JP2022547305A - Ａａｖ適合性ラミニン－リンカー重合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、組換えラミニンアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）構築物、および欠損哺乳動物または基底膜が不安定な哺乳動物におけるラミニン発現を回復させるための関連する方法に関する。【選択図】図１６

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１９年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９００，２３６号の利益を主張する、２０１９年５月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１３６９の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の声明

本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１－ＤＫ３６４２５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
配列表

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子データ提出された配列表を包含し、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２０年９月１１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、１０４９１＿００６５４２－Ｗ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、２２９ＫＢ（２３４，５４５バイト）のサイズである。

本発明は、組換えラミニンアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）構築物、および欠損哺乳動物または基底膜が不安定な哺乳動物におけるラミニン発現を回復させるための関連する方法に関する。

ラミニンは、基底膜（ＢＭ）およびそのアセンブリの必須構成要素である。これらの大きな糖タンパク質は、長いコイルドコイルに結合されたα、β、およびγサブユニットからなるヘテロ三量体である。ラミニンの基本的な役割は、（１）細胞外マトリックスを細胞表面および細胞骨格に付着させる、ならびに（２）ナイドジェン、コラーゲン、パールカン／アグリンといったヘパリン硫酸プロテオグリカン等の他の細胞外マトリックス成分が安定に付着するプラットフォームとして機能する、主要な足場を形成することである。

多くの異なるタイプの疾患には、基底膜およびラミニンが関係している。転移性固形腫瘍は、基底膜を通過して血管系に到達する必要があり、さまざまな微生物およびウイルスは、ラミニンと直接相互作用することにより細胞に侵入する。マウスの遺伝的証拠に基づくと、少なくとも９つのラミニンが生命に不可欠である。いくつかのラミニンのラミニンＮ末端（ＬＮ）重合ドメインにおける変異は、筋肉、神経、および腎臓の疾患の原因となる。例えば、Ｓｃｈｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８５（８）：８２５－３６を参照されたい。

ラミニン－２１１（α２、β１およびγ１サブユニットで構成されるヘテロ三量体、Ｌｍ２１１と略される）は、骨格筋および末梢神経シュワン細胞（ＳＣ）の基底膜の主要なラミニンであり、脳毛細血管にも見られる。例えば、Ａｕｍａｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ２４（５）：３２６－３２を参照されたい。

胚形成中、ラミニンα２鎖は、発生の胎生１１日目から筋肉が発生するにつれて発現する。ラミニンα２鎖をコードするＬＡＭＡ２遺伝子内のＬＮドメインの変異は、ラミニンα２タンパク質サブユニット発現の完全またはほぼ完全な喪失をもたらし、ラミニンα２欠損型筋ジストロフィー（ＬＡＭＡ２－ＭＤ）を引き起こす可能性がある。ＬＡＭＡ２－ＭＤは、通常、歩行不能な先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）として現れる常染色体劣性疾患であり、これは、先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）としても知られており、出生時または乳児期に始まり、多くの場合、末梢神経および脳の関与を伴う、特に重度の歩行不能な先天性ジストロフィーである。

イギリスのＬＡＭＡ２ ＭＤ患者２４９人を対象とした最近の研究では、ＬＡＭＡ２の変異が最も多く見られ（３７．４％）、ジストログリカノパチーとウルリッヒＣＭＤがそれに続くことが明らかになった。Ｓｆｒａｍｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒ ２７（９）：７９３－８０３を参照されたい。また、少数のミスセンス変異およびインフレーム欠失変異も存在し、そのほとんどが、より軽度の歩行可能なジストロフィーを引き起こすラミニンα２短腕重合ドメイン（ＬＮ）にマッピングされている。Ａｌｌａｍａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ６（５）：７４７－５２；Ｇａｖａｓｓｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ４４（５）：７０３－９；Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２４（４）：２８９－３１１；Ｃｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２４（８）：６７７－８３を参照されたい。どちらも病態も、脳白質異常および末梢神経伝導速度低下を伴う、筋変性、筋再生、慢性筋炎および筋線維症からなる。Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｍａｌｌｅｂｒｅｒａ，ｅｔ ａｌ．，（２００２５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２（７－８）：８０９－２３を参照されたい。無発現変異のある患者は歩行することができず、末梢神経伝導障害、発作、中度精神遅滞を有する可能性があり、多くの場合、若年時に筋肉消耗および呼吸不全のために死亡する。α２－ラミニンに欠陥のある患者は、後年、それほど重症ではない歩行型のジストロフィー、通常は肢帯型筋ジストロフィーを呈し、末梢神経系および中枢神経系の欠陥も示す。Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２４（４）：２８９－３１１を参照されたい。治療は一般的に、状態の個々の兆候および症状を管理することに焦点を当てている。現在のところ、どちらの治療法も分かっていない。

別の神経筋疾患であるピアソン症候群は、神経筋接合部の糸球体基底膜だけでなく、眼球内の筋肉、水晶体、および網膜にも顕著に発現するラミニンβ２鎖の欠損に関連している。ラミニンβ２鎖欠損は、ＬＡＭＢ２遺伝子のミスセンス変異およびインフレーム欠失変異によって引き起こされる。ピアソン症候群は、常染色体劣性疾患であり、主に腎臓と目に影響を及ぼす非常に稀な疾患である。罹患した小児のほとんどは、早期発症型の、慢性腎不全、神経発達障害、失明、筋緊張低下、精神運動遅延、片麻痺および異常な動きを含み得る明確な眼の異常を有する。Ｓｃｈｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８５：８２５－８３６を参照されたい。罹患した乳児は、生後数週間または数ヶ月を超えて生存できない場合がある。乳児期を超えて生存した乳児は、通常、神経障害および発達遅延を有する。ほとんどは、生後１０年以内に末期腎疾患のために腎移植を必要とする。長期的な見通しは不良である。

より良い治療法、特に患者におけるラミニン重合発現および基底膜アセンブリを回復させるための、具体的にはラミニンα２およびラミニンβ２の欠損を伴う疾患を治療するための遺伝子治療が引き続き必要とされている。

特定の実施形態において、本発明は、ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ（αＬＮＮｄΔＧ２’）をコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）に関する。特定の実施形態では、αＬＮＮｄΔＧ２’は配列番号１を含む。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号１２を含むＣＭＶプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、ｒＡＡＶはＡＡＶ８またはＡＡＶ－ＤＪである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む。特定の実施形態において、ＩＴＲは、配列番号１１を含む５’ＩＴＲおよび配列番号１６を含む３’ＩＴＲである。

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組換えＡＡＶ’のいずれかを含む組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は医薬担体をさらに含む。

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物を含む容器ハウジングを含むキットに関する。特定の実施形態において、容器はシリンジである。

特定の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを対象に投与することを含む、対象におけるラミニン重合発現および基底膜アセンブリを回復させる方法に関する。

特定の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるラミニンα２欠損を治療する方法に関する。

特定の実施形態において、本発明は、対象において、ラミニン欠損型筋ジストロフィーおよびラミニンα２欠損型筋ジストロフィーからなる群から選択されるラミニン欠損に関連する症状の少なくとも１つを軽減する方法に関し、該方法は、有効量の本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを対象に投与することを含む。

特定の実施形態において、本発明は、対象において、筋変性、筋再生、慢性筋炎、筋線維症、脳白質異常、末梢神経伝導速度低下、発作、中度精神遅滞、および呼吸不全からなる群から選択されるラミニンα２欠損に関連する症状の少なくとも１つを軽減する方法に関し、該方法は、有効量の本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを対象に投与することを含む。

特定の態様において、本発明の実施形態は、ＬＡＭＡ２遺伝子の欠損またはハプロ不全を特徴とする対象におけるラミニンα２欠損型筋ジストロフィーを治療するための方法に関する。この方法は、所望の細胞でαＬＮＮｄΔＧ２’産物を発現するプロモーター配列の制御下で、ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ（αＬＮＮｄΔＧ２’）をコードする核酸配列（すなわち、導入遺伝子）を担持する有効量の組換えアデノ随伴ウイルスを対象に投与することを含み得る。特定の実施形態において、プロモーター配列は、基底膜におけるαＬＮＮｄΔＧ２’産物の発現を提供する。特定の実施形態において、導入遺伝子遺伝子の発現は、対象における所望のラミニン重合発現および基底膜アセンブリを回復させるまたは維持するために必要な産物を細胞に提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、ラミニンα２欠損型筋ジストロフィーの治療のための組成物を提供する。そのような組成物は、注射に適した担体および追加成分とともに製剤化され得る。

本発明の他の態様および利点は、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに説明される。

コア基底膜（ＢＭ）成分と相互作用する神経筋ラミニンを示す。関連するラミニンおよび他のタンパク質ドメインが標識されている。破線および点線は、ドメイン結合の相互作用を示している。略語：ラミニン（Ｌｍ）、ラミニン１１１（Ｌｍ１１１）、ラミニン４１１（Ｌｍ４１１）、硫酸化糖脂質（ＳＧＬ）、α－ジストログリカン（αＤＧ）、ナイドジェン（Ｎｄ）、Ｌｍα２短腕重合ドメイン（ＬＮ）。 筋肉および末梢神経におけるＬｍ２１１およびＬｍ４１１によって媒介されるＢＭアセンブリのモデルを示す。略語：ラミニン２１１（Ｌｍ２１１）、ラミニン４１１（Ｌｍ４１１）、硫酸化糖脂質（ＳＧＬ）、α－ジストログリカン（αＤＧ）、ナイドジェン（Ｎｄ）、Ｌｍα２短腕重合ドメイン（ＬＮ）；ラミニンコイルドコイルに結合するアグリンのＮ末端ドメイン（アグリン－ＮｔＡ）、ラミニンＧ様ドメイン（ＬＧ）。 図３Ａ～３Ｅは」ラミニン機能のリンカータンパク質修復を示す図、ＥＭ画像、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像である。図３Ａは、αＬＮＮｄおよびｍａｇのドメイン構造と機能的活動を示す。ラミニン－α１に由来する領域は緑色であり、ナイドジェン－１に由来する領域はオレンジ色である。Ｍａｇは、Ｎ末端領域（青）とＣ末端部分（赤）を有するアグリンの小型化形態である。図３Ｂは、αＬＮＮｄおよびｍａｇ、ならびにラミニンとの複合体のロータリーシャドウ法によるＥＭ画像を示している。図３Ｃは、歩行型のＬＡＭＡ２ ＭＤおよびそのｄｙ２Ｊ／ｄｙ２Ｊマウスモデルにおいて、Ｌｍ－２１１の短縮型（「ｄｙ２Ｊ－Ｌｍ－２１１」）が発現されていることを示す。αＬＮＮｄは、ナイドジェン結合部位に結合し、機能的なＬＮドメインを含む人工短腕を形成する。αＬＮＮｄとｍａｇの共発現は、重合およびαＤＧ固定に必要なドメインを提供する。図３Ｄは、Ｇ２ドメイン±２ＥＧＦ様リピートを欠く重合リンカータンパク質の短縮型、すなわち、αＬＮＮｄ、αＬＮＮｄΔＧ２、およびαＬＮＮｄΔＧ２を示す。図３Ｅは、αＬＮＮｄΔＧ２とＬｍα１ΔＬＮ－Ｌ４ｂとのリンカー－ラミニン複合体形成を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 Ｇ２ドメイン±２ＥＧＦ様リピートを欠くαＬＮＮｄ重合リンカータンパク質の短縮型、すなわちαＬＮＮｄ（ａｌｐｈａＬＮＮｄ、ここでａｌｐｈａはラミニンα１、ＬＮはＬＮドメイン、Ｎｄはナイドジェンを指す）、αＬＮＮｄΔＧ２（ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２）、およびαＬＮＮｄΔＧ２’（ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ）を示す。 図５Ａ～５ＥはＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫蛍光画像、およびＬｍ４１１に結合したαＬＮＮｄΔＧ２’およびｍａｇのＡＡＶ発現、ならびにシュワン細胞上でのαＬＮＮｄΔＧ’－Ｌｍ４１１のアセンブリを示すグラフである。図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、Ｌｍ４１１を発現する２９３細胞のαＬＮＮｄΔＧ２’－ＡＡＶおよびｍａｇ５ｍｙｃ－ＡＡＶ感染を示している。Ｌｍ４１１との複合体は、培地からのＮ末端ＦＬＡＧタグ付きＬｍ４１１の免疫沈降と、それに続く図５ＡのＬｍα４の上部セグメントおよびαＬＮＮｄΔＧ２’の下部セグメントまたは図５ＢのｍａｇおよびαＬＮＮｄΔＧ２’の免疫ブロットで膜を切断することによって示される。図５Ｃおよび５Ｄは、ＡＡＶ生成αＬＮＮｄΔＧ２’に起因するＬｍ４１１アセンブリの大幅な増加を示している。図５Ｅは、１週齢のｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋ、ｍａｇ ＴｇマウスへのＡＡＶ－αＬＮＮｄΔＧ２’の筋肉内注射による抗体染色αＬＮＮｄΔＧ２’（赤）およびラミニン（緑）の筋細胞膜における検出を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ－ＭＣＳ発現ベクターのマップである。 ｐＡＡＶ－ＤＪベクターのマップである。 ｐＨｅｌｐｅｒベクターのマップである。 タンパク質ＢＬＡＳＴアラインメントを用いた、αＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質のマウスとヒトのアミノ酸配列の比較である。クエリ＝ヒトαＬＮＮｄΔＧ２’アミノ酸配列。対象－マウスαＬＮＮｄΔＧ２’アミノ酸配列。 同上 ＡＡＶに挿入されたマウスαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。シグナルペプチドは、ヌクレオチド１～５１によってコードされる（色：緑）。Ｌｍａ１ ＬＮは、ヌクレオチド５２～８０４によってコードされる（色：青）。ＬＥａ１は、ヌクレオチド８０５～９７５によってコードされる（色：マゼンタ）。ＬＥａ２は、ヌクレオチド９７６～１１８５によってコードされる（色：緑）。ＬＥａ３は、ヌクレオチド１１８６～１３５６によってコードされる（色：赤）。Ｌｅａ４は、ヌクレオチド１３５７～１５０３によってコードされる（色：シアン）。Ｌｍａ１ ＬＦセグメントは、ヌクレオチド１５０４～１５３６によってコードされる（色：青）。Ｎｄ ｅｇｆ－４は、ヌクレオチド１５３７～１６６８によってコードされる（色：赤）。Ｎｄ ｅｇｆ－５は、ヌクレオチド１６６９～１８０９によってコードされる（色：シアン）。ＮｄＴＹは、ヌクレオチド１８１０～２０９１によってコードされる（色：マゼンタ）。Ｎｄ Ｇ３は、ヌクレオチド２０９２～２８３５によってコードされる（色：緑）。Ｎｄ ｅｇｆ－６は、ヌクレオチド２８３６～３００６によってコードされる（色：赤）。 同上 ＡＡＶに挿入されたヒトαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。シグナルペプチドは、ヌクレオチド１～５１によってコードされる（色：緑）。Ｌｍａ１ ＬＮは、ヌクレオチド５２～８０４によってコードされる（色：青）。ＬＥａ１は、ヌクレオチド８０５～９７５によってコードされる（色：マゼンタ）。ＬＥａ２は、ヌクレオチド９７６～１１８５によってコードされる（色：緑）。ＬＥａ３は、ヌクレオチド１１８６～１３５６によってコードされる（色：赤）。ＬＥａ ４は、ヌクレオチド１３５７～１５０３によってコードされる（色：シアン）。ＬＦ断片は、ヌクレオチド１５０４～１５３６によってコードされる（色：青）。Ｎｄ ｅｇｆ－４は、ヌクレオチド１５３７～１６６８によってコードされる（色：赤）。Ｎｄ ｅｇｆ－５は、ヌクレオチド１６６９～１８０９によってコードされる（色：シアン）。ＮｄＴＹは、ヌクレオチド１８１０～２０９１によってコードされる（色：マゼンタ）。Ｎｄ Ｇ３は、ヌクレオチド２０９２～２８３５によってコードされる（色：緑）。Ｎｄ ｅｇｆ－６は、ヌクレオチド２８３６～３００６によってコードされる（色：赤）。 同上 ＡＡＶに挿入されたマウスαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を提供する。 マウスαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のアミノ酸配列を提供する。 ＡＡＶに挿入されたヒトαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を提供する。 ヒトαＬＮＮｄΔＧ２’（ｓｈｏｒｔ－ｎｏＧ２）のアミノ酸配列を提供する。 培養筋管でのラミニンアセンブリのリンカータンパク質メディエーションの結果を示すグラフを提供する。リンカータンパク質αＬＮＮｄ（［１］として示される）、αＬＮＮｄΔＬＥａ３，４（［２］として示される）、αＬＮＮｄΔＧ２’（［３］として示される）、およびαＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’（［４］として示される）はすべて、非重合ラミニン対象群と比較して、筋管表面で実質的かつ有意に増加したラミニンを示した。 図１７Ａ～１７Ｃは選択したリンカータンパク質のナイドジェン競合と、Ｃ２Ｃ１２筋管上の３つのリンカータンパク質とナイドジェン－１（Ｎｄ）間の競合の結果を示すグラフを提供する。図１７Ａは、リンカーαＬＮＮｄ（ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬＭＮＯＰ）リンカーとナイドジェン－１間の競合の結果を示す。図１７Ｂは、リンカーαＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’（ＡＢＣＤＨＩＪＮＯＰ）とナイドジェン－１間の競合の結果を示す。図１７Ｃは、リンカーαＬＮＮｄＧ２’（ＡＢＣＤＥＦＬＭＮＯＰ）とナイドジェン－１間の競合の結果を示す。 同上 同上 図１８Ａ～１８Ｃは縮小サイズのリンカータンパク質（コード：ＡＢＣＨＩＪＮＯＰ）とインキュベートされ、培養シュワン細胞の培地に添加された非重合ラミニンの結果を示す免疫染色画像および棒グラフである。図１８Ａは、シュワン細胞表面の非重合ラミニンアセンブリを示す免疫染色画像である。図１８Ｂは、タンパク質を重合する機能の獲得に伴うラミニンの蓄積の増加を示す免疫染色画像である。図１８Ｃは、図１８Ａおよび１８Ｂの定量的比較を提供するグラフである。なしはラミニンがないことを表す。Ｌｍα１ΔＬＮ－Ｌ４ｂは、α１短腕重合ドメインを欠くラミニン１１１を指す。Ｎｄはナイドジェン－１を指す。Ｃｏｌ４およびＣ４はＩＶ型コラーゲンを指し、ＡＢＣＨＩＪＮＯＰはαＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’からＬＥａ２、ＥＧＦ３を引いたものを指す。Ｒｅｌ．Ｌｍγ１免疫蛍光／細胞は、相対的なＬｍγ１免疫蛍光をカウントされた細胞の数で割ったものである。「平均」は平均を指す。 同上 同上

