의 뉴클레오티드로 구성된다.
mRNA 분자의 "코딩 영역"은 또한 mRNA 분자의 번역 동안 전달 RNA 분자의 항-코돈 영역과 매칭되거나 정지 코돈을 인코딩하는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 잔기로 구성된다. 따라서 코딩 영역은 mRNA 분자에 의해 인코딩된 성숙 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 단백질 배출 신호 서열에서의 아미노산 잔기)에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다.
핵산을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된 "상보성"은 2개 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행한 제2 핵산 영역의 잔기와 특정한 수소 결합 ("염기 쌍")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우 제1 가닥에 역평행한 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은 두 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있는 경우 동일한 또는 상이한 핵산의 제2 영역에 상보성이다. 일 실시형태에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분에서의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "DNA"는 데옥시리보핵산으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현"은 그 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 그 다음 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우, 이들 서열은 예를 들어 안티센스 분자, siRNA, 리보자임 등의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 제어 서열을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 제어하는 제어 서열에 부가하여, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능으로 또한 작용하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "야생형"은 통상인에 의해 이해되는 당업계의 용어이고, 자연에서 발생하여 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 의미한다.
용어 "상동성"은 상보성의 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전한 상 동성 (즉, 동일성)이 있을 수 있다. 상동성은 종종 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group. University of Wisconsin Biotechnology Center. 1710 University Avenue. Madison, Wis. 53705)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 삽입 및 기타 수정에 상동성의 정도를 할당함에 의해 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
"단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 정상적인 상황에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 그 자연 상황의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
"단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이, 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 통상적으로 그것의 공급원에서 연관되는 적어도 하나의 오염물로부터 동정되고 분리된 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 다른 형태 또는 설정으로 존재한다. 대조적으로, 비-단리된 핵산 (예를 들어, DNA 및 RNA)은 그것이 자연에 존재하는 상태에서 발견된다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 인접 유전자에 근접한 숙주 세포 염색체에서 발견된다; RNA 서열 (예를 들어, 특정한 단백질을 인코딩하는 특정한 mRNA 서열)은 다수의 단백질을 인코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로 세포에서 발견된다. 그러나, 단리된 핵산은 예로서, 핵산이 자연 세포의 것과 다른 염색체 위치에 있거나 그렇지 않으면 자연에서 발견된 것과 다른 핵산 서열이 측면에 있는 그 핵산을 통상적으로 발현하는 세포 내의 그러한 핵산을 포함한다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 단백질을 발현하는데 이용되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 함유하지만 (즉, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥일 수 있음), 센스와 안티-센스 가닥 둘 모두를 함유할 수 있다 (즉, 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥일 수 있음).
"단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"에서와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 통상적으로 그 공급원에서 연관된 적어도 하나의 오염물로부터 동정되고 분리된 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드는 자연에서 발견되는 것과 다른 형태 또는 설정으로 존재한다. 대조적으로, 비-단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질 및 효소)는 그것이 자연에 존재하는 상태에서 발견된다.
"핵산"은 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드로 구성되었든, 그리고 포스포디에스테르 연결 또는 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 설폰 연결, 및 이러한 연결의 조합과 같은 변형된 연결로 구성되었든, 임의의 핵산을 의미한다. 용어 핵산은 또한 5가지 생물학적으로 발생하는 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산을 구체적으로 포함한다. 용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
통상적인 표기법은 폴리뉴클레오티드 서열을 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'-말단이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5'-방향으로 지칭된다.
발생기 RNA 트랜스크립트에 대해 뉴클레오티드의 5'에서 3'로 부가하는 방향은 전사 방향으로 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 지칭되며; DNA 상의 기준점에서 대해 5'에 위치한 DNA 가닥 상의 서열은 "업스트림 서열"로 지칭되며; DNA 상의 기준점에 대해 3'인 DNA 가닥 상의 서열을 "다운스트림 서열"로 지칭된다.
"발현 카세트"는 전사 및 선택적으로 코딩 서열의 번역에 필요한 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생성되는 방식으로 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 용어는 또한 기능적 (예를 들어, 효소적으로 활성이고, 결합 파트너에 결합할 수 있고, 억제할 수 있는 등) 단백질 또는 폴리펩티드가 생성되는 방식으로 아미노산을 인코딩하는 서열의 연결을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어 유전자 산물을 유도성 방식으로 발현하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 상보성을 갖는 핵산이 표적 서열과 현저하게 혼성화하고 실질적으로 비-표적 서열에 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존성이고, 다수의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록 서열이 그 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비-제한적 예는 Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y에 자세히 기술되어 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍, 후그스타인 결합 또는 임의의 다른 서열 특정한 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 분열과 같은 보다 광범위한 과정의 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "보체"로 지칭된다.
"유도성" 프로모터는 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결될 때, 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도효소가 존재할 때만 유전자 생성물이 생성되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"구성적" 프로모터는 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결될 때, 유전자 생성물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에서 세포에서 생산되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 사슬로 정의된다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환 가능하다. 당업자는 핵산이 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용된 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 통상적인 클로닝 기술 및 PCR 등을 사용하여, 재조합 수단, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝을 포함하여, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대한 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄, 및 이들 중 많은 유형이 있는, 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 예를 들어, 다른 것들 중에서도, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "RNA"는 리보핵산으로 정의된다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"는 함께 자연적으로 연결되지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩 기능 (예를 들어, 프로모터, 복제의 기점, 리보솜-결합 부위 등)으로도 작용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성된 폴리펩티드로 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어로서 "변이체"는 각각 참조 핵산 서열 또는 펩티드 서열과 서열이 다르지만 참조 분자의 필수적인 생물학적 특성을 보유하는 핵산 서열 또는 펩티드 서열이다. 핵산 변이체의 서열에서 변화는 참조 핵산에 의해 인코딩된 펩티드의 아미노산 서열을 변경하지 않을 수 있거나, 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 펩티드 변이체의 서열에서 변화는 전형적으로 제한적이거나 보존적이므로, 참조 펩티드 및 변이체의 서열은 전체적으로 거의 유사하고 많은 영역에서 동등한다. 변이체 및 참조 펩티드는 임의의 조합에서 하나 이상의 치환, 첨가, 결실에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 핵산 또는 펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생하거나, 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 핵산 및 펩티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체는 돌연변이유발 기술 또는 직접적 합성에 의해 만들어 질 수 있다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포 안으로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성과 간결성을 위한 것이고 본 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6, 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6인, 그 범위 내의 개별 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계 없이 적용한다.
융합 단백질
일 양태에서, 본 발명은 핵에 효과적으로 전달되는 편집 단백질의 신규한 융합의 개발에 기초한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 효과적으로 핵으로 전달되고 핵 RNA를 분열할 수 있다.. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 효과적으로 핵으로 전달되고 핵 RNA를 시각화할 수 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 효과적으로 핵으로 전달되고 핵 RNA의 분열 및/또는 폴리아데닐화를 조절할 수 있다.
EraseR
일 양태에서, 본 발명은 효과적으로 핵으로 전달되는 편집 단백질의 신규한 융합의 개발에 기초한다. 일 양태에서, 본 발명은 제1 아미노산 서열을 갖는 편집 단백질 및 제2 아미노산 서열을 갖는 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예에는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은, 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 분열, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, dUrCas13d, 또는 이의 변이체이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; 및 East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나의 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-46 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 El a 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS 단백질은 서열번호: 75-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개의 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호:702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 702의 서열을 포함한다.
HilightR
일 양태에서, 본 발명은 효과적으로 핵에 전달되는 편집 단백질과 형광 단백질의 신규한 융합의 개발에 기초한다. 이들 융합 단백질은 형광 단백질의 시각화 능력과 촉매적으로 죽은 Cas의 프로그래밍 가능한 DNA 표적화 능력을 조합한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 제1 아미노산 서열을 갖는 CRISPR-연관 (Cas) 단백질 및 제2 아미노산 서열을 갖는 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제3 아미노산 서열을 갖는 핵 국재화 신호를 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제4 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 형광 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제5 아미노산 서열을 갖는 정제 및/또는 검출 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 절단, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, 또는 dUrCas13d이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; 및 East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3으로, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나의 변이체의 서열을 포함하며, 여기서 변이체는 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 서열번호: 1-46 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환은 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나의 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 47-48 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 Ela 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS 단백질은 서열번호: 75-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 대체를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, mCherry-MBNL1, sfGFP, sfGFP (1-10), sfGFP(1-10)-L-(11), 7xS11, sfCherry, S11, 에메랄드, 슈퍼폴드 GFP, 아자미 그린, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire, 블루 형광 단백질, EBFP, EBFP2, 아주라이트, mTagBFP, Cyan Fluorescent Proteins, eCFP, mECFP, Cerulean, mTurquoise, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, Midori-Ishi Cyan , mTFP1 (Teal), 옐로우 형광 단백질, EYFP, 토파즈, 비너스, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana, 오렌지 형광 단백질, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, dTomato-Tandem TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine, 적색 형광 단백질, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum , 또는 AQ143이다.
일 실시형태에서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, sfGFP, sfGFP(1-10), sfGFP(1-10)-L-(11), sfCherry, 또는 7xS11이다. 일 실시형태에서, 형광 단백질은 서열번호: 59-66 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 형광 단백질은 서열번호: 59-66 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 정제 및/또는 검출 태그를 포함한다. 일 실시형태에서, 태그는 융합 단백질의 N-말단 상에 있다. 일 실시형태에서, 태그는 서열번호:74에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 태그는 서열번호: 7474의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 형광 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질의 C-말단과 형광 단백질의 N-말단에 연결된다. 일 실시형태에서, 링커는 서열번호: 67-73 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 서열번호: 67-73 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 699-701 중 하나에 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 699-701 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
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일 양태에서, 본 발명은 핵에 효과적으로 전달되는 편집 단백질 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질의 신규한 융합의 개발에 기초한다. 이들 융합 단백질은 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질의 촉매적 활성과 촉매적으로 죽은 Cas의 프로그래밍 가능한 DNA 표적화 능력을 조합한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 제1 아미노산 서열을 갖는 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 및 제2 아미노산 서열을 갖는 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제3 아미노산 서열을 갖는 핵 국재화 신호를 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제4 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 제5 아미노산 서열을 갖는 정제 및/또는 검출 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 절단, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, 또는 dUrCas13d이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; 및 East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3으로, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나의 변이체의 서열을 포함하며, 여기서 변이체는 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 서열번호: 1-46 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환은 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 1-48 중 하나의 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 서열번호: 47-48 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 Ela 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS 단백질은 서열번호: 75-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 인간 3' 말단 처리 기구의 RNA 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 CPSF30, WDR33 또는 NUDT21이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21, NUDT21 돌연변이, NUDT21 이량체, NUDT21 융합 단백질 또는 이의 임의의 조합이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 인간 NUDT21, 벌레 NUDT21, 파리 NUDT21, 제브라피시 NUDT21 NUDT21_R63S, NUDT21_F103A, 또는 NUDT21의 탠덤 이량체이다.
일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 서열번호: 49-58 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 서열번호: 49-58 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 서열번호: 51-58 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 서열번호: 51-58의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 정제 및/또는 검출 태그를 포함한다. 일 실시형태에서, 태그는 융합 단백질의 N-말단 상에 있다. 일 실시형태에서, 태그는 서열번호: 74에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 태그는 서열번호: 74의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질과 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 연결한다. 일 실시형태에서, 링커는 Cas 단백질의 C-말단 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질의 N-말단에 연결된다. 일 실시형태에서, 링커는 서열번호: 67-73 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 서열번호: 67-73 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 696-698 중 하나에 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 696-698 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 화학적 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 고체상 기술 (Roberge J Y 등 (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고, 수지로부터 분열되고, 분취용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 제조업체가 제공한 지침에 따라 ABI 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 융합-단백질과 실질적인 상동성을 갖는 임의의 형태의 융합 단백질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 상동성"인 융합 단백질은 본 명세서에 개시된 융합-단백질의 아미노산 서열에 대해 약 50% 상동성, 약 70% 상동성, 약 80% 상동성, 약 90% 상동성, 약 95% 상동성, 또는 약 99% 상동성이다.
융합 단백질은 대안적으로 재조합 수단 또는 더 긴 폴리펩티드로부터의 분열에 의해 만들어 질 수 있다. 융합 단백질의 조성은 아미노산 분석이나 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비-보존 아미노산 잔기로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전적 코드에 의해 인코딩된 것일 수 있거나 아닐 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어 치환기의 부착에 의해 변형된 잔기가 있는 것, (iii) 펩티드가 본 발명의 융합 단백질의 대안적 스플라이스 변이체인 것, (iv) 펩티드의 단편 및/또는 (v) 융합 단백질이 리더 또는 분비 서열 또는 정제 (예를 들어, His-tag) 또는 검출 (예를 들어, Sv5 에피토프 태그)에 이용되는 서열과 같은 다른 펩티드와 융합된 것일 수 있다. 단편은 원래 서열의 단백질분해 분열 (다중-부위 단백질분해 포함)을 통해 생성된 펩티드를 포함한다. 변이체는 번역-후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
당업계에 공지된 바와 같이 2개 융합 단백질 간의 "유사성"은 아미노산 서열 및 하나의 폴리펩티드의 보존된 아미노산 대체물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함에 의해 결정된다. 변이체는 원래 서열과 다른 펩티드 서열을 포함하도록 정의된다. 일 실시형태에서, 변이체는 관심 있는 세그먼트 당 잔기의 25% 미만에서 원래 서열과 상이한 관심 있는 세그먼트 당 잔기의 40% 미만에서 원래 서열과 상이하거나, 관심 있는 세그먼트 당 잔기의 10% 미만만큼 상이하거나, 또는 관심 있는 세그먼트 당 단 몇개의 잔기에서 원래 단백질 서열과 상이하고 동시에 원래 서열의 기능성 및/또는 조골세포 계통 안으로 줄기 세포의 분화를 자극하는 능력을 보존하기 위해 원래 서열과 충분히 상동성이다. 본 발명은 원래 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% 또는 95% 유사하거나 동등한 아미노산 서열을 포함한다. 두 펩티드 간의 동일성의 정도는 당업자에게 널리 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 두 아미노산 서열 간의 동일성은 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다 [BLAST Manual, Altschul, S., 등, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
본 발명의 융합 단백질은 번역-후 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 범주 내에 속하는 번역-후 변형에는 신호 펩티드 분열, 글리코실화, 아세틸화, 이소프레닐화, 단백질분해, 미리스토일화, 단백질 폴딩 및 단백질분해 처리 등이 포함된다. 일부 변형 또는 처리 이벤트는 추가적인 생물학적 기구의 도입을 필요로 한다. 예를 들어, 신호 펩티드 분열 및 코어 글리코실화와 같은 처리 이벤트는 표준 번역 반응에 케이나인 마이크로솜 멤브레인 또는 제노푸스 에그 추출물 (미국 특허 번호 6,103,489)을 추가함에 의해 검사된다.
본 발명의 융합 단백질은 번역-후 변형 또는 번역 동안 비천연 아미노산을 도입함에 의해 형성된 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 단백질 번역 동안 비천연 아미노산을 도입하기 위한 다양한 접근법이 이용가능하다.
본 발명의 융합 단백질은 Reedijk 등 (The EMBO Journal 11(4):1365, 1992)에 기술된 방법과 같은 통상적인 방법을 사용하여 인산화될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 고리형 유도체도 본 발명의 일부이다. 고리화는 융합 단백질이 다른 분자와의 연계를 위해 보다 유리한 형태를 취할 수 있게 한다. 고리화는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 이황화 결합은 유리 설프히드릴기를 갖는 2개의 적절하게 이격된 구성요소 사이에 형성될 수 있거나, 아미드 결합은 한 구성요소의 아미노기와 다른 구성요소의 카르복실기 사이에 형성될 수 있다. 고리화는 또한 Ulysse, L., 등, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467에 의해 기술된 바와 같이 아조벤젠-함유 아미노산을 사용하여 달성될 수 있다. 결합을 형성하는 구성요소는 아미노산의 측쇄, 비-아미노산 구성요소 또는 둘의 조합일 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 고리형 펩티드는 우측 위치에서 베타-턴을 포함할 수 있다. 베타-턴은 우측 위치에 아미노산 Pro-Gly를 첨가함에 의해 본 발명의 펩티드 안으로 도입될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 펩티드 결합 연결을 함유하는 고리형 펩티드보다 더 유연한 고리형 융합 단백질을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 보다 유연한 펩티드는 펩티드의 우측 위치와 왼쪽 위치에 시스테인을 도입하고 두 시스테인 사이에 디설파이드 브릿지를 형성함에 의해 제조될 수 있다. 두 시스테인은 베타-시트 및 턴을 변형시키지 않도록 배열된다. 디설파이드 브릿지의 길이와 베타-시트 부분에서 수소 결합의 보다 적은 수 때문에 펩티드는 보다 유연하다. 고리형 펩티드의 상대적인 유연성은 분자 역학적 시뮬레이션에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 Cas13 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 Cas13 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 펩티드에 관한 것으로서, 여기서 융합 단백질은 그 자체로, 키메라 단백질을 원하는 세포 구성요소 또는 세포 유형 또는 조직으로 보낼 수 있는 표적 단백질 및/또는 표적화 도메인에 융합되거나 그 안으로 통합된다. 키메라 단백질은 또한 추가 아미노산 서열 또는 도메인을 함유할 수 있다. 키메라 단백질은 다양한 구성요소가 서로 다른 근원에서 유래하고, 그와 같이 자연에서는 함께 발견되지 않는다는 관점에서 재조합이다 (즉, 이종성이다).
일 실시형태에서, 표적화 도메인은 막 스패닝 도메인, 막 결합 도메인, 또는 단백질이 예를 들어 소포 또는 핵과 연합하도록 지시하는 서열일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화 도메인은 특정 세포 유형 또는 조직에 펩티드를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 표적화 도메인은 세포 표면 리간드 또는 표적 조직의 세포 표면 항원에 대한 항체일 수 있다. 표적화 도메인은 본 발명의 펩티드를 세포 구성요소에 표적화할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 키메라 단백질은 고체상 펩티드 합성을 사용한 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다. 이들 방법은 고체 또는 용액 상 합성 방법을 이용한다 (예를 들어, 고체 상 합성 기술에 대해, J. M. Stewart, 및 J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford Ill. (1984) 및 G. Barany 및 R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis Synthesis, Biology editors E. Gross 및 J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, New York, 1980, pp. 3-254; 및 고전적 용액 합성에 대해, M Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin 1984, 및 E. Gross 및 J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, suprs, Vol 1, 참고). 예로서, 본 발명의 펩티드는 N-플루오레닐메톡시-카르보닐-O-벤질-L-포스포트레오닌 유도체로서 포스포트레오닌의 직접적 혼입으로 9-플루오레닐 메톡시카르보닐 (Fmoc) 고체 상 화학을 사용하여 합성될 수 있다.
다른 분자와 접합된 본 발명의 펩티드 또는 키메라 단백질을 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질은 재조합 기술을 통해 펩티드 또는 키메라 단백질의 N-말단 또는 C-말단과, 원하는 생물학적 기능을 가진 선택된 단백질 또는 선택 가능한 마커의 서열을 융합함에 의해 제조될 수 있다. 생성된 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택된 단백질 또는 마커 단백질에 융합된 융합 단백질을 함유한다. 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 단백질의 예는 면역글로불린, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 헤마글루티닌 (HA) 및 절단된 myc를 포함한다.
본 발명의 펩티드는 생물학적 발현 시스템을 사용하여 전개될 수 있다. 이들 시스템을 사용하면 무작위 펩티드 서열의 대규모 라이브러리를 생성하고 특정 단백질에 결합하는 펩티드 서열에 대해 이들 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 라이브러리는 무작위 펩티드 서열을 적절한 발현 벡터 안으로 인코딩하는 합성 DNA를 클로닝함에 의해 생성될 수 있다 (Christian 등 1992, J. Mol. Biol. 227:711; Devlin 등, 1990 Science 249:404; Cwirla 등 1990, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 87:6378 참고). 라이브러리는 또한 중첩하는 펩티드의 동시 합성에 의해 구축될 수 있다 (미국 특허 번호 4,708,871 참고).
본 발명의 펩티드 및 키메라 단백질은 염산, 황산, 브롬화수소산, 인산 등과 같은 무기산, 또는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 살리실산, 베네젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 반응함에 의해 약학적 염으로 전환될 수 있다.
핵산
일 양태에서, 본 발명은 효과적으로 핵에 전달되는 편집 단백질의 신규한 융합을 인코딩하는 핵산의 개발에 기초한다. 일 실시형태에서, 핵산은 효과적으로 핵에 전달될 수 있고 핵 RNA를 분열할 수 있는 융합 단백질을 인코딩한다. 일 실시형태에서, 핵산은 효과적으로 핵에 전달될 수 있고 핵 RNA를 시각화할 수 있는 융합 단백질을 인코딩한다. 일 실시형태에서, 핵산은 효과적으로 핵에 전달될 수 있고 핵 RNA의 분열 및/또는 폴리아데닐화를 조절할 수 있는 융합 단백질을 인코딩한다.
EraseR
일 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 편집 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 및 핵 국재화 신호 (NLS)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은, 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 절단, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, 또는 dUrCas13d이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; 및 East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3으로, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-46 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 707-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 Ela 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 724에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:724의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호:702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 702의 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 702의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
HilightR
일 양태에서, 본 발명은 효과적으로 핵에 전달되는 편집 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 신규한 핵산의 개발에 기초한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 편집 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 및 형광 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 핵 국재화 신호 (NLS)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 링커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 절단, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, 또는 dUrCas13d이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; and East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3으로, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나의 변이체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 변이체는 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 서열번호: 1-46 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환은 Cas 단백질은 촉매적으로 불활성화시킨다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 47-48 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 707-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 Ela 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 724에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 724의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, mCherry-MBNL1, sfGFP, sfGFP(1-10), sfGFP(1-10)-L-(11), sfCherry 7xS11, S11, 에메랄드, 슈퍼폴드 GFP, 아자미 그린, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire, 블루 형광 단백질, EBFP, EBFP2, 아주라이트, mTagBFP, 시안 형광 단백질, eCFP, mECFP, Cerulean, mTurquoise, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1 (Teal), 옐로우 형광 단백질, EYFP, 토파즈, 비너스, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana, 오렌지 형광 단백질, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine, 적색 형광 단백질, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, 또는 AQ143이다.
일 실시형태에서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, sfGFP, sfGFP(1-10), sfGFP(1-10)-L-(11), sfCherry 또는 7xS11이다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 59-66 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 59-66 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 718-721 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 718-721 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 태그를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 74에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 7474의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 723에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 723의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 링커를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 67-73 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 67-73.74 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 722에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 722723의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 699-701 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 699-701 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 728-730 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 728-730 중 하나의 서열을 포함한다.
PostscriptR
일 양태에서, 본 발명은 효과적으로 핵에 전달되는 편집 단백질 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 신규한 핵산의 개발에 기초한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 편집 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 및 분열 및/또는 폴리아데닐화를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 핵 국재화 신호 (NLS)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 링커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 편집 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 단백질, 및 DNA 또는 RNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2. Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, SpCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CjCas9, CjCas9, AsCpf1, LbCpf1, FnCpf1, VRER SpCas9, VQR SpCas9, xCas9 3.7, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 DNA 또는 RNA 분열 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기쌍 내의 하나 또는 두 가닥의 분열을 지시한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9, Cas13 또는 Cpf1이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 촉매적으로 결핍이다 (dCas).
일 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas13이다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 PspCas13b, PspCas13b 절단, AdmCas13d, AspCas13b, AspCas13c, BmaCas13a, BzoCas13b, CamCas13a, CcaCas13b, Cga2Cas13a, CgaCas13a, EbaCas13a, EreCas13a, EsCas13d, FbrCas13b, FnbCas13c, FndCas13c, FnfCas13c, FnsCas13c, FpeCas13c, FulCas13c, HheCas13a, LbfCas13a, LbmCas13a, LbnCas13a, LbuCas13a, LseCas13a, LshCas13a, LspCas13a, Lwa2cas13a, LwaCas13a, LweCas13a, PauCas13b, PbuCas13b, PgiCas13b, PguCas13b, Pin2Cas13b, Pin3Cas13b, PinCas13b, Pprcas13a, PsaCas13b, PsmCas13b, RaCas13d, RanCas13b, RcdCas13a, RcrCas13a, RcsCas13a, RfxCas13d, UrCas13d, dPspCas13b, PspCas13b_A133H, PspCas13b_A1058H, dPspCas13b truncation, dAdmCas13d, dAspCas13b, dAspCas13c, dBmaCas13a, dBzoCas13b, dCamCas13a, dCcaCas13b, dCga2Cas13a, dCgaCas13a, dEbaCas13a, dEreCas13a, dEsCas13d, dFbrCas13b, dFnbCas13c, dFndCas13c, dFnfCas13c, dFnsCas13c, dFpeCas13c, dFulCas13c, dHheCas13a, dLbfCas13a, dLbmCas13a, dLbnCas13a, dLbuCas13a, dLseCas13a, dLshCas13a, dLspCas13a, dLwa2cas13a, dLwaCas13a, dLweCas13a, dPauCas13b, dPbuCas13b, dPgiCas13b, dPguCas13b, dPin2Cas13b, dPin3Cas13b, dPinCas13b, dPprCas13a, dPsaCas13b, dPsmCas13b, dRaCas13d, dRanCas13b, dRcdCas13a, dRcrCas13a, dRcsCas13a, dRfxCas13d, 또는 dUrCas13d이다. 추가의 Cas 단백질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Konermann 등, Cell, 2018, 173:665-676 e14, Yan 등, Mol Cell, 2018, 7:327-339 e5; Cox, D.B.T., 등, Science, 2017, 358: 1019-1027; Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550: 280-284, Gootenberg 등, Science, 2017, 356: 438-442; and East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66: 373-383 e3으로, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나의 변이체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 변이체는 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 갖는 서열번호: 1-46 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환은 Cas 단백질을 촉매적으로 불활성화시킨다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 47-48 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 705-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 707-708 중 하나의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 레트로트랜스포존 NLS이다. 일 실시형태에서, NLS는 Ty1, 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 대형 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 Ela 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유류 라민, c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질, 뉴클레오플라스민 (NPM2), 뉴클레오포스민 (NPM1) 또는 simian vims 40 ("SV40") T-항원으로부터 유래된다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1 또는 Ty1-유래 NLS, Ty2 또는 Ty2-유래 NLS 또는 MAK11 또는 MAK11-유래 NLS이다. 일 실시형태에서, Ty1 NLS는 서열번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty2 NLS는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, MAK11 NLS는 서열번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 Ty1-유사 NLS이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 KKRX 및 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 N-말단에 KKRX 및 C-말단에 KKR 모티프를 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 적어도 20개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 20개 내지 40개 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS는 서열번호: 83-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS는 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함하며, 여기서 서열은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상, 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, Ty1-유사 NLS 단백질은 서열번호: 83-695 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, NLS는 동일한 NLS의 2개 카피를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NLS는 제1 Ty1-유래 NLS 및 제2 Ty1-유래 NLS의 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 724에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, NLS를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 724의 핵산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 인간 3' 말단 처리 기구의 RNA 결합 단백질이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 CPSF30, WDR33, 또는 NUDT21이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21, NUDT21 돌연변이, NUDT21 이량체, NUDT21 융합 단백질 또는 이의 임의의 조합이다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 인간 NUDT21, 벌레 NUDT21, 파리 NUDT21, 제브라피시 NUDT21 NUDT21_R63S, NUDT21_F103A, 또는 NUDT21의 탠덤 이량체이다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 49-58 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 49-58 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 51-58 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 51-58 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 711-717 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 711709-717 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 709-717 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 709-717 중 하나의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 태그를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호:74에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 7474의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호:723에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 723의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 링커를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 67-73 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 67-73.74 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 722에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호: 722723의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 696-698 중 하나의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 725-727 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호: 725-727 중 하나의 서열을 포함한다.
