NO20150196L - Fremgangsmåte for detektering og/eller identifisering av adeno-assosierte virus (AAV) sekvenser og isolering av nye sekvenser som derved identifiseres. - Google Patents
Fremgangsmåte for detektering og/eller identifisering av adeno-assosierte virus (AAV) sekvenser og isolering av nye sekvenser som derved identifiseres.Info
- Publication number
- NO20150196L NO20150196L NO20150196A NO20150196A NO20150196L NO 20150196 L NO20150196 L NO 20150196L NO 20150196 A NO20150196 A NO 20150196A NO 20150196 A NO20150196 A NO 20150196A NO 20150196 L NO20150196 L NO 20150196L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- aav
- seq
- sequences
- sequence
- aav2
- Prior art date
Links
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 111
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 181
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 132
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 80
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 61
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 60
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 50
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 50
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 16
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 188
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 148
- 239000000047 product Substances 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 47
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 44
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 26
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 24
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 23
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 17
- -1 tissue Chemical class 0.000 description 16
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 15
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 15
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 15
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 13
- 239000000306 component Substances 0.000 description 13
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 11
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 11
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 11
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 11
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 10
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 9
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 9
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 9
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 9
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 7
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 7
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 7
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 6
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 6
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 6
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 5
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000803403 Homo sapiens Vimentin Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 5
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 5
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 102100038388 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 4
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Chemical group 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 3
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 3
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 2
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101100468640 Danio rerio rhcgl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102100033295 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010018693 Granuloma inguinale Diseases 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000837829 Homo sapiens Transcription factor IIIA Proteins 0.000 description 2
- 102100036705 Interleukin-23 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 101150078498 MYB gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 description 2
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 description 2
- 101100368917 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) taz1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004446 Serum Response Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010042291 Serum Response Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000001203 Smallpox Diseases 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001062859 Sus scrofa Fatty acid-binding protein, adipocyte Proteins 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- CBOQJANXLMLOSS-UHFFFAOYSA-N ethyl vanillin Chemical compound CCOC1=CC(C=O)=CC=C1O CBOQJANXLMLOSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 101150053759 rhcg gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101150079978 AGRN gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000425548 Adeno-associated virus 3A Species 0.000 description 1
- 241000958487 Adeno-associated virus 3B Species 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100040026 Agrin Human genes 0.000 description 1
- 108700019743 Agrin Proteins 0.000 description 1
- 108010080691 Alcohol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- 208000004881 Amebiasis Diseases 0.000 description 1
- 206010001980 Amoebiasis Diseases 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 101000805768 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010044583 Bartonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 101000742334 Bdellovibrio phage phiMH2K Replication-associated protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 241000701021 Betaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- 206010005098 Blastomycosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 206010069748 Burkholderia pseudomallei infection Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710186200 CCAAT/enhancer-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 101000686790 Chaetoceros protobacilladnavirus 2 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 101000864475 Chlamydia phage 1 Internal scaffolding protein VP3 Proteins 0.000 description 1
- 206010008803 Chromoblastomycosis Diseases 0.000 description 1
- 208000015116 Chromomycosis Diseases 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241001445332 Coxiella <snail> Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023580 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Human genes 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 206010012504 Dermatophytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000006825 Eastern Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 201000005804 Eastern equine encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 241000588877 Eikenella Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 206010014587 Encephalitis eastern equine Diseases 0.000 description 1
- 206010014611 Encephalitis venezuelan equine Diseases 0.000 description 1
- 206010014614 Encephalitis western equine Diseases 0.000 description 1
- 206010053025 Endemic syphilis Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000700572 Entomopoxvirinae Species 0.000 description 1
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000803553 Eumenes pomiformis Venom peptide 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000004729 Feline Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000002613 Feline Panleukopenia Diseases 0.000 description 1
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 201000006353 Filariasis Diseases 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700042658 GAP-43 Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001066288 Gallus gallus GATA-binding factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010015451 Glutaryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100028603 Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108090000826 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Proteins 0.000 description 1
- 102000004327 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Human genes 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 101000852023 Halorubrum pleomorphic virus 1 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101000583961 Halorubrum pleomorphic virus 1 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000905743 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000979333 Homo sapiens Neurofilament light polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 101000837845 Homo sapiens Transcription factor E3 Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091054729 IRF family Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000028547 Inborn Urea Cycle disease Diseases 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000016854 Interferon Regulatory Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010013792 Isovaleryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100025392 Isovaleryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010023927 Lassa fever Diseases 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 241000701043 Lymphocryptovirus Species 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150013833 MYOD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282564 Macaca fuscata Species 0.000 description 1
- 241000282561 Macaca nemestrina Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283923 Marmota monax Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010085747 Methylmalonyl-CoA Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001460074 Microsporum distortum Species 0.000 description 1
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101000930477 Mus musculus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000041810 Mycetoma Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102100032970 Myogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010056785 Myogenin Proteins 0.000 description 1
- 102100026057 Myosin regulatory light chain 2, atrial isoform Human genes 0.000 description 1
- 101710098224 Myosin regulatory light chain 2, atrial isoform Proteins 0.000 description 1
- 208000006007 Nairobi Sheep Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010074223 Netrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009065 Netrin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014413 Neuregulin Human genes 0.000 description 1
- 108050003475 Neuregulin Proteins 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 1
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029443 Nocardia Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010029444 Nocardiosis Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 241000713137 Phlebovirus Species 0.000 description 1
- 108010064071 Phosphorylase Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 208000004842 Pinta Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 description 1
- 101150096292 Ppme1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 description 1
- 208000000705 Rift Valley Fever Diseases 0.000 description 1
- 208000006257 Rinderpest Diseases 0.000 description 1
- 206010039207 Rocky Mountain Spotted Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108050003978 Semaphorin Proteins 0.000 description 1
- 102000014105 Semaphorin Human genes 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 241000605008 Spirillum Species 0.000 description 1
- 206010041896 St. Louis Encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241001478880 Streptobacillus moniliformis Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101100239689 Takifugu rubripes myod gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100028507 Transcription factor E3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 241000869417 Trematodes Species 0.000 description 1
- 206010044608 Trichiniasis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 101150004676 VGF gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000870995 Variola Species 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 201000009145 Venezuelan equine encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000711970 Vesiculovirus Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 101800001476 Viral genome-linked protein Proteins 0.000 description 1
- 208000028227 Viral hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 208000005466 Western Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 235000021068 Western diet Nutrition 0.000 description 1
- 201000005806 Western equine encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 description 1
- 101710127857 Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 101100239691 Xenopus laevis myod1-a gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 206010061418 Zygomycosis Diseases 0.000 description 1
- 241000606834 [Haemophilus] ducreyi Species 0.000 description 1
- 201000007691 actinomycosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 206010004145 bartonellosis Diseases 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 201000004308 chancroid Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 description 1
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073505 ethyl vanillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005098 feline infectious peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000006592 giardiasis Diseases 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000057393 human VIM Human genes 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000001581 lymphogranuloma venereum Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000004015 melioidosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N methylmalonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000007524 mucormycosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108010081726 netrin-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 229940090668 parachlorophenol Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 208000011079 pinta disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000955 splenic vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940044609 sulfur dioxide Drugs 0.000 description 1
- 235000010269 sulphur dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 208000003982 trichinellosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007588 trichinosis Diseases 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000002311 trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000030954 urea cycle disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 201000006266 variola major Diseases 0.000 description 1
- 102000009310 vitamin D receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000156 vitamin D receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001614 vomer Anatomy 0.000 description 1
- 101150040614 vpx gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009482 yaws Diseases 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2750/14162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/90—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates avian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
Det beskrives en fremgangsmåte for detektering og isolering av AAV sekvenser i en prøve av DNA, oppnådd fra vev eller celler. Det beskrives videre AAV sekvenser som er identifisert ved denne metode samt vektorer som er konstruert ved bruk av disse sekvenser.
Description
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
Adeno-assosiert virus (AAV), et medlem av Parvovirusfamilien, er en liten, ikke-innpakket, ikosaedrisk virus med enkelttrådede lineære DNA genomer på 4,7 kilobaser (kb) til 6 kb. AAV er tilskrevet genusen Dependovirus fordi virusen ble oppdaget som en kontaminant i rensede adenovirusforråd. AAV livscyklusen inkluderer en latent fase med hvilken AAV genomer, etter infeksjon, blir setespesifikt integrert i vertskromoso-mer, og en infektiøs fase der, etter enten adenovirus- eller herpes simplex virus infeksjon, de integrerte genomer deretter reddes, replikeres og pakkes i infektiøse vimser. Egenskapene når det gjelder ikke-patogenisitet, bredt verksspektrum når det gjelder infektivitet inkluderer ikke-delende celler, og potensiell, setespesifikk kromosomal integrering, gjør AAV til et attraktivt verktøy for overføring av gener.
Nylige studier antyder at AAV vektorer kan være den foretrukne vehikel for genterapi. Til i dag er det isolert 6 forskjellige serotyper av AAVer fra humane eller ikke-humane primater (NHP) og disse er godtkarakterisert. Blant disse er human serotype 2 den førs-te AAV som ble utviklet som en genoverføringsvektor; den er senere utstrakt brukt for effektive genoverføringsforsøk i forskjellige målvev og dyremodeller. Kliniske prøver av forsøksapplikasjon av AAV2 baserte vektorer mot visse humansykdomsmodeller er i forløp og inkluderer sykdommer som systisk fibrose og hemofili B.
Ønsket er å tilveiebringe AAV-baserte konstrukter for genavlevering.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
I ett aspekt angår foreliggende oppfinnelse en ny metode for å detektere og å identifisere AAV sekvenser fra cellulære DNA'er av forskjellige human- og ikke-human primat (NHP) vev ved bruk av bioinformatikkanalyser, PCR basert genforsterkning og klo-ningsteknologi, basert på arten av latens og integrering av AAVer i fravær av hjelpevi-ruskoinfeksjon.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for isolering av nye detekterte AAV sekvenser ved bruk av den ovenfor beskrevne metode ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen omfatter videre metoder for generering av vektorer basert på disse nye AAV serotyper for serologi og genoverføringsstudier kun basert på tilgjenge-lighet av capsidgensekvenser og strukturen for rep/cap genskjøter.
I nok et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ny fremgangsmåte for å gjen-nomføre studier i forbindelse med serologj, epidemiologi, biofordeling og transmi-sjonsmåte ved bruk av reagenser ifølge oppfinnelsen som inkluderer generiske sett av primere/prober og kvantitativ real tids PCR.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å isolere komplette og infektiøse genomer av nyere AAV serotyper fra cellulær DNA og forskjellige opprinnelser ved bruk av RACE og andre molekylære teknikker.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å komme frem til nye serotyper av AAV genomer fra human- og NHP cellelinjer ved bruk av adenovirushjelpere av forskjellige opprinnelser.
I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nye AAV serotyper, vektorer inneholdende disse og metoder for bruk av disse.
Disse og andre aspekter ifølge oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelse.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figurene IA til 1AAAR tilveiebringer en innretning av nukleinsyresekvensen som koder minst cap proteinene for AAV serotypene. Full-lengdesekvensene inkludert ITRene, rep området og capsid området tilveiebringes for nye AAV serotyper 7 [SEQ ID nr. 1], og for tidligere publiserte AAV1 [SEQ IN Nr. 6], AAV2 [SEQ ID nr. 7]; og AAV3 [SEQ ID nr. 8]. Nye AAV serotyper AAV8 [SEQ ID nr. 4] og AAV9 [SEQ ID nr. 5] er gjenstand for samtidig inngitte søknader. De andre nye kloner ifølge oppfinnelsen som tilveiebringes i denne innretning inkluderer: 42-2 [SEQ ID nr. 9], 42-8 [SEQ ID
nr. 27], 42-15 [SEQ ID nr. 28], 42-5b [SEQ ID nr. 29], 42-lb [SEQ ID nr. 30]; 42-13 [SEQ ID nr. 31], 42-3a [SEQ ID nr. 32], 42-4 [SEQ ID nr. 33], 42-5a [SEQ ID nr. 34], 42-10 [SEQ ID nr. 35], 42-3b [SEQ ID nr. 36], 42-11 [SEQ ID nr. 37], 42-6b [SEQ ID nr. 38], 43-1 [SEQ ID nr. 39], 43-5 [SEQ ID nr. 40], 43-12 [SEQ ID nr. 41], 43-20 [SEQ ID nr. 42], 43-21 [SEQ ID nr. 43], 43-23 [SEQ ID nr. 44], 43-25 [SEQ ID nr. 45], 44.1 [SEQ ID nr. 47], 44.5 [SEQ ID nr. 47], 223.10 [SEQ ID nr. 48], 223.2 [SEQ ID nr. 49], 223.4 [SEQ ID nr. 50], 223.5 [SEQ ID nr.51], 223.6 [SEQ ID nr. 52], 223.7 [SEQ ID nr. 53], A3.4 [SEQ ID nr. 54], A3.5 [SEQ ID nr. 55], A3.7 [SEQ ID nr. 56],
A3.3 [SEQ ID nr. 57], 42.12 [SEQ ID nr. 58], 44.2 [SEQ ID nr. 59]. Nukleotidsekven-sene av signaturområdene av AAV10 [SEQ ID nr. 117], AAV11 [SEQ ID nr. 118] og AAV12 [SEQ ID nr. 119] er tilveiebragt i denne figur. Kritiske landemerker i strukture-ne av AAV genomene vises. Gap påvises ved punkter. 3' ITR'en av AAV1 [SEQ ID nr. 6] vises i den samme konfigurasjon som i de publiserte sekvenser. TRS representerer termaloppløsningssetet. Merk at AAV7 er den eneste AAV som er rapportert som bru-ker GTG som initieringskodon for VP3.
Figurene 2A til 2F er innretninger av aminosyresekvensene av proteinene av vpl capsid proteinene av tidligere publiserte AAV serotyper 1 [SEQ ID nr. 64], AAV2 [SEQ ID nr. 70], AAV3 [SEQ ID nr. 71], AAV4 [SEQ ID nr. 63], AAV5 [SEQ ID nr. 114] og
AAV6 [SEQ ID nr. 65] og nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen, inkludert: Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ ID nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr. 73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24.1 [SEQ ID nr. 101], 42.2 [SEQ ID nr. 102], 7.2 [SEQ ID nr. 103], 27.3 [SEQ ID nr. 104], 16.3 [SEQ ID nr. 105], 42.10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], 5F [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112], 42-12 [SEQ ID nr. 113].
Nye serotyper AAV8 [SEQ ID nr. 95] og AAV9 [SEQ ID nr. 100] er gjenstand for samtidig inngitte søknader.
Figurene 3 A til 3C gir aminosyresekvensen av AAV7 rep proteinene [SEQ ID nr. 3].
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Ifølge oppfinnelsen har foreliggende oppfinnere funnet en metode som trekker fordel av evnen hos adenoassosiert virus (AAV) å penetrere nukleus og, i fravær av en hjelpevi-rusko-infeksjon, å integrere inn i cellulær DNA og etablere en latent infeksjon. Denne metode benytter en polymerasekjedereaksjon (PCR)-basert strategi for detektering, identifisering og/eller isolering av sekvenser av AAVer fra DNA'er fra vev av human og ikke-human primatopprinnelse så vel som for andre kilder. Fortrinnsvis er denne metode også egnet for detektering, identifisering og/eller isolering av andre integrerte, virale og ikke-virale sekvenser, som beskrevet nedenfor.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre nukleinsyresekvenser som er identifisert i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte. En slik adenoassosiert virus er av en ny serotype, her kalt serotype 7 (AAV7). Andre, nye adenoassosierte virus serotyper som her tilveiebringes inkluderer også AAV 10, AAV11 og AAV12. Ytterligere andre AAV serotyper som er identifisert ifølge oppfinnelsens metoder tilveiebringes i foreliggende beskrivelse, det vises til figurene og sekvenslistingen som er en del av beskrivelsen.
Det tilveiebringes videre fragmenter av disse AAV sekvenser. Blant spesielt ønskede AAV fragmenter er cap proteinene inkludert vi, vp2, vp3, de hypervariable områder, rep proteinene inkludert rep 78, rep 68, rep 52 og rep 40, og sekvensene som koder disse proteiner. Hvert av disse fragmenter kan lett benyttes i forskjellige vektorsystemer og vertsceller. Slike fragmenter kan benyttes alene, i kombinasjon med andre AAV sekvenser eller -fragmenter, eller i kombinasjon med elementer fra andre AAV- eller ik-ke-AAV virale sekvenser. I en spesielt ønskelig utførelsesform inneholder en vektor AAV cap- og/eller rep sekvensene ifølge oppfinnelsen.
Som beskrevet her blir innretning gjennomført ved bruk av en hvilken som helst av et antall ålment eller kommersielt tilgjengelige "Multiple Sequence Alignment Programs" som "Clustal W", tilgjengelig via Web Servere på internet. Alternativt blir vektor NTI utiliteter også benyttet. Det finnes også et antall algoritmer som er velkjente i teknikken som kan benyttes for å måle nukleotidsekvensidentitet inkludert de som inneholdes i programmene som beskrevet ovenfor. Som et annet eksempel kan polynukleotidsekven-ser sammenlignes ved bruk av Fasta, et program i GCG Versjon 6.1. Fasta tilveiebringer innretninger og prosent sekvensidentitet for områdene med best overlapping mellom spørsmåls- og svarsekvensene. For eksempel kan prosent sekvensidentitet mellom nukleinsyresekvenser bestemmes ved bruk av Fasta med dens default parametre (en ordstør-relse på 6 og NOPAM faktoren for bedømmelsesmatrisen) slik den tilveiebringes i GCG Versjon 6.1, hvortil det vises når det gjelder detaljer. Tilsvarende programmer er tilgjengelige for aminosyresekvenser, for eksempel "Clustal X" programmet. Generelt kan et hvilket som helst av disse programmer være brukbare som default settinger selv om fagmannen på området kan endre disse etter behov. Alternativt kan fagmannen på området benytte andre algoritme- eller maskinprogrammer som gir minst det identitets-eller innretningsnivå som tilveiebringes av nevnte algoritmer og programmer. Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" indikerer at, under henvisning til en nukleinsyre eller et fragment derav, og ved optimal innretning med egnede nukleotid-innskudd eller delesjoner med andre nukleinsyrer (eller dens kompiementærtråd), er det nukleotidsekvensidentitet i minst rundt 95 til 99 % av de innrettede sekvenser. Fortrinnsvis er homologien over full-lengde sekvens, eller en åpen leseramme derav, eller et annet egnet fragment som er minst 15 nukleotider i lengde. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
Uttrykket "vesentlig homologi" eller "vesentlig likhet" indikerer at, under henvisning til aminosyrer eller fragmenter derav og når det er optimalt innrettet med egnede aminosy-reinnskudd eller delesjoner med andre aminosyrer, er det aminosyresekvensidentitet på minst rundt 95 til 99 % av de innrettede sekvenser. Fortrinnsvis er homologien over full-lengde sekvenser eller et protein derav, for eksempel et cap protein, et rep protein eller et fragment derav med minst 8 aminosyrer eller helst minst 15 aminosyrer i lengde. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
Med uttrykket "meget bevart" eller lignende menes minst 80 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet og aller helst mer enn 97 % identitet. Identitet bestemmes lett av fagmannen på området ved å benytte algoritmer og dataprogrammer som kjent av fagmannen.
Utrykket "prosent sekvensidentitet" eller "identisk" i konteksten nukleinsyresekvenser henviser til rester i de to sekvenser som er de samme når de innrettes for maksimal overensstemmelse. Lengden av sekvensidentitetsammenligningen kan være over hele lengden av genomet, hele lengden av en genkodende sekvens, eller et fragment på minst 500 til 5000 nukleotider, hvis ønskelig. Imidlertid kan identitet blant mindre fragmenter, for eksempel minst rundt 9 nukleotider, vanligvis minst rundt 20 til 24 nukleotider, minst rundt 28 til 32 nukleotider eller minst rundt 36 eller flere nukleotider, også være ønskelig. På samme måte kan "prosent sekvensidentitet" lett bestemmes for aminosyresekvenser over hele lengden av et protein, eller et fragment derav. Hensiktsmessig er et fragment minst 8 aminosyrer i lengde og kan være opp til 700 aminosyrer. Eksempler på egnede fragmenter er beskrevet her.
AAV sekvensene og fragmentene derav er brukbare ved fremstilling av rAAV og er også brukbare som antisense avleveringsvektorer, genterapivektorer eller vaksinevekto-rer. Oppfinnelsen tilveiebringer videre nukleinsyremolekyler, genavleveringsvektorer og vertsceller som inneholder AAV sekvensene ifølge oppfinnelsen.
Som beskrevet her er vektorene ifølge oppfinnelsen inneholdende AAV capsid proteinene ifølge oppfinnelsen spesielt godt egnet for anvendelse ved applikasjon der de nøyt-raliserende antistoffer reduserer effektivitetene av andre AAVserotyp baserte vektorer, så vel som andre virale vektorer. rAAV vektorene ifølge oppfinnelsen er spesielt fordel-aktige ved rAAV readministrering og repeat genterapi.
Disse og andre utførelsesformer og fordeler ifølge oppfinnelsen beskrives i større detalj nedenfor.
Som benyttet i beskrivelsen og krav er uttrykkene "omfattende" og "inkludert" og deres varianter, inkluderende når det gjelder andre komponenter, elementer, integere, trinn og lignende. Omvendt er uttrykket "bestående av" og varianter derav ekskluderende for andre komponenter, elementer, integere, trinn og lignende.
I. Metoder ifølge oppfinnelsen
A. Detektering av sekvenser via molekylær kloning
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å detektere og/eller identifisere store nukleinsyresekvenser i en prøve. Denne prøve er spesielt velegnet for detektering av virale sekvenser som er integrert i en celles kromosom, for eksempel adenoassosierte vimser (AAV) og retrovimser, blant andre. Beskrivelsen henviser til AAV som er ek-semplifisert her. Basert på denne informasjon vil fagmannen imidlertid lett kunne gjen-nomføre metodene ifølge oppfinnelsen på retro vimser [for eksempel felin leukemi vi-ms (FeLV), HTLVI og HTLVUI], og lentivirinae [for eksempel human immunodefekt vims (FflV), simian immunodefekt vims (SIV), felin immunodefekt vims (FIV), ekvin infektiøs anemi vims, og spumavirinal)], blant andre. Videre kan metoden ifølge oppfinnelsen også benyttes for detektering av andre virale og ikke-virale sekvenser, uansett om de er integrert eller ikke-integrert i genomet av vertscellen.
Som benyttet her er en prøve en hvilken som helst kilde inneholdende nukleinsyrer, for eksempel vev, vevkultur, celler, cellekultur og biologiske fluider inkludert, uten begrensning, urin og blod. Disse nukleinsyresekvenser kan være DNA eller RNA fra plasmider, naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde inkludert bakterier, gjær, vimser og høyere organismer som planter eller dyr. DNA eller RNA ekstraheres fra prøver ved et antall teknikker som er velkjente for fagmannen og som de som er beskrevet av Sambrook i "Molecular Cloning: A Laboratoray Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory). Opprinnelsen for prøven og den metode med hvilken nuk-leinsyrene oppnås for gjennomføring av metoden ifølge oppfinnelsen er ingen begrensning for denne. Eventuelt kan oppfinnelsens metoder gjennomføres direkte på kilden for DNA, eller på oppnådde nukleinsyrer (som for eksempel er ekstrahert) fra en kilde.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen involverer å underkaste en prøve inneholdende DNA en forsterkning via polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av et første sett primere som er spesifikke for et første område av dobbeltstrengede nukleinsyresekvenser for derved å oppnå forsterkede sekvenser. Som benytter her er hvert av "områdene" bestemt på forhånd basert på innretningen av nukleinsyresekvensen av minst to serotyper (for eksempel AAV) eller stammer (for eksempel lentiviruser) og der hvert av områdene består av sekvenser med en 5' ende som er meget konservert, en midtre som fortrinnsvis men ikke nødvendigvis er variabel, og en 3' ende som er sterkt konservert idet hver av disse er konservert eller variable relativt sekvensene av de minst to innrettede AAV serotyper. Fortrinnsvis er 5- og/eller 3-enden sterkt konservert i forhold til minst 9 og aller helst minst 18 basepar (bp). Imidlertid kan en eller begge av sekvensene ved 5- eller 3-enden være konservert over mer enn 18 bp, mer enn 25 bp, mer enn 30 bp eller mer enn 50 bp ved 5-enden. Med henblikk på det variable området er det intet krav for konserverte sekvenser, disse sekvenser kan være relativt konservert eller kan ha mindre enn 90, 80 eller 70 % identitet blant de innrettede serotyper eller stammer.
Hvert av områdene kan spenne over 100 bp til rundt 10 kilobase par i lengde. Imidlertid er det spesielt ønskelig at et av områdene er et "signaturområde", det vil si et område som er tilstrekkelig unikt til positivt å identifisere den forsterkede sekvens som en fra målkilden. I en utførelsesform har for eksempel det første området en lengde på rundt 250 bp og er tilstrekkelig unikt blant kjente AAV sekvenser til at det positivt identifise-rer det forsterkede området til å være av AAV opprinnelse. Videre er de variable sekvenser innen området tilstrekkelig unike til at de kan benyttes til å identifisere serotypen hvorfra den forsterkede sekvens stammer. Når de først er forsterket (og derved detektert) kan sekvensene identifiseres ved å gjennomføre konvensjonell restriksjonsdi-gestering og sammenligning med restriksjonsregj streite mønstere for dette området i en hvilken som helst av AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, eller AAV6, eller den til AAV7, AAV10, AAV11, AAV12 eller en hvilken som helst annen ny serotype som er identifisert ifølge oppfinnelsen, som er bestemt på forhånd og tilveiebragt ved oppfinnelsen.
Gitt de rettledninger som finnes her kan fagmannen på området lett identifisere slike områder blant andre, integrerte vimser for å tillate lett detektering og identifisering av disse sekvenser. Deretter kan et optimalt sett av generiske primere lokalisert i de sterkt konserverte ender konstmeres og testes for effektiv forsterkning av de valgte områder fra prøvene. Dette aspekt ved oppfinnelsen kan lett tilpasses et diagnostisk sett for detektering av nærværet av målsekvensen (for eksempel AAV) og for å identifisere AAV serotypen, ved bmk av standarder som inkluderer restriksjonsmønstrene for AAV serotypene som beskrives her eller som isoleres ved bmk av de her beskrevne teknikker. For eksempel kan hurtig identifisering eller molekylær serotyping av PCR produkter gjen-nomføres ved digestering av PCR produktene og sammenligning av restriksjonsmøns-tre.
I en utførelsesform spenner således "signaturområdet" for AAV mndt bp 2800 til mndt 3200 av AAV1 [SEQ ID nr. 6] og tilsvarende basepar i AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 og AAV6. Mer ønskelig er området cirka 250 bp, lokalisert innen bp 2886 til mndt 3143 bp av AAV1 [SEQ ID nr. 6] og tilsvarende basepar i AAV2 [SEQ ID nr. 7], AAV3 [SEQ ID nr. 8] og andre AAV serotyper, det henvises til figur 1. For å tillate hurtig detektering av AAV i prøven benyttes det primere som spesielt forsterker dette signaturområdet. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til de nøyaktige sekvenser som er identifisert her for AAV signaturområdet da fagmannen lett kan endre området til å omfatte et kortere fragment eller større fragmenter av dette signaturområdet.
PCR primerne genereres ved bmk av teknikker som er velkjente for fagmannen. Hvert av PCR primersettene består av en 5' primer og en 3' primer, se for eksempel Sambrook et al supra. Uttrykket "primer" henviser til et nukleotid som virker som et initierings-punkt for syntesen ved anbringelse under betingelser hvori synteser av et primerforleng-elsesprodukt som er komplementært til nukleinsyretråden, induseres. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet. Hvis imidlertid en dobbelttrådet primer benyttes behandles denne for å separere trådene før de benyttes for å fremstille forlengelsesproduktene. Primerne kan være mndt 15 til 25 eller flere nukleotider og er fortrinnsvis minst 18 nukleotider. For enkelte anvendelser benyttes det imidlertid kortere nukleotider, for eksempel 7 til 15 nukleotider.
Primerne velges for å være tilstrekkelig komplementære til de forskjellige tråder av hver spesifikke sekvens som skal forsterkes for å hybridere med deres respektive tråder. Primersekvensen behøver derfor ikke å reflektere den nøyaktige sekvens av området som forsterkes. For eksempel kan et ikke-komplementært nukleotidfragment festes til 5- enden av primeren mens resten av primersekvensen er fullstendig komplementær til tråden. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller lengre sekvenser intersperseres inn i primeren forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen i tråden som skal forsterkes til å hybridere med denne og danne et templat for syntese av forlengelsesproduktet av den andre primer.
PCR primerne for signaturområdet ifølge oppfinnelsen er basert på de sterkt konserverte sekvenser av to eller flere innrettede sekvenser (for eksempel to eller flere AAV serotyper). Primerne kan stemme overens med mindre enn nøyaktig identitet blant to eller flere innrettede AAV serotyper ved 5-enden eller i midten. Imidlertid tilsvarer sekvens ved 3-enden av primerne et område av to eller flere innrettede AAV serotyper hvori det er eksakt identitet over minst fem og fortrinnsvis over minst ni basepar, aller helst over minst 18 basepar ved 3-enden av primerne. Således består 3-enden av primerne av sekvenser med 100 % identitet til de innrettede sekvenser over minst fem nukleotider. Imidlertid kan man eventuelt benytte en, to eller flere degeneratnukleotider ved 3-enden av primeren.
For eksempel ble primersettet for signaturområdet av AAV konstruert basert på et unikt område innen AAV capsidet som følger. 5' primerenden var basert på nt 2867-2891 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], 5 -GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3'. Se figur 1.3' primerenden ble konstruert basert på nt 3096-3122 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], 5-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-3'. Imidlertid kan fagmannen lett konstruere primersettet basert på de tilsvarende områder av AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, eller basert på den formasjon som er gitt der, AAV7, AAAV10, AAV11, AAV12, eller en annen ny AAV ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan ytterligere andre primersett lett konstrueres for å forsterke dette signaturområdet ved bruk av teknikker som er velkjente for fagmannen.
B. Isolering av mål sekvenser
Som beskrevet her tilveiebringer oppfinnelsen et første primersett som spesifikt forsterker signaturområdet av målsekvensen, for eksempel en AAV serotype, for å tillate detektering av målet. I en situasjon hvori ytterligere sekvenser er ønsket, hvis for eksempel en ny AAV serotype er identifisert, kan signaturområdet forlenges. Således kan oppfinnelsen videre benytte ett eller flere ytterligere primersett.
Hensiktsmessig er disse primersett konstruert til å inkludere enten 5- eller 3-primeren av det første primersettet og en andre primer som er unik for primersettet slik at primersettet forsterker et område 5' eller 3'til signaturområdet som annellerer enten til 5-enden eller 3 -enden av signaturområdet. For eksempel består et første primersett av en 5' primer, Pl og en 3' primer P2 for å forsterke signaturområdet. For å forlenge signaturområdet ved dettes 3-ende består et andre primersett av primer Pl og en 3' primer P4 som forsterker signaturområdet og nabosekvenser nedstrøms signaturområdet. For å forlenge signaturområdet ved dettes 5-ende består et tredje primersett av en 5' primer, P5, og primeren 2 slik at signaturområdet og nabosekvenser oppstrøms signaturområdet forsterkes. Disse forlengelsestrinn gjentas (eller gjennomføres samtidig) etter behov eller ønske. Deretter blir produktene som stammer fra disse forsterkningstrinn fusert ved bruk av konvensjonelle trinn for å gi en isolert sekvens med ønsket lengde.
Det andre og tredje primersett konstrueres som med primersettet for signaturområdet for å forsterke et område med sterk konservert sekvenser blant de innrettede sekvenser.
Referanser hertil uttrykket "andre" eller "tredje" primersett er kun for diskusjon og uten hensyn til den rekkefølge med hvilken disse primere settes til reaksjonsblandingen, eller benyttes for forsterkning. Området som forsterkes ved det andre primersett velges slik at ved forsterkning annellerer det ved sin 5-ende til 3-enden av signaturområdet. På tilsvarende måte blir området som forsterkes av det tredje primersett valgt slik at ved forsterkning annellerer det ved sin 3-ende til 5-enden av signaturområdet. Ytterligere primersett kan konstrueres slik at områdene som de forsterker annellerer til enten 5-enden eller 3-enden av forlengelsesproduktene som dannes av det andre eller tredje primersett, eller av etterfølgende primersett.
Der for eksempel AAV er målsekvensen blir et første sett av primere (Pl og P2) benyttet for å forsterke signaturområdet fra prøven. I en ønsket utførelsesform er dette signaturområdet lokalisert inne i AAV capsidet. Et andre sett primere (Pl og P4) benyttes for å forlenge 3-enden av signaturområdet til en lokasjon i AAV sekvensen som er akkurat foran AAV 3'ITR, det vil si som gir et forlengelsesprodukt inneholdende hele 3-enden av AAV capsidet når man benytter signaturområdet som anker. I en utførelsesform tilsvarer P4 primeren nt 4435 til 4462 av AAV2 [SEQ ID nr. 7], og tilsvarende sekvenser i de andre AAV serotyper. Dette resulterer i forsterkning av et område på rundt 1,6 kb som inneholder 0,25 kb signaturområde. Et tredje sett primere (P3 og P2) benyttes for å forlenge 5-enden av signaturområdet til en lokasjon i AAV sekvensene som er i 3-enden av rep genene, det vil si som gir et forlengelsesprodukt inneholdende hele 5-enden av AAV capsidet når man benytter signaturområdet som anker. I en utførelses- form tilsvarer P3 primeren nt 1384 til 1409 av AAV2 [SEQ ID nr. 7] og tilsvarende sekvenser i andre AAV serotyper. Dette resulterer i forsterkning av et område på rundt 1,7 kb som inneholder 0,25 kb signaturområde. Eventuelt blir et fjerde sett av primere benyttet for ytterligere å forlenge forlengelsesproduktet inneholdende hele 5-enden av AAV capsidet til også å inkluder rep sekvensene. I en utførelsesform tilsvarer P5 nt 108 til 133 av AAV2 [SEQ ID nr. 7] og tilsvarende sekvenser i de andre AAV serotyper og benyttes i forbindelse med P2 primeren.