ヘテロ三量体ラミニンは、全ての基底膜を決定づける要素であり、細胞関連ネットワークに自己集合する。哺乳動物において、全てのラミニンは、５つのα鎖のうちの１つ、３つのβ鎖のうちの１つ、および３つのγ鎖のうちの１つからなるヘテロ三量体である。合計で少なくとも４５の潜在的なαβγ鎖の組み合わせがあるにもかかわらず、２０１０年の時点で、わずか１５の異なるラミニンアイソフォームが報告されていた。インビトロ研究に基づいて、少なくとも１６の認可されたラミニンアイソフォームが存在する（下の表１）。

ラミニンは基底膜の重要な中心的オーガナイザーであり、おそらくそれは、細胞、自己、および他の基底膜成分に結合するラミニンの独特の能力の結果である。組織および分化した細胞の出現に必要な基底膜は、胚発生、組織恒常性、およびヒト疾患において重要である。

十字型のラミニン分子の３本の短腕がネットワークノードを形成し、１つのα、１つのβ、および１つのγアームについて厳しい要件を伴う。相同な短腕は、遠位のラミニンＮ末端（ＬＮ）ドメインと、それに続く、未知の構造の球状ドメインが点在するラミニン型上皮成長因子様（ＬＥ）ドメインのタンデムリピートからなる。ＬＮドメインは、ラミニン重合およびＢＭアセンブリに不可欠である。ラミニン重合は、ミエリン形成にとっても重要である。α３Ａ、α４、およびα２サブユニットを含むラミニンは、ＬＮドメインの完全な相補体を有しないため、重合することができない（Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ．２０１２．Ｃｅｌｌ Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．２０１３．７（１）：５６－６３において考察されている）。

十字架の長腕（長さ７５～８０ｎｍ）は、３つ全ての鎖から形成されたαヘリックスコイルドコイルであるが、３つの短腕（３５～５０ｎｍ）はそれぞれ１つ鎖からなる。長腕の遠位端で、α鎖は、ラミニンの主要な細胞接着部位を含む５つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインを追加する。長腕の端部にあるこの球状ドメインは、インテグリン、α－ジストログリカン、ヘパラン硫酸、および硫酸化糖脂質を含む細胞受容体に結合する。ラミニンネットワークの付加的な固定は、プロテオグリカンであるパールカンおよびアグリンによって提供される。次いで、ＩＶ型コラーゲンによって第２のネットワークが形成され、それがパールカンおよびアグリンのヘパラン硫酸鎖、ならびにナイドジェンによる追加の結合を介してラミニンネットワークと相互作用する。一般的に、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｃｅｌｌ Ａｈｄ Ｍｉｇｒ．７（１）：５６－６３を参照されたい。基底膜のこの成熟は、胚発生の後の段階で不可欠となる。図１では、胚形成において発現した原型ラミニン（Ｌｍ）であるＬｍ１１１が、細胞表面の硫酸化糖脂質（ＳＧＬ）、インテグリン、α－ジストログリカン（αＤＧ）、ナイドジェン（Ｎｄ）、アグリンに結合し、そのＬＮドメインを介して重合する。コラーゲン－ＩＶおよびパールカンはナイドジェンに結合する。インテグリンおよびαＤＧはアダプタータンパク質を介して細胞骨格に付着する。重合しないＬｍアイソフォームであるＬｍ４１１は、非常に弱いインテグリンおよびαＤＧ結合を示す。

Ｌｍ２１１およびＬｍ４１１は、筋肉および末梢神経におけるＢＭアセンブリを媒介する。ラミニンは、スルファチド等の硫酸化糖脂質（ＳＧＬ）に結合し、インテグリンα７β１およびα－ジストログリカン（αＤＧ）に結合し、図２に示すＬＮ相互作用を介して重合することにより、初期の新生足場を形成する。ナイドジェン（主にナイドジェン－１）は、ラミニンおよびコラーゲン－ＩＶに結合し、ブリッジとして機能し、コラーゲンが重合して第２のネットワークを形成する。全ての成分は、ラミニンを介して直接的または間接的に細胞受容体に繋ぎ止められるが、他のインテグリンと個別に相互作用することができる。Ｌｍ４１１は、神経内でＬｍ２１１と共集合する非重合ラミニンである。αＬＮＮｄは、Ｌｍ４１１に結合し、重合活性を付与する。ミニアグリン（ｍａｇ、ｍＡ）は、Ｌｍ４１１に結合し、αＤＧ結合を付与する。（ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２７： １０７５－１０８９ ａｎｄ Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ２８：９（３９６）， ｐｉｉ： ｅａａｌ４６４９． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｌ４６４９を参照されたい）。

シュワン細胞（ＳＣ）ＢＭは、全体的な構造組織を筋肉ＢＭと共有しているが、それらはいくつかの点で異なる：（ｉ）β１－インテグリンはミエリン形成の主要なメディエーターであるが、筋肉ではαＤＧが最も重要な受容体である、（ｉｉ）いくつかのＳＣインテグリンがＢＭと相互作用するために利用可能であり（ただし、筋肉内ではα７β１のみ）、他のＢＭ成分のインテグリン結合を可能にする、（ｉｉｉ）筋線維に存在しないＬｍα４は、ミエリン形成に寄与する正常なＳＣサブユニットである、（ｉｖ）ＳＣは、α４－ラミニンの接着を可能にし得るスルファチドおよびＣＤ１４６を発現する、（ｖ）Ｄｙ２Ｊのミエリン消失は坐骨神経および神経根で最も顕著であり、ラミニン重合の特別な重要性を示唆している。アルファ２－ラミニンは、血液脳関門を形成する毛細血管にも見られる。ラミニンサブユニットの喪失により関門が水に漏れやすくなることが、ほぼ全てのＬＡＭＡ２－ＭＤ患者でＭＲＩによって検出される脳白質の変化の原因である可能性が高い。

ラミニンα２欠損型筋ジストロフィー（ＬＡＭＡ２－ＭＤ）は、通常、歩行不能な先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）として現れる、ＬＡＭＡ２遺伝子内の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患である。ジストロフィーはしばしば末梢神経と脳の関与を伴う。ＬＡＭＡ２変異の大多数は、タンパク質サブユニットの発現、特にＬｍ２１１の完全またはほぼ完全な喪失をもたらし、特に重症の歩行不能な先天性ジストロフィーを引き起こす。少数のミスセンス変異およびインフレーム欠失変異も存在し、そのほとんどが、より軽度の歩行可能なジストロフィーを引き起こすＬｍα 短腕重合ドメイン（ＬＮ）にマッピングされている。ＬＡＭＡ２－ＭＤでは、Ｌｍ４１１の転写およびタンパク質の蓄積が増加し、Ｌｍ５１１がわずかに増加する。Ｌｍ４１１は、筋肉のαＤＧおよびインテグリンに弱く結合し、重合する能力を欠いているという点で珍しい。Ｌｍ４１１はＢＭアセンブリには不十分であるため、他のラミニンと比較して細胞表面の蓄積には高いＬｍ４１１濃度が必要であり、ＬＡＭＡ２変異をレスキューする能力が限られていることを説明している。これらの組成変化は、ラミニン－α２の非存在下で見られるＢＭの構造的減衰の根底にあるＹｕｒｃｈｅｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｉｉ：Ｓ０９４５－０５３Ｘ（１７）３０３３３－５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２０１７．１１．００９のレビューを参照されたい。

ラミニンα２鎖欠損のいくつかのマウスモデルが利用可能であり、それらはまた、筋ジストロフィーならびに末梢神経系および中枢神経系のミエリン形成の欠陥を示す。ＬＭα２鎖欠損筋肉では、ＢＭが破壊され、ＬＭα２鎖受容体と一部のＢＭ関連タンパク質の発現が変化し、構造的欠陥とシグナル伝達欠陥の両方が正常な筋肉機能に有害である可能性がある。さらに、シュワン細胞の増殖およびオリゴデンドロサイトの拡散、ならびに末梢神経系中および枢神経系におけるミエリン形成をそれぞれ誘導するラミニンα２鎖の重要な役割が実証されている。Ｓｃｈｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８５：８２５－８３６を参照されたい。ラミニンα２は、ｄｙＷ（ｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗ）マウスでは大幅に減少するが、ｄｙ３Ｋ（ｄｙ^３Ｋ／ｄｙ^３Ｋ）Ｌａｍａ２ノックアウトマウスには完全に存在しない。これらの２つのモデルは、ラミニンα２サブユニットを非常に低く発現するか、まったく発現しないＬＡＭＡ２－ＭＤ患者の大多数を表している。マウスの中で最も深刻な影響を受けているｄｙ３Ｋマウスは、非常に弱く、小さく、非常に短命である。第３のモデルはｄｙ２Ｊ（ｄｙ^２Ｊ／ｄｙ^２Ｊ遺伝子型）マウスであり、ラミニンα２はわずかに減少し、ラミニンα４はやや増加する。ＬＮドメインの損失のために、ｄｙ２ＪマウスのＬｍ２１１は重合することができない。Ｄｙ２Ｊマウスは、約３週半の年齢で始まって、最初は後肢、その後、軸性筋組織および前肢筋組織に発症する進行性の衰弱および麻痺を特徴とし、シュワン細胞が軸索を選別して鞘に収めることができず、その結果としてミエリン喪失を引き起こす。しかしながら、これらのマウスは何ヶ月も生き残ることができる。