융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 서열은, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하고, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함에 의해, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리함에 의한 것과 같이, 당업계에 공지된 임의의 많은 재조합 방법을 사용하여 획득될 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자는 클로닝 대신 합성적으로 생산될 수 있다.
단리된 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 조성물은 예를 들어 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 cDNA 분자를 포함하는 단리된 DNA 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 RNA 분자 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 세포 배양을 위한 혈청 또는 성장 배지에서 안정성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 변형은 안정성, 기능성 및/또는 특이성을 증진시키고 본 발명의 핵산 분자의 면역자극 특성을 최소화하기 위해 추가될 수 있다. 예를 들어, 안정성을 향상시키기 위해, 3'-잔기는 분해에 대해 안정화될 수 있으며, 예를 들어 그것이 퓨린 뉴클레오티드, 특히 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드로 구성되도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들어 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘의 치환이 허용되고 분자의 기능에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말단은 변형된 뉴클레오티드 유사체를 통합함에 의해 안정화될 수 있다.
뉴클레오티드 유사체의 비-제한적인 예는 당- 및/또는 백본-변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다 (즉, 인산염-당 백본에 대한 변형을 포함한다). 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 질소 또는 황 헤테로 원자 중 적어도 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 예시적인 백본-변형된 리보뉴클레오티드에서 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된 포스포에스테르기는, 예를 들어, 포스포티오에이트기의 변형된 기에 의해 대체된다. 예시적인 당-변형된 리보뉴클레오티드에서, 2' OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 ON으로부터 선택된 기에 의해 대체되고, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다.
변형의 다른 예는 핵염기-변형된 리보뉴클레오티드, 즉 자연적으로 발생하는 핵염기 대신 적어도 하나의 비-자연적으로 발생하는 핵염기를 함유하는 리보뉴클레오티드이다. 염기는 아데노신 데아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. 예시적인 변형된 핵염기는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 5-위치에서 변형된 우리딘 및/또는 시티딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8 위치에서 변형된 아데노신 및/또는 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 적합하다. 상기 변형은 조합될 수 있음을 유의해야 한다.
일부 예에서, 핵산 분자는 다음 화학적 변형 중 적어도 하나를 포함한다: 하나 이상의 뉴클레오티드의 2'-H, 2'-O-메틸, 또는 2'-OH 변형. 특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 뉴클레아제에 대한 증진된 내성을 가질 수 있다. 증가된 뉴클레아제 내성을 위해, 핵산 분자는, 예를 들어 2'-변형된 리보스 단위 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기 (OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 변형되거나 대체될 수 있다. 증가된 뉴클레아제 내성을 위해 본 발명의 핵산 분자는 2'-O-메틸, 2'-불소, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노프로필, 2'-아미노 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 잠긴 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 예를 들어 2'-4'-에틸렌-브릿지된 핵산 및 특정 핵염기 변형 예컨대, 2-아미노-A, 2-티오 (예를 들어, 2-티오-U), G-클램프 변형의 함입은 또한 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 2'-변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA)를 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 일부 실시형태에서, 핵산 분자의 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
본 명세서에서 논의된 핵산 제제는 달리 비변형된 RNA 및 DNA뿐만 아니라, 예를 들어 효능을 개선하기 위해 변형된 RNA 및 DNA, 및 뉴클레오시드 대리물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 구성요소, 즉 당, 염기 및 인산염 모이어티가 자연에서 발생하거나 인체에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 본질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 당해 기술은 희귀하거나 비정상적이지만 자연적으로 발생하는 RNA를 변형된 RNA로 지칭하고 있고, 예를 들어, Limbach 등 (Nucleic Acids Res., 1994, 22:2183-2196)를 참고한다. 종종 변형된 RNA라고 불리는 이러한 희귀하거나 비정상적인 RNA는 전형적으로 전사-후 변형의 결과이고 본 명세서에서 사용되는 용어 비변형 RNA 내에 있다. 본 명세서에 사용된, 변형된 RNA는 핵산의 하나 이상의 구성요소, 즉 당, 염기 및 인산염 모이어티가 자연에서 발생하는 것과 다르거나 인체에서 발생하는 것과 다르다. 그것은 "변형된 RNA"로 지칭되지만, 물론 변형으로 인해 엄밀히 말하면 RNA가 아닌 분자를 포함한다. 뉴클레오시드 대체물은 리보포스페이트 백본이 염기가 올바른 공간적 관계로 제시되도록 하는 비-리보포스페이트 작제물로 대체되어 하이브리드화가 리보포스페이트 백본으로 보이는 것, 예를 들어, 리보포스페이트 백본의 비-하전된 모방체와 실질적으로 유사한 분자이다.
본 발명의 핵산의 변형은 포스페이트 기, 당 기, 백본, N-말단, C-말단 또는 핵염기 중 하나 이상에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산이 삽입된 벡터를 포함한다. 당해 기술에서 본 발명에 유용한 적절한 벡터는 충분하다.
간단히 요약하면, 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 그 작제물을 발현 벡터 안으로 합체함에 의해 달성된다. 사용되는 벡터는 복제 및 선택적으로 진핵 세포에서의 통합에 적합하다. 전형적인 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
본 발명의 벡터는 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 치료에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466을 참고한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자 치료 벡터를 제공한다.
본 발명의 단리된 핵산은 다수의 벡터 유형 안으로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터 안으로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
더욱이, 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Sambrook 등 (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제의 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
전달 시스템 및 방법
일 양태에서, 본 발명은 신규한 렌티바이러스 패키징 및 전달 시스템의 개발에 관한 것이다. 렌티바이러스 입자는 바이러스 효소를 단백질로서 전달한다. 이 방식에서, 렌티바이러스 효소는 수명이 짧기 때문에 세포의 전체 수명 동안 장기 발현으로 인한 표적을 벗어난 편집 가능성을 제한한다. 편집 구성요소, 또는 렌티바이러스 입자에서 단백질로서 기존 CRISPR-Cas 편집 구성요소의 통합은 그 필요한 활성이 단지 짧은 시간 동안에만 필요하다는 점을 감안하여 유리한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 렌티바이러스 전달 시스템 및 본 발명의 조성물 전달, 유전 물질 편집 및 렌티바이러스 전달 시스템을 사용한 핵산 전달의 방법을 제공한다.
일 양태에서, 전달 시스템은 (1) 패키징 플라스미드 (3) 엔벨롭 플라스미드, 및 (4) VPR 플라스미드를 포함한다. 일 실시형태에서, 패키징 플라스미드는 gag-pol 폴리단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, gag-pol 폴리단백질은 촉매적으로 죽은 인테그라제를 포함한다. 일 실시형태에서, gag-pol 폴리단백질은 D116N 인테그라제 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에서, 엔벨롭 플라스미드는 엔벨롭 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 엔벨롭 플라스미드는 HIV 엔벨롭 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 엔벨롭 플라스미드는 소포성 구내염 바이러스 g-단백질 (VSV-g) 엔벨롭 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 엔벨롭 단백질은 원하는 세포 유형에 기초하여 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, VPR 플라스미드는 VPR, Cas 단백질 및 하나 이상의 NLS, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, VPR 플라스미드는 VPR, Cas 단백질 및 하나 이상의 NLS, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, VPR 플라스미드는 VPR, Cas 단백질 및 하나 이상의 NLS, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 VPR과 Cas 단백질 NLS 사이의 프로테아제 분열 부위, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 또는 형광 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, VPR 플라스미드 패키징 플라스미드는 가이드 RNA 서열을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 패키징 플라스미드, 트랜스퍼 플라스미드, 엔벨롭 플라스미드 및 VPR 플라스미드는 세포 안으로 도입된다. 일 실시형태에서, 세포는 gag-pol 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 전사하고 번역하여 gag-pol 폴리단백질을 생성한다. 일 실시형태에서, 세포는 엔벨롭 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 전사하고 번역하여 엔벨롭 단백질을 생성한다. 일 실시형태에서, 세포는 융합 단백질을 전사하고 번역하여 VPR-융합 단백질을 생성한다. 일 실시형태에서, 세포는 융합 단백질을 전사하고 번역하여 VPR-융합 단백질을 생성한다. 일 실시형태에서, 세포는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 전사한다.
일 실시형태에서, 가이드 RNA에 결합된 gag-pol 단백질, 엔벨롭 폴리단백질 및 VPR-융합 단백질은 바이러스 입자 안으로 패키징된다. 일 실시형태에서, 바이러스 입자는 세포 배지로부터 수집된다. 일 실시형태에서, VPR은 프로테아제 부위를 통해 바이러스 입자의 융합 단백질로부터 절단되어 Cas-융합 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서, 바이러스 입자는 표적 세포를 형질도입하고, 여기서 가이드 RNA는 RNA의 표적 영역에 결합하여 Cas 융합 단백질을 표적화한다.
더욱이, 포유류 세포 안으로의 유전자 전달을 위해 다수의 추가 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자를 벡터 안으로 삽입하고 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 그 다음 재조합 바이러스는 단리되고 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
예를 들어, 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스에서 유래된 벡터는 이식유전자의 장기적이고, 안정적인 합체와 딸 세포에서의 그 증식을 허용하기 때문에 장기적 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤어라인 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 부가된 이점을 갖는다. 그것은 또한 낮은 면역원성의 부가된 이점을 갖는다.
일 실시형태에서, 조성물은 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 벡터를 포함한다. 용어 "AAV 벡터"는 제한 없이 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 및 AAV-9를 포함하는 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 의미한다. AAV 벡터는 다양한 장애의 치료를 위한 강력한 유전자 전달 도구가 되었다. AAV 벡터는 병원성의 결여, 최소한의 면역원성 및 안정적이고 효율적인 방식으로 유사분열후 세포를 형질도입하는 능력을 포함하여 유전자 치료에 이상적으로 적합하게 하는 다수의 기능을 보유한다. AAV 벡터 내에 함유된 특정 유전자의 발현은 AAV 혈청형, 프로모터 및 전달 방법의 적절한 조합을 선택함으로써 하나 이상의 유형의 세포에 특이적으로 표적화될 수 있다.
AAV 벡터는 전체 또는 일부, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자에서 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자를 가질 수 있지만, 기능적 측면 ITR 서열은 유지한다. 높은 수준의 상동성에도 불구하고, 다른 혈청형은 다른 조직에 대해 향성을 갖는다. AAV1에 대한 수용체는 알려져 있지 않다; 그러나, AAV1은 AAV2보다 골격 및 심장 근육을 더 효율적으로 형질도입하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 연구는 AAV2 ITR이 측면에 있는 벡터 DNA가 대안적 혈청형의 캡시드 안으로 패키징된 유사형의 벡터로 수행되었으므로, 생물학적 차이가 게놈보다는 캡시드와 관련이 있음이 분명한다. 최근 증거는 AAV 1 캡시드에 패키징된 DNA 발현 카세트가 AAV2 캡시드에 패키징된 것보다 심근세포를 형질도입하는데 적어도 1 log 10 더 효율적이라는 것을 나타낸다. 일 실시형태에서, 바이러스 전달 시스템은 아데노-관련 바이러스 전달 시스템이다. 아데노-관련 바이러스는 혈청형 1 (AAV 1), 혈청형 2 (AAV2), 혈청형 3 (AAV3), 혈청형 4 (AAV4), 혈청형 5 (AAV5), 혈청형 6 (AAV6), 혈청형 7 (AAV7), 혈청형 8 (AAV8) 또는 혈청형 9 (AAV9)일 수 있다.
벡터로의 조립을 위한 바람직한 AAV 단편은 vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역을 포함하는 cap 단백질, rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40을 포함하는 rep 단백질 및 이들 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 이들 단편은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 쉽게 이용될 수 있다. 이러한 단편은 단독으로, 다른 AAV 혈청형 서열 또는 단편과 조합하여, 또는 다른 AAV 또는 비-AAV 바이러스 서열의 요소와 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 인공 AAV 혈청형은 제한 없이 비-자연적으로 발생하는 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 포함한다. 이러한 인공 캡시드는 다른 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비-연속적 부분으로부터, 비-AAV 바이러스 근원으로부터 또는 비-바이러스 근원으로부터 얻을 수 있는 이종성 서열과 조합하여 선택된 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하는 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 제한 없이 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있다. 따라서 하나 이상의 단백질의 발현에 적합한, 예시적인 AAV 또는 인공 AAV는 다른 것들 중에서도 AAV2/8 (미국 특허 번호 7,282,199 참고), AAV2/5 (국립 보건원으로부터 이용 가능함), AAV2/9 (국제 특허 공개 번호 WO2005/033321), AAV2/6 (미국 특허 번호 6,156,303) 및 AAVrh8 (국제 특허 공개 번호 WO2003/042397)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 본 발명에 의해 생성된 바이러스로 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 도입유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 있는 유전자와 인접하는 발현 조절 서열 및 관심 유전자를 조절하기 위해 트랜스에서 또는 떨어져서 작용하는 발현 조절 서열 둘 모두를 포함한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 증진시키는 서열 (즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 매우 많은 수의 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
추가 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로 이들은 시작 부위의 업스트림 30-110 bp 영역에 위치되지만, 최근에 다수의 프로모터가 역시 시작 부위의 다운스트림에 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 유연하므로 요소가 서로 반전되거나 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 한 예는 즉시 초기 거대세포 바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 여기에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 연장 성장 인자(Elongation Growth Factor)-1α (EF-1α)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, Epstein-Barr 바이러스 즉시 초기 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 그러한 발현이 바람직할 때 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나 발현을 원하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
벡터 상에서 발견되는 인핸서 서열은 또한 그 안에 함유된 유전자의 발현을 조절한다. 전형적으로 인핸서는 단백질 인자와 결합하여 유전자의 전사를 증진시킨다. 인핸서는 그것이 조절하는 유전자의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. 인핸서는 특정한 세포 또는 조직 유형에서 전사를 증진시키기 위해 조직-특이적일 수도 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 벡터 내에 존재하는 유전자의 전사를 증강하는 하나 이상의 인핸서를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 발현을 평가하기 위해, 세포 안으로 도입될 발현 벡터는 또한 선별 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있어, 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염되도록 시도된 세포의 모집단으로부터 발현 세포의 동정 및 선별을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 가능한 마커는 별도의 DNA 조각 상으로 운반될 수 있고 공-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 측면에 위치할 수 있다. 유용한 선별 가능한 마커는, 예를 들어, 네오 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 예를 들어 효소 활성 같은 일부 쉽게 검출 가능한 특성에 의해 그 발현이 명백하게 되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포 안으로 도입된 후 적절한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, Ui-Tei 등, 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 획득될 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 수준의 리포터 유전자의 발현을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 작제물이 프로모터로 동정된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대한 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
유전자를 세포 안으로 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 안으로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 안으로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입하는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등 (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참고한다. 숙주 세포 안으로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 예시적인 방법은 인산 칼슘 형질감염이다.
관심 있는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입하는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 예를 들어 인간 세포 안으로 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,350,674 및 5,585,362를 참고한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입하는 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함한 지질-기반 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 숙주 세포 안으로 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 핵산을 도입하기 위해 지질 제형의 사용이 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되고, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체화되고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 결합되고, 지질에 현탁액으로 함유되고, 미셀과 함께 함유되거나 이와 복합체화되고, 또는 그렇지 않으면 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그것은 이중층 구조, 미셀 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그것은 또한 단순히 용액에 산재되어, 가능하기로는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그 유도체 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma로부터 획득될 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K&K Laboratories (뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 획득될 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 획득될 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (알라바마주 버닝햄 소재)으로부터 획득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에 지질의 저장 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로 사용된다. "리포솜"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중 라멜라의 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 다중 라멜라의 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 복수의 지질층을 갖는다. 그것은 인지질이 과잉의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성요소는 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자기-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh 등, 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물이 또한 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
숙주 세포 안으로 외인성 핵산을 도입하는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 Southern and Northern 블랏팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블랏)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 제제를 동정하기 위해 본 명세서에 기재된 검정에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
시스템
일 양태에서, 본 발명은 RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두를 조절하기 위한 시스템을 제공한다. 일 실시형태에서, 시스템은 하나 이상의 벡터에 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질, 및 핵 국재화 신호 (NLS); 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템 crRNA는 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 실질적으로 혼성화한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 동일한 벡터에 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 상이한 벡터에 있다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-46 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; (2) 서열번호: 51-58 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (3) 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열으로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; (2) 서열번호: 51-58 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (3) 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 696-698 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 RNA 트랜스크립트의 수를 감소시키기 위한 시스템을 제공한다. 일 실시형태에서, 시스템은 하나 이상의 벡터에 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질 및 핵 국재화 신호 (NLS); 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템 crRNA는 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 실질적으로 혼성화한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 동일한 벡터에 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 상이한 벡터에 있다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-46 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (2) 서열번호: 75-695 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (2) 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 702의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA를 시각화하기 위한 시스템을 제공한다. 일 실시형태에서 시스템은 하나 이상의 벡터에 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 CRISPR-연관 (Cas) 단백질, 형광 단백질 및 핵 국재화 신호 (NLS); 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템 crRNA는 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 실질적으로 혼성화한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 동일한 벡터에 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 CRISPR-Cas 시스템 crRNA를 코딩하는 핵산 서열은 상이한 벡터에 있다.
일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-46 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; (2) 서열번호: 59-66 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (3) 서열번호: 699-701 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (1) 서열번호: 1-48 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; (2) 서열번호: 59-66 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; 및 (3) 서열번호: 75-695 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 699-701 중 하나의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
시스템 및 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 트랜스크립트 (예를 들어, 핵산 트랜스크립트, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 트랜스크립트는 대장균, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포와 같은 박테리아 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에서 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터 시스템은, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물에 도입되고 번식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원핵생물은 진핵생물 세포 안으로 도입될 벡터의 카피를 증폭하기 위해 또는 진핵생물 세포 안으로 도입될 벡터의 생산에서 매개 벡터로서 사용된다 (예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드 증폭). 일부 실시형태에서, 원핵생물은 벡터의 카피를 증폭하고, 예컨대 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 전달하기 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 하나 이상의 핵산을 발현하는 데 사용된다. 원핵생물에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터와 함께 대장균에서 가장 자주 수행된다. 융합 벡터는 재조합 단백질의 아미노 말단과 같이 그 안에 인코딩된 단백질에 다수의 아미노산을 추가한다. 이러한 융합 벡터는 하나 이상의 목적, 예컨대: (i) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; (ii) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 그리고 (iii) 친화성 정제에서 리간드로 작용함에 의해 재조합 단백질의 정제에 도움이 되는 작용을 할 수 있다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제에 후속하는 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 하기 위해 융합 모이어티와 재조합 단백질의 접합부에 단백질분해 분열 부위가 도입된다. 이러한 효소 및 그 동계 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 융합 발현 벡터의 예는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A.를 각각 표적 재조합 단백질에 융합하는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 및 Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, 매사추세츠주 베벌리 소재) 및 pRIT5 (Pharmacia, 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)를 포함한다.
적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann 등, (1988) Gene 69: 301-315) 및 pET 11d (Studier 등, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세리비새에서 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari, 등, 1987. EMBO J.　6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell　30: 933-943), pJRY88 (Schultz 등, 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 picZ (InVitrogen Corp, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용 가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith, 등, 1983. Mol. Cell. Biol.　3: 2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers, 1989. Virology　170: 31-39)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수있다. 포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) 및 pMT2PC (Kaufman, 등, 1987. EMBO J. 6: 187-195)를 포함한다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40 및 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지된 다른 것들로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는, 예를 들어, Chapters 16 and 17 of Sambrook, 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989를 참고한다.
일부 실시형태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 지시할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현하는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 알려져 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert, 등, 1987. Genes Dev.　1: 268-277), 림프구-특이적 프로모터 (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) 및 면역글로불린 (Baneiji, 등, 1983. Cell 33: 729-740); Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), 뉴런-특이적 프로모터 (예를 들어, 신경필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund, 등, 1985. Science 230: 912-916) 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 우유 유청 프로모터; 미국 특허 번호 4,873,316 및 유럽 출원 공개 번호 264,166)를 포함한다. 발달적으로-조절된 프로모터, 예를 들어 뮤어라인 hox 프로모터 (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 α-태아단백 프로모터 (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)가 또한 포괄된다.
일부 실시형태에서, 조절 요소는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하기 위해 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 SPIDR (SPacer Interspersed Direct Repeats)로도 알려진, CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)은 통상적으로 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌 패밀리를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 대장균 (Ishino 등, J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; 및 Nakata 등, J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]) 및 관련된 유전자에서 인식되는 별개의 부류의 산재된 짧은 서열 반복 (SSR)을 포함한다. 유사한 산재된 SSR은 할로페락스 메디테라네이, 스트렙토코커스 피오게네스, 아나배나 및 미코박테리움 튜버큘로시스에서 동정되었다 (Groenen 등, Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe 등, Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl 등, Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; 및 Mojica 등, Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995] 참고). CRISPR 유전자좌는 전형적으로 짧은 규칙적으로 이격된 반복 (SRSR)이라고 하는 반복의 구조에 의해 다른 SSR과 상이하다 (Janssen 등, OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2002]; 및 Mojica 등, Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). 일반적으로, 반복은 실질적으로 일정한 길이를 갖는 고유한 개재하는 서열에 의해 규칙적으로 이격된 클러스터에서 발생하는 짧은 요소이다 (Mojica 등, [2000], 상동). 반복 서열은 균주간에 고도로 보존되지만, 산재된 반복의 수와 스페이서 영역의 서열은 전형적으로 균주마다 상이하다 (van Embden 등, J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). CRISPR 유전자좌는 에어로피럼, 피로바큘럼, 술포로버스, 아캐오글로버스, 할로칼큘라, 메타노박테리움, 메타노코커스, 메타노살시나, 메타노피루스, 피로코커스, 피크로필루스, 써니오플라스니아, 코리네박테리움, 미코박테리움, 스트렙토마이세스, 아퀴플스, 포피로모나스, 클로로비움, 써무스, 바실러스, 리스테리아, 스타필로코커스, 클로스트리디움, 써모안에어로박터, 미코플라즈마, 푸소박테리움, 아자르쿠스, 크로모박테리움, 네이세리아, 니트로소모나스, 데술포비브리오, 게오박터, 미로코커스, 캄피로박터, 월리넬라, 아시네토박터, 어위니아, 에쉬리키아, 레지오넬라, 메틸코커스, 파스테우렐라, 포토박테리움, 살모넬라, 크산토모나스, 예르시니아, 트레포네마, 및 써모토가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 40 초과의 원핵생물에서 동정되었다 (예를 들어, Jansen 등, Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; 및 Mojica 등, [2005] 참고).
본 명세서에서 사용된, "표적 서열"은 crRNA 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 필수적으로 요구되지는 않는다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 있을 수 있다.
표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 crRNA의 능력은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 테스트되는 가이드 서열을 포함한, 핵산-표적화 복합체를 형성하기에 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 구성요소는, 핵산-표적화 복합체의 구성요소를 인코딩하는 벡터로 형질감염과, 이어서 본 명세서에 기재된 서베이어 (Surveyor) 검정에 의해서와 같이 표적 핵산 서열 내의 우선적 표적화 (예를 들어, 분열)의 평가에 의해서와 같이, 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 핵산 서열의 분열은 표적 핵산 서열, 테스트되는 가이드 서열을 포함하는 핵산-표적화 복합체의 구성요소 및 테스트 가이드 서열와 상이한 제어 가이드 서열을 제공하고, 테스트와 제어 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 또는 분열의 속도를 비교함에 의해 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하고 당업자에게 일어날 것이다. crRNA 서열 및 따라서 핵산-표적화 crRNA는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 핵소체 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 및 작은 세포질 RNA (scRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA, pre-mRNA 및 rRNA로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA로 구성된 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 더 바람직한 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내에서 2차 구조의 각도를 감소시키기 위해 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지 계산을 기반으로 한다. 그러한 알고리즘 중 하나의 예는 Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9(1981), 133-148)에 의해 기술된 바와 같은 mFold이다. 또 다른 폴딩 알고리즘 예는 비엔나 대학의 이론 화학 연구소에서 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여 개발된 온라인 웹 서버 RNAfold이다 (예를 들어, A. R. Gruber 등, 2008, Cell　106(1): 23-24; 및 PA Carr 및 GM Church, 2009, Nature Biotechnology　27(12): 1151-62 참고).
일부 실시형태에서, crRNA는 핵산-표적화 가이드 내에서 2차 구조 각도를 감소시키기 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 핵산-표적화 가이드의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 또는 그 이하는 최적으로 접었을 때 자체-상보성 염기 페어링에 참여한다. 최적의 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지 계산을 기반으로 한다. 그러한 알고리즘 중 하나의 예는 Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9(1981), 133-148)에 의해 기술된 바와 같은 mFold이다. 또 다른 폴딩 알고리즘 예는 비엔나 대학의 이론 화학 연구소에서 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여 개발된 온라인 웹 서버 RNAfold이다 (예를 들어, A. R. Gruber 등, 2008, Cell　106(1): 23-24; 및 PA Carr 및 GM Church, 2009, Nature Biotechnology　27(12): 1151-62 참고).
특정 실시형태에서, crRNA는 직접 반복 (DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, crRNA는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 업스트림 (즉, 5')에 위치할 수 있다. 다른 실시형태에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 다운스트림 (즉, 3')에 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, crRNA는 스템 루프를 포함한다. 일 실시형태에서, crRNA는 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 실시형태에서, 직접 반복 서열은 스템 루프를 형성한다. 일 실시형태에서, 직접 반복 서열은 단일 스템 루프를 형성한다.
일 실시형태에서, crRNA는 표적 서열에 대한 표적화하는 Cas13의 활성, Cas13 촉매 활성 또는 둘 모두를 증진시킨다. 예를 들어, 일 실시형태에서, crRNA crRNA 서열은 그의 직접 반복 서열에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, crRNA는 T17C 점 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, crRNA는 T18C 점 돌연변이를 포함한다.
약학적 조성물 및 제형
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 본 발명의 약학적 조성물 또는 이의 염의 용도를 포괄한다. 이러한 약학적 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 본 발명의 적어도 하나의 조절제 (예를 들어, 억제제 또는 활성화제) 조성물 또는 이의 염으로 구성될 수 있거나, 또는 약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 조절제 (예를 들어, 억제제 또는 활성화제) 조성물 또는 이의 염 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 하나 이상의 추가 성분, 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 당업계에 널리 공지된 바와 같이 생리학적으로 허용 가능한 양이온 또는 음이온과의 조합과 같은, 생리학적으로 허용 가능한 염의 형태로 약학적 조성물에 존재할 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 약학적 조성물은 1ng/kg/일 내지 100mg/kg/일의 용량을 전달하도록 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명을 실시하는데 유용한 약학적 조성물은 1ng/kg/일 내지 500mg/kg/일의 용량을 전달하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료 대상체의 신원, 크기 및 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되어 지는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로써, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강, 협측, 안과 또는 다른 투여 경로에 적합하게 개발될 수 있다. 본 발명의 방법 내에 유용한 조성물은 포유류의 피부 또는 임의의 다른 조직에 직접 투여될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재밀봉된 적혈구 및 면역학적-기반 제형을 포함한다. 투여의 경로(들)는 숙련된 기술자에게 쉽게 명백할 것이고 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 치료되는 가축 또는 인간 대상체의 유형 및 연령 등을 포함하는 임의의 수의 인자에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 제형은 약리학의 분야에서 공지되거나 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함하고, 그 다음 필요하거나 바람직하다면, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 예를 들어, 그러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 그러한 투여량의 편리한 분획과 동일하다. 단위 투여량 형태는 단일 매일 용량 또는 다중 매일 용량 (예를 들어, 1일당 약 1 내지 4회 이상) 중 하나일 수 있다. 다중 매일 용량이 사용되는 경우, 단위 투여량 형태는 각 용량에 대해 동일하거나 다를 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 사용하여 제형화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 화합물 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 유용한 약학적으로 허용 가능한 담체는 글리세롤, 물, 식염수, 에탄올 및 기타 약학적으로 허용 가능한 염 용액 예컨대 인산염 및 유기산 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., 뉴저지주 소재)에 기술되어 있다.