Etter fullføring av det ønskede antall forlengelsestrinn blir de forskjellige forlengelses-produkter fusert idet man gjør bruk av signaturområdet som anker eller markør for å konstruere en intakt sekvens. I det her gitte eksempel oppnås det AAV sekvenser som som et minimum inneholder et intakt AAV cap gen. Større sekvenser kan oppnås, avhengig av antall forl engel sestrinn som gjennomføres.
Hensiktsmessig blir forlengelsesproduktene satt sammen til en intakt AAV sekvens ved bruk av metoder som er velkjente for fagmannen. For eksempel kan forlengelsesproduktene digesteres med DraUI som spalter ved DraUI setet lokalisert i signaturområdet, for å gi restriksjonsfragmenter som re-ligeres for å gi produkter som (som et minimum) inneholder et intakt AAV cap gen. Imidlertid kan andre egnede teknikker for å sette sammen forlengelsesproduktene til en intakt sekvens, benyttes. Det vises her generelt til Sambrook et al. supra.
Som et alternativ til de multiple forlengelsestrinn som er beskrevet ovenfor gir en annen utførelsesform av oppfinnelsen direkteforsterkning av et 3,1 kb fragment som tillater isolering av full-lengde sekvenser. For direkte å forsterke et 3,1 kb full-lengde cap fragment fra NHP vev- og -blod DNA'er ble to andre sterkt konserverte områder identifisert i AAV genomer for bruk ved PCR forsterkning av store fragmenter. En primer innen et konservert område lokalisert i midten av rep genet benyttes (AVlns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt av SEQ ID nr. 6) i kombinasjon med 3'primeren lokalisert i et annet konservert område nedstrøms cap genet (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID nr. 7) for forsterkning av AAV sekvenser inkludert den angjeldende full-lengde AAV cap. Etter forsterkning blir produktene typisk klonet og sekvensanalyse gjennomført med en nøyaktighet på >99,9 %. Ved bruk av denne metode har foreliggende oppfinnere isolert minst 50 capsid kloner som deretter erkarakterisert. Blant disse ble 37 kloner avledet fra Rhesus macaque vev (rh. 1 - rh.37), 6 kloner fra cynomologe macaquer (cy. 1 - cy.6), 2 kloner fra bavianer (bb.l og bb.2) og 5 kloner fra sjimpanser (ch.l - ch.5). Disse kloner er identifisert annensteds i beskrivelsen sammen med dyrespesiene hvorfra de ble identifisert og ve-vene i det dyr der disse nye sekvenser ble lokalisert.
C. Alternativ metode for isolering av ny AAV
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en alternativ metode for å isolere nye AAV fra en celle. Denne metode involverer infeksjon av cellen med en vektor som tilveiebringer hjelperfunksjoner til den angjeldende AAV; isolering av infektiøse kloner inneholdende AAV; sekvensering av den isolerte AAV; og sammenligning av sekvensen av den isolerte AAV med kjente AAV serotyper hvorved forskjeller i sekvensene av de isolerte AAV- og kjente AAV serotyper indikerer nærværet av en ny AAV.
I en utførelsesform tilveiebringer vektoren som tilveiebringer hjelperfunksjonen essensielle adenovirusfunksjoner inkludert for eksempel Ela, Elb, E2a, E40RF6.1 en utfø-relsesform tilveiebringes disse hjelperfunksjoner av en adenovirus. Adenovirusen kan være en vill-type adenovirus og kan være av human eller ikke-human opprinnelse, fortrinnsvis av ikke-human primat (NHP) opprinnelse. DNA sekvensene av et antall ade-novirustyper er tilgjengelige fra Genbank inkludert type Ad5 [Genbank Aksess nr. M73260]. Adenovirussekvensene kan oppnås fra en hvilken som helst kjent adenovirus serotype som serotypene 2, 3, 4, 7, 12 og 40, og inkluderer videre en hvilken som helst av de til nu identifiserte humane typer, se for eksempel Horwitz supra. Tilsvarende adenoviruser som er kjente for å infisere ikke-humane dyr, for eksempel sjimpanser, kan også benyttes i vektorkonstruktene ifølge oppfinnelsen, se for eksempel US 6 083 716.1 tillegg til vill-type adenoviruser kan rekombinante vimser eller ikke-virale vektorer (for eksempel plasmider, episomer og så videre) som bærer de nødvendige hjelperfunksjoner, benyttes. Slike rekombinante vimser er velkjente i teknikken og kan fremstilles i henhold til offentliggjorte teknikker, se for eksempel US 5 871 982 og 6 251 677 som beskriver en hybrid Ad/AAV vims. Valget av adenovims type er ikke ansett som begrensende for oppfinnelsen. Et antall adenovims stammer er tilgjengelige fra "American Type Culture Collection", Manassas, Virginia eller tilgjengelige på forespørsel fra et antall kommersielle og institusjonelle kilder. Videre er sekvensene for mange slike stammer tilgjengelige fra et antall databaser inkludert for eksempel PubMed og GenBank.
I et annet alternativ kan infektiøs AAV isoleres ved bmk av genom vandreteknologi (Siebert et al., 1995, "Nucleic Acid Research", 23:1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, "J. Biol. Chem." 261: 6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo, Alto, CA). Genomvandring er spesielt godt egnet for identifisering og isolering av sekvenser ved siden av de nye sekvenser som identifiseres ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte. For eksempel kan denne teknikk være brukbar for å isolere invertert terminal repeat (ITR'er) av den nye AAV serotype, basert på de nye AAV capsid- og/eller -rep sekvenser som er identifisert ved bruk av oppfinnelsens metoder. Denne teknikk er også brukbar for å isolere sekvenser ved siden av andre AAV- og ikke-AAV sekvenser som er identifisert og isolert ifølge oppfinnelsen, se eksemplene 3 og 4.
Metodene ifølge oppfinnelsen kan lett benyttes for et antall epidemiologiske studier, studier av biofordeling, overvåking av genterapi via AAV vektorer og vektorer avledet fra andre integrerte vimser. Således er metodene vel egnet for anvendelse i på forhånd pakkede sett for bmk av leger, forskere og epidemiologer.
n. Diagnosesett
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et diagnosesett for detektering av nærværet av en kjent eller ukjent adenoassosiert vims (AAV) i en prøve. Et slikt sett kan inneholde et første sett av 5- og 3'PCR primere som er spesifikke for signaturområdet av AAV nukleinsyresekvensen. Alternativt eller i tillegg kan et slikt sett inneholde et første sett av 5- og 3'PCR primere spesifikke for 3,1 kb fragmentet som inkluderer full-lengde AAV capsid nukleinsyresekvensen som er identifisert her (for eksempel AVlns- og AV2cas primerne). Eventuelt kan et sett ifølge oppfinnelsen videre inneholde to eller flere ytterligere sett av 5- og 3' primere som beskrevet her, og/eller PCR prober. Disse primere og prober benyttes ifølge oppfinnelsen for å forsterke signaturområder av hver AAV serotype, for eksempel ved bmk av kvantitativ PCR.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre et sett som er brukbart for å identifisere en AAV serotype som er detektert i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte og/eller for å skille ny AAV fra kjent AAV. Et slikt sett kan videre inkludere ett eller flere restriksjonsen-zymer, standarder for AAV serotyper som tilveiebringer deres "signatur restriksjons enzym digesteringsanalyser" og/eller andre midler for å bestemme serotypen av den detekterte AAV.
I tillegg kan sett ifølge oppfinnelsen inkludere instmksjoner, en negativ og/eller positiv kontroll, beholdere, diluenter og buffere for prøven, indikatorkart for signatursammen-ligninger, engangshansker, dekontamineringsinstmksjoner, applikatorstifter eller beholdere, og prøvepreparatorlokk, så vel som hvilke som helst ønskede reagenser inkludert media, vaskereagenser og konsentrasjonsreagenser. Slike reagenser kan lett velges blant de som er beskrevet her og blant konvensjonelle konsentrasjonsreagenser. I en ønsket utførelsesform er vaskereagensen en isotonisk saltoppløsning som er bufret til fysiologisk pH-verdi, for eksempel fosfatbufret saltoppløsning (PBS), elueringsreagensen er PBS inneholdende 0,4 M NaCl og konsentrasjonsreagensen og innretninger. For eksempel vil fagmannen på området erkjenne at reagenser som polyetylenglykol (PEG) eller NH4SO4kan være brukbare, eller at innretninger som filterinnretninger, for eksempel en filterinnretning med en 100 K membran, vil konsentrere rAAV.
Settene som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen er brukbare for å gjennomføre metodene som beskrevet her og for studering av biofordeling, epidemiologi, transmisjonsmodus for nye AAV serotyper i mennesker og NHP'er.
Således tillater metoden og settene ifølge oppfinnelsen detektering, identifisering og isolering av virale målsekvenser og særlig integrerte virale sekvenser. Metodene og settene er spesielt egnet for bruk ved detektering, identifisering og isolering av AAV sekvenser og som kan inkludere nye AAV serotyper.
I et spesielt eksempel lettet metoden ifølge oppfinnelsen analysen av AAV sekvenser som var klonet av oppfinnerne og som avdekket heterogenitet av provirale sekvenser mellom klonede fragmenter fra forskjellige dyr, alle distinkte fra de kjente seks AAV serotyper, med hovedandelen av variasjonen lokalisert til hypervariable områder av capsidproteinet. Overraskende divergens fra AAV sekvenser ble notert i kloner som var isolert fra enkle vevkilder som lymfeknuten, fra en individuell rhesus ape. Denne heterogenitet forklares best ved den åpenbare evolusjon av AAV sekvensen i det individuelle dyr som delvis skyldes ekstensiv, homolog rekombinering mellom et begrenset antall ko-infiserende parenterale vimser. Disse studier antyder sekvensevaluering av utstrakt disseminert vims under forløpet av en naturlig AAV infeksjon som antagelig fører til dannelse av svermer av kvasispesier som skiller seg fra hverandre i mønstere av capsid hypervariable områder. Dette er det første eksempel på hurtig molekular utvikling av en DNA vims på en måte som tidligere var antatt å være begrenset til RNA vimser.
Det tilveiebringes sekvenser av flere nye AAV serotyper som er identifisert ved metoden ifølge oppfinnelsen samt karakteriseringen av disse serotyper.
Ul. Nye AAV serotyper
A. Nukleinsyresekvenser
Nukleinsyresekvenser av nye AAV serotyper som var identifisert ved oppfinnelsens metode tilveiebringes her, se SEQ ID nr. 1, 9 - 59 samt 117 - 120 hvortil det vises. Det skal også vises til figur 1 og sekvenslistene.
For den nye serotype AAV7 tilveiebringes full-lengde sekvensene inkludert AAV5' ITR'ene, capsid, rep og AAV3'ITR'ene i SEQ ID nr. 1.
For andre nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det omtrent 3,1 kb store fragment som var isolert ifølge oppfinnelsens metode. Dette fragment inneholder sekvenser som koder full-lengde capsid protein eller hele eller en del av sekvensene som koder rep proteinet. Disse sekvenser inkluderer klonene som er identifisert nedenfor.
For ytterligere andre AAV serotyper tilveiebringes det signaturområdet som koder capsid proteinet. For eksempel inkluderer AAV10 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen de som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 117 som spenner over 255 baser].
AAV11 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen inkluderer de DNA sekvenser som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 118 som spenner over 258 baser]. AAV 12 nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen inkluderer de DNA sekvenser som er illustrert i figur 1 [se SEQ ID nr. 19 som består av 258 baser]. Ved bruk av metodologien som beskrevet ovenfor kan videre AAV10-, AAV11- og AAV12-sekvensen lett identifiseres og anvendes for et antall formål inkludert det som er beskrevet for AAV7 og andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen.
Figur 1 tilveiebringer de ikke-human primat (NHP) AAV nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen i en innretning med alle tidligere publiserte AAV serotyper, AAV1 [SEQ ID nr. 6], AAV2 [SEQ ID nr. 7] og AAV3 [SEQ ID nr. 8]. Disse nye NHP sekvenser inkluderer de som er gitt i den følgende tabell 1 og som er identifisert ved klon nr.:
En ny NHP klon ble tildannet ved å spleise capsidfragmenter fra to sjimpanseadenovi-rus til et AAV2 rep konstrukt. Den nye klon, A3,l, er også kalt Ch.5 [SEQ ID nr. 20]. I tillegg inkluderer oppfinnelsen to human AAV sekvenser kalt H6 [SEQ ID nr. 25] og H2 [SEQ ID nr. 26].
AAV nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen omfatter videre tråden som er komplementær til de tråder som tilveiebringes i sekvensen som gitt i figur 1 og i sekvenslistene [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117 - 120], nukleinsyresekvenser så vel som RNA- og cDNA-sekvenser tilsvarende sekvensene som er gitt i figur 1 og sekvenslisten [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117-120], og deres komplementære tråder. Videre inkludert i nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen er naturlige varianter og konstruerte modifikasjoner av sekvensene ifølge figur 1 og sekvenslistene [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117-120] og deres komplementære tråder. Slike modifikasjoner inkluderer for eksempel merkelapper som er velkjente i teknikken, metylering, og substituering av en eller flere av de naturlig forekommende nukleotider med et degenerat nukleotid.
Videre inkludert i oppfinnelsen er nukleinsyresekvenser som er mer enn 85 %, fortrinnsvis minst rundt 90 % og aller helst minst rundt 95 %, spesielt minst rundt 98 til 99 % identiske eller homologe med sekvensene ifølge oppfinnelsen inkludert figur 1 og sekvenslisten [SEQ ID nr. 1, 9 - 59, 117-120]. Disse termer er som definert her.
Også inkludert i oppfinnelsen er fragmenter av de nye AAV sekvenser identifisert ved de her beskrevne metoder. Egnede fragmenter er minst 15 nukleotider lange og omfatter funksjonelle fragmenter, det vil si fragmenter som er av biologisk interesse. I en utførel-sesform er disse fragmenter slike av de nye sekvenser med figur 1 og sekvenslistene [SEQ ID nr. 1,9- 59, 117-120], deres komplementære tråder, cDNA og RNA som er komplementære dertil.
Eksempler på egnede fragmenter tilveiebringes med henblikk på lokasjonen av disse fragmenter på AAV1, AAV2 eller AAV7. Imidlertid kan fagmannen ved bruk av inn-retningene som her er gitt (oppnådd ved bruk av Clustal W programmet ved default innstilling), eller tilsvarende teknikker for å generere en innretning med andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen, lett identifisere de nøyaktige nukleotid start- og stopp-codoner for ønskede fragmenter.
Eksempler på egnede fragmenter inkluderer sekvensene som koder de tre variable proteiner (vp) av AAV capsidet som er alternative spleisevarianter: vpl [for eksempel nt 825 til 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]; vp2 [for eksempel nt 1234 - 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]; og vp3 [for eksempel nt 1434 - 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1]. Det er verdt å merke seg at AAV7 har en uvanlig GTG startcodon. Bortsett fra noen få hus-holdningsgener er en slik startcodon tidligere ikke rapportert i DNA vimser. Startcodonene for vpl, vp2 og vp3 for andre AAV serotyper er antatt å være slik at de tillater den cellulære mekanisme i vertscellen hvori de residerer å produser vpl, vp2 og vp3 i et forhold på henholdsvis 10 %: 10 %:80 %, for å tillate effektiv sammensetning av virionet. Imidlertid er AAV7 virionet funnet å sette seg sammen effektivt selv med denne sjeldne GTG startcodon. Således antar oppfinnerne at det er ønskelig å endre startcodonen for vp3 for andre AAV serotyper til å inneholde denne sjeldne GTG startcodon for å forbedre pakkingseffektiviteten, for å endre virionstrukturen og/eller for å endre lokasjonen av epitoper (for eksempel nøytraliserende antistoffepitoper) av andre AAV serotyper. Startcodonene kan endres ved bmk av konvensjonelle teknikker inkludert for eksempel seterettet mutagenese. Således omfatter foreliggende oppfinnelse endrede AAV virioner av en hvilken som helst valgt serotype, bestående av en vp3, og/eller eventuelt vpl og/eller vp2 med startcodoner endret til GTG.
Andre egnede fragmenter av AAV inkludert et fragment inneholdende startcodonen for AAV capsidproteinet [for eksempel nt 468 til 3090 av AAV7, SEQ ID nr. 1, nt 725 til
3090 av AAV7, SEQ ID nr. 1 og tilsvarende regioner av andre AAV serotyper]. Ytterligere andre fragmenter av AAV7 og de andre nye AAV serotyper som er identifisert ved bruk av de her beskrevne metoder inkluderer de som koder rep proteinene, inkludert rep 78 [for eksempel initialcodon 334 av figur 1 for AAV7], rep 68 [initialcodon nt 334 av
figur 1 for AAV7], rep 52 [initialcodon 1006 av figur 1 for AAV7] og rep 40 [initalco-don 1006 av figur 1 for AAV7]. Andre fragmenter av interesse kan inkludere de AAV5' inverterte terminalrepeat ITR'er [nt 1 til 107 av figur 1 for AAV7]; AAV3'ITR'er [nt 4704 til 4721 av figur 1 for AAV7], P19 sekvenser, AAV P40 sekvenser, rep bindings-sete og terminal resolutt sete (TRS). Ytterligere andre egnede fragmenter vil lett fremgå for fagmannen. De egnede områder i andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen kan lett bestemmes under henvisning til figur 1 eller ved å benytte konvensjonelle innretnings-teknikker med de sekvenser som her tilveiebringes.
I tillegg til å inkludere nukleinsyresekvensene som gis i figurene og sekvenslisten inkluderer oppfinnelsen nukleinsyremolekyler og sekvenser som er designert til å uttrykke aminosyresekvensene, proteinene og peptidene av AAV serotypene ifølge oppfinnelsen. Således inkluderer oppfinnelsen nukleinsyresekvenser som koder de følgende nye AAV aminosyresekvenser: Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ ID nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr. 73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3 A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24,1 [SEQ ID nr. 101], 42,2 [SEQ ID nr. 102], 7,2 [SEQ ID nr. 103], 27,3 [SEQ ID nr. 104], 16,3 [SEQ ID nr. 105], 42,10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], F5 [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112] og/eller 42-12 [SEQ ID nr. 113] og kunstige AAV serotyper som genereres ved bruk av disse sekvenser og/eller unike fragmenter derav.
Som benyttet her inkluderer kunstige AAV serotyper uten begrensning AAV med et ikke-naturlig forekommende capsid protein. Et slikt kunstig capsid kan generere ved en hvilken som helst egnet teknikk ved bruk av en ny AAV sekvens ifølge oppfinnelsen (for eksempel et fragment av et vpl capsid protein) i kombinasjon med heterologe sekvenser som kan oppnås fra en annen AAV serotype (kjent eller ny), ikke-kontigøse deler av den samme AAV serotype, fra en ikke-AAV viral kilde, eller fra en ikke-viral kilde. En kunstig AAV serotype kan uten begrensning være et kimerisk AAV capsid, et rekombinant AAV capsid eller et "humanisert" AAV capsid.
B. AAV aminosyresekvenser, proteiner og peptider
Oppfinnelsen tilveiebringer proteiner og fragmenter derav som kodes av nukleinsyresekvensen av de her identifiserte nye AAV serotyper inkludert for eksempel AAV7 [nt 825 til 3049 av AAV7, SEQ ID nr. 1], de andre nye serotyper som beskrevet her. Således kan capsidproteinene av de nye serotyper ifølge oppfinnelsen, inkludert: H6 [SEQ ID nr. 25], H2 [SEQ ID nr. 26], 42-2 [SEQ ID nr. 9], 42-8 [SEQ ID nr. 27], 42-15 [SEQ ID nr. 28], 42-5b [SEQ ID nr. 29], 42-lb [SEQ ID nr. 30], 42-13 [SEQ ID nr. 31], 42-3a [SEQ ID nr. 32], 42-4 [SEQ ID nr. 33], 42-5a [SEQ ID nr. 34], 42-10 [SEQ ID nr. 35], 42-3b [SEQ ID nr. 36], 42-11 [SEQ ID nr. 37], 42-6b [SEQ ID nr. 38], 43-1 [SEQ ID nr. 39], 43-5 [SEQ ID nr. 40], 43-12 [SEQ ID nr. 41], 43-20 [SEQ ID nr. 42], 43-21 [SEQ ID nr. 43], 43-23 [SEQ ID nr. 44], 43-25 [SEQ ID nr. 45], 44.1 [SEQ ID nr. 47], 44.5 [SEQ ID nr. 47], 223.10 [SEQ ID nr. 48], 223.2 [SEQ ID nr. 49], 223.4 [SEQ ID nr. 50], 223.5 [SEQ ID nr. 51], 223.6 [SEQ ID nr. 52], 223.7 [SEQ ID nr. 53], A3.4 [SEQ ID nr. 54], A3.5 [SEQ ID nr. 55], A3.7 [SEQ ID nr. 56], A3.3 [SEQ ID nr. 57], 42.12 [SEQ ID nr. 58] og 44.2 [SEQ ID nr. 59], lett genereres ved bruk av konvensjonelle teknikker fra de åpne leserammer som tilveiebringes for de ovenfor anførte kloner.
Oppfinnelsen omfatter videre AAV serotyper som er generert ved bruk av sekvenser av de nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen og som er generert ved bruk av syntetiske, rekombinante eller andre teknikker som velkjente for fagmannen. Oppfinnelsen er ikke begrenset til nye AAV aminosyresekvenser, peptider og proteiner som er uttrykt fra de nye AAV nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen og omfatter aminosyresekvenser, peptider og proteiner som er generert ved andre metoder som kjent i teknikken, inkludert for eksempel ved kjemisk syntese, eller ved andre syntetiske teknikker, eller ved andre metoder. For eksempel kan sekvensene av en hvilken som helst av Cl [SEQ ID nr. 60], C2 [SEQ ID nr. 61], C5 [SEQ Id nr. 62], A3-3 [SEQ ID nr. 66], A3-7 [SEQ ID nr. 67], A3-4 [SEQ ID nr. 68], A3-5 [SEQ ID nr. 69], 3.3b [SEQ ID nr. 62], 223.4 [SEQ ID nr.73], 223-5 [SEQ ID nr. 74], 223-10 [SEQ ID nr. 75], 223-2 [SEQ ID nr. 76], 223-7 [SEQ ID nr. 77], 223-6 [SEQ ID nr. 78], 44-1 [SEQ ID nr. 79], 44-5 [SEQ ID nr. 80], 44-2 [SEQ ID nr. 81], 42-15 [SEQ ID nr. 84], 42-8 [SEQ ID nr. 85], 42-13 [SEQ ID nr. 86], 42-3A [SEQ ID nr. 87], 42-4 [SEQ ID nr. 88], 42-5A [SEQ ID nr. 89], 42-1B [SEQ ID nr. 90], 42-5B [SEQ ID nr. 91], 43-1 [SEQ ID nr. 92], 43-12 [SEQ ID nr. 93], 43-5 [SEQ ID nr. 94], 43-21 [SEQ ID nr. 96], 43-25 [SEQ ID nr. 97], 43-20 [SEQ ID nr. 99], 24.1 [SEQ ID nr. 101], 42.2 [SEQ ID nr. 102], 7.2 [SEQ ID nr. 103], 27.3 [SEQ ID nr. 104], 16.3 [SEQ ID nr. 105], 42.10 [SEQ ID nr. 106], 42-3B [SEQ ID nr. 107], 42-11 [SEQ ID nr. 108], Fl [SEQ ID nr. 109], F5 [SEQ ID nr. 110], F3 [SEQ ID nr. 111], 42-6B [SEQ ID nr. 112], og/eller 42-12 [SEQ ID nr. 113] lett genereres ved bruk av et antall teknikker.
Egnede produksjonsteknikker er velkjente for fagfolk på området, se for eksempel Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativt kan peptider også syntetiseres ved den godt kjente fastfasepeptidsyntesemetode (Merrifield, "J. Am. Chem. Soc", 85:2149 (1962); Stewart og Young, "Solid PhasePeptide Synthesis" (Freeman, San Francisco, 1969),s. 27-62). Disse og andre egnede produksjonsmetoder ligger innenfor fagmannens kunn-skapsområde og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
Spesielt ønskelige proteiner inkluderer AAV capsidproteinene som kodes av nukleotid-sekvensene som identifisert ovenfor. Sekvensene av mange av capsidproteinene ifølge oppfinnelsen er tilveiebragt i en innretning i figur 12 og/eller i sekvenslistene, SEQ ID nr. 2 og 60 til 115 hvortil det vises når det gjelder detaljer. AAV capsidet består av tre proteiner, vpl, vp2 og vp3, som er alternative spleisevarianter. Full-lengde sekvensen som tilveiebringes i disse figurer er den til vpl. Basert på nummereringen av AAV7 capsidet [SEQ ID nr. 2] spenner sekvensene av vp2 over aminosyre 138 - 737 av AAV7 og sekvensene av vp3 spenner over aminosyrene 203 - 737 av AAV7. Med denne informasjon kan fagmannen lett bestemme lokasjonen for vp2- og vp3-proteinene for de andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen.
Andre ønskelige proteiner og fragmenter av capsidproteinet inkluderer de konstante og variable områder, lokalisert mellom hypervariable områder (HPV) og sekvensene av HPV områdene selv. En algoritme utviklet for å bestemme arealer med sekvensdivergens i AAV2 har gitt 12 hypervariable områder (HVR) av hvilke 5 overlapper eller er del av de fire tidligere beskrevne variable områder, se Chiorini et al, "J. Virol", 73:1309-19 (1999), Rutledge et al, "J. Virol.", 72:309-319. Ved bruk av denne algoritme og/eller innretningsteknikkene som beskrevet her bestemmes HVR av de nye AAV serotyper. Med henblikk på numre av AAV2 vpl [SEQ ID nr. 70], er for eksempel HVR lokalisert som følger: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264, HVR4, aa 381-383, HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; ogHVR12, aa 705-719. Ved bruk av en innretning fremstilt i henhold til konvensjonelle metoder og de nye sekvenser som er gitt her, se for eksempel figur 2, kan man lett bestemme lokasjonen av denne HVR i de nye AAV serotyper ifølge oppfinnelsen. Ved bruk for eksempel av figur 2 kan man lett bestemme at for AAV7 [SEQ ID nr. 2] er HVRl lokalisert ved aa 146 - 152; er HVR2 lokalisert ved 182-187; er HVR3 lokalisert ved 263-266, er HVR4 lokalisert ved aa 383-385, er HVR5 lokalisert ved aa 451-475; er HVR6 lokalisert ved aa 491-496, er HVR7 lokalisert ved aa 501-505; er HVR8 lokalisert ved aa 513-521; erHVR9 lokalisert ved 533-554; erHVRlO lokalisert ved aa 583-596; er HVRl 1 lokalisert ved aa 660-669, er HVR12 lokalisert ved 707-721. Ved bruk av den her gitte informasjon kan HVR'ene for de andre nye serotyper ifølge oppfinnelsen lett bestemmes.
I tillegg er, i capsidet, aminosyreidentitetskassettene identifisert. Disse kassetter er av spesiell interesse da de er brukbare ved konstruering av kunstige serotyper, for eksempel ved å erstatte en HVRl kassett av en valgt serotype med en HVRl kassett av en annen serotype. Visse av disse identitetskassetter er angitt i figur 2, se figur 2, som tilveiebringer Clustal X innretningen som har en lineal vist under sekvensen og som star-ter ved 1 for posisjonen for den første rest. Linjen over lineal en benyttes for å markere sterkt konserverte posisjoner. Tegnene (<*>, :,.) benyttes. "<*>" antyder posisjoner som har en enkelt, helt konservert rest.":" antyder at en "sterk" gruppe er helt bevart."." indikerer at en "svakere" gruppe er fullt konservert. Dette er alle positivt bedømmende grupper som opptrer i Gonnet Pam250 matrisen. De sterke grupper er definert som en sterk bedømmelse >0,5 og de svake grupper er definert som svak bedømmelse <0,5.
I tillegg inkluderer eksempler på andre egnede fragmenter av AAV capsider, med henblikk på nummerering av AAV2 [SEQ ID nr. 70], aa 24 - 42, aa 25- 28; aa 81 - 85; Aal33-165; aa 134- 165; aa 137-143; aa 154-156; aa 194-208; aa 261-274; aa262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Ytterligere andre ønskelige fragmenter inkluderer for eksempel, i AAV7, aminosyrene 1 til 184 av SEQ ID nr. 2, aminosyrene 199 til 259; aminosyrene 274 til 446; aminosyrene 603 til 659; aminosyrene 670 til 706; aminosyrene 724 til 736; aa 185 til 198; aa 260 til 273; aa 447 til 477; aa 495 til 602; aa 660 til 669; og aa 707 til 723. Ytterligere andre ønskelige områder, basert på nummereringen av AAV7 [SEQ ID nr. 2] er valgt fra gruppen bestående av aa 185 til 198; aa 260 til 273; aa 447 til 477; aa 495 til 602; aa 660 til 669; og aa 707 til 723. Ved bruk av innretningen som tilveiebragt her, oppnådd ved bruk av Clustal X programmet ved default innstillinger, eller ved bruk av andre kommersielt eller ålment tilgjengelige innretningsprogrammer ved default innstillinger, kan fagmannen lett bestemme tilsvarende fragmenter av de nye AAV capsider ifølge oppfinnelsen.
Andre ønskelige proteiner er AAV rep proteinene [aa 1 til623 av SEQ ID nr. 3 for AAV7] og funksjonelle fragmenter derav inkludert for eksempel aa 1 til 171, aa 172 til 372, aa 373 til 444, aa 445 til 623 av SEQ ID nr. 3, blant andre. Hensiktsmessig er disse fragmenter minst 8 aminosyrer lange, se figur 3. Sammenlignbare områder kan identifiseres i proteinene av andre nye AAVer ifølge oppfinnelsen ved bruk av de her beskrevne teknikker og de som er kjente i teknikken. I tillegg kan fragmenter av andre ønskede lengder lett benyttes. Slike fragmenter kan produseres rekombinant eller ved andre egnede midler, for eksempel kjemisk syntese.
Sekvensene, proteinene og fragmentene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på en hvilken som helst egnet måte inkludert rekombinantproduksjon, kjemisk syntese eller andre syntetiske midler. Slike produksjonsmetoder ligger innenfor fagmannens kunnskapsom-råde og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
IV. Produksjon av rAAV med nye AAV capsider
Oppfinnelsen omfatter nye, vill-type AAV serotyper som er identifisert ifølge oppfinnelsen, der sekvensene av disse vill-type AAV serotyper er frie for DNA og/eller cellu-lært materiale som disse vimser er forbundet med i naturen. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen molekyler som benytter de nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen, inkludert fragmenter derav, for fremstilling av molekyler som er brukbare ved avlevering av et heterologt gen eller andre nukleinsyresekvenser til en målcelle.
Molekylene ifølge oppfinnelsen som inneholder sekvenser av en ny AAV serotype iføl-ge oppfinnelsen inkluderer et hvilket som helst genetisk element (vektor) som kan avgis til en vertscelle, for eksempel naken DNA, et plasmid, en fag, en transposon, et cosmid, et episom, et protein i en ikke-viral avleveringsbærer (for eksempel en lipidbasert bærer), en vims og så videre som overfører sekvensen som bæres derpå. Den valgte vektor kan avleveres ved hjelp av en hvilken som helst egnet metode inkludert transfeksjon, elektroporering, liposomavlevering, membranfusjonsteknikker, høyhastighets DNA-belagte pellets, viralinfeksjon og protoplastfusjon. Metodene som benyttes for å konstruere enhver utførelsesform av oppfinnelsen er velkjente for fagmannen på nukleinsy-remanipulering og inkluderer genetisk konstruksjon, rekombinant konstruksjon og syn-teseteknikker, se for eksempel Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
I en utførelsesform inneholder vektorene ifølge oppfinnelsens sekvenser som koder et nytt AAV capsid ifølge oppfinnelsen (for eksempel AAV7 capsid, AAV 44-2 (rh.10), et AAV10 capsid, et AAV11 capsid, et AAV12 capsid), eller et fragment av et eller flere av disse AAV capsider. Alternativt kan vektorene selv inneholde capsidproteinet eller et fragment derav.
Eventuelt kan vektorene ifølge oppfinnelsen inneholde sekvenser som koder AAV rep proteiner. Slike rep sekvenser kan være fra den samme AAV serotype som tilveiebringer cap sekvensen. Alternativt tilveiebringer oppfinnelsen vektorer hvor rep sekvensen er fra en AAV serotype som skiller seg fra den som tilveiebringer cap sekvensene. I en utførelsesform blir rep- og cap-sekvensene uttrykt fra separate kilder (for eksempel separate vektorer, eller en vertscelle og en vektor). I en annen utførelsesform blir disse rep sekvenser uttrykt fra den samme kilde som cap sekvensene. I denne utførelsesform kan rep sekvensene fuseres i rammen til cap sekvensene av en forskjellig AAV serotype for å danne en kimer AAV vektor. Eventuelt kan vektorene ifølge oppfinnelsen videre inneholder et minigen omfattende et valgt transgen som er flankert av AAV5' ITR og
AAV3'ITR.