ＬＡＭＡ２－ＭＤの治療法の開発には課題がある。Ｌａｍａ１（Ｌｍα１）の生殖系列遺伝子組換えによってラミニンの発現を回復させる直接的なアプローチは、マウスにおいて正常な機能を回復させる能力において効果的であるが、９．３ｋｂのＤＮＡ構築物は利用可能な送達系には大き過ぎる。薬物療法は改善を示すが、重要なことに、根本的な構造上の欠陥を修正しない。炎症を起こした筋肉に非経口で送達されたＥＨＳ由来のＬｍ１１１は、ｄｙＷマウスにおいて有益であることが分かっているが、このアプローチは、治療に必要な組換えラミニンでは効果的であることが示されていない。フレームシフト変異を修正するためのエクソンスキッピングがジストロフィン欠損を治療するために用いられてきたが、エクソンの境界がタンパク質ドメインの境界と一致せず、ほぼ全てのＬＡＭＡ２エクソンをスキップするとシステイン不対合およびドメインのミスフォールディングが起こる可能性があるため、ラミニン欠損には問題がある。ＬＡＭＡ２－ＭＤ被験者の約２０％に見られるスプライス欠陥の修復には、ＡＡＶ由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が使用されている。トランスジェニックミニアグリン（ｍｉｎａｇｒｉｎ）（ｍａｇ）の発現は、出生後に発現した場合でも、ラミニン－α２欠損型筋ジストロフィーのマウスモデルの筋病態生理を部分的に改善することが示された。ｍａｇ遺伝子がＡＡＶによって周産期のｄｙＷ（ｄｙＷ／ｄｙＷ）マウスに導入された場合にも、同様の利点が観察された。Ｑｉａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００５）１０２（３４）：１１９９９－２００４．を参照されたい。ヒトのデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための、マイクロジストロフィンのＡＡＶによる送達が実証されている。Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ（２０１２）を参照されたい。本発明は、全てのＬＡＭＡ２－ＭＤを改善する可能性のある基底膜の修復を提供する。

組換えラミニンとキメラリンカータンパク質は、ＬＡＭＡ２－ＭＤのモデルにおいて基底膜の欠陥を修復することができる。ＢＭアセンブリの要件を理解する上での最近の進歩は、ラミニン結合タンパク質が、ＬＮドメインを欠いたラミニンでの重合のための代替の腕を提供し得ることを示している。αＬＮＮｄ、ＤｏＬＮＮｄ、およびγＬＮＮｄリンカータンパク質は、対応するＬＮ、βＬＮ、およびγＬＮドメインを欠いたラミニンでの重合を可能にすることができる。ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ（２０１８）ｗｗｗ．／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２０１８．０１．０１２，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ，Ｐｉｅｒｓｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌａｍｉｎｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓを参照されたい。図３Ａおよび図４に示すように、αＬＮＮｄは３つの球状ドメインからなり、Ｌｍα１ＬＮ－Ｌｅａドメインとナイドジェン－１ Ｇ２－Ｇ３ドメインの融合から生じるロッドが介在している。ＬＮ球状ドメインは、重合ドメインである。Ｇ２はコラーゲン－ＩＶおよびパールカンに結合し、Ｇ３はＬｍγ１－ＬＥｂ３ドメインに結合して、短腕の交差点近くの遺伝子座に結合する人工腕を形成する。α－ＬＮドメインを欠く非重合ラミニンに結合すると、αＬＮＮｄはＷＴラミニンに悪影響を与えることなく、ＢＭへの重合およびコラーゲン－ＩＶ動員を可能にする。ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，（２００９）２８４（１３）：８９８４－８９９４を参照されたい。

αＬＮＮｄのトランスジェニック発現は、ｄｙ２Ｊ筋ジストロフィーを改善することが示されており、また、受容体結合を増強するタンパク質であるミニアグリン（ｍｉｎａｇｒｉｎ）と組み合わせると、より重度のｄｙＷジストロフィーも改善することが示されている。ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２０１７）１２７（３）１０７５－１０８９、Ｒｅｉｎｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１７）９（３９６）を参照されたい。さらに注目すべきは、αＬＮＮｄタンパク質の代わりにβＬＮＮｄを使用してβ２ＬＮ変異を担持する糸球体Ｌｍ５２１への重合を回復させることにより、ラミニン自己アセンブリの失敗に起因するピアソン症候群の患者を治療することが可能であり得ることである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、筋肉、末梢神経、および他の組織で高発現を達成することができる、最も有望な遺伝子送達系の１つである。潜在的なリスクとして、導入遺伝子産物に対する宿主細胞の免疫応答と、それに続くタンパク質の損失を伴うＡＡＶキャプシドが挙げられる。しかしながら、この問題は、導入遺伝子のネオ抗原の形成を回避することにより解消されてきた。αＬＮＮｄおよびβＬＮＮｄおよびγＬＮＮｄリンカータンパク質のドメインは、通常、たとえジストロフィー状態であっても、より大きな基底膜タンパク質の一部として発現され、免疫原性である可能性は低い。ＣＭＶプロモーターが増強された、最大の挿入容量を有するＡＡＶ送達における最近の改善を利用するために、本発明のための好ましいＡＡＶシステムは、混合された血清型キャプシドを含む増強されたＣＭＶプロモーターを用いるＡＡＶ－ＤＪ系であり、最大３．１ｋＢの挿入が可能である（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６～図８を参照）。

αＬＮＮｄのＡＡＶ体細胞遺伝子発現の問題は、αＬＮＮｄがＡＡＶによって発現されるのに十分小さい一方で、プロモーターは非常に小さくなければならず、良好な発現を提供する可能性が低いことである。この問題の潜在的な解決策は、ＡＡＶに適合するようにαＬＮＮｄ ＤＮＡのサイズを４．１７ｋＢに縮小することであったが、サイズを縮小すると、基底膜アセンブリおよびミエリン形成のためのタンパク質の機能に影響し得るという懸念があった。Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは不可欠であるため、内部ドメインのサイズを縮小することに重点が置かれた。作成され、αＬＮＮｄΔＧ２と称される最初の修飾タンパク質を図３Ａおよび図４に示す。Ｇ２の除去により必要な縮小のほとんどが得られたが、コラーゲン－ＩＶおよびパールカンへの重合ラミニンの直接結合が失われるという犠牲を伴った。シュワン細胞、筋管、および後根神経節を用いて行われた実験により、Ｇ２およびその隣接する３ｋＢまでのＬＥ／ＥＧＦ様ドメインは、試験システムにいくらかのナイドジェン－１が存在する限り消費可能であることが明らかになった。遺伝子組換えを用いた他の実験では、かなりのナイドジェン－１が基底膜に残っていることが示され、αＬＮＮｄリンカータンパク質のサイズ縮小を探究できることが示唆された。本発明は、内部Ｇ２および２つのＥＧＦ様スペーサードメインが除去され、ヌクレオチド配列のサイズが約２．９～３．０ｋＢに縮小された、ＡＡＶによって発現されるには十分に小さいが、基底膜アセンブリおよびミエリン形成のためのタンパク質の機能を依然として保持する、αＬＮＮｄΔＧ２’と称される新しいαＬＮＮｄリンカータンパク質を提供する。

本発明は、ＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’構築物を使用して、筋肉、末梢神経および他の組織におけるラミニン重合および基底膜アセンブリを回復し、ＬＡＭＡ２－ＭＤを改善することに関する。そのような方法およびＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’構築物は、ヒトの疾患に対する有効な治療となり得ることが期待される。参照を容易にするために、本明細書に記載のベクター構築物は、様々なＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’構築物と称され、他の要素の中でも、マウスａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔタンパク質をコードする核酸配列を含むＡＡＶ－ＤＪ構築物を意味する。図９に示すように、ヒトａｌｐｈａＬＬＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔタンパク質は、マウスａｌｐｈａＬＬＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔタンパク質と８７％の同一性を有する。コドン最適化されたヒト構築物は、筋肉、末梢神経および他の組織におけるラミニン重合および基底膜アセンブリを回復し、ＬＡＭＡ２－ＭＤを改善するために、同じ所望の様式で機能することが期待される。β２ＬＮ変異を担持する糸球体Ｌｍ５２１への重合を回復させるために、ａｌｐｈａ１セグメントをβＬＮＮｄタンパク質のベータ１セグメントに置き換えることにより、同じＡＡＶ－ＤＪ構築物を使用してピアソン症候群の患者を治療することができると考えられる。
ＡＡＶ適合性ラミニン－リンカータンパク質ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ 略語：
ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス
ｒＡＡＶ：組換えアデノ随伴ウイルスまたはウイルスベクター
ＢＭ：基底膜
αＬＮＮｄ：アルファラミニンＮ末端ドメイン結合タンパク質
αＬＮＮｄΔＧ２’：アルファラミニンＮ末端ドメインデルタＧ２短鎖タンパク質、ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ
α－ＤＧ：α－ジストログリカン
βＬＮＮｄΔＧ２’：ベータラミニンＮ末端ドメインデルタＧ２短鎖タンパク質、ｂｅｔａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ
ＥＣＭ：細胞外マトリックス
γＬＮＮｄΔＧ２’：ガンマラミニンＮ末端ドメインデルタＧ２短鎖タンパク質、ｇａｍｍａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ
ＬＥドメイン：ラミニン型上皮成長因子様ドメイン
ＬＧドメイン：ラミニンＧ様ドメイン
ＬＭまたはＬｍ：ラミニン
ＬＮドメイン：ラミニンＮ末端ドメイン
定義

本発明をより容易に理解することができるように、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で特に断りがない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている。

添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」等の単数形の単語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限りそれらの対応する複数の言及を含む。

細胞または受容体に適用される「活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、「刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」、および「処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、例えば、文脈によって、または明白にそうでないことが示されない限り、リガンドによる細胞または受容体の活性化、刺激または処理と同じ意味をもち得る。「リガンド」は、天然および合成のリガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質、および抗体から誘導した結合化合物を包含する。「リガンド」はまた、小分子、例えばサイトカインのペプチド模倣物および抗体のペプチド模倣物を包含する。「活性化」とは、内部機構ならびに外部因子または環境因子によって調節されるような細胞活性化を意味する場合がある。例えば細胞、組織、器官、または生物の「応答」は、生化学的または生理学的挙動の変化、例えば生物学的コンパートメント内の濃度、密度、付着、または遊走、遺伝子発現率、または分化状態の変化を包含するが、その場合に変化は活性化、刺激、または治療、あるいは遺伝的プログラミングのような内部メカニズムと相関する。

分子の 「活性」は、リガンドへのまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現または細胞シグナル伝達、細胞分化もしくは細胞成熟化を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性調節等を説明または意味してもよい。分子の「活性」はまた、細胞－細胞相互作用の調節または維持における活性、例えば、付着、または細胞構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格の維持における活性を指す場合がある。「活性」はまた、比活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的コンパートメント中の濃度等を意味し得る。「活性」は、先天的または適応免疫系の構成要素の調節を意味し得る。

動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または体液に適用される「投与」および「治療」は、外因性の医薬、治療薬、診断薬、または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または体液への接触を意味する。「投与」および「治療」は、例えば治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法、および実験方法を指す場合がある。細胞の処理は、細胞への試薬の接触、ならびに液体が細胞と接触している場合に試薬と液体との接触を包含する。「投与」および「治療」はまた、例えば、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、細胞のインビトロおよびエクスビボでの処理を意味する。用語「対象」は任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒト患者を含むヒトを含む。

「ａｌｐｈａＬＮＮｄ」（αＬＮＮｄ）は、３つの球状ドメインからなるリンカータンパク質であり、Ｌｍα１ＬＮ－ＬＥａドメインとナイドジェン－１ Ｇ２－Ｇ３ドメインの融合から生じるロッドが介在している。ＬＮ球状ドメインは、重合ドメインである。Ｇ２はコラーゲン－ＩＶおよびパールカンに結合し、Ｇ３はＬｍα１－ＬＥｂ３ドメインに結合して、短腕の交差点近くの遺伝子座に結合する人工腕を形成する。αＬＮドメインを欠く非重合ラミニンに結合すると、αＬＮＮｄはＷＴラミニンに悪影響を与えることなく、ＢＭへの重合およびコラーゲン－ＩＶ動員を可能にする。

「治療する」または「治療すること」は、本発明のｒＡＡＶ構築物のいずれかを含む組成物等の治療薬を、該治療薬が治療活性を有する、１つ以上の疾患症状を有する、または疾患を有することが疑われる、または疾患に罹患するリスクが高い対象または患者に、内的または外的に投与することを意味する。典型的には、そのような症状の後退の誘導によるか、または進行の阻害によるかにかかわらず、治療対象または集団における１つ以上の疾患症状を任意の臨床的に測定可能な度合で軽減するのに有効な量で薬剤が投与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称される）は、患者の病状、年齢、および体重、ならびに対象における所望の反応を引き出す薬物の能力等の因子によって変化してもよい。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態（例えば、治療方法または製品）は、すべての対象における標的疾患症状を軽減するのに有効ではないかもしれないが、例えばスチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン検定等の当該技術分野で公知の任意の統計的検定によって決定されるような被験者の統計的に有意な数では標的疾患症状を軽減するはずである。

「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、それがヒト、獣医学、または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段、研究および診断的応用を指す。「治療」は、それがヒト、獣医学、もしくは研究対象、または細胞、組織、もしくは器官に適用される場合、ヒトまたは動物対象、細胞、組織、生理学的コンパートメント、または生理学的液体に適用される本発明のｒＡＡＶ構築物または関連する方法のいずれかのトランスフェクションを包含する。

「単離された核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは一部と関連していないか、またはそれが天然では連結されないポリヌクレオチドに連結される、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことを理解されたい。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０個もしくはさらには最大２０個以上の他のタンパク質もしくはその一部もしくは断片のコード配列を含み得る、または列挙される核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含み得る、かつ／またはベクター配列を含み得る。

「制御配列」という句は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列は、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に「作動可能に連結する」。例えば、プレシーケンスまたは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結し、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置された場合、コード配列に作動可能に連結する。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接し、かつ読み取り相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、従来の制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。

本明細書中で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は交互に用いられ、そして全てのそのような表示は子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、初代の対象細胞およびそれに由来する培養物を移入数に関係なく含む。故意または偶然の突然変異のために、すべての子孫が正確に同一のＤＮＡ含量を有するわけではないこともまた理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。明確な名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
組換えＡＡＶ

いくつかの態様において、本発明は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その天然の環境から（例えば、宿主細胞、組織、または対象から）単離された、または人工的に生成されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を用いて生成され得る。そのようなＡＡＶは、本明細書において「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１つ以上の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的な標的化能を有することが好ましい。ＡＡＶキャプシドは、これらの組織特異的な標的化能を決定する上で重要な要素である。したがって、標的とされる組織に適切なキャプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。