담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성 될 수 있다. 많은 경우에 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 또는 만니톨 및 소르비톨과 같은 폴리알코올이 조성물에 포함된다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴에 의해 야기될 수 있다. 일 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 DMSO 단독이 아니다.
제형은 통상적인 부형제, 즉 경구, 질, 비경구, 비강, 정맥내, 피하, 장내 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 투여 방식에 적합한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 이용될 수 있다. 약학적 제제는 멸균될 수 있고 원하는 경우 보조제, 예를 들어 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압 완충액에 영향을 미치는 염, 착색제, 향료 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 이들은 또한 원하는 경우 다른 활성제, 예를 들어 다른 진통제와 조합될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "추가 성분"은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향료; 착색제; 방부제; 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해 가능한 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충액; 염류; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약학적으로 허용 가능한 중합성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된, Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴 소재)에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.005% 내지 2.0%의 방부제를 포함할 수 있다. 방부제는 환경에서 오염물질에 노출된 경우 부패를 방지하는 데 사용된다. 본 발명에 따라 유용한 방부제의 예는 벤질 알코올, 소르브산, 파라벤, 이미두레아 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 방부제는 약 0.5% 내지 2.0% 벤질 알코올과 0.05% 내지 0.5% 소르브산의 조합이다.
일 실시형태에서, 조성물은 화합물의 분해를 억제하는 항산화제 및 킬레이트제를 포함한다. 일부 화합물에 대한 예시적인 항산화제는 조성물 총 중량을 기준으로 약 0.01% 내지 0.3% 범위의 BHT, BHA, 알파-토코페롤 및 아스코르브산 및 0.03% 내지 0.1% 범위의 BHT이다. 일 실시형태에서, 킬레이트제는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01% 내지 0.5%의 양으로 존재한다. 예시적인 킬레이트제는 약 0.01% 내지 0.20%의 중량 범위로 에데테이트 염 (예를 들어, 이나트륨 에데테이트) 및 시트르산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 킬레이트제는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.02% 내지 0.10%의 범위로 된다. 킬레이트제는 제형의 저장 수명에 해로울 수 있는 조성물에서 금속 이온을 킬레이팅하는데 유용하다. BHT 및 이나트륨 에데테이트는 각각 일부 화합물에 대한 예시적인 항산화제 및 킬레이트제이지만, 당업자에게 공지된 바와 같이 다른 적합하고 동등한 항산화제 및 킬레이트제가 따라서 대체될 수 있다.
액체 현탁액은 수성 또는 유성 비히클에서 활성 성분의 현탁액을 달성하기 위해 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 수성 비히클은, 예를 들어 물 및 등장 식염수를 포함한다. 유성 비히클은, 예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 아라키스, 올리브, 참깨 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 분별된 식물성 오일 및 유동 파라핀과 같은 미네랄 오일을 포함한다. 액체 현탁액은 현탁제, 분산제 또는 습윤제, 유화제, 완화제, 보존제, 완충액, 염, 향료, 착색제 및 감미제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유성 현탁액은 증점제를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁제는 소르비톨 시럽, 수소화된 식용 지방, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 아카시아 검, 및 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 공지된 분산제 또는 습윤제는 자연-발생 포스파티드 예컨대 레시틴, 알킬렌 옥사이드의 지방산, 장쇄 지방족 알코올, 지방산 및 헥시톨에서 유래된 부분적 에스테르, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분적 에스테르 (예를 들어, 각각 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)와의 축합 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 공지된 유화제는 레시틴 및 아카시아를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 공지된 방부제는 메틸, 에틸 또는 n-프로필-파라-하이드록시벤조에이트, 아스코르브산 및 소르브산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 공지된 감미제는, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 수크로스 및 사카린을 포함한다. 유성 현탁액에 대한 공지된 증점제는, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 및 세틸 알코올을 포함한다.
수성 또는 유성 용매에서 활성 성분의 액체 용액은 액체 현탁액과 실질적으로 동일한 방식으로 제조될 수 있으며, 주요 차이점은 활성 성분이 용매에 현탁되기보다는 용해된다는 것이다. 본 명세서에서 사용된, "유성" 액체는 탄소-함유 액체 분자를 포함하고 물보다 적은 극성 특색을 나타내는 액체이다. 본 발명의 약학적 조성물의 액체 용액은 액체 현탁액과 관련하여 기재된 각각의 구성요소를 포함할 수 있으며, 현탁제가 용매에서 활성 성분의 용해를 반드시 돕는 것은 아닐것이다는 것이 이해된다. 수성 용매는, 예를 들어 물 및 등장 식염수를 포함한다. 유성 용매는, 예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 아라키스, 올리브, 참깨 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 분별된 식물성 오일 및 유동 파라핀과 같은 미네랄 오일을 포함한다.
본 발명의 약학적 제제의 분말 및 과립 제형은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 제형은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 정제를 형성하거나, 캡슐을 충진하거나, 여기에 수성 또는 유성 비히클의 첨가에 의해 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이들 제형 각각은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 방부제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 충전제 및 감미료, 향료 또는 착색제와 같은 추가 부형제가 또한 이들 제형에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 유상은 올리브 또는 아라키스 오일과 같은 식물성 오일, 액체 파라핀과 같은 미네랄 오일, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 조성물은 하나 이상의 유화제 예컨대 아카시아 검 또는 트라가칸트 검과 같은 자연 발생 검, 대두 또는 레시틴 포스파티드와 같은 자연 발생 포스파티드, 지방산 및 소르비탄 모노올레에이트와 같은 헥시톨 무수물의 조합으로부터 유도된 에스테르 또는 부분적 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 에틸렌 옥사이드와 이러한 부분적 에스테르의 축합 생성물을 추가로 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 또한, 예를 들어 감미제 또는 향미제를 포함한 추가 성분을 함유할 수 있다.
화학적 조성물로 물질을 함침 또는 코팅하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 화학적 조성물을 표면 상에 침착 또는 결합시키는 방법, 화학적 조성물을 물질의 합성 (예를 들어, 예컨대 생리학적으로 분해 가능한 물질과 함께) 동안 물질의 구조에 포함시키는 방법, 및 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 후속 건조의 유무에 관계 없이 흡수성 물질 안으로 흡수하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
투여의 요법은 유효량을 구성하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 치료적 제형은 질환의 진단 이전 또는 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 추가로, 여러개의 분할된 복용량뿐만 아니라 엇갈린 복용량이 매일 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 용량은 연속적으로 주입될 수 있거나, 큰 환약 주입일 수 있다. 더욱이, 치료적 제형의 복용량은 치료적 또는 예방적 상황의 긴급성에 의해 표시되는 바와 같이 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다.
포유류, 예를 들어 인간을 포함하는 대상체에게 본 발명의 조성물의 투여는 공지된 절차를 사용하여 질환을 예방 또는 치료하기에 효과적인 기간 동안 복용량으로 수행될 수 있다. 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 치료적 화합물의 유효량은 이용되는 특정 화합물의 활성; 투여 시간; 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 화합물과 조합하여 사용되는 기타 약물, 화합물 또는 물질; 치료되는 대상체의 질환 또는 장애의 상태, 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 이전 병력, 및 의료 분야에서 잘-알려진 요인과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 복용량 요법은 최적의 치료적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러개의 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나 용량이 치료적 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 본 발명의 치료적 화합물에 대한 유효한 용량 범위의 비-제한적인 예는 약 1 내지 5,000mg/체중의 kg/1일당이다. 당업자는 관련 인자를 연구하고 과도한 실험 없이 치료적 화합물의 유효량에 관한 결정을 내릴 수 있을 것이다.
화합물은 매일 수회의 빈도로 대상체에게 투여될 수 있거나, 덜 빈번하게, 예컨대 하루에 한 번, 일주일에 한 번, 2주에 한 번, 한 달에 한 번, 또는 훨씬 덜 빈번하게, 예컨대 몇 달에 한 번 또는 더욱이 1년에 한 번 또는 그 이하로 투여될 수 있다. 1일당 투여되는 화합물의 양은 비-제한적인 예에서 매일, 격일로, 2일마다, 3일마다, 4일마다 또는 5일마다 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 격일 투여로, 1일당 5mg 용량이 월요일에 시작되고, 제1 후속의 1일당 5mg이 수요일에 투여되고, 제2 후속의 1일당 5mg이 금요일에 투여되는 식으로 될 수 있다. 용량의 빈도는 숙련된 기술자에게 쉽게 명백할 것이고, 비제한적으로, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 동물의 유형 및 연령 등과 같은 임의의 수의 요인에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 복용량 수준은 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료적 반응을, 대상체에게 독성이 되지 않게 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다.
당업계에서 통상의 기술을 갖는 의학 박사, 예를 들어 의사 또는 수의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 약학적 조성물에 이용된 본 발명의 화합물의 용량으로 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 복용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 투여의 용이성 및 복용량의 균일성을 위해 복용량 단위 형태로 화합물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 복용량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단위 복용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구된 약학적 비히클과 관련하여 원하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 치료적 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 복용량 단위 형태는 (a) 치료적 화합물의 고유한 특성 및 달성되는 특정 치료적 효과, 및 (b) 대상체의 질환 치료를 위해 이러한 치료적 화합물을 배합/제형하는 기술에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1일당 1회 내지 5회 또는 그 이상 범위의 복용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 매일, 2일마다, 3일마다 1회 내지 1주에 1회 및 2주마다 1회를 포함하지만 이에 제한되지 않는 복용량 범위로 대상체에게 투여된다. 본 발명의 다양한 조합 조성물의 투여의 빈도는 치료되어 지는 연령, 질환 또는 장애, 성별, 전반적인 건강 및 기타 요인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 인자에 따라 대상체마다 다를 것이라는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 복용량 요법으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 임의의 대상체에게 투여되어 지는 정확한 복용량 및 조성물은 대상체에 대한 다른 모든 요인을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다.
투여를 위한 본 발명의 화합물은 약 1mg 내지 약 10,000mg, 약 20mg 내지 약 9,500mg, 약 40mg 내지 약 9,000mg, 약 75mg 내지 약 8,500mg, 약 150mg 내지 약 7,500mg, 약 200mg 내지 약 7,000mg, 약 3050mg 내지 약 6,000mg, 약 500mg 내지 약 5,000mg, 약 750mg 내지 약 4,000mg, 약 1mg 내지 약 3,000mg, 약 10mg 내지 약 2,500mg , 약 20mg 내지 약 2,000mg, 약 25mg 내지 약 1,500mg, 약 50mg 내지 약 1,000mg, 약 75mg 내지 약 900mg, 약 100mg 내지 약 800mg, 약 250mg 내지 약 750mg, 약 300mg 내지 약 600mg, 약 400mg 내지 약 500mg, 및 이들 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적 증분의 범위 내에 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물의 용량은 약 1mg 내지 약 2,500mg이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 용량은 약 10,000mg 미만, 또는 약 8,000mg 미만, 또는 약 6,000mg 미만, 또는 약 5,000mg 미만, 또는 약 3,000mg 미만, 또는 약 2,000mg 미만, 또는 약 1,000mg 미만, 또는 약 500mg 미만, 또는 약 200mg 미만, 또는 약 50mg 미만이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 화합물 (즉, 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 것과 동일하거나 다른 질환을 치료하기 위해 사용되는 약물)의 용량은 약 1,000mg 미만, 또는 약 800mg 미만, 또는 약 600mg 미만, 또는 약 500mg 미만, 또는 약 400mg 미만, 또는 약 300mg 미만, 또는 약 200mg 미만, 또는 약 100mg 미만, 또는 약 50mg 미만 , 또는 약 40mg 미만, 또는 약 30mg 미만, 또는 약 25mg 미만, 또는 약 20mg 미만, 또는 약 15mg 미만, 또는 약 10mg 미만, 또는 약 5mg 미만, 또는 약 2mg 미만, 또는 약 1mg 미만, 또는 약 0.5mg 미만, 및 그의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적 증분이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 화합물 또는 접합체를 단독으로 또는 제2 약학적 작용제와 조합하여 보유하는 용기; 및 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키기 위해 화합물 또는 접합체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 포장된 약학적 조성물에 대한 것이다.
용어 "용기"는 약학적 조성물을 보유하기 위한 임의의 저장소를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 용기는 약학적 조성물을 함유하는 포장재이다. 다른 실시형태에서, 용기는 약학적 조성물을 함유하는 포장재가 아니며, 즉 용기는 포장된 약학적 조성물 또는 포장되지 않은 약학적 조성물 및 약학적 조성물의 사용 설명서를 포함하는 상자 또는 바이알과 같은 저장소이다. 더욱이, 포장 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 약학적 조성물의 사용 설명서는 약학적 조성물을 함유하는 포장재에 함유될 수 있고, 따라서 설명서는 포장된 생성물에 대한 증가된 기능적 관계를 형성한다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 설명서는 그 의도된 기능을 수행하는 화합물의 능력, 예를 들어, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하거나, 영상화 또는 진단 제제를 대상체에게 전달하는 화합물의 능력에 관한 정보를 함유할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 임의의 조성물의 투여의 경로는 경구, 비강, 비경구, 설하, 경피, 경점막 (예를 들어, 설하, 설측, (트랜스)구강 및 (인트라)비골,), 방광내, 십이지장내, 위내, 직장, 복강-내, 피하, 근육내, 피내, 동맥-내, 정맥내 또는 투여를 포함한다.
적합한 조성물 및 복용량 형태는, 예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플릿, 환약, 겔 캡, 트로키, 분산액, 현탁액, 용액, 시럽, 과립, 비드, 경피 패치, 겔, 분말, 펠렛, 마그마, 로젠지, 크림, 페이스트, 플라스터, 로션, 디스크, 좌약, 비강 또는 경구 투여용 액체 스프레이, 흡입용 건조 분말 또는 에어로졸화 제형, 방광내 투여용 조성물 및 제형 등을 포함한다. 본 발명에 유용한 제형 및 조성물은 본 명세서에 기재된 특정 제형 및 조성물에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
RNA 분열 및/또는 폴리아데닐화를 조절하는 방법 & 치료 방법
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두를 조절하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 대상체는 세포이다. 일 실시형태에서, 대상체는 포유류이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 토끼, 돼지, 쥐 또는 마우스이다. 일 실시형태에서, 대상체는 비-포유류 대상체이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 제브라피쉬, 초파리 또는 회충이다.
일 실시형태에서, RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두는 시험관내에서 조절된다. 일 실시형태에서, RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두는 생체내에서 조절된다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 것을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트이다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 725-727 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트이다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 양태에서, 본 발명은 비정상적인 분열 및/또는 폴리아데닐화와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 및 (2) 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 (2) 유전자에서 표적 영역에 상보적인 crRNA 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 유전자는 질환 또는 장애를 야기하는 비정상적인 3'UTR 연장, 3'UTR 단축, 폴리아데닐화 신호 변경 또는 기타 비정상적인 폴리아데닐화와 관련된다. 예시적인 질환 또는 장애 및 상응하는 표적은 표 1에 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 알츠하이머병을 치료하는 일 실시형태에서, 여기서 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 (2) ABCA3, EIF2B3, MSTO2P, OGDHL, PARP6, SLC33A1, SUPV3L1, TAF3, WASH7P, JAK1, ABCA3, UBR1, ALDOC, C10ord10, GABARAPL2, KAT2A, POLR3A, SH3BGRL2, TIMM23, TMC6, UNC80, 및 WTAP로 구성된 군으로부터 선택된 유전자에서 표적 영역에 상보적인 crRNA 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
표 1. 비정상적인 분열 및/또는 폴리아데닐화와 관련된 질환 또는 장애 및 표적 유전자(들),
Figure pct00001
Figure pct00002
RNA를 감소시키는 방법 & 치료 방법
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA의 수를 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 핵 RNA는 비정상적인 핵 RNA이다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 것을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 731에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 702 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 대상체는 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물, 동물 또는 진균 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 효모 세포이다.
일 실시형태에서, 대상체는 포유류이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 토끼, 돼지, 랫트 또는 마우스이다. 일 실시형태에서, 대상체는 비-포유류 대상체이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 제브라피쉬, 초파리 또는 회충이다.
일 실시형태에서, 핵 RNA의 양은 시험관내에서 감소된다. 일 실시형태에서, 핵 RNA의 양은 생체내에서 감소된다.
일 실시형태에서, 핵 RNA는 핵 RNA 초점이다. 일 실시형태에서, 가이드 핵산은 인간 디스트로피아 미요토니카-프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 3'UTR에서 CTG 반복 확장에 상보적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 가이드 핵산은 서열번호: 762-764 중 하나의 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 비정상적인 핵 RNA와 관련된 질환 또는 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 비정상적인 핵 RNA와 관련된 질환 또는 장애는 근육긴장 퇴행위축 유형 2 (DM2), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병-유사 2 (HDL2), 척수소뇌성 실조증 8, 31 및 10 (SCA8, -31, -10) 및 취약한 X-관련 떨림 운동실조 증후군 (FXTAS)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 비정상적인 핵 RNA는 독성 핵 RNA 초점이다. 일 실시형태에서, 독성 핵 RNA 초점 근육긴장 퇴행위축 유형 1과 관련된 질환 또는 장애. 일 실시형태에서, 표적화 뉴클레오티드 서열은 인간 디스트로피아 미요토니카-프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 3'UTR에서 CTG 반복 확장에 상보적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 표적화 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 762-764로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA를 분열하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 증가된 유전자 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 유전자의 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 유전자의 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 RNA 트랜스크립트를 분열하며 이에 의해 번역 및 단백질 발현을 방지한다.
일 양태에서, 본 발명은 RNA와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명은 RNA 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 DNA 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 바이러스 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 바이러스 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 RNA 트랜스크립트를 분열하며 이에 의해 바이러스 단백질의 번역 및 발현을 방지한다.
RNA 시각화 방법
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 핵 RNA를 시각화하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 (A) 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것; 및 (B) 핵 RNA를 시각화하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, RNA를 시각화하는 것은 이미징을 통해 일어난다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 가이드 핵산에 결합하고, 가이드 핵산은 표적 RNA 서열에 결합하고 그리고 형광 단백질이 검출된다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 699-701 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 것을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 728-730 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 699-701 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 대상체는 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물, 동물 또는 진균 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 효모 세포이다.
일 실시형태에서, 대상체는 포유류이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 토끼, 돼지, 랫트 또는 마우스이다. 일 실시형태에서, 대상체는 비-포유류 대상체이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 제브라피쉬, 초파리 또는 회충이다.
일 실시형태에서, 핵 RNA는 시험관내에서 시각화된다. 일 실시형태에서, 핵 RNA는 생체내에서 시각화된다.
일 실시형태에서, 핵 RNA는 핵 RNA 초점이다. 일 실시형태에서, crRNA는 인간 디스트로피아 미요토니카-프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 3'UTR에서 CTG 반복 확장에 상보적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, crNA는 서열번호: 23, 서열번호: 24, 또는 서열번호: 25의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 비정상적인 핵 RNA와 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 (A) 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 비정상적인 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것; (B) 비정상적인 핵 RNA를 시각화하는 것; 및 (C) 비정상적인 핵 RNA가 존재할 때 질환 또는 장애를 진단하는 것을 포함한다.
치료 및 사용 방법
본 발명은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료, 증상을 감소 및/또는 발병 위험을 감소하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 포유류에서 질환 또는 장애를 치료, 증상을 감소 및/또는 발병 위험을 감소한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 식물에서 질환 또는 장애를 치료, 증상을 감소 및/또는 발병 위험을 감소한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 효모 유기체에서 질환 또는 장애를 치료, 증상을 감소 및/또는 발병 위험을 감소한다.
일 실시형태에서, 대상체는 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물, 동물 또는 진균 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 식물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 효모 세포이다.
일 실시형태에서, 대상체는 포유류이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 토끼, 돼지, 랫트 또는 마우스이다. 일 실시형태에서, 대상체는 비-포유류 대상체이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 제브라피쉬, 초파리 또는 회충이다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 게놈 유전자좌에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 야기된다. 따라서, 일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 치료되거나, 감소될 수 있거나, 또는 mRNA 트랜스크립트를 예방 또는 감소시키거나 단백질의 번역을 예방 또는 감소시키는 요소를 통해 위험이 감소될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 방법은 RNA 트랜스크립트의 조작을 포함한다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비정상적인 RNA에 의해 야기된다. 따라서, 일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 치료되거나, 감소될 수 있거나, 또는 RNA 트랜스크립트를 예방 또는 감소시키는 요소를 통해 위험이 감소될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 방법은 RNA 트랜스크립트의 조작을 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 및 (2) 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 분열 및/또는 폴리아데닐화 단백질은 RNA 트랜스크립트의 분열 및/또는 폴리아데닐화를 조절한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 것을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 725-727 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 696-698 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 (1) Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 Cas 단백질 및 NLS를 포함하는 본 발명의 융합 단백질, 및 (2) 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, Cas 단백질은 RNA 트랜스크립트를 분열한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 702에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 것을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 731에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 서열번호: 702 중 하나에 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동등한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 유전자에서 표적 영역에 상보적인 표적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자는 RNA 트랜스크립트를 인코딩한다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 RNA와 관련된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스 감염이다. 일 실시형태에서, RNA 바이러스는 양성 가닥 RNA 바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스 또는 이중-가닥 RNA 바이러스이다.
예시적인 RNA 바이러스는 영장류 T-림프구 향성 바이러스 1, 영장류 T-림프구 향성 바이러스 2, 영장류 T-림프구 향성 바이러스 3, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, 유인원 포미 바이러스, 인간 피코비르나바이러스, 콜로라도 진드기 열 바이러스, 창기놀라 바이러스, 그레이트 아일랜드 바이러스, 레봄보 바이러스, 오룬고 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 반나 바이러스, 보르나 질환 바이러스, 레이크 빅토리아 마르부르그바이러스, 레스톤 에볼라바이러스, 수단 에볼라바이러스, 타이 포레스트 에볼라바이러스, 자이레 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2, 인간 파라인플루엔자 바이러스 4, 볼거리 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 인간 파라인플루엔자 바이러스 3, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모 바이러스, 찬디푸라 바이러스, 이스파한 바이러스, 피리 바이러스, 수포성 구내염 알라고아스 바이러스, 수포성 구내염 인디아나 바이러스, 수포성 구내염 뉴저지 바이러스, 호주 박쥐 리사바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스 1, 유럽 박쥐 리사바이러스 2, 모콜라 바이러스, 광견병 바이러스, 구아나리토 바이러스, 쥬닌 바이러스, 라싸 바이러스, 림프구성 맥락막염 바이러스, 마츄포 바이러스, 피친데 바이러스, 사비아 바이러스, 화이트워터 아로요 바이러스, 번얌워라 바이러스, 브왐바 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 카라파루 바이러스, 카투 바이러스, 구아마 바이러스, 구아로아 바이러스, 카이리 바이러스, 마리투바 바이러스, 오리보카 바이러스, 오로파우치 바이러스, 서니 바이러스, 타카이우마 바이러스, 웨이요미아 바이러스, 안데스 바이러스, 베이오우 바이러스, 블랙 크릭 카날 바이러스, 도브라바-벨그레이드 바이러스, 한타안 바이러스, 라구나 네그라 바이러스, 뉴욕 바이러스, 퓨우말라 바이러스, 서울 바이러스, 신 놈브레 바이러스, 크리민-콩고 출혈열 바이러스, 듀그베 바이러스, 칸디루 바이러스, 푼타 토로 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 샌드플라이 열 나폴리 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스 , 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 도리 바이러스, 토고토 바이러스, 델타 간염 바이러스, 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 NL63, 인간 코로나바이러스 HKU1, 인간 코로나바이러스 OC43, SARS 코로나바이러스, 인간 토로바이러스, 인간 엔테로바이러스 A, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 엔테로바이러스 C, 인간 엔테로바이러스 D, 인간 라이노바이러스 A, 인간 라이노바이러스 B, 인간 라이노바이러스 C, 뇌심근염 바이러스, 테일로바이러스, 말 비염 A 바이러스, 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, 인간 파레코바이러스, 융안 바이러스, 아이치 바이러스, 인간 아스트로바이러스, 인간 아스트로바이러스 2, 인간 아스트로바이러스 3, 인간 아스트로바이러스 4, 인간 아스트로바이러스 5, 인간 아스트로바이러스 6, 인간 아스트로바이러스 7, 인간 아스트로바이러스 8, 노워크 바이러스, 삿포로 바이러스, 아로아 바이러스, 반지 바이러스, 뎅기열 바이러스, 일례우스 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 코코베라 바이러스, 키안사너 포레스트 바이러스, 로우핑 질병 바이러스, 무레이 밸리 뇌염 바이러스, 엔타야 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 포와산 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 우수투 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 바르마흐 포레스트 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 에버글레이즈 바이러스, 게타 바이러스, 마야로 바이러스, 무캄보 바이러스, 오'뇽-뇽 바이러스, 픽수나 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서양 말 뇌염 바이러스, 화타로아 바이러스, 풍진 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
일 실시형태에서, DNA 바이러스는 단일-가닥 DNA 바이러스 또는 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 예시적인 DNA 바이러스는 AAV9, AAV12, AAV18, AAV31, HBV, EBV, KSHV, HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV45, 메르켈 세포 폴리마바이러스 및 MCV를 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비정상적인 폴리아데닐화 또는 비정상적인 RNA와 관련된다. 일 실시형태에서, 방법은 비정상적인 비정상적인 폴리아데닐화 또는 비정상적인 RNA와 관련된 질환 또는 장애를 치료하며, 여기서 비정상적인 폴리아데닐화 또는 비정상적인 RNA가 표적화된다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 내분비 질환이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 내분비 질환은 β-지중해빈혈, 신생아 당뇨병, IPEX 증후군, 메이어-로키탄스키-퀴스터-하우저 증후군, 시상하부-뇌하수체-부신축 조절 장애, 부신 기능장애, 생식선 기능장애, 자궁외 쿠싱 증후군, 임신중독증, 당뇨병성 신병증, I형 당뇨병, II형 당뇨병 및 IGF-1 결핍을 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 종양원성 질환이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 종양원성 질환은 맨틀 세포 림프종, 유전성 & 산발성 부갑상선 종양, 수질 갑상선 암종, 다발성 질환, 결장 직장암, 교모세포종, 만성 림프구성 백혈병 및 유방암을 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 신경계 질환 또는 장애이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 신경계 질환은 파킨슨병, 안구인두 근육긴장퇴행위축, 헌팅턴병, 파브리병, 취약 X 증후군, 척추 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 척수소뇌성 실조증 척수소뇌성 실조증 1, 척수소뇌성 실조증 2, 척수소뇌성 실조증 3, 척수소뇌성 실조증 6, 척수소뇌성 실조증 7, 척수소뇌성 실조증 8, 척수소뇌성 실조증 10, 척수소뇌성 실조증 17, 척수소뇌성 실조증 31, 알츠하이머 병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 혈액학적 질환 또는 장애이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 혈액학적 질환은 β-지중해빈혈 및 α-지중해빈혈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 감염 또는 면역학적 질환 또는 장애이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 감염 또는 면역학적 질환은 B-세포 분화, T-세포 활성화, 전신성 홍반성 루푸스, 위스콧-알드리치 증후군, 골관절염, 경피증 및 IPEX 증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 근골격 질환 또는 장애이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 감염 또는 면역학적 질환은 근육긴장퇴행위축 1형, 척추 및 구근 위축증, 및 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증을 포함한다.