Således inneholder i en utførelsesform de her beskrevne vektorer nukleinsyresekvenser som koder et intakt AAV capsid som kan være fra en enkelt AAV serotype (for eksempel AAV7 eller en annen ny AVV). Alternativt inneholder disse vektorer sekvenser som koder kunstige capsider som inneholder ett eller fleres fragmenter av AAV7 (eller en annen ny AAV capsid) fusert til heterologe AAV- eller ikke-AAV capsidproteiner eller fragmenter derav. Disse kunstige capsidproteiner er valgt blant ikke-kontigøse deler av AAV7 (eller en annen ny AAV) capsid eller fra capsider av andre AAV serotyper. For eksempel kan det være ønskelig å modifisere de kodende områder av en eller flere av AAV vpl, for eksempel i ett eller flere av de hypervariable områder (det vil si HPV1-12), eller vp2 og/eller vp3.1 et annet eksempel kan det være ønskelig å endre startcodonen for vp3 proteinet til GTG. Disse modifikasjoner kan skje for å øke ekspresjon, utbytte og/eller forbedre rensing i de valgte ekspresjonssystemer, eller for et annet ønsket formål (for eksempel for å endre tropismen eller endre nøytraliseringsantistoffepito-pene).
Vektorene som beskrives her, for eksempel et plasmid, er brukbare for et antall formål men er spesielt godt egnet for bruk ved produksjon av en rAAV inneholdende et capsid omfattende AAV sekvenser eller et fragment derav. Disse vektorer, inkludert rAAV, deres elementer, konstruksjon og anvendelse er beskrevet i detalj her.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å generere en rekombinant, adenoassosiert virus (AAV) med et AAV serotype 7 (eller et annet nytt AAV) capsid, eller en del derav. En slik metode involverer dyrking av en vertscelle som inneholder en nukleinsyresekvens som koder et adenoassosiert virus (AAV) serotype 7 (eller et annen nytt AAV) capsid protein eller et fragment derav, som definert her; et funksjonelt rep gen; et minigen bestående minimum av AAV inverterte terminal repeater (ITR'er) og et transgen; og tilstrekkelig med hjelperfunksjoner til å tillate pakking av minigenet inn i AAV7 (eller et annet nytt AAV) capsid protein.
Komponentene som kreves for dyrking i vertscellen for pakking av et AAV minigen i et AAV capsid kan tilveiebringes i vertscellen in trans. Alternativt kan hvilke som helst en eller flere av de krevede komponenter (for eksempel minigen, rep sekvenser, cap sekvenser, og/eller hjelperfunksjoner) tilveiebringes av en stabil vertscelle som er konstruert til å inneholde en eller flere av de nødvendige komponenter ved bruk av i og for seg kjente metoder for fagmannen. Helst vil en slik stabil vertscelle inneholde den eller de krevede komponenter under kontroll av en induserbar promoter. Imidlertid kan den eller de krevede komponenter være under kontroll av en konstitutiv promoter. Eksempler på egnede induserbare og konstitutive promotere gis her i diskusjonen av regulatoriske elementer som er egnet for bruk med transgenet. I nok et alternativ kan en valgt, stabil vertscelle inneholde en eller flere valgte komponenter under kontroll av en konstitutiv promoter og en eller flere andre valgte komponenter under kontroll av en eller flere induserbare promotere. For eksempel kan en stabil vertscelle genereres avledet fra 293 celler (som inneholder El hjelperfunksjoner under kontroll av en konstitutiv promoter), men som inneholder rep- og/eller cap proteinene under kontroll av induserbare promotere. Ytterligere andre stabile vertsceller kan genereres av fagmannen på området.
Minigenet, rep sekvensene, cap sekvensene og hjelperfunksj onene som er nødvendige for å produsere oppfinnelsens rAAV kan avleveres til den pakkende vertscelle i form av et hvilket som helst genetisk element som overfører sekvensene som bæres derpå. Det valgte, genetiske element kan avleveres ved en hvilken som helst egnet metode inkludert de som er beskrevet her. Metodene som benyttes for å konstruere en hvilken som helst utførelsesform av oppfinnelsen er velkjente for fagmannen på området nukleinsy-remanipulering og inkluderer genetisk konstruksjon, rekombinant konstruksjon og syntetiske teknikker, se for eksempel Sambrook et al. i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. På tilsvarende måte er metoder for generering av rAAV virioner velkjent og valget av en egnet metode er ingen begrensning for oppfinnelsen, se for eksempel K. Fisher et al. i "J. Virol.", 70:520-532 (1993) samt US 5 478 745.
A. Minigen
Minigenet består minimum av et transgen og dettes regulatoriske sekvenser, og 5'- og 3' AAV inverterte terminal repeater (ITR'er). Det er dette minigen som pakkes inn i et capsidprotein og avgis til en valgt vertscelle.
1. Transgen
Transgenet er en nukleinsyresekvens, heterolog til vektorsekvensene som flankerer transgenet, som koder et polypeptid, et protein eller et annet produkt av interesse. Den nukleinsyrekodende sekvens er operativt forbundet med regulatoriske komponenter på en måte som tillater transgen transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en vertscelle.
Sammensetningen av transgensekvensen vil avhenge av den anvendelse den resulterende vektor vil brukes for. For eksempel inkluderer en type transgensekvens en rapportør-sekvens som ved ekspresjon produserer et detekterbart signal. Slike rapportørsekvenser inkluderer uten begrensning DNA sekvenser som koder fJ-laktamase, P-galaktosidase
(LacZ), alkalisk fosfatase, tymidinkinase, grønt fluorescent protein (GFP), kloramfeni-kol acetyltransferase (CAT), luciferase, membranbundne proteiner inkludert for eksempel CD2, CD4, CD8, influensa hemagglutininproteinet, og andre som er velkjente i teknikken, til hvilke det foreligger høyaffinitetsantistoff rettet mot det eller kan produseres ved konvensjonelle midler, og fusjonsproteiner omfattende et membranbundet protein som på egnet måte er fusert til et anti-gen tag domene fra blant annet hemagglutinin eller Mye.
Disse kodende sekvenser, assosiert med regulatoriske elementer som driver deres ekspresjon, gir signaler som er detekterbare ved konvensjonelle midler inkludert enzyma-tiske, radiografiske, kolorimetriske, fluoressens- eller andre spektrografiske analyser, fluorescentaktiverende cellesorteringsanalyser og immunologiske analyser, inkludert enzymlinket immunoabsorbentanalyse (ELISA), radioimmunoanalyse (RIA) og im-munohistokjemi. Der for eksempel markørsekvensen er LacZ genet blir nærværet av vektoren som bærer signalet detektert ved analyser på P-galaktosidaseaktivitet. Der transgenet er grønt fluorescent protein eller luciferase kan vektoren som bærer signalet måles visuelt ved farve- eller lysproduksjon i et luminometer.
Imidlertid er transgenet helst en ikke-markør sekvens som koder et produkt som er brukbart i biologi og medisin som proteiner, peptider, RNA, enzymer, eller katalytiske RNA'er. Øskede RNA molekyler inkluderer tRNA, dsRNA, ribosomal RNA, katalytiske RNA'er og antisense RNA'er. Et eksempel på en brukbar RNA sekvens er en sekvens som sletter ekspresjon av en innsiktet nukleinsyresekvens i det behandlede dyr.
Transgenet kan benyttes for å korrigere eller forbedre gendefekt og som kan inkludere defekter der normale gener uttrykkes i mindre enn normale nivåer eller defekter der det funksjonelle genprodukt ikke uttrykkes. En foretrukken type transgensekvenser koder et terapeutisk protein eller et polypeptid som uttrykkes i en vertscelle. Oppfinnelsen inkluderer videre bruken av multiple transgener, for eksempel for å korrigere eller forbedre en gendefekt forårsaket av et multisubenhetprotein. I visse situasjoner kan et forskjellig transgen benyttes for å kode hver subenhet av et protein, eller for å kode forskjellige peptider eller proteiner. Dette er ønskelig når størrelsen av det DNA som koder protein-subenheten er stor, for eksempel for et immunoglobulin, den plateavledede vekstfaktor, eller et dystrofint protein. For at cellen skal produsere multisubenhetproteinet blir cellen fisert med den rekombinante virus inneholdende hver av de forskjellige subenheter. Alternativt kan forskjellige subenheter av et protein kodes av det samme transgen. I dette tilfelle inkluderer et enkelt transgen det DNA som koder hver av subenhetene med DNA for hver subenhet separert av et indre ribozym inngangssete (IRES). Det er ønskelig når størrelsen for det DNA som koder hver av subenhetene er liten, for eksempel at den totale størrelse for det DNA som koder subenhetene og IRES er mindre enn fem kilobaser. Som et alternativ til en IRES kan det angjeldende DNA være separert av sekvenser som koder et 2A peptid, som er selvspaltende i et post-translasjonelt evenement, se for eksempel M L. Donnelly et al. i "J. Gen. Virol.", 78(Pt 1): 13-21 (Jan 1997); S Furier et al. i "Gene Ther.", 8(ll):864-873 (Juni 2001); H Klump et al. i "Gene Ther.", 8(10:811-817 (Mai 2001). Dette 2A peptid er signifikant mindre enn en IRES, noe som gjør det velegnet for bruk når rommet er en begrensende faktor. Imidlertid kan det valgte transgen kode et hvilket som helst, biologisk aktivt produkt eller et annet produkt, for eksempel et produkt som er ønskelig for studier.
Egnede transgener kan lett velges av fagmannen på området. Valget av transgen er ikke ansett som en begrensende faktor for oppfinnelsen.
2. Regulatoriske elementer
I tillegg til hovedelementene som er identifisert ovenfor for minigenet inkluderer vektoren også nødvendige, konvensjonelle kontrollelementer som operativt er forbundet til transgenet på en måte som tillater dets transkripsjon, translasjon og/eller ekspresjon i en celle som er transfektert med plasmidvektoren eller infisert med virusen som produseres ifølge oppfinnelsen. Som benyttet her inkluderer "operativt forbundne" sekvenser både ekspresjonskontrollsekvenser som er tilstøtende genet av interesse og ekspresjonskontrollsekvenser som virker in trans eller i en avstand for å kontrollere genet av interesse.
Ekspresjonskontroll sekvenser inkluderer egnede transkripsjonsinitierings-, -terminerings-, promoter- og enhancersekvenser; effektive RNA prosesseringssignaler som spleise- og polyadenylerings (poly A) signaler, sekvenser som stabiliserer cyto-plasmiske mRNA; sekvenser som forbedrer translasjonseffektiviteten (det vil si Kozak konsensus sekvens); sekvenser som forbedrer proteinstabiliteten; og, hvis ønskelig, sekvenser som forbedrer sekresjonen av det kodede produkt. Et stort antall ekspresjonskontroll sekvenser, inkludert promotere som er native, konstitutive, induserbare og/eller vevspesifikke, er velkjente i teknikken og kan benyttes.
Eksempler på konstitutive promotere inkluderer, uten begrensning, den retrovirale Rous sarkoma virus (RSV) LTR promoter (eventuelt med RSV enhanceren), cytomegalovirus (CMV) promoteren (eventuelt med CMV enhanceren), [se for eksempel Boshart et al. i "Cell", 41:521-530 (1985)], SV40 promoteren, dihydrofolatreduktasepromoteren, p-aktivpromoteren, fosfoglycerol kinase (PGK) promoteren, og EF la promoteren [Invitrogen].
Induserbare promotere tillater regulering av genekspresjon og kan reguleres ved eksogent tilførte forbindelser, miljøfaktorer som temperatur, eller nærværet av en spesifikk fysiologisk tilstand, for eksempel akuttfase, en spesiell differensieringstilstand for cellen, eller kun i replikerende celler. Induserbare promotere og induserbare systemer er tilgjengelige fra et antall kommersielle kilder inkludert, uten begrensning, Invitrogen, Clontech og Ariad. Mange andre systemer er beskrevet og kan lett velges av fagmannen. Eksempler på induserbare promotere som reguleres av eksogent tilførte promotere inkluderer den sinkinduserbare saue metallotionin (MT) promoter, den deksametason (Dex)-induserbare musebrysttumorvirus (MMTV) promoter, T7 polymerase promoter system [WO 98/10088]; ekdyson insektpromoteren [No et al. "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 93:3346-3351 (1996)], det tetracyklinrepresserbare system [Gossen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 89:5547-5551] (1992)], det tetracyklininduserbare system [Gossen et al. "Science", 268:1766-1769 (1995), se også Harvey et al. "Curr. Opin. Chem. Biol.", 2:512-518 (1998)], det RU486-induserbare system [Wang et al., "Nat. Biotech.", 15:239-243 (1997) og Wang et al., "Gene Ther.", 4:432-441 (1997)] og det rapamycin-induserbare system [Magari et al., "J. Clin. Invest", 100:2865-2872 (1997)]. Ytterligere andre typer av induserbare promotere som kan være brukbare i denne kontekst er de som reguleres av en spesifikk, fysiologisk tilstand, for eksempel temperatur, akuttfase, en spesiell differensieringstilstand hos cellen eller kun i replikerende celler.
I en annen utførelsesformer vil man benytte den native promoter for transgenet. Den native promoter kan være foretrukket når det er ønskelig at ekspresjonen av transgen
etterligner den native ekspresjon. Den native promoter kan benyttes når ekspresjonen av transgenet må reguleres temporært eller utviklingsmessig, eller i en vevspesifikk modus, eller som respons på spesifikke transkripsjonelle stimuli. I en ytterligere utførelsesform kan andre native ekspresjonskontrollelementer som enhancerelementer, polyadenyle-ringsseter eller Kozak konsensus sekvenser også benyttes for å etterligne den native ekspresjon.
En annen utførelsesform av transgenet inkluderer et transgen som operativt er forbundet med en vevspesfikk promoter. Hvis det for eksempel er ønskelig med ekspresjon i ge-lettmuskelen bør det benyttes en promoter som er aktiv i muskler. Disse inkluderer promotere fra gener som koder skjelett P-aktin, myosin lettkjedet 2A, dystofin, muskel - kreatin kinase, så vel som syntetiske muskelpromotere som aktiverer høyere enn naturlig forekommende promotere, (se Li et al. i "Nat. Biotech.", 17:241-245 (1999)). Eksempler på promotere som er vevspesifikke er kjente for leveren (albumin, Miyatake et al. i "J. Virol.", 71:5124-32 (1997); hepatitt B virus kjernepromoter, Sandig et al. i "Ge-ne Ther.", 3:1002-9 (1996); a-fetoprotein (AFP); Arbuthnot et al. i "Hum. Gene Ther.", 7:1503-14 (1996)), benosteokalcin (Stein et al. i "Mol. Biol. Rep." 24:185-96 (1997)), bensialoprotein (Chen et al. i "J. Bone Miner. Res.", 11:654-64 (1996)), lymfocytter (CD2, Hansal et al. i "J. Immunol.", 161:1063-8 (1998), immunoglobulin tungkjede; T celle receptor a kjede), neuronal som neuron-spesifikk enolase (NSE) promoter (Ander- sen et al. i "Cell. Mol. Neurobiol.", 13:503-15 (1993)), neurofilament lett-kjede gen (Piccioli et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 88:5611-5 (1991)) og det neuro-spesifikke vgf gen (Piccioli et al. i "Neuron", 15:373-84 (1995)), blant andre.
Eventuelt kan plasmider som bærer terapeutisk brukbare transgener også inkludere valgbare markører eller rapportørgener kan inkludere sekvenser som koder geneticin-, hygromicin- eller purimycinresistens, blant andre. Slike valgbare rapportører eller mar-kørgener (fortrinnsvis lokalisert utenfor det virale genom som skal tilveiebringes via oppfinnelsens metode) kan benyttes for å signalisere nærværet av plasmidene i bakterieceller, som ampicillinresistens. Andre komponenter av plasmidet kan inkludere en replikasjonsopprinnelse. Valget av disse og andre promotere og vektorelementer er konvensjonelle og mange slike sekvenser er tilgjengelige, se for eksempel Sambrook et al. og de deri angitte referanser.
Kombinasjonen av transgenet, promoter/enhancer, og 5- og 3' ITR'ene angis som et "minigen" for hensiktsmessighetens skyld i foreliggende beskrivelse. Tilveiebragt sammen med læren ifølge oppfinnelsen vil konstruksjonen av et slikt minigen lett kunne foretas ved å ty til konvensjonelle teknikker.
3. Avlevering av minigenet til en pakkende vertscelle
Minigenet kan bæres på en hvilken som helst egnet vektor, for eksempel et plasmid, som avgis til en vertscelle. Plasmider som er brukbare ifølge oppfinnelsen kan konstrueres slik at de er egnet for replikasjon og eventuelt integrasjon i prokaryotiske celler, pattedyrceller eller begge deler. Disse plasmider (eller andre vektorer som bærer de 5' AAV ITR-heterolog molekyl-3' ITR) inneholder sekvenser som tillater replikasjon av minigenet i eukaryoter og/eller prokaryoter og seleksjonsmarkører for disse systemer. Valgbare markører eller rapportørgener kan inkludere sekvenser som koder genetisin-, hygromicin- eller purimycinresistens, blant andre. Plasmidene kan også inneholde visse valgbare rapportører eller markørgener som kan benyttes for å signalisere nærværet av vektoren i bakterieceller, som ampicillinresistens. Andre komponenter av plasmidet kan inkludere en replikasjonsopprinnelse og et amplikon, for eksempel det amplikonsystem som benytter Epstein Barr virus nukleær antigenet. Dette amplikon system, eller andre tilsvarende amplikon komponenter, tillater høy kopi episomal replikasjon i cellene. Fortrinnsvis blir molekylet som bærer minigenet transfektert inn i cellen der det kan eksistere transient. Alternativt kan minigenet (som bærer den angjeldende 5' AAV ITR-heterologmolekyl-3' ITR) stabilt være integrert i genomet av vertscellen, enten kromo-somalt eller som et episom. I visse utførelsesformer kan minigenet være til stede i mul tiple kopier, eventuelt i hode-mot-hode-, hode-mot-hale- eller hale-mot-hale kontakta-merer. Egnede transfeksjonsteknikker er velkjente og kan lett benyttes for å avgi minigenet til vertscellen.
Ved avlevering av vektoren omfattende minigenet ved transfeksjon blir generelt vektoren avgitt i en mengde fra rundt 5 ug til rundt 100 ug DNA og fortrinnsvis rundt 10 til rundt 50 ug DNA til rundt 1 x IO<4>celler til rundt 1 x IO13 celler og fortrinnsvis rundt 10<5>celler. Imidlertid kan de relative mengder av vektor DNA i forhold til vertsceller justeres, tatt i betraktning faktorer som valgt vektor, avleveringsmetode og de valgte vertsceller.
B. Rep- og Cap sekvenser
I tillegg til minigenet inneholder vertscellen de sekvenser som driver ekspresjonen av det nye AAV capsid protein (for eksempel AAV7- eller annet nytt AAV capsid eller et kunstig capsid protein omfattende et fragment av ett eller flere av disse capsider) i vertscellen og rep sekvenser av den samme serotype som serotypen av de AAV ITR'er som ble funnet i minigenet. AAV cap- og -rep sekvensene kan uavhengig oppnås fra en AAV kilde som beskrevet ovenfor og kan innføres i vertscellen på en hvilken som helst kjent måte for fagmannen som beskrevet ovenfor. I tillegg og ved pseudotyping av et nytt AAV capsid ifølge oppfinnelsen kan sekvensene som koder hvert av de essensielle rep proteiner suppleres med den samme AAV serotype, eller sekvensene som koder rep proteinene kan suppleres med forskjellige AAV serotyper (for eksempel AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 eller en av de nye serotyper som er identifisert her). For eksempel kan rep78/68 sekvensene være fra AAV2 mens rep52/40 sekvensene kan være fraAAVl.
I en utførelsesform inneholder vertscellen stabilt capsidprotein under kontroll av en egnet promoter, for eksempel de som er beskrevet ovenfor. Aller helst og i denne utførel-sesform uttrykkes capsidproteinet under kontroll av en induserbar promoter. I en annen utførelsesform bringes capsidproteinet til veie til vertscellen in trans. Avgitt til vertscellen in trans kan capsidproteinet avgis via et plasmid som inneholder se sekvenser som er nødvendige for å styre ekspresjonen av det valgte capsidprotein i vertscellen. Helst bærer plasmidet som bærer capsidproteinet, når det avgis til vertscellen in trans, også andre sekvenser som er nødvendige for pakking av den angjeldende rAAV, for eksempel rep sekvensene.
I en annen utførelsesform inneholder vertscellen stabilt rep sekvensene under kontroll av en egnet promoter som de som er beskrevet ovenfor. Helst blir de essensielle rep proteiner, i denne utførelsesform, uttrykt under kontroll av en induserbar promoter. I en annen utførelsesform tilveiebringes rep proteinene til vertscellene in trans. Avgitt til vertscellen in trans kan rep proteinene avlevers via et plasmid som inneholder de sekvenser som er nødvendige for å styre ekspresjonen av de valgte rep proteiner i vertscellen. Aller helst bærer plasmidet som bærer capsidet, når det avgis til vertscellen in trans, også andre sekvenser som er nødvendige for å pakke den angjeldende rAAV, for eksempel rep- og cap sekvensene.
I en utførelsesform kan således rep- og cap-sekvensene transfekteres inn i vertscellen på et enkelt nukleinsyremolekyl og eksistere stabilt i cellen som et episom. I en annen utfø-relsesform blir rep- og cap sekvensene stabilt integrert inn i genomet av cellen. En annen utførelsesform har rep- og trans sekvensene transient uttrykt i vertscellen. For eksempel omfatter et brukbart nukleinsyremolekyl for slik transfeksjon, fra 5'til 3', en promoter, en eventuell spacer anordnet mellom promoteren og startsetet for rep gen sekvensen, en AAV rep gen sekvens, og en AAV cap gen sekvens.
Eventuelt kan rep- og/eller cap sekvensene tilveiebringes på en vektor som inneholder andre DNA sekvenser som skal innføres i vertscellen. For eksempel kan vektoren inneholde rAAV konstruktet omfattende minigenet. Vektoren kan omfatte ett eller flere gener som koder hjelperfunksjonene, for eksempel de adenovirale proteiner El, E2a, og E40RF6, og genet for VAI RNA.
Fortrinnsvis kan promoteren som brukes i dette konstrukt være en hvilken som helst av de konstitutive, induserbare eller native promotere som er velkjente for fagmannen på området eller som diskutert ovenfor. I en utførelsesform benyttes en AAV P5 promoter sekvens. Valget av AAVen for å tilveiebringe en hvilken som helst av disse sekvenser er ikke en begrensning for oppfinnelsen.
I en annen foretrukken utførelsesform er promoteren for rep en induserbar promoter som diskutert ovenfor i forbindelse med de transgenregulatoriske elementer. En foretrukken promoter for repekspresjon er T7 promoteren. Vektoren omfattende rep genet som reguleres av T7 promoteren og cap genet transfekteres eller transformeres inn i en celle som enten konstitutivt eller induserbart uttrykker T7 polymerasen, se WO 98/10088, publisert 12. mars 1998.
Spaceren er et eventuelt element i konstruksjonen av vektoren. Spaceren er en DNA sekvens som er anbragt mellom promoteren og rep genet ATG startsete. Spaceren kan ha en hvilken som helst ønsket konstruksjon, det vil si at den kan være en vilkårlig sekvens av nukleotider eller kan eventuelt kode et genprodukt, for eksempel et markørgen. Spaceren kan inneholde gener som typisk inkorporerer start/stopp- og polyA seter. Spaceren kan være en ikke-kodende DNA sekvens fra en prokaryot eller en eukaryot, en repetitiv ikke-kodende sekvens, en kodende sekvens uten transkripsjonene kontroller eller en kodende sekvens med transkripsjonene kontroller. To eksempelkilder for spa-cersekvensen er a fag stigesekvens eller gjærstigesekvensen, som er kommersielt tilgjengelige, for eksempel blant annet fra Gibco eller Invitrogen. Spaceren kan være av en hvilken som helst størrelse tilstrekkelig til å redusere ekspresjonen av rep78- og rep68 genproduktene og etterlate rep52-, rep40- og cap gen produktene uttrykt i normale nivåer. Lengden av spaceren kan derfor ligge fra rundt 10 bp til rundt 10,0 kbp, fortrinnsvis i ormådet rundt lOObp til rundt 8,0 kbp. For å redusere muligheten for rekom-binasjon har spaceren fortrinnsvis en lengde kortere enn 2 kbp, imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset av dette.
Selv o molekylet eller molekylene som tilveiebringer rep og cap kan eksistere i vertscellen transient (det vil si ved transfeksjon), er det foretrukket at en eller begge av rep- og cap proteinene og promoteren eller promoterne som kontrollerer deres ekspresjon, stabilt uttrykkes i vertscellen, for eksempel som et episom eller ved integrering i kromo-somet av vertscellen. Metodene som benyttes for å konstruere utførelsesformer av oppfinnelsen er konvensjonelle genetiske konstruksjons- eller rekombinante konstruksjons-teknikker som de som er beskrevet i referansene ovenfor. Mens foreliggende beskrivelse gir illustrerende eksempler på de spesifikke konstrukter vil fagmannen ved bruk av den her gitte informasjon kunne velge å konstruere hvilke som helst andre egnede konstrukter ved bruk av et utvalg av spacere, P5 promotere og andre elementer, inkludert minst ett translasjonelt start- og stoppsignal, og den eventuelle addisjon av polyadenylerings-seter.
I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan rep- eller cap proteinet tilveiebringes stabilt av en vertscelle.
C. Hjelperfunksjoner
Den pakkende vertscelle krever også hjelperfunksjoner for å pakke oppfinnelsens rAAV. Disse funksjoner kan eventuelt leveres av en herpesvirus. Helst blir de nødven-dige hjelperfunksjoner alle tilveiebragt fra en human eller ikke-human primatadenovi- ruskilde som de som er beskrevet ovenfor og/eller som er tilgjengelige fra et antall kilder inkludert "American Type Culture Collection" (ATCC), Manassas, VA (US). I en i dag foretrukken utførelsesform tilveiebringes vertscellen med og/eller inneholder et Ela genprodukt, et Elb genprodukt, et E2a genprodukt og/eller et E4 ORF6 genprodukt. Vertscellen kan inneholde andre adenovirale gener som VAI RNA men disse gener er ikke nødvendige. I en foretrukken utførelsesform er ingen andre adenovirusgener eller
-genfunksj oner til stede i vertscellen.
Med "adenoviral DNA som uttrykker Ela genproduktet" menes en hvilken som helst adenovirussekvens som koder Ela eller en hvilken som helst funksjonell Ela del. Adenoviral DNA som uttrykker E2a genprodukt og adenoviral DNA som uttrykker E4 ORF6 genprodukt defineres på tilsvarende måte. Også inkludert er hvilke som helst alleler eller andre modifikasjoner av det adenovirale gen eller funksjonelle deler derav. Slike modifikasjoner kan med hensikt innføres ved å ty til konvensjonelle genetiske konstruksjons- eller mutagene teknikker for å øke den adenovirale funksjon på en eller annen måte så vel som naturlig forekommende allelvarianter derav. Slike modifikasjoner og metoder for å manipulere DNA for å oppå disse adenovirusgenfunksjoner er velkjente for fagmannen.
Adenovirus Ela-, -Elb-, -E2a- og/eller E40RF6 genprodukt, såvel som hvilke som helst andre ønskede hjelperfunksjoner, kan tilveiebringes på en hvilken som helst måte som tillater deres ekspresjon i en celle. Hver av sekvensene som koder disse produkter kan være på en separat vektor, eller et eller flere gener kan være på samme vektor. Vektoren kan være en hvilken som helst vektor som er kjent i teknikken eller beskrevet her inkludert plasmider, kosmider og vimser. Innføring i vertscellen av vektoren kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte i teknikken eller som beskrevet ovenfor, inkludert transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon, liposomavlevering, membranfusjonsteknikker, høyhastighets DNA-belagte pellets, viralinfeksjon og protoplastfusjon blant andre. Ett eller flere av de adenovirale gener kan stabilt være integrert i genomet av vertscellen, stabilt uttrykkes som episomer eller uttrykkes transient. Genproduktene kan alle uttrykkes transient, på et episom eller integreres stabilt, eller noen av genproduktene kan uttrykkes stabilt mens andre uttrykkes transient. Videre kan promoterne for hvert av de adenovirale gener velges uavhengig fra en konstitutiv promoter, en induserbar promoter eller en nativ adenoviral promoter. Disse promotere kan reguleres via en spesifikk, fysiologisk tilstand hos organismen eller cellen (for eksempel ved differensieringstilstan-der eller i replikerende eller hvilende celler) eller ved eksogent tilsatte faktorer, som eksempler.
D. Vertsceller og pakkende cellelinjer
Vertscellen kan per se være valgt fra en hvilken som helst biologisk organisme inkludert prokaryotiske (for eksempel bakterielle) celler, og eukaryotiske celler inkludert insekt-, gjær- og pattedyrceller. Spesielt ønskelige vertsceller er valgt blant hvilke som helst pattedyrceller inkludert, uten begrensning, celler som A549-, WEFfl-, 3T3-, 10T1/2-, BHK-, MDCK-, COS 1-, COS 7-, BSC 1-, BSC 40-, BMT 10-, VERO-, WI38- HeLa-eller 293 celler (som uttrykker funksjonell adenoviral El), Saos-, C2C12- eller L-celler, HT1080-, HepG2- og primær fibroblast-, hepatocyt- og myoblastceller avledet fra pattedyr inkludert mennesker, aper, mus, rotter, kaniner og hamstere. Valget av en patte-dyrspesie for å tilveiebringe cellene er ingen begrensning av oppfinnelsen og heller ikke er typen pattedyrceller det, for eksempel fibroblast-, hepatocyt-, tumorceller og så videre. De mest ønskede celler bærer ingen adenovirusgener andre enn El, E2a og/eller E4 ORF6; heller ikke inneholder de noen andre virusgener som kunne resultere i homolog rekombinering av en kontaminerende virus under produksjonen av rAAV; og den er i stand til infeksjon eller transfeksjon av DNA og ekspresjon av den transfekterte DNA. I en foretrukken utførelsesform er vertscellen en som har rep og cap stabilt transfektert i cellen.
En vertscelle som er brukbar ifølge oppfinnelsen er en vertscelle som stabilt er transformert med sekvensene som koder rep og cap og som er transfektert med den angjeldende adenovirus El-, -E2a- og -E40RF6 DNA og et konstrukt som bærer minigenet som beskrevet ovenfor. Stabile rep- og/eller cap uttrykkende cellelinjer som B-50
(PCT/US98) 19463) og de som er beskrevet i US 5 658 785, kan også benyttes på tilsvarende måte. Andre ønskelige vertsceller inneholder den minimale adenovirale DNA som er tilstrekkelig til å uttrykke E4 ORF6. Ytterligere andre cellelinjer kan konstrueres ved bruk av de nye AAV rep- og/eller nye AAV cap sekvenser ifølge oppfinnelsen.
Fremstillingen av en vertscelle ifølge oppfinnelsen involverer teknikker som sammensetning av valgte DNA sekvenser. Denne sammensetning kan gjennomføres ved å benytte konvensjonelle teknikker. Slike teknikker inkluderer cDNA- og genomiske kloner, noe som er velkjent for fagmannen og beskrevet av Sambrook et al. supra, ved bruk av overlappende oligonukleotidsekvenser av adenovirusen og AAV genomene, kombinert med polymerasekjedereaksjon, syntetiske metoder og hvilke som helst andre egnede metoder som gir de ønskede nukleotidsekvenser.
Innføring av molekylene (som plasmider eller vimser) i vertscellen kan også gjennom-føres ved bmk av teknikker som er kjente for fagmannen og som diskutert i foreliggende beskrivelse. I en foretrukken utførelsesform benyttes det standard transfeksjonsteknikker, for eksempel CaPC^transfeksjon eller elektroporering, og/eller infeksjon ved hybrid adenovims/AAV vektorer inn i cellelinjene som den humane embryoniske nyrecellelinje HEK 293 (en human nyrecellelinje inneholdende funksjonelle adenovims El gener som gir transvirkende El proteiner).
Disse nye AAV-baserte vektorer som genereres av fagmannen på området er fordelakti-ge for genavlevering til valgte vertsceller og genterapipasienter fordi ingen nøytralise-rende antistoffer til AAV7 er funnet i den humane populasjon. Videre viser tidlige studier ingen nøytraliserende antistoffer i cyno ape- eller sjimpansepopulasjoner og mindre enn 15 % kryss-reaktivitet av AAV7 i rhesus aper, spesiene hvorfra serotypen ble isolert. Fagmannen på området kan lett fremstille andre rAAV virale vektorer inneholdende AAV7 capsidproteinene som tilveiebringes der ved bmk av et antall teknikker som er velkjente for fagmannen. Man kan ganske enkelt fremstille ytterligere andre rAAV virale vektorer inneholdende AAV7 sekvensene og AAV capsidene av en annen serotype. Tilsvarende fordeler oppnås ved vektorene som er basert på andre nye AAVer ifølge oppfinnelsen.
Således vil fagmannen på området lett forstå at AAV7 sekvensene ifølge oppfinnelsen lett kan tilpasses for bmk i disse og andre virale vektorsystemer for in vitro-, ex vivo-eller in vivo-genavlevering. Tilsvarende kan fagmannen på området lett velge andre fragmenter av det nye AAV genom ifølge oppfinnelsen for bmk i et antall rAAV- og ikke-rAAV vektorsystemer. Slike vektorsystemer kan blant andre for eksempel inkludere lentivimser, retrovimser, poxvimser, vaksinevimser og adenovirale systemer. Valg blant disse vektorsystemer er ingen begrensning for oppfinnelsen.
Således tilveiebringer oppfinnelsen videre vektorer generert ved bmk av nukleinsyren og aminosyresekvensen av den nye AAV ifølge oppfinnelsen. Slike vektorer er brukbare for et antall formål, inkludert for avlevering av terapeutiske molekyler og for bmk i vaksineregimer. Særlig ønskelige for avlevering av terapeutiske molekyler er rekombinant AAV holdige capsider av de nye AAVer ifølge oppfinnelsen. Disse eller andre vek-torkonstrukter inneholdende nye AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen kan benyttes i vaksineregimer, for eksempel for samtidig avlevering av et cytokin, eller for avlevering av immunogenet per se.