ラミニンアルファ２欠損の治療に関連して所望の組織を標的化するために、１つの好ましいｒＡＡＶはＡＡＶ－ＤＪキャプシドとＡＡＶ－２ Ｒｅｐ遺伝子バックボーンの組み合わせであり、本明細書に記載の様々なｒＡＡＶが得られる（配列リストを参照）。別の好ましいｒＡＡＶは、組織発現パターンが筋肉および神経を含む変異体であるＡＡＶ－９である。

所望のキャプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法が記載されている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照されたい）。いくつかの異なるＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６３８１－６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）；Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１－６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）；ＵＳ２００３－０１３８７７２、ＵＳ２００７／００３６７６０、ＵＳ２００９／０１９７３３８に開示されるものが記載されており、ＡＡＶキャプシドタンパク質ならびに関連するヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関連するそれらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される構築物および方法の所望のパッケージングには、ＡＡＶ－９ベクターおよびキャプシド、ならびにＡＡＶ－ＤＪベクターおよびキャプシドが好ましい（配列番号１７）。さらに、他のＡＡＶベクターおよびキャプシドは、まだ開発されていないものもあり、将来的にも有用であることが証明される可能性がある。典型的には、方法は、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子； ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる組換えＡＡＶベクター；ならびに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養して、組換えＡＡＶベクターのＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングを可能にすることを含む。

ｒＡＡＶベクターをＡＡＶキャプシドにパッケージするために宿主細胞中で培養される成分は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは、必要な成分のいずれか１つ以上（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）は、当業者に既知の方法を用いて必要な成分の１つ以上を含むように操作された安定な宿主細胞によって提供されてもよい。最も適切には、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な成分（複数可）を含むであろう。しかしながら、必要な成分（複数可）は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。さらに別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下で選択された成分（複数可）を、また１つ以上の誘導性プロモーターの制御下で他の選択された成分（複数可）を含み得る。例えば、（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含む）２９３細胞に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含む、安定な宿主細胞が生成され得る。

組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびｒＡＡＶを生成するためのヘルパー機能は、任意の適切な遺伝要素（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝要素は、本明細書に記載されるものを含む任意の適切な方法によって送達され得る。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０－５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に詳述されるような（トリプルトランスフェクション法に関連する内容は、参照により本明細書に組み込まれる））三重トランスフェクション法を用いて生成され得る。典型的には、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターにパッケージされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）で宿主細胞をトランスフェクトすることにより生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためにトランスで機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成することなく、効率的なＡＡＶベクターの産生を支持する。本発明での使用に適したベクターの非限定的な例として、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９、および米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられ、それらはどちらも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ複製に必要な機能を含み、それには、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分が含まれる。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、ワクシニアウイルス等の既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

トランスフェクトされた宿主細胞に関して、「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子等の１つ以上の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入することができる。

「宿主細胞」は、目的の物質を保持するか、または保持することができる任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的、または意図的な突然変異に起因して、形態においてまたはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らないことを理解されたい。

細胞に関して、「単離された」という用語は、その自然環境から（例えば、組織または対象から）単離された細胞を指す。「細胞株」という用語は、インビトロで連続的または長期の増殖および分裂が可能な細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自発的または誘発された変化が、そのようなクローン集団の保存または移入の間に核型において起こり得ることは当該技術分野においてさらに知られている。したがって、言及された細胞株由来の細胞は、祖先の細胞または培養物と正確に同一ではない可能性があり、言及された細胞株はそのような変異体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「組換え細胞」とは、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡ等の生物学的に活性な核酸の産生をもたらすＤＮＡセグメント等の外因性ＤＮＡセグメントが導入されている細胞を指す。

「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等の任意の遺伝要素を含み、これらは適切な制御要素に関連付けられた場合に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を移動させることができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置されたベクターであることが企図される。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「作動可能に配置された」、「作動可能に連結された」、「制御下」、または「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するように、プロモーターが核酸に対して正しい位置および配向にあることを意味する。「発現ベクターまたは構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能な核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物を意味する。いくつかの実施形態において、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生成するための核酸の転写を含む。
組換えＡＡＶベクター

本明細書に記載の「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最低でも、導入遺伝子（例えば、αＬＮＮｄΔＧ２’をコードする）およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。キャプシドタンパク質にパッケージされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）または他の目的の遺伝子産物（例えば、αＬＮＮｄΔＧ２’）をコードする、ベクター配列と異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする方法で、調節成分に作動可能に連結されている。

ベクターのＡＡＶ配列は、シス作用性の５’および３’逆方向末端反復配列を含み得る（例えば、「Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ''Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ''，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照）。ＩＴＲ配列は、典型的には約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする配列全体が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の微細な変更は許容される。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，''Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ''，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）等のテキストを参照）。そのような分子の例は、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素は、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶタイプを含む、任意の既知のＡＡＶから得ることができる。

組換えＡＡＶベクターについて上記で特定された要素に加えて、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞または本発明によって生成されたウイルスに感染した細胞における、その転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御要素も含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに、必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野で既知であり、利用することができる。

本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような様式で共有結合される場合、作動可能に連結していると言われる。核酸配列を機能性タンパク質に翻訳することが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されたと言われるのは以下の場合である：５’調節配列へのプロモーターの導入がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉しない。したがって、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができ、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、プロモーター領域は核酸配列に作動可能に連結されるであろう。同様に、２つ以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写がインフレームで翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすように連結される場合、作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生じる。いくつかの実施形態において、作動可能に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生じる。

タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後、かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明において有用なｒＡＡＶ構築物は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンも含み得る。１つの考えられるイントロン配列は、ＳＶ-４０に由来し、ＳＶ-４０ Ｔイントロン配列と言及される。使用され得る別のベクター要素は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物から１つより多くのポリペプチドを生成するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、１つより多くのポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用される。これらおよび他の一般的なベクター要素の選択は従来のものであり、多くのそのような配列が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、およびこれに引用される参考文献、例えば、３．１８ ３．２６および１６．１７ １６．２７ページ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）。いくつかの状況において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列がポリタンパク質に含まれてもよい：これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（約１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工的な系において以前に実証されている（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：１９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００；１１：１９２１－１９３１．；およびＫｌｕｍｐ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８１１－８１７）。

宿主細胞における遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織、または細胞型の間で異なるが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサー要素等の、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、そのような５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまた、必要に応じて、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含み得る。ベクターは、任意選択的に、５’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。

構成的プロモーターの例として、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または細胞の複製においてのみ、調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む、様々な商業的供給源から入手可能である。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例として、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９３：３３４６－３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏ．ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７））およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７））が挙げられる。この状況において有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または細胞の複製においてのみ、調節されるものである。

別の実施形態において、導入遺伝子のための天然プロモーターまたはその断片が使用される。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが所望される場合、天然のプロモーターが好ましい場合がある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的もしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用され得る。さらなる実施形態において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列等の他の天然の発現制御要素を使用して、天然の発現を模倣することもできる。

いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を付与する。場合によっては、組織特異的な調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。そのような組織特異的な調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は当該技術分野で周知である。例示的な組織特異的な調節配列として、以下の組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター等のニューロンプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＤＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、およびニューロン－特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは以下から選択される遺伝子のプロモーターである：神経核（ＮｅｕＮ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）。いくつかの実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態において、調節配列は、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ， ７：１７－２７（２０１４））。配列番号１７７は、ＷＰＲＥのヌクレオチド配列を提供する。ＷＰＲＥの改変型は、導入遺伝子の発現にも使用できる（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ， ７：１７－２７（２０１４））。いくつかの実施形態では、配列番号１７８のヌクレオチド配列を有する短縮型ＷＰＲＥが使用される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＢｈ一般発現プロモーターであり、これは、Ｖｅｘｔａｌ Ｂｉｄｅｒ，Ｉｎｃ．（米国イリノイ州シカゴ）から市販されているＣＢＡプロモーターに由来する（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２２：１１４３-１１５３（２０１１））。
導入遺伝子コード配列

ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子配列の組成は、結果として得られるベクターが使用される用途に依存する。例えば、ある種の導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。別の例において、導入遺伝子は、治療用αＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質または治療用機能性ＲＮＡをコードする。別の例において、導入遺伝子は、研究目的で、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために、例えば、導入遺伝子を保持する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。別の例において、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者には明らかであろう。

いくつかの態様において、本発明は、例えば、対象においてラミニンアルファ２ポリペプチド欠損をもたらす遺伝子欠損等の、哺乳動物におけるＬＡＭＡ２遺伝子欠損（例えば、遺伝性遺伝子欠損、体細胞遺伝子変化）を予防または治療する方法において使用するための、特にラミニンアルファ２欠損を呈する対象において欠損の重症度または程度を治療または軽減するための、ｒＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態において、方法は、薬学的に許容される担体中の、１つ以上の治療用ペプチド、ポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド等をコードするｒＡＡＶベクターを、そのような障害を有するまたは有すると疑われる対象におけるＬＡＭＡ２障害を治療するのに十分な量および期間で対象に投与することを含む。
組換えＡＡＶの投与

ｒＡＡＶＳは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なく十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路は、限定されないが、選択された組織への直接送達（例えば、脳内投与、髄腔内投与）、静脈内、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口投与経路を含む。必要であれば、投与経路を組み合わせてもよい。

対象への特定のｒＡＡＶの送達は、例えば、対象の血流への投与によるものであってもよい。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管への注射によるものであり得る。さらに、特定の例では、ｒＡＡＶを脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔等に送達することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、定位注射等による当該技術分野で既知の神経外科技術を用いて、針、カテーテルまたは関連デバイスを用いて脊髄または脳に直接送達され得る（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４－３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９－２２３，１９９３；およびＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５－２３２９，２０００を参照）。特定の状況において、皮下、膵内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、脳内、髄腔内、脳内、経口、腹腔内、または吸入のいずれかにより、本明細書に開示される適切に製剤化された医薬組成物中でｒＡＡＶベースの治療用構築物を送達することが望ましい。いくつかの実施形態において、米国特許第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（それぞれ、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）に記載される投与モダリティを用いてｒＡＡＶを送達することができる。
組換えＡＡＶ組成物

ｒＡＡＶは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法に従って、組成物中で対象に送達されてもよい。好ましくは生理学的に適合性のある担体（例えば、組成物中）に懸濁されたｒＡＡＶは、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）に投与されてもよい。特定の実施形態において、組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１つ以上の他のウイルス（例えば、１つ以上の異なる導入遺伝子をコードする／有する第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含み得る。

適切な担体は、ｒＡＡＶが対象とする適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体は、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化され得る生理食塩水を含む。他の例示的な担体として、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が挙げられる。担体の選択は、本発明の限定ではない。

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、防腐剤または化学安定剤等の他の従来の医薬成分を含み得る。適切な例示的な防腐剤として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。

所望の効果または「治療効果」を達成するために必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、体重１キログラム当たりのベクターゲノム中の用量の単位／（ｖｇ／ｋｇ）は、限定されないが、以下を含むいくつかの要因に基づいて変化する：ｒＡＡＶ投与経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療されている特定の疾患または障害、ならびに遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性。当業者は、前述の要因、および当該技術分野で周知の他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する対象を治療するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を容易に決定することができる。ｒＡＡＶの有効量は、一般に、対象当たり約１０^９～１０^１６ゲノムコピーを含む約１０μｌ～約１００ｍｌの範囲の溶液である。他の体積の溶液が使用されてもよい。使用される体積は通常、とりわけ、対象のサイズ、ｒＡＡＶの用量、および投与経路に依存する。例えば、髄腔内または脳内投与の場合、１μｌ～１０μｌまたは１０μｌ～１００μｌの範囲の体積を使用することができる。静脈内投与の場合、１０μｌ～１００μｌ、１００μｌ～１ｍｌ、１ｍｌ～１０ｍｌ、またはそれ以上の範囲の体積を使用することができる。場合によっては、対象当たり約１０^１０～１０^１２のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。特定の実施形態において、対象当たり約１０^１２のｒＡＡＶゲノムコピーが、ＣＮＳ組織を標的とするのに効果的である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、対象当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５ゲノムコピーの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは１ｋｇ当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４ゲノムコピーの用量で投与される。

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、特に高濃度のｒＡＡＶが存在する場合（例えば、約１０^１３ ＧＣ／ｍｌ以上）、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等が挙げられる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ Ｆ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，１７１－１７８（参照によりその内容が本明細書に組み込まれる）を参照）。

本明細書に記載の特定の組成物を様々な治療計画で使用するための適切な投薬および治療計画の開発と同様に、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の有効成分を含み得るが、活性成分（複数可）のパーセンテージは当然変更されてもよく、好都合には全製剤の重量または体積の約１または２％～約７０％または８０％以上である。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性成分の量は、適切な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるようも調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、および他の薬理学的考慮事項等の要因は、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投薬量および治療計画が望ましい場合がある。

注射用途に適した医薬品形態は、滅菌水溶液、または滅菌注射液もしくは分散液の即時調製のための分散剤および滅菌粉末を含む。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。多くの場合、その形態は滅菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性である。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。

注射用水溶液の投与の場合、例えば、溶液は必要に応じて適切に緩衝されてもよく、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は当業者に既知であろう。例えば、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの皮下点滴用輸液に添加するか、または提案された注入部位に注射することができる（例えば、''Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ'' １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照）。宿主の状態に応じて、投与量に多少の変動が必然的に起こる。投与責任者は、いずれにしても、個々の宿主に適切な用量を決定する。

滅菌注射液は、必要に応じて、本明細書に列挙される他の様々な成分とともに必要量の活性ｒＡＡＶを適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、活性成分に加えて、予め滅菌濾過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。

本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物はまた、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基からも誘導することができる。製剤化されると、溶液は、投与製剤に適合する様式で、かつ治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射液、薬物放出カプセル等の様々な剤形で容易に投与される。

本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。補助的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときにアレルギー反応または同様の有害な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。

リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルは、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。特に、ｒＡＡＶベクターによって送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子等のいずれかにカプセル化して、送達のために製剤化され得る。

そのような製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入に好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に知られている。最近、血清安定性および循環半減期が改善されたリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号）。

リポソームは、通常は他の手順によるトランスフェクションに抵抗性である多くの細胞型とともに順調に用いられてきた。さらに、リポソームには、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡの長さの制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療薬、ウイルス、転写因子、およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されてきた。さらに、リポソーム媒介性の薬物送達の有効性を調べるいくつかの臨床試験が成功裏に完了している。