예시적인 질환 또는 장애 및 상응하는 표적은 표 2에 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가 질환 및 장애 및 상응하는 유전자는 당업계에, 예를 들어 Rehfeld 등, Alternations in Polyadenylation and its Implications for Endocrine Disease, Front. Endocrinol. 4:53 (2013), Chang 등, Alternative Polyadenylation in Human Diseases, Endocrinol Metab. 32:413-421 (2017), 및 Curinha 등, Implications of polyadenylation in health and disease, Nucleus 5:508-519 (2014)에 공지되어 있으며, 이는 그 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다.
표 2. 질환 또는 장애 및 표적 유전자
Figure pct00003
Figure pct00004
아미노산 및 핵산 서열
표 3은 서열의 참조를 제공한다.
표 3
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Figure pct00007
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실험적 실시예
본 발명은 다음의 실험적 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 다음의 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 당업자는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명을 만들고 이용하고 청구된 방법을 실행할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 다음의 작업 실시예는 본 발명의 특정 실시형태를 구체적으로 지적하고, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: CRISPR-Cas13에 의한 RNA의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화
본 명세서에 제시된 데이터는 단일 포유류 폴리아데닐화 인자인, Nudix 가수분해효소 21 (NUDT21)에 촉매적으로 죽은 Cas13의 융합이 포유류 세포에서 RNA의 부위-특이적 CRISPR-Cas13-유도된 분열 및 폴리아데닐화를 허용함을 입증한다. 이 접근법은 Postscriptr로 불리며 유전자 발현의 비-게놈 조작에 이용될 수 있고 인간 RNA 처리 질환을 치료하기 위한 잠재적인 미래의 치료적 응용을 가질 수 있다.
폴리(A) 꼬리의 RNA 분열 및 추가의 3' 부위는 전형적으로 정규의 6량체 모티프 AAUAAA 및 업스트림 및 다운스트림 서열 요소 (각각 USE 및 DSE)로 구성된 고유한 폴리아데닐화 신호 (PAS) 서열에 의해 정확하게 결정된다 (Tian & Graber, Wiley Interdiscip Rev RNA, 2012, 3:385-396). AAUAAA PAS 모티프는 전형적으로 RNA 분열 부위의 ~25 뉴클레오티드 업스트림에서 발견되고 분열 및 폴리아데닐화 특이적 인자 (CPSF) 복합체의 두 가지 구성요소인: 분열 및 폴리아데닐화 인자 30 (CPSF30) 및 WD 반복-함유 단백질 33 (WDR33)에 의해 직접적으로 결합된다 (Chan 등, Genes Dev, 2014, 28:2370-2380). 분열 인자 Im (CFIm) 복합체의 구성요소는 RNA 분열 부위의 ~50 뉴클레오티드 업스트림에서 발생하는 USE 모티프 UGUA에 직접적으로 결합한다 (Ellkon 등, Nat Rev Genet, 2013, 14:496-506). 정규의 AAUAAA 모티프를 결하는 트랜스크립트에서, CFIm 복합체는 폴리(A) 신호 인식의 주요 결정인자로 역할을 한다 (Venkataraman 등, Genes Dev, 2005, 19:1315-1327). CFIm 복합체의 RNA 결합 구성요소인 Nudix 가수분해효소 21 (NUDT21/CPSF5)은 3' 말단 처리의 활성화제 및 대안적 폴리아데닐화 부위 선택의 조절자로 역할을 한다 (Zhu 등, Mol Cell, 2018, 69:62-74 ). CFIm 복합체의 결합은 3' 말단 처리의 제1 단계 중에 있고 3' 말단 처리 기계에 추가 보조-인자를 모집하는 기능을 한다. 폴리아데닐화 슈퍼컴플렉스의 구성요소와 RNA 중합효소 II의 C-말단 도메인 간의 직접적인 상호작용은 신장 복합체의 분해를 유발하고 전사 종결과 함께 3' 말단 처리를 조정한다 (Zhao 등, Microbiol Mol Biol Rev, 1999, 63:405 -45).
Cas13은 RNA에 대한 특이적 친화성을 가진 박테리아-유래 crRNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다 (Abudayyeh 등, Science, 2016, 353:aaf5573). Cas9와 유사하게 Cas13의 뉴클레아제 도메인 내 잔기의 돌연변이는 촉매적으로 죽은 효소를 생성하지만 RNA 결합 친화도를 유지한다 (dCas13). 최근, 포유류 RNA 변형 효소에 dCas13의 융합은 포유류 세포에서 RNA를 조작하는 데 유용한 것으로 나타났다 (Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550:280-84; Cox 등, Science, 2017, 358:1019-27; O'Connell, J Mol Biol, 2019, 431:66-87). dCas13을 사용하여 폴리아데닐화 복합체 형성을 지시하기 위해, 촉매적으로 죽은 PspCas13b (dPspCas13b)를 CPSF30, WDR33 및 NUDT21을 포함한 인간 3' 말단 처리 기계의 RNA 결합 구성요소와 결합하여 3가지 융합 단백질이 설계되었다 (도 1a). N-말단 3x FLAG 에피토프 태그는 단백질 검출을 위해 포함되었고 입체 장애의 가능성을 줄이기 위해 dPspCas13b와 폴리아데닐화 구성요소 사이에 길고 유연한 아미노산 펩티드 링커 [GGGGSGGGGS (서열번호: 69)]가 포함되었다.
세포질에서 발생하는 dCas13을 활용하는 RNA 변형 응용과 달리, RNA의 전사-후 분열 및 폴리아데닐화는 진핵 핵 내에서 발생하고 따라서 dCas13 융합 단백질의 효율적인 핵 국재화를 필요로 한다. Cas13의 큰 크기 및 고유한 핵 국재화 신호 (NLS)의 그 결여는 포유류 세포에서 효율적인 핵 국재화를 방지할 수 있다. 이와 일치하여, 포유류 NLS를 결하는 dPspCas13b 융합 단백질은 항-FLAG 항체를 사용하여 면역세포화학에 의해 검출된 바와 같이 포유류 COS7 세포에서 발현될 때 세포질에 유지되었다 (도 5). 놀랍게도, 뉴클레오플라스민 (NPM)의 고전적인 SV40 NLS 또는 이분 NLS의 추가는 둘 모두 dPspCas13b 융합 단백질의 핵 국재화를 촉진하기에 불충분했다 (도 5). 그러나, 정상적인 세포 유입 기계를 사용하지만 전형적 이분 NLS보다 거의 3배 긴 링커 서열을 함유하는, 효모 Ty1 레트로트랜스포존에서 유래된 비-고전적 이분 NLS의 단일 카피의 추가 (McLane 등, NAR, 2008, 36:4317-26; Kenna 등, Mol Cell Biol, 1998, 18:1115-24)는 3가지 dPspCas13b 융합 단백질 모두의 강력한 핵 국재화를 초래했다 (도 1b).
다음으로, 리포터 유전자는 슈퍼폴더 GFP (sfGFP)의 형광 및 비-형광 오픈 리딩 프레임 사이를 전환할 수 있는 포유류 세포에서 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 감지하도록 설계되었다 (도 2). sfGFP는 11개 반평행 베타 가닥으로 구성된 베타 배럴을 형성하여, 10번째와 11번째 베타 가닥 사이의 서열 삽입을 허용할 수 있지만 11번째 베타 가닥이 제거되면 형광을 상실한다 (Kamiyama 등, Nat Commun, 2016, 7:11046; Feng 등, Nat Commun, 2017, 8:370). sfGFP 리포터 작제물은 원형의 포유류 인트로닉 (토끼 베타 글로빈 유전자의 제2 인트론) (sfGFPapa) 내에 포매된 11번째 베타 가닥에 대한 코딩 서열로 생성되었다 (도 2a). 11번째 베타 가닥의 코딩 서열은 10번째와 11번째 베타 가닥 사이에 14개 아미노산 링커 서열이 있음에도 불구하고 근위 오픈 리딩 프레임의 번역이 완전한 sfGFP 서열을 인코딩하도록 업스트림 sfGFP 코딩 서열과 인-프레임으로 설계되어 개재하는 인트로닉 서열 [sfGFP(1-10)-L-11]의 번역을 초래한다. 포유류 COS7 세포에서 sfGFPapa 리포터의 발현은 거의 검출 가능한 형광을 초래하지 않았으며, 이는 11번째 베타 가닥을 함유하는 인트론의 효율적인 제거와 비-형광 sfGFP(1-10) 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 시사한다 (도 2b 내지 도 2d). 그러나 스플라이싱 억제제 이소깅게틴으로 처리된 sfGFPapa 리포터를 발현하는 세포 (O'Brien 등, J Biol Chem, 2008, 283:33147-54)는 24시간 후 검출 가능한 녹색 형광을 초래하여, 10번째와 11번째 베타 가닥 사이에 링커를 함유하는 변형된 sfGFP 오픈 리딩 프레임이 기능성이다는 것을 입증한다 (도 6a 및 도 6b). sfGFP의 11번째 베타 가닥 (sfGFPapa-pA)에 대한 코딩 서열의 다운스트림에 SV40 폴리아데닐화 카세트의 삽입은 강력한 녹색 형광을 초래하여, sfGFPapa 리포터의 인트로닉 분열 및 폴리아데닐화가 기능성 sfGFP(1-10)-L-11 오픈 리딩 프레임의 이용을 촉진한다는 것을 입증한다 (도 2e 내지 2h). 함께, 이들 데이터는 sfGFPapa 리포터 유전자가 스플라이싱 또는 인트로닉 분열 및 폴리아데닐화에서의 변화에 반응하여 전환될 수 있는 기능성 및 비-기능성 오픈 리딩 프레임 둘 모두를 인코딩한다는 것을 입증한다.
dPspCas13b 융합 단백질이 sfGFPapa 리포터 mRNA의 CRISPR-Cas13-매개된 분열 및 폴리아데닐화를 촉진할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, sfGFPapa 리포터에서 sfGFP의 11번째 베타 가닥의 코딩 서열의 인트로닉 서열 다운스트림을 표적화하는 crRNA를 설계했다 (도 3a). 라이브 세포 검정에서, 형광 신호는 sfGFPapa 리포터 단독에 비해, 비-표적 crRNA를 사용한 임의의 dPspCas13b 융합 단백질을 발현하는 세포에서 검출되지 않았다 (도 3b 및 도 7). 그러나, CPSF30 또는 WDR33 융합 단백질이 아닌 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질로 crRNA를 표적화하는 인트론의 발현은 24시간 후에 검출 가능한 녹색 형광 세포를 생성했다 (도 3b 및 도 7).
cDNA 말단의 3' 급속 증폭 (3'RACE)을 수행하여 형광 신호가 sfGFPapa 리포터 mRNA의 CRISPR-Cas13-매개된 표적화된 분열 및 폴리아데닐화에 기인하였는지 여부를 결정했다. RACE 호환성 cDNA는 2개 5' 중첩된 프라이머 서열을 함유하는 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 총 RNA에서 생성되었다. crRNA 표적 서열의 업스트림에 2개 중첩된 리포터 특정 프라이머를 사용하여, 양 샘플에 대해 sfGFPapa pre-mRNA 트랜스크립트의 예측된 크기에 해당하는 고 분자량 대역이 검출되었다 (도 3c). 흥미롭게도, 인트로닉 crRNA로 표적화된 세포에서 더 작은 RACE 생성물의 추가의 넓은 대역이 검출되어, 표적화된 crRNA 서열 근처에서 분열 및 폴리아데닐화가 발생했을 수 있었음을 시사한다 (도 3c 및 도 3d). 3' RACE 생성물의 서열을 결정하기 위해, 200-500 염기쌍 영역을 겔 정제하고 TOPO TA 클로닝을 사용하여 서브클로닝했다. 11개 고유한 클론을 단리하고 서열화하여 sfGFPapa mRNA가 crRNA 표적 서열의 3' 측에 비해 -7로부터 +110 뉴클레오티드의 범위인 부위에서 분열되고 폴리아데닐화되었음을 나타냈다 (도 3e). 주로 CA 디뉴클레오티드 후에 발생하는 포유류 분열에 대비하여, Postscriptr-유도된 분열은 C 또는 T 뉴클레오티드에서 가장 자주 발생했다 (도 3f). 흥미롭게도, 11개 클론 중 4개는 폴리(A) 꼬리 연장 이전에 비-주형 뉴클레오티드의 3' 첨가를 나타냈으며, 이는 포유류 종에서는 드물다고 생각되지만 식물 mRNA에서는 널리 퍼져있다 (Jin & Bian, RNA, 2004, 10:1695-97). 이들 데이터는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질이 crRNA에 의해 표적화된 인트로닉 서열에서 리포터 mRNA의 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분하였다는 것을 입증한다.
Postscriptr가 내인성으로 발현된 인간 mRNA의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 촉진할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 스테롤 조절 요소 결합 단백질 1 (SREBP1)을 인코딩하는 트랜스크립트를 표적화했다. SREBP1은 스테롤 조절 요소 (SRE)를 함유하는 유전자를 트랜스 활성화하고 저-밀도 지단백 수용체 (LDLR)와 같은 지질 합성 및 흡수를 제어하는 단백질을 인코딩하는 도처에 존재하게 발현된 전사 인자이다 (도 4) (Horton 등, J Clin Invest, 2002, 109:1125-31). SREBP1은 먼저 소포체 (ER)의 막 내에 고정된 전사적으로 비활성 전구체 단백질로 합성된다 (Brown & Goldstein, Cell, 1997, 89:331-40) (도 4a). 스테롤 고갈된 세포에서, S2P에 의한 SREBP1의 단백질분해 분열은 SREBP1이 핵 안에 들어가 유전자 전사를 활성화할 수 있도록 하는 N-말단 DNA-결합 단편을 방출한다 (Brown 등, Cell, 2000, 100:391-98) (도 4a). 간에서 SREBP1 트랜스크립트는 내인성 인트로닉 PAS를 이용하고 전사적으로 활성 S2P 분열 생성물에 인접한 부위에서 종결된 단백질 단편을 생성할 수 있다 [SREBP1aΔ, AB373958; SREBP1cΔ, AB373959] (도 4b 및 c). 다음으로 Postscriptr가 비-간 세포주에서 SREBP1 인트로닉 PAS의 이용을 촉진하고 SREBP1 표적 유전자 발현을 상향조절할 수 있는지 여부를 결정했다. dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질은 인간 HEK293T 세포에서 SREBP1-표적화 또는 비-표적화 crRNA와 공-발현되었다 (도 4d). 3'RACE를 수행하여, SREBP1-표적화 crRNA로 형질감염된 세포에서 예상된 3'RACE 생성물의 대략적인 크기에 해당하는 강한 대역이 검출되었고 대조군 crRNA로 형질감염된 세포에서는 대역이 검출되지 않았다 (도 8). 이 3' RACE 생성물의 직접 시퀀싱은 SREBP1 트랜스크립트가 crRNA 표적 서열의 71개 뉴클레오티드 다운스트림에서 분열되고 폴리아데닐화되었으며 말단 엑손의 스플라이싱이 억제되었음을 나타냈다 (도 4d 및 e). 분열은 인간에서 보고된 분열 부위의 36개 뉴클레오티드 다운스트림에 CA 디뉴클레오티드에서 발생하였고 보유된 인트로닉 서열 내의 정지 코돈에서 종결되는 오픈 리딩 프레임을 생성하여, SREBP1의 C-말단에 추가의 16개 아미노산을 첨가한다 (도 4e 및 f). SREBP1-표적화 및 비-표적화된 HEK293T 세포의 혼합된 모집단에서의 유전자 발현 분석은 crRNA 표적 서열의 업스트림에서 qRT-PCR 및 PCR 프라이머를 사용할 때 전반적인 SREBP1 트랜스크립트 수준이 변하지 않았음을 보여주었다 (도 4g). 그러나, 표적화된 엑손에 걸친 프라이머는 표적화된 세포 대 비-표적화된 세포에서 SREBP1 트랜스크립트 수준에서 현저한 감소를 나타내어, 전사 종결이 Postscriptr-매개된 분열 및 폴리아데닐화와 연결될 수 있음을 시사한다 (도 4h). 흥미롭게도, SREBP1-표적화된 세포에서 잘-특성화된 SREBP1-반응성 유전자인 LDLR의 트랜스크립트 수준에서 유의한 증가가 추가로 감지되었다 (도 4i).
결론적으로, 본 명세서에 제시된 데이트는 포유류 세포에서 RNA의 서열-특이적 분열 및 폴리아데닐화를 유도하는 독특한 CRISPR-Cas13 RNA 변형 기술의 개발을 입증한다. 이 접근법은 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질을 이용하는데, 이는 본 명세서에서 입증된 바와 같이 포유류 세포에서 핵 국재화를 위해 비-고전적인 이분 NLS를 필요로한다. 본 명세서에 제시된 데이터는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질이 신규한 기능-이득 형광 리포터인 sfGFPapa 내의 인트로닉 서열에서 분열 및 폴리아데닐화를 촉진하기에 충분했음을 입증한다. 토끼 베타 글로빈 유전자의 제2 인트론이 임의의 알려진 내인성 PAS 서열을 함유하지 않는다는 것을 고려하여, sfGFPapa 리포터의 분열 및 폴리아데닐화를 촉진하는 Postscriptr의 능력은 놀랍다. 이들 발견은 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질이 crRNA 표적 서열에서 기능적 3' 말단 처리 복합체의 동원을 독립적으로 촉진할 수 있음을 입증한다. 이들 발견은 포유류에서 분열 및 대안적 폴리아데닐화 부위 선택의 부상하는 마스터 조절자로서 NUDT21의 역할을 지지한다 (Zhu 등, Mol Cell, 2018, 69:62-74; Brumbaugh 등, Cell, 2018, 172:106 -120; Sartini 등, Biol Reprod, 2008, 89:472-82).
CPSF30 또는 WDR33에 dPspCas13b의 융합이 이들 검정에서 sfGFPapa 리포터의 분열 및 폴리아데닐화를 촉진하기에 충분하지 않은 이유는 현재로 명확하지 않다. CPSF30과 WDR33 둘 모두는 AAUAAA PAS 모티프와 직접 접촉하는 것으로 나타났기 때문에, 하나의 가능성은 3원 복합체 형성을 촉진하기 위한 PAS RNA의 요건일 수 있다. 대안적으로, CPSF30 및 WDR33의 테더링은, 토끼 베타 글로빈 유전자 리포터의 제2 인트로닉 내에 최소 합성 PAS (AAUAAA 모티프 및 다운스트림 서열 요소 포함)의 삽입은 인트로닉 분열 및 폴리아데닐화를 촉진하기에 불충분했다는 것을 보여주는 데이터와 일치하는 가능성인, 3' 말단 처리를 유도하기에 불충분할 수 있다 (Levitt 등, Genes Dev, 1989 3:1019-25).
또한 Postscriptr가 인간 SREBP1 유전자의 내인성 인트로닉 PAS에서 분열 및 폴리아데닐화를 지시할 수 있음이 본 명세서에서 입증되었다. 내인성 SREBP1 인트로닉 PAS를 표적화할 때 단일 1차 분열 부위가 유도된 이유는 현재로 명확하지 않지만, sfGFPapa 리포터를 표적화할 때 ~100개 뉴클레오티드에 걸친 다양한 분열 생성물이 여전히 유도되었다. 특정 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, sfGFPapa 리포터에서 토끼 베타 글로빈 유전자의 제2 인트로닉 내 고유한 PAS 서열의 결여는 분열 부위 특이성을 안내하는 것을 돕는데 필요할 수 있다는 것이 가능하다. 이소성 표적 부위에서 Postscriptr 표적화를 증진시킬 수 있는 최소 업스트림 및 다운스트림 서열 요소를 파악하기 위해 향후 연구가 필요하다.
Cas13의 엔도뉴클레아제 활성은 포유류 세포에서 유전자 녹다운에 매우 효과적이지만 (Abudayyeh 등, Nature, 2017, 550:280-84), Postscriptr 기술은 세포에서 RNA를 조작하는 독특한 접근법을 허용하며 이는 3' 말단 RNA 처리의 연구 및 내인성 유전자 발현의 조작에 유용할 수 있다. 한 가지 흥미로운 예는 lncRNA 기능의 물음이며, 이들 중 다수는 염색질 변형 복합체의 동원을 통해 또는 허용 국소 염색질 환경을 확립함에 의해 유전자 발현을 제어한다 (Anderson 등, Nature, 2016, 539:433-36; Joung 등, Nature, 2017, 5448:343-46; Engreitz 등, Nautre, 2016, 539:452-55; Rinn & Chang, Annu Rev Biochem, 2012, 81:145-66). Postscriptr-안내된 분열, 폴리아데닐화 및 lncRNA의 전사 종료는 기능성 lncRNA 도메인 또는 기능성 게놈 영역의 식별을 허용할 수 있다. 부가하여, 다수의 인간 질환은 트랜스크립트 연장 및 mRNA 안정성과 번역을 초래할 수 있는 폴리(A) 신호 서열 내 기능-상실 돌연변이의 직접적인 결과이다 (Higgs 등, Nature, 1983, 306:398-400; Orkin 등, EMBO J, 1985, 4:453-56; Rund 등, PNAS, 1992, 89:4324-28). 여기서, Postscriptr 기술의 고유한 치료적 응용은 질환이 있는 조직에서 정상적인 RNA 분열 및 폴리아데닐화 부위 선택의 교정에 유용할 수 있다.
합성 DNA 및 클로닝
인간 CPSF30, WDR33 및 NUDT21의 코딩 서열은 gBlocks (IDT, Integrated DNA Technologies)로 조립을 위해 설계되고 합성되었으며 dPspCas13b에 대한 C-말단 융합으로 5' T7 프로모터를 함유하는 CS2 포유류 발현 벡터 (CSX)의 변형된 버전으로 클로닝되었다. sfGFPapa 리포터는 2개의 별도 gBlock 유전자 단편으로 설계되고 합성되었으며 CS2 포유류 발현 벡터 안으로 서브클로닝되었다. 모든 플라스미드 코딩 서열은 생거 시퀀싱에 의해 완전히 검증되었다. 코딩 서열 및 리포터 서열의 목록에 대해서는 실시예 3을 참고한다.
세포주, 일시적 형질감염 및 약물 치료
COS7 세포주는 5% CO2 분위기에서 37℃에서 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 DMEM에서 유지되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Fugene6 (Promega)를 사용하여 세포를 시딩하고 일시적으로 형질감염했다. 형질감염 20-시간 후, 세포를 이미지화하거나 DMSO 또는 이소깅게틴으로 처리하고 이미지화 이전에 추가의 24시간 동안 배양했다. 살아 있는 세포 이미지화를 위해, 세포를 DPBS로 2회 세정하고 DPBS에서 10μg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen)로 상온에서 10분 동안 반대 염색하고 ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad) 상에서 이미지화했다.
항체 및 면역조직화학
일시적으로 형질감염된 COS7 세포를 PBS 내 4% 포름알데히드에 20분 동안 고정하고 3% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 차단하고 1% BSA에서 1:1000에서 1시간 동안 실온에서 1차 항-FLAG (Sigma, F1864)로 인큐베이션했다. 세포를 이어서 30분 동안 실온에서 1% BSA에서 Alexa488 접합된 이차 항체 (Thermofisher)로 인큐베이션했다. 커버슬립은 DAPI (Vector Biolabs, H-1200)를 함유하는 항-페이드 형광 장착 배지를 사용하여 장착하고 공초점 현미경으로 이미지화했다.
cDNA 말단의 3' 급속 증폭 (3' RACE)
형질감염된 세포를 DPBS로 2회 세정하고 1ml의 Trizol에서 수확하여 총 RNA를 단리하였다. RACE 호환성 cDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 SuperScript III (Invitrogen)을 사용하지만, 단, 2개의 5' 중첩된 프라이머 서열을 함유하는 맞춤형 올리고 d(T) 올리고뉴클레오티드는 예외로 하여 생성되었다. RACE PCR은 다음과 같이 2개의 중첩된 표적 유전자 특이적 프라이머와 터치다운 PCR 프로토콜을 사용하여 수행되었다: 1분 동안 94℃ (1주기); 30초 동안 94℃, 1분 동안 72℃ (5주기); 30초 동안 94℃, 4분 동안 70℃ (5주기); 20초 동안 94℃, 1분 동안 68℃ (25주기); 5분 동안 72℃. PCR 프라이머 및 3'RACE 특이적 프라이머의 목록에 대해서는 실시예 3을 참고한다.
실시예 2: PspCas13b crRNA의 직접적인 반복에서 폴리(T) 서열의 파괴는 Postscriptr 활성을 증진시킨다
CRISPR-Cas13 시스템은 전형적으로 중합효소 III (Pol III) 프로모터, 예를 들어 U6, 7SK 또는 H1에 의해 포유류 세포에서 발현되는 작은 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 자연적으로 가이드된다. Pol II 의존성 중합효소와 달리 Pol III 프로모터는 종종 단지 6개 이상의 연속성 T들로 구성된 짧은 폴리(T) 서열에 의해 종결된다. 시험관내 및 포유류 세포 둘 모두에서 Pol III 프로모터의 종결 특이성의 자세한 분석은 4 T들의 짧은 스트레치조차도 작은 RNA의 전체 길이 발현에서 75% 감소로 이어지는 것을 밝혔다 (도 9a) (Gao 등 ., Mol Ther Nucleic Acids, 2018, 10:36-44). 많은 Cas13b 패밀리 구성원은 그의 직접적인 반복 (DR) 서열 내에 4-5개 내부 T들을 함유하여 Pol III 구동 프로모터로부터의 그 효율적인 발현을 유의하게 방지하고 Cas13b 표적화를 억제할 수 있었다 (도 9b). DR의 루프 영역 (도 9c) 내에 속하는 이들 서열이 Cas13b 표적화에 필수적인지 여부는 현재로 명확하지 않다. PbuCas13b 및 BzoCas13b 둘 모두에 대한 최근 고-해상도 결정 구조는 Cas13b 단백질에서 떨어져 배향된 U에 대해 코딩된 적어도 하나의 T를 나타냈으며, 이는 이들 위치에서 이들 뉴클레오티드가 특정 상호작용에 필요하지 않을 수 있음을 나타낸다 (도 9d). PspCas13b DR에서 폴리(T) 서열이 crRNA 발현을 증진시키기 위해 파괴될 수 있는지 결정하기 위해, 보존적 (U 대 C, 피리미딘 대 피리미딘) 단일 돌연변이를 생성하여 sfGFPapa 형광 리포터의 Postscriptr (dPspCas13b-NUDT21) 표적화된 활성화에 대한 그 영향을 결정했다 (도 9e). 현저하게, T17C 또는 T18C인, 두 부위에서 뉴클레오티드의 돌연변이는 증진된 Postscriptr 활성을 초래한 반면 T19C의 돌연변이는 활성을 폐지했다. 이들 결과는 증진된 활성이 증가된 crRNA 수율에서 유래될 수 있는 반면, 일부 위치의 돌연변이는 정상적인 Cas-crRNA 결합을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: Postscriptr 융합 단백질의 조절 및 표적화된 RNA 분열 및 폴리아데닐화에 대한 영향
NUDT21 폴리아데닐화 인자는 먼 종에 걸쳐서 고도로 보존된다. 인간, 파리 및 벌레로부터의 NUDT21 오솔로그의 다중 단백질 서열 정렬은 종에 걸쳐 강력한 서열 식별을 밝혔다 (도 10).