V. Rekombinante vimser og anvendelse derav.
Ved bmk av de her beskrevne teknikker kan fagmannen på området generere en rAAV med et capsid av en ny serotype ifølge oppfinnelsen, eller et nytt capsid inneholdende ett eller flere fragmenter av en AAV serotype identifisert ved oppfinnelsens metode. I en utførelsesform kan det benyttes et full-lengde capsid fra en enkelt serotype, for eksempel AAV7 [SEQ ID nr. 2]. I en annen utførelsesform kan et full-lengde capsid genereres inneholdende ett eller flere fragmenter av en ny serotype ifølge oppfinnelsen, fusert i ramme med sekvenser fra en annen, valgt AAV serotype. For eksempel kan en rAAV inneholde en eller flere av de nye hypervariabelområdesekvenser av en AAV serotype ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan de unike AAV serotyper ifølge oppfinnelsen benyttes i konstrukter inneholdende andre virale eller ikke-virale sekvenser.
Det vil lett fremgå for fagmannen at i en utførelsesform vil visse serotyper ifølge oppfinnelsen være spesielt egnet for visse anvendelser. For eksempel er vektorer basert på AAV7 capsider ifølge oppfinnelsen spesielt godt egnet for anvendelse i muskler mens vektorer basert på rh.10 (44-2) capsider ifølge oppfinnelsen er spesielt godt egnet for bmk i lungen. Bmken av slike vektorer er ikke begrenset og fagmannen kan benytte disse vektorer for avlevering til andre celletyper, vev eller organer. Videre kan vektorer basert på andre capsider ifølge oppfinnelsen benyttes for avlevering til disse eller andre celler, vev eller organer.
A. Avlevering av et transgen
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for avlevering av et transgen til en vert som involverer transfektering eller infisering av en valgt vertscelle med en vektor generert med sekvensene av oppfinnelsens AAV. Metoder for avlevering er velkjente for fagmannen på området og er ingen begrensning av oppfinnelsen.
I en ønsket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for AAV-mediert avlevering av et transgen til en vert. Metoden involverer transfektering eller infisering av en valgt vertscelle med en rekombinant viral vektor inneholdende et valgt transgen under kontroll av sekvenser som styrer ekspresjonen derav og AAV capsid proteinene.
Eventuelt kan en prøve fra verten først analyseres på nærvære av antistoffer mot en valgt AAV serotype. Et antall analyseformater for detektering av nøytraliserende anti stoffer er velkjente for fagmannen. Valget av en slik analyse er ingen begrensning av oppfinnelsen, se for eksempel Fisher et al. i "Nature Med.", 3(3):306-312 (Mars, 1997) samt W.C. Manning et al. i "Human Gene Therapy", 9:477-485 (Mars 1, 1998). Resultatene av denne analyse kan benyttes for å bestemme hvorvidt AAV vektorholdige capsidproteiner av en spesiell serotype er foretrukket for avlevering, for eksempel ved fravær av nøytraliserende antistoffer som er spesifikke for denne capsid serotype.
I ett aspekt ved denne metode kan avleveringen av en vektor med et valgt AAV capsidprotein gå foran eller følge etter avlevering av et gen via en vektor med et forskjellig serotype AAV capsidprotein. Tilsvarende kan avleveringen av vektor med andre nye AAV capsidproteiner ifølge oppfinnelsen gå foran eller følge etter avlevering av et gen via en vektor med et forskjellig serotype AAV capsidprotein. Således kan genavlevering via rAAV vektorer benyttes for gjentatt genavlevering til en valgt vertscelle. Ønskelig bærer senere administrerte rAAV vektorer det samme transgen som den første rAAV vektor mens de etterfølgende administrerte vektorer inneholder capsidproteiner av serotyper som er forskjellige fra den første vektor. Hvis for eksempel en første vektor har AAV7 capsidproteiner [SEQ ID nr. 2] kan senere administrerte vektorer ha capsidproteiner som er valgt blant andre serotyper inkludert AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, AAV10, AAV11, og AAV 12, eller et hvilket som helst av de andre nye AAV capsider som er identifisert her, uten begrensning inkludert: A3.1, H2, H6, Cl, C2, C5, A3-3, A3-7, A3-4, A3-5, 3.3b, 223.4, 223-5, 223-10, 223-2, 223-7, 223-6, 44-1, 44.5, 44_2, 42-15, 42-8, 42-13, 42-3A, 42-4, 42-5A, 42-1B, 42-5B, 43-1, 43-12, 43-5, 43-21, 43-25, 43-20, 24.1, 42.2., 7.2., 27.3, 16.3, 42.10. 42-3B, 42-11, Fl, F5, F3, 42-6B, og eller 42-12.
De ovenfor beskrevne, rekombinante vektorer kan avleveres til vertsceller i henhold til publiserte metoder. Den angjeldende rAAV, fortrinnsvis suspendert i en fysiologisk akseptabel bærer, kan administreres til en human eller ikke-human pattedyrpasient. Egnede bærere kan lett velges av fagmannen på området i lys av den indikasjon for hvilken overføringsvirusen bestemmes. For eksempel inkluderer en egnet bærer saltoppløsning som kan formuleres med et antall bufferoppløsninger (for eksempel fosfatbufret saltopp-løsning). Andre eksempler på bærere er sterile saltoppløsninger, laktose, sukrose, kal-siumfosfat, gelatin, dekstran, agar, pektin, jordnøtt- eller sesamolje, samt vann. Valget av bærer er ingen begrensning for oppfinnelsen.
Eentuelt kan preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg til rAAV og en eller flere bærere inneholde andre konvensjonelle, farmasøytiske bestanddeler som preserveringsmidler eller kjemiske stabilisatorer. Egnede eksempler på preserveringsmidler er klorbutanol, kaliumsorbat, sorbinsyre, svoveldioksyd, propylgallat, parabener, etylvanillin, glycerin, fenol og paraklorfenol. Egnede kjemiske stabilisatorer er gelatin og albumin.
De virale vektorer administreres i mengder tilstrekkelig til å transfektere cellen og å tilveiebringe tilstrekkelige nivåer av genoverføring og ekspresjon for derved å tilveiebringe en terapeutisk fordel uten urimelige negative effekter, eller med medisinsk akseptable fysiologiske effekter, som kan bestemmes av fagmannen på området. Konvensjonelle og farmasøytisk akseptable administeringsveier er, uten begrensning, å rette avleveringen til det valgte organ (for eksempel intraportal avlevering til leveren), oral, inhalering (inkludert intranasal og intratrakeal avlevering), intraokkulær, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intradermal og andre parenterale administreringsveier. Admi-nistreringsveiene kan hvis ønskelig kombineres.
Doser av den virale vektor vil primært avhenge av faktorer som den tilstand hos indivi-det som skal behandles, vider alder, vekt og helse og kan således variere blant forskjellige pasienter. For eksempel ligger en terapeutisk effektiv, human dose av den virale vektor generelt i området fra rundt 1 ml til rundt 100 ml oppløsning inneholdende kon-sentrasjoner fra rundt 1 x IO<9>til 1 x IO<16>genomer virus vektor. En foretrukken human-dosering kan være fra rundt 1 x IO<13>til 1 x IO<16>AAV genomer. Doseringen vil justeres for å balansere den terapeutiske fordel mot eventuelle bivirkninger og slike doseringer kan variere avhengig av den terapeutiske anvendelse for hvilken den rekombinante vektor benyttes. Ekspresjonsnivåene for transgenet kan overvåkes for å bestemme frekven-sen av dosering som resulterer i virale vektorer, fortrinnsvis AAV vektorer inneholdende minigenet. Eventuelt kan doseringsregimer tilsvarende det som er beskrevet for terapeutiske formål benyttes for immunisering ved bruk av oppfinnelsens preparater.
Eksempler på terapeutiske produkter og immunogene produkter for avlevering via AAV-holdige vektorer ifølge oppfinnelsen skal beskrives nedenfor. Disse vektorer kan benyttes ved et antall terapeutiske eller vaksineformål som beskrevet her. I tillegg kan disse vektorer avleveres i kombinasjon med en eller flere andre vektorer eller aktive bestanddeler i et ønsket terapeutisk og/eller vaksineregjme.
B. Terapeutiske transgener
Brukbare, terapeutiske produkter som kodes av transgenet inkluderer hormoner og vekst- og differensieringsfaktorer inkludert, uten begrensning, insulin, glukagon, vekst-hormon (GH), paratyoridhormon (PTH), vektshormonfrigivende faktor (GRF), follikel- stimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), humankorionisk gonadotropin (hCG), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), angiopoietiner, angiostatin, granau-locyttkolonistimulerende faktor (GCSF), erytropoietin (EPO), bindevevsvektfaktor (CTGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), sur fibroblast vekstfaktor (aFGF), epi-dermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor a (TGFa), plateavledet vekstfaktor (PDGF), insulin vekstfaktorene I og II (IGF-I og IGF-II), en hvilken som helst fra den transformerende vekstfaktor P superfamilie inkludert TGF P, aktiviner, inhibiner, eller et hvilket som helst av de benmorfogeniske proteiner (BMP) BMPs 1-15, en hvilken som helst fra heregluin/neuregulin/ARIA<y>nydifferenseieringsfaktor (NDF) familien av vekstsfaktorer, nervevekstfaktor (NGF), hjerne-avledet neurotropisk faktor (BDNF), neurotrofiner NT-3 og NT-4/5, ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), glialcelleavledet neurotrofisk faktor (GDNF), neurturin, agrin, et hvilket som helst fra familien av sema-foriner/kollapsiner, netrin-1 og netrin-2, hepatocyt vekstfaktor (HGF), efriner, noggjn, sonisk hedgehod- og tyrosinhydroksylase.
Andre, brukbare transgene produkter inkluderer proteiner som regulerer immunsystemet inkludert, uten begrensning, cytokiner og lymfokiner som trombopoietin (TPO), inter-leukiner (IL) IL-1 til og med IL-25 (inkludert IL-2, IL-4, IL-12, og IL-18), monocytt kjemoattraktantprotein, leukemiinhibitorisk faktor, granulocytt-makrofagkolonistimu-lerende faktor, Fas ligand, tumor nekrosefaktor a og -P, interferoner a, p og y, stamcel-lefaktor, flk-2/flt3 ligand. Genprodukter som produseres av immunsystemet er også brukbare ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer, uten begrensning, immunoglobuliner IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, kimeriske immunoglobuliner, humaniserte antistoffer, en-keltkjedeantistoffer,T-celle receptorer, kimeriske T-celle receptorer, enkeltkjede T-celle receptorer, klasse I- og klasse IIMHC molekyler, så vel som konstruerte immunoglobuliner og MHC molekyler. Brukbare genprodukter inkluderer også komplementregulato-riske proteiner som komplettmentregulatoriske proteiner, membran kofaktor protein (MCP), nedbrytningsaksellererende faktor (DAF), CR1, CF2 og CD59.
Ytterligere andre brukbare genprodukter inkluderer en hvilken som helst av receptorene for hormonene, vekstfaktorene, cytokinene, lymfokinene, de regulatoriske proteiner og immunsystemproteinene. Oppfinnelsen omfatter receptorer for kolesterolregulering inkludert lavdensitets lipoprotein (LDL) receptoren, høydensitets lipoprotein (HDL), meget lav densitets lipoprotein (VLDL) receptoren samt oppfanger (scavenger) receptoren. Oppfinnelsen omfatter også genprodukter som medlemmer av steroidhormon receptor superfamilien inkludert glukokortikoidreceptorer og østrogenreceptorer, vitamin D receptorer og andre nukleære receptorer. I tillegg inkluderer brukbare genprodukter tran- skripsjonsfaktorer som jun, fos, max, mad, serumresponsfaktor (SRF), aP-1, AP2, myb, Myod og myogenin, ETS-boksholdige proteiner, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-boksbindende proteiner, interferonreguleringsfaktor (TRF-1), Wilms tumor protein, ETS-bindingsprotein, STAT, GATA-boksbindingsproteiner, for eksempel GATA-3, og gaffelfamilien av vingede heliksproteiner.
Andre brukbare genprodukter inkluderer carbamoylsyntase I, ornitin transkarbamylase, argjnosuccinatsyntease, arginosuccinatlyase, arginase, fumarylacetacetathydrolase, fenylalaninhydroksylase, a-1 antitrypsin, glukose-6-fosfatase, porfobilinogen deamina-se, faktor VJJI, faktor IX, cystation P-syntase, forgrenetkjede ketosyre dekarboksylase, albumin, isovaleryl-coA dehydrogenase, propionyl CoA karboksylase, metylmalonyl CoA mustase, glutaryl CoA dehydrogenase, insulin, P-glukosidase, pyruvatkarboksylat, hepatisk fosforylase, fosforylasekinase, glycin dekarboksylase, H-protein, T-protein, en cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) sekvens og en en dystrofin cDNA sekvens. Ytterligere andre brukbare genprodukter inkluderer enzymer som de som kan være brukbare ved enzymerstatningsterapi som er brukbar ved et antall tilstander som skyldes defekt enzymaktivitet. For eksempel kan enzymer som inneholder mannose-6-fosfat benyttes i terapier for lysosomal lagringssykdommer (for eksempel et egnet gen inkludert det som koder P-glukoronidase (GUSB)).
Andre brukbare genprodukter inkluderer ikke-naturlig forekommende polypeptider som kimeriske eller hybride polypeptider med en ikke-naturlig forekommende aminosyresekvens inneholdende innskudd, delesjoner eller aminosyresubstitusjoner. For eksempel kan enkeltkjedekonstruerte immunoglobuliner være brukbare hos visse immunokom-promitterte pasienter. Andre typer ikke-naturlig forekommende gensekvenser inkluderer antisense molekyler og katalytiske nukleinsyrer som ribozymer, som kan benyttes for å redusere overekspresjon av et mål.
Reduksjon og/eller modulering av ekspresjonen av et gen er spesielt ønskelig for behandling av hyperproliferative tilstander som karakteriseres ved hyperprolifererende celler, som cancere og psoriasis. Målpolypeptider inkluderer de polypeptider som produseres utelukkende eller ved høyere nivåer i hyperproliferative celler sammenlignet med normale celler. Målantigener inkluderer polypeptider som kodes av onkogener som myb, mye, fyn, og translokasjonsgenet bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk og EGRF. I tillegg til onkogenprodukter som målantigener inkluderer målpolypeptidet for anticancerbe-handling og protektive regimer variable områder av antistoffer lavet av B-celle lymfo mer og variable områder av T-celle receptorer av T-celle lymfomer som, ved enkelt utførelsesformer, også benyttes som målantigener for autoimmunsykdom. Andre tumor-assosierte polypeptider kan benyttes som målpolypeptider, for eksempel polypeptider som finnes ved høyere nivåer i tumorceller inkludert det polypeptid som gjengkjennes av monoklonalt antistoff 17-1A og folatbindingspolypeptider.
Andre egnede, terapeutiske polypeptider og proteiner inkluderer de som kan være brukbare for behandling av individer som lider av autoimmune sykdommer og lidelser ved å tilveiebringe en bredt basert, protektiv immunrespons mot mål som er assosiert med autoimmunitet inkludert cellereceptorer og celler som produserer "selv"-styrte antistoffer. T-celle medierte autoimmunsykdommer inkluderer rheumatoid aitritt (RA), multippel sklerose (MS), Sjøgrens syndrom, sarkoidose, insulinavhengig diabetes mellitus (JDDM), autoimmun tyroiditt, reaktiv aitritt, anyloserende spondylitt, skleroderma, po-lymyositt, dermatomyositt, psoriasis, vaskulitt, Wegeners granulomatose, Chrons sykdom og ulcerativ kolitt. Hver av disse sykdommer karakteriseres ved T-celle receptorer (TCRer) som binder til endogene antigener og initierer den inflammatoriske kaskade som assosieres med autoimmune sykdommer.
C. Immunogene transgener
Alternativt, eller i tillegg, kan vektorene ifølge oppfinnelsen inneholde AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen og et transgen som koder et peptid, polypeptid eller protein som induserer en immunrespons mot et valgt immunogen. For eksempel kan immunogenene være valgt fra et antall virale familier. Eksempler på ønskede virale familier mot hvilken en immunrespons ville være ønskelig inkluderer pikornavirusfamilien som inkluderer genera rhinoviruser, som er ansvarlige for en 50 % av tilfellene av vanlig forkjølelse; genera enteroviruser som inkluderer polioviruser, coxsackieviruser, echoviruser og human enteroviruser som hepatitt A virus; og genera aptoviruser som er ansvarlige for munn- og klovsyke, primært hos ikke-humane dyr. Innen picornavirusfamilien av vimser inkluderer målantigener VP1, VP2, VP3, VP4 og VPG. En annen viral familie inkluderer calcivirusfamilien som omfatter Norwalkgruppen av vimser som er et viktig kausativt middel for epidemisk gastroenteritt. En ytterligere viral familie som er ønskelig for bmk i innsikting av antigener for å indusere immunresponser hos mennesker og ikke-humane dyr er togavirusfamilien som inkluderer genera a-virus som inkluderer Sindbis vimser, RossRiver vimser og venezuelansk, øst- og vest-ekvin encefalitt, og mbivims inkludert Rubella vims. Flaviviridaefamilien inkluderer dengue-, gulfeber-, japansk encefalitt-, St. Louis encefalitt- og flottbåret encefalitt vimser. Andre målantigener kan genereres fra hepatitis C- eller coronavirusfamilien som inkluderer et antall ikke-humane vimser som infektiøs bronkitt vims (fjærfe), porcin transmitterbar gastroenterisk vims (svin), porcin hemagglutinerende encfalomyelitt vims (svin), felin infektiøss pritonitt vims (katter), felin enterisk koronavims (katter), canine koronavims (hunder), og humanrespiratoriske koronavimser som kan forårsake vanlig forkjølelse og/eller ikke-A, B eller C hepatitt. Innen koronavimsfamilien inkluderer målantigenene El (også kalt M eller matriksprotein), E2 (også kalt S- eller Spike protein), E3 (også kalt HE eller hemagglutin-elterose), glykoprotein (ikke til stede i alle koronavimser), eller N (nukleocapsid). Ytterligere andre antigener kan innsiktes mot rhabdovirusfamilien som inkluderer genera vesikulovirus (for eksempel Vesicular Stomatit vims) og den generelle lyssavims (for eksempel rabies). Innen rhabdovirusfamilien kan egnede antigener avledes fra G-proteinet eller N-proteinet. Familien filoviridae som inkluderer he-moragjsk febervirus som Marburg- og Ebolavims kan være en egnet kilde for antigener. Paramyksovirusfamilien inkluderer parainfluensa vims type 1, parainfluensa vims type 3, bovin parainfluensa vims type 3, mbulavims (kusmavims, parainfluensa vims type 2, parainfluensa vims type 4, Newcastle sykdom vims (kyllinger), kvegpest, morbillivirus, som inkluderer meslinger og kanindistemper, og pneumovims som inkluderer respiratorisk syncytisk vims. Influensavirus er klassifisert innen familien orotomyksoviurs og er en egnet kilde for antigen (for eksempel HA proteinet, NI proteinet). Bunyavirusfami-lien inkluderer genera bunyavims (Californai encefalitt, La Crosose), flebovirus (Rift Valley Feber), hantavirus (puremala er en hemahagin feber vims), nairovims (Nairobi sauesykdom) og forskjellige ikketilskreve bungavimser. Arenavirusfamiline tilveiebringer en kilde for antigener mot LCM- og Lassa feber vims. Reovimsfamilien inkluderer genera reovims, rotavims (som forårsaker akutt gastroenteritt hos barn), orbivim-ser og kultiviruser (Colorado Flott feber, Lebombo (mennesker), ekvin encefalose, blå-tunge).
Retrovirusfamilien inkluder subfamilien onkorivirinal som omfatter slike human- og veterinærsykdommer som felinleukemivirus, HTLVI og HTLVTI, lentivirinal (som inkluderer human immunodefektiv vims (HIV), simian immunodefekt vims (SIV), felin immunodefekt vims (FIV), ekvin efektiøs anemi vims og spumavirinal). Mellom HIV og SIV er mange egnede antigener beskrevet og kan lett velges. Eksempler på egnede HIV- og SIV antigener inkluderer uten begrensning gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat og Rev proteinene så vel som forskjellige fragmenter derav. I tillegg er et antall modifikasjoner til disse antigener beskrevet. Egnede antigener for dette formål er velkjente for fagmanne. For eksempel kan man velge en sekvens som koder gag, pol, Vif og Vpr, Env, Tat og Rev, blant andre proteiner, se for eksempel det modifiserte gag protein som er beskrevet i US 5 972 596. Se videre de HIV- og SIV proteiner som er beskrevet av D.H. Barouch et al. i "J: Virol.", 75(5):2462-2467 (Mars 20001), samt av R.R. Amara et al. i "Science", 292:69-74 (6 April 2002). Disse proteiner eller subenheter derav kan avleveres alene, eller i kombinasjon via separate vektorer eller fra en enkelt vektor.
Papovavirusfamilien inkluderer subfamilien polyomaviruser (BKU- og JCU vimser) og subfamilien papillomavimser (assosiert med cancere og malignant progresjon av papill-oma). Adenovimsfamilien inkluderer vimser ((EX, AD7, ARD, O.B.) som forårsaker respiratorisk sykdom og/eller enteritt. Parvovimsfamilien inkluderer felin parvovims (felinenteritt); felin panleukopeniavims, canine parvovims og porcine parvovims. Her-pesvimsfamilien inkluderer sub-familien alfaherpesvirinae, som omfatter genera sim-plexvims (HSVL HSVIT), varicellovims (pseudorabies, varicella zoster) og sub-familien betaherpesvirinae, som inkluderer genera cytomegalovirus (HCMV, muromegalovims) og sub-familien gammeherpesvirinae som inkluderer genera lymfokryptovirus, EBV (Burkitts lymfom), infektiør rhinotrakeitt, Mareks sykdomsvims og rhadinovims. Poxvimsfamilien inkluderer sub-familien kordopoxvirinae som omfatter genera orto-poxvims (Variola (småkopper) og vaksinia (kukopper)), parapoxvims, avipoxvims, capripoxvims, leporipoxvims, suipoxvims og sub-familien entomopoxvirinae. Hepad-nvavimsfamilien inkluderer hepatitt B vimsen. En ikke-klassifisert vims som kan være en egnet kilde for antigener er Hepatitis delta vimsen. Ytterligere andre virale kilder kan inkludere avian infektiøs bursal sykdoms vims og porcin respiratorisk og reproduktiv syndromvims. Alfavimsfamilien inkluderer ekvin arteritis vims og forskjellige Encefa-litis vimser.
Foreliggende oppfinnelse kan også omfatte immunogener som er brukbare for å immun-iser et menneske eller ikke-humant dyr mot andre patogener inkludert bakteria, fungj, parasittiske mikroorganismer eller multicellulære parasitter som infiserer humane og ikke-humane vertebrater, eller danner en cancercelle eller tumorcelle. Eksempler på bakterielle patogener inkluderer patogenisk gram-positive kokki inkludert pneumo-kokki; stafylokokki; og streptokokki. Patogeniske, gram-negative kokki inkluderer me-ningokokkus; gonokokkus. Patogeniske, enteriske gram-negative bacilli inkluderer en-terobacteriaceae; psudomonas, acinetobacteia og eikenella; melioidosis, salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. Ducreyi (som forårsaker chancroid); bmcella; Franisealla tularensis (som forårsaker tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis og spirillum; Gram-positive bacilli inkluderer listeria monocytogeners; erypsipelotrhrix rhusopathiae; Corynebacterium diphteria (difteri), kloera; B. Anthracis (anthrax); donovanosis (granuloma inguinale); og bartonellose. Sykdommer forårsaket av patogeniske, anaerobe bakterier inkluderer tetanus; botulisme; andre clostridia; tu- berkulose; leprosi; og andre mykobakteria. Patogeniske, spiroketale sykdommer inkluderer syfilis; treponematoser; yaws, pinta og endemisk syfilis; og leptospirose. Andre infeksjoner forårsaket av høyere patogenbakteria og patogeniske fungi inkluderer akti-nomykose, nokardiose; kryptokokkose, blastomykose, histoplasmose og kokkidiomyko-se; candidiase, aspergillose, og mukormykose; sportotrikose; parakokkidiodomykose, petriellidiose, torulopsose, mycetoma og kromomykose; og dermatofytose. Ricketsielle infeksjoner inkluder Tyfusfeber, Rocky Mountain flekkfeber, Q feber og Rickettsial-opox. Eksempler på mykoplasma og klamydiale infeksjoner inkluderer: mycoplasma pneumoniae; lympfogranuloma venereum, psittakose; og perinatal klamydiale infeksjoner. Patogeniske eukaryoter omfatter patogeniske protozoaner og helminter og infeksjoner fra disse inkluderer: amebiaser, malaria, leishamiase; trypanosomiase; toxoplasmo-se; Pneumocystis carinii; Trikaner, Toxoplasmo gondii; babesiose; giardiase; trikinose; filariase; schistosomiase; nematoder; trematoder eller "flukes"; og cestose (bendelorm) infeksjoner.
Mange av disse organismer og/eller toksiner som produsere av disse er identifisert av "Centers for Disease Control" [(CDC), Department of Health and Human Services, USA], som midler som har potensiale for bruk ved biologiske angrep. For eksempel inkluderer noen av disse biologiske midler Bacillus anthracis (antrax), Clostridium bo-tulinum og dettes toksin (botulisme), Yersinia pestis (pest) vari ola major (småkopper), Francisella tularensis (tularemi), og viral hemoragisk feber, alt i dag klassifisert som Kategori A midler; Coxiella burnetti (Q feber); Brucella species (brucellose), Burkhol-deria matlei (snive), Ricinus communis og dettes toksin (ricintoksin), Clostridium per-jringens og dettes toksin (e-toksin ), Stahylococcus spesier og deres toksiner (enterotok-sin B), alt i dag klassifisert som Kategori B midler; og Nipan virus og hantaviruser som i dag er klassifisert som Kategori C midler. I tillegg kan andre organismer som er klassifisert slik eller forskjellig, identifiseres og/eller benyttes for et slikt formål i fremtiden. Det vil være lett å forstå at de virale vektorer og andre konstrukter som beskrevet her er brukbare for å avlevere antigener fra disse organismer, vimser og deres toksiner eller andre biprodukter, som vil forhindre og/eller behandle infeksjon eller andre ugunstige reaksjoner med disse biologiske midler.
Administrering av vektorene ifølge oppfinnelsen for å avlevere immunogener mot det variable området av T-cellen utløser en immunrespons inkludert CTL'er for å eliminere disse T-celler. Ved rheumatoid aitritt (RA) er diverse spesifikke, variable områder av T-celle receptorer (TCR'er) som er involvert i sykdommen,karakterisert. Disse TCR'er inkluderer V-3, V-14, V-17 og Va-17. Således vil avlevering av en nukleinsyresekvens som koder minst ett av disse polypeptider utløse en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert ved RA. Ved multippel sklerose (MS) er flere spesifikke, variable områder av TCR'er som er involvert i sykdommen,karakterisert. Disse TCR'er inkluderer V-7 og Va-10. Således vil avlevering av en nukleinsyresekvens som koder minst ett av disse polypeptider elicitere en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert i MS. Ved skleroderma er detkarakterisertflere spesifikke, variable områder av TCR'er som er involvert i sykdommen. Disse TCR'er inkluderer V-6, V8, V-14 og Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 og Va-12. Således vil avlevering av et nukleinsyremolekyl som koder minst ett av disse polypeptider utløse en immunrespons som vil ta sikte på T-celler involvert i skleroderma.
Eventuelt kan vektorer inneholdende AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen avleveres ved bruk av et prime-boost regime. En antall slike regimer er beskrevet i teknikken og kan lett velges, se for eksempel TO 00/11140, publisert 2. mars 2000, hvortil det vises når det gjelder detaljer.
Slike prime-boost regimer involverer karakteristisk administrering av en DNA (for eksempel plasmid) basert vektor for å prime immunsystemet til andre, booster, administrering med et tradisjonelt antigen som et protein eller en rekombinant virus som bærer sekvensene som koder et slikt antigen. I en slik utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for priming og boosting av en immunrespons mot et valgt anti-gen ved avlevering av en plasmid DNA vektor som bærer nevnte antigen, fulgt av boosting, for eksempel med en vektor inneholdende AAV sekvenser ifølge oppfinnelsen.
I en utførelsesform involverer prime-boost regimet ekspresjonene av multiproteiner fra prime- og/eller boost bærerer, se for eksempel R.R. Amara i "Science", 292:69-74 (6 april 2001) som beskriver et multiproteinregime for ekspresjon av proteinsubenheter som kan brukes for generering av en immunrespons mot HIV og SIV. For eksempel kan en DNA prime avlevere Gag, Pol, Vif, VPX og Vpr og Env, Tat, og Rev fra et enkelt transkript. Alternativt avgis SIV Gag, Pol og HIV-1 Env.
Imidlertid er prime-boost regimene ikke begrenset til immunisering for HIV eller for avlevering av disse antigener. For eksempel kan priming involvere avlevering med en første chimp vektor ifølge oppfinnelsen fulgt av boosting med en andre chimp vektor, eller med et preparat inneholdende antigenet per se i protein form. I ett eksempel kan prime-boost regimet tilveiebringe en protektiv immunrespons mot virusen, bakterien eller en annen organisme hvorfra antigenet avleveres. I en annen ønsket utførelsesform tilveiebringer prime-boost regimet en terapeutisk effekt som kan måles ved bruk av konvensjonelle analyser for detektering av nærvær av tilstanden for hvilken terapien administreres.
Primingvaksinen kan administreres på forskjellige seter i kroppen i en doseavhengig modus som avhenger av antigenet mot hvilket den ønskede immunrespons innsiktes. Oppfinnelsen er ikke begrenset til mengden injeksjonsseter eller til farmasøytisk bærer. Tvert imot inkluderer primingstrinn behandlingsregimer som inkluderer en enkelt dose eller dosering som administreres per time, per dag, per uke, per måned eller per år. Som et eksempel kan pattedyr motta en eller to primingjnjeksjoner inneholdende mellom 10 ug og 50 ug plasmid i bærer. En ønsket primingmengde eller dosering for priming DNA vaksinepreparater ligger mellom rundt 1 ug og 10.000 ug av DNA vaksinen. Dose-ringene kan variere fra 1 ug til 1.000 ug DNA per kg individ kroppsvekt. Mengden eller injeksjonssetet velges fortrinnsvis basert på identitet og tilstand hos det pattedyr som behandles.
Doseringsenheten for DNA vaksinen som er egnet for avlevering av antigenet til patte-dyret, beskrives her. DNA vaksinen fremstilles for administrering med suspendering eller oppløsning i en farmasøytisk eller fysiologisk akseptabel bærer som isotonisk salt-oppløsning, isotoniske salter i oppløsning eller andre formuleringer som vil være åpenbare for fagmannen på området. Den egnede bærer vil være åpenbar for fagmannen og vil avhenge for det meste av administreringsveien. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et pattedyr i henhold til de ovenfor beskrevne veier i form av en formu-lering med opprettholdt frigivning ved bruk av en bionedbrytbar biokompatibel poly-mer, eller ved avlevering på setet ved bruk av miceller, geler og liposomer.
Eventuelt kan primingtrinnet ifølge oppfinnelsen også inkludere, sammen med administreringen av priming DNA vaksinepreparatet, en egnet mengde av en adj uvant som definert her.
Fortrinnsvis blir et boostingpreparat administrert rundt 2 til rundt 27 uker etter administrering av priming DNA vaksinen til mammalindividet. Administreringen av boostingpreparatet gjennomføres ved bruk av en effektiv mengde av et boostingvaksinepreparat inneholdende eller i stand til å avgi det samme antigen som administrert av priming DNA vaksinen. Boostingpreparatet kan bestå av en rekombinant, viral vektor avledet fra den samme virale kilde eller fra en annen kilde. Alternativt kan "boostingpreparatet" være et preparat inneholdende det samme antigen som kodet i priming DNA vaksinen men i form av et protein eller peptid, hvilket preparat induserer en immunrespons hos verten. I en annen utførelsesform inkluderer boostingvaksinepreparatet et preparat inneholdende en DNA sekvens som koder antigenet under kontroll av en regulatorisk sekvens som styrer dens ekspresjon i en pattedyrcelle, for eksempel vektorer som velkjente bakterielle eller virale vektorer. De primære krav for boostingvaksinepreparatet er at antigenet av vaksinepreparatet er det samme antigen, eller et kryssreaktivt antigen, som kodet av DNA vaksinen.
Fortrinnsvis er vektorene ifølge oppfinnelsen også velegnet for bruk i regimer som benytter ikke-AAV vektorer så vel som proteiner, peptider og/eller andre biologisk brukbare terapeutiske eller immunogeniske forbindelser. Disse regimer er spesielt velegnet for genavlevering for terapeutiske formål og for immunisering, inkludert indusering av protektiv immunitet. Slike anvendelser vil lett være åpenbare for fagmannen.
Videre tilveiebringer en vektor ifølge oppfinnelsen en effektiv genoverføringstranspor-tør som kan avlevere et valgt transgen til en valgt vertscelle in vivo eller ex vivo også der organismen har nøytraliserende antistoffer mot en eller flere AAV serotyper. I en utførelsesform blir vektoren (for eksempel en rAAV) og cellene blandet ex vivo; de infi-serte celler dyrkes ved bruk av konvensjonelle metoder; og de transduserte celler reinfu-seres i pasienten. Videre kan vektorene ifølge oppfinnelsen også benyttes for fremstilling av et ønsket genprodukt in vitro. For in vitro produksjon kan et ønsket produkt (for eksempel et protein) oppnås fra en ønsket kultur etter transfeksjon av vertsceller med en rAAV inneholdende molekylet som koder det ønskede produkt og dyrking av cellekul-turen under betingelser som tillater ekspresjon. Det uttrykte produkt kan så renses og isoleres etter ønske. Egnede teknikker for transfeksjon, celledyrking, rensing og isolasjon er velkjent for fagmannen.