リポソームは、水性媒体に分散されたリン脂質から形成され、自発的に多層同心二分子膜小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般に２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含む、直径２００～５００Åの範囲の小単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。

あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは通常、物質を安定かつ再現可能な様式で封じ込めることができる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を回避するために、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解できるポリマーを使用して設計するべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。

上記の送達方法に加えて、以下の技術も、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替方法として企図される。ソノフォレシス（すなわち、超音波）が使用されており、循環系への、および循環系を介した薬物透過の速度および有効性を高めるためのデバイスとして米国特許第５，６５６，０１６号記載されている。企図される他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。
ｒＡＡＶ組成物の送達に関連する一般的な方法

本発明は、ｒＡＡＶビリオンを含む安定な医薬組成物を提供する。組成物は、凍結／解凍サイクルに供された場合、およびガラスを含む様々な材料で作られた容器に保存された場合であっても、安定かつ活性な状態を維持する。

目的の異種ヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶビリオンは、遺伝子送達のために、例えば、遺伝子治療用途において、トランスジェニック動物の作成のために、核酸ワクチン接種、リボザイムおよびアンチセンス治療において等、ならびに様々な細胞型へのインビトロでの遺伝子送達のために使用することができる。

一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロのいずれかの形質導入技術を用いて対象の細胞に導入される。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエント細胞は対象から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系細胞または異種細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。

形質導入された細胞を対象に送達および導入するための適切な方法が記載されている。例えば、細胞は、例えば適切な培地で、組換えＡＡＶビリオンを細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲ等の従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、目的のＤＮＡを保持する細胞をスクリーニングすることによってインビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞は、後にさらに十分に説明する医薬組成物に製剤化され得、該組成物は、例えば、カテーテルを使用して、または臓器に直接、筋肉内、静脈内、動脈内、皮下および腹腔内注射、または平滑筋への注射等の様々な経路で対象に導入される。

インビボ送達の場合、ｒＡＡＶビリオンは医薬組成物に製剤化され、一般に非経口的に、例えば、骨格筋への直接的な筋肉内注射によって、関節内に、静脈内に、または臓器に直接的に投与される。

適切な用量は、他の要因の中でも、治療される対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、治療される対象の年齢および全身状態、治療される状態の重症度、ｒＡＡＶビリオンの投与様式に依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。

したがって、「治療有効量」は、臨床試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に入る。例えば、インビボ注射、すなわち対象への直接注射の場合、治療有効用量は、約１０^５～１０^１６のｒＡＡＶビリオン、より好ましくは１０^８～１０^１４程のｒＡＡＶビリオンである。インビトロ形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０^５～１０^１３、好ましくは１０^８～１０^１３のｒＡＡＶビリオン程である。組成物が、対象に戻される形質導入細胞を含む場合、医薬組成物中の形質細胞の量は、約１０^４～１０^１０細胞、より好ましくは１０^５～１０^８細胞であろう。当然のことながら、用量は、形質導入の効率、プロモーター強度、メッセージの安定性およびそれによってコードされるタンパク質等に依存する。有効投与量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通じて当業者によって容易に確立され得る。

投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであってもよい。さらに、対象は、必要に応じて多くの用量を投与されてもよい。したがって、対象は、例えば、単回投与で１０^５～１０^１６ｒＡＡＶビリオン、または集合的に、例えば、１０^５～１０^１６ｒＡＡＶビリオンの送達をもたらす２、４、５、６またはそれ以上の用量で与えられてもよい。当業者は、投与する用量の適切な回数を容易に決定することができる。

したがって、医薬組成物は、目的のタンパク質の治療有効量、すなわち問題の病状の症状を軽減もしくは改善するのに十分な量、または所望の利益をもたらすのに十分な量を産生するのに十分な遺伝物質を含む。そのため、ｒＡＡＶビリオンは、１回または複数回の用量で投与された場合に治療効果を提供するのに十分な量で対象組成物中に存在する。ｒＡＡＶビリオンは、凍結乾燥調製物として提供され、即時または将来の使用のためにビリオン安定化組成物に希釈され得る。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、製造直後に提供され、将来の使用のために保存されてもよい。

医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含む。そのような賦形剤は、それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール等の液体を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩がそれに含まれてもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が、そのようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容される賦形剤の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）から入手可能である。

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、特定の核酸配列、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるように増幅される手順または技術を指す。一般に、関心領域の末端またはその向こう側からの配列情報を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対側の鎖と配列が同一であるかまたは類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致する可能性がある。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列を増幅するために使用することができる。一般的にＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，（１９８９）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の例の１つであると考えられるが、唯一の例ではなく、該方法は、核酸の特定の断片を増幅または生成するために、プライマーとしての既知の核酸および核酸ポリメラーゼの使用を含む。
核酸

本発明はまた、本明細書に記載のαＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質をコードする特定の構築物および核酸を含む。配列番号１および配列番号２４を含む配列リストに列挙される選択された配列を含む特定の構築物および配列は、本発明の実施形態において有用であり得る。

好ましくは、核酸は、低、中、または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、生物学的機能を維持するαＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質をコードする。第１の核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第２の核酸分子にアニールすることができる場合、第１の核酸分子は第２の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ホルムアミドなし、または４２℃で３０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む。典型的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、４２℃で、４０％ホルムアミド、５Ｘまたは６Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、４２℃または任意選択的により高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５°または６８℃）で、５０％ホルムアミド、５Ｘまたは６ＸＳＳＣである。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣ１および０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、核酸がハイブリダイズできるストリンジェンシーは高くなる。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための方程式が導き出されている（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０～９．５１を参照）。より短い核酸、例えばオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１１．７～１１．８を参照）。

αＬＮＮｄΔＧ２’マウスポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。αＬＮＮｄΔＧ２’ヒトポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、図９に示されるように、マウスポリペプチドと８７％の同一性を有する。アルゴリズムのパラメーターがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較が行われる場合、本明細書（配列番号２１～２２）に提供されるαＬＮＮｄΔＧ２’アミノ配列と少なくとも約９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含むαＬＮＮｄΔＧ２’ポリペプチドが、ラミニン重合機能の回復に関して企図される。アルゴリズムのパラメーターがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較が行われる場合、参照αＬＮＮｄΔＧ２’アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約９０％類似し、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドも、本発明の構築物および方法に含まれる。

配列同一性は、２つの配列を最適に整列させたときに、２つのポリペプチドのアミノ酸が同等の位置で同じである程度を指す。配列の類似性は、同一の残基と、同一でない、生化学的に関連するアミノ酸を含む。類似した特性を共有し、互換性であり得る生化学的に関連するアミノ酸については上で論じている。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列間の、または２つのポリペプチド配列を最適に整列させたときのそれらの間の配列類似性を指す。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較される位置の総数で割り、１００を掛けたものである。例えば、配列を最適に整列させたときに、２つの配列の１０の位置のうち６つがマッチするかまたは相同である場合、その２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、最大パーセント相同性を得るように２つの配列を整列させたときに行われる。。

以下の参考文献は、配列分析によく使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関連している：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，''Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．'' ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５－３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，''Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．'' ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．'' Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３－３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９；ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．''Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．'' ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７）ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

本発明はまた、様々な核酸を含む発現ベクターも提供し、ここで、核酸は、宿主細胞がベクターでトランスフェクトされると宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結される。また、組換えＡＡＶ－ＤＪおよび特定のＡＡＶ－２配列、ならびにＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの指示下でαＬＮＮｄΔＧ２’を発現させるための核酸配列を含むビリオンも提供される。サイズが小さく、良好な発現を伴う高い活性を有するならば、代替のプロモーターを使用することができる。これらの構築物内で、ｒＡＡＶ２配列は５’および３’ＩＴＲ配列、例えば、配列リストに記載される配列番号１１および１６ならびに他の配列に対応する。本発明においてラミニンα－２欠損に治療効果のあるビリオンを形成するために、これらの配列をＡＡＶ－ＤＪキャプシドでパッケージングした。
医薬組成物および投与

本発明の組成の医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、ＡＡＶ－ＤＪベクターまたは関連する組成物を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ（１９８４）を参照されたい。

治療薬および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液もしくは懸濁液の形態で許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。

単独でまたは他の薬剤と組み合わせて投与される治療用組成物の毒性および治療効果は、例えば ＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療効果のある量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法によって決定できる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）である。特定の態様では、高い治療指数を示す治療用組成物が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータはヒト用途の投与量の範囲を処方するのに使用され得る。そのような化合物の投与量は、ほとんどまたはまったく毒性のないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。

本発明の一実施形態において、本発明の組成物は、医薬品便覧２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ； 第５７版（２００２年１１月１日））に従って対象に投与される。

投与方法は異なり得る。適切な投与経路は、経口、直腸、経粘膜、腸管内、非経口、筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、送気、局所、皮膚、経皮、または動脈内を含む。

特定の実施形態において、組成物または治療薬は注射等の侵襲的経路によって投与することができる（上記参照）。本発明のさらなる実施形態において、組成物、治療薬またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（例えば関節炎の関節に）、腫瘍内、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口で；例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤で）による投与もまた本発明の範囲内である。

組成物は、当該技術分野において公知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、例えばプレフィルドシリンジまたは自己注射器を含む皮下注射針を用いた注射により投与することができる。

本発明の医薬組成物は、例えば米国特許第６，６２０，１３５号；６，０９６，００２号； ５，３９９，１６３号； ５，３８３，８５１号； ５，３１２，３３５号； ５，０６４，４１３号； ４，９４１，８８０号； ４，７９０，８２４号または ４，５９６，５５６号に開示されている装置等の無針皮下注射装置を用いて投与してもよい。

あるいは、ＡＡＶ－ＤＪベクターまたは関連化合物を、全身的にではなく局所的に、例えば、しばしばデポ製剤または徐放性製剤として、所望の標的部位に直接注射することにより投与してもよい。さらに、標的薬物送達系において、例えば、脳を標的とする、例えば、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームにおいて、組成物を投与することができる。リポソームは、所望の組織に標的化され、所望の組織によって選択的に取り込まれるであろう。

投与計画は、治療用組成物の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、および生体マトリックスにおける標的細胞の近接性を含むいくつかの要因に依存する。好ましくは、投与計画は、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えながら、標的病態の改善に影響を与える十分な治療組成物を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の治療用組成物および治療されている疾患の重症度に部分的に依存する。

適切な用量の決定は、例えば、治療に影響を与えることが当技術分野において公知であるかまたは疑われるパラメーターもしくは因子を用いて臨床医によって行われる。一般に、用量は最適用量より幾分少ない量で始まり、その後、任意の負の副作用に対して所望のまたは最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させる。重要な診断方法には、例えば炎症の症状または産生される炎症性サイトカインのレベルの診断法が含まれる。一般に、使用される生物製剤は、治療の標的となる動物と同じ種に由来し、それによって試薬に対する任意の免疫応答を最小限に抑えることが望ましい。

本明細書中で使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、障害と関連する症状の発症の延期および／またはそのような障害の症状の重症度の低下を含む。当該用語はさらに、既存の管理されていないまたは望ましくない症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、およびそのような症状の根本的な原因を改善または防止することを含む。従って、当該用語は、障害、疾患または症状を有する、またはそのような障害、疾患または症状を発症する可能性を有する脊椎動物対象に有益な結果が付与されたことを示す。

本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」は、単独でまたはさらなる治療薬と組み合わせて細胞、組織または対象に投与されたときに、疾患もしくは状態の１つ以上の症状において、またはそのような疾患もしくは状態の進行において測定可能な改善をもたらすのに効果的である、本発明のｒＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’ベースの化合物の量を指す。治療有効用量はさらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば、治療、治癒、予防もしくは関連する病状の改善、または治療率、治癒、予防もしくはそのような症状の改善の増加をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される活性成分を個体に適用したときは、治療有効用量はその成分単独を指す。組み合わせに適用される場合、治療有効用量は、併用、連続的投与、または同時投与にかかわらず治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を指す。有効量の治療薬は、少なくとも１０％、通常少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の診断尺度またはパラメーターの改善をもたらすであろう。疾患重症度を評価するために主観的尺度が用いられる場合、有効量はまた主観的尺度の改善ももたらし得る。
キット

本発明はまた、キットの形で本発明の組合せの成分を含むキットを提供する。本発明のキットは、限定されないが、本明細書に記載される薬学的に許容される担体および／または化学療法薬を含む１つ以上のさらなる成分と合わせて、限定されないが、本明細書で論じられるｒＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’ベースの化合物を含む１つ以上の成分を含む。ｒＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’ベースの化合物もしくは組成物および／または治療薬は、純粋な組成物として、または医薬組成物中に薬剤的に許容される担体と組み合わせて製剤化され得る。

一実施形態において、キットは、１つの容器（例えば、滅菌したガラスまたはプラスチックバイアル中）に本発明のｒＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’ベースの化合物／組成物またはその医薬組成物、ならびに別の容器（例えば、滅菌したガラスまたはプラスチックバイアル中）にその医薬組成物および／または化学療法薬を含む。

本発明の別の実施形態において、キットは、任意選択的に、単一の共同容器中に、任意選択的に、一緒に製剤化される１つ以上の化学療法薬成分と組み合わせて、薬学的に許容される担体とともにｒＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’ベースの化合物を含む、本発明の組み合わせを含む。

キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、キットはそのような投与を行うための装置を含むことができる。例えば、キットは、１つ以上の皮下注射針または上記のような他の注射装置を含み得る。

キットは、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含み得る。一般に、このような情報は、患者および医師が同封の医薬組成物および剤形を効果的かつ安全に使用するのを助ける。例えば、本発明の組み合わせに関する以下の情報：薬物動態、薬力学、臨床試験、効能パラメーター、適応症および用法、禁忌、警告、注意、副作用、過剰投与、適正な用量および投与、供給方法、適切な保管条件、参考文献、製造業者／販売代理店情報および特許情報が添付文書として提供されてもよい。
一般的な方法

分子生物学の標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ｗｕ（１９９３） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｖｏｌ． ２１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に記載されている。標準的な方法はまた、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載するＡｕｓｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ．１－４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹにも出ている。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製の方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． １， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ＮＹ， ｐｐ． １６．０．５－１６．２２．１７； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｃｏ．（２００１） Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； ｐｐ． ４５－８９； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１） ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐｐ． ３８４－３９１を参照）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成、精製、および断片化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、上記参照）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
実施例
実施例１
ＡｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ（αＬＮＮｄΔＧ２’）構構築物開発