현저하게, Postscriptr (dPspCas13b-NUDT21) 융합 단백질의 맥락에서, 먼 종으로부터의 NUDT21 오솔로그는 포유류 세포에서 sfGFPapa 리포터의 유사한 활성화를 나타냈다 (도 11).
이들 오솔로그는 상당한 서열 동일성을 공유하지만 그것은 처음 ~30개 N-말단 아미노산 내에 보존을 거의 나타내지 않는다 (도 10). 이 영역은 인간 NUDT21에 대한 부정적인 조절 영역으로 작용할 수 있어, 이 영역에서 잔기가 아세틸화될 때 폴리(A) 중합효소 (PAP)와 CF1m 복합체 간의 상호작용을 억제한다 (Shimazu 등, J Biol Chem, 2007, 282:4470-78). 이 역할과 일치하여, Postscriptr 융합 단백질의 맥락에서 인간 NUDT21의 N-말단 30개 아미노산의 결실은 활성을 위해 필요하지 않았고 오히려 sfGFPapa 리포터의 증진된 활성화를 초래했다.
NUDT21은 정상적으로 직접적인 RNA 결합을 통해 RNA 폴리아데닐화 서열에 표적화되는 반면, NUDT21 RNA 결합의 99%를 폐기하는 잔기의 돌연변이 (R63S 또는 F103A)는 Postscriptr 활성에 거의 영향을 미치지 않았으며, 이는 Postscriptr 융합 단백질의 맥락에서 dCas13에 의해 RNA에 표적화된다 (Yang 등, PNAS, 2010, 107:10062-67; Yang 등,. Structure, 2011, 19:368-77).
NUDT21은 절대 이량체로 기능하기 때문에, NUDT21의 강제된 탠덤 이량체를 인코딩하는 Postscriptr 융합 단백질이 생성되어, 현저하게 sfGFPapa 리포터의 유의한 증진된 활성화를 초래했다.
dPspCas13b의 C-말단의 유의한 절단이 RNA 표적화에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 이전 보고서와 일치하게 (Cox 등, Science, 2017, 358:1019-27), Postscriptr 융합 단백질의 맥락에서 유사한 결실은 Postscriptr 활성에는 거의 영향을 미치지 않지만 AAV에 의한 바이러스 전달을 위한 융합 단백질의 총 크기를 줄이는 데 유리할 수 있다.
실시예 4: 근육긴장퇴행위축의 Postscriptr -Cas13-매개된 예방
근육긴장퇴행위축 (DM)은 진행성 근육 약화, 근육 손실, 근긴장, 심장 부정맥 및 인지 기능장애에 의해 특징되어 지는 상염색체 우성 유전성 유전 질환이다. DM은 성인-발병 근육긴장퇴행위축의 가장 흔한 형태이고 8,000명 중 대략 1명에게서 발생한다. 일부 지역에서는 DM이 500명 중 1명에서 발생할 수 있다.
2가지 유형의 DM인, DM1 및 DM2가 있으며, 이는 각각 DMPK 또는 CNBP 유전자에서 뉴클레오티드 반복 확장의 결과로 발생한다. DM1은 더 심각하고 더 흔하며 염색체 19 상의 인간 DMPK 유전자의 비-코딩 3' 비번역된 영역 (3'UTR)에서 트리뉴클레오티드 (CUG) 반복 확장의 결과로 발생한다. ~50 카피보다 큰 CUG 반복 확장을 함유하는 개인에서 DMPK RNA의 전사는 독성 핵 RNA 초점의 형성을 초래하며, 이는 RNA 스플라이싱 인자의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리를 결합하고 격리한다 (도 12). 이것은 MBNL 기능의 상실과 광범위한 스플라이싱 이상을 초래한다. DMPK의 코딩 서열은 정상이지만, 비정상적인 DMPK 트랜스크립트에 의한 핵 RNA 초점의 형성은 또한 감소된 DMPK 발현을 초래한다.
현재로서 DM에 대한 치료법은 없다. 현재 치료적 접근법은 반복 확장에 특이적인 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 머슬블라인드-유사 단백질의 결합 및 격리를 방지하는 것이다. 대안적으로, 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 녹다운은 독성 반복 RNA의 축적을 방지할 수 있지만, 정상적인 DMPK 발현 및 기능의 손실을 초래할 수 있다. 불행히도, 이들 올리고뉴클레오티드-기반 요법의 전달 및 투여는 인간 환자에서 중요한 도전으로 남아있다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 Postscriptr는 CRISPR-Cas13에 의한 RNA 트랜스크립트의 표적화된 RNA 분열 및 폴리아데닐화를 허용한다. Postscriptr 접근법은 촉매적으로 비활성 Cas13 (dPspCas13b)과 포유류 폴리아데닐화 인자 사이의 융합 단백질인, NUDT21을 이용한다 (도 13a). 가이드-RNA를 사용한 Postscriptr 융합 단백질의 표적화는 RNA 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분하다 (실시예 1). 따라서, DMPK 트랜스크립트의 Postscriptr-가이드된 폴리아데닐화는 DMPK 코딩 서열의 정상적인 발현을 허용하고 다운스트림 독성 RNA 반복 서열의 전사를 방지할 수 있다 (도 13b). Postscriptr 기술은 DM1 개체의 체세포에서 장기 발현을 위해 AAV 또는 기타 부상하는 바이러스 전달 방법을 사용하여 전달될 수 있다. 중요하게는, Postscriptr 기술이 DMPK RNA만을 표적화하기 때문에, "표적을 벗어난" DNA 게놈 편집에 대한 가능성 또는 생식선 전파에 대한 가능성이 없다.
인간 DMPK 트랜스크립트의 말단 엑손은 923개 뉴클레오티드 길이이고 말단 코딩 서열과 전체 3' UTR 둘 모두를 함유한다. 정상적인 분열 및 폴리아데닐화는 보존된 컨센서스 PAS (AAUAAA (서열번호: 789)) 서열의 다운스트림에서 발생한다. 인간 DM1 환자에 존재하는 CUG 트리뉴클레오티드 반복 확장은 인간 DMPK 유전자의 말단 엑손의 비코딩 3'UTR 영역 내에서, 정지 코돈의 ~200개 뉴클레오티드 다운스트림에서 발생한다 (도 12).
DMPK 트랜스크립트는 인간 HEK293T 세포에서 발현되기 때문에, Postscriptr가 이 인간 세포주에서 내인성 DMPK 트랜스크립트를 분열하고 폴리아데닐화할 수 있는지가 결정되었다. crRNA는 CUG 반복 확장 부위의 업스트림에 있는, 인간 DMPK의 말단 엑손을 표적화하여 설계되었다. Postscriptr 융합 단백질과 crRNA는 24시간 동안 HEK293T 세포 안으로 공-발현되었으며, 그 후 맞춤 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 cDNA 말단의 3' 급속 증폭 (RACE)에 의한 후속 분석을 위해 총 RNA가 분리되었다. 2개의 중첩된 DMPK-특이적 프라이머를 사용한 PCR-기반 증폭은 특히 하나의 crRNA가 전장 3'UTR (DMPK-PS)보다 짧은 폴리아데닐화된 트랜스크립트의 발현을 유도했다는 것을 나타냈다 (도 13c). 이 대역의 시퀀싱은 DMPK 3'UTR에 특이적이고 분열 및 폴리아데닐화가 crRNA 표적 서열의 70개 뉴클레오티드 다운스트림에서 발생했음을 밝혔다 (도 13d). 이것은 CUG 반복 확장의 부위의 ~130개 뉴클레오티드 업스트림에서 상응한다. 흥미롭게도, 전장 DMPK 엑손 (DMPK-FL)에 상응하는 대역은 Postscriptr 변형된 세포에서 감소되었다 (도 13d). 이 영역에서 보존된 PAS 서열의 존재에도 불구하고, 유사한 근위 분열 및 폴리아데닐화 부위를 갖는 몇몇 인간 DMPK mRNA가 보고되었다. 이들 데이터는 Postscriptr가 인간 DMPK 트랜스크립트의 조기 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 지시하기에 충분하다는 것을 입증하며, 이는 내인성 숨은 업스트림 또는 다운스트림 폴리아데닐화 서열 요소에 의해 보조될 수 있다. Postscriptr 편집은 DMPK 트랜스크립트의 조기 종료를 초래하기 때문에, 이 접근법은 DM1의 치료에 치료학적으로 유용할 수 있다.
실시예 5: 인간 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 대안적 분열 및 폴리아데닐화
근육긴장퇴행위축 유형 1 (DM1)은 진행성 근육 소모, 근긴장, 심장 부정맥 및 인지 기능장애에 의해 특징되어 지는 단일원성 상염색체 우성 장애이다. DM1은 가장 흔한 성인-발병 근육 위축증이고 인간 디스트로피아 미요토니카 프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 비코딩 3' 비번역된 영역에서 CUG 트리뉴클레오티드 반복의 확장 및 발현으로부터 발생한다. ~50 CUG 반복 초과를 갖는 돌연변이체 DMPK mRNA는 독성 핵 RNA 초점을 형성하여, 정상적인 DMPK 발현을 방지하고, RNA 결합 단백질의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리 구성원을 격리함에 의해 대안적 스플라이싱 및 대안적 폴리아데닐화에서 광범위한 결함을 유도한다. DM1에 특정한 승인된 치료법은 없고 CUG RNA 반복을 표적화하는 현재 전략은 DMPK 발현의 손실을 다루지 않는다.
RNA의 대안적 폴리아데닐화 (APA)는 발달 및 질환 동안 유전자 발현을 제어하는 중요한 조절 메커니즘이다. 최근 딥 시퀀싱은 일부 DMPK 트랜스크립트가 CUG 확장 부위의 업스트림 위치에서 대안적으로 분열되고 폴리아데닐화될 수 있음을 밝혀냈으며, 이는 APA를 조작하는 것이 DMPK 발현을 보존하는 동시에 다운스트림 독성 반복 RNA의 전사를 방지하는 둘 모두에 유용한 접근법이 될 수 있음을 시사한다. 실시예 1 및 2는 CRISPR-Cas13의 프로그래밍 가능한 RNA-표적화 능력을 포유류 폴리아데닐화 인자와 결합하여 RNA 트랜스크립트의 부위-특이적 분열 및 폴리아데닐화를 유도하는, Postscriptr로 명명된, 신규한 RNA-편집 기술을 입증한다. 본 명세서에 제시된 데이터는 Postscriptr가 CUG 반복 확장의 부위의 내인성 인간 DMPK 트랜스크립트 업스트림의 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 강력하게 유도할 수 있음을 입증한다. 따라서, 본 명세서에서 논의된 바와 같이, Postscriptr에 의한 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 대안적 폴리아데닐화 양자는 DMPK 발현을 구제하고 다운스트림 독성 CUG 반복 RNA의 전사를 방지한다.
DM1의 분자 기원
DM1은 분자 수준에서 인간 염색체 19 상에 DM 단백질 키나제 (DMPK) 유전자의 3'-비번역된 영역에서 트리뉴클레오티드 CTG 반복의 과도한 확장으로부터 발생하는 인간 단일원성 상염색체 우성 장애의 부류 중 하나이다 (도 14a) (Fu 등, Science, 1992, 255:1256-58; Mahadevan 등, Science, 1992, 255:1253-55). CTG 반복 길이는, 영향을 받지 않은 개인에서 5-35 반복, 경증 DM1 환자에서 적어도 50 반복, 중증 선천성 DM1 환자에서 가능한 수천의 반복으로, 발병의 연령 및 질환 중증도와 양성적으로 상관관계가 있다 (Brook 등, cell, 1992, 68:799-808; Martorell 등, Neurology, 2001, 56:328-35; Harley 등, Am J Hum Genet, 1993, 52:1164-74). 5개 초과 CUG 반복을 갖는 전사된 DMPK mRNA는 반복 길이가 증가함에 따라 안정성이 증가하는 헤어핀 구조를 형성하는 것으로 생각된다 (도 14b) (Napierala & Krzyzosiak, J Biol Chem, 1997, 272:31079-85; Tian 등, RNA, 2000, 6:79-87). CUGexp RNA의 비정상적인 헤어핀 구조는 핵 초점에서 격리되는, 현저하기로는 RNA 조절 단백질의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리인, 여러 단백질에 의해 단단히 결합되어 있다 (도 14b 및 도 14c) (Mankodi 등, Hum MOl Genet , 2001, 10:2165-70; Taneja 등, J Cell Biol, 1995, 128:995-1002). MBNL 단백질의 기능적 손실은 여러 중요한 근육 유전자의 대안적 스플라이싱 및 폴리아데닐화의 결함을 포함하여 RNA 처리에서 광범위한 결함을 유발한다 (Nakamori 등, Ann Neruol, 2013, 74:862-72; Kuyumcu-Martinez & Cooper, Prog MOl Subcell Biol, 2006, 44:133-59; Batra 등, Mol Cell, 2014, 56:311-22). >100개 유전자에서 대안적 스플라이싱에서 결함은 DM1 환자에서 증상 중증도에 기여하고 전압-조절된 염화물 채널 (ClC-1), 리아노이딘 수용체 유형 1 (RyR1), 전압-게이트 L-유형 Ca2+ 채널 (CaV1.1) 및 횡문근형질/내형질 Ca2+-ATPase 1 (SERCA1)의 베타 서브유닛과 같은 중요한 근육 이온 조작 단백질을 포함하는 근육 약화 및 소모를 유발하는 것으로 생각된다. 골격근에서 발현되는 주요 염화물 채널인, CIC-1의 대안적 스플라이싱은 CIC-1 발현을 감소시키고 DM1 환자에서 근긴장의 기원이다 (Wheeler 등, J Clin Invest, 2007, 117:3952-57). DM1의 동물 모델은 DM1 환자에서 발견되는 많은 스플라이싱 및 폴리아데닐화 결함을 공유하는 골격근에서 CUGexp RNA를 과발현함에 의해 발생된다 (Mankodi 등, Science, 2000, 289:1769-73). 따라서, DM1은 독성 RNA의 발현으로부터 발생하고 DM1 병인은 주로 MBNL 패밀리 구성원 (MBNL1 및 2)의 기능의 상실에 기인했다는 발견으로 이어졌다. MBNL1 및 2를 결하는 마우스는 관찰된 DM1 표현형의 최대 80%를 차지하여, 인간 환자에서 발견되는 일부 심혈관, 근육, 눈 및 RNA-스플라이싱 이상을 요약한다 (Kanadia 등, Science, 2003, 302:1978-90; Lee 등, EMBO Mol Med, 2013, 5:1887-900). 그러나, DM1 마우스 모델에서 MBNL 단백질의 과발현은 DM1의 마우스 모델에서 스플라이싱을 구제하고 근육 증상의 완만한 개선에 제한된 성공을 했으며, 이는 DM1 증상에 대한 다중인자의 원인을 시사한다 (Yadava 등, Hum Geet, 2019; Kanadia 등, PNAS, 2006, 103:11748-53). 실제로, 관찰된 RNA 독성에 부가하여, CUGexp RNA는 비정상적인 반복-관련 비-ATG 번역 (RAN) 및 독성 폴리L, 폴리C 및 폴리A 펩티드의 축적을 유발하는 것으로 보고되었다 (Zu 등, PNAS, 2011 , 108:260-65). 병원성 확장된 CUG 반복 RNA와 관련된 복수의 기능장애 경로를 감안할 때, 가장 유익한 치료법은 돌연변이체 DMPK 유전자좌로부터 CUGexp RNA 반복의 발현을 방지하는 동시에 DMPK 발현을 보존하는 것을 목표로 해야 한다.
인간에서 DM1을 치료하기 위한 현재 도전
강렬한 노력에도 불구하고, DM1에 대한 치료 옵션은 부분적으로는 DM1 병인의 복잡성, 즉 독성 기능-획득 초위성체 반복 RNA의 발현에 기인하여 제한적이다 (Thornton 등, Curr Opin gen & Devel, 2018, 44:135-40). DM1 치료를 위한 한 가지 유망한 전략은 독성 RNA의 수준을 감소시키거나 MBNL 패밀리 단백질의 결합 및 격리를 방지하기 위해 DMPK-표적화 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용하는 것이다 (Jauvin 등, Mol Ther Nucleic Acids, 2017, 7:465- 74; Wheeler 등, Nature, 2012, 488:111-15). 그러나, 인간 환자에서의 골격근에서 치료적으로 효과적인 수준에 도달하는 ASO의 효율적인 전달에 대해서는 상당한 도전이 남아 있다 (clinicaltrials.gov identifier: NCT02312011). 초위성체 반복 RNA는 가능하기로는 그 안정적인 헤어핀 구조에 기인하여 RNA 유도된 분해에 저항성이어서, 이 접근법에 대해 많은 도전을 제공한다. 부가적으로, 칼슘/칼모듈린 의존성 세린 단백질 키나제 (CASK), 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 키나제 4 (MAP3K4) 또는 LDL 수용체 관련된 단백질 8 (LRP8)과 같은 그 코딩 서열에 짧은 CUG-반복 모티프를 함유하는 다른 인간 mRNA 트랜스크립트의 표적을 벗어난 ASO 녹다운은 DM1 환자에게 잠재적으로 해로운 영향을 미칠 수 있었다.
박테리아 유래된 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제를 사용하는 게놈 편집 접근법은 DM1을 교정하는 것을 목표로 하는 최신 전략 중 하나이다. CRISPR-Cas9 편집 전략은 DMPK 유전자 좌위를 직접적으로 편집하기 위해 이용되었다. CTG 게놈 반복의 5' 또는 3' 말단에서 단일 절단 CRISPR-Cas9 편집은 크고 제어되지 않은 서열 결실을 유도할 수 있지만, 반복 확장 측면에 있는 이중 가이드-RNA의 사용은 반복 서열의 정확한 결실을 가능하게 하였다 (van Agmall 등, Mol Ther, 2018, 25:24-43; Wang 등, Mol Ther, 2018, 26:2617-30). 그러나, 이것은 빈번한 서열 반전으로 이어질 수 있으며 (~7%), 그 자체로 독성이 있을 수 있다. 흥미롭게도, CTG 확장의 업스트림에 폴리아데닐화 카세트를 삽입하기 위해 CRISPR-Cas9를 사용하는 DMPK 유전자좌의 게놈 편집은 CUGexp RNA의 다운스트림 발현을 방지하여, 이에 의해 DM1 환자 유래된 iPS 세포에서 RNA 초점 형성 및 RNA-유도된 세포 독성을 억제하는 것으로 나타났다 (Gao 등, Mol Ther, 2016, 24:1378-87. 그러나, 생체내에서 CRISPR-Cas를 사용하여 주형 폴리아데닐화 서열을 전달하는 능력은 비-분할 조직에서 상동성재조합 수선 (HDR)에 대한 낮은 효율성을 제공하기 때문에 여전히 도전적이다. 부가하여, 이들 전략은 세포 및 DM1 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었지만, 인간 게놈 DNA 편집은 생식계열 편집 가능성으로 인해 논란의 여지가 남아있다. 대안적으로, DNA 및 RNA 둘 모두를 인식할 수 있는, 촉매적으로 비활성 Cas9 (dCas9)에 리보뉴클레아제 도메인의 융합은 CUG-반복 서열을 직접적으로 표적화함에 의해 초위성체 반복 RNA의 분해를 허용했다 (Batra 등, 2017, Cell, 2018, 170:899-912). 그러나, 반복-표적화된 ASO의 표적을 벗어난 잠재력에 유사하게, 이 접근법은 CUG-반복 모티프를 함유하는 다른 비-병원성 인간 mRNA를 분열할 잠재력을 갖는다. 따라서, DM1 환자에서 독성 RNA를 표적화하는 치료적 전략을 개발하는 데 상당한 도전이 남아있다.
CRISPR-Cas13에 의한 RNA의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화
최근까지 mRNA 대안적 분열 및 폴리아데닐화의 직접 조작은 DNA 안으로 폴리아데닐화 카세트의 삽입과 같은 게놈-편집 접근법으로 제한되어 왔으며, 이는 기술적으로 도전적이고 치료적으로 효율적이지 않다. 실시예 1 및 2는 포유류 폴리아데닐화의 마스터 조절자인, NUDT21과 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)을 융합함에 의해 포유류 세포에서 RNA의 부위-특이적 분열 및 폴리아데닐화를 허용하는 Postscriptr라고하는 신규한 RNA-편집 기술의 개발을 입증한다. Postscriptr 기술은 분열 및 폴리아데닐화 둘 모두에 대해 mRNA의 직접 표적화를 허용하며, 이는 mRNA를 따라 임의의 서열 또는 내인성 대안적 폴리아데닐화 부위에서 유도될 수 있다. 게놈을 직접적으로 편집하는 다른 CRISPR 도구와 달리, Postscriptr는 전사-후에 유전자 발현을 변경하고 환자의 DNA를 조작하지 않고 인간 RNA 처리 질환을 치료하는 치료적 응용에 사용될 수 있다.
여기서, Postscriptr RNA-편집은 인간 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트를 표적화하고 조직학적 (근육 소모 및 약화), 세포 (중앙집중화된 핵, 섬유 유형 변화) 및 분자 (RNA 초점 형성, MBNL1 오-국재화 및 대안적 스플라이싱 결함)를 포함한 DM1 증상을 치료하는 데 이 접근법의 효과를 결정하는 데 사용된다. 이 프레임워크는 인간 환자에서 DM1에 대한 잠재적인 치료법으로서 DMPK 트랜스크립트의 Postscriptr-표적화된 대안적 폴리아데닐화의 효능의 결정을 허용한다. 현재 다수의 골격근 이영양증에 대한 유전자 치료 시험에서 테스트되고 있는, AAV와 같은 비-통합 바이러스 유전자 전달 입자 안으로 Postscriptr 편집 구성요소의 패키징은 인간 환자에게 강력한 전달 접근법을 제공한다. 중요하기로는, 인간 DMPK 트랜스크립트 서열을 표적화하는 시약의 설계, 개발, 시험 및 전달은 인간 환자에서 DM1을 예방하기 위한 Postscriptr의 잠재적인 향후 임상적 적용을 위한 이 접근법의 신속한 해석을 허용한다.
포유류 3' 말단 처리
모든 인간 유전자의 절반 초과가 DMPK를 포함한 대안적 분열 및 폴리아데닐화를 겪는다. (도 15a). 폴리아데닐화는 RNA 트랜스크립트 안정성, 핵외수송 및 번역 효율성을 제어하는 데 필수적인 역할을 한다. RNA 분열 및 폴리(A) 꼬리의 첨가의 3' 부위는 전형적으로 정규의 6량체 모티프 AAUAAA (서열번호: 789) 및 업스트림과 다운스트림 서열 요소로 구성된 고유한 폴리아데닐화 신호 (PAS) 서열에 의해 결정된다 (도 15b). AAUAAA PAS 모티프는 RNA 분열 부위의 ~25개 뉴클레오티드 (nt) 업스트림에서 발견되고 분열 및 폴리아데닐화 특이적 인자 (CPSF) 복합체의 2가지 구성요소인: 분열 및 폴리아데닐화 인자 30 (CPSF30) 및 WD 반복-함유 단백질 33 (WDR33)에 의해 직접적으로 결합된다. 분열 인자 Im (CFIm) 복합체의 구성요소는 RNA 분열 부위의 ~50 nt 업스트림에서 발생하는 USE 모티프 UGUA에 직접적으로 결합한다. 정규의 AAUAAA (서열번호: 789) 모티프를 결하는 트랜스크립트에서, CFIm 복합체는 폴리(A) 신호 인식의 1차 결정인자로 기능한다. CFIm 복합체의 RNA-결합 구성요소인, Nudix 가수분해효소 21 (NUDT21)은 3' 말단 처리의 활성화제 및 대안적 폴리아데닐화 부위 선택의 조절자로 기능한다. CFIm 복합체 결합은 3' 말단 처리의 제1 단계 중 하나이고 3' 말단 처리 기계에 추가의 공-인자를 모집한다. 폴리아데닐화 슈퍼컴플렉스 구성요소와 RNA 중합효소 II의 C-말단 도메인 간의 직접적인 상호작용은 신장 복합체의 분해를 촉발하고 전사 종료와 함께 3' 말단 처리를 조정한다. APA 부위 선택을 조절하는 내인성 세포 메커니즘이 불분명한 반면, RNA 분열 및 폴리아데닐화를 지시하는 능력은 대안적 유전자 이소폼 발현 및 트랜스크립트 종결에 걸쳐 정확한 제어를 허용할 것이다. 본 명세서에 제시된 데이터는 CRISPR-Cas13을 사용하여 포유류 3' 말단 처리를 지시하는 프로그래밍 가능한 RNA 편집 기술의 개발을 입증한다 (도 15c).
CRISPR-Cas13에 의한 RNA 표적화 및 조작
박테리아-유래된 유형 VI CRISPR-Cas 시스템은 Cas13으로 명명된 RNA-가이드된 엔도리보뉴클레아제의 패밀리를 인코딩한다 (Abudayyeh 등, Science, 2016, 353:aaf5573; Smargon 등, MOl Cell, 2017, 64:618-30; East-Seletsky 등, Mol Cell, 2017, 66:373-83). Cas9에 유사하게, Cas13의 뉴클레아제 도메인 내 잔기의 돌연변이는 RNA 결합 능력을 유지하는 촉매적으로 죽은 효소 (dCas13)를 생성한다 (Cox 등, Science, 2017, 358:1019-27). dCas13을 사용하여 폴리아데닐화 복합체 형성을 지시하기 위해, 3가지 융합 단백질이 CPSF30, WDR33 및 NUDT21을 포함한 인간 3' 말단 처리 기계의 RNA 결합 구성요소와 프리보텔라 sp. P5-125로부터 촉매적으로 죽은 유형 VI-B Cas13 효소 (dPspCas13b)를 조합함에 의해 설계되었다 (도 16a). N-말단 3x FLAG 에피토프 태그가 단백질 검출을 위해 포함되었고, 긴 가요성 펩티드 링커 [GGGGSGGGGS (서열번호: 69)]가 입체 장애의 가능성을 줄이기 위해 dPspCas13b와 폴리아데닐화 구성요소 사이에 포함되었다.
효모 Ty1 NLS는 dCas13 단백질의 효율적인 핵 국재화를 허용한다
이전의 dCas13-매개된 RNA 편집 적용은 세포질 내에서 발생했지만 RNA의 전사-후 분열 및 폴리아데닐화는 핵 내에서 발생하고 따라서 dCas13 융합 단백질의 효율적인 핵 국재화를 필요로 한다. dCas13 단백질은 가능하기로는 그 큰 크기와 고유한 핵 국재화 신호 (NLS)의 결여에 기인하여 핵에 국재화할 수 없었다. 놀랍게도, 뉴클레오플라스민 (NPM)으로부터의 고전적인 SV40 NLS 또는 이분 NLS의 첨가는 dPspCas13b 융합 단백질의 효율적인 핵 국재화를 촉진하지 않았다. 그러나, 정상적인 세포 단백질 유입 기계를 이용하지만 전형적인 이분 NLS보다 거의 3배 긴 링커 서열을 함유하는, 효모 Ty1 레트로트랜스포손에서 유래된 비-고전적인 이분 NLS의 단일 카피의 첨가 (McLane 등, NAR, 2008, 36:4317-26; Kenna 등, Mol cell Biol, 1998, 18:1115-24)는 dPspCas13b 융합 단백질의 강력한 핵 국재화를 초래했다 (도 16b).
dPspCas13b-NUDT21은 RNA의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분하다
분열 및 폴리아데닐화를 정량화하고 시각화하기 위해, 슈퍼폴더 GFP (sfGFP)의 형광 및 비-형광 오픈 리딩 프레임 (ORF) 사이를 전환할 수 있는 리포터가 설계되었다. sfGFP 리포터 작제물은 프로토타입 포유류 인트로닉 (sfGFPapa) 내에 포매된 11번째 베타 가닥에 대한 코딩 서열로 생성되었다 (도 17a). 포유류 COS7 세포에서 sfGFPapa 리포터의 발현은 거의 검출 가능하지 않은 형광을 초래했으며, 이는 11번째 베타 가닥을 함유하는 인트론의 효율적인 제거와 비-형광 sfGFP 단백질을 인코딩하는 ORF의 번역을 시사한다. dPspCas13b 융합 단백질이 sfGFPapa 리포터 mRNA의 CRISPR-Cas13-매개된 분열 및 폴리아데닐화를 촉진할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, sfGFPapa 리포터에서 sfGFP의 11번째 베타 가닥의 코딩 서열의 인트로닉 서열 다운스트림을 표적화하는 crRNA를 설계했다. 살아있는 세포 검정에서, sfGFPapa 리포터 단독에 비해 비-표적화 crRNA를 사용하여 임의의 dPspCas13b 융합 단백질을 발현하는 세포에서 형광 신호는 검출되지 않았다. 그러나, CPSF30 또는 WDR33 융합 단백질이 아닌 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질로 crRNA를 표적화하는 인트론의 발현은 24시간 후에 검출 가능한 녹색 형광 세포를 생성하였다 (도 17b). cDNA 말단의 3' 급속 증폭 (RACE)은 sGFPapa mRNA가 crRNA 표적 서열의 3' 측에 대해 -7에서 +110 nt 범위의 부위에서 분열되고 폴리아데닐화되었음을 확인했다. dPspCas13b-NUDT21은 mRNA를 폴리아데닐화하는 데 효율적이었기 때문에, 이 표적화 접근법을 Postscriptr로 명명했다. 주로 CA 디뉴클레오티드 이후에 발생하는 포유류 분열에 대비하여, Postscriptr-유도된 분열은 C 또는 T 뉴클레오티드에서 가장 자주 발생했다. 이들 데이터는 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질이 crRNA에 의해 표적화된 인트로닉 서열에서 리포터 mRNA의 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분하였다는 것을 입증했다.
세포에서 내인성 인간 DMPK 트랜스크립트 표적화
다수의 대안적으로 스플라이싱된 DMPK 트랜스크립트 및 잠재적인 대안적 폴리아데닐화 신호 서열의 존재는 DMPK 기능을 제어하는 메커니즘이 복잡하고 조직에 걸쳐서 그리고 조직 내에서 다양할 수 있음을 시사한다. DMPK의 주요한 긴 이소폼은 DMPK 단백질을 세포내의 막에 국재화시키는 C-말단 단일 막횡단 알파 나선을 인코딩하여, 가능하기로는 포스폴람반 또는 미오레굴린과 같은 막 결합 표적을 인산화하는 그 역할을 지지한다. DMPK의 더 짧은 이소폼은 이 C-말단 막횡단 나선을 결하고, 또한 대한적으로 폴리아데닐화되어 절단된 3' UTR 서열을 생성할 것으로 예측된다. 인간 DMPK 트랜스크립트의 말단 엑손은 923개 뉴클레오티드 길이이고 말단 코딩 서열 및 전체 3' UTR 둘 모두를 함유한다. 분열 및 폴리아데닐화는 보존된 컨센서스 PAS (AAUAAA (서열번호: 789)) 서열의 다운스트림에서 발생한다. 인간 DM1 환자에 존재하는 CUG 트리뉴클레오티드 반복 확장은, 정지 코돈의 ~200개 뉴클레오티드 다운스트림인, 인간 DMPK 유전자의 말단 엑손의 비코딩 3'UTR 영역 내에서 발생한다 (도 18). DMPK 트랜스크립트가 인간 HEK293T 세포에서 발현되기 때문에, Postscriptr가 이 인간 세포주에서 내인성 DMPK 트랜스크립트를 분열하고 폴리아 데닐화할 수 있는지 여부가 결정되었다. crRNA는 CUG 반복 확장 부위의 업스트림인, 인간 DMPK의 말단 엑손을 표적화하여 설계되었다. Postscriptr 융합 단백질과 crRNA는 24시간 동안 HEK293T 세포 안으로 공-발현되었으며, 그 후 맞춤 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 3' RACE에 의한 후속 분석을 위해 총 RNA를 단리했다. 2개의 중첩된 DMPK-특이적 프라이머를 사용한 PCR-기반 증폭은 특히 하나의 crRNA가 전장 3'UTR (DMPK-PS)보다 짧은 폴리아데닐화된 트랜스크립트의 발현을 유도하였다는 것을 보여주었다 (도 18). 이 대역의 시퀀싱은 그것이 DMPK 3'UTR에 특이적이었다는 것과 분열 및 폴리아데닐화가 crRNA 표적 서열의 70개 뉴클레오티드 다운스트림에서 발생했다는 것을 밝혔다 (도 18). 폴리아데닐화는 대안적으로 스플라이싱된 DMPK 이소폼의 정상적인 분열 및 폴리아데닐화 부위에 상응하는 CUG 반복 확장의 ~130개 뉴클레오티드 업스트림에서 발생했다. 중요하기로는, 이 경우 전장 단백질 코딩 서열의 발현이 보존되었다. 부가적으로, 전장 DMPK 트랜스크립트 (DMPK-FL)에 상응하는 대역이 Postscriptr 변형된 세포에서 감소되었으며, 이는 짧은 DMPK 대 전장 DMPK 이소폼의 비율이 전환되었음을 입증한다 (도 18). 이들 데이터는 Postscriptr가 내인성 업스트림 또는 다운스트림 폴리아데닐화 서열 요소에 의해 가이드될 수 있는 인간 DMPK 트랜스크립트의 조기 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 지시하기에 충분하다는 것을 확립한다. Postscriptr 편집은 CUGexp의 DMPK 트랜스크립트 업스트림의 조기 종료를 초래하기 때문에, 이 접근법은 DM1의 예방에 치료학적으로 유용할 수 있었다.
핵 초점에서 CUG exp RNA는 dCas13으로 표적화될 수 있다
실시예 1-4에서 입증된 바와 같이, Postscriptr는 돌연변이체 DMPK mRNA의 경우에 독성 CUG 반복을 인코딩하는 전장 DMPK의 발현을 방지하기 위해 DMPK 트랜스크립트의 분열 및 폴리아데닐화를 유도할 수 있다. DM1 환자는 핵 RNA 초점에 존재하는 돌연변이체 DMPK RNA의 큰 기존 분획을 가지기 때문에, Postscriptr로 그 형성을 방지하는 것 외에도 이 돌연변이체 mRNA 트랜스크립트의 풀을 표적화하는 것이 유용할 수 있다. dCas13이 핵 RNA 초점에 효율적으로 표적화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 형광 융합 단백질을 dPspCas13b와 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 조합함에 의해 설계했다 (도 19). Ty1 핵 국재화 서열 (Ty1 NLS)은 강력한 핵 국재화를 허용하기 위해 dPspCas13b-eGFP 융합 단백질의 N-말단에 포함되었다 (도 19). 예상대로 dPspCas13b-GFP 융합 단백질이 포유류 COS7 세포에서 발현되었을 때 GFP 발현은 핵으로 제한되었다. DM1 환자에서 발견되는 핵 RNA 초점을 모방하기 위해, 엑손 11-15를 포함하는 인간 DMPK 유전자좌의 맥락에서 960개 CUG 반복을 함유하는 벡터의 일시적 발현이 사용되었다 (DT960, Addgene 플라스미드 #80412) (도 19b). dPspCas13b-eGFP 융합 단백질을 CUG 반복 서열에 국재화시키기 위해, CUG 안티센스 반복 표적 서열을 함유하는 호환 가능한 crRNA를 설계했으며, 이는 9개 CUG 반복 (CAGx9 crRNA)과 혼성화할 것으로 예측된다 (도 19c). CUG-표적화 crRNA와 공-형질감염된 경우, dPspCas13b-eGFP 융합 단백질은 돌연변이체 DMPK RNA의 발현에 의해 생성된 핵 RNA 초점에 강력하게 표적화되었지만, 비-표적화 대조 crRNA를 사용하는 경우에는 그렇지 않았다. 이전 보고와 일치하여, DT960은 mCherry-MBNL1 융합 단백질과 공-국재화된 dCas13b-eGFP로 강조표시된 RNA 초점을 유도했다 (도 19d). HiLightr로 명명된 이 기술은 고정 및 살아 있는 세포에서 질환-관련 RNA 초점의 시각화를 크게 단순화할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 추가로, 이들 데이터는 Ty1 NLS로 국재화되었을 때, 그 세포독성을 완화하기 위해 이들 RNA를 방지 또는 편집하는 목표로, dCas13이 3' 말단 처리 전후에 mRNA를 표적화할 가능성이 있음을 보여준다
이들 데이터는 CRISPR-Cas13에 의한 표적화된 RNA 편집이 DMPK 발현을 보존하고 독성 CUG 확장 RNA의 전사를 방지하기 위한 잠재적인 치료적 접근법이라는 결론을 뒷받침한다.
인간 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 대안적 분열 및 폴리아데닐화.
인간 DMPK 유전자좌의 조절은 적어도 6개의 주요 대안적으로 스플라이싱된 이소폼과 적어도 4개의 잠재적인 대안적 폴리아데닐화 부위로 복잡하다. 가장 긴 DMPK 이소폼은 말단 엑손의 3' UTR에서 발생하는 CUGexp RNA의 부위로, 15개의 엑손을 함유하는 트랜스크립트를 인코딩한다. 다음 연구의 성공적인 완료는 인간 DMPK 이소폼의 효율적인 분열 및 폴리아데닐화를 유도하고 CUGexp RNA의 다운스트림 전사를 방지하는 Postscriptr 가이드 RNA를 동정한다. 본 명세서에 제시된 데이터는 Postscriptr가 인간 세포에서 CUG 확장 부위의 업스트림에서 종결되는 HEK293T 세포에서 하나의 대안적 DMPK 이소폼의 분열 및 폴리아데닐화를 유도할 수 있음을 입증한다. 가이드-RNA는 다운스트림 CUGexp RNA 전사를 충분히 방지하면서 정상적인 DMPK 기능을 둘 모두 보존하기 위한 노력으로 DMPK 유전자좌를 따라 모든 자연적으로 발생하는 APA-조절된 이소폼의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 유도하도록 설계되었다.
3' RACE를 사용하여 태아 및 성인 인체 조직에서 APA에 의해 조절된 주요 DMPK 이소폼의 동정. 인간 DMPK 트랜스크립트의 대안적 폴리아데닐화의 주석은 다른 인간 조직에 걸쳐 열악하게 특성화되었으며, 이는 다른 대안적 분열 및 폴리아데닐화 부위를 이용할 수 있다. Postscriptr는 표적화된 폴리아데닐화를 유도하기 위해 내인성 PAS 부위를 필요로하지 않지만, 내인성 APA 부위에서 표적화하는 Postscriptr는 내인성 APA 부위에서 고유한 PAS 서열에 의해 보조될 수 있는 보다 효율적이고 정확한 분열을 허용한다. APA 조절된 DMPK 이소폼은 인간 태아 및 성인 조직과 그의 정확한 분열 부위에서 동정되며, 이는 Postscriptr 가이드-RNA의 설계 및 표적화에 도움이 된다. RACE-ready Marathon cDNA (Clontech) (태아 및 성인: 골격근, 뇌, 폐 및 위)를 사용하여, 3'RACE는 인간 돌연변이체 DMPK 작제물 및 유도성 DM1 마우스 모델 내에 존재하는 대부분의 5' 서열을 나타내는 인간 DMPK의 엑손 11에 특이적인 중첩된 프라이머를 사용하여 수행된다. PCR-생성된 3'RACE 생성물은 아가로스 겔-전기영동을 사용하여 분리하고, TOPO 클로닝을 사용하여 서브클로닝하고, 시퀀싱 및 매핑하여 그 분열 부위를 동정한다.
CRISPR 가이드-RNA를 타일링함에 의해 DMPK 이소폼의 Postscriptr 편집 효율성을 평가한다. 효율적인 결합 및 분열을 위해 인접한 프로토스페이서 모티프 (PAM)를 필요로하는 Cas9와 달리, Cas13b는 RNA 표적화를 위해 측접하는 서열을 필요로하지 않는다. 이는 서열 전반에 걸쳐 가이드-RNA의 효율적인 타일링을 허용하여 결합 효율이 가장 높은 부위를 동정한다. 각 APA 이소폼에 대해 10개 가이드-RNA가 RNA 분열 부위에 대해 5개 뉴클레오티드 (-50 내지 -100 범위)마다 타일링하도록 설계된다. 이 서열 범위를 표적화하는 것은 Postscriptr 편집에 가장 활성적이다. Postscriptr를 사용하여 DMPK의 APA 이소폼을 유도하는 것 외에도 돌연변이체 DMPK RNA는 CAGx9 가이드-RNA를 사용하여 직접적으로 표적화된다. Postscriptr는 분열 활성을 갖고 dCas13-GFP 단백질은 핵 초점에 표적화될 수 있기 때문에, 이 접근법은 CUGexp RNA 초점의 분열을 허용하거나 DMPK mRNA의 처리 및 유출을 촉진한다. 그러나, 이 표적화 접근법은 짧은 CUG-모티프를 함유하는 다른 인간 mRNA의 표적을 벗어난 절단으로 이어질 수 있다. 대안적으로, CUGexp RNA에 대한 dCas13 단독 (융합 도메인 없음)의 표적화는 입체 장애를 제공하고 MBNL 단백질이 독성 CUG 반복에 결합 및 격리되는 것을 방지하며, 이는 그 자체가 치료적으로 유익할 수 있다.
PspCas13b 가이드-RNA 설계 및 클로닝. 가이드-RNA의 타일링은 RNA 폴딩, 안정성 또는 표적 RNA 접근성에 의해 영향을 받을 수 있는 가장 활성인 서열을 동정하는 데 필요한다. 그 표적 서열에 3개 초과의 연속적인 T를 갖는 crRNA 서열은 종결자로 폴리 T를 사용하는 인간 U6 pol III 프로모터로부터의 발현을 현저하게 방지할 수 있으므로 회피된다. 가이드-RNA는 표준 클로닝 기술을 사용하여 상보성 올리고뉴클레오티드를 pC0043 안으로 어닐링함에 의해 클로닝된다.
sfGFPapa 리포터를 사용한 가이드-RNA 효율성 시험. APA를 검출하기 위해 개발된 sfGFP 형광 리포터 (sfGFPapa)는 sfGFP 오픈 리딩 프레임의 다운스트림인, 토끼 베타 글로빈 인트론 내에서 역방향으로 가이드-RNA를 삽입할 수 있도록 하는 서열 오버행을 갖는 내부 클로닝 부위를 함유한다. 이 리포터 안으로 가이드-RNA를 클로닝하는 것은 리포터의 자가-표적화 및 활성화를 허용하여 각 가이드-RNA의 활성을 결정한다. 이 전략을 사용하여, 가이드-RNA를 스크리닝하여 가장 효율적인 것을 동정하고, 형질감염 효율에 대한 대조로서 내부 SV40-루시퍼라제 발현 벡터에 비해 녹색 형광의 강도로 측정하였다. 형광은 BMG FluoStar Optima Plate 판독기 상에서 측정되고 추가 분석을 위해 가장 큰 신호를 생성한 가이드-RNA가 선택된다.
3'RACE를 사용하여 COS7 세포에서 CUG exp DMPK RNA 상의 가이드-RNA 시험. 효율적인 가이드-RNA는 인간 DMPK 엑손 11-15의 맥락에서 960개 CUG 반복을 인코딩하는 돌연변이체 인간 DMPK 발현 플라스미드인, DT960의 분열 및 폴리아데닐화를 표적화하고 유도하는 그의 능력에 대해 추가로 시험된다. Postscriptr 융합 단백질, 가이드-RNA 및 DT960 플라스미드를 인코딩하는 플라스미드는 24시간 동안 COS7 세포 안으로 공-발현되며, 그 후 맞춤 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 3' RACE에 의한 후속 분석을 위해 TRIzol을 사용하여 총 RNA가 단리된다. 이들 연구의 결과는 돌연변이체 DMPK RNA의 Postscriptr 편집이 확장된 다운스트림 CUG 반복의 존재에서 발생할 수 있으며, 이는 3' 말단 처리에 필요한 다운스트림 서열 요소를 변경하거나 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 오-국재화 또는 폴딩을 유발하여 3'말단 처리가 억제될 수 있다는 것을 입증한다. 최근 연구는 배타적으로 핵인 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트는 폴리아데닐화되고 정상 DMPK 트랜스크립트와 비교하여 그 폴리(A) 꼬리에서 유사한 크기 분포를 공유하는 것을 시사하여, 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 3' 말단 처리가 광범위하게 억제되지 않음을 시사한다.
Postscriptr 편집 효율성. 상기에서 생성된 총 RNA를 사용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 랜덤 6량체와 Superscript III을 사용하여 cDNA를 생성한다. 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트의 Postscriptr 유도된 APA의 편집 효율은 가이드-RNA의 엑손 업스트림에 특이적인 프라이머 세트 및 DMPK 3' UTR에서 CUG 확장 부위의 다른 세트 다운스트림을 사용한 qRT-PCR을 사용하여 평가된다. 효율적인 가이드-RNA의 경우, 표적 부위의 인간 DMPK 트랜스크립트 업스트림의 동등한 수준이지만 현저하게 감소된 수준 다운스트림이 관찰되어, DMPK mRNA는 보존되지만 전사는 조기 종료한다는 것을 나타낸다. 가장 효과적인 가이드-RNA는 DMPK 발현을 구제하고 CUGexp 관련 독성을 감소시키는 능력에 대해 추가로 시험된다.
Postscriptr 가 DMPK mRNA의 핵세포질 셔틀링 및 발현을 구제하는지 여부의 결정.
핵 초점에서 돌연변이체 DMPK mRNA의 보유는 DM1 환자에서 감소된 DMPK 발현에 기초가 되는 주요한 메커니즘이다. 이전 보고와 일치하여, 큰 CUGexp 반복을 함유하는 인간 DMPK 3' UTR을 함유하는 루시퍼라제 이식유전자는 12개 CUG 반복만을 갖는 작제물에 비해 루시퍼라제 발현을 현저하게 감소시킨다 (>90%) (도 20). Postscriptr 편집이 세포 기반 검정을 사용한 돌연변이체 DMPK mRNA의 정상 핵세포질 셔틀링 및 발현을 구제할 수 있는지 여부가 결정된다.
DMPK의 핵세포질 셔틀링. 인간 DMPK에 대한 신뢰할 수 있는 항체가 존재하지 않기 때문에, Postscriptr 편집이 돌연변이체 DMPK RNA의 핵세포질 셔틀링을 구제하는지 여부가 먼저 결정된다. Postscriptr 편집 구성요소는 COS7 세포에서 DT960 돌연변이체 DMPK 발현 플라스미드와 함께 24시간 동안 공-형질감염되며, 그 후 세포질 및 핵 RNA가 분획화된다. 업스트림 DMPK 엑손 11-12에 특이적인 sybr 프라이머를 사용하는 qRT-PCR이 핵 대 세포질 DMPK RNA의 비율을 결정하기 위해 사용된다. 비-표적화 가이드-RNA에 비해 DMPK의 상대적 세포질 수준을 증가시키는 가이드-RNA가 추가 시험을 위해 선택된다.
루시퍼라제-DMPK 이식유전자 발현의 구제. CUG 반복을 표적화하는 가이드-RNA의 경우, Postscriptr가 비-표적화 가이드-RNA에 비해 960개 CUG 반복을 인코딩하는 루시퍼라제-DMPK 이식유전자 (pGL3P-DT960)의 발현을 구제할 수 있는지 여부가 결정된다. 루시퍼라제 활성 및 형광은 BMG FluoStar Optima 플레이트 리더 상에서 측정된다. 가장 큰 신호를 생성하는 가이드-RNA는 추가 분석을 위해 선택된다.
Postscriptr 가 핵 RNA 초점 형성 및 MBNL 오-국재화를 방지하는지 여부의 결정.
아마도 DM1 병리학의 가장 눈에 띄는 특징은 CUGexp RNA를 함유하는 핵 초점의 존재이며, 이는 MBNL 패밀리 단백질과 공-국재화되고 기능적으로 고갈된다. Postscriptr가 RNA 초점을 줄이거나 폐기하고 MBNL1의 격리를 방지할 수 있는지 여부가 결정된다. 인간 DMPK 이소폼을 표적화하는 Postscriptr 가이드-RNA는 24시간 동안 C2C12 근아세포 세포에서 돌연변이체 DMPK 발현 플라스미드인, DT960과 공-형질감염된다. 세포는 그런 다음 CUGexp RNA 초점을 검출하기 위해 조합된 형광 제자리 혼성화 (FISH) 및 MBNL1을 검출하기 위해 면역형광 (IF)을 사용하여 분석된다. 비-표적화 가이드 RNA 및 DT960과 공-형질감염된 Postscriptr는 RNA 초점 및 MBNL1 공-국재화에 대한 양성 대조군으로 사용되고 DT960 없이 음성 대조군으로 사용된다. 조합된 FISH/IF는 다음과 같이 수행된다. 간단히 말해, 유리 커버슬립 상에 배양된 세포를 4% PFA에서 15분 동안 고정하고 PBS로 2회 세정한다. 고정된 세포는 PBS 내 0.5% Triton X-100에서 10분 동안 투과하고 PBS로 3회 세정한 후 40% DMSO, 40% 포름아미드, 10% BSA (10mg/ml), 2X SCC에서 30분 동안 사전-혼성화한다. 그런 다음 커버슬립을 혼성화 완충액 (40% 포름아미드, 10% DMSO, 2X SCC, 2mM 바나딜 리보뉴클레오시드, 60μg/ml tRNA, 30μg/ml BSA 및 0.75μg 8xCAG-Cy3 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브 (IDT)에서 2시간 동안 혼성화한다. 후속 IF의 경우, 커버슬립을 2X SCC/50% 포름아미드, 2X SCC 및 PBS에서 2회 세정한다. MBNL1은 항-MBNL1 항체 (클론 3A4, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 2시간 동안 검출하고, PBS에서 2회 세정한 다음, Alexa-Fluor 488과 접합된 염소 항-토끼 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이션한다. 커버슬립은 Vectashield를 사용하여 DAPI (Vector Biolabs)가 장착되고 공초점 현미경을 사용하여 이미지화된다. Postscriptr가 세포당 RNA 초점의 수를 감소시키는지 여부와 초점이 MBNL1과 공-국재화되는지 여부가 결정된다. 적어도 15개 세포가 적어도 3번의 독립적인 실험으로부터 계산된다.
인간 DMPK 유전자좌의 조절은 이미 주석이 추가된 다중 스플라이스 이소폼으로 복잡한다. 따라서, 엑손 12의 인트로닉 서열 다운스트림이 또한 표적화되어, 대부분의 DMPK의 코딩 잠재력을 보존한다. CRISPR-Cas9 시스템의 경우, 단일 또는 이중 서열 불일치를 견딜 수 있는 그 능력, 그 짧은 단일 20개 뉴클레오티드 가이드-RNA 및 잠재적 표적 모집단이 크다 (~ 30억 염기쌍 인간 게놈)는 것을 감안할 때 표적을 벗어난 편집이 문제가 될 수 있다. 그러나, CRISPR-Cas13 시스템에 대한 잠재적인 표적을 벗어난 편집은 더 긴 ~30개 뉴클레오티드 가이드-RNA에 의해 가이드되고 표적 모집단이 훨씬 더 작기 때문에 (단지 전사된 RNA, 표적화된 안티센스) 거의 문제가 되지 않는다. BLAST 알고리즘은 임의의 잠재적인 표적을 벗어난 것을 동정하고 제한하는 데 이용된다. mRNA를 함유하는 다른 주요 짧은 CUG 반복의 발현의 분석이 이 방법의 표적을 벗어나는 가능성을 결정하기 위해 포함된다. 가이드-RNA는 스플라이싱된 DMPK 트랜스크립트에 존재하는 엑손 서열을 표적화하도록 설계되었기 때문에, Postscriptr 편집은 광범위한 기간에 걸쳐 핵에서 기존 돌연변이체 DMPK 트랜스크립트를 표적화할 수 있다. 세포 배양 및 일시적 형질감염의 한계로 인해 이들 실험은 24시간 및 48시간에서 분석된다.
Postscriptr 가 DM1의 인간화된 마우스 모델에서 질환 결과를 완화하는지 여부의 결정.
여기에서, 생체내 Postscriptr 편집 구성요소의 바이러스 전달 및 발현은 DM1-관련 세포 및 분자 병리를 교정하기 위한 치료적 접근법으로서 DMPK 이소폼의 표적화된 APA의 효능을 결정하는 데 사용된다. DMPK APA 이소폼을 표적화하는 가이드-RNA 및 비-표적화 대조 가이드-RNA (총 3개)가 시험된다.
골격근에서 DMPK DM1 트랜스크립트의 Postscriptr 표적화의 생체내 효율성을 평가한다.
이들 연구를 위해, 인간 DMPK 엑손 11-15의 맥락에서 960개 CUG 반복을 발현하는 이전에 확립된 유도성 DM1 마우스 모델이 사용된다 (TREDT960I)(도 21). 상기에서 기술된 바와 같이, 돌연변이체 DMPK (DT960)의 동일한 단편이 Postscriptr 가이드-RNA를 설계하고 시험하는데 사용된다. 인간 DMPK 유전자좌의 이 큰 단편은 DMPK 유전자좌를 따라 다중 부위에서 Postscriptr 표적화를 허용하여 인공 및 내인성 교대로 스플라이싱 및 폴리아데닐화된 DMPK 이소폼 둘 모두를 시험할 수 있다. 이 모델에서, 출생 후 1일차에서 돌연변이체 DMPK 이식유전자의 유도는 근병증, MBNL1과 공-국재화된 CUG 핵 RNA 초점 및 특징적인 DM1 스플라이싱 결함을 포함하여 10주령에서 DM1 관련 표현형을 초래했다. 흥미롭게도, 이 모델은 이들 병리가 가역적이라는 것을 보여주었으며, 이는 CUGexp RNA의 전사를 종료하는 것이 치료적 이점에 충분하다는 것을 시사한다.
DM1의 유도성 마우스 모델. TREDT960I 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입했다. 골격근에서 돌연변이체 DMPK 발현을 유도하기 위해, TREDT960I 동형접합 마우스는 인간 골격 액틴 프로모터 (HSA-rtTA)의 제어하에 rtTA 발현 카세트를 함유하는 반접합성 이식유전자의 마우스와 교배된다. 이것은 이중-이식유전자의 자손 (TREDT960I 및 HSA-rtTA) 및 HSA-rtTA를 결하는 단일 이식유전자 (TREDT960I) 대조군을 생성한다. [수컷TREDT960I/TREDT960I x 암컷HSA-rtTA/+ = 수컷 또는 암컷TREDT960I/+; HSA-rtTA/+ 및 수컷 또는 암컷TREDT960I/+; +/+.] 모든 한배새끼는 출생 후 1일차 (P1)에서 간호 댐을 통해 2.0g/kb 독시사이클린 (dox) 사료 (Bio-Serv)로 유도되지만, 이중-이식유전자의 동물 만이 돌연변이체 DMPK 이식유전자 (CUG960)를 발현한다. (도 21a 및 도 21b). 이 육종 계획은 dox 처리 이전에 유전형분석을 필요로하지 않고 dox에 의한 조기 유도를 용이하게 한다. TREDT960I 마우스는 생존 가능한 동형접합 이계교배로 유지되고, HSA-rtTA 마우스는 야생형에 교배된 반접합 마우스로 유지된다.
Postscriptr 편집 구성요소의 렌티바이러스 생산. CRISPR-Cas9 렌티바이러스 전달 플라스미드 LentiCRISPR V2는 PspCas13 호환성 가이드-RNA 카세트 및 dPspCas13-NUDT21 융합 단백질을 인코딩하도록 변형된다 (도 21c). 부가적으로, P2A 분열 펩티드를 갖는 mScarlet-i (mSi) 적색 형광 단백질이 dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질의 업스트림에 삽입되어 형질도입된 세포를 동정하는 데 도움이 된다. 렌티바이러스 입자는 모든 세포 유형의 광범위한 형질도입을 허용하는 VSV-G 엔벨롭 단백질을 함유하는 Postscriptr 렌티바이러스 벡터인, psPax2 (패키징 플라스미드) 및 pMD2.G로 일시적으로 형질감염된 낮은 계대 Lenti-X 293T 세포 (Clontech, 632180)를 사용하여 생성된다. Postscriptr 융합 단백질의 강력한 골격근 제한된 발현을 허용하기 위해, 광범위하게 발현하는 EF1 알파 프로모터를 강력한 미니 근육 크레아틴 키나제 프로모터인, CK8e로 대체했다. 가이드-RNA는 CUG960 유도성 DM1 마우스 모델의 골격근에서 Postscriptr 편집 구성요소의 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생성하는데 사용되는 이 벡터 안으로 클로닝된다. 렌티바이러스-함유 상청액은 Lenti-X 농축기를 사용하여 농축되고 COS7 세포의 형질도입 및 % mScarlet-i 발현 세포를 측정하는 FACS 분석을 사용하여 적정된다. 가변성을 제한하기 위해, 실험을 위한 모든 Postscriptr 렌티바이러스 입자는 각 가이드-RNA에 대해 생성되고 -80℃에서 단일 사용 분취량으로 저장된다.
렌티바이러스 전달. P3에서 Postscriptr 렌티바이러스 입자의 1.6e8 TU를 6마리 수컷 및 6마리 암컷 CUG960 마우스와 동일한 수의 수컷 및 암컷 단일 이식유전자의 TREDT960I 대조군 (모두 dox 상)에 대해 표면 측두 정맥을 통해 주입한다. 신생아 마우스에서 형질도입은 근육을 강력하게 형질도입하는 데 필요한 렌티바이러스의 양을 유의하게 감소시킨다. 이들 실험은 비-표적화 가이드-RNA, DMPK 표적화 가이드-RNA 또는 CUG 표적화 가이드-RNA를 함유하는 Postscriptr 렌티바이러스를 사용하여 수행된다. 더 작은 코호트에서, 3마리 수컷 및 3마리 암컷 CUG960 마우스와 렌티바이러스 형질도입을 받지 않는 동일한 수의 수컷 및 암컷 단일 이식유전자의 TREDT960I 대조군 (모두 dox 상)을 생성하여 렌티바이러스 형질도입 또는 비-표적화된 Postscriptr 발현 단독이 DM1 진행에 영향을 미친다는 것을 확인한다.
조직 수확 및 근육 무게. 10주령 (CUG960 발현의 유도 및 Postscriptr 렌티바이러스 전달 10주 후)에서 총 무게를 기록하고 뒷다리 근육 (비복근, 대퇴사두근 및 경골 전방 (TA) 근육)을 수확하고 계량하고, 경골 길이로 정규화한다. mScarlet 이식유전자의 발현으로부터 적색 형광은 해부시 스테레오 형광 해부 범위를 사용하여 모니터링되어 골격근에서 렌티바이러스 형질도입 및 발현을 확인한다. 오른쪽 근육은 PBS 내 4% 포름알데히드에 고정되고 파라핀 조직학에 대한 일상적인 방법을 사용하여 처리된다. 추가 RNA 및 단백질 분석을 위해 왼쪽 근육을 액체 질소에서 빠르게 냉동한다. dox 상의 CUG960 마우스의 뒷다리 근육은 dox 상의 단일 이식유전자의 마우스보다 유의하게 무게가 적다. 효율적인 Postscriptr 편집은 근육 무게를 보존하고 CUG960 근육에서 손실을 방지하고 단일 이식유전자의 마우스 (단지 TREDT960I)에 유의한 영향을 나타내지 않는다.
RNA 단리 및 cDNA의 생성. 액체 질소에서 급속 냉동된 골격근은 Bessman Tissue Pulverizer를 사용하여 분쇄되어 전체 조직 균질물을 얻는다. RNA 단리를 위해, 분쇄된 골격근 균질물을 1ml의 얼음-냉 TRIzol에 첨가하고 2.8mm 세라믹 비드를 사용하여 VWR Beadmill에서 균질화한다. 총 RNA는 이소프로판올 침전에 의해 추출되고 cDNA는 qRT-PCR 또는 3' RACE 용 SuperScriptr III (ThermoFisher)을 사용하여 생성된다.
부위 특이적 분열 및 폴리아데닐화의 효능을 결정하기 위한 3' RACE 및 qRT-PCR. 상기에서 기술된 3' RACE 및 qRT-PCR 전략을 사용하여, CUG960 마우스의 골격근 (비복근)에서 돌연변이체 DMPK 이식유전자의 Postscriptr-매개된 표적화된 분열 및 폴리아데닐화의 효능이 결정된다. 돌연변이체 DMPK 이식유전자 발현은 유전자형에 걸쳐 돌연변이체 DMPK 대립유전자의 적절한 발현을 보장하기 위해 Postscriptr 표적 부위의 프라이머 업스트림을 사용하여 qRT-PCR에 의해 확인된다.
Postscriptr- 편집된 DM1 골격근에서 조직학적 및 세포 리모델링 변화를 평가한다.
dox에 의한 유도-후 10주에, CUG960 마우스는 중앙집중된 핵 및 감소된 근섬유 단면적을 함유한다. 근육에서 Postscriptr 편집의 효능은 이들 매개변수를 사용하여 결정된다.
조직학적 분석, 근섬유 단면적 및 중앙집중된 핵. 적어도 3가지 다른 마우스의 비복근 근육의 횡단 조직학적 섹션의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색이 수행된다. 뒷다리 근육에서 중앙집중된 핵과 근섬유의 비율을 비교하는 정량적 비교 및 통계적 분석이 수행된다. 각 유전자형의 3개의 다른 마우스에서 적어도 3개의 다른 단면 수준이 비교된다. 덜 심각한 표현형을 나타내는 Postscriptr 처리된 CUG960 마우스는 중앙집중된 핵을 가진 근섬유의 감소된 비율 및 보존된 근섬유 단면적을 가진다 (ImageJ를 사용하여 정량화됨).
Postscriptr 융합 단백질의 생체내 전달 및 발현. dPspCas13b-NUDT21 융합 단백질을 발현하는 근섬유 및 핵 국재화의 백분율은 섹션에서 면역조직화학을 사용한 항-FLAG 항체를 사용하여 정량화된다. 부가적으로, 근육내 개별 근섬유 (중앙집중된 핵 % 및 단면적)에 대한 Postscriptr 편집의 효과는 동일한 근육 내에서 근섬유를 발현하는 비-Postscriptr와 비교된다.
RNA-시퀀싱을 사용하여 편집된 근육에서 교정된 DM1-관련 RNA 스플라이싱 결함 정량화.
불분명한 이유 때문에, 마우스 DM1 모델에서 미스플라이싱의 효과는 모델에 따라 유의하게 다르다. 이는 돌연변이체 이식유전자의 상대적 발현, CUG 반복의 특성 (중단 대 모든 동시) 또는 CUG 확장의 크기에 기인할 수 있다. 이들 연구에 사용된 유도성 DM1 마우스 모델은 다른 모델에 비해 광범위하지만 경미한 스플라이싱 이상이 있는 것으로 보고되었다.
RT-PCR에 의한 대안적 스플라이싱의 검출. 대안적 스플라이싱의 상대적 백분율은 이중-이식유전자의 CUG960 마우스 (수컷 및 암컷, 유전자형 당 적어도 3개)로부터 Postscriptr 처리된 비복근 근육 대 비-처리된 비복근 근육에서 RT-PCR을 사용하여 결정된다. 이들 유전자는 Atp2a1 엑손 22, Bin1 엑손 11 및 Cacna1s 엑손 29를 포함하며, 이는 이들 마우스에서 동정된 가장 강력한 스플라이스 이벤트 중 하나였다. 상대적 이소폼 스플라이싱의 정량화는 BioRAD ChemiDocMP를 사용하여 측정되고, 스플라이스 이벤트의 Postscriptr 의존성 구제는 음성 대조군 가이드-RNA로 처리된 마우스에 비교하여 측정된다.
표적화된 RNA 시퀀싱. 추가로, 대안적 스플라이싱에서 글로벌 변화에 대한 Postscriptr 편집의 효과는 36개 DM1-특이적 스플라이싱 이벤트를 조사하기 위해 표적화된 RNA 시퀀싱을 수행함에 의해 비교된다. 간단히 말해서, 다중 RT-PCR은 각 샘플 상에 바 코드 및 시퀀싱 어댑터를 포함하여 수행되며, 이는 풀링되고 시퀀싱되고 (Illumina) 분석되어 각 샘플에서 각 대안적 엑손에 대한 분획적 함입을 결정한다. 결과는 재현성이 높고 (대부분의 스플라이스 이벤트에 대해 실행 간에 r2> 0,98), 겔 분석에서 보이는 바닥- 및 천장-효과를 회피한다.
근육 강도의 Postscriptr 의존성 구제를 위한 골격근의 생리학적 시험을 수행한다.
근육 기능은 잘-확립된 생리학적 방법을 사용하여 직접적으로 평가되어 Postscriptr 편집이 운동 성능과 근육 기능을 유의하게 향상시키는지 여부를 결정한다. 이들 연구는 DM1 증상 완화에 가장 효과적인 Postscriptr 가이드-RNA와 비-표적화 가이드를 사용하여 수행된다.
Postscriptr 구제된 CUG 960 마우스의 운동 성능. Postscriptr 구제된 CUG960 마우스에서 운동 성능과 간접적으로 골격근 기능을 측정하기 위해, 가이드-RNA를 인코딩하는 Postscriptr 렌티바이러스 벡터 (상기 기술된 육종 및 렌티바이러스 표적화 및 전달 체계를 사용한, 표적화 또는 비-표적화)로 형질도입된 9마리 CUG960 이중-이식유전자 및 단일 이식유전자의 마우스를 러닝 프로토콜에 따라 유도-후 10주령에서 트레이드밀 (Exer-6M, Columbus Instruments, 10% 경사) 상에서 강제된 러닝으로 기진맥진시킨다. CUG960 마우스에서 10주령에 관찰된 영양장애-유사 표현형에 기반하여, CUG960 마우스는 총 거리 달리기로 측정된, 운동 성능에서 심각한 결함을 보인다. Postscriptr 표적화 DMPK로 처리된 마우스는 비-표적화된 대조군에 비해 총 거리 달리기를 유의하게 증가시킨다.
골격근 수축 검정. 근육 강도 및 피로도는 비-표적 또는 DMPK 가이드-RNA (그룹당 4마리 마우스)를 사용하여 Postscriptr로 편집된 10-주령 CUG960 마우스에서 평가된다. 절제된 빠른-경련 장지신근 (EDL) 및 느린-경련 가자미근 (Sol) 근육은 300C-LR 이중 모드 힘 변환기와 701C 자극기가 장착된 ASI 근육 수축 시스템 (Aurora Scientific, 캐나다 온타리오주 아우로라 소재)을 사용하여 분석된다. 근육은 산소화된 링거 용액 (25℃)에서 수평으로 침지되고 2개의 백금 전극을 사용하여 0.2ms 사각 파 펄스로 근육을 자극한다. 특정 힘 (kN/㎡)은 섬유 길이, 근육 질량 및 최대 등척성 파상풍 힘을 기반으로 계산된다. 수축 특성의 분석에 이어, 피로 프로토콜은 EDL 및 Sol 근육 둘 모두를 사용하여 시작된다. 프로토콜은 최대 등척성 파상풍 힘을 제공하기 위해 미리 결정된 주파수, 전압 및 근육 길이로 전달되는 0.2ms 사각 펄스의 200ms 자극 트레인으로 구성된다. 자극 트레인은 0, 1, 2, 5, 15 및 30분 동안 0.1-0.2Hz로 전달된다. 피로에서 회복하는 근육의 능력은 피로 프로토콜에 따라 1시간 동안 5분마다 200ms 자극 트레인의 전달에 의해 결정된다. Postscriptr 편집된 근육의 근육 이완 속도는 야생형 한배새끼보다 크고 CUG960 마우스는 근육 수축의 속도가 감소했다. 강력한 Postscriptr 발현을 보여주는 골격근은 mScarlet 형광을 사용하여 확인 및 비교된다.
DMSXL 또는 HSALR 이식유전자주와 같은 DM1의 다른 잘-확립된 마우스 모델이 또한 이용된다. DMSXL 이식유전자의 마우스는 전체 인간 DMPK 유전자, 1,200 CTG 반복 및 >10kb의 측접하는 서열을 함유하는 DM1 환자로부터 단리된 코스미드 단편을 운반한다. 긴 반복 확장에도 불구하고, 골격근에서 DMPK 이식유전자 발현이 내인성 Dmpk보다 ~4-배 낮기 때문에 이들 동물은 강력한 근육 표현형을 나타내지 않는다. 이 모델은 생체내 RNA 초점 형성의 Postscriptr 예방 또는 인간 DMPK mRNA의 핵세포질 셔틀링의 구제를 결정하는 데 유용하다. HSALR 마우스는 엄정한 근육 표현형을 가지고 있지만 인간 골격 작용 (HSA)을 인코딩하는 게놈 단편의 3' UTR에서 250개 CUG 반복을 수반하며, 이는 가이드-RNA 표적화 전략이 인간 환자에게 직접적으로 번역 가능하지 않게 한다. 그러나, 이 마우스 모델은 CUG 반복을 직접적으로 표적화하거나 HSA mRNA를 표적화하는 가이드-RNA를 사용하여 가이드-RNA를 시험하는 데 매우-적합하다.
DM1에서의 표현형 엄격함에서 성별 특이적 차이. 분자적 근거는 아직 파악하기 어렵지만, DM1에 대한 표현형 엄격함에서의 분명한 성별-특이적 차이가 관찰되었다. 구체적으로, 남성 DM1 환자는 인지 장애, 근력 약화, 근긴장, 호흡기 및 심장 전도 결함을 포함한 고전적인 DM1 증상을 나타낼 가능성이 더 높고, 여성 환자는 백내장, 비만 및 갑상선 관련을 포함한, 비-근육 조직과 관련된 증상을 보일 가능성이 더 높다. DM1에서 성별-특이적 차이의 중요성을 감안할 때 두 성별 모두 마우스 연구를 조사한다.
통계적 분석. 단일 치료를 비교하기 위해 스튜던트 t-테스트가 적용된다. 다중 생리적 및 생화학적 검정은 원-웨이 또는 반복된 측정 ANOVA를 사용하여 분석된다.
요약하면, Postscriptr RNA 편집의 개발은 DM1 또는 기타 독성 기능-획득 RNA 질환의 맥락에서 질환 결과의 예방을 위한 신규한 접근 방식을 제공하는 전사-후로 포유류 3' 말단 처리를 조작하는 가능성을 제공했다. 본 명세서에 제시된 데이터는 Postscriptr가 내인성 인간 DMPK 트랜스크립트의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다. 이 접근법은 DMPK의 Postscriptr 표적화가 DM1의 마우스 모델에서 DM1-관련 세포독성 및 골격근 기능 및 질환 병인을 구제할 수 있는지를 결정하는데 사용된다. Postscriptr의 프로그래밍 가능한 본질은 이 접근법이 근육긴장퇴행위축 유형 2 (DM2), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병-유사 2 (HDL2), 척수소뇌성 실조증 8, 31 및 10 (SCA8, -31, -10) 및 취약한 X-관련 떨림 운동실조 증후군 (FXTAS)을 포함한 다른 독성 RNA 반복 질환을 치료하는데 쉽게 각색되도록 허용한다.
실시예 6: CRISPR-Cas13에 의한 독성 핵 RNA 초점 표적화
본 명세서에 제시된 데이터는 강력한 비-고전적 핵 국재화 신호를 갖는 RNA-결합 CRISPR-Cas13이, 본 명세서에서 각각 hilightR 및 eraseR로 지칭되는 접근법인, 시각화 또는 분열을 위해 독성 핵 RNA 초점에 효율적으로 표적화될 수 있음을 입증한다. HilightR은 촉매적으로 죽은 Cas13b (dCas13)를 형광 단백질과 조합하여 살아 있는 세포의 핵에서 CUG 반복 RNA 초점을 직접적으로 시각화하여, 초점 수의 정량화 및 초점 역학의 관찰을 가능하게 한다. EraseR은 핵 초점을 파괴하기 위해 핵 CUG 반복 RNA를 표적화하는 Cas13b의 고유한 엔도리보뉴클레아제 활성을 이용한다. 이들 연구는 근육긴장퇴행위축 유형 1의 식별 또는 치료를 위해 CRISPR-Cas13으로 독성 핵 RNA 초점을 직접적으로 표적화하는 잠재력을 입증한다. CRISPR-Cas13 시스템의 효율적이고 서열 프로그래밍 가능한 본성은 게놈 편집의 관련된 위험 없이 다른 인간 핵 RNA 장애의 신속한 표적화 및 조작을 허용한다.
박테리아 유래된 CRISPR-Cas13 시스템은 RNA에 특이적으로 결합하고 엔도리보뉴클레아제로 기능하여 RNA를 분열하여, DNA-결합 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제와 관련된 생식계열 편집의 위험을 우회한다. Cas13의 두 뉴클레아제 도메인 내의 단일 잔기 돌연변이는 촉매적으로 비활성화된 효소 (dCas13)를 생성하며, 이는 효율적인 표적화를 위한 PAM 서열에 대한 요구사항 없이 포유류 시스템에서 프로그래밍 가능한 RNA 결합 친화성을 보유한다. 그 큰 크기 및 고유한 국재화 신호의 결여 때문에, Cas9 및 Cas13 융합 단백질 둘 모두는 포유류 핵에 비효율적으로 국재화된다. RNA의 표적화된 분열 및 폴리아데닐화를 유도하기 위한 CRISPR-Cas13의 신규한 적응을 기술하는 본 발명자들의 최근 사전-인쇄 원고에서, Cas13의 강력한 핵 국재화를 촉진하는 효모 Ty1 레트로트랜스포존에서 유래된 비-고전적인 핵 국재화 신호 (NLS)가 동정되었다. Ty1 NLS의 강력한 활성은 CRISPR-Cas13으로 시각화 및 분열 둘 모두를 위해 핵 RNA의 효율적인 표적화가 달성될 수 있음을 시사했다.
독성 RNA 초점은 DM1의 세포 특징이다. CRISPR-Cas13을 사용하여 핵 RNA를 시각화하기 위해, 프리보텔라 sp. P5-125로부터 촉매적으로 죽은 유형 VI-B Cas13b 효소 (dPspCas13b)를 C-말단 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 또는 적색 형광 단백질인, mCherry와 조합한 융합 단백질이 설계되었다 (도 22a). 3x FLAG 에피토프 태그 (F) 및 Ty1 핵 국재화 서열 (Ty1 NLS)은 효율적인 핵 국재화를 촉진하기 위해 dPspCas13b 융합 단백질의 N-말단에 추가되었으며, 이하에서는 hilightR 녹색 또는 hilightR 적색으로 지칭된다 (도 22a). 독성 RNA 초점은 DM1의 세포 특징이고 확장된 CUG 반복을 발현하는 이식유전자의 발현에 의해 많은 세포 유형에서 유도될 수 있다. DM1 환자에서 발견되는 핵 RNA 초점을 모방하기 위해, 인간 DMPK 3' UTR (DT960)에서 960개 CUG 반복을 함유하는 벡터를 이용했다 (도 22b)23. DT960 작제물은 세포에서 RNA 초점 형성을 재현하기에 충분하고 안티센스 (CAG) 반복 프로브를 사용하거나 mCherry-MBNL1 융합 단백질로 형광 제자리 혼성화 (FISH)에 의해 검출 될 수 있다 (도 26a 및 도 26b). hilightR 융합 단백질을 CUG 반복에 표적화하기 위해, 안티센스 CAG 반복 표적 서열 (CAGx9)을 함유하는 PspCas13b-호환성 crRNA가 설계되었으며, 이는 9개 CUG 반복과 혼성화할 것으로 예측된다 (도 22c). CAGx9 반복 crRNA에 의해 가이드되는, hilightR 녹색 및 적색은 완전히 핵 국재화되었고 DT960 벡터에 의해 생성된 핵 RNA 초점이 강조되었다 (도 22d 및 도 25). 대조적으로, 비-표적화 crRNA와 hilightR 작제물의 공-발현은 광범위하고 비-국재화된 핵 형광을 초래했다 (도 22d 및 도 25c).
hilightR 녹색으로 표지된 핵 초점은 FISH를 사용하여 검출된, Alexa Fluor 488-접합된 CAG 올리고뉴클레오티드 프로브 (AF488-CAGx7)와 공-국재화했다 (도 23a). 이전 보고와 일치하여, hilightR 녹색으로 표지된 핵 초점은 mCherry-MBNL1 융합 단백질을 사용하여 검출된, MBNL1 단백질과 공-국재화했고, SC-35에 특이적인 항체로 검출된, 스플라이싱 반점과 부분적으로 공-국재화했다 (도 23b 및 도 26). 이들 결과는 hilightR이 CUGexp RNA 초점을 정확하게 감지한다는 것을 입증한다.
CUGexp RNA 초점은 그 고유한 엔도리보뉴클레아제 활성을 사용하여 독성 CUGexp RNA의 표적화된 분열에 유용할 수 있다는 것을 시사했다. Cas13은 포유류 및 식물 세포에서 mRNA 트랜스크립트의 특정한 분열에 유용한 것으로 나타났다. Cas13 엔도리보뉴클레아제 활성이 CUGexp RNA 초점을 분열하기에 충분한지를 결정하기 위해, hilightR 녹색 융합 단백질이 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 PspCas13b의 촉매적 돌연변이를 재활성화함에 의해 변형되었다. 놀랍게도 활성화된 hilightR 녹색은 비-표적화 가이드-RNA에 비해 CAGx9 표적화 crRNA를 사용하여 RNA 초점의 수를 유의하게 감소시키지 않았다. 그러나, N-말단 Ty1 NLS를 함유하지만 C-말단 eGFP (본 명세서에서 eraseR로 지칭됨)가 없는 활성화된 PspCas13b는 mCherry-MNBL1 융합 단백질을 사용하여 정량화된 RNA 초점의 수와 강도에서 유의한 감소를 초래했다 (도 24a 및 24b). 표적 부위 측접하는 서열이 Cas13 뉴클레아제 활성화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, CAGx9 crRNA는 두 상이한 판독 프레임 (CAGx9-f2 및 CAGx9-f3)에서 시험되었다. 3개 CAGx9 crRNA 모두에 의해 가이드된 EraseR은 비-표적화 crRNA와 비교하여 세포당 RNA 초점의 수와 강도에서 유의한 감소를 초래했다 (도 24a 및 24b). 부가적으로, N-말단 Ty1 NLS를 함유하고 C-말단 eGFP를 결하는 촉매적으로 죽은 PspCas13b는 mCherry-MNBL1 융합 단백질을 사용하여 정량화된 RNA 초점의 수와 강도를 유의하게 감소시키지 않았다 (도 27). 이들 데이트는 CRISPR-Cas13이 CUGexp RNA 초점을 분해하기에 충분하다는 것을 처음으로 입증한다.
현재 근육긴장 퇴행위축 또는 기타 인간 RNA 반복 확장 장애에 대한 이용 가능한 치료법은 없지만, RNA-표적화 CRISPR-Cas 시스템의 급속한 진행은 DM1을 치료하기 위한 표적화된 접근법이 곧 달성될 수 있다는 희망을 제공한다. ASO는 스플라이싱 인자와 독성 RNA 초점 간의 결합을 방해하는데 매우 효율적이지만, 이러한 접근법은 현재로는 부적절한 전달 방법에 의해 제한된다. 부가적으로, DMPK 또는 MBNL 발현을 복원하기 위한 유전자 치료 접근법은 CUGexp RNA의 결과로 발생하는 기능 결손의 우세한 세포독성 이득을 구제하기에 불충분하다. 따라서, CUG RNA의 표적 파괴는 RNA 유발 질환을 감소시키거나 예방하기 위한 유망한 전략이다. 강력한 비-고전적인 Ty1 NLS에 의해 국재화된 CRISPR-Cas13이 시각화 및 표적 분해 둘 모두를 위해 CUGexp RNA 초점을 효율적으로 표적화하는데 사용될 수 있음이 본 명세서에서 입증된다. Ty1 NLS는 게놈 복제를 위해 핵에 프로바이러스 DNA 사본의 통합이 이어지는 세포질에서 RNA 중간체의 역전사를 사용한, 효모 LTR-레트로트랜스포존에서 유래된다. 세포 분열 동안 개방 유사분열을 겪는 고등 진핵생물과 반대로, 효모는 폐쇄 유사분열을 겪고 그 동안 핵 엔벨롭은 손상되지 않는다. Ty1 생물발생 동안, 레트로트랜스포존 게놈 복합체의 핵 유입은 활성 핵 유입을 필요로하고 따라서 레트로트랜스포지션에 필요한 강력한 NLS를 함유한다. 흥미롭게도, 핵 엔벨롭을 보유하는 활발하지 않은 포유류 세포에서 Ty1 NLS는 Cas 단백질에 의한 핵 RNA의 효율적인 표적화를 위해 유사하게 필요할 수 있다.