De følgende eksempler skal illustrere forskjellige aspekter og utførelsesformer av oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1:
PCR forsterkning, kloning og karakterisering av nye AAV sekvenser.
Vev fra ikke-humane primater avsøkes på AAV sekvenser ved bruk av en PCR metode basert på oligonukleotider til sterkt konserverte områder av kjente AAVer. En strekning av AAV sekvens som spennes over 2886 til 3143 bp av AAV1 [SEQ ID nr. 6] ble valgt som en PCR amplikon der et hypervariabelt område av capsidproteinet (Cap) som er unikt for hver kjente AAV serotype, og som her angis som et "signaturområde", er flankert av konserverte sekvenser. I senere analyser ble dette signaturområdet vist å være lokalisert mellom konserverte rester som spente over hypervariabelt område 3.
En første undersøkelse av perifert blod fra et antall ikke-human primat spesier avdekket detekterbar AAV i et subsett av dyr fra spesier som rhesus macaquer, cynomologe macaquer, sjimpanser og bavianer. Imidlertid var det ingen AAV sekvens detektert i noen av de andre testede spesier inkludet rjapanske macaquer, grisehalemacaquer og ekorna-per. En mer utstrakt analyse av vektorfordelingen ble gjennomført i vev av Rhesusaper ved University of Pennsylvania and Tulane-kolonier gjenvunnet ved nekropsi. Dette avdekket AAV sekvens gjennom et vidt mønster av vev.
A. Forsterkning av et AA V signaturområde
DNA sekvenser av AAV1-6 og AAVer isolert fra gjess og ender ble innrettet ved siden av hverandre ved bruk av "Clustal W" ved default innstilling. Innretningen for AAV1-6 og inkludering av informasjon for den nye AAV7 er gitt i figur 1. Sekvenslikheter blant AAVene ble sammenlignet.
Ved denne studie ble et 257 bp område som spente over 2886 bp til 3143 bp av AAV1 [SEQ ID nr. 6], og det tilsvarende område i genomene av AAV 2-6 genomene [se figur 1] identifisert av oppfinnerne. Dette område er lokalisert ved AAV capsid genet og har sterkt konserverte sekvenser både ved 5- og 3' endene og har en relativt variabel sekvens i midten. I tillegg inneholder dette området et DralU restriksjons enzymsete (CACCACGTC, SEQ ID nr. 15). Oppfinnerne har funnet at dette området tjener som spesifikk signatur for hver kjente type av AAV DNA. Ved med andre ord å følge PCR reaksjoner, digestering med endonukleaser som er spesifikke for hver kjente serotype, og gel elektroforeseanalyse kan dette området benyttes for definitivt å identifisere forsterkede DNA til å være fra serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, eller en annen serotype.
Primerne ble designert, validert og PCR betingelsene optimalisert med AAV1, 2 og 5 DNA kontroller. Primerne var basert på sekvensene av AAV2: 5'primeren, IS: bp 2867-2891 av AAV2 (SEQ ID nr. 7) og 3'primeren, 18as, bp 3095-3121 av AAV2 (SEQ ID nr. 7).
Cellulære DNA'er fra forskjellige vev inkludert blod, hjerne, lever, lunge, testis og så videre fra forskjellige rhesusaper ble studert ved bruk av strategien som beskrevet ovenfor. Resultatene viste at DNA'er fra forskjellige vev av disse aper gav grunn til sterke PCR forsterkninger. Ytterligere restriksjonsanalyser av PCR produkter indikerte at de ble forsterket fra AAV sekvenser som var forskjellige fra alle publiserte AAV sekvenser.
PCR produkter (med størrelse rundt 255 bp) fra DNA'er fra en varietet av apevev er klonet og sekvensert. Bioinformasjonsstudier over disse nye AAV sekvenser antydet at de er nye AAV sekvenser av capsid gen og distinkte fra hverandre. Figur 1 inkluderer innretningen av de nye AAV signaturområder for AAV 10-12 [SEQ ID nr. 117, 118 henholdsvis 119]. Multippelsekvensinnretninganalyse ble gjennomført ved bruk av Clustal W (1.81) programmet. Prosentandelen sekvensidentitet mellom signaturområdene for AAV 1-7- og AAV 10-12 genomene er gitt nedenfor.
Over 300 kloner inneholdende nye AAV serotypesekvenser som spenner over det valgte 257 bp område ble isolert og sekvensert. Bioinformatikkanalyse av disse 300+ kloner antydet at dette 257 bp området er kritisk med henblikk på å tjene som en god land mar-kør eller signatursekvens for hurtig isolering og identifisering av en ny AAV serotype.
B. Bruk av signaturområde for PCR forsterkning
257 bp signaturområdet ble benyttet som et PCR anker for å forlenge PCR forsterk-ningene til 5' av genomet for å dekke skjøteområdet for rep- og cap genene (1398 bp - 3143 bp, SEQ ID nr. 6) og 3' av genomet for å oppnå hele cap gen sekvensen (2866 bp - 4600 bp, SEQ ID nr. 6). PCR forsterkninger ble gjennomført ved å benytte standardbe-tingelsene inkludert denaturering ved 95 °C i 0,5-1 minutt, annellering ved 60-65 °C i 0,5-1 minutt og forlengelse ved 72 °C i 1 minutt per kb med et totalt antall forsterk-ningscykler fra 28 til 42.
Ved bruk av de innrettede sekvenser som beskrevet under punkt "A" ble to andre relativt konserverte områder identifisert i sekvensen lokalisert i 3' enden av rep gener og 5' til 257 bp området og i sekvensen nedstrøms 57 bp fragmentet men før AAV 3 ITR. To sett av nye primere ble designet og PCR betingelsene optimalisert for gjenvinning av totalt capsid eller en del av rep sekvensene av nye AAV serotyper. Mer spesifikt var for 5'forsterkningen, 5'primeren, AVINs, GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC [nt 1398-1423 av AVI, SEQ ID nr. 6] og 3'primeren var 18as, identifisert ovenfor. For 3' forsterkning var 5' primeren ls, identifisert ovenfor, og 3' primeren var Av2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 4435-4462 av AAV2, SEQ ID nr. 7].
Ved disse PCR forsterkninger ble 257 bp området benyttet som et PCR anker og land-markør for å generere overlappingsfragmenter for å konstruere et komplett capsid gen
ved fusjon ved DRAin setet i signaturområdet fulgt av forsterkning av 5- og 3'forleng-elsesfragmentene, oppnådd som beskrevet her. Mer spesielt ble, for å generere det intakte AAV 7 cap gen, de tre forsterkningsprodukter (a) sekvensene av signaturområdet; (b) sekvensene av 5'forlengelsen; og (c) sekvensene av 3'forlengelsen, klonet inn i et
pCR4-Topo [Invitrogen] plasmidskjelett i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble plasmidene digestert med Drain og rekombinert for å danne et intakt cap gen.
Ved denne arbeidsvei ble rundt 80 % av capsid sekvensene av AAV7 og AAV8 isolert og analysert. En annen ny serotype, AAV9, ble også oppdaget fra ape nr. 2.
Ved bruk av PCR betingelsene som beskrevet ovenfor isoleres den gjenværende del av rep gen sekvensen for AAV7 og klones så ved bruk av primere som forsterker 108 bp til 1461 bp av AAV genomet (beregnet ved bruk av nummereringen av AAV2, SEQ ID nr. 7). Denne klon sekvenseres for konstruksjon av et fullstendig AAV7 genom uten ITR'er.
C. Direkteforsterkning av 3,1 kb Cap fragmentet
For direkte å forsterke et 3,1 kb full-lengde Cap fragment fra NHP vev- og -blod DNA'er ble to andre sterkt konserverte områder identifisert i AAV genomer for bruk ved PCR forsterkning av store fragmenter. En primer i et konservert område lokalisert i midten av rep genet ble valgt (AVlns: 5' GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3', nt 1398-1423 av SEQ ID nr. 6) i kombinasjon med 3'primeren lokalisert i et annet konservert område nedstrøms cap genet (AV2cas: 5' CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3', SEQ ID nr. 7) for forsterkning av full-lengde cap fragmenter. PCR produktene var Topo-klonet i henhold til produsentens retningslinjer (Invitrogen) og sekvensanalysen ble gjennomført med Qiagengenomics (Qiagengenomics, Seattle, WA) med en nøyaktighet på >99,9 %. Til sammen 50 capsid kloner ble isolert ogkarakterisert. Blant disse var 37 kloner avledet fra Rhesus macaque vev (rh. 1 - rh.37), 6 kloner fra cynomologe macaquer (cy. 1 - cy.6), 2 kloner fra bavianer (bb.l og bb.2) og 5 kloner fra sjimpanser (ch.l - ch.5).
For å utelukke muligheten for at sekvensdiversiteten i den nye AAV familie ikke var et resultat av PCR, som PCR-mediert genspleising ved overlapsforlengelse mellom forskjellige partial DNA templater med homologe sekvenser, eller resultatet av rekombinasjonsprosesser i bakterier, ble en serie forsøk gjennomført under identiske betingelser for VPl forsterkning ved bruk av total cellulære DNA'er. Først ble intakte AAV7- og AAV8 plasmider blandet i et likt molforhold fulgt av seriefortynninger. De seriefortyn-nede blandinger ble benyttet som templater for PCR forsterkning av 3,1 kb VP1 fragmenter ved bruk av universalprimere og identiske PCR betingelser til det som ble benyttet for DNA forsterkning for å se hvorvidt det ble generert noen hybrid PCR produkter. Blandingen ble transformert inn i bakterier og isolerte transformanter for å se etter hybridkloner som eventuelt kunne oppstå fra rekombinasjonsprosesser i bakterieceller. I et annet forsøk ble AAV7- og AAV8 plasmider restriksjonsbehandlet med Msp I, Ava I og Hael, der alle kuttet begge genomer flere ganger ved forskjellige posisjoner, blandet så digestsjonene i forskjelligge rekombinasjoner og benyttet disse for PCR forsterkning av VP1 fragmenter under de samme betingelser for å teste hvorvidt PCR produkter kunne genereres ved overlapsekvensforlengelse av partielle AAV sekvenser. I et annet for-søk ble en blanding av gelrenset 5' l,5kb AAV7 VP1 fragment og 3' 1,7 kb AAV8 VP1 fragment med overlap i signaturområdet, seriefortynnet og benyttet for PCR forsterkning i nærvær og fravær av 200 ng cellulær DNA, ekstrahert fra en apecellelinje som var fri for AAV sekvenser ved TaqMan analyse. Ingen av disse forsøkene viste effektiv PCR mediert overlapsekvensproduksjon under betingelsen for den genomiske DNA cap forsterkning (data ikke vist). Som en ytterligere bekreftelse ble det designert 3 par primere som var lokalisert i forskjellige HVR'er, og var sekvenser spesifikke til variantene av klon 42s fra Rhesus macaque F953, i forskjellige kombinasjoner, for å forsterke kortere fragmenter fra mesenterisk lymfeknute (MLN) DNA fra F953 hvorfra klonet 42s ble isolert. Alle sekvensvariasjoner som var identifisert i full-lengde cap kloner ble funnet i disse korte fragmenter (data ikke vist).
Eksempel 2: Adeno-assosierte vimser undergår substansiell utvikling i primater under naturlige infeksjoner.
Sekvensanalyse av valgte AAV isolater viste divergens gjennom genomet som er mest
konsentrert i hypervariable områder av capsid proteinene. Epidemiologiske data antyder at alle kjent serotyper er endemiske til primater selv om isolasjon av kliniske isolater er begrenset til AAV2 og AAV3 fra anal- og strupeutskrap av humanbarn og AAV5 fra en human condylomatøs vorte. Ingen kjente kliniske sekveller er assosiert med AAV infeksjon.
I et forsøk på bedre å forstå biologien for AAV ble ikke-humane primater benyttet som modeller for å karakterisere sekvellene for naturlige infeksjoner. Vev fra ikke-humane primater ble avsøkt på AAV sekvenser ved bmk av PCR metoden ifølge oppfinnelsen basert på oligonukleotidet til høyt konserverte områder av kjente AAVer (se eksempel 1). Et strekk av AAV sekvens over 2886 til 3143 bp av AAV1 [SEQ ID nr. 6] ble valgt som en PCR amplikon hvori konserverte sekvenser er flankert av et hypervariabelt område som er unikt for hver kjente AAV serotype, her angitt som et "signaturområde".
En første undersøkelse av perfert blod fra et antall ikke-humane primatspesier inkludert Rhesusaper, cynomologe aper, sjimpanser og bavianer, viste detekterbar AAV i et subsett av dyr fra alle spesier. En mer utstrakt analyse av vektorfordelingen ble gjennomført i vev av Rhesusaper fra University of Pennsylvania and Tulane-kolonier, gjenvunnet ved nekropsi. Dette viste ata AAV sekvenser gjennom et vidt mønster av vev.
Den forsterkede signatursekvens ble subklonet inn i plasmider og individuelle transformanter ble underkaste sekvensanalyse. Dette viste substansiell variasjon i nukleotid-sekvensen for kloner avledet fra forskjellige dyr. Variasjon i signatursekvensen ble også notert i kloner oppnådd innen individuelle dyr. Vev som var hentet fra to dyr hvori unike signatursekvenser var identifisert (det vil si kolon fra 98E044 og hjerte fra 98E056) ble ytterligerekarakterisert vedå utvide sekvensen forsterket ved PCR ved bruk av oligonukleotider til høyt konserverte sekvenser. På denne måte ble komplette, provirale strukturer rekonstruert for virale genomer fra begge vev som beskrevet her. Disse provi-ruser skiller seg fra de kjente AAVer med den største sekvensdivergens som ble notert i områdene av Cap genet.
Ytterligere forsøk ble gjennomført for å bekrefte at AAV sekvensene som er resistente til ikke-humant privatvev representerte proviralgenomer av infektiøse vimser som er i stand til å kunne hentes og danne virioner. Genomisk DNA fra levervev av dyr 98E056 hvorfra AAV8 signatursekvensen var bestemt, ble digestert med en endonuklease som ikke har et sete innen AAV sekvensen og transfektert inn i 293 celler med et plasmid inneholdende et El deletert genom av human adenovims serotype 5 som en kilde for hjelperfunksjoner. Det resulterende lysat ble bragt på 293 celler en gang og lysatet gjenvunnet og analysert på nærværet av AAV cap proteiner ved bmk av et bredt reagerende, polyklonalt antistoff mot cap proteiner og nærværet og rikeligheten av DNA sekvenser fra den PCR forsterkede AAV provims hvorfra AAV8 var avledet. Transfeksjon av endonuklease restriksjonsbehandlet hjerte DNA og adenovims hjelperplasmidet gav høye mengder AAV8 vims som påvist ved detektering av cap proteiner ved Western blot analyse og nærværet av IO<4>AAV8 vektorgenomer per 293 celler. Lysater ble generert fra en storskalapreparering og AAV ble renset ved cesiumsedimentering. Det rensede preparat viste 26 nm ikosoedrisk struktur som virket identisk med de til AAV serotype 2. Transfeksjon med adenovirushjelperen alene gav ikke AAV proteiner eller -genomer, noe som utelukker kontaminering som en kilde for gjenvunnet AAV.
For ytterligere å karakterisere inter- og intra dyrevariasjonen av AAV signatursekvensen ble valgte vev underkastet ustrakt PCR for å forsterke hele Cap åpne leserammer.
De resulterende fragmenter ble klonet inn i bakterielle plasmider og individuelle transformanter ble isolert og sekvensielt fullstendig. Denne analyse involverte mesenteriske lymfeknuter fra tre rhesus aper (Tulane/V223 - 6 kloner; tulane/T612 - 7 kloner; Tula-ne/F953 - 14 kloner), lever fra to rhesuaper (Tulane/V251 - 3 kloner; Penn/00E033 - 3 kloner), milt fra en rhesusape (Penn/97E043 - 3 kloner), hjerte fra en rhesusape (JHGT/98E046- 1 klon) og perifert blod fra en sjimpanse (New Iberia/X133 - 5 kloner), seks cynomologe macaquer (Charles River/A1378, A3099, A3388, A3442, A2821, A3442 - til sammen 6 kloner) og en bavian (SFRB/8644 - 2 kloner). Av de 50 kloner som ble sekvensielt fra 15 forskjellige dyr ble 30 ansett som ikke-rikelige basert på funn av minst 7 aminosyredifferanser fra hverandre. De ikke-redundante VPl kloner ble nummerert sekvensielt etter hvert som de ble isolert med en prefiks som antyder spesiene av den ikke-humane primat hvorfra de ble hentet. Den strukturelle sammenheng mellom disse 30 ikke-redundante kloner og de tidligere beskrevne 8 AAV serotyper ble bestemt ved bruk av SplitsTree programmet [D.H. Huson i "SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data." " Bioinformatics" 14, 68-73 (1998)] med implementering av metoden med splittdekomponering. Analysen angir homoplasi mellom et sett av frekvenser i et tre-lignende nettverk heller enn et tre som deler seg i to. Fordelen er å mu-liggjøre detektering av grupperinger som er resultatet av konvergens og å vise fylogene-tiske sammenhenger selv når de er forstyrret av parallelle evenementer. Ekstensiv fylo-genetisk forskning vil være nødvendig for å elucidere AAV utvikling, intensjonen her er kun å grupper forskjellige kloner hva angår deres sekvenslikhet.
For å bekrefte at de nye VPl sekvenser var avledet fra infektiøse, virale genomer, ble cellulær DNA fra vev med høy rikelighet av viral DNA behandlet med en endonuklease som ikke skulle spalte i AAV og så transfektert inn i 293 celler, fulgt av infeksjon med adenovirus. Dette resulterte i "rescue" og forsterkning av AAV genomer fra DNA fra vev fra to forskjellige dyr (data ikke vist).
VPl sekvenser av de nye AAVer ble ytterligerekarakterisertmed henblikk på arten og lokasjonen av aminosekvensvariasjonen. Alle 30 VPl kloner som ble påvist å skille seg fra hverandre med mer enn 1 % aminosyresekvens ble innrettet og bedømt på variasjon i hver rest. En algoritme som var utviklet for å bestemme arealer av sekvensdivergens gav 12 hypervariable områder (HVR) hvorav 5 overlappet eller er en del av de 4 tidligere beskrevne, variable områder [Kotin, supra; Rutledge, supra]. De tre-ganger-proksimale topper inneholder mesteparten av variabiliteten (HVR5-10). Interessant er at løkkene som var lokalisert ved 2- og 5 ganger aksen også viste intens variasjon. HVR'ene 1 og 2 opptrer i den N-terminale del av capsid proteinet som ikke er oppløst i røntgenstrukturen og antyder at N-terminus av VPl proteinet er eksponert på overflaten av virionet.
Sann-tid PCR ble benyttet for å kvantifisere AAV sekvenser fra vev av 21 rhesusaper ved bruk av primere og prober på høyt konserverte områder av Rep (ett sett) og Cap (to sett) av kjente AAVer. Hvert datapunkt representerer analyse fra vev DNA fra et indi-viduelt dyr. Dette bekreftet den vide fordeling av AAV sekvenser selv om den kvantita-tive fordeling var forskjellig dyrene seg imellom. Kilden for dyr og tidligere historie eller behandling syntes ikke å påvirke fordelingen av AAV sekvenser i rhesus macaquer. Tre forskjellige sett av primere og prober ble benyttet for å kvantifisere AAV og gav konsistente resultater. De høyeste nivåer av AAV ble funnet konsistente i mesenteriske lymfeknuter ved et middel på 0,01 kopier per diploidgenom for 13 dyr som var positive. Lever og milt inneholdt også høy rikelighet av virus DNA. Det var eksempler på meget høy AAV som i hjerte av rhesus macaquen 98E056, milten av rhesus macaquen 97E043 og lever fra rhesus macaquen RQ4407, som viste 1,5, 3 henholdsvis 20 kopier av AAV sekvens per diploid genom. Relativt høye nivåer av virus DNA ble notert i perifere mononukleære blodceller, noe som antyder at data i vev ikke skyldes residente blodkomponenter (data ikke vist). Det skal påpekes at denne metode ikke nød-vendigvis vil fange opp alle AAVer som er residente til de ikke-humane primater fordi detekteringen krever høy homologi både hva angår oligonukleotidene og sann-tid PCR proben. Vev fra dyr med høy rikelighet av AAV DNA ble analysert videre på moleky-lærtilstand av den angjeldende DNA ved DNA hybridiseringsteknikker, og dens cellulære fordeling, ved in situ hybridisering.
Type sekvensvariasjon som ble avdekket i AAV provirale fragmenter som var isolert fra forskjellige dyr og innen vev fra samme dyr, er reminiscent fra utviklingen som inntrer for mange RNA vimser under pandemi eller sogar innen infeksjonen av et individ. I noen situasjoner er nosjonen av en vill-type vims erstattet med eksistensen av svermer av kvasispesier som utvikler seg som et resultat av hurtig replikering og mutasjoner i nærvær av selektivt trykk. Ett eksempel er infeksjon ved HIV som utvikles i respons på immunologisk og farmakologisk trykk. Flere mekanismer bidrar til den høye grad av mutasjoner i RNA vimser inkludert lav fidelitet og mangel på sikker avlesningskapasitet av reverstranskriptase og ikke-homolog og homolog rekombinering.
Bevis på dannelse av kvasispesier av AAV ble illustrert i denne studie ved den systema-tiske sekvensering av multippelklonede provirale fragmenter. Således kunne identiske sekvenser ikke finnes innen noen forlengede kloner isolert mellom eller innen dyrene. En viktig mekanisme for denne utvikling av sekvens synes å være den høye grad av homolog rekombinering mellom et mer begrenset antall parenterale vimser. Nettoresul-tatet er en utstrakt bytting av hypervariable områder av cap protein som fører til et mønster av kimerer som kan ha forskjellig tropisme og serologiske spesifisiteter (for eksempel evnen til å slippe unna immunologiske responser, spesielt når det angår nøyt-raliserende antistoffer). Mekanismer ved hvilke homolog rekombinering kan inntre er uklar. En mulighet er at + - og -trådene av forskjellige enkelttrådede AAV genomer annellerer under replikering slik det er beskrevet under høy multiplisitet av infeksjoner med AAV rekombinanter. Det er uklart om andre mekanismer bidrar til sekvensutvik-ling i AAV infeksjoner. Den totale grad av mutasjon som inntrer under AAV replikering synes å være relativt lav og data antyder ikke høye frekvenser av replikasjonsfeil. Imidlertid er vesentlige omarrangeringer av AAV genom beskrevet under lytisk infeksjon som fører til dannelsen av defektive, interfererende partikler. Uansett de mekanismer som fører til sevkvensdivergens forble, med få unntak, vpl strukturen av kvasispe-siene intakt uten rammeskifte eller ikke-sense mutasjon, noe som antyder at kompetitiv seleksjon av vims med den gunstigste tilpasningsprofil bidrar til populasjonsdynamik-ken.
Disse studier har implikasjoner på flere områder av biologi og medisin. Konseptet med
hurtig vimsutvikling, tidligere antatt å være en egenskap begrenset til RNA vimser, bør tas i betraktning i DNA vimser som klassisk har værtkarakterisert vedserologiske analyser. Det vil være viktig uttrykt ved parvoviruser å utvikle en ny metode for å beskrive vimsisolater som fanger inn kompleksiteten av deres struktur og biologi som ved HIV, som er kategorisert som generelle familier av lik struktur og funksjon kalt Clades. En alternativ strategi er å fortsette å kategorisere isolater med henblikk på serologisk spesi-fisitet og å utvikle kriterier for å beskrive varianter innen serologiske grupper.
Eksempel 3: Vektorologj for rekombinante AAV genomer utstyrt med AAV2 ITR'er ved bmk av kimere plasmider inneholdende AAV2 rep- og nye AAV cap gener for serologisk og genoverføringsstudier i forskjellige dyremodeller.
Kimeriske pakningskonstrukter genereres ved å fusere AAV2 rep med cap sekvenser av nye AAV serotyper. Disse kimere pakkingskonstrukter benyttes i utgangspunktet for pseudotyping av rekombinante AAV genomer som bærer AAV2 ITR'er ved trippeltransfeksjon i 293 celler ved bruk av Ad5 hjelperplasmid. Disse pseudotyper vektorer benyttes for å evaluere ytelsen i transduksjonsbaserte, serologiske studier og evaluerer genoverføringseffektiviteten av nye AAV serotyper i forskjellige dyremodeller inkludert NHP og gnagere, før intakte og infektiøse vimser av disse nye serotyper isoleres.
A. pAAV2GFP
AAV2 plasmidet som inneholder AAV2 ITR'ene og grønt fluorescent protein uttrykt under kontroll av en konstitutiv promoter. Dette plasmid inneholder de følgende elementer: AAV2 ITR'ene, en CMV promoter, og GFP kodingssekvensen.
B. Kloning av trans plasmid
For å konstmere det kimeriske transplasmid for produksjon av rekombinante, pseudotypede AAV7 vektorer, ble p5E18 plasmidet (Xiao et al., 1999, "J. Virol." 73:3994-4003) partielt digestert med Xho I for å linealisere plasmid ved Xho I setet kun i posisjon 3169. De Xho I kuttede ender ble så fylt inn og ligert tilbake. Dette modifiserte p5E18 plasmid ble behandlet med Xba I og Xho I i en fullstendig digestering for å fjerne AAV2 cap gen sekvensen og erstattet med et 2267 bp Spe I/Xho fragment inneholdende AAV7 cap genet som var isolert fra pCRAAV7 6-5+15-4 plasmid.
Det resulterende plasmid inneholder AAV2 rep sekvensene for Rep78/68 under kontroll av AV2 P5 promoteren og AAV2 rep sekvensene for Rep52/40 under kontroll av AAV2 P19 promoteren. AAV7 capsid sekvensene er under kontroll av AAV2 P40 promoteren dette plasmid inneholder videre en spacer 5' av rep ORF.
C. Fremstilling av pseudotypet rAA V
rAAV partiklene (AAV2 vektor i AAV7 capsid) genereres under en adenovimsfri metode. Kort sagt ble cis plasmidet (pAAV2.1 lacZ plasmid inneholdende AAV2 ITR'ene) og trans plasmidet pCRAAV7 6-5+15-4 (inneholdende AAV2 rep og AAV7 cap) og henholdsvis et hjelperplasmid, samtidig kotransfektert inn i 293 celler i et forhold på 1:1:2 ved kalsiumfosfatprecipitering.
For konstmksjon av pAd hjelperplasmidene ble pBGlO plasmid ervervet fra Microbix (Canada). Et RsII fragment inneholdende L2 og L13 ble deletert fra pBHGlO, noe som gav det første hjelperplasmid, pAdAF13. Plasmid AdA Fl ble konstruert ved å klone Asp700/Sall fragment med en Pmel/Sgfl delesjon, isolering fra pBHGlO inni Bluescriptet. MLPL, L2 og L3, ble deletert i pAdAFl. Videre delesjoner av et 2,3 kb Nrul fragment og deretter et 0,5 kb RsrH/NruI fragment genererte hjelperplasmider pADAF5 henholdsvis pADAF6. Hjelperplasmidet, kalt pAF6, gav de vesentlige hjelperfunksjoner av E2a og E4 ORF6 som ikke ble tilveiebragt av den El-uttrykkende hjel-percelle, men er deletert fra adenovirale capsid proteiner og funksjonelle El områder.
Karakeristisk ble 50 ug DNA (cis:trans:hjelper) transfektert på en 150 mm vevkulturs-kål. 293 cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, sonikert og behandlet med 0,5 % natriumdeoksykolat (37 °C i 10 minutter). Cellelysater ble så underkastet to run-der av en CsCl gradient. Toppfraksjoner inneholdende rAAV vektor ble samlet, slått sammen og dialysert mot PBS.
Eksempel 4: Dannelse av infektiøse kloner som bærer intakte, nye AAV serotyper for studie av prinsipiell virologi i human- og NHP avledede cellelinjer og bedømmelse av patogenese av nye AAV serotyper i NHP- og andre dyremodeller.
For å oppnå dette formål ble genom vandrer systemet benyttet for å oppnå 5'- og 3- terminal sekvenser (ITR'er) og fullstendig konstruksjon av kloner inneholdende intakte, nye AAV serotype genomer.
Ved bruk av et kommersielt tilgjengelig "Universal Genome Walker Kit" [Clontech] ble kort sagt genomiske DNA'er fra apevev eller cellelinjer som er identifisert som positive for nærvær av AAV7 sekvensen, digestert med Dra I-, EcoR V-, Pvu II- og Stu I-endonuklease og ligert til "Genome Walker Adaptor" for å generere 4 individuelle "Genome Walker Libraries" (GWL'er). Ved bruk av DNA'er fra GWL'ene som templater blir AAV7 og nabogenomiske sekvenser PCR-forsterket av adaptorprimer 1 (API, tilvei ebragt i settet) og en AAV7 spesifikk primer 1, fulgt av en nestet PCR ved bruk av adaptor primer 2 (AP2) og en ytterligere AAV7 spesifikk primer 2, begge interne i det første sett av primere. Hoved PCR produktene fra den "nestede" PCR klones og karakteriseres ved sekvensanalyse.
I dette forsøk ble primere som dekker de 257 bp eller andre signaturfragmenter av et generisk AAV genom benyttet for PCR forsterkning av cellulære DNA'er ekstrahert fra Human- og NHP avledede cellelinjer for å identifisere og karakterisere de latente AAV sekvenser. De identifiserte, latente AAV genomer gjenvinnes fra de positive cellelinjer ved bruk av adenovirushjelpere av forskjellige spesier og stammer.
For å isolere infektiøse AAV kloner fra NHP avledede cellelinjer oppnås en ønsket cellelinje fra ATCC og avsøkes ved PCR for å identifisere 257 bp amplikonet, det vil si oppfinnelsens signaturområde. Dette 257 bp PCR produkt klones og serotypes ved se-kvenseringsanalyse. For disse cellelinjer inneholdende AAV7 sekvensen blir cellene infisert med SV-15, en simian adenovirus ervervet fra ATCC, human Ad5 eller transfektert med plasmidkonstrukt som huser de humane Ad gener som er ansvarlige for AAV hjelperfunksjonene. 48 timer etter infeksjon eller transfeksjon blir cellene høstet og Hirt DNA preparert for kloning av AAV7 genom i henhold til Xiao et al., 1999, "J. Virol.", 73:3994-4003.
Eksempel 5: Fremstilling av AAV vektorer
En pseudotypingsstrategj tilsvarende den i eksempel 3 for AAV1/7 ble benyttet for å
produsere AAV2 vektorer pakket med AAV1-, AAV5- og AAV8 capsid proteiner. Kort sagt blir rekombinante AAV genomer utstyrt med AAV2 ITR'er pakket ved trippeltransfeksjon av 293 celler med cis-plasmid, adenovirushjelperplasmid og et kimerisk pakke-konstrukt der AAV2 rep genet er fusert med cap gener av nye AAV serotyper. For å skape de kimeriske pakningskonstrukter ble Xho I setet av p5E18 plasmid ablatert ved 3169 bp og det modfiserte plasmid ble behandlet med Xba I og Xho I i en fullstendig digestering for å fjerne AAV2 cap genet og erstatte dette med et 2267 bp Spe I/Xho I fragment inneholdende AAV8 cap genet [Xiao, W., et al., (1999) "J Virol" 73, 3994-4003]. En tilsvarende kloningsstrategj ble benyttet for å skape kimere pakningsplasmi-der av AAV2/1 og AAV2/5. Alle rekombinante vektorer ble renset ved standard CsCb sedimenteringsmetoden bortsett fra AAV2/2 som ble renset ved en enkelttrinns hepa-rinkromatografi.
Genomkopi (GC) titere av AAV vektorer ble bestemt ved TaqMan analyse ved bruk av prober og primere som siktes på SV40 poly A området som beskrevet tidligere [Gao, G, et al., (2000) "Hum Gene Ther" 11, 2079-91].
Vektorer ble konstruert for hver serotype for et antall av in vitro- og in vivo studier. Åtte forskjellige transgene kassetter ble innarbeidet i vektorene og rekombinante virioner ble fremstilt for hver serotype. Gjenvinningen av virus, basert på genomkopi er, er oppsummert i tabell 4. Utbyttene av vektor var høy for hver serotype uten noen konsistente forskjeller mellom serotypene. Data som er vist i tabellen er midlere genomkopiutbytter med standardavvik x IO<13>av multiple produksjonsloter på 50 plate (150 mm) transfek-sjoner.
Eksempel 6: Serologiske analyser av pseudotypede vektorer
C57BL/6 mus ble injisert med vektorer av forskjellige serotyper av AAVCBA1AT vektorer intramuskulært (5 x 10<11>) og serumprøver ble samlet 34 dager senere. For å teste nøytraliserings- og kryssnøytraliseringsaktiviteten for sera mot hver serotype av AAV, ble sera analysert i en transduksjonsbasert, nøytraliserende antistoffanalyse [Gao,G.P., et al., (1996) "J Virol", 70, 8934-43]. Mer spesielt ble nærvær av nøytraliserende antistoffer bestemt ved å bedømme evnen hos serum til å inhibere transduksjon av 84-31 celler med rapportørviruser (AAVCMVEGFP) av forskjellige serotyper. Spesifikt ble rapportørvirusen AAVCMVEGFP av hver serotype [ved infeksjonsmultiplisitet (MOI) som ledet til transduksjon av 90 % av indikatorcellene] forinkubert med varmeinaktivert serum fra dyr som hadde mottatt forskjellige serotyper av AAV fra naive mus. Etter 1 times inhibering ved 37 °C ble virusene satt til 84-31 cellene i 96 brønners plater i 48 eller 72 timer, avhengig av virus serotypen. Ekspresjonen av GFP ble målt ved Fluor-olmagjn (Molecular Dynamics) og kvantifisert ved "Image Quant Software". Nøytrali-serende antistofftitere ble rapportert som den høyeste serumfortynning som inhiberte transduksjon til mindre enn 50 %.