αＬＮＮｄ ｐｃＤＮＡ３．１ ＺｅｏにおけるＧ２ナイドジェン－１ドメインの除去は、オーバーラップＰＣＲで達成された。ＰＣＲの第１ラウンドで、１．２Ｋｂ－５’（Ｆ１ｎｏＧ２ １Ｆ ５’－ｃｔｇｇｇｔｃａｃｔｇｔｃａｃｃｃｔｇｇ－３’（配列番号２）およびｎｏＧ２ ２Ｒ ５’－ａｔｇｇａｔｔｃｔｇａａｇａｃａｇａｃａｃｃａｇａｇａｃａｃ－３’（配列番号３））および１．８Ｋｂ－３’（ｎｏＧ２ ２Ｆ ５’－ｃｔｇｇｔｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇａａｔｃｃａｔｇｃｔａｃ－３’（配列番号４）およびＦ１ｎｏＧ２ １Ｒ ５’－ｇａａｇｇｃａｃａｇｔｃｇａｇｇｃｔｇａｔｃａｇ－３’（配列番号５））生成物をαＬＮＮｄのＧ２ナイドジェン１ドメインの両側に作製した。それらを第２ラウンドのＰＣＲ（Ｆ１ｎｏＧ２１ＦおよびＦ１ｎｏＧ２１Ｒ）と一緒に３Ｋｂの産物に縫い付け、ＥｃｏＲＩで２．４Ｋｂに消化し、５．８５ＫｂのＥｃｏＲＩ αＬＮＮｄ ｐｃＤＮＡ ３．１ ｚｅｏベクターにライゲーションした（８．２５Ｋｂ ｎｏＧ２ αＬＮＮｄ ｐｃＤＮＡ３．１ ｚｅｏプラスミドを作製）。オーバーラップＰＣＲ用プライマー（Ｂａｍ ｓｈｎｏＧ２ １Ｆ ５’－ｃｇｇｃａｇｃｃｔｇａａｔｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｔａｇａ－３’（配列番号６）およびｓｈｎｏＧ２ ２Ｒ ５’－ｃａｃａｇｔａｇｔｔｇａｔｇｇｇａｃａｇａｃａｃｃ－３’（配列番号７））および３’（ｓｈｎｏＧ２ ２Ｆ ５’－ｇｔｃｔｃｔｇｇｔｇｔｃｔｇｔｃｃｃａｔｃａａｃｔａ－３’（配列番号８）およびｓｓｅ ｓｈｎｏＧ２ １Ｒ ５’－ｇａｇｇｃａｃａａａｃａｔｃｃｃｃｔｇｃａｇｇｇｔｇｇｇｃｃ－３’（配列番号９）を用いてｎｏＧ２ αＬＮＮＤのさらなる２ＥＧＦ（２７０ｂｐ）欠失を行い、それぞれ１６０ｂｐおよび３５７ｂｐの産物を生成した。第２ラウンドのＰＣＲ後、４８５ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳｂｆＩで消化したインサートを、同様に消化したｎｏＧ２ αＬＮＮｄ ｐｃＤＮＡ３．１ ｚｅｏベクター（７．５Ｋｂ）にライゲーションした。短いｎｏＧ２αＬＮＮｄオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端Ｍｙｃタグを除去するために、１．５Ｋｂ ＢａｍＨＩインサートをＦ３－８ｍｃｋ－ｐＡ構築物からＭＣＳ－ＡＡＶベクター（４．６Ｋｂ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＶＰＫ－４１０－ＤＪ）に移動し、６．１Ｋｂ ＡＡＶ－５’Ｆ１タグなし－１０プラスミドを生成した。短いｎｏＧ２ αＬＮＮＤ ｐｃＤＮＡ３．１ ｚｅｏプラスミドをＦｓｅＩおよびＸｈｏＩで消化して２．８ Ｋｂインサートを作成し、同様に消化したＡＡＶ－５’Ｆ１タグなし－１０ベクター（４．９Ｋｂ）にライゲーションした。最終的なベクターサイズは、３００９ｂｐ（配列番号１）のａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔ（αＬＮＮｄΔＧ２’）のＯＲＦを含めて７．７Ｋｂであった。
実施例２
ＡＡＶウイルスの生成

αＬＮＮｄΔＧ２’－ＭＣＳプラスミドを、リン酸カルシウム一過性トランスフェクションの一般的な方法を使用して、ＡＡＶ－ＤＪ ｐＨｅｌｐｅｒ ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（それぞれ配列番号１、１７、２０：図６～図８）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに接着ＨＥＫ２９３に１：１：１の比率でトリプルトランスフェクトした。簡単に述べると、製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号ＣＡＰＨＯＳ）に従って、１２．５ｕｇ／１５０ｍｍ皿（プレップあたり１０～１５０ｍｍ皿）を７５％コンフルエントなＨＥＫ２９３細胞に一晩かけて加えた。ＡＡＶｐｒｏ精製キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、カタログ番号６６６６）を用いて、９６時間後に培養物からウイルスを回収した。細胞の凍結融解またはＴｒｉｔｏｎ－１００溶解、それに続くＰＥＧ８０００および／または塩化セシウム遠心分離を含む、代替の精製方法が利用可能である。ウイルス力価は、リアルタイムＰＣＲ（ＡＡＶｐｒｏ滴定キット、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、カタログ番号６２３３）を用いて決定した。
実施例３
ＡＡＶで生成したαＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質の発現および分析

安定してトランスフェクトされた４１１ ＨＥＫ２９３細胞を、約６ｘ１０ｖｇ／６ウェル皿で感染させた。４日後、室温で１時間のａ－ｆｌａｇアガロースビーズを用いた免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によって馴化培地を評価した。ウエスタンブロットを切り取り、１ｇ／ｍｌの抗フラッグ（上）または抗Ｇ２－Ｇ２ナイドジェン（下）で染色した。結果を図５Ａに示す。さらに、馴化ＡＡＶ ４１１ ＨＥＫ２９３培地を高継代ラットシュワン細胞に１時間添加し、１ｕｇ／ｍｌニワトリ抗α４および１：１００抗ニワトリＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号Ａ－２１４４９）を使用して、免疫蛍光法により４１１ラミニンアセンブリについて分析した。図５Ｃおよび５Ｄに示すように、Ｌｍ４１１アセンブリの大幅な増加は、ＡＡＶで生成されたαＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質に起因していた。

ＡＡＶαＬＮＮｄΔＧ２’（ウイルス、約２５μｌで１０^１０ｖｇ）またはＰＢＳバッファを１週齢のｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋｍａｇマウスに筋肉内注射した。２週間後、大腿四頭筋を採取し、切片化し、抗体で染色して、図５Ｅに示すαＬＮＮｄΔＧ２’（赤）とラミニン（緑）を検出した。αＬＮＮｄΔＧ２’の∞１ＬＮエピトープが四肢筋組織で検出され、リンカーが筋細胞膜に組み込まれたことが示唆された。
実施例４
症状を示すマウスにラミニンα２を戻す

アグリンの小型化形態（図３Ｂ）であるｍａｇ導入遺伝子（配列番号２３）を発現するｄｙ３Ｋ／ｄｙ３ＫマウスへのＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’構築物の注射、およびαＬＮＮｄ導入遺伝子を発現するｄｙ３Ｋ／ｄｙ３ＫマウスへのＡＡＶ－ＤＪ－αＬＮＮｄΔＧ２’構築物の注射を行って、ペアのリンカータンパク質の安定した既に特徴付けられた発現と併せて一度に１つのウイルス感染を評価し、各リンカータンパク質を個別に検証することで変動を最小限に抑える。最初の分析は筋肉に対して行われ、ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７（３）：１０７５－１０８９；Ｒｅｉｎｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３９６）に記載されている特定のリンカーおよびラミニン抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法を使用して、注射後の神経発現の程度および発現の持続性にしたがって、どの筋肉にαＬＮＮｄΔＧ２’およびｍａｇが多く存在するかを決定する。

最初の分析の評価にしたがって、ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋマウスを両方のウイルス調製物に同時感染させる。注射は、ミエリン形成の周産期の時間経過を考慮して、出生後１日目または２日目に行われる（生後１週間で実質的に発生する放射状の選別により、出生前にＳＣ増殖が開始する）。行われる表現型および組織学の分析は以下を含む：（１）生存率、体重、筋肉重量、垂直格子上での時間、握力、および異なる年齢での全体的な行動の測定、（２）横隔膜、肋間筋および横隔神経の検査、（３）Ｈ＆ＥおよびＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ（コラーゲン）による骨格筋の分析：繊維のサイズ、数、再生（中心核を有する筋線維の割合）、炎症および線維症の形態計測的定量化による、異なる年齢での前肢橈側手根伸筋および横隔膜／肋間筋の組織学染色、（４）以下による末梢神経分析：免疫染色された神経および神経根を調べてリンカー－ｐｒｏｔ７ｅｉｎ発現の程度を推定し、ラミニンサブユニットにおける相対的な変化を検出する；電子顕微鏡を使用してメチレンブルー染色された半薄切片を調べ、軸索の分類、ミエリン形成、ミエリンの厚さ、および裸の軸索の割合を定量的に評価する；ＥｄＵ／ｄａｐｉ比からＳＣ増殖を決定し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してミエリン形成の成熟を評価する（例えば、Ｏｃｔ６、Ｓｏｘ２、ｃＪｕｎ）。

分析の結果は、送達を最適化し、機能をさらに改善する可能性のあるαＬＮＮｄΔＧ２’およびｍａｇリンカータンパク質の変異体を評価するために使用される。
実施例５
変異血清型キャプシドを有するＡＡＶによるαＬＮＮｄΔＧ２’の発現

組織の特異性（例えば、骨格筋と心臓または主に肝臓のみ）を変更する目的で、異なるキャプシド血清型または複合血清型をコードするＡＡＶベクターにαＬＮＮｄΔＧ２’ＤＮＡを挿入する。注：αＬＮＮｄΔＧ２’は、合成部位が標的細胞型である必要がない可溶性分泌タンパク質である。
実施例６
ユビキチン化を低下させるように修飾されたＡＡＶキャプシド配列

ＡＡＶ－ＤＪは、他のＡＡＶと同様に、キャプシドにいくつかのリン酸化部位およびユビキチン化部位を含む。Ｋ１３７Ｒ、Ｓ５０３Ａ、およびＴ２５１Ａでのｒｅｐ／ｃａｐプラスミドの点突然変異は、インビトロおよびインビボでタンパク質発現を大幅に増加させることが分かった（Ｍａｏ，Ｗａｎｇ，Ｙａｎ，Ｌｉ，Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｌｉ，２０１６， “Ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ －ＤＪ ｃａｐｓｉｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１－８に記載されている）。ＡＡＶプラスミドは、この改善を導入するように容易に修飾することができる。
実施例７
特殊なプロモーターを使用したＡＡＶによるαＬＮＮｄΔＧ２’の発現

αＬＮＮｄΔＧ２’ＤＮＡを、（ａ）特異性の変更および／または（ｂ）インサートの許容可能なオープンリーディングフレームの増加といった効果を有する異なるプロモーター／エンハンサーを用いてＡＡＶベクターに挿入する。骨格筋および心臓におけるマイクロジストロフィンの発現を促進するために使用される例は、筋クレアチンキナーゼ遺伝子の基礎プロモーターおよび上流エンハンサーから改変された４３６ｂｐ ＣＫ８ｅプロモーター／エンハンサーである。ＣＫ８ｅプロモーター／エンハンサーは、Ｊ．Ｎ．Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２７：６２３－６３５に記載されている。
実施例８
代替シグナル配列を有するＬｍα１ＬＮＮｄΔＧ２’の発現

タンパク質αＬＮＮｄΔＧ２’および関連タンパク質は、配列番号２５のヌクレオチド配列を有し、かつ下の表２で文字コードＡが与えられているＢＭ－４０シグナル配列を使用して、インビトロおよびマウスで発現されている。代替方法は、配列番号２７のヌクレオチド配列を有し、かつ表２で文字コードＡ’が与えられている内因性α１サブユニットシグナルペプチドでタンパク質を発現させることである。

表２は、ＢＭ－４０シグナルペプチド、または通常、ラミニンＮ末端サブユニットの前にあるラミニン内因性シグナルペプチドのいずれかとともに使用できる、文字コードが割り当てられた全ての変異タンパク質配列のリストを提供する。これらのドメインを使用して、ラミニン重合を可能にするリンカータンパク質を作製することができる。重合を可能にするラミニン結合リンカータンパク質および内部的に縮小されたサイズのリンカータンパク質のマウスドメインには、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の両方について文字コードＡ、Ａ’～Ｐが割り当てられている（配列番号２５～５８）。代替のＮ末端ドメイン、マウスおよびヒトには、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の両方について文字コードＱ～Ｚおよびａ～ｂが割り当てられている（配列番号５９～１０６）。追加のＣ末端ドメイン、重合リンカータンパク質のナイドジェンラミニン結合Ｇ３ドメインに（５’から）Ｃ末端を融合できるマウスおよびヒトの非神経アグリンジストログリカン結合ドメインには、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の両方について文字コードｃ～ｊが割り当てられている（配列番号１０７～１３８）。

表３は、表２に列挙される変異タンパク質配列のそれぞれについて、マウスおよびヒトのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供し、配列リストでこれらの配列に割り当てられている配列番号を提供する。

実施例９
機能強化のためのＬｍαＬＮＮｄΔＧ２’の簡略化と修飾

現在評価されているＡＡＶ－ＤＪ構築物には、オープンリーディングフレームを代表する３．１ｋＢのＤＮＡを含めることができる。既存または計画中の他の構築物は、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９のいずれを使用するにせよ、より大きな包含を可能にすることができる。許容されるタンパク質サイズについてＡＡＶ－ＤＪ制限を基準にすると、Ｊ．Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ ４２４：９６３－９７４に記載されるように、ＬｍαＬＮＮｄΔＧ２’のナイドジェンＧ３ドメインのサイズをプロペラドメインのサイズ（約２７０残基、８１０ｂｐ）に縮小し、ラミニン結合を保持できることに留意されたい。３９３ｂｐの減少によりドメインの再配置が可能になり、Ｇ２のＩＶ型コラーゲンおよびパールカン結合ドメインを含めることができる。新しい配置では、ラミニンの重合をコラーゲン／パールカンの結合と組み合わせることができる。例として、（ａ）αＬＮＮｄＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ（３．０８ｋＢ）および（ｂ）αＬＮＮｄＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ－２（３．０２ｋＢ）が挙げられる。これらのそれぞれのドメイン構成を、表２に提供した文字ドメインコーディングを使用して下の表４に示す。ドメイン構成に使用されるドメインのヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、表３および配列リストに提供される。別の配置では、ラミニン重合をジストログリカン結合と組み合わせることができ、その例は、αＬＮＮｄＰｒｏｐｅｌｌｅｒＡｇｒｉｎＬＧ（３．６ｋＢ）である。αＬＮＮｄＰｒｏｐｅｌｌｅｒＡｇｒｉｎＬＧのドメイン構成を、表２に提供した文字ドメインコーディングを使用して下の表４に示す。ドメイン構成に使用されるドメインのヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、表３および配列リストに提供される。

^７ ＤＮＡオープンリーディングフレームインサートは、指定の配列にライゲーションしたＤＮＡドメインセグメントからなる
^８ ＬＥおよびその他のＥＧＦ様ドメインは、ドメイン間スペーサーとして機能し、構築物内で置換可能と考えられる

実施例１０
重合欠陥のある他のラミニンの修復

ピアソン症候群は、眼の異常を伴う先天性ネフローゼ症候群であり、早期の末期腎疾患、失明および死をもたらす。原因は、ラミニンβ２サブユニットをコードするＬＡＭＢ２遺伝子のヌル、インフレーム削除、またはミスセンス変異である。これらの変異は、サブユニットの発現を妨げるか、またはサブユニットの特性を変更する。ミスセンス変異のいくつかは、β２ＬＮドメインにクラスター化される（Ｍａａｔｅｊａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３８：９９２－１００２およびＫ．Ｋ．ＭｃＫｅｅ，Ｍ．Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖａ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，２０１８，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７：３２－４６を参照）。ＬＮドメインはラミニンの重合を媒介する。これらの変異の影響として考えられるのは、低／非分泌型であり得るドメインをフォールディングできないことと、変異体を重合できないことである。ピアソン症候群の２つの高度に保存された変異体（Ｓ８０ＲおよびＨ１４７Ｒ）をβ１サブユニット（Ｓ６８ＲおよびＨ１３５Ｒ）に配置した後でそれらを評価した。どちらの変異も重合を大幅に減少させ、βＬＮＮｄ（β１ＬＮ－ＬＥａドメインがナイドジェンＧ３との融合においてβ１ＬＮ－ＬＥａと交換された）は、ラミニンがβＬＮドメインを欠いていたために重合できなかった組換えラミニンを救済できることが分かった（Ｋ．Ｋ．ＭｃＫｅｅ，Ｍ．Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖａ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，２０１８，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７：３２－４６に記載）。βＬＮＮｄは、ピアソンの欠陥をインビトロで修復することができるため、より短いβＬＮＮｄΔＧ２を使用して疾患を治療できることになる。同様に、重合に影響を与えるラミニンＬＮ変異による他の疾患は、対応するＬＮ－ＬＥａセグメントが融合タンパク質のα１ＬＮ－ＬＥａセグメントに置き換わった関連するラミニンリンカータンパク質の発現によって治療可能であると予想される。これらのタンパク質（βＬＮＮｄΔＧ２’、βＬＮＮｄＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ、γＬＮＮｄΔＧ２’、およびγＬＮＮｄＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ）は、表３および配列リストに提供されるドメイン構成で用いられたドメインの配列とともに、表２および４のドメイン構成によって説明される。
実施例１１
ジストログリカン結合活性のαＬＮＮｄΔＧ２への直接付加

完全なＧ３ドメイン複合体の代わりに、ナイドジェンプロペラドメインを採用すると、（許容されるＡＡＶインサートのサイズとの関連から）ジストログリカン結合ドメインを付加する余地が生まれる。このタンパク質はαＬＮＮｄΔＧ２ＰｒｏｐｅｌｌｅｒＡｇｒｉｎＬＧと称される。ドメイン構成は、表３および配列リストに提供されるドメイン構成で用いられたドメインの配列とともに、表２および４のドメイン構成に示される。この場合、サイズが大きくなると、標準的なＡＡＶ－ＤＪウイルスにおける使用が妨げられ、より小さなＣＫ８ｅプロモーターを含むもの等の、より大きなインサートを許容するウイルスが必要となる。
実施例１２
非経口注射によるタンパク質の送達

ＬｍαＬＮＮｄΔＧ２’タンパク質およびその代替形態のいずれかを非経口的に注射して（腹腔内、血管内、筋肉内経路）、ウイルスによって送達される体細胞遺伝子治療の代替として、タンパク質を目的の組織標的に送達することができます。
構築物のコドン最適化

製造プロセス中のウイルス力価を低下させる手段としてだけではなく、高濃度のウイルスに関連する安全性の懸念にも対応するように本明細書に記載の試験構築物の発現を最適化するために、αＬＮＮｄΔＧ２’導入遺伝子は、自由に利用可能なソフトウェアを使用したコドン最適化プロセスを用いて評価される（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）。さらに、必要に応じてコンセンサスコザックシーケンスが構築物に導入される。したがって、本明細書に記載される構築物または要素のいずれも、この様式でコドン最適化され得る。修飾された構築物のそれぞれは、マウスにおいて親構築物と並行して試験される。簡単に述べると、構築物は側頭静脈を介して仔マウスに全身投与される。次いで、動物を２週間または３週間後に安楽死させ、各構築物からのタンパク質のレベルをＱ－ＰＣＲおよびウエスタンブロット法によって決定する。最も迅速で高レベルの発現をもたらす構築物は、非ヒト霊長類研究における、また最終的にはヒト患者の臨床試験における最終的な使用について検討される。
実施例１３
ＬＥおよびＥＧＦスペーサードメインの除去によるリンカータンパク質サイズの縮小

ＬＥａ１ドメインはＬＮドメインの分泌に必要であり、すべてのＥＧＦドメインを除去すると、ラミニンへのＴｙＧ３ｐｒｏｐｅｌｌｅｒＥＧＦ６（「Ｇ３」ドメイン複合体）の結合が大幅に減少するが、介在するラミニンタイプＬＥおよびナイドジェンＥＧＦドメインを除去して、コラーゲン－ＩＶおよびパーレカンに結合するナイドジェンＧ２ドメインを含めることができる。これを、培養筋管でのラミニンアセンブリのリンカータンパク質メディエーションの結果を示す図１６に示す。

融合したＣ２Ｃ１２筋管の生地を調製した。非重合ラミニン（Ｌｍα１ΔＬＮ－ＬＥａ）を、１４ｎＭのコラーゲン－ＩＶ（Ｃ４）±２８ｎＭのナイドジェン－１（Ｎｄ）とともに、２８ｎＭαＬＮリンカータンパク質あり、またはなしで、２８ｎＭで筋管の培地に添加した。インキュベーション後（３７℃）、細胞を洗浄し、固定し、γ１ラミニン特異的抗体でインキュベートし、二次蛍光タグ付き抗体に続く。洗浄後、デジタルカメラを備えた蛍光顕微鏡で画像を記録した。７つ以上の１０ｘフィールドからの画像をＩｍａｇｅＪで分析して、フィールドごとの蛍光の合計を決定した。リンカータンパク質コードについては表４を参照のこと。リンカータンパク質αＬＮＮｄ（図１６では［１］として示される）、αＬＮＮｄΔＬＥａ３，４（図１６では［２］として示される）、αＬＮＮｄΔＧ２’（図１６では［３］として示される）、およびαＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’（図１６では［４］として示される）はすべて、非重合ラミニン対象群と比較して、筋管表面で実質的かつ有意に増加したラミニンを示した。縮小サイズのリンカータンパク質のいくつかは、非重合ラミニンで得られたものと比較して、筋管上のラミニンアセンブリの２倍の増加を示した。
実施例１４
ラミニンへのリンカータンパク質結合について内因性ナイドジェン競合の可能性

内因性ナイドジェン－１は、キメラリンカータンパク質と同じラミニン結合部位（Ｌｍγ１ＬＥｂ３）を活用する。これにより、ラミニン結合中のリンカーナイドジェン競合が可能になり、ラミニン占有の程度が減少する可能性がある。しかし、αＬＮＮｄは、ｄｙ２Ｊマウスモデルの非重合ラミニンに十分に結合してジストロフィーを改善し、おそらく重合活性を獲得するという理由から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合実験で見られるように、リンカータンパク質に有利に働くことが見出されている（ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ． ２０１７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２７： １０７５－１０８９）。等モルおよびモル過剰のナイドジェン－１の存在下で筋管上のラミニンアセンブリを増加させるために、２つの縮小サイズのリンカータンパク質を比較し、より良くはないにしても類似していることが分かった。これを図１７Ａ～図１７Ｃに示す。同図は、選択されたリンカータンパク質に対するナイドジェン競合、およびＣ２Ｃ１２筋管上の３つのリンカータンパク質とナイドジェン-１との間の競合を示す。

αＬＮリンカータンパク質は、Ｌｍγ１におけるナイドジェン－１と同じ遺伝子座に結合し、２つのタンパク質がラミニン結合をめぐって競合するという予測につながる。Ｃ２Ｃ１２筋管は異なる比率のリンカー、即ち、αＬＮＮｄ、αＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’、αＬＮＮｄＧ２’、および１４ｎＭのＩＶ型コラーゲンの存在下で２８ｎＭのＬｍα１ΔＬｎ－Ｌ４ｂで共インキュベートされたナイドジェン－１（Ｎｄ）によって処理された。図１７Ａは、リンカーαＬＮＮｄ（ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬＭＮＯＰ）を使用した結果を示しす。図１７Ｂは、リンカーαＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’（ＡＢＣＤＨＩＪＮＯＰ）を使用した結果を示す。図１７Ｃは、リンカーαＬＮＮｄＧ２’（ＡＢＣＤＥＦＬＭＮＯＰ）を使用した結果を示す。非重合性ラミニンでナイドジェン／リンカー比を増加させると、筋管へのラミニン蓄積が減少し、一方、リンカー／ナイドジェン比を増加させると、ラミニン蓄積が増加した。ラミニン重合は、ナイドジェン単独よりもアセンブリにプラスに働き、リンカー修飾ラミニンに有利な蓄積を傾斜させるようである。
実施例１５
非重合Ｌｍα１ΔＬＮ－Ｌ４ｂに結合した後の細胞上の縮小サイズリンカーのアセンブリ

α１短腕重合ドメイン（Ｌｍα１ΔＬＮ－Ｌ４ｂ）を欠くラミニン１１１を含む馴化培地は、リンカータンパク質αＬＮＮｄΔ２ＥＧＦ’からＬＥａ２、ＥＧＦ３を引いたもの（ＡＢＣＨＩＪＮＯＰ）を含む馴化培地とともに一晩インキュベートされた。タンパク質の複合体を含む培地を、コラーゲン－ＩＶおよびナイドジェン－１を含む培養シュワン細胞（ラミニン／基底膜アセンブリを測定するために使用される細胞株）の単層に添加した。１時間後、この細胞を洗浄し、固定し、ラミニンγ１サブユニットについて免疫染色し、ｄａｐｉ（核）で対比染色した。図１８Ａは、シュワン細胞表面の非重合ラミニンアセンブリを示す。図１８Ｂは、タンパク質の重合機能の獲得に伴うラミニンの蓄積の増加を示す。図１８Ｃは、図１８Ａのシュワン細胞表面上の非重合ラミニンアセンブリと、図１８Ｂのタンパク質の重合機能の獲得によるラミニンの蓄積の増加との定量的比較を示す。対応するＤＮＡオープンリーディングフレームが３．２７ｋＢのリンカー（親のαＬＮＮｄが４．１５ｋＢであるのと比較して）は、細胞表面でのラミニンの蓄積を大幅に増加させ、つまり、ラミニンのアセンブリを大幅に増加させた。
実施例１６
ＣＢｈプロモーターを使用したＡＡＶ９構築物へのリンカータンパク質の挿入

ラミニン結合リンカータンパク質の修復の程度は、筋肉と末梢神経の発現レベルに依存する。リンカータンパク質をコードするｃＤＮＡのサイズが小さいほど、組織でより高い発現を達成するためのプロモーター、エンハンサー、およびその他の安定化要素を選択する自由度が高くなる。他方、プロモーター、エンハンサーおよび安定化要素の開発における最近の進歩によって、それらのサイズの縮小が可能となった。ＡＡＶキャプシドは、総ＤＮＡ量を約５ｋＢに制限する。表５は、これらの要素とリンカータンパク質の代替配置の例を示す。

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Ｇａｖａｓｓｉｎｉ， Ｂ．Ｆ．， Ｎ． Ｃａｒｂｏｎｉ， Ｊ．Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｅ．Ｒ． Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ， Ｃ． Ｔｈｏｍｓｅｎ， Ｋ． Ｓｖｅｎｓｔｒｕｐ， Ｌ． Ｂｅｌｌｏ， Ｍ．Ａ． Ｍａｉｏｌｉ， Ｇ． Ｍａｒｒｏｓｕ， Ａ．Ｆ． Ｔｉｃｃａ， Ｍ． Ｍｕｒａ， Ｍ．Ｇ． Ｍａｒｒｏｓｕ， Ｇ． Ｓｏｒａｒｕ， Ｃ． Ａｎｇｅｌｉｎｉ， Ｊ． Ｖｉｓｓｉｎｇ， ａｎｄ Ｅ． Ｐｅｇｏｒａｒｏ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｍｂ ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｕｅ ｔｏ ＬＡＭＡ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ， ２０１１．４４（５）： ｐ．７０３－９．
Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ， Ｃ．Ｇ．， Ｃ．Ｈ． Ｗａｎｇ， Ｓ． Ｑｕｉｊａｎｏ－Ｒｏｙ， Ｎ． Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ， Ｅ． Ｂｅｒｔｉｎｉ， Ａ． Ｆｅｒｒｅｉｒｏ， Ｆ． Ｍｕｎｔｏｎｉ， Ｃ． Ｓｅｗｒｙ， Ｃ． Ｂｅｒｏｕｄ， Ｋ．Ｄ． Ｍａｔｈｅｗｓ， Ｓ．Ａ． Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｂｅｌｌｉｎｉ， Ａ． Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ， ａｎｄ Ｋ．Ｎ． Ｎｏｒｔｈ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ， ２０１４．２４（４）： ｐ．２８９－３１１．
Ｃｈａｎ， Ｓ．Ｈ．， Ａ．Ｒ． Ｆｏｌｅｙ， Ｒ． Ｐｈａｄｋｅ， Ａ．Ａ． Ｍａｔｈｅｗ， Ｍ． Ｐｉｔｔ， Ｃ． Ｓｅｗｒｙ， ａｎｄ Ｆ． Ｍｕｎｔｏｎｉ， Ｌｉｍｂ ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｕｅ ｔｏ ＬＡＭＡ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ： ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ， ２０１４．２４（８）： ｐ．６７７－８３．
ＭｃＫｅｅ， Ｋ．Ｋ．， Ｄ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｃａｐｉｚｚｉ， ａｎｄ Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｒｏｌｅ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００７．２８２（２９）： ｐ．２１４３７－４７．
ＭｃＫｅｅ， Ｋ．Ｋ．， Ｄ．Ｈ． Ｙａｎｇ， Ｒ． Ｐａｔｅｌ， Ｚ．Ｌ． Ｃｈｅｎ， Ｓ． Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ， Ｊ． Ｔａｋａｇｉ， Ｋ． Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ， ａｎｄＰ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｓｃｈｗａｎｎ Ｃｅｌｌ Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， ２０１２．１２５（１９）： ｐ．４６０９－４６１９．ＰＭＣ３５００８６６
ＭｃＫｅｅ， Ｋ．Ｋ．， Ｓ． Ｃａｐｉｚｚｉ， ａｎｄ Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｆｏｒｍｉｎｇ ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｖｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌａｍｉｎｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９．２８４（１３）： ｐ．８９８４－８９９４．ＰＭＣ２６５９２５５
Ｓｍｉｒｎｏｖ， Ｓ．Ｐ．， Ｐ． Ｂａｒｚａｇｈｉ， Ｋ．Ｋ． ＭｃＫｅｅ， Ｍ．Ａ． Ｒｕｅｇｇ， ａｎｄ Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＧ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｒｌｅｃａｎ ｔｏ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｌａｍｉｎｉｎ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００５．２８０（５０）： ｐ．４１４４９－５７．
Ｃｈａｎｇ， Ｃ．， Ｈ．Ｌ． Ｇｏｅｌ， Ｈ． Ｇａｏ， Ｂ． Ｐｕｒｓｅｌｌ， Ｌ．Ｄ． Ｓｈｕｌｔｚ， Ｄ．Ｌ． Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｓ． Ｉｎｇｅｒｐｕｕ， Ｍ． Ｐａｔａｒｒｏｙｏ， Ｓ． Ｃａｏ， Ｅ． Ｌｉｍ， Ｊ． Ｍａｏ， Ｋ．Ｋ． ＭｃＫｅｅ， Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， ａｎｄ Ａ．Ｍ． Ｍｅｒｃｕｒｉｏ， Ａｌａｍｉｎｉｎ ５１１ ｍａｔｒｉｘ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＴＡＺ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｐｈａ６Ｂｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔｏ ｓｕｓｔａｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２０１５．２９（１）： ｐ．１－６．ＰＭＣ４２８１５６０
Ｃｏｌｏｍｂｅｌｌｉ， Ｃ．， Ｍ． Ｐａｌｍｉｓａｎｏ， Ｙ． Ｅｓｈｅｄ－Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ， Ｄ． Ｚａｍｂｒｏｎｉ， Ｅ． Ｐａｖｏｎｉ， Ｃ． Ｆｅｒｒｉ， Ｓ．Ｓａｃｃｕｃｃｉ， Ｓ． Ｎｉｃｏｌｅ， Ｒ． Ｓｏｉｎｉｎｅｎ， Ｋ．Ｋ． ＭｃＫｅｅ， Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｅ． Ｐｅｌｅｓ， Ｌ． Ｗｒａｂｅｔｚ， ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｆｅｌｔｒｉ， Ｐｅｒｌｅｃａｎ ｉｓ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ ｔｏ ｎｏｄｅｓ ｏｆ Ｒａｎｖｉｅｒ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｇｌｉｏｍｅｄｉｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２０１５．２０８（３）： ｐ．３１３－２９．ＰＭＣ４３１５２４６
Ｙａｚｌｏｖｉｔｓｋａｙａ， Ｅ．Ｍ．， Ｈ．Ｙ． Ｔｓｅｎｇ， Ｏ． Ｖｉｑｕｅｚ， Ｔ． Ｔｕ， Ｇ． Ｍｅｒｎａｕｇｈ， Ｋ．Ｋ． ＭｃＫｅｅ， Ｋ． Ｒｉｇｇｉｎｓ， Ｖ． Ｑｕａｒａｎｔａ， Ａ． Ｐａｔｈａｋ， Ｂ．Ｄ． Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ａ． Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ， Ｒ．Ｔ． Ｂｏｔｔｃｈｅｒ， Ａ． Ｐｏｚｚｉ， ａｎｄ Ｒ． Ｚｅｎｔ， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｋｉｄｎｅｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｉａ ＴＲＡＦ６－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ６３－ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ， ２０１５．２６（１０）： ｐ．１８５７－７４．ＰＭＣ４４３６８３１
Ｒｅｕｔｅｎ， Ｒ．， Ｔ．Ｒ． Ｐａｔｅｌ， Ｍ． ＭｃＤｏｕｇａｌｌ， Ｎ． Ｒａｍａ， Ｄ． Ｎｉｋｏｄｅｍｕｓ， Ｂ． Ｇｉｂｅｒｔ， Ｊ．Ｇ． Ｄｅｌｃｒｏｓ， Ｃ． Ｐｒｅｉｎ， Ｍ． Ｍｅｉｅｒ， Ｓ． Ｍｅｔｚｇｅｒ， Ｚ． Ｚｈｏｕ， Ｊ． Ｋａｌｔｅｎｂｅｒｇ， Ｋ．Ｋ． ＭｃＫｅｅ， Ｔ． Ｂａｌｄ， Ｔ． Ｔｕｔｉｎｇ， Ｐ． Ｚｉｇｒｉｎｏ， Ｖ． Ｄｊｏｎｏｖ， Ｗ． Ｂｌｏｃｈ， Ｈ． Ｃｌａｕｓｅｎ－Ｓｃｈａｕｍａｎｎ， Ｅ． Ｐｏｓｃｈｌ， Ｐ．Ｄ． Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ， Ｍ． Ｅｈｒｂａｒ， Ｐ． Ｍｅｈｌｅｎ， Ｊ． Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ， ａｎｄ Ｍ． Ｋｏｃｈ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ｎｅｔｒｉｎ－４ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄｓ ｍａｔｕｒｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ， ２０１６．７： ｐ．１３５１５．ＰＭＣ５１４３６７
Ｃｈｏｉ， Ｊ．， Ｎ． Ｙｕ， Ｇ． Ｂａｅｋ， Ｊ． Ｂａｋｅｓ， Ｄ． Ｓｅｏ， Ｈ．Ｊ． Ｎａｍ， Ｓ．Ｈ． Ｂａｅｋ， Ｃ． Ｌｉｍ， Ｙ． Ｌｅｅ， ａｎｄ Ｂ． Ｋａａｎｇ， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ， ２０１４．７： ｐ．１７－２７
Ｇｒａｙ ＳＪ， Ｆｏｔｉ ＳＢ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＷ， Ｂａｃｈａｂｏｉｎａ Ｌ， Ｔａｙｌｏｒ－Ｂｌａｋｅ Ｂ， Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ， Ｅｈｌｅｒｓ ＭＤ， Ｚｙｌｋａ ＭＪ， ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪＣＰ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１１； ２２：１１４３-１１５３．［ＰｕｂＭｅｄ： ２１４７６８６７］Ｇｒｉｅｇｅｒ

当業者には明らかであろうように本発明の多くの変更および変形は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本発明は、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によって定義される。以下の実施例を含む本明細書に記載された特定の実施形態は、ほんの一例として提供され、それらの詳述によって本発明の範囲は限定されない。

本明細書中に引用された全ての参考文献は、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が具体的かつ個別に参考として援用されるのと同じ程度まで参考として援用される。参照によるこの援用の陳述は、出願人が、あらゆる出版物、データベースの登録（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願、または特許に関する３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従っていることを意図し、たとえこれらの個別の引用が参照による援用宣言の陳述の直ぐ近傍になかったとしても、３７ ＣＦＲ§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に識別される。明細書の中に参照による援用の特別な記述があったとしても、それが参照によるこの一般的な援用の宣言を決して弱めることはない。本明細書中の参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることを承認することを意図するものではなく、これらの出版物または文書の内容または日付に関していかなる承認も構成するものでもない。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な改変は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

前述の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかとなりそして添付の特許請求の範囲内に入る。

例示的な組換えアデノ随伴ベクター、組成物および方法は、以下の項目に記載されている。

項目１
ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目２
ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔが配列番号１または配列番号２４を含む、項目１の組換えＡＡＶ。

項目３
前記ＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－９、またはＡＡＶ－ＤＪである、項目１の組換えＡＡＶ。

項目４
ＣＭＶプロモーターをさらに含む、項目１に記載の組換えＡＡＶ。

項目５
前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号１２を含む、項目４の組換えＡＡＶ。

項目６
前記組換えベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、項目１に記載の組換えＡＡＶ。

項目７
前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１１を含む５’ＩＴＲである、項目６に記載の組換えＡＡＶ。

項目８
前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１６を含む３’ＩＴＲである、請求項６に記載の組換えＡＡＶ。

項目９
変異体ａｌｐｈａＬＮＮｄをコードする導入遺伝子を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記変異体ａｌｐｈａＬＮＮＤは、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１または配列番号２４を含む核酸配列を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目１０
ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記核酸配列は、（ａ）配列番号２５、２９、３１、３３、３５、４１、４５および５５；（ｂ）配列番号２５、２９、３１、３３、３５、４１、４７および５５；または（ｃ）配列番号２５、２９、３１、３３、３５、４１、５１および５５のいずれかを含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目１１
ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２Ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ－２をコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記核酸配列は配列番号２５、２９、３１、３３、４１、４３、４５および５５を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目１２
ｂｅｔａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記核酸配列は、配列番号５９、６３、６７、７１、７５、７９、４９、５１、５３、５５および５７を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目１３
ｇａｍｍａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記核酸配列は、配列番号８３、８７、９１、９５、９９、１０３、４９、５１、５３、５５および５７を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。

項目１４
項目１、２、９、１０、１１、１２または１３の組換えＡＡＶおよび医薬担体を含む、医薬組成物。

項目１５
項目１４の組成物を含む容器ハウジングを含む、キット。

項目１６
有効量の項目１、２、９、１０、１１、１２または１３に記載の組換えＡＡＶベクターを対象に投与することを含む、前記対象におけるラミニン重合発現および基底膜アセンブリを回復させる方法。

項目１７
それを必要とする対象においてラミニンα－２欠損症候群を治療する方法であって、有効量の項目１または９の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

項目１８
対象において、ラミニン欠損型筋ジストロフィーおよびラミニンα２欠損型筋ジストロフィーからなる群から選択されるラミニン欠損に関連する症状のうちの少なくとも１つを軽減する方法であって、有効量の項目１または９の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

項目１９
対象において、筋変性、筋再生、慢性筋炎、筋線維症、脳白質異常、末梢神経伝導速度低下、発作、中度精神遅滞、および呼吸不全からなる群から選択されるラミニンα２欠損に関連する症状の少なくとも１つを軽減する方法であって、有効量の項目１または９の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。

項目２０
ａｌｐｈａＬＮＮｄＤｅｌｔａＧ２ｓｈｏｒｔが配列番号１または配列番号２４を含む、項目１７、１８または１９の方法。

項目２１
前記ＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－９またはＡＡＶ－ＤＪである、項目１７、１８または１９の方法。

項目２２
前記組換えＡＡＶは、項目ＣＭＶプロモーターをさらに含む、項目１７、１８または１９の方法。

項目２３
前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号１２を含む、項目２２の方法。

項目２４
前記組換えベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、項目１７、１８または１９の方法。

項目２５
前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１１を含む５’ＩＴＲである、項目２４の方法。

項目２６
前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１６を含む３’ＩＴＲである、項目２４の方法。

項目２７
前記組換えＡＡＶは、医薬担体をさらに含む医薬組成物内に含まれる、項目１７、１８または１９の方法。

Claims (15)

1. 変異体ａｌｐｈａＬＮＮｄをコードする導入遺伝子を含む組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記変異体ａｌｐｈａＬＮＮＤは、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１または配列番号２４を含む核酸配列を含む、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）。
2. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－９またはＡＡＶ－ＤＪである、請求項１に記載の組換えＡＡＶ。
3. ＣＭＶプロモーターをさらに含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶ。
4. 前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号１２を含む、請求項３に記載の組換えＡＡＶ。
5. 前記組換えベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶ。
6. 前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１１を含む５’ＩＴＲである、請求項５に記載の組換えＡＡＶ。
7. 前記逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１６を含む３’ＩＴＲである、請求項５に記載の組換えＡＡＶ。
8. 請求項１に記載の組換えＡＡＶと、医薬担体と、を含む、医薬組成物。
9. 有効量の請求項１に記載の組換えＡＡＶベクターを対象に投与することを含む、前記対象におけるラミニン重合発現および基底膜アセンブリを回復させる方法。
10. それを必要とする対象においてラミニンα－２欠損症候群を治療する方法であって、有効量の請求項１に記載の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
11. 対象において、ラミニン欠損型筋ジストロフィーおよびラミニンα２欠損型筋ジストロフィーからなる群から選択されるラミニン欠損に関連する症状のうちの少なくとも１つを軽減する方法であって、有効量の請求項１に記載の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
12. 対象において、筋変性、筋再生、慢性筋炎、筋線維症、脳白質異常、末梢神経伝導速度低下、発作、中度精神遅滞、および呼吸不全からなる群から選択されるラミニンα２欠損に関連する症状の少なくとも１つを軽減する方法であって、有効量の請求項１に記載の組換えＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
13. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－９またはＡＡＶ－ＤＪである、請求項１０、１１または１２に記載の方法。
14. 前記組換えＡＡＶは、ＣＭＶプロモーターをさらに含む、請求項１０、１１または１２に記載の方法。
15. 前記組換えベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、請求項１０、１１または１２に記載の方法。

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