CRISPR-Cas13의 프로그래밍 가능한 본질은 crRNA 표적 서열의 간단한 변형을 통해 hilightR 및 eraseR을 다른 핵 RNA의 연구 및 분열 또는 기타 반복 확장 장애 예컨대 근육긴장퇴행위축 유형 2 (DM2), 근위축성 측면 경화증 (ALS), 헌팅턴병-유사 2 (HDL2), 척수소뇌성 실조증 8, 31 및 10 (SCA8, -31, -10) 및 취약한 X-관련 떨림 운동실조 증후군 (FXTAS)에 쉽게 각색되도록 허용한다. 짧은 탠덤 반복 서열을 직접 표적화하는 다른 시스템 (ASO 또는 CRISPR-Cas)과 마찬가지로, 비-병원성 짧은 반복 모티프를 함유하는 다른 인간 mRNA 트랜스크립트의 표적을 벗어난 분열 가능성이 남아 있다. 대안적으로, 분해를 위해 또는 CRISPR-Cas13 융합 단백질로 초위성체 RNA의 다른 형태의 RNA 조작에 의해 고유한 DMPK 서열을 표적화하는 것은 독성 RNA 질환의 치료를 위한 추가 접근법을 제공할 수 있다.
이제 재료와 방법이 기술된다.
합성 DNA 및 클로닝
dPspCas13b에 융합된 N-말단 3xFLAG 및 Ty1 NLS를 함유하는 포유류 발현 벡터는 C-말단 강화 녹색 형광 단백질 (eGFP) 또는 mCherry 적색 형광 단백질을 인코딩하도록 변형되었다. 모든 crRNA는 길이가 30개 뉴클레오티드로 되고 pC00043에서 hU6 프로모터로부터 효율적인 전사를 위해 5' G로 시작하도록 설계되었다. 음성 대조군 비-표적화 crRNA는 이전에 기술되었다. mCherry-MBNL 발현 플라스미드를 생성하기 위해, 인간 MBNL1의 코딩 서열을 설계하고 어셈블리를 위해 gBlock (IDT, Integrated DNA Technologies)으로 합성하고 CS2mCherry 포유류 발현 플라스미드 안으로 클로닝했다.
세포 배양 및 면역조직화학
COS7 세포주는 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 DMEM에서 유지되었다. 세포를 6-웰 플레이트에서 유리 커버슬립 상에 씨딩하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Fugene6 (Promega)을 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 일시적으로 형질감염된 COS7 세포를 DPBS에서 4% 포름알데히드에 15분 동안 고정하고 3% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 차단하고 1% BSA에서 1차 항체와 함께 실온에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 사용된 1차 항체는 1:1000에서의 항-FLAG (Sigma, F1864) 및 1:1000에서의 항-SC-35 (Abcam, ab11826)였다. 이어서 세포를 실온에서 30분 동안 1% BSA에서 Alexa Fluor 488 또는 594 접합된 2차 항체 (Thermofisher)와 함께 인큐베이션했다. 커버슬립은 DAPI (Vector Biolabs, H-1200)를 함유하는 항-페이드 형광 장착 배지를 사용하여 장착하고 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했다.
형광 제자리 혼성화 (FISH)
형질감염-후, 세포를 얼음 냉각 100% 메탄올에 -20℃에서 10분 동안 고정한 다음 DPBS로 2회, 세정 완충액 [2X SSC pH 7.0, 10% 포름아미드]로 1회 세정했다. 이어서 세포를 100nM의 최종 프로브 농도로 혼성화 완충액 [10% 덱스트란 설페이트, 2X SSC pH7.0, 10% 포름아미드]에서 프로브와 혼성화했다. 세포를 37℃에서 밤새 혼성화했다. 그런 다음 세포를 37℃에서 30분 동안 세정 완충액에서 1회 세정한 다음 슬라이드 상에 DAPI (Vector Biolabs)를 갖는 VectaShield로 장착하고 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했다. 프로브는 5' Alexa Fluor 488 염료와 접합되고 HPLC (IDT, Integrated DNA Technologies)를 사용하여 정제된 21-mer DNA 올리고뉴클레오티드 (CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG (서열번호: 762))였다.
실시예 7: 이레이저 (eraser)로 CUGexp RNA의 표적화된 분해
근육긴장퇴행위축 유형 1 (DM1)은 8,000명 중 1명의 개체에서 발생하는 유전된 다중-시스템, 점진적으로 쇠약해지는 질환이고, 특정 모집단에서 500명 중 1명 정도로 높은 발병률로 심장 합병증이 DM1 환자의 ~ 80%에서 전개하고 주요 사망의 원인이다. DM1은 인간 디스트로피아 미요토니카 프로테인 키나제 (DMPK) 유전자의 비코딩 3' 비번역 영역에서 CUG 트리뉴클레오티드 반복의 확장 및 발현에서 발생한다 (도 29). ~50 초과 CUG 반복을 갖는 돌연변이체 DMPK mRNA는 독성 핵 RNA 초점을 형성하며, 이는 정상적인 DMPK 발현을 방지하고, RNA 결합 단백질의 머슬블라인드-유사 (MBNL) 패밀리의 구성원을 격리함에 의해 대안적 스플라이싱에서 광범위한 결함을 유도한다 (도 29). DM1 병인의 기초가 되는 다수의 파괴된 근육 유전자로 인해, 환자는 종종 심방 및 심실 부정맥, 확장된 심근병증 및 심근 섬유증을 포함한 다양한 임상적 심장 표현형을 나타낸다. 현재 DM1을 치료하기 위한 승인된 치료법은 없고, 안티-센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용하여 반복 초점을 표적화하는 이전 접근법은 성인 인간 심장 및 골격근에 대한 비효율적인 전달로 인해 여전히 도전적이다.
RNA 결합 CRISPR-Cas13은, 강력한 비-고전적인 핵 국재화 신호로 국재화될 때 세포에서 독성 핵 RNA 초점을 시각화하고 분해하는데 사용될 수 있다는 실시예 6에서 입증된 바와 같이, 도구는 hilightR 및 eraseR로 명명되었다 (도 29). CRISPR-Cas 기술은 전통적인 유전자 치료 대체 전략을 사용하여 교정할 수 없는, 인간 RNA 질환의 치료를 위해 표적화된 치료제를 개발할 수 있다는 희망을 제공한다. 그러나, 독성 RNA 초점의 분해가 심장에서 DM1 병인을 예방하기에 충분한지 또는 DM1-관련 세포 및 전기적 리모델링이 가역적인지 여부는 여전히 불분명하다. DM1의 마우스 심장 모델에서 eraseR로 독성 RNA 초점의 표적화된 분해는 정상적인 RNA 스플라이싱을 복원함에 의해 심장 유전자 발현 및 펌프 기능을 개선한다 (도 29). 본 명세서에 기술된 바와 같이, eraseR은 생체내 CUGexp RNA를 파괴하기 위한 효율적이고 특정한 도구로서 개발되고 DM1의 마우스 심장 모델에서 eraseR을 사용하여 치료 결과를 결정한다.
독성 핵 초점은 Cas13에 의해 표적화될 수 있다
CRISPR-Cas13 시스템은 RNA에만 결합하고 특정 엔도리보뉴클레아제로 기능하여 표적 RNA를 분열하여, DNA-결합 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제와 관련된 생식계열 편집의 위험을 우회한다. 그러나, 그 크기가 크고 고유한 국재화 신호가 없기 때문에, Cas13 융합 단백질은 포유류 핵에 비효율적으로 국재화된다. 본 발명자들은 최근 Cas13의 강력한 핵 국재화를 촉진하는 효모 Ty1 레트로트랜스포존에서 유래된 비-고전적인 핵 국재화 신호 (NLS)를 확인했다. Ty1 NLS의 강력한 활성은 CRISPR-Cas13을 사용하여 시각화 또는 분열을 위해 핵 RNA의 효율적인 표적화가 달성될 수 있음을 시사했다.
핵 반복 RNA가 살아 있는 세포에서 시각화될 수 있는지 결정하기 위해, C-말단 강화 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 갖는 프리보텔라 sp. P5-125로부터 촉매적으로 죽은 유형 VI-B Cas13b 효소 (dPspCas13b)를 사용하여 융합 단백질을 설계했다 (도 22a). DM1 환자에서 발견되는 핵 RNA 초점을 모방하기 위해, 인간 DMPK 3' UTR (DT960)에서 960개 CUG 반복을 함유하는 벡터의 일시적 발현이 사용되었다 (도 22b). dPspCas13b-eGFP 융합 단백질을 CUG 반복에 표적화하기 위해, CAG 반복 표적 서열을 함유하는 PspCas13b 호환성 crRNA가 설계되었으며, 이는 9개 CUG 반복과 혼성화할 것으로 예측된다 (도 22c). CAG 반복 crRNA에 의해 가이드된, dPspCas13b-eGFP의 공-형질감염은 완전히 핵 국재화되었고 DT960의 발현에서 특이적으로 생성된 핵 RNA 초점이 강조되었다 (도 22d). 대조적으로, 비-표적화 crRNA와의 공-발현은 광범위하고 비-국재화된 핵 형광을 초래했다 (도 22d). Cas13의 CUG RNA 초점에 대한 효율적인 핵 표적화는 고유한 엔도리보뉴클레아제 활성을 사용하여 CUGexp RNA의 표적화된 분열에 유용한 도구가 될 수 있음을 시사했다.
EraseR 은 시험관에서 독성 RNA 초점을 분해할 수 있다
Ty1 NLS를 함유하는 활성화된 PspCas13b는, mCherry-MNBL1을 사용하여 검출된 바와 같이, RNA 초점의 수 및 강도에서 유의한 감소를 초래했다 (도 24a 및 24b). 주변 표적 서열이 Cas13 뉴클레아제 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, crRNA는 3가지 판독 프레임 모두에서 시험되었고 모든 CAGx9 crRNA는 세포당 RNA 초점의 수에서 유의한 감소를 초래했다 (도 24). 이들 데이터는 eraseR이 시험관내 인간 DMPK 유전자에서 CUGexp에 의해 유도된 독성 RNA 초점을 효율적으로 감소시킨다는 것을 보여준다.
이들 연구는 CRISPR-Cas13이 CUGexp RNA를 표적화하고 분해하기에 충분하다는 것을 처음으로 입증했으며, 이는 DM1 치료를 위한 신규한 치료적 접근법의 개발을 향한 명확한 경로를 제공한다. 추가의 연구는 DM1의 심장 인간화된 마우스 모델에서 독성 RNA 초점의 eraseR 분열 및 효능을 증진시키는 매개변수를 결정하기 위해 엄격하게 설계되고 제어된다. 중요하기로는, 본 명세서에서 개발되고 시험된 도구는 인간 DM1 환자에게 전달될 수 있는 도구와 동일하다.
eraseR 로 CUG exp RNA의 표적화된 분해
다수의 변수가 CRISPR-Cas13 엔도리보뉴클레아제 활성화의 분열 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 궁극적으로 DM1을 치료하기 위한 eraseR의 분열의 효율 및 치료적 잠재력을 강조할 것이다. 본 명세서에 제시된 데이터는 eraseR이 이미 RNA 초점을 유의하게 분해할 수 있음을 보여주었지만, 분열 효율이 Cas13 단백질, crRNA 가이드 및/또는 표적 서열에 대한 변형에 의해 추가로 증진될 수 있는지는 여부가 본 명세서에서 결정된다. 세포에서 RNA 초점의 감소는 형광 제자리 혼성화 (FISH), mCherry-태그된 MBNL1을 사용한 형광 및 DT960 트랜스크립트에 특이적인 프라이머를 사용한 정량적 실시간-PCR을 사용하여 분석된다.
다른 Cas13 패밀리 구성원. EraseR은 이전에 RNA 염기 편집을 위한 가장 강력한 Cas13 구성원인 것으로 나타난, 프리보텔라 sp. P5-125로부터의 Cas13b (PspCas13b)를 이용한다. 그러나, Cas13 시스템은 4개 주요 패밀리 (Cas13A-D)로 구성되며, 이는 CUGexp RNA 초점을 분해하기 위해 다른 분열 활성을 제공할 수 있다. 따라서, 대표적인 Cas13 단백질은 N 말단 Ty1 NLS 융합으로 CSX 발현 벡터 안으로 클로닝되고 그의 상대적 분열 효율은 PspCas13b와 비교하여 결정된다.
가이드 RNA 길이. 모든 자연적으로 발생하는 Cas13 CRISPR 어레이는 RNA 표적 서열의 크기에 상응하는 스페이서 길이와 함께, 특정 스페이서 및 직접 반복 길이를 갖는다. PspCas13으로의 초기 연구는 내인성 스페이서 크기와 일치하는 30개 뉴클레오티드의 스페이서 길이를 이용했다. 그러나, 스페이서 길이는 표적 서열 인식, 분열 활성화 또는 탠덤 반복 서열 상으로 Cas13 효소의 패킹에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 길이가 더 짧은 (25nt), 및 더 긴 (35, 40, 45, 50, 55 및 60nt) crRNA를 시험함에 의해 스페이서 길이가 초점의 분해에 영향을 미치는지 여부가 시험된다.
액세서리 단백질에 의한 CRISPR 분열 활성에 의한 활성화. 일부 CRISPR-Cas13 패밀리는 더 작은 CRISPR 관련된 단백질로 클러스터링되어, 분열 효율을 억제하거나 증진시키는 역할을 한다. 이전에 Cas13b 분열 활성을 증진시키는 것으로 나타났던 Csx28의 공-발현이 본 발명자들의 세포 기반 검정을 사용하여 RNA 초점의 분해를 증진시키는지 결정된다.
eraseR 에 의한 RNA 초점의 감소가 생체내에서 DM1 심혈관 표현형을 개선하는지 여부의 결정.
960개 CUG 반복 (CUG960)을 갖는 인간 DMPK 유전자를 인코딩하는 Tet 유도성 이식유전자를 갖는 심장 DM1 마우스 모델이 사용되고 심장 특이적 tTA 이식유전자 (Myh6-tTA)를 사용하여 유도된다 (도 30). 이 구조의 발현은 이전에 MBNL-관련 RNA 초점 형성, 스플라이싱 결함 및, 확장된 심근병증, 부정맥 및 수축 결함을 포함한 심장 기능장애를 유도하는 것으로 나타났다. 간단히 말해서, CUG960 동형접합 마우스를 반접합 tTA 마우스와 교배하여 이중-이식유전자의 자손 (CUG960 및 Myh6-tTA) 및 단일 이식유전자 (CUG960) 대조군을 생성한다 (도 30a 및 도 30b).
마우스에서 AAV9 바이러스를 사용한 심근세포-특이적 유전자 전달. AAV9 혈청형 바이러스는 심장에서 유전자의 전달 및 발현을 위한 유망한 치료적 벡터이다. EraseR 및 가이드-RNA 발현 카세트는 AAV9 바이러스 패키징 플라스미드 안으로 서브클로닝되고 고역가 바이러스가 생성된다 (도 30c). 이들 연구를 위해, PspCas13b 및 CAGx9 가이드 RNA를 사용하는 eraseR이 사용된다. 심근세포-특이적 발현 (pAAV:cTNT::루시퍼라제)을 위해 치킨 심장 트로포닌 T 프로모터 (cTnT)에 의해 구동되는 루시페라제를 인코딩하는 AAV9 바이러스는 출생 후 10일차 (P10) 신생아에서 복강내로 주사했을 때 강력한 심장 특이적 발현을 나타냈고 10주 후 150μg/g 루시페린을 사용하여 시각화했다 (도 30d). P10에서, 3.75e11 gc/ml의 AAV가 6마리 수컷 및 6마리 암컷 CUG960:tTA 이중-이식유전자의 마우스, 및 동일한 수의 수컷 및 암컷 단일 이식유전자의 대조군에 표면 측두 정맥을 통해 주입된다. 측정 (아래 참고)은 주사 후 12주에서 이루어진다. EraseR 처리된 마우스는 향상된 심장 기능을 보여준다 (도 30e).
eraseR 치료가 심초음파 및 심전도에 의해 심장 기능을 개선하는지 여부 결정. 일련의 심장초음파는 SIG Visual Sonics Vevo 2100을 사용하여 2-차원 심장초음파에 의해 AAV-매개된 eraseR 주입에 이어 12주에서 수행된다. 심박수 (HR), 구획 단축율 (FS) 및 박출계수 (EF), 좌심실 치수의 측정이 기록되고 비교된다. 구획 단축율 (%FS)은 손상된 심장 기능을 나타내는데 사용되며 40% 아래의 %FS는 심근병증을 나타내는데 사용된다. 마취된 마우스에 대한 ECG 측정은 AdInstruments BioAmp ECG 장치를 사용하여 측정된다. ECG 기록은 각 동물에 대해 10분 동안 캡처되고 LabChart7 소프트웨어를 사용하여 분석된다. PR 및 QRS 간격의 길이는 DM1에서 연장되므로 특별한 주의를 기울인다.
eraseR- 처리된 DM1 심장에서 심장 조직학 및 RNA 초점의 평가. 심장초음파 및 ECG 측정에 이어서, 파라핀 포매에 의한 조직학적 분석을 위해 심장을 수집한다. H&E 염색은 총 해부구조와 심근 세포 형태에서 임의의 차이를 시각화하는데 사용된다. 심장 성장의 변화를 동정하기 위해, 형태 측정은 심장 무게 대 체중, 심장 무게 대 경골 길이, 좌심실 후벽 두께 및 심실 중격 두께를 포함한다. 12주령에서 비-침습적 심장 모니터링 실험이 수행된 후, 마우스 절반으로부터의 심장을 조직학을 위해 수확하고 심장 절반은 CUG960 이식유전자의 녹다운을 결정하고 스플라이싱의 구제를 위해 qRT-PCR을 사용하여 분석한다. 핵 초점은 5' Alexa Fluor 488 염료와 접합된 21-mer 올리고뉴클레오티드를 사용한 FISH에 의해 12주에 검사된다. 핵은 DAPI로 대조염색된다. EraseR 처리된 마우스는 유의하게 감소된 핵 초점 및 감소된 독성 RNA 수준을 가진다.
DM1에 대해 개발된 모델은 그 표현형의 심각도에서 광범위하게 다를 수 있으며 성별 특이적 차이는 심장 표현형 및 심장 전기생리학의 결과를 방해할 수 있다. 남성 DM1 환자는 여성 환자보다 DM1 증상을 나타낼 가능성이 더 높고 심장 전도 결함을 전개할 위험이 더 높다. 성별 특이적 차이의 중요성을 감안하여, 두 성별 모두 검사된다.
통계적 방법. 단일 치료를 비교하기 위해 스튜던트 t-테스트가 적용된다. 다중 생리적 및 생화학적 검정은 원-웨이 또는 반복된 측정 ANOVA를 사용하여 분석된다. Post-hoc 분석 (즉, Newman-Keuls)이 수행된다.
실시예 7: 칼시뉴린 시그널링의 Postscriptr- 매개된 활성화
칼시뉴린은 T 세포의 성장 및 자극, 폐 성숙 및 스트레스-유발 병리적 심장 비대를 포함한 많은 생물학적 과정에 중요한 세포내 시그널링 경로에서 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 포스파타제이다. 칼시뉴린은 촉매적 서브유닛 (칼시뉴린 A, CnA)과 조절성 서브유닛 (칼시뉴린 B, CnB)으로 구성된 이종이량체로 기능한다. 촉매적 서브유닛은 칼슘 시그널링의 부재에서 칼시뉴린 활성을 억제하는 C-말단 자가-억제성 도메인을 함유한다 (도 31a). 자동억제를 완화하는 Ca2+/칼모듈린 결합에 의한 활성화시, 칼시뉴린은 NFAT 전사 인자를 탈인산화하여 핵 안으로의 그의 진입과 NFAT-의존성 유전자 프로그램의 활성화를 허용한다 (도 31b). 이전 데이터는 C-말단 자동 억제성 도메인을 결하는 칼시뉴린의 발현이 NFAT-GFP 형광 리포터를 사용하여 시각화될 수 있는 NFAT 전사 인자의 구성적 활성화 및 핵 중요를 허용한다는 것을 보여주었다. Postscriptr가 그 자가억제성 도메인을 결하는 C-말단 칼시뉴린 단백질의 발현을 유도하는 데 이용될 수 있는지 결정하기 위해, 마우스 칼시뉴린 촉매적 서브유닛 (PPP3CB)의 인트론 서열을 표적화하는 Cas13b crRNA를 설계했다 (도 31c). 비-표적화 crRNA로 가이드된 Postscriptr의 발현은 주로 세포질에 국한된 NFAT-GFP 리포터의 국재화를 변경하지 않았지만, PPPCB 유전자를 표적화하는 crRNA는 NFAT-GFP 리포터의 강력한 핵 국재화를 초래하여, 이들 세포에서 칼시뉴린 활성의 활성화를 시사한다 (도 31d).
실시예 8: dCas13 으로 RNA 시각화 및 융합 단백질 국재화 증진
dPspCas13b와 증진된 GFP (eGFP)의 융합은 Ty1 NLS와 조합되어 핵 RNA 초점의 강력하고 구체적인 시각화를 허용했다 (도 32a). 초위성체 반복 확장된 RNA 초점의 시각화를 위해, 배경에 대한 표적 RNA 신호 강도는 1) 반복적인 RNA 서열 내의 다중 RNA 표적 서열 및 2) 핵 초점 내의 신호의 초점 농도에 의해 지원된다. 고유하거나 낮은 카피의 RNA 서열을 표적화하는 시각화 애플리케이션은 전통적으로 낮은 신호-대-잡음 비에 의해 방해를 받는다. 본 명세서에는 1) dCas13 표적화된 RNA의 신호 대 잡음 비를 증진시키거나 표적 RNA 서열에 대한 융합 단백질의 국재화를 증가시키기 위한 Cas13에 대한 접근법이 기술된다.
이 접근법은 GFP에 유사하게 11개 베타 가닥의 베타 배럴 구조로 구성된, 수퍼폴더 GFP에 고유한 형광 보완에 의존한다. sfGFP로부터 11번째 베타 가닥의 결실은 형광 활성을 폐지하지만, 11번째 베타 가닥은 시스 또는 트랜스로 전달되어 형광을 복원할 수 있다. 더욱이, 11번째 가닥은 단백질 상에 작은 태그로 역할을 할 수 있으며, 이는 처음 10개 베타 가닥을 인코딩하는 sfGFP와 공-발현될 때 GFP 융합 단백질을 재구성할 것이다 (도 32b). S11 가닥의 탠덤 어셈블리는 dCas13 표적화된 RNA의 신호 대 잡음 비를 증가시킬 가능성이 있다 (도 32c). 더욱이, 이 접근법은 관심 있는 단백질에 대한 융합을 인코딩하는 sfGFP 1-10과 공-발현될 때 더 큰 수의 융합 단백질 (단백질 X)을 표적화하는 데 유사하게 유용할 수 있다 (도 32d).
실시예 9: Postscriptr-매개된 RNA 분열 및 폴리아데닐화의 구조-기능 분석의 구조-기능 분석
도 33은 Postscriptr RNA 편집의 구조-기능 분석을 입증한다. Cas13b (PDB: 6DTD) (Slaymaker 등, Cell Rep, 2019, 26: 3741-3751 e5) 및 NUDT21 (PDB: 3MDG) (Yang 등, PNAS, 2010, 107:10062-7)의 결정 구조는 dCas13b-NUDT21 융합 단백질 및 crRNA를 모델링하는데 사용되었다 (도 33a). NUDT21은 N 및 C-말단의 근접성으로 인해 dCas13b에 융합된 탠덤 이량체로 발현될 수 있는 천연 동종이량체를 형성한다 (dCas13b-tdNUDT21) (도 33b). NUDT21의 방향화는 Postscriptr-유도된 RNA 분열 및 폴리아데닐화의 관찰된 위치와 일치하는 표적 RNA 상의 crRNA 표적 서열로 3'이 발생할 것으로 예측된다. (도 33c).
본 명세서에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명이 특정 실시형태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 실시형태 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시형태 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
<110> University of Rochester Anderson, Douglas M <120> Targeted Nuclear RNA Cleavage and Polyadenylation with CRISPR-Cas <130> 204606-0111-00WO <150> US62/791,971 <151> 2019-01-14 <150> US62/877,415 <151> 2019-07-23 <160> 789 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1089 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 1 Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr Tyr 1 5 10 15 Ser Val Met Ala Met Leu Asn Ala Gln Thr Val Leu Asp His Ile Gln 20 25 30 Lys Val Ala Asp Ile Glu Gly Glu Gln Asn Glu Asn Asn Glu Asn Leu 35 40 45 Trp Phe His Pro Val Met Ser His Leu Tyr Asn Ala Lys Asn Gly Tyr 50 55 60 Asp Lys Gln Pro Glu Lys Thr Met Phe Ile Ile Glu Arg Leu Gln Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Pro Phe Leu Lys Ile Met Ala Glu Asn Gln Arg Glu Tyr Ser 85 90 95 Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp Ile 100 105 110 Phe Glu Val Leu Lys Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Met Tyr Arg Asp 115 120 125 Leu Thr Asn His Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn 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<223> Chemically synthesized <400> 779 gttggaactg ctcattttgg agggtaatca caac 34 <210> 780 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 780 gttgcatctg ccttcttttt gaaaggtaaa aacaac 36 <210> 781 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> n is a, c, g, t or u <400> 781 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuguggaag guccaguuuu gaggggcuau 60 uacaac 66 <210> 782 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 782 gttgtggaag gtccagcttt gaggggctat tacaac 36 <210> 783 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 783 gttgtggaag gtccagtctt gaggggctat tacaac 36 <210> 784 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 784 gttgtggaag gtccagttct gaggggctat tacaac 36 <210> 785 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 785 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Claims (30)

  1. a) CRISPR-연관 (Cas) 단백질; 및
    b) 분열 또는 폴리아데닐화 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, Cas 단백질은 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)인, 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, dCas13은 서열번호: 47-48, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분열 또는 폴리아데닐화 단백질은 NUDT21인, 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, NUDT21은 서열번호: 51-58, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 서열번호: 696-698, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  9. a) CRISPR-연관 (Cas) 단백질; 및
    b) 형광 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, Cas 단백질은 촉매적으로 죽은 Cas13 (dCas13)인, 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, dCas13은 서열번호: 47-48, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 단백질은 eGFP, mCherry, sfGFP, sfGFP(1-10), sfGFP(1-10)-L-(11) 및 7xS11로 구성된 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 단백질은 서열번호: 59-66, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 서열번호: 699-701, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  17. a) CRISPR-연관 (Cas) 단백질; 및
    b) 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는, 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, Cas 단백질은 Cas13인, 융합 단백질.
  19. 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Cas13은 서열번호: 1-46, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, NLS는 서열번호: 75-695, 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 서열번호: 702, 또는 이의 변이체의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
  23. 대상체에서 RNA 트랜스크립트의 분열, 폴리아데닐화 또는 둘 모두를 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제22항의 핵산 분자 및 RNA 트랜스크립트에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 시험관내 또는 생체내 방법인 제23항의 방법.
  25. 대상체에서 핵 RNA를 시각화하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게: 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제22항의 핵산 분자 및 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것; 및 핵 RNA를 시각화하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 시험관내 또는 생체내 방법인 제25항의 방법.
  27. 대상체에서 핵 RNA의 수를 감소시키거나 핵 RNA를 분열하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게: 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제22항의 핵산 분자 및 핵 RNA에서 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 시험관내 또는 생체내 방법인 제27항의 방법.
  29. 약제의 제조에서 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제22항의 핵산 분자의 용도.
  30. RNA와 관련된 질환 또는 장애의 치료에서 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제22항의 핵산 분자의 용도.
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