Tilgjengeligheten av GFP uttrykkende vektorer forenklet utviklingen av en analyse for nøytralisering av antistoffer som var basert på inhibering av transduksjon i en tillatende cellelinje (det vil 293 celler som stabilt uttrykker E4 fra Ad5). Sera til utvalgte AAV serotyper ble generert ved intramuskulær injeksjon av de rekombinante vimser. Nøytra-lisering av AAV transduksjonen ved 1:20- og 1:80 fortynninger av antisera ble evaluert (se tabell 5). Antisera til AAV1, AAV2, AAV5 og AAV8 nøytraliserte transduksjon av serotyper hvortil antiserumet ble generert (AAV5 og AAV8 i mindre grad enn AAV1 og AAV2) men ikke til den andre serotype (det vil si at det ikke var noe bevis på noen kryssnøytralisering som antyder at AAV8 er en virkelig unik serotype).
Humansera fra 52 normale individer ble avsøkt på nøytralisering mot valgte serotyper. Ingen serumprøve ble funnet å nøytralisere AAV2/7 og AAV2/8 mens AAV2/2- og AAV2/1 vektorer ble nøytralisert i 20 % henholdsvis 10 % semm. En fraksjon av hu-mansammenslått IgG som representerer en samling av 60 000 individuelle prøver nøyt-raliserte ikke AAV2/7 og AAV2/8 mens AAV2/2- og AAV2/1 vektorene ble nøytrali-sert ved semmtitere lik 1:1280 henholdsvis 1:640.
Eksempel 7: In vivo evaluering av forskjellige serotyper av AAV vektorer
I denne studie ble 7 rekombinante AAV genomer, AAV2CBhAl AT, AAV2AlbhA1 AT, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ og AAV2TBGLacZ pakket med capsid proteiner av forskjellige serotyper. I alle syv konstrukter var minigenkassetten flankert med AAV2 ITR'er. cDNA'er av human a-antitrypsin- (AlAT) [Xiao, W., et al., (1999) "J Virol" 73, 3994-4003], P-subenheten av rhesusape koriogonadotropisk hormon- (CG) [Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000) " Mol Ther" 2,657-9], canine faktor IX- [Wang, L., et ala., (1997) " Proe Nati Acad Sei USA " 94,11563-6] og bakteriell P-galaktosidase (det vil si Lac Z) gener ble benyttet som rapportørgener. For leverrettet genoverføring ble enten musealbumingenpromoter (Alb) [Xiao, W. (1999), supra] eller humantyroidhormonbindingsglobulingenpromoter (TBG) [Wang (1977), supra] benyttet for å drive leverspesifikk ekspresjon av rappor-tørgener. I muskelrettet genoverføirngsforsøk ble enten den tidlige cytomegalovirus-promoter (CMV) eller kylling P-aktinpromoter med CMV enhancer (CB) benyttet for å styre ekspresjonen av rapportører.
For muskelrettet genoverføring ble vektorer injisert i den høyre tibialis anterior på 4-6 uker gamle nakne NCR- eller C57BL/6 mus (Taconic, Germantown, NY). I lever-rettet genoverføringsstudier ble vektorer infusert intraportalt i 7-9 uker gamle nakne NCR-eller C57BL/6 mus (Taconic, Germantown, NY). Serumprøver ble samlet intraorbitalt på forskjellige tidspunkter etter vektoradministreringen. Muskel- og/eller levervev ble høstet på forskjellige tidspunkter for cryosnitt og Xgal histokjemisk farving fra dyr som fikk lacZ vektorene. For re-administreringsforsøket fikk C56BL/6 mus først AAV2/1-, - 2/2-, -2/5-, -2/7- og -2/8CBA1 AT vektorer intramuskulært og fulgt for Al AT genekspresjon i 7 uker. Dyrene ble så behandlet med AAV"(8TBGcFDC intraportalt og studert for cFJX genekspresjon.
ELISA baserte analyser ble gjennomført for å kvantifisere serumnivåene av hAl AT-, rhCG- og cFIX proteiner som beskrevet tidligere [Gao, G.P., et al, (1996) " J Virol" 70, 8934-43; Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000) " Mol Ther" 2, 657-9; Wang, L., et al., " Proe Nati Acad Sei USA "94, 11563-6]. Forsøkene ble fullført når dyrene ble avlivet for høsting av muskel- og levervev for DNA ekstrahering og kvantitativ analyse av genomkopier av vektorer til stede i målvevet ved TaqMan ved bruk av det samme sett av primere og prober som ved titrering av vektorpreparatene [Zhang, Y., et al., (2001) " Mol Ther" 3, 697-707].
Ytelsen for vektorer basert på de nye serotyper ble bedømt i murinmodeller av muskel-og leverrettet genoverføring og sammenlignet med vektorer basert på de kjente serotyper AAV1, AAV2 og AAV5. Vektorer som uttrykker utskilte proteiner (a-antitrypsin (Al AT) og chorionisk gonadotropin (CG)) ble benyttet for å kvantifisere relative trans-duksjonseffektiviteter mellom forskjellige serotyper ved hjelp av ELISA analyse av sera. Cellulærfordelingen av transduksjon innen mål organet ble bedømt ved bruk av lacZ uttrykkende vektorer og Z-gal histokjemi.
Ytelsen for AAV vektorer i skjelettmuskelen ble analysert etter direkteinjeksjon i tibialis anterior musklene. Vektorer inneholdt det samme AAV2 baserte genom med det umiddelbart tidlige gen av CMV eller en CMV enhanced P-actin promoter, som driver ekspresjonen av transgenet. Tidlige studier indikerte at immunkompetente C57BL/6 mus utløste begrensede humorale responser til human Al AT proteinet når det ble uttrykt fra AAV vektorer [Xiao, W. Et al., (1999) " J Virol" 73, 3994-4003].
I hver stamme produserte AAV2/1 vektorer de høyeste nivåer av Al AT og AAV2/2 vektoren de laveste mens AAV2/7- og AAV2/8 vektorene viste mellomliggende nivåer for ekspresjonen. Toppnivåer av CG 28 dager etter injeksjonen av nu/nu NCR mus viste de høye nivåer fra AAV2/7 og de laveste fra AAV2/2 mens AAV2/8 og AAV2/1 lå mellom disse. Injeksjon av AAV2/1- og AAV2/7 lacZ vektorer gav genekspresjon ved injeksjonssetene i alle muskelfibrene med vesentlig færre lacZ positive fibre observert med AAV2/2- og AAV2/8 vektorer. Disse data antyder at transduksjonseffektiviteten med AAV2/7 vektorer i skjelettmuskelen er tilsvarende det som oppnås med AAV2/1 som er den mest effektive i skjelettmuskler av de tidligere beskrevne serotyper [Xiao, W. (1999), sitert ovenfor, Chao, H., et al., (2001), " Mol Ther" 4, 217-22; Chao, H., et al., (2000) " Mol Ther" 2, 619-23].
Tilsvarende murinmodeller ble benyttet for å evaluere leverrettet genoverføring. Identiske doser av vektorer basert på genomkopier ble infusert i portalvenene av mus som ble analysert deretter på ekspresjon av transgenet. Hver vektor inneholdt et AAV2 basert genom ved bruk av tidligere beskrevne, leverspesifikke promotere (det vil si albumin- eller tyroidhormonbindingsglobulin) for å drive ekspresjonen av transgenet. Mer spesielt ble CMVCG- og TBGCG minigen kassetter benyttet for muskel- henholdsvis leverberettet genoverføring. Nivåer av rhCG ble definert som relative enheter (Rus x IO<3>). Data er angitt fra analysering av serumprøver samlet dag 28 etter vektoradministrering (4 dyr per gruppe). Som vist i tabell 3 var virkningen av capsid proteiner på effektiviteten av transduksjon av Al AT vektorer i nu/nu- og C57BL/6 mus og CG vektorer i C57BL/6 mus konsistent (se tabell 6).
I alle tilfeller gav AAV2/8 vektorer de høyeste nivåer av transgen ekspresjon som lå fra 16 til 110 større enn det som ble oppnådd med AAV2/2 vektorer; ekspresjonen fra AAV2/5- og AAV2/7 vektorer lå mellom med AAV2/7 høyere enn AAV2/5. Analyser av X-Gal farvede leversnitt fra dyr som mottok de tilsvarende lacZ vektorer viste en korrelasjon mellom antallet transduserte celler og de totale nivåer av transgen ekspresjon. DNA'er som var ekstrahert fra levere fra C57BL/6 mus som fikk Al AT vektorene ble analysert på forekomsten av vektor DNA ved bruk av sann-tid PCR teknologi.
Mengden vektor DNA som ble funnet i leveren 56 dager etter injeksjon korrelerte med nivåene av transgen ekspresjonen (se tabell 7). For dette forsøk ble et sett av probe og primere innsiktet på SV40 polyA området av vektorgenomet benyttet for TaqMan PCR. De viste verdier er gjennomsnittet av tre individuelle dyr med standardavvik. Dyrene ble avlivet dag 56 for å høste levervev for DNA ekstrahering. Disse studier antyder at AAV8 er den mest effektive vektor for leverrettet genoverføring på grunn av øket antall transduserte hepatocyter.
De serologiske data som er beskrevet ovenfor antyder at AAV2/8 vektorer ikke skulle
nøytraliseres in vivo etter immunisering med de andre serotyper. C57BL/6 mus som fikk intraportale injeksjoner av AAV2/8 vektorer uttrykker canine faktor JX (IO<11>genomkopier) 56 dager etter at de fikk intramuskulære injeksjoner av Al AT vektorer fra forskjellige serotyper. Høye nivåer av faktor JX ekspresjon ble oppnådd 14 dager etter infusjon av AAV2/8 i naive dyr (17±2 ug/ml, n=4), noe som ikke var signifikant forskjellig fra det som ble observert hos dyr som var immunisert med AAV2/1 (31±23 ug/ml, n=4), AAV2/2 (16 ug/ml, n=2) og AAV2/7 (12 ug/ml, n=2). Dette står i motsetning til det som ble observert i AAV2/8 immuniserte dyr som var infusert med AAV2/8 faktor JX vektor der ingen detekterbar faktor JX ble observert (<0,1 ug/ml, n=4).
Oligonukleotider til konserverte områder av cap genet forsterket sekvenser fra rhesusaper som representerte unike AAVer. Identiske cap signatursekvenser ble funnet i mange vev fra rhesusaper som stammet fra minst to forskjellige kolonier. Full-lengde rep- og cap åpen leserammer ble isolert og sekvensert fra enkelte kilder. Kun de cap åpne leserammer av de nye AAVer var nødvendige for å evaluere deres potensiale som vektorer fordi vektorer med AAV7- eller AAV8 capsidene ble generert ved bruk av ITR'ene og rep fra AAV2. Dette forenklet også sammenligningen mellom forskjellige vektorer fordi det aktuelle vektorgenom er identisk mellom forskjellige vektor serotyper. Således var utbyttene av rekombinante vektorer som var generert ved bruk av denne vei ikke vesentlig forskjellig mellom serotypene.
Vektorer basert på AAV7 og AAV8 syntes å være immunologisk distinkte (det vil si at de ikke ble nøytralisert av antistoffer generert mot andre serotyper). Videre nøytraliserte ikke sera fra mennesker transduksjon med AAV7- og AAV8 vektorer, noe som er en vesentlig fordel i forhold til de humanavledede AAVer som i dag er under utvikling for hvilke en signifikant andel av den humane populasjon har pre-eksisterende immunitet som er nøytraliserende [Chirmule, N., et al., (1999) " Gene Ther" 6, 1574-83].
Tropismen for hver ny vektor er gunstig for in vivo anvendelser. AAV2/7 vektorene synes å transdusere skjelettmuskelen like effektivt som AAV2/1 som er den serotype som gir det høyeste nivå av transduksjon i skjelettmuskelen hos primat AAVer testet til i dag [Xioa., W., supra; Chou (2001), supra og Chou (2000) supra]. Viktig er at AAV2/8 gir en vesentlig fordel i forhold til de andre serotyper uttrykt ved effektivitet ved genoverføring til leveren som inntil nu har vært relativt skuffende uttrykt ved antallet hepatocyter som stabilt ble transdusert. AAV2/8 oppnådde konsistent en 10 til 100- gangers forbedring i genoverføringseffektiviteten sammenlignet med de andre vektorer. Basis for den forbedrede effektivitet for AAV2/8 er uklar selv om det muligens skyldes opptaket via en annen receptor som er mer aktiv i den basolaterale overflate av hepatocytene. Denne forbedre effektivitet vil være heller brukbar ved utvikling av leverrettet genoverføring der antallet transduserte celler er kritisk, for eksempel slik tilfellet er når det gjelder urea cyklus lidelser og arvelig hyperkolesterolemi.
Således tilveiebringer oppfinnelsen en ny tilnærmelse for isolering av nye AAVer basert på PCR gjenvinning av genomiske sekvenser. De forsterkede sekvenser ble lett innarbeidet i vektorer og testet i dyr. Mangelen på for-eksisterende immunitet til AAV7 og den gunstige tropisme hos vektorene for muskelen antyder at AAV7 er egnet for anvendelse som vektor i humangenterapi og andre in vivo anvendelser. Tilsvarende gjør mangelen på for-eksisterende immunitet mot AAV serotypene ifølge oppfinnelsen, og deres tropismer, dem også brukbare for avlevering av terapeutiske molekyler og andre brukbare molekyler.
Eksempel 9 - Vevtropismestudier
Ved konstruksjonen av et høyytelsesfunksjonelt screeningskjema for nye AAV konstrukter ble en ikke-vev spesifikk og meget aktiv promoter, CB promoteren (CMV enhanced kylling p actin promoter) valgt for å drive et lett detekterbart og kvantifiser-bart rapportørgen, human a anti-trypsin genet. Således behøver man kun å lave en vektor for hver nye AAV klon for genoverføringsstudiet som tar sikte på 3 forskjellige vev, lever, lunge og muskel, for avsøking for vevtropisme for et spesielt AAV konstrukt. Tabell 8 oppsummerer data som er generert fra 4 nye AAV vektorer i vevtropismestudi-ene (AAVCBA1 AT), hvorfra en ny AAV capsid klon, 44.2, ble funnet å være en meget potent genoverføringsbærer i alle 3 vev med stor avstand når det gjelder særlig lungevev. Tabell 8 rapporterer data oppnådd (i ug Al AT/ml serum) på studiens dag 14.
Et par andre forsøk ble så gjennomført for å bekrefte den overlegne tropisme for AAV 44,2 i lungevev. Først ble AAV vektorbåret CClOhal AT minigen for lungespesifikk ekspresjon pseudotypet med capsider av nye AAVer gitt til immundefekte dyr (nakne NCR) i et likt volum (50 ul hver av de opprinnelige preparater uten fortynning) via intratrakeale injeksjoner som gitt i tabell 9.1 tabell 9 vises 50 ul av hvert opprinnelige preparat per mus, NCR nakne, med detekteringsgrense >0,033 ug/ml, dag 28.
Vektorene ble også administrert til immunkompetente dyr (C57BL/6) i like genomkopier (1 x 10<11>) som vist i tabell 10. (1 x 10<11>GC per dyr, C57BL/6, dag 14, detekteringsgrense >0,033 ug/ml)
Data fra begge forsøk bekreftet den overlegne tropisme for klon 44,2 i lungerettet gen-overføring.
Interessant er at ytelsen for klon 44,2 i lever- og muskelrettet genoverføring også var fremragende, nær den til den beste levertransducer, AAV8, og den beste muskeltransdu-cer AAV1, noe som antyder at denne nye AAV har en viss spesiell biologisk signifi-kans.
For å studere serologiske egenskaper for disse nye AAVer ble pseudotypede AAVGFP vektorer skapt for immunisering av kaniner og in vitro transduksjon av 84-31 celler i nærvær og fravær av antisera mot de forskjellige capsider. Data er oppsummert nedenfor:
Eksempel 10 - Musemodell for arvelig hyperkolesterolemi
De følgende forsøk viser at AAV2/7 konstruktet ifølge oppfinnelsen avgir LDL receptoren og uttrykker LDL receptoren i en mengde tilstrekkelig til å redusere nivåene for plasmakolesterol og triglycerider i dyremodeller av arvelig hyperkolesterolemi.
A. Vektorkonstruksjon
AAV vektorer, pakket med AAV7- eller AAV8 capsid proteiner ble konstruert ved bruk av en pseudotypingsstrategi [Hildinger, M et al., " J. Virol" 2001; 75:6199-6203]. Rekombinante AAV genomer med AAV2 inverterte terminalrepeatere (ITR) ble pakket ved trippeltransfeksjon av 293 celler med cis-plasmidet, adenovirushjelperplasmidet og et kimerisk pakkingskonstrukt, en fusjon av capsidene av de nye AAV serotyper med rep genet av AAV2. Det kimeriske pakkingsplasmid ble konstruert som beskrevet tidligere [Hildinger et al, supra]. De rekombinante vektorer ble renset ved standard CsCb sedimenteringsmetoden. For å bestemme utbyttet ble TaqMan (Applied Biosystems) analyse gjennomført ved bruk av prober og primere som sikter på SV40 poly(A) området av vektorene [Gao GP, et al. " Hum Gene Ther." 2000 Okt 10, 11(15):2079-91]. De resulterende vektorer uttrykker trans genet under kontroll av den humane tyroid-hormonbindingsglobulingenpromoter (TBG).
B. Dyr
LDL receptordefekte mus med C57B1/6 bakgrunn ble ervervet fra Jackson Laboratory (Bar Harbour, ME, USA) og holdt som en formeringskoloni. Musene ble gitt ubegrenset tilgang til vann og fikk en Western Diet med høyt fettinnhold (høy % kolesterol) med start tre uker før vektorinjeksjon. På dag -7 så vel som dag 0 ble blod oppnådd via retroorbitale tappinger og lipidprofilen ble bedømt. Musene ble vilkårlig inndelt i syv grupper. Vektoren ble injisert via en intraportalinjeksjon som beskrevet tidligere ([Chen SJ et al., " Mol Thercpy" 2000; 2(3), 256-261]. Kort sagt ble musene anestetisert med ketamin og xylazin. En laparotomy ble gjennomført og portalvenen eksponert. Ved bruk av en 30g nål ble den egnede dose av vektor, fortynnet i lOOul PBS, injisert direkte i portalvenen. Trykk ble lagt på injeksjonssetet for å sikre blødningsstoff. Huden rundt ble lukket og drapert og musene omhyggelig overvåket den følgende dag. Ukentlige tappinger ble gjennomført med start dag 14 etter leverrettet genoverføring for å måle blodlipidene. To dyr i hver gruppe ble avlivet på tidspunktene 6 uker og 12 uker etter vektorinjeksjon for å undersøke aterosklerotisk plakkstørrelse så vel som receptoreks-presjon. De gjenværende mus ble avlivet i uke 20 for plakkmåling og bestemmelse av trans gen ekspresjon.
C. Serum lipoprotein- og leverfunksjonsanalyse
Blodprøver ble oppnådd fra den retroorbitale pleksus etter en 6 timers fasteperiode. Serum ble separert fra plasma ved sentrifugering. Mengden plasmalipoproteiner og lever-transaminaser i serum ble detektert ved bruk av en automatisert, klinisk kjemianalysør (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassemann).
D. Detektering av transgenekspresjon
LDL receptor ekspresjon ble evaluert ved immunofluoressensfarving og Western Blot. For Western Blot ble frossent levervev homogenisert med lyseringsbuffer (20 mM Tris, pH7,4, 130mMNacl, 1 % triton X 100, proteinaseinhibitor (komplett, EDTA-fri, Roche Mannheim, Tyskland). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av "Micro BCA Protein Assay Reagent Kit" (Pierce, Rockford, IL). 40 ug protein ble oppløst i 4-15 % Tris-HCl "Ready Gels" (Biorad, Hercules, CA) og overført til en nitrocellulosemembran (InVitrogen). For å generere Anti-hLDL receptorantistoffer ble en kanin injisert intra-venøst med et AdhLDLr prep (lxlO<13>GC). Fire uker senere ble kaninserum oppnådd og benyttet for Western Blot. En 1:100 fortynning av serum ble benyttet som et primærantistoff fulgt av et HRP-konjugert anti-kanin IgG og ECL kjemiluminescent detektering ("ECL Western Blot Detection Kit", Amersham, Arlington Heights, IL).
E. Immunocytokjemi
For bestemmelse av LDL receptorekspresjonen i frosne leversnitt ble det gjennomført immunohistokjemianalyser. 10 um kryostatsnitt ble enten fiksert i aceton i 5 minutter eller ikke fiksert. Blokkering ble oppnådd via en 1 times inkuberingsperiode med 10 % gjeteserum. Snitt ble så inkubert i en time med det primære antistoff ved romtemperatur. Et kaninpolyklonalt antistoff anti-human LDL (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) ble benyttet fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner. Snittene ble vasket med PBS og inkubert med 1:100 fortynnet fluorescein gjeteantikanin IgG (Sigma, St Louis, MO). Prøver ble til slutt undersøkt under fluoressensmikroskop Nikon Microphot-FXA. I alle tilfelle ble hver inkubering fulgt av utstrakt vasking med PBS. Negative kontroller bestod av forinkubering med PBS, utelatelse av det primære antistoff og erstatning av det primære antistoff med et isotypetilpasset ikke-immunt kon-trollantistoff. De tre typer kontroller som nevnt ovenfor ble gjennomført for hvert forsøk den samme dag.
F. Genoverføringseffektivitet
Levervev ble oppnådd etter avlivning av musene på de angitte tidspunkter. Vevet ble sjokkfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C inntil ytterligere prosessering. DNA ble ekstrahert fra levervevet ved bruk av et "QIAamp DNA Mini Kit" (QIAGEN Gmbh, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Genomkopi er av AAV vektorer i levervevet ble evaluert ved bruk av Taqman analyse ved bruk av prober og primere mot SV40 poly(A) halen som beskrevet ovenfor.
G. Aterosklerotisk plakkmåling
For kvantifisering av tilstedeværende aterosklerotisk plakk i museaorta ble musene anestetisert (10 % ketamin og xylazin, ip), brystet åpnet og arteriesystemet perfusert med iskold fosfatbufret saltoppløsning gjennom den venstre ventrikkel. Aorta ble så forsiktig hentet ut, skåret ned langs den ventrale midtlinje fra aortabuen ned til femoral- arteriene og fiksert i formalin. De lipidrike, aterosklerotiske plakk ble farvet med Sudan IV (Sigma, Tyskland) og aorta satt opp flatt på en sort voksoverflate. Bildet ble tatt med et Sony DXC-960 MD farvevideokamera. Området for plakk så vel som den fullstendi-ge aortaoverflate ble bestemt ved bruk av "Phase 3 Imaging Systems (Media Cyberne-tics).
H. Klaring av I<125>LDL
To dyr per forsøksgruppe ble testet. En bolus av I<125->merket LDL (velvillig tilveiebragt av Dan Rader, U Penn) ble infusert langsomt gjennom nålevenen i løpet av et tidsrom på 30 sekunder (1 000 000 tellinger [1<125>]-LDL fortynnet i 100 ul steril PBS/dyr. På tidspunktene 3 minutter, 30 minutter, 1,5 time, 3 timer og 6 timer etter injeksjon ble en blodprøve oppnådd via den retroorbitale pleksus. Plasma ble separert fra fullblodet og 10 ul plasma tellet i y-telleren. Til slutt ble andelen katabolsk grad beregnet fra de oppnådde lipoproteinklaringsdata.
I. Evaluering av leverlipidakkumulering
Oljerød farving av frosne leversnitt ble gjennomført for å bestemme lipidakkumulering. De frosne leversnitt ble kort skyllet i destillert vann fulgt av en 2 minutters inkuberingsperiode i absolutt propylenglykol. Snittene ble så farvet i oljerød oppløsning (0,5 % i propylenglykol) i 16 timer fulgt av en motfarving med Mayers hematoxylin-oppløsning i 30 sekunder og anbringelse i oppvarmet glyceringeleoppløsning.
For kvantifisering av leverkolesterol- og -triglyceridnivå ble leversnitt homogenisert og inkubert i kloroform:metanol 2:1 over natten. Etter tilsetning av 0,05 % H2SO4og sentrifugering i 10 minutter ble det nedre sjikt av hver prøve samlet, delt i to alikvoter og tørket under nitrogen. For kolesterolmålingen ble de tørkede lipider fra den første alikvot oppløst i 1 % Triton X-100 i kloroform. Når det var oppløst ble oppløsningen så tørket under nitrogen. Etter oppløsning av lipidene i ddH20 og inkubering i 30 minutter ved 37 °C ble den totale kolesterolkonsentrasjon målt ved bruk av et "Total Cholesterol Kit" (Wako Diagnostics). For den andre alikvot ble de tørkede lipider oppløst i alkoho-lisk KOH og inkubert ved 60 °C i 30 minutter. Deretter ble IM MgC12 tilsatt, fulgt av inkubering på is i 10 minutter og sentrifugering ved 14 000 omdreininger per minutt i 30 minutter. Supernatanten ble til slutt evaluert på triglycerider (Wako Diagnostics).
Alle av vektorene som var pseudotypet i et AAV2/8- eller AAV2/7 capsid reduserte totalkolesterol, LDL, og triglycerider, sammenlignet med kontrollen. Disse testvektorer korrigerte også fenotypen av kolesterolemi på dosisavhengjg måte. En reduksjon av plakkarealet for AAV2/8- og AAV2/7 mus ble observert i behandlede mus ved den førs-te test (2 måneder) og effekten ble observert å vare over hele forsøket (6 måneder).
Eksempel 10 - Funksjonell faktor IX ekspresjon og korreksjon av hemofili
A. Knock- out mus
Funksjonell caninefaktor IX (FIX) ekspresjon ble bedømt i hemofilia B mus. Vektorer med capsidene av AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 eller AAV8 ble konstruert for å avlevere AAV2 5' ITR- lever-spesifikk promoter [LSP] - canine FIX - "woodchuck" hepatitt postregulatorisk element (WPRE) - AAV2 3' ITR. Vektorene ble konstruert som beskrevet hos Wang et al, 2000 " Molecular Therapy" 2: 154-158 ved bruk av de egnede capsider.
Knock-out mus ble generert som beskrevet hos Wang et al, 1997 " Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94: 11563-11566. Denne modell etterlignet nært fenotypene av hemofili B hos mennesker.
Vektorer av forskjellige serotyper (AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 og AAV8) ble avle-vert som en enkelt intraportal injeksjon i leveren til voksne hemofiliske C57B1/6 mus i en dose på lxlO<11>GC/mus for de fem forskjellige serotyper og en gruppe fikk en AAV8 vektor ved en lavere dose, lxlO<10>GC/mus. Kontrollgruppen ble injisert med lxlO11GC av AAV2/8 TBG LacZ3. Hver gruppe inneholdt 5-10 hann- og hunnmus. Musene ble tappet hver annen uke etter vektoradministrering.
1. ELISA
Canine FIX konsentrasjonen i museplasma ble bestemt ved en ELISA analyse spesifikk for canine faktor JX, gjennomført i det vesentlige som beskrevet av Axelrod et al, 1990 " Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 87:5173-5177 med modifikasjoner. Saue anticaninefaktor IX (Enzyme Research Laboratories) ble benyttet som primærantistoff og kanin anti-canine faktor JX (Enzyme Research Laboratories) ble benyttet som sekundært antistoff. Med start to uker etter injeksjon ble økede plasmanivåer av cFJX bestemt for alle testvektorer. De økede nivåer ble holdt ved terapeutiske nivåer gjennom hele forsøkets lengde, det vil si til 12 uker. Terapeutiske nivåer anses å være 5 % av normale nivåer, det vil si rundt 250 ng/ml.
De høyeste nivåer av ekspresjon ble observert for AAV2/8- (ved 10<11>) og AAV2/7 konstruktene som opprettholdt superfysiologjske nivåer av cFJX (ti ganger høyere enn normalnivået). Ekspresjonsnivåene for AAV2/8 (IO<11>) var omtrent 10 ganger høyere enn den dose som ble observert for AAV2/2 og AAV2/8 (10<10>). De laveste ekspresjons-nivåer ble observert for AAV2/5 selv om dette fremdeles var over det terapeutiske området.
2. In vitro aktivert partialtromboplastintid ( aPTT) analyse
Funksjonell faktor IV aktivitet i plasma hos FDC knock-out mus ble bestemt ved en in vitro aktivert partialtromboplastintid (aPTT) analyse. Museblodprøver ble samlet fra den retroorbitale pleksus i 1/10 volum citratbuffer. aPPT analysen ble gjennomført som beskrevet av Wang et al, 1977 i " Proe. Nati. Acad. Sei. USA " 94:11563-11566.
Klumpingstidene ved aPTT på plasmaprøver for alle vektorinjiserte mus lå innen det normale området (cirka 60 sekunder), målt to uker etter injeksjon, og opprettholdt klumpingstider i det normale eller kortere enn normale området gjennom studieperioden (12 uker).
De laveste klumpingstider som ble opprettholdt ble observert i dyrene som fikk AAV2/8 (10<11>) og AAV2/7. Etter 12 uker induserte AAV2/2 også klumpingstider tilsvarende de for AAV2/8 og AAV2/7. Imidlertid ble de laveste klumpingstider ikke observert for AAV2/2 inntil uke 12 mens reduserte klumpingstider (i området 25 - 40 sekunder) ble observert for AAV2/8 og AAV2/7 med begynnelse i uke to.
Immunohistokjemifarving av levervevene høstet fra noen av de behandlede mus er for tiden under gjennomføring. Cirka 70-80 % av hepatocytene er farvet positive for canine FDC i mus injisert med AAV2/8.cFDC vektor.
B. Hemofili B hunder
Hunder som har en punktmutasjon i det katalytiske domenet av F.DC genet som, basert på modellstudier, synes å gjøre proteinet ustabilt, lider av hemofili B (Evans et al, 1989 i " Proe. Nati. Acad. Sei. "USA, 86:10095-10099). En koloni av slike hunder er holdt i mer enn to tiår ved University of North Carolina, Chapel Hill. De homeostatiske parametre for disse hunder er godt beskrevet og inkluderer fraværet av plasma F.DC antigen, fullblod klumpingstider på over 60 minutter mens normale hunder er 6-8 minutter, og forlenget aktivert partialtromboplastintid på 50-80 sekunder mens normale hunder har 13-28 sekunder. Disse hunder erfarer rekurrent spontanhemoragi. Karakteristisk ble signifikante blødningsepisoder med hell ordnet ved enkel intravenøs infusjon av 10 ml/kg normal canine plasma; leilighetsvis krever gjentatte infusjoner for å kontrollere blødningen.
Fire hunder injiseres intraportalt med AAV.cFIX i henhold til planen nedenfor. En førte hund mottar en enkelt injeksjon med AAV2/2.cFIX i en dose på 3,7xlO<n>genomkopier (GC)/kg. En andre hund mottar en første injeksjon på AAV2/2.cFIX (2,8xlO<n>GC/kg) fulgt av en andre injeksjon med AAV2/7.cFIX (2,3xl0<13>GC/kg) på dag 1180. En tredje hund mottar en enkelt injeksjon med AAV2/2.cFIX i en dose på 4,6xl0<12>GC/kg. Den fjerde hund mottar en injeksjon med AAV2/2.cFIX (2,8x10<12>GC/kg) og en injeksjon på dag 995 med AAV2/7.cFK (5xl012GC/kg).
Abdomen av hemofilihunder åpnes aseptisk og kirurgisk under generell anestesi og en enkelt infusjon av vektor administreres inn i portalvenen. Dyrene beskyttes mot hemo-ragj i den perioperative periode ved intravenøs administrering av normal canine plasma. Hundene sederes, intuberes for å indusere generell anestesi og abdomen barberes og prepareres. Etter at abdomen er åpnet flyttes milten til operasjonsfeltet. Miltvenen loka-liseres og en sutur plasseres løst proksimalt til et lite, distalt innsnitt i venen. En nål inn-føres hurtig i venen og deretter blir suturen løsnet og en 5 F kanyle anbragt til en intra-venøs lokasjon nær portalvenen og ført til en intravenøs lokasjon nær portalvenebifur-kasjonen. Etter at hemostase er sikret og kateterballongen blåst opp blir cirka 5,0 ml vektor fortynnet i PBS infusert i portalvenen i løpet av et intervall på 5 minutter. Vek-torinfusjonen følges av en 5,0 ml infusjon av saltoppløsning. Ballongen blir så avlastet, callula fjernet og den venøse hemostase sikret. Milten blir så bragt tilbake, blødende kar kauterisert og operasjonssåret lukket. Dyret ekstuberes og har tålt den kirurgiske prose-dyre godt. Blodprøvene analyseres som beskrevet [Wang et al, 2000 i " Molecular Therapy" 2: 154-158].
Resultater som viser korreksjon eller partialkorreksjon er antisipert for AAV2/7.
Alle publikasjoner som er nevnt i beskrivelsen skal anses som en del av denne. Mens oppfinnelsen er beskrevet under henvisning til spesielt foretrukne utførelsesformer skal det være klart at modifikasjoner kan foretas uten å gå utenfor oppfinnelsens ramme. Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor kravenes ramme.
Claims (13)
1. Adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at det omfatter et AAV capsid som har en aminosyresekvens AAVrh.10, aminosyrer 1 til 738 fra SEQ ID NO:81 eller en sekvens som er minst 95% identisk dermed og et minigen som har AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et heterologt gen operativt koblet til regulatoriske sekvenser som dirigerer dets ekspresjon i en vertscelle.
2. Adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at det omfatter et AAV capsid som omfatter minst AAVrh.10 vp3 som har aminosyresekvensen 203 til 738 fra SEQ ID NO:81 eller en sekvens som er minst 95% identisk dertil og et minigen som har AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et heterologt gen operativt koblet til regulatoriske sekvenser som dirigerer dets ekspresjon i en vertscelle.
3. Adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at det omfatter et AAV capsid som omfatter minst AAVrh.10 vp2 som har aminosyresekvensen 138 til 738 fra SEQ ID NO:81 eller en sekvens som er minst 95% identisk dermed og et minigen som har AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et heterologt gen operativt koblet til regulatoriske sekvenser som dirigerer dets ekspresjon i en vertscelle.
4. AAV i følge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert v e d at ITRene er fra AAV2.
5. Isolert capsidprotein, karakterisert ved det omfatter et AAVrh. 10 protein valgt fra:
Vpl capsidprotein, aminosyrer 1 til 738 fra SEQ ID NO:81; og vp2 capsidprotein, aminosyrer 138 til 738 fra SEQ ID NO:81; og vp3 capsidprotein, aminosyrer 203 til 738 fra SEQ ID NO:81.
6.
Isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl karakterisert ved at det koder for et protein i følge krav 5.
7.
Isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl som koder for et fragment fra et adeno-assosiert virus rh. 10 capsidprotein, karakterisert ved at nevnte nukleinsyresekvens er valgt fra gruppen bestående av:
vpl, nukleotidene 845 til 3061 fra SEQ ID NO:59;
vp2, nukleotidene 1256 til 3061 fra SEQ ID NO:59; og
vp3, nukleotidene 1454 til 3061 fra SEQ ID NO:59.
8.
Molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 6 eller 7, karakterisert ved at nevnte molekyl er et plasmid.
9.
Molekyl i følge et hvilket som helse av kravene 6 eller 7, karakterisert ved at nevnte molekyl ytterligere omfatter et funksjonelt AAV rep gen.
10.
Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant adenoassosiert virus (AAV), karakterisert ved at den omfatter et AAVrh.10 serotype capsid som omfatter trinnene å dyrke en vertcelle som inneholder:
a) et molekyl i følge kravene 6 eller 7 som koder for et adenoassosiert viruscapsid;
b) et funksjonelt rep gen;
c) et minigen som omfatter AAV inverterte terminale repetisjoner (ITRer) og et transgen; og
d) tilstrekkelige hjelperfunksjoner som tillater pakking av minigenet inn i AAV capsidproteinet.
11.
In vitro vertcelle, karakterisert ved at den er transfektert med et adenoassosiert virus i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller et molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 6 til 9.
12.
Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter AAV i følge krav 1 eller 4, og en fysiologisk kompatibel bærer.
13.
Sammensetning karakterisert ved at den omfatter et molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 6 til 9, og en fysiologisk kompatibel bærer.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US35060701P | 2001-11-13 | 2001-11-13 | |
US34111701P | 2001-12-17 | 2001-12-17 | |
US37706602P | 2002-05-01 | 2002-05-01 | |
US38667502P | 2002-06-05 | 2002-06-05 | |
PCT/US2002/033629 WO2003042397A2 (en) | 2001-11-13 | 2002-11-12 | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20150196L true NO20150196L (no) | 2004-07-14 |
NO338362B1 NO338362B1 (no) | 2016-08-15 |
Family
ID=27502639
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20042183A NO334379B1 (no) | 2001-11-13 | 2004-05-26 | Fremgangsmåte for detektering av adenoassosiert virus (AAV) i en prøve, samt kit for detektering av et ukjent AAV i en prøve |
NO20131359A NO336468B1 (no) | 2001-11-13 | 2013-10-14 | Adeno-assosierte virus (AAV8) capsidprotein, vertcelle og vektor inneholdende dette samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning |
NO20140988A NO336801B1 (no) | 2001-11-13 | 2014-08-14 | Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning |
NO20150196A NO338362B1 (no) | 2001-11-13 | 2015-02-10 | Adeno-assosierte virus (AAV), fremgangsmåte for fremstilling derav, isolert capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, molekyl, vertscelle samt sammensetning. |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20042183A NO334379B1 (no) | 2001-11-13 | 2004-05-26 | Fremgangsmåte for detektering av adenoassosiert virus (AAV) i en prøve, samt kit for detektering av et ukjent AAV i en prøve |
NO20131359A NO336468B1 (no) | 2001-11-13 | 2013-10-14 | Adeno-assosierte virus (AAV8) capsidprotein, vertcelle og vektor inneholdende dette samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning |
NO20140988A NO336801B1 (no) | 2001-11-13 | 2014-08-14 | Adeno-assosierte virus (AAV) capsidprotein, isolert eller syntetisk nukleinsyremolekyl, vertscelle samt en fremgangsmåte for å fremstille AAV og en sammensetning |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (15) | US20030138772A1 (no) |
EP (4) | EP2338900B1 (no) |
JP (6) | JP4677187B2 (no) |
KR (2) | KR101014207B1 (no) |
CN (6) | CN103555678B (no) |
AT (2) | ATE520707T1 (no) |
AU (1) | AU2002361573B2 (no) |
BR (3) | BR122016004546B8 (no) |
CA (8) | CA3159060C (no) |
DE (1) | DE60209193T2 (no) |
DK (1) | DK1310571T3 (no) |
ES (3) | ES2439515T3 (no) |
HK (2) | HK1056198A1 (no) |
HU (2) | HU230406B1 (no) |
IL (11) | IL270065B2 (no) |
MX (3) | MX346493B (no) |
NO (4) | NO334379B1 (no) |
NZ (7) | NZ532635A (no) |
PH (2) | PH12014501487B1 (no) |
PL (4) | PL217623B1 (no) |
SG (5) | SG168422A1 (no) |
WO (1) | WO2003042397A2 (no) |
ZA (1) | ZA200403360B (no) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10308958B2 (en) | 2001-11-13 | 2019-06-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Families Citing this family (508)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030215422A1 (en) | 1996-09-11 | 2003-11-20 | John A. Chiorini | Aav4 vector and uses thereof |
EP1082413B1 (en) | 1998-05-28 | 2008-07-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Aav5 vector and uses thereof |
US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
EP1453547B1 (en) | 2001-12-17 | 2016-09-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
CA2469053C (en) * | 2001-12-17 | 2011-08-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
DE60310297T2 (de) | 2002-04-29 | 2007-06-06 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methode für die direkte Gewinnung und Amplifikation von integrierten Viren aus zellulärer Gewebe-DNA |
US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
WO2004020600A2 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | University Of Florida | Modified aav |
CA2508726A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
WO2005017101A2 (en) | 2003-05-19 | 2005-02-24 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH | Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof |
DK2657247T3 (en) * | 2003-06-19 | 2017-07-10 | Genzyme Corp | AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof |
US9441244B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-09-13 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
US9233131B2 (en) * | 2003-06-30 | 2016-01-12 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
AU2010201278B2 (en) * | 2003-09-01 | 2012-11-15 | Academisch Medisch Centrum | AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis |
US8529885B2 (en) * | 2003-09-01 | 2013-09-10 | Academisch Medisch Centrum | AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis |
US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US20120122103A1 (en) | 2003-09-11 | 2012-05-17 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of bacteria |
CN1856576B (zh) * | 2003-09-30 | 2011-05-04 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 |
AU2011250849B2 (en) * | 2003-09-30 | 2013-09-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor |
US8137960B2 (en) | 2003-12-04 | 2012-03-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Bovine adeno-associated viral (BAAV) vector and uses thereof |
US8163895B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-04-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of orthopoxviruses |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
ES2442225T3 (es) | 2004-04-28 | 2014-02-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Régimen de inmunización con cebado de adenovirus suprimido en E4 y potenciación de adenovirus suprimido en E1 |
EP1742668B1 (en) | 2004-04-28 | 2011-02-09 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations |
JP4810533B2 (ja) | 2004-05-24 | 2011-11-09 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法 |
US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
WO2006073496A2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-07-13 | Targeted Genetics Corporation | Recombinant aav based vaccine methods |
US7309589B2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-12-18 | Vironix Llc | Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing |
KR20070056138A (ko) * | 2004-10-05 | 2007-05-31 | 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 | Cns 장애를 치료하기 위한 신규 환상 및 비환상프로페논 |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
EP1869180B1 (en) | 2005-03-03 | 2013-02-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of polyoma viruses |
CN104293835B (zh) * | 2005-04-07 | 2017-07-04 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 增强腺相关病毒载体功能的方法 |
US8283151B2 (en) | 2005-04-29 | 2012-10-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (AAV) serotypes |
AU2006272776B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
EP1957678B1 (en) * | 2005-11-28 | 2012-06-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses |
WO2007120542A2 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Aav capsid library and aav capsid proteins |
EP2018421B1 (en) | 2006-04-28 | 2012-12-19 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Scalable production method for aav |
EP2044199B1 (en) * | 2006-07-25 | 2012-11-14 | Celladon Corporation | Extended antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated viral vectors comprising serca2a for gene therapy |
JP5420412B2 (ja) | 2006-09-14 | 2014-02-19 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 病原体の同定のための標的全ゲノム増幅方法 |
WO2008104002A2 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic dna analysis |
US9725485B2 (en) | 2012-05-15 | 2017-08-08 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy |
US9611302B2 (en) | 2007-04-09 | 2017-04-04 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use |
EP2191001B1 (en) | 2007-04-09 | 2016-06-08 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use |
WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
EP2058401A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
GB2472964B (en) | 2008-05-20 | 2013-04-24 | Eos Neuroscience Inc | Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use |
US9217155B2 (en) | 2008-05-28 | 2015-12-22 | University Of Massachusetts | Isolation of novel AAV'S and uses thereof |
US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
WO2010033625A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
WO2010033627A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
WO2010093943A1 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
CN102439157B (zh) | 2009-04-30 | 2015-09-16 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 包含腺伴随病毒构建体的靶向传导气道细胞组合物 |
WO2010138263A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | University Of Massachusetts | Novel aav 's and uses thereof |
WO2010143761A1 (ko) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | (주)바이오니아 | 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법 |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
EP2454000A4 (en) | 2009-07-17 | 2016-08-10 | Ibis Biosciences Inc | SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES |
WO2011041502A1 (en) | 2009-10-01 | 2011-04-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav vectors expressing sec1o for treating kidney damage |
WO2011047307A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
SG10201908848RA (en) | 2010-03-29 | 2019-10-30 | Univ Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
CA2833908C (en) | 2010-04-23 | 2021-02-09 | University Of Massachusetts | Cns targeting aav vectors and methods of use thereof |
CA3050894C (en) | 2010-04-23 | 2022-10-18 | University Of Massachusetts | Multicistronic expression constructs |
WO2011133901A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Aav-based treatment of cholesterol-related disorders |
CA2805170C (en) | 2010-07-12 | 2021-09-21 | Fatima Bosch Tubert | Gene therapy composition for use in diabetes treatment |
US8663624B2 (en) | 2010-10-06 | 2014-03-04 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof |
WO2012145572A1 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens |
US9226976B2 (en) | 2011-04-21 | 2016-01-05 | University Of Massachusetts | RAAV-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies |
LT3693025T (lt) | 2011-04-22 | 2022-02-10 | The Regents Of The University Of California | Adeno-asocijuoto viruso virionai su variantine kapside ir jų panaudojimo būdai |
EP3147295B2 (en) * | 2011-08-24 | 2023-11-22 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | New avv capsid proteins for nucleic acid transfer |
US20130136729A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-30 | University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group | Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors |
KR102057540B1 (ko) * | 2012-02-17 | 2019-12-19 | 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 | 세포, 기관 및 조직으로의 유전자 전이를 위한 aav 벡터 조성물 및 방법 |
US10093947B2 (en) * | 2012-02-28 | 2018-10-09 | Cornell University | AAV-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation |
US10004811B2 (en) * | 2012-04-13 | 2018-06-26 | Cornell University | Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction |
US10294281B2 (en) | 2012-05-15 | 2019-05-21 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use |
EP2692868A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-05 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue |
DK2954051T3 (da) | 2013-02-08 | 2019-07-08 | Univ Pennsylvania | Modificeret kapsid til genoverførsel til behandling af nethinden |
RS64664B1 (sr) | 2013-02-15 | 2023-11-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | Gen optimizovanog faktora viii |
US8957044B2 (en) | 2013-03-01 | 2015-02-17 | Wake Forest University Health Sciences | Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM) |
EP2984166B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-04-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for treating mpsi |
US9719106B2 (en) | 2013-04-29 | 2017-08-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof |
JP6600624B2 (ja) | 2013-05-31 | 2019-10-30 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法 |
SI3024498T1 (sl) | 2013-07-22 | 2020-07-31 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Različica AAV in sestavki, postopki in uporabe za prenos genov v celice, organe in tkiva |
PT3099333T (pt) | 2014-01-31 | 2020-12-24 | Univ Temple | Bag3 como alvo para terapia de insuficiência cardíaca |
GB201403684D0 (en) | 2014-03-03 | 2014-04-16 | King S College London | Vector |
US10072251B2 (en) | 2014-02-19 | 2018-09-11 | University Of Massachusetts | Recombinant AAVS having useful transcytosis properties |
DK3116900T3 (da) | 2014-03-09 | 2020-09-28 | Univ Pennsylvania | Sammensætninger som kan anvendes til behandling af ornithintranscarbamylase (otc) defekt |
EP3800191A1 (en) | 2014-03-17 | 2021-04-07 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells |
DK3119797T3 (da) | 2014-03-18 | 2021-03-15 | Univ Massachusetts | Raav-baserede sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af amyotrofisk lateralsklerose |
EP3628334B1 (en) | 2014-03-21 | 2023-06-28 | Genzyme Corporation | Gene therapy for retinitis pigmentosa |
EP2933335A1 (en) | 2014-04-18 | 2015-10-21 | Genethon | A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases |
WO2015164786A1 (en) | 2014-04-25 | 2015-10-29 | University Of Massachusetts | Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products |
US10780182B2 (en) | 2014-04-25 | 2020-09-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain |
ES2876409T3 (es) | 2014-04-25 | 2021-11-12 | Univ Pennsylvania | Variantes del RLBD y su uso en composiciones para reducir los niveles de colesterol |
CA2947614C (en) | 2014-05-13 | 2023-10-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof |
US10689653B2 (en) | 2014-06-03 | 2020-06-23 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for modulating dysferlin expression |
US10577627B2 (en) | 2014-06-09 | 2020-03-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
EP2960336A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Genethon | Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies |
WO2016044478A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Genzyme Corporation | Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma |
EP4012035A1 (en) | 2014-09-16 | 2022-06-15 | Genzyme Corporation | Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma |
US10711270B2 (en) | 2014-10-03 | 2020-07-14 | University Of Massachusetts | High efficiency library-identified AAV vectors |
WO2016054554A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | University Of Massachusetts | Heterologous targeting peptide grafted aavs |
RU2738421C2 (ru) | 2014-10-21 | 2020-12-14 | Юниверсити Оф Массачусетс | Варианты рекомбинантных aav и их применения |
WO2016073693A2 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease |
AU2015346162B2 (en) | 2014-11-14 | 2022-02-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
JP6863891B2 (ja) | 2014-11-14 | 2021-04-21 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 調節性ポリヌクレオチド |
WO2016094783A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scaav |
CA2974235A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-14 | Universitat Autonoma De Barcelona | Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes |
WO2016115503A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Central nervous system targeting polynucleotides |
CN107646052A (zh) | 2015-01-20 | 2018-01-30 | 建新公司 | 用于表征重组病毒颗粒的分析性超速离心法 |
WO2016126857A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-11 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof |
WO2016130600A2 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | Duke University | Compositions and methods for epigenome editing |
MX2017010369A (es) | 2015-02-10 | 2017-12-14 | Genzyme Corp | Arni variante. |
JP6928558B2 (ja) | 2015-02-10 | 2021-09-01 | ジェンザイム・コーポレーション | 線条体および皮質へのウイルス粒子の強化された送達 |
US10584321B2 (en) | 2015-02-13 | 2020-03-10 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for transient delivery of nucleases |
EA201791939A1 (ru) | 2015-03-02 | 2018-01-31 | Адверум Байотекнолоджиз, Инк. | Композиции и способы интравитреальной доставки полинуклеотидов в колбочки сетчатки |
MX2017011615A (es) | 2015-03-10 | 2018-04-11 | Univ Columbia | Construcciones de vectores virales adeno-asociados de glut1 recombinantes y métodos relacionados para restablecer la expresión de glut1. |
AU2016235163B2 (en) | 2015-03-24 | 2022-03-24 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus variants and methods of use thereof |
TWI707951B (zh) | 2015-04-08 | 2020-10-21 | 美商健臻公司 | 過大腺相關載體之製造 |
CA3019315A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | University Of Massachusetts | Modulation of aav vector transgene expression |
CA3021949C (en) | 2015-04-24 | 2023-10-17 | University Of Massachusetts | Modified aav constructs and uses thereof |
EP3288594B1 (en) | 2015-04-27 | 2022-06-29 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Dual aav vector system for crispr/cas9 mediated correction of human disease |
GB201508026D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Capsid |
EP3307310A2 (en) | 2015-05-13 | 2018-04-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof |
PT3298134T (pt) | 2015-05-16 | 2023-08-18 | Genzyme Corp | Edição génica de mutações intrónicas profundas |
IL309741A (en) | 2015-06-23 | 2024-02-01 | Childrens Hospital Philadelphia | Modified factor IX, and preparations, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues |
EP3325018A4 (en) | 2015-07-22 | 2019-04-24 | Duke University | HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES |
EP3341727B1 (en) | 2015-08-25 | 2022-08-10 | Duke University | Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases |
CN108137664B (zh) | 2015-08-31 | 2021-11-26 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 用于治疗伴侣动物的aav-epo |
JP7261583B2 (ja) | 2015-09-24 | 2023-04-20 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 補体媒介性疾患を処置するための組成物及び方法 |
CN114606267A (zh) | 2015-09-28 | 2022-06-10 | 北卡罗来纳-查佩尔山大学 | 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物 |
US11273227B2 (en) | 2015-10-09 | 2022-03-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful in treating Stargardt's disease and other ocular disorders |
WO2017066497A2 (en) | 2015-10-13 | 2017-04-20 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
WO2017070516A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | University Of Massachusetts | Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors |
EP3364997B1 (en) | 2015-10-22 | 2024-01-17 | University of Massachusetts | Aspartoacylase gene therapy in the treatment of canavan disease |
WO2017075335A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Voyager Therapeutics, Inc. | Regulatable expression using adeno-associated virus (aav) |
EP3368563A1 (en) | 2015-10-28 | 2018-09-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy |
WO2017072361A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Nbe-Therapeutics Ag | Anti-ror1 antibodies |
WO2017096162A1 (en) | 2015-12-02 | 2017-06-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Assays for the detection of aav neutralizing antibodies |
FR3044926B1 (fr) | 2015-12-09 | 2020-01-31 | Genethon | Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine |
US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
ES2918998T3 (es) | 2015-12-11 | 2022-07-21 | Univ Pennsylvania | Método de purificación escalable para AAVrh10 |
US11015174B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
US11098286B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
CN115957350A (zh) | 2015-12-11 | 2023-04-14 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 用于治疗家族性高胆固醇血症的基因疗法 |
KR20180099719A (ko) | 2015-12-14 | 2018-09-05 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 눈 장애에 대한 유전자 요법 |
JP7061067B2 (ja) | 2015-12-14 | 2022-04-27 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物 |
IL259964B (en) | 2015-12-15 | 2022-09-01 | Genzyme Corp | Adenovirus-associated vectors for the treatment of mucolipodosis type ii |
RU2766190C2 (ru) | 2016-01-20 | 2022-02-09 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Композиции антител к ror1 и соответствующие способы |
JP7217630B2 (ja) | 2016-02-01 | 2023-02-03 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 最適化第viii因子遺伝子 |
CA3011939A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-08-10 | University Of Massachusetts | Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system |
KR20180121899A (ko) | 2016-02-03 | 2018-11-09 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | I형 점액다당류증을 치료하기 위한 유전자 요법 |
WO2017139643A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-17 | University Of Massachusetts | Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization |
WO2017151717A1 (en) * | 2016-03-01 | 2017-09-08 | French Brent A | Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells |
US11207426B2 (en) | 2016-04-05 | 2021-12-28 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression |
US11446398B2 (en) | 2016-04-11 | 2022-09-20 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Regulated biocircuit systems |
WO2017181105A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating metabolic imbalance |
SG10202009852PA (en) * | 2016-04-15 | 2020-11-27 | Univ Pennsylvania | Novel aav8 mutant capsids and compositions containing same |
CA3019425A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating hemophilia a |
EP3452103A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration |
EP3452104A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-03-13 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii |
US11191847B2 (en) | 2016-04-15 | 2021-12-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating hemophilia B |
WO2017184463A1 (en) | 2016-04-17 | 2017-10-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates |
WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
GB201608046D0 (en) * | 2016-05-09 | 2016-06-22 | Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The | Treatment of complement-mediated disorders |
KR102234930B1 (ko) | 2016-05-13 | 2021-04-02 | 4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨. | 아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도 |
EP3458589A4 (en) | 2016-05-18 | 2020-01-01 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE |
IL302748A (en) | 2016-05-18 | 2023-07-01 | Voyager Therapeutics Inc | modulatory polynucleotides |
US11158076B2 (en) | 2016-06-08 | 2021-10-26 | Sony Corporation | Imaging control device and method, and vehicle |
US11882815B2 (en) | 2016-06-15 | 2024-01-30 | University Of Massachusetts | Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells |
MX2019000221A (es) | 2016-07-05 | 2020-02-07 | Univ Massachusetts | Suministro genetico de sfasl mediado por aav2 como una terapia neuro-protectora en el glaucoma. |
IL264070B2 (en) | 2016-07-08 | 2023-03-01 | Univ Pennsylvania | Methods and preparations for the treatment of disorders and diseases involving rdh12 |
WO2018022511A1 (en) | 2016-07-25 | 2018-02-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof |
US11584780B2 (en) | 2016-07-26 | 2023-02-21 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Adeno-associated virus capsid proteins |
KR20230039779A (ko) | 2016-07-29 | 2023-03-21 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법 |
MA55748A (fr) | 2016-08-15 | 2022-03-02 | Genzyme Corp | Procédés de détection d'aav |
CN110650673B (zh) | 2016-08-30 | 2024-04-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于生物医学靶向和递送的方法以及用于实践该方法的装置和系统 |
US10457940B2 (en) | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
WO2018064624A1 (en) * | 2016-09-29 | 2018-04-05 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Aavrh.10 variants with host antibody escape capabilities and altered tissue targeting properties |
AU2017341849B2 (en) | 2016-10-13 | 2024-03-21 | University Of Massachusetts | AAV capsid designs |
US11192925B2 (en) | 2016-10-19 | 2021-12-07 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Modified AAV capsids and uses thereof |
US20190328846A1 (en) | 2016-12-01 | 2019-10-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Pharmaceutical compositions for the treatment of retinal degenerative diseases |
WO2018112225A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | The J. David Gladstone Institutes | Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (dip) |
CA3048038A1 (en) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating phenylketonuria |
US11554147B2 (en) | 2017-02-20 | 2023-01-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia |
SG10201913833PA (en) | 2017-02-28 | 2020-03-30 | Univ Pennsylvania | Influenza vaccines based on aav vectors |
JOP20190200A1 (ar) | 2017-02-28 | 2019-08-27 | Univ Pennsylvania | تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي |
WO2018160582A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor |
CN110582572A (zh) | 2017-03-01 | 2019-12-17 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 用于眼部病症的基因疗法 |
US11376321B2 (en) | 2017-03-02 | 2022-07-05 | Genethon | Method for removing anti-AAV antibodies from a blood-derived composition |
EP3606544A4 (en) | 2017-04-05 | 2021-04-07 | University of Massachusetts | MINI-GENE THERAPY |
EP3610016A1 (en) | 2017-04-10 | 2020-02-19 | Genethon | Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies |
BR112019021569A2 (pt) | 2017-04-14 | 2020-05-12 | Regenxbio Inc. | Precursor de iduronato-2-sulfatase humana recombinante glicosilada (ids), método para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo ii (mps ii) |
EP3634986A4 (en) | 2017-04-24 | 2021-09-08 | The Trustees of The University of Pennsylvania | GENE THERAPY FOR EYE DISEASES |
MX2019013172A (es) | 2017-05-05 | 2020-09-07 | Voyager Therapeutics Inc | Composiciones y metodos para tratar la enfermedad de huntington. |
WO2018204786A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
CA3059213A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-11-15 | University Of Massachusetts | Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
SG11201910015SA (en) | 2017-05-11 | 2019-11-28 | Univ Pennsylvania | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
CN108103058A (zh) * | 2017-05-12 | 2018-06-01 | 北京五加和分子医学研究所有限公司 | 一种i型糖尿病的基因治疗药物 |
JP2020519294A (ja) | 2017-05-12 | 2020-07-02 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | ウイルスベクター産生 |
EP3630986A4 (en) | 2017-05-31 | 2021-08-11 | The Trustees of The University of Pennsylvania | GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF PEROXYSOMA DISORDERS |
US11680275B2 (en) | 2017-06-06 | 2023-06-20 | University Of Massachusetts | Self-regulating AAV vectors for safe expression of MeCP2 in rett syndrome |
US11827898B2 (en) | 2017-06-14 | 2023-11-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for ocular disorders |
US10708306B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-07-07 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
US10721272B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-07-21 | Palo Alto Networks, Inc. | Mobile equipment identity and/or IOT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks |
US10693918B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-06-23 | Palo Alto Networks, Inc. | Radio access technology based security in service provider networks |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
US11050789B2 (en) | 2017-06-15 | 2021-06-29 | Palo Alto Networks, Inc. | Location based security in service provider networks |
US10812532B2 (en) | 2017-06-15 | 2020-10-20 | Palo Alto Networks, Inc. | Security for cellular internet of things in mobile networks |
CA3068286A1 (en) * | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof |
JP2020526514A (ja) | 2017-07-06 | 2020-08-31 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | ムコ多糖症i型を治療するための遺伝子治療 |
EP3648783A1 (en) | 2017-07-07 | 2020-05-13 | Genethon | Novel polynucleotides encoding a human fkrp protein |
WO2019018342A1 (en) | 2017-07-17 | 2019-01-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM |
JP7221275B2 (ja) | 2017-08-03 | 2023-02-13 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | Aavを送達するための組成物および方法 |
AU2018315127B2 (en) | 2017-08-07 | 2021-12-23 | Nbe-Therapeutics Ag | Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability |
US11680249B2 (en) * | 2017-08-28 | 2023-06-20 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof |
EP4218828A3 (en) | 2017-09-20 | 2023-09-27 | 4D Molecular Therapeutics Inc. | Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof |
US11819539B2 (en) | 2017-09-22 | 2023-11-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating Mucopolysaccharidosis type II |
SG11202002488UA (en) | 2017-09-22 | 2020-04-29 | Genzyme Corp | Variant rnai |
AU2018338188A1 (en) | 2017-09-22 | 2020-04-02 | University Of Massachusetts | SOD1 dual expression vectors and uses thereof |
EP3692151A4 (en) * | 2017-10-03 | 2021-07-14 | Prevail Therapeutics, Inc. | GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS |
CA3077426A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
WO2019079496A2 (en) | 2017-10-18 | 2019-04-25 | Regenxbio, Inc. | FULLY HUMAN ANTIBODY-BASED THERAPEUTIC AGENTS HAVING POST-TRANSLATION MODIFICATION |
US10722487B2 (en) | 2017-10-18 | 2020-07-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Glutaminase inhibitor therapy |
MX2020003945A (es) | 2017-10-18 | 2020-11-09 | Regenxbio Inc | Tratamiento de enfermedades oculares y cancer de colon metastasico con vegf-trap humano modificado post-traduccionalmente . |
JP7184894B2 (ja) | 2017-11-27 | 2022-12-06 | 4ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用 |
US11555206B2 (en) | 2017-11-30 | 2023-01-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for mucopolysaccharidosis IIIA |
US11723989B2 (en) | 2017-11-30 | 2023-08-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for mucopolysaccharidosis IIIB |
EP3727468A4 (en) | 2017-12-19 | 2021-09-22 | Akouos, Inc. | AAV-MEDIATED DELIVERY OF THERAPEUTIC ANTIBODIES TO THE INNER EAR |
US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
EP3755795A4 (en) | 2018-02-19 | 2022-07-20 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF |
WO2019173434A1 (en) | 2018-03-06 | 2019-09-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes |
CN112368051A (zh) | 2018-03-23 | 2021-02-12 | 马萨诸塞大学 | 用于治疗骨病的基因治疗剂 |
US11472848B2 (en) | 2018-04-27 | 2022-10-18 | University Of Massachusetts | AAV capsids identified by in vivo library selection |
US20210231560A1 (en) | 2018-04-29 | 2021-07-29 | Regenxbio Inc. | Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles |
EP3787771A1 (en) | 2018-04-29 | 2021-03-10 | REGENXBIO Inc. | Scalable clarification process for recombinant aav production |
SG11202009914SA (en) | 2018-05-08 | 2020-11-27 | Rutgers The State University Of New Jersey | Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins |
BR112020022722A8 (pt) | 2018-05-09 | 2022-01-18 | Biomarin Pharm Inc | Genoma e seu uso, vetor, partícula, molécula de ácido nucleico isolada, ácido nucleico, composição, tratamento, método |
TW202005978A (zh) | 2018-05-14 | 2020-02-01 | 美商拜奧馬林製藥公司 | 新穎肝靶向腺相關病毒載體 |
EP3793616A1 (en) | 2018-05-15 | 2021-03-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
BR112020023082A2 (pt) | 2018-05-15 | 2021-02-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | composições e métodos para o tratamento de doença de parkinson |
EP3793615A2 (en) | 2018-05-16 | 2021-03-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Directed evolution of aav to improve tropism for cns |
WO2019222441A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav serotypes for brain specific payload delivery |
WO2019241315A1 (en) | 2018-06-12 | 2019-12-19 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
US20210301305A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-09-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered untranslated regions (utr) for aav production |
AU2019285186A1 (en) | 2018-06-14 | 2021-01-07 | Regenxbio Inc. | Anion exchange chromatography for recombinant AAV production |
JP2021529513A (ja) | 2018-07-02 | 2021-11-04 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療 |
GB201811368D0 (en) | 2018-07-11 | 2018-08-29 | Ucb Biopharma Sprl | Antibody |
JP2021530548A (ja) | 2018-07-24 | 2021-11-11 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. | 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法 |
WO2020026968A1 (ja) * | 2018-07-30 | 2020-02-06 | 株式会社遺伝子治療研究所 | Aavベクターによる遺伝子発現を増強する方法 |
KR20210062627A (ko) | 2018-08-03 | 2021-05-31 | 젠자임 코포레이션 | 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi |
KR20210043580A (ko) | 2018-08-10 | 2021-04-21 | 리젠엑스바이오 인크. | 재조합 aav 생산을 위한 규모 조정 가능한 방법 |
CA3111076A1 (en) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1 |
MX2021003663A (es) | 2018-09-28 | 2021-05-28 | Harvard College | Reprogramacion celular para revertir el envejecimiento y promover la regeneracion de organos y tejidos. |
AU2019346655A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-05-06 | Voyager Therapeutics, Inc. | Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof |
CA3113470A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant reverse tetracycline transactivators for expression of genes |
SG11202102942VA (en) | 2018-10-01 | 2021-04-29 | Univ Pennsylvania | Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis |
TW202035689A (zh) | 2018-10-04 | 2020-10-01 | 美商航海家醫療公司 | 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法 |
EP3861107A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins |
JP2022504740A (ja) | 2018-10-12 | 2022-01-13 | ジェンザイム・コーポレーション | 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のpkuを処置するための改善されたヒトpahの生成 |
WO2020077165A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
CA3115524A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Win Den Cheung | Methods for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses |
UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
CA3116701A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system |
JP2022513376A (ja) | 2018-10-22 | 2022-02-07 | ユニバーシティ オブ ロチェスター | レトロウイルスインテグラーゼ-Cas9融合タンパク質を使用した指向性非相同DNA挿入によるゲノム編集 |
WO2020086742A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-30 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
EP3650956A1 (fr) | 2018-11-07 | 2020-05-13 | Tissot S.A. | Procede de diffusion d'un signal acoustique |
SG11202105030VA (en) | 2018-11-16 | 2021-06-29 | Astellas Pharma Inc | Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene |
EP3880823A4 (en) * | 2018-11-16 | 2022-08-17 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | THERAPEUTIC ADENO-ASSOCIATED VIRUS FOR THE TREATMENT OF PUMP DISEASE |
WO2020112967A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | University Of Massachusetts | Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors |
WO2020140007A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | University Of Rochester | Gene therapy for best1 dominant mutations |
US20220090131A1 (en) | 2019-01-04 | 2022-03-24 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Gene therapy constructs for treating wilson disease |
MX2021008487A (es) | 2019-01-14 | 2021-11-12 | Univ Rochester | Escisión y poliadenilación del arn nuclear dirigido con crispr-cas. |
EP3911410A1 (en) | 2019-01-18 | 2021-11-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods and systems for producing aav particles |
CA3128230A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Oregon Health & Science University | Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids |
SG11202108504YA (en) | 2019-02-22 | 2021-09-29 | Univ Pennsylvania | Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration |
CA3131023A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Michael R. Volkert | Oxr1 gene therapy |
SG11202108044YA (en) | 2019-02-25 | 2021-09-29 | Novartis Ag | Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy |
JP2022520875A (ja) | 2019-02-25 | 2022-04-01 | ノバルティス アーゲー | Biettiクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法 |
CN114040980A (zh) | 2019-02-26 | 2022-02-11 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 可用于治疗克拉伯病的组合物 |
US20220047618A1 (en) | 2019-02-28 | 2022-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics |
EP3947427A1 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Genethon | Production of large-sized quasidystrophins using overlapping aav vectors |
EP3946467A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-02-09 | REGENXBIO Inc. | Gene therapy for eye pathologies |
TW202102526A (zh) | 2019-04-04 | 2021-01-16 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 重組腺相關病毒及其用途 |
FI3953483T3 (fi) | 2019-04-11 | 2023-11-30 | Regenxbio Inc | Kokoekskluusiokromatografiamenetelmiä rekombinanttien adenoassosioituneiden viruskoostumusten karakterisoimiseksi |
US20220323519A1 (en) | 2019-04-17 | 2022-10-13 | Codiak Biosciences, Inc. | Compositions of exosomes and aav |
JP2022529002A (ja) | 2019-04-19 | 2022-06-16 | レジェンクスバイオ インコーポレーテッド | アデノ随伴ウイルスベクター製剤及び方法 |
EP3959323A1 (en) | 2019-04-24 | 2022-03-02 | REGENXBIO Inc. | Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics |
US20220220453A1 (en) * | 2019-04-29 | 2022-07-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel aav capsids and compositions containing same |
EP3962536A1 (en) | 2019-04-29 | 2022-03-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors |
WO2020227515A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation |
CA3140386A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified viral particles and uses thereof |
EP3976785A1 (en) | 2019-05-28 | 2022-04-06 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene |
US20220348912A1 (en) | 2019-06-20 | 2022-11-03 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for improved gene editing |
TW202122579A (zh) | 2019-07-02 | 2021-06-16 | 美商M6P生物醫藥公司 | 用於治療溶酶體儲積症之載體組合物及其使用方法 |
WO2021005223A1 (en) | 2019-07-10 | 2021-01-14 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the treatment of epilepsy |
WO2021005210A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Centre National De La Recherche Scientifique | Chemically-modified adeno-associated virus |
WO2021007515A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors |
US10557149B1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-02-11 | Vigene Biosciences, Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus |
US10653731B1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-05-19 | Vigene Biosciences Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency |
WO2021016453A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-28 | University Of Rochester | Targeted rna cleavage with crispr-cas |
WO2021021674A1 (en) | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Akouos, Inc. | Methods of treating hearing loss using a secreted target protein |
WO2021021661A1 (en) | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Regenxbio Inc. | Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof |
WO2021030125A1 (en) | 2019-08-09 | 2021-02-18 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors |
AU2020330121A1 (en) * | 2019-08-14 | 2022-03-03 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | AAV capsid variants for gene therapy |
WO2021041373A1 (en) | 2019-08-26 | 2021-03-04 | Regenxbio Inc. | Treatment of diabetic retinopathy with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab |
TW202122582A (zh) | 2019-08-26 | 2021-06-16 | 美商航海家醫療公司 | 病毒蛋白之控制表現 |
TW202118873A (zh) | 2019-08-27 | 2021-05-16 | 美商維泰克斯製藥公司 | 用於治療與重複性dna有關之病症之組合物及方法 |
US20220333133A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-10-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
CN114555814A (zh) | 2019-09-13 | 2022-05-27 | 罗特格斯新泽西州立大学 | Aav相容的层粘连蛋白-连接子聚合蛋白 |
EP4031673A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-07-27 | Genethon | Gene therapy expression system alleviating cardiac toxicity of fkrp |
US11492622B2 (en) | 2019-09-26 | 2022-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | MicroRNA-based logic gates and uses thereof |
WO2021062092A1 (en) | 2019-09-26 | 2021-04-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Trans-activated functional rna by strand displacement and uses thereof |
JP2022550435A (ja) | 2019-10-04 | 2022-12-01 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 組換えaavの改善された治療的使用のための方法 |
MX2022004146A (es) | 2019-10-07 | 2022-09-19 | Regenxbio Inc | Composición farmacéutica de vector de virus adenoasociado y métodos. |
CN113518824B (zh) * | 2019-10-16 | 2024-02-23 | 上海药明康德新药开发有限公司 | 新的aav变体 |
US11905523B2 (en) | 2019-10-17 | 2024-02-20 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick Disease type-C |
KR20220098210A (ko) | 2019-11-14 | 2022-07-11 | 바이오마린 파머수티컬 인크. | 간-특이적 유전자 요법 벡터를 이용한 유전성 혈관 부종의 치료 |
EP4061943A1 (en) | 2019-11-19 | 2022-09-28 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer |
AU2020392243A1 (en) | 2019-11-28 | 2022-06-16 | Regenxbio Inc. | Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof |
MX2022007135A (es) | 2019-12-10 | 2022-09-19 | Takeda Pharmaceuticals Co | Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento del síndrome de hunter. |
TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
EP4093428A1 (en) | 2020-01-22 | 2022-11-30 | RegenxBio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua) |
CA3168251A1 (en) | 2020-01-29 | 2021-08-05 | Regenxbio Inc. | Treatment of mucopolysaccharidosis iva |
KR20220148162A (ko) | 2020-01-29 | 2022-11-04 | 리젠엑스바이오 인크. | 인간 신경 또는 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 이두로네이트-2-설파타아제 (ids)를 사용한 점액다당류증 ii의 치료 |
KR20220144377A (ko) | 2020-01-30 | 2022-10-26 | 우모자 바이오파마 인코포레이티드 | 이중특이적 형질도입 촉진제 |
KR20220145838A (ko) | 2020-02-02 | 2022-10-31 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | Gm1 강글리오사이드증을 치료하는 데 유용한 조성물 |
CN115335526A (zh) | 2020-02-07 | 2022-11-11 | 罗切斯特大学 | 核酶介导的rna组装和表达 |
JP2023513211A (ja) | 2020-02-07 | 2023-03-30 | ユニバーシティ オブ ロチェスター | タンパク質合成を増強するためのCRISPR-Cas13による標的RNA翻訳 |
JP2023514204A (ja) | 2020-02-14 | 2023-04-05 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | Cdkl5欠損障害を処置するための遺伝子治療 |
EP4114421A1 (en) | 2020-03-02 | 2023-01-11 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas |
US20240024520A1 (en) | 2020-03-27 | 2024-01-25 | UCB Biopharma SRL | Autonomous knob domain peptides |
US20230103771A1 (en) | 2020-03-27 | 2023-04-06 | University Of Rochester | CRISPR-Cas13 crRNA Arrays |
EP4127169A1 (en) | 2020-03-27 | 2023-02-08 | University of Rochester | Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13 |
AU2021248577A1 (en) | 2020-03-31 | 2022-09-29 | Sichuan Univeristy | AAV capsids variants and uses thereof |
JP2023520402A (ja) | 2020-03-31 | 2023-05-17 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療 |
AR122409A1 (es) | 2020-04-03 | 2022-09-07 | Biomarin Pharm Inc | Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas |
EP4132955A2 (en) | 2020-04-10 | 2023-02-15 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of protein aggregation disorders |
AU2021257848A1 (en) | 2020-04-15 | 2022-12-01 | Voyager Therapeutics, Inc. | Tau binding compounds |
BR112022021604A2 (pt) | 2020-04-28 | 2022-12-06 | Sola Biosciences Llc | Composições e métodos para tratamento de proteinopatias associadas à tdp-43 |
EP4162059A1 (en) | 2020-05-12 | 2023-04-12 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Compositions for drg-specific reduction of transgene expression |
MX2022014245A (es) | 2020-05-12 | 2023-02-22 | Univ Pennsylvania | Composiciones utiles en el tratamiento de la enfermedad de krabbe. |
EP4165195A2 (en) | 2020-05-13 | 2023-04-19 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss |
US20230212606A1 (en) | 2020-05-13 | 2023-07-06 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss |
WO2021230385A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene |
WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
CN116096737A (zh) | 2020-06-05 | 2023-05-09 | 索拉生物科学有限公司 | 用于治疗突触核蛋白病的组合物和方法 |
KR20230025000A (ko) | 2020-06-17 | 2023-02-21 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 유전자 요법 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법 |
CN115996758A (zh) | 2020-06-19 | 2023-04-21 | 吉尼松公司 | 使sgcg在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达系统 |
WO2022011262A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and compositions for treating epilepsy |
WO2022008711A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Genethon | A novel muscle-specific promoter |
CA3185281A1 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | James M. Wilson | Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease |
EP4182455A1 (en) | 2020-07-15 | 2023-05-24 | University of Rochester | Targeted rna cleavage with dcasl3-rnase fusion proteins |
WO2022017630A1 (en) | 2020-07-23 | 2022-01-27 | Ucl Business Ltd | GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF |
US20230285596A1 (en) | 2020-07-27 | 2023-09-14 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
JP2023536091A (ja) | 2020-07-27 | 2023-08-23 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | グルコシルセラミダーゼベータ欠損に関連する神経障害の治療のための組成物及び方法 |
EP4192514A1 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors |
IL300263A (en) | 2020-08-07 | 2023-03-01 | Spacecraft Seven Llc | Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using an AAV vector |
CA3188420A1 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-10 | Joseph Bauman | Vesicle targeting proteins and uses of same |
CN114075610B (zh) * | 2020-08-11 | 2023-11-17 | 北京荷塘生华医疗科技有限公司 | 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用 |
MX2023001863A (es) | 2020-08-14 | 2023-06-13 | Univ Pennsylvania | Nuevas cápsides de aav y composiciones que las contienen. |
MX2023002293A (es) | 2020-08-24 | 2023-05-19 | Univ Pennsylvania | Vectores virales que codifican fusiones de agonistas del receptor de glp-1 y usos de estos en el tratamiento de enfermedades metabólica. |
GB202013194D0 (en) | 2020-08-24 | 2020-10-07 | Combigene Ab | Gene therapy for lipodystrophy |
EP4204014A1 (en) | 2020-08-26 | 2023-07-05 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration |
TW202218686A (zh) | 2020-09-09 | 2022-05-16 | 美商維泰克斯製藥公司 | 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之組合物及方法 |
JP2023540960A (ja) | 2020-09-10 | 2023-09-27 | ルートビヒ-マキシミリアンズ-ウニベルジテート ミュンヘン | 操作されたaavベクター |
WO2022060916A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Regenxbio Inc. | Vectorized antibodies for anti-viral therapy |
EP4213890A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | RegenxBio Inc. | Vectorized lanadelumab and administration thereof |
US20230383278A1 (en) | 2020-09-18 | 2023-11-30 | The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services | Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency |
EP4217376A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-08-02 | University of Massachusetts | Aav vectors encoding nf1 and uses thereof |
IL301677A (en) | 2020-10-01 | 2023-05-01 | Genzyme Corp | A human PAH expression cassette for the treatment of PKU by liver-directed gene replacement therapy |
US20230372538A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-11-23 | Regenxbio Inc. | Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation |
JP2023544803A (ja) | 2020-10-07 | 2023-10-25 | レジェンクスバイオ インコーポレーテッド | Cln2疾患の眼症状に対する遺伝子療法 |
WO2022076595A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Regenxbio Inc. | Formulations for suprachoroidal administration such as gel formulations |
TW202228648A (zh) | 2020-10-07 | 2022-08-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 諸如高黏度調配物之用於脈絡膜上投與之調配物 |
KR20230082614A (ko) | 2020-10-07 | 2023-06-08 | 리젠엑스바이오 인크. | 유전자 요법을 안구 전달하기 위한 아데노-연관 바이러스 |
WO2022076750A2 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery |
CA3193833A1 (en) | 2020-10-09 | 2022-04-14 | Juliette HORDEAUX | Compositions and methods for treatment of fabry disease |
US11781156B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-10-10 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
CA3195553A1 (en) | 2020-10-18 | 2022-04-21 | Qiang Wang | Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor |
WO2022094078A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful in treatment of rett syndrome |
WO2022094157A1 (en) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | Regenxbio Inc. | Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof |
US20230391864A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-12-07 | Regenxbio, Inc. | Vectorized anti-tnf-alpha antibodies for ocular indications |
US20230390418A1 (en) | 2020-10-29 | 2023-12-07 | Regenxbio Inc. | Vectorized factor xii antibodies and administration thereof |
EP4237453A1 (en) | 2020-10-29 | 2023-09-06 | RegenxBio Inc. | Vectorized tnf-alpha antagonists for ocular indications |
WO2022098933A1 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9 |
CN112322791B (zh) * | 2020-11-27 | 2023-10-27 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 |
CN116670152A (zh) | 2020-12-01 | 2023-08-29 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 具有组织特异性靶向基序的新型组合物和含有其的组合物 |
KR20230117179A (ko) | 2020-12-01 | 2023-08-07 | 아카우오스, 인크. | 청신경초종 연관 증상을 치료하기 위한 항-vegf 항체작제물 및 관련된 방법 |
JP2023551911A (ja) | 2020-12-01 | 2023-12-13 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用 |
JP2023554389A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-27 | リジェネクスバイオ インコーポレイテッド | 組換えアデノ随伴ウイルスウイルス粒子を生成する方法 |
WO2022147087A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Regenxbio Inc. | Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof |
AU2021412962A1 (en) | 2020-12-29 | 2023-08-17 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss |
WO2022159662A1 (en) | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Regenxbio Inc. | Improved production of recombinant polypeptides and viruses |
JP2024505887A (ja) | 2021-01-27 | 2024-02-08 | ウモジャ バイオファーマ, インコーポレイテッド | 抗cd19キメラ抗原受容体を発現する細胞を生成するためのレンチウイルス |
AU2022214429A1 (en) | 2021-02-01 | 2023-09-14 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
KR20230145386A (ko) | 2021-02-10 | 2023-10-17 | 리젠엑스바이오 인크. | 재조합 인간 이두로네이트-2-설파타아제(ids)를 사용한 점액다당류증 ii의 치료 |
GB202101958D0 (en) | 2021-02-12 | 2021-03-31 | Ucl Business Ltd | Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome |
WO2022182959A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9 |
WO2022182957A1 (en) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9 |
JP2024509792A (ja) | 2021-02-26 | 2024-03-05 | 武田薬品工業株式会社 | ファブリー病の治療のための組成物及び方法 |
WO2022187548A1 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
WO2022187473A2 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
EP4314303A2 (en) | 2021-03-22 | 2024-02-07 | Genzyme Corporation | Size exclusion chromatography analysis of empty and full aav capsids |
WO2022204476A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing |
AU2022258312A1 (en) | 2021-04-12 | 2023-10-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful for treating spinal and bulbar muscular atrophy (sbma) |
CA3216146A1 (en) | 2021-04-23 | 2022-10-27 | Douglas Anderson | Genome editing by directed non-homologous dna insertion using a retroviral integrase-cas fusion protein and methods of treatment |
AU2022262771A1 (en) | 2021-04-23 | 2023-11-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same |
WO2022229851A1 (en) | 2021-04-26 | 2022-11-03 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences |
KR20240004564A (ko) | 2021-04-26 | 2024-01-11 | 리젠엑스바이오 인크. | 디스트로핀병증의 치료를 위한 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 투여 |
WO2022235614A2 (en) | 2021-05-04 | 2022-11-10 | Regenxbio Inc. | Novel aav vectors and methods and uses thereof |
WO2022234519A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences |
WO2022241030A1 (en) | 2021-05-11 | 2022-11-17 | Regenxbio Inc. | Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof |
US20230055381A1 (en) | 2021-06-25 | 2023-02-23 | Oxford Biomedica Solutions Llc | Adeno-associated virus packaging systems |
AU2022301302A1 (en) | 2021-07-01 | 2024-01-25 | Indapta Therapeutics, Inc. | Engineered natural killer (nk) cells and related methods |
WO2023279073A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Amicus Therapeutics, Inc. | Neurotensin variants and tagged proteins comprising neurotensin or sortilin propeptide |
TW202317768A (zh) | 2021-07-08 | 2023-05-01 | 美商特納亞治療股份有限公司 | 用於基因療法的優化表現卡匣 |
WO2023004331A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-26 | New York University | Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease |
AU2022318664A1 (en) | 2021-07-30 | 2024-02-29 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) |
CA3227103A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Matthew P. GEMBERLING | Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn) |
WO2023018637A1 (en) | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Gene editing of regulatory elements |
AU2022325955A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions |
WO2023019229A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy |
WO2023019227A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions |
WO2023019226A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy |
WO2023039444A2 (en) | 2021-09-08 | 2023-03-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy |
WO2023056329A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Akouos, Inc. | Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss |
AR127217A1 (es) | 2021-10-01 | 2023-12-27 | Biomarin Pharm Inc | Tratamiento de angioedema hereditario con vectores de genoterapia de aav y formulaciones terapéuticas |
TW202325845A (zh) | 2021-10-02 | 2023-07-01 | 賓州大學委員會 | 新穎aav衣殼及含其之組成物 |
WO2023060113A1 (en) | 2021-10-05 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Compositions and methods for recombinant aav production |
WO2023060272A2 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery |
WO2023060269A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery |
WO2023060248A1 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers |
WO2023060221A2 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of proteopathies |
WO2023070019A1 (en) | 2021-10-21 | 2023-04-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hypoimmune cells |
WO2023077092A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Regenxbio Inc. | Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof |
WO2023087019A2 (en) | 2021-11-15 | 2023-05-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions for drg-specific reduction of transgene expression |
WO2023102442A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Jaguar Gene Therapy, Llc | Gene therapy methods for treatment of diabetes |
WO2023102517A1 (en) | 2021-12-02 | 2023-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of fabry disease |
TW202344689A (zh) | 2021-12-17 | 2023-11-16 | 國家科學研究中心 | 用於治療疼痛之肽及方法 |
WO2023133593A2 (en) * | 2022-01-10 | 2023-07-13 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Aav5 capsid variants |
WO2023133574A1 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods useful for treatment of c9orf72-mediated disorders |
WO2023133584A1 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful in treatment of metachromatic leukodystrophy |
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
EP4215614A1 (en) | 2022-01-24 | 2023-07-26 | Dynacure | Combination therapy for dystrophin-related diseases |
WO2023147304A1 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver |
WO2023150647A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
TW202342525A (zh) | 2022-02-02 | 2023-11-01 | 美商阿科奧斯公司 | 用於治療前庭神經鞘瘤相關症狀之抗vegf抗體構築體及相關方法 |
TW202346599A (zh) | 2022-02-08 | 2023-12-01 | 美商航海家醫療公司 | Aav衣殼變異體及其用途 |
WO2023158836A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Sana Biotechnology, Inc. | Engineered cd47 proteins and uses thereof |
WO2023156530A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Lysogene | Gene therapy for neurodegenerative diseases |
WO2023172926A1 (en) | 2022-03-08 | 2023-09-14 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy |
TW202345911A (zh) | 2022-03-08 | 2023-12-01 | 美商維泰克斯製藥公司 | 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除 |
WO2023173123A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells and compositions and uses thereof |
TW202346590A (zh) | 2022-03-13 | 2023-12-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 經修飾之肌肉特異性啟動子 |
WO2023178220A1 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | Regenxbio Inc. | Compositions and methods for recombinant aav production |
WO2023183623A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Regenxbio Inc. | Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy |
WO2023187728A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Gene therapy for diseases with cns manifestations |
WO2023196873A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Regenxbio Inc. | Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration |
WO2023196893A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treating her2 positive metastatic breast cancer and other cancers |
WO2023196851A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | President And Fellows Of Harvard College | Reversing aging of the central nervous system |
WO2023196892A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors |
WO2023196842A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Regenxbio Inc. | Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation |
TW202345913A (zh) | 2022-04-06 | 2023-12-01 | 美商銳進科斯生物股份有限公司 | 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物 |
US20230365968A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-11-16 | Genzyme Corporation | Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy |
WO2023201207A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus with engineered capsid |
WO2023198652A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Centre National De La Recherche Scientifique | Chemically-modified adeno-associated viruses |
US20230346977A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-11-02 | Universitat Autònoma De Barcelona | Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein |
WO2023201308A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for treating an ocular disease |
WO2023201277A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery |
WO2023205606A1 (en) | 2022-04-18 | 2023-10-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver |
WO2023215807A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Regenxbio Inc. | VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS |
WO2023215806A2 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Regenxbio Inc. | Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof |
WO2023214346A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides |
WO2023227731A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Tafalgie Therapeutics | Peptides and methods for use in treating pain |
WO2023239627A2 (en) | 2022-06-08 | 2023-12-14 | Regenxbio Inc. | Methods for recombinant aav production |
WO2023240236A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders |
WO2024006770A1 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Astellas Gene Therapies, Inc. | Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophies |
WO2024006741A1 (en) | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
WO2024007020A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Indapta Therapeutics, Inc. | Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods |
WO2024011112A1 (en) | 2022-07-06 | 2024-01-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
WO2024015881A2 (en) | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation |
WO2024020352A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing |
WO2024017990A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods and compositions for treating chronic pain disorders |
WO2024026377A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors |
CN115354049A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-11-18 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用 |
WO2024044725A2 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Regenxbio Inc. | Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof |
WO2024042485A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Composition for use in the treatment of fabry disease |
WO2024054983A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Controlled expression of viral proteins |
WO2024064856A1 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors |
WO2024064863A2 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors |
WO2024073669A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Regenxbio Inc. | Treatment of ocular diseases with recombinant viral vectors encoding anti-vegf fab |
CN116622908B (zh) * | 2023-04-13 | 2024-02-06 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用 |
Family Cites Families (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8929110D0 (en) * | 1989-12-22 | 1990-02-28 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides and dna encoding therefor |
US5449616A (en) | 1990-05-23 | 1995-09-12 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein |
US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
CA2046745A1 (en) | 1991-07-10 | 1993-01-11 | Isaac Neuman | Article including a container containing at least one precious stone |
US6174666B1 (en) | 1992-03-27 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
US6204059B1 (en) | 1994-06-30 | 2001-03-20 | University Of Pittsburgh | AAV capsid vehicles for molecular transfer |
US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
US6001650A (en) * | 1995-08-03 | 1999-12-14 | Avigen, Inc. | High-efficiency wild-type-free AAV helper functions |
CA2230758A1 (en) * | 1995-09-08 | 1997-03-13 | Genzyme Corporation | Improved aav vectors for gene therapy |
US6140103A (en) * | 1995-12-01 | 2000-10-31 | Introgene B.V. | Regulated protein expression in stably transfected mammalian cells |
US20020037867A1 (en) * | 1999-02-26 | 2002-03-28 | James M. Wilson | Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy |
US6083716A (en) | 1996-09-06 | 2000-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
US5866552A (en) * | 1996-09-06 | 1999-02-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for expressing a gene in the absence of an immune response |
CA2264499A1 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses |
IL128779A0 (en) | 1996-09-06 | 2000-01-31 | Univ Pennsylvania | Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy |
EP0931158A1 (en) | 1996-09-06 | 1999-07-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase |
US20030215422A1 (en) * | 1996-09-11 | 2003-11-20 | John A. Chiorini | Aav4 vector and uses thereof |
ES2215222T3 (es) * | 1996-12-05 | 2004-10-01 | Crucell Holland B.V. | Modificacion genetica de celulas cepa de repoblacion hematopoyeticas de primates. |
US6039942A (en) * | 1996-12-20 | 2000-03-21 | Novo Nordick A/S | Phytase polypeptides |
US6156303A (en) | 1997-06-11 | 2000-12-05 | University Of Washington | Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom |
US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
CA2303768C (en) * | 1997-09-19 | 2009-11-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav |
EP1015619A1 (en) * | 1997-09-19 | 2000-07-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses |
WO1999015677A1 (en) | 1997-09-19 | 1999-04-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein |
US6953690B1 (en) | 1998-03-20 | 2005-10-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
EP1064393B1 (en) | 1998-03-20 | 2004-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
EP1082413B1 (en) | 1998-05-28 | 2008-07-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Aav5 vector and uses thereof |
US6210663B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-04-03 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting |
US6759237B1 (en) * | 1998-11-05 | 2004-07-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same |
ES2288037T3 (es) * | 1998-11-05 | 2007-12-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Secuencia de acido nucleico del serotipo 1 de adenovirus asociado, vectores y celulas huesped que las contienen. |
US6387368B1 (en) * | 1999-02-08 | 2002-05-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
JP4693244B2 (ja) * | 1999-03-18 | 2011-06-01 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法 |
AU2409200A (en) | 1999-06-02 | 2000-12-28 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses |
AU781478B2 (en) * | 1999-08-20 | 2005-05-26 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries |
JP2003523320A (ja) | 1999-09-29 | 2003-08-05 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | ウイルスベクターの迅速なpeg改変方法、高められた遺伝子形質導入のための組成物、高められた物理的安定性を伴う組成物、およびそのための用途 |
US6365394B1 (en) * | 1999-09-29 | 2002-04-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus |
AU1796801A (en) | 1999-12-03 | 2001-06-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals |
US6821512B1 (en) | 1999-12-03 | 2004-11-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals |
JP2003526377A (ja) * | 2000-03-14 | 2003-09-09 | ニユーロロジクス・インコーポレーテツド | キメラキャプシドベクターの製造 |
US6855314B1 (en) | 2000-03-22 | 2005-02-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells |
US6468524B1 (en) * | 2000-03-22 | 2002-10-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | AAV4 vector and uses thereof |
AU5557501A (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Univ Pennsylvania | Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids |
AU2001289177A1 (en) * | 2000-08-30 | 2002-03-13 | Haplogen, Llc | Method for determining alleles |
US7749492B2 (en) | 2001-01-05 | 2010-07-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | AAV vectors and methods |
US20020159978A1 (en) * | 2001-02-06 | 2002-10-31 | James Allen | Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions |
NZ532635A (en) * | 2001-11-13 | 2007-05-31 | Univ Pennsylvania | A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method |
EP1453547B1 (en) * | 2001-12-17 | 2016-09-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
CA2469053C (en) | 2001-12-17 | 2011-08-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
AU2002367943A1 (en) | 2001-12-18 | 2003-12-22 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Improved reagents and methods for producing parvoviruses |
US20040002159A1 (en) * | 2002-04-05 | 2004-01-01 | Weidong Xiao | Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof |
DE60310297T2 (de) * | 2002-04-29 | 2007-06-06 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methode für die direkte Gewinnung und Amplifikation von integrierten Viren aus zellulärer Gewebe-DNA |
DK2657247T3 (en) | 2003-06-19 | 2017-07-10 | Genzyme Corp | AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof |
CN1856576B (zh) * | 2003-09-30 | 2011-05-04 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 |
US20090054823A1 (en) | 2004-09-30 | 2009-02-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules |
CN104293835B (zh) | 2005-04-07 | 2017-07-04 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 增强腺相关病毒载体功能的方法 |
US7788045B2 (en) | 2005-09-01 | 2010-08-31 | Meditasks, Llc | Systems and method for homeostatic blood states |
EP2018421B1 (en) | 2006-04-28 | 2012-12-19 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Scalable production method for aav |
JP2009102988A (ja) | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Toyota Motor Corp | 内燃機関の燃料噴射装置 |
JP5634272B2 (ja) | 2008-03-14 | 2014-12-03 | ヒューマンザイム リミテッド | ヒト細胞発現系を用いる真正ヒトタンパク質の組換え生産 |
US20090280103A1 (en) | 2008-04-04 | 2009-11-12 | Martin Flueck | Regulation of muscle repair |
US8729041B2 (en) | 2008-12-03 | 2014-05-20 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for treating hepatic neoplasia |
CA2833908C (en) | 2010-04-23 | 2021-02-09 | University Of Massachusetts | Cns targeting aav vectors and methods of use thereof |
CN103648328B (zh) | 2011-07-15 | 2016-01-06 | 阿尔弗雷德·凯驰两合公司 | 旋转刷和带旋转刷的清扫机 |
WO2013078316A1 (en) | 2011-11-23 | 2013-05-30 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides |
KR102057540B1 (ko) | 2012-02-17 | 2019-12-19 | 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 | 세포, 기관 및 조직으로의 유전자 전이를 위한 aav 벡터 조성물 및 방법 |
EP3470523A1 (en) | 2012-05-09 | 2019-04-17 | Oregon Health & Science University | Adeno associated virus plasmids and vectors |
US9819463B2 (en) | 2016-02-18 | 2017-11-14 | Huawei Technologies Co., Ltd. | Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system |
WO2018160582A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor |
-
2002
- 2002-11-12 NZ NZ532635A patent/NZ532635A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 NZ NZ564506A patent/NZ564506A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 SG SG200904776-2A patent/SG168422A1/en unknown
- 2002-11-12 PL PL373864A patent/PL217623B1/pl unknown
- 2002-11-12 MX MX2015000026A patent/MX346493B/es unknown
- 2002-11-12 CN CN201310326978.2A patent/CN103555678B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 BR BR122016004546A patent/BR122016004546B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 CA CA3159060A patent/CA3159060C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 EP EP20100178970 patent/EP2338900B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201310326627.1A patent/CN103555676B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2864537A patent/CA2864537C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2465868A patent/CA2465868C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2945734A patent/CA2945734C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201110081897.1A patent/CN102181480B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA3066428A patent/CA3066428C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 IL IL270065A patent/IL270065B2/en unknown
- 2002-11-12 AU AU2002361573A patent/AU2002361573B2/en not_active Expired
- 2002-11-12 US US10/291,583 patent/US20030138772A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-12 NZ NZ591012A patent/NZ591012A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 SG SG10201912509RA patent/SG10201912509RA/en unknown
- 2002-11-12 NZ NZ61829802A patent/NZ618298A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 EP EP02797050A patent/EP1456419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201610112637.9A patent/CN105671005B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 SG SG10202108118RA patent/SG10202108118RA/en unknown
- 2002-11-12 SG SG200603024-1A patent/SG157224A1/en unknown
- 2002-11-12 CN CN201310326905.3A patent/CN103555677B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 EP EP20100178940 patent/EP2341068B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 HU HU1500180A patent/HU230406B1/hu unknown
- 2002-11-12 NZ NZ60012102A patent/NZ600121A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 ES ES10178940T patent/ES2439515T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 JP JP2003544211A patent/JP4677187B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 PL PL397823A patent/PL220644B1/pl unknown
- 2002-11-12 NZ NZ578982A patent/NZ578982A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 AT AT02797050T patent/ATE520707T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 BR BR122016004944A patent/BR122016004944B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 SG SG10201506627PA patent/SG10201506627PA/en unknown
- 2002-11-12 BR BRPI0214119A patent/BRPI0214119B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-12 CA CA 2406745 patent/CA2406745C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 PL PL409838A patent/PL222683B1/pl unknown
- 2002-11-12 DK DK02257826T patent/DK1310571T3/da active
- 2002-11-12 EP EP20020257826 patent/EP1310571B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 ES ES02257826T patent/ES2258601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CN CN201310326869.0A patent/CN103589692B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 MX MX2017003704A patent/MX359371B/es unknown
- 2002-11-12 AT AT02257826T patent/ATE317916T1/de active
- 2002-11-12 KR KR1020107001837A patent/KR101014207B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-12 HU HU0600229A patent/HU229379B1/hu unknown
- 2002-11-12 IL IL16182702A patent/IL161827A0/xx unknown
- 2002-11-12 CA CA2756866A patent/CA2756866C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 PL PL404537A patent/PL221877B1/pl unknown
- 2002-11-12 WO PCT/US2002/033629 patent/WO2003042397A2/en active Application Filing
- 2002-11-12 ES ES10178970T patent/ES2455126T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 DE DE2002609193 patent/DE60209193T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 KR KR20047007245A patent/KR101015854B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-12 JP JP2002328852A patent/JP3958191B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-12 CA CA2915124A patent/CA2915124C/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-11-11 HK HK03108160A patent/HK1056198A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-05-04 ZA ZA2004/03360A patent/ZA200403360B/en unknown
- 2004-05-06 IL IL161827A patent/IL161827A/en active IP Right Grant
- 2004-05-13 MX MXPA04004600 patent/MXPA04004600A/es active IP Right Grant
- 2004-05-26 NO NO20042183A patent/NO334379B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-25 HK HK05101633.6A patent/HK1068925A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-23 NZ NZ548094A patent/NZ548094A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-11-14 US US11/985,096 patent/US8906675B2/en active Active
-
2008
- 2008-08-18 IL IL193525A patent/IL193525A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-04-21 JP JP2009102988A patent/JP5140627B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-12-08 US US12/962,793 patent/US8524446B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-06-28 IL IL213810A patent/IL213810A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-08-23 IL IL221602A patent/IL221602A/en active IP Right Grant
- 2012-09-12 JP JP2012200500A patent/JP5669795B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2012-10-03 US US13/633,971 patent/US9790472B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-08-08 IL IL227866A patent/IL227866A/en active IP Right Grant
- 2013-10-14 NO NO20131359A patent/NO336468B1/no not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-06-13 JP JP2014122390A patent/JP5969547B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2014-06-26 IL IL233391A patent/IL233391A/en active IP Right Grant
- 2014-06-26 PH PH12014501487A patent/PH12014501487B1/en unknown
- 2014-08-11 IL IL234063A patent/IL234063A/en active IP Right Grant
- 2014-08-14 NO NO20140988A patent/NO336801B1/no not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-02-10 NO NO20150196A patent/NO338362B1/no not_active IP Right Cessation
- 2015-12-02 US US14/956,934 patent/US10041090B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-02-08 JP JP2016021585A patent/JP6212142B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2016-11-03 IL IL248724A patent/IL248724B/en active IP Right Grant
- 2016-12-22 PH PH12016502583A patent/PH12016502583A1/en unknown
-
2017
- 2017-05-02 US US15/584,674 patent/US10508286B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-06-27 US US15/633,906 patent/US10308958B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-10-13 US US15/782,980 patent/US10526617B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-04-08 IL IL25854518A patent/IL258545B/en active IP Right Grant
- 2018-09-28 US US16/145,848 patent/US10544432B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-11-13 US US16/682,712 patent/US11041171B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2019-11-21 US US16/691,227 patent/US11034976B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2019-11-27 US US16/698,412 patent/US11034977B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2021
- 2021-05-13 US US17/319,564 patent/US20210285012A1/en not_active Abandoned
- 2021-10-12 US US17/499,555 patent/US11377669B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2021-10-12 US US17/499,531 patent/US11499167B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10308958B2 (en) | 2001-11-13 | 2019-06-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11377669B2 (en) | Method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby | |
AU2017279564B2 (en) | ADENO-ASSOCIATED VIRUS cy.5 (AAVcy.5) SEQUENCES AND RECOMBINANT AAVs COMPRISING SAME | |
AU2011250837B2 (en) | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby | |
AU2008202344B2 (en) | A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (AAV) sequences and isolating novel sequences identified thereby |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |