JP2003523320A

JP2003523320A - ウイルスベクターの迅速なｐｅｇ改変方法、高められた遺伝子形質導入のための組成物、高められた物理的安定性を伴う組成物、およびそのための用途

Info

Publication number: JP2003523320A
Application number: JP2001526210A
Authority: JP
Inventors: クロイル，マリア・エイ; ウイルソン，ジエイムズ・エム
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2003-08-05
Also published as: CA2384814A1; US6399385B1; WO2001023001A2; WO2001023001A3; EP1218035A2; AU1071701A

Abstract

(57)【要約】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるウイルスのキャプシドもしくはエンベロープタンパク質の迅速な改変方法を記述する。本発明のＰＥＧで改変されたウイルスを使用する分子の送達方法もまた提供する。本発明のＰＥＧで改変されたウイルスを含有する組成物は、改良された遺伝子発現、低下された中和抗体およびＣＴＬ産生を特徴とする。ウイルスがショ糖およびマンニトールの１：１の比を有する製剤中で凍結乾燥される、高められた物理的安定性を有するウイルス組成物もまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本研究は、ＮＩＨ［Ｐ３０ＤＫ４７７５７−０５、−０７およびＰＯ１Ｈ
Ｌ５９４０７−０２］ならびにＮＩＨ／ＮＩＡＭＳ［Ｐ０１ＡＲ／ＮＳ４３６
４８−０４］からの助成金により部分的に資金供給された。米国政府は本発明に
おいてある種の権利を有してよい。

【０００２】（発明の分野）本発明は一般的に宿主細胞への遺伝子送達の分野、およびより具体的にはウイ
ルスベクターを介する遺伝子送達に関する。

【０００３】（発明の背景）ウイルスに媒介される遺伝子送達は、患者への治療的遺伝子の送達について記
述されている。現在既知の方法の一限界は、ウイルスキャプシドに対する患者の
免疫応答による中和抗体（ＮＡＢ）の生成であり、これは再投与に際して有意の
レベルの遺伝子発現を禁止する。従って、これらの免疫応答を回避する遺伝子送
達方法が必要とされる。

【０００４】官能性化されたポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）でのタンパク質および
酵素の共有改変が研究されている。ＰＥＧは非免疫原性でありかつ非常に低い位
数の毒性を有する荷電していない親水性の直鎖状ポリマーである。最近、Ｏ’Ｒ
ｉｏｒｄａｎらは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質に多様なポリエチレ
ングリコールを共有結合する方法を開発した［Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、ＨｕＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１０：１３４９−１３５８（１９９９）］。しかしな
がら、この方法は２０ないし２４時間の期間のインキュベーションを必要とする
。

【０００５】必要とされるものは、再投与のための現在の構築物の限界を回避するウイルス
ベクター、ならびに高レベルのこうした構築物の迅速な生成方法である。

【０００６】（発明の要約）一局面において、本発明は、その形質導入効率を高めるための組換えウイルス
のポリエチレングリコールとの結合方法を提供する。本方法は、活性化されたＰ
ＥＧおよび組換えウイルスを室温で約１５分ないし約２時間反応させること；な
らびに、反応を停止し、それによりＰＥＧ結合されたウイルスを得ることの段階
を必要とする。最も適しては、活性化されたＰＥＧおよび組換えウイルスは、約
１０：１のポリエチレングリコール対ウイルスの比で反応される。望ましくは、
組換えウイルスは、反応溶液１ｍｌあたり約１×１０¹⁰ないし約１×１０¹⁵個の
粒子の濃度で存在する。

【０００７】別の局面において、本発明は、本発明の方法により製造されるＰＥＧ結合され
たウイルスを提供する。

【０００８】なお別の局面において、本発明は、本発明の改変された組換えウイルスを宿主
細胞に送達させることを必要とする、組換えウイルスの形質導入効率の増大方法
を提供する。

【０００９】さらに別の局面において、本発明は、ウイルスベクターを介する選択された宿
主細胞への分子の再投与方法を提供する。本方法は、本発明のＰＥＧで改変され
たウイルスと宿主細胞を接触させること（前記ウイルスは宿主細胞への送達のた
めの分子を含んで成り）；および該分子を含んで成る組換えウイルスと該宿主細
胞を接触させることの段階を必要とする。

【００１０】なおさらなる一局面において、本発明は宿主細胞への選択された分子の送達に
有用な組成物を提供する。該組成物は、本発明の方法により製造されたＰＥＧ結
合されたウイルス、および生理学的に許容できる担体を含有する。

【００１１】なおさらなる一局面において、本発明はウイルスベクターの物理的安定性を高
める組成物を提供する。本組成物は、宿主細胞への送達のための分子を含んで成
る組換えウイルスベクター、ショ糖およびマンニトールを含有し、ここで、ショ
糖対マンニトールの比は約１対約１である。望ましくは、該組成物は、約１．２
％ないし約１．７％の最終水分含量まで凍結乾燥される。

【００１２】本発明の他の局面および利点は、本発明の以下の詳述される記述から明らかで
あろう。

【００１３】（発明の詳細な記述）本発明は、活性化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーでのタン
パク質もしくは酵素の新規の迅速な改変方法を提供する。有利には、本明細書に
記述される改変方法は、短い時間の期間（例えば約１ないし２時間）内で完了し
、穏やかな条件（例えば室温、生理学的ｐＨ）下で起こり、そして極端な貯蔵条
件下での物理的安定性を高める。

【００１４】本方法は、ウイルスベクターのキャプシドタンパク質の改変にとりわけ良好に
適することが見出された。有利には、実質的な遺伝子発現が、本発明のＰＥＧで
改変されたウイルスベクターを使用して、静脈内および筋肉内での再投与に際し
て、他の病原体に対するレシピエントの免疫系を損なうことなく得られている。
本発明のベクターはまた他の経路による送達にも有用である。本発明の改変され
たベクターは、慢性の治療を必要とする治療法でとりわけ有用である。さらに、
これらの改変されたベクターは、高力価の中和抗体を伴い、患者中での有意のレ
ベルの遺伝子発現を見込む。加えて、再投与は、改変されたウイルスへの前曝露
の後に、天然のウイルスを用いて起こることができる。

【００１５】従って、本発明のＰＥＧ改変方法は、宿主細胞への送達に望ましい分子をキャ
プシドもしくはエンベロープタンパク質内に含有する組換えウイルスの改変にと
りわけ良好に適する。とりわけ望ましい一態様において、送達のための分子は、
宿主細胞中でのその発現を指図する調節配列の制御下のトランスジーン（ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｅ）をコードする核酸配列である。別の望ましい態様において、送達
のための分子はタンパク質、化学物質、酵素もしくは他の部分である。送達のた
めの分子の選択は本発明の制限でない。

【００１６】とりわけ望ましい一態様において、本発明の方法はアデノ随伴ウイルスととも
に使用される。しかしながら、これらの方法は、それらの遺伝物質をキャプシド
もしくはエンベロープタンパク質内に含有する他のウイルスに容易に適用するこ
とができる。ＰＥＧ改変に適するキャプシドもしくはエンベロープを有する他の
適するウイルスの例は、なかんずく、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチ
ウイルスを包含する。明細全体での便宜性のため、キャプシドタンパク質に言及
することができる。しかしながら、類似の方法を、ウイルスエンベロープタンパ
ク質を改変するのに適用してよいことが理解されよう。同様に、本発明の方法は
、他のタンパク質および酵素（ウイルス性であるにしろもしくは非ウイルス性で
あるにしろ）を改変するのに容易に使用することができる。本明細書で定義され
るところのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、式：Ｈ−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n
−ＯＨ（式中、ｎは２ないし約１０００である）の反復単位より構成されるポリ
マーである。最も適しては、本発明は、約５００ないし約５００，０００、約１
０００ないし約２００，０００、および約５０００ないし１００，０００から選
択される範囲の分子量を有するＰＥＧ化合物を使用する。置換されたＰＥＧ化合
物がこの定義内に包含される。現在好ましい一態様において、置換されたＰＥＧ
は５０００の分子量を有するモノメチオキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ
）である。ＭＰＥＧは式ＣＨ₃−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＯＨを有し、かつ、慣習的
な合成技術により生成させてよいか、もしくは商業的に購入してよい。他の適す
る置換されたＰＥＧ化合物は、とりわけ、活性化に適する化学基を提示するため
かつ／もしくはウイルスタンパク質キャプシドへの結合の点として、容易に決定
もしくは設計することができる。

【００１７】ＭＰＥＧ（もしくは別の選択されたＰＥＧ）は、選択されたタンパク質（例え
ばウイルスキャプシド）もしくは酵素への結合の前に化学的に活性化される。化
学的活性化は慣習的技術を使用して実施してよい。活性化されたＭＰＥＧは、多
様な商業的供給元から購入してよい。例えば、トレシル−ＭＰＥＧ（ＴＭＰＥＧ
）、コハク酸スクシンイミジル−ＭＰＥＧ（ＳＳＭＰＥＧ）および塩化シアヌル
−ＭＰＥＧ（ＣＣＭＰＥＧ）を、シグマケミカルズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）（ミズーリ州セントルイス）から得てよい。あるいは、ＭＰＥＧは、
以下のスキーム：

【００１８】

【化１】

【００１９】に従ってスクシンイミジル活性化エステルで活性化してよい。

【００２０】ＭＰＥＧは、以下のスキーム：

【００２１】

【化２】

【００２２】に従って塩化トレシルで活性化してよい。

【００２３】ＭＰＥＧは、以下の２種のスキームの１つに従って塩化シアヌルで活性化して
よい：

【００２４】

【化３】

【００２５】塩化シアヌルでのＭＰＥＧの活性化のための別の適するスキームは、以下のと
おりである：

【００２６】

【化４】

【００２７】利用される活性化の化合物もしくは方法に関係なく、活性化されたＭＰＥＧを
その後、従来技術の方法［例えば、Ｄｅｌｇａｌｄｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２：１１９−１２８（１９９９）を参照された
い］に比較してより迅速でありかつより少なく厳しい条件下で実施される本発明
の方法を使用して、選択されたタンパク質（例えばウイルスキャプシド）と結合
する。より具体的には、当該技術分野の方法は、２０ないし２４時間の期間のイ
ンキュベーションを必要とし、また、いくつかの場合には、インキュベーション
期間の間、規則的な間隔で、変動する濃度の活性化されたＰＥＧの段階的な添加
を必要とした。生じる生成物は「超ペギル化された（ｓｕｐｅｒ−ｐｅｇｙｌａ
ｔｅｄ）ビリオン」であった。有利には、本発明の方法は、活性化されたＰＥＧ
の規則的な間隔での添加に対するこの要件を排除し、そして約１ないし２時間で
ＰＥＧで改変された生成物を提供する。

【００２８】本発明の方法により、改変に選択されたタンパク質（例えばウイルスキャプシ
ド）は、好ましくはいかなる汚染物質からも精製する。例えば、ウイルスベクタ
ーは、当業者に既知の方法［例えばＫ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０：５２０−５３２（１９９６）を参照されたい］を使用して生じさせてよい
。その後、ウイルスベクターを、好ましくは慣習的方法により精製する。例えば
、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：３０６−３１２（１９９７）］およびカラムクロマトグラフィーの方法が
とりわけ望ましい。精製に有用な多様なカラムが商業的に入手可能であり（例え
ばバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、パーセプティブバイオシステムズ（Ｐｅ
ｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）など）、また、他の方法が文献に記
述されている。精製方法の選択は本発明の制限でない。

【００２９】適しては、ＰＥＧ改変に選択される構築物（例えば精製されたウイルスベクタ
ー）を脱塩して、精製過程（例えばＣｓＣｌ）もしくは貯蔵媒体からいかなる残
余の塩も除去する。望ましい一態様において、この脱塩は商業的に入手可能なク
ロマトグラフィーカラム上で実施する。脱塩した後に、ウイルスベクターを、下
述されるＰＥＧ結合反応、もしくは長期の貯蔵に際してウイルスの安定性を高め
た製剤と適合性の緩衝液で平衡化する。適しては、ベクターは結合反応での使用
に選択される緩衝液で平衡化してよい。緩衝液は、便宜性、および反応で使用さ
れる活性化されたＰＥＧの型のような因子を考慮に入れて選択してよい。

【００３０】例えば、構築物を本発明によりＴＭＰＥＧと結合するはずである場合、とりわ
け望ましい緩衝液は、約７ないし約８、および最も好ましくは７．４のｐＨのリ
ン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢＳ）である。ＳＳＭＰＥＧおよびＣＣＭＰＥＧとの
結合については、精製されたタンパク質（例えばＣｓＣｌ勾配からのバンド）を
、リン酸ナトリウム（ｐＨ約６．５ないし約７．５、および最も好ましくは７．
２）ならびに四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ約８．５ないし約９．９、および最も好
ましくは９．２）緩衝液中で脱塩する。しかしながら、これらのパラメータを考
え、当業者はこれらの緩衝液を必要とされるとおり調節してよい。

【００３１】タンパク質を脱塩し（必要な場合）かつ選択された緩衝液で平衡化すれば、選
択された活性化されたＰＥＧをウイルスと組み合わせてＰＥＧおよびタンパク質
の反応混合物を形成し、ここでは活性化されたＰＥＧが、１：１ないし２０：１
、および約５：１ないし１５：１の範囲のＰＥＧ対ウイルス比で存在する。ウイ
ルスがｒＡＡＶである場合には１０：１の比が好ましい。しかしながら、当業者
はこれらの比を所望のとおり容易に調節することができる。適しては、反応混合
物は、約１５分ないし約１２０分間、穏やかな攪拌下に室温（例えば約２２℃な
いし２４℃）で実施し、そして反応を停止する。反応の所望の一停止方法は、Ｐ
ＥＧの量に関して過剰のＬ−リシンを添加することによる。約１０倍過剰が望ま
しいと見出されているが；しかしながら、当業者は別の適する量を容易に選択す
ることができる。あるいは、反応は、反応の温度を約４℃に低下させることによ
り停止してもよい。望ましくは、反応は、標的タンパク質（例えばウイルスキャ
プシド）の完全な改変（すなわち約１００％）改変が達成されるまで進行させる
。しかしながら、ある情況下では、反応は改変が完了未満である場合に停止して
よい。例えば、ある種の活性化されたＣＣＰＥＧを利用する場合、ある種のタン
パク質中である型の活性化されたＣＣＰＥＧを用いて観察される凝集を回避する
ために、改変が約７０％完了である場合に反応を停止することが望ましいことが
できる。しかしながら、増大された形質導入効率を包含する本発明の利点は１０
０％未満の改変で観察されているため、当業者に容易に明らかであろう多様な理
由から、反応を７０％ないし９８％、７５％ないし９５％、８０％ないし９０％
、もしくは８５％完了で停止することが望ましいことができる。改変の程度は慣
習的方法を使用して決定することができる。例えば、本明細書の実施例３に記述
されるフルオレスカミンアッセイを参照されたい。

【００３２】生じるＰＥＧで改変されたタンパク質を、反応されないＰＥＧ、過剰のリシン
および反応副生成物から分離する。適する分離方法の例は、ＣｓＣｌ遠心分離、
もしくは適する緩衝液（例えばｐＨ７．４の１０ｍＭカリウム緩衝生理的食塩水
（ＫＰＢＳ））で平衡化されたカラムを通る反応混合物の通過を包含する。しか
しながら、他の分離方法を容易に選択することができる。その後、ＰＥＧで改変
された構築物を含有する画分を、２６０ｎｍでのＵＶ分光測光的分析もしくは他
の適する方法により確認することができる。分離（精製）後に、ＰＥＧで改変さ
れた構築物（例えばウイルス）を、貯蔵および／もしくは宿主細胞への送達に適
する溶液に懸濁してよい。

【００３３】有利には、発明者らは、この方法により改変されたウイルスが感染性を保持す
ることを見出した。最も適しては、本発明のＰＥＧで改変されたウイルスは、改
変されたウイルスへの活性化基の組み込みを回避し、従って、結合する部分の潜
在的な免疫原性に関連するいかなる問題も回避する。従って、本発明は、本発明
のＰＥＧで改変されたウイルス、ならびに多様な治療および他の目的上の宿主細
胞への組成物の送達に適する担体を含有する組成物をさらに提供する。本発明の組成物Ａ．ＰＥＧで改変された構築物一態様において、本発明の組成物は、本発明のＰＥＧで改変されたタンパク質
もしくは酵素、および生理学的に適合性の担体を含有する。とりわけ望ましい一
態様において、本発明はＰＥＧで改変されたウイルスを含有する組成物を提供す
る。適しては、こうしたウイルスは宿主細胞中でのその発現を指図する調節配列
の制御下にあるトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）をコードする。あるいは
、該ウイルスは、宿主細胞への送達が望ましい別の分子を担持してよい。

【００３４】ＰＥＧで改変されたウイルスの適する用量は、治療されている病状、家畜もし
くはヒト患者の健康状態、齢および体重、ならびに他の関係する因子に依存して
、当業者により容易に決定することができる。しかしながら、一般に、適する用
量は、約８０ｋｇの重量を有する成体のヒトについて、１用量あたり１０¹⁰ない
し１０¹⁸、および好ましくは約１０¹⁴ないし１０¹⁶個のウイルス粒子の範囲にあ
ってよい。この用量を、約０．０１ｍＬないし約１ｍＬの生理学的に適合性の担
体に懸濁しかついずれかの適する手段により送達させてよい。用量は、いずれか
の適する送達手段を使用して、毎日、毎週、毎月、もしくは他の選択された間隔
で、必要とされるもしくは所望のように反復してよい。

【００３５】適しては、こうした担体は、ヒトもしくは非ヒトの哺乳動物患者への投与に適
する、生理学的に適合性の例えば生理的食塩水、蒸留水、リン酸緩衝生理的食塩
水（ＰＢＳ）、カリウム（Ｋ）ＰＢＳ、ナトリウムＰＢＳなどである。他の例示
的担体は、滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デ
キストラン、アガー、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担
体の選択は本発明の制限でない。

【００３６】場合によっては、本発明の組成物は、ＰＥＧで改変されたウイルスおよび担体
（１種もしくは複数）に加えて、保存剤、化学的安定剤のような他の慣習的製薬
学的成分を含有してよいか、もしくは界面活性剤を製剤中に包含してよい。適す
る例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸
化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェ
ノールおよびパラクロロフェノールを包含する。例えば、適する化学的安定剤は
ゼラチンおよびアルブミンを包含してよい。場合によっては、本発明の組成物は
、遊離のアミノ酸、例えばアデノシン、炭水化物、界面活性剤および他の安定剤
のような他の成分を含有してよい。Ｂ．物理的安定性を高める製剤別の局面において、本発明は過酷な貯蔵条件下でさえウイルスベクターの物理
的安定性を高める新規製剤を提供する。一態様において、これらのウイルスベク
ターは本発明の方法により改変される。しかしながら、本明細書に記述される製
剤は多様な他のウイルスベクターに有用であり、それらは当業者により容易に選
択されることができる。加えて、本明細書に記述される製剤は、凍結乾燥、冷凍
庫もしくは冷蔵条件下での長期貯蔵、および出荷にかけられるであろう多様な非
ウイルスベクター、例えばプラスミド、または他のＤＮＡもしくはタンパク質に
望ましいことができる。

【００３７】適しては、長期貯蔵のためには、ウイルスベクターは、製剤中に約１．２％な
いし１．７％、およびより好ましくは約１．３％ないし１．４％の範囲の最終水
分含量を含有するよう凍結乾燥される。望ましくは、本発明の製剤は、１ｍｌあ
たり最低約５×１０¹⁰ないし約１×１０¹⁶、もしくは約５×１０¹¹個のウイルス
粒子を含有する。非ウイルス構築物を利用する場合、当業者は、選択された構築
物の適切な濃度を容易に決定することができる。例えば、本発明の製剤は、約０
．１μｇないし約１０ｍｇのＤＮＡ、より好ましくは約１０μｇないし約１ｍｇ
のＤＮＡ、もしくは約０．１μｇないし約１０ｍｇのタンパク質、より好ましく
は約１０μｇないし約１ｍｇのタンパク質を含有してよい。しかしながら、他の
適する濃度を当業者により容易に選択することができる。これらのパラメータを
使用して、凍結乾燥を、慣習的技術を使用して実施してよい。一般に、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨーク州
コールドスプリングハーバーを参照されたい。

【００３８】とりわけ望ましい一態様において、本発明の組成物に処方されるべき構築物（
例えばウイルスベクター）は、溶液中でショ糖およびマンニトールと組み合わせ
られる。ウイルスベクターについて、約１：１のショ糖対マンニトールの比がと
りわけ望ましい。しかしながら、ショ糖対マンニトールの比は、貯蔵に際しての
選択された構築物の安定性を考慮に入れ、およびより望ましくは約３：４のショ
糖対マンニトール、調節してよい。例えば、一般に、アデノ随伴ウイルスベクタ
ーは、長期の貯蔵条件下でアデノウイルスベクターよりも良好な安定性を表す傾
向がある。例えば、比は、約４：１のショ糖対マンニトールから約１：４のショ
糖対マンニトールまで、およびより望ましくは約３：４のショ糖対マンニトール
、そして最も望ましくは約１：１の範囲にわたってよい。

【００３９】最も好ましくは、高められた貯蔵安定性を有する本発明の組成物は、約０．５
％ないし５％のβ−シクロデキストリン（ＢＣＤ）、および最も好ましくは三級
アミンＢＣＤもまた含有する。とりわけ望ましい一態様において、この組成物は
、約０．５ｍｇ／ｍｌないし約１ｍｇ／ｍｌのプルロニックプロタミンをさらに
含有する。

【００４０】場合によっては、本発明の組成物は、上述されるもののような、保存剤、炭水
化物、安定剤もしくは界面活性剤のような慣習的な製薬学的成分を含有してよい
。

【００４１】本発明のＰＥＧで改変された構築物（上述されるように処方されようとそうで
なかろうと）、および／または長期貯蔵のための処方された組成物（ＰＥＧで改
変された構築物を用いて製造されたにしろもしくは他の構築物を用いて製造され
たにしろ）を包含する本発明の組成物は、当業者に既知の方法を使用して送達さ
せてよい。ＰＥＧで改変されたベクター（もしくは他の構築物）が凍結乾燥され
ている場合には、ベクターは、当業者に既知の方法を使用して容易に再構成する
ことができる。例えば、Ｌ．ＲｅｙとＪ．Ｃ．Ｍａｙ、“Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙ
ｉｎｇ／ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ”，ＤｒｕｇｓａｎｄｔｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．９６、１
９９９、マルセルデッカー（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ）：ニューヨーク州
ニューヨーク；Ｍ．Ｊ．Ｐｉｋａｌ、“Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇｏｆＰ
ｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｐａｒｔ１：ＰｒｏｃｅｓｓＤｅｓｉｇｎ．、Ｂｉｏｐｈａｒｍ、１９９０年９月：ｐ．１８−２７；Ｍ．Ｊ．Ｐｉｋａｌ、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、３（８）：２８−３１（１９９０）を参照されたい。本発明の方法本発明は、ＰＥＧで改変された構築物を患者に送達させることによるヒトもし
くは家畜の患者へのトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）もしくは他の分子の
送達方法を提供する。標的細胞は、標的細胞の選択およびそのために患者が治療
されている病状のような因子を考慮に入れて、インビボもしくはエクスビボで形
質導入してよい。便宜上、以下の論考はＰＥＧで改変されたウイルスベクターに
よるトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の送達に言及するであろう。しかし
ながら、これらの方法は、他のＰＥＧで改変された構築物、および本発明の他の
組成物を送達させるのに使用してもまたよい。Ａ．インビボトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のインビボ送達のためには、標的器官
、組織もしくは部位への直接送達、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、膣、直
腸および経口投与を包含する、いずれかの適する投与経路を使用してよい。投与
経路は反復される治療もしくは免疫感作の経過内で組み合わせてよい。

【００４２】ＰＥＧで改変されたウイルスの適する用量は、治療されている病状、家畜もし
くはヒト患者の健康状態、齢および体重、ならびに他の関係する因子に依存して
、当業者により容易に決定することができる。しかしながら、一般には、適する
用量は、約８０ｋｇの重量を有する成体について、１用量あたり、１０³ないし
１０¹⁸、好ましくは約１０⁵ないし１０¹⁶個の粒子の範囲にあってよい。この用
量を、上述されるとおり（例えば、約０．０１ｍＬないし約１ｍＬの生理学的に
適合性の担体に懸濁して）製薬学的組成物に処方し、かつ、いずれかの適する手
段により送達させてよい。用量は、毎日、毎週、毎月、もしくは他の選択された
間隔で、必要とされるもしくは所望のように反復してよい。Ｂ．エクスビボ別の態様において、本発明のＰＥＧで改変されたウイルスは、標的細胞のエク
スビボ形質導入に有用である。一般に、エクスビボ療法は、標的細胞を含有する
細胞の集団の除去、該細胞のインビトロでの形質導入、およびその後形質導入さ
れた細胞のヒトもしくは家畜の患者への再注入を必要とする。こうしたエクスビ
ボ形質導入は、標的細胞が樹状細胞もしくはマクロファージである場合、および
／またはトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）もしくは送達されている他の分
子が高度に毒性である場合、例えば癌の治療で使用される数種の遺伝子の場合に
とりわけ望ましい。しかしながら、当業者は、送達されるべき標的細胞の型、送
達されるべき分子、治療されている病状、患者の状態などのような因子を考慮に
入れて、本発明のエクスビボ療法を容易に選択することができる。

【００４３】一般に、エクスビボ療法に使用される場合、標的にされる宿主細胞を、標的細
胞の集団中の各１０¹ないし１０¹⁰個の細胞について１０⁵個のウイルス粒子ない
し１０¹⁰個のウイルス粒子で感染させる。しかしながら、他の適するエクスビボ
投与のレベルは、当業者により容易に選択することができる。Ｃ．再投与一態様において、本発明は、ＭＰＥＧの活性化基が第一の投与のＰＥＧで改変
されたベクター上で利用される活性化基と異なる、本発明のＰＥＧで改変された
ベクターを使用して再投与もしくは反復送達が実施される、ＰＥＧで改変された
ウイルスベクターを介するトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の送達方法を
提供する。従って、本発明は、第一の活性化されたＭＰＥＧ（例えばトレシル−
ＭＰＥＧ）と結合されたＰＥＧで改変されたウイルスベクターを送達すること、
およびＭＰＥＧが第二の活性化されたＭＰＥＧ基（例えばコハク酸スクシンイミ
ジルＭＰＥＧ、ＳＳＰＥＧ）と結合されるＰＥＧで改変されたウイルスベクター
を用いる第二の送達を必要としてよい。あるいは、本発明のＰＥＧで改変された
ウイルスベクターを、ペギル化されない（ｎｏｎ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ウイル
スベクターを利用する投薬計画で使用してよい。従って、本発明のＰＥＧで改変
されたウイルスベクターは、ペギル化されないウイルスベクターの送達前に送達
させてよい。別の例において、本発明のＰＥＧで改変されたウイルスベクターの
送達が、ペギル化されないウイルスベクターでの前投与の後に続いてよい。

【００４４】以下の実施例は本発明の組成物の製造方法および本発明の方法を具体的に説明
するために提供される。これらの実施例は本発明の範囲を制限しない。当業者は
、特定の試薬および条件が以下の実施例中に概説されるとは言え、本発明の技術
思想および範囲により包含されることを意味される改変をなすことができること
を認識するであろう。実施例１−結合されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造Ａ．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製ＬａｃＺを含有するｒＡＡＶを、発表された方法により調製した。以下の研究
で使用されるｒＡＡＶ、ＡＡＶＣＭＶＬａｃＺは、ヒトサイトメガロウイルス（
ＣＭＶ）プロモーターの制御下で発現される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラク
トシダーゼレポーター遺伝子に隣接するＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含有す
る。これらの研究で使用された別のｒＡＡＶはＡＡＶＡｌｂα１ＡＴであり、こ
れはアルブミンプロモーターの制御下で発現されるヒトα１−アンチトリプシン
（α１ＡＴ）遺伝子に隣接するＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含有する。これ
らを、記述される［Ｇ．−Ｐ．Ｇａｏら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、９：
２３５３−２３６２（１９９８）］とおり、Ｂ５０細胞系を使用して製造した。

【００４５】Ｂ５０細胞（ＡＡＶＲｅｐ／Ｃａｐタンパク質を発現するＨｅＬａに基づく
細胞系）を、１０の感染多重度で野性型Ａｄ５に２４時間、そしてその後同一の
感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄ−ＡＡＶハイブリッドベクター［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈ
ｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０：５２０−５３２（１９９６）］に追加の４８時
間、感染させた。この時点で細胞を収穫し、１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．１に
再懸濁し、そしてドライアイス／エタノールおよび３７℃浴中での３回の凍結／
融解周期により溶解した。ベンゾナーゼ（ニューコメッドファーマ（Ｎｕｃｏ
ｍｅｄＰｈａｒｍａ）、純粋等級）を混合物に添加し（５０Ｕ／ｍｌ、最終濃
度）、そしてライセートを３７℃で３０分間インキュベートした。ライセートを
３７００ｇで２０分間の遠心分離により澄明にし、そして上清を収集した。確立
された方法［Ｓ．Ｚｏｌｏｔｕｋｉｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、６：９７３−
９８５（１９９９）］に従って、ライセートを、２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５
）、２５０ｍＭＮａＣｌで平衡化されたＰＯＲＯＳＨＥ２０（パースペク
ティブバイオシステムズ（ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
）カラムに負荷した。ライセートが樹脂に進入した後に、カラムを１０カラム容
積の平衡緩衝液で洗浄した。ベクターを、２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ５．５）４０
０ｍＭＮａＣｌで該カラムからＰＯＲＯＳ５０ＰＩカラム上に直接溶出し
た。第二のカラムからの画分を収集し、濃縮し、そして５６℃で１０分間インキ
ュベートして調製物中のいかなる残余のアデノウイルスも不活性化した。Ｂ．ウイルスベクターの結合ポリエチレングリコール（およそＭＷ５０００）のモノメトキシ誘導体を、
ｒＡＡＶ粒子への結合のため選んだ。この化合物は最初に、結合反応の前に化学
的に活性化しなければならない。３つの型の活性化されたモノメトキシポリエチ
レングリコール（ＭＰＥＧ）、すなわちトレシル−ＭＰＥＧ（ＴＭＰＥＧ）、コ
ハク酸スクシンイミジルＭＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）および塩化シアヌルＭＰＥＧ
（ＣＣ−ＭＰＥＧ）を本研究で使用した。全部の活性化されたＰＥＧはシグマ
ケミカルズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミズーリ州セントルイス）か
ら得た。全部の場合で、結合反応は、確立された方法［Ｄｅｌｇａｄｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２：１１９−１２８（１９９
０）；Ｋｉｔａ、ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ＆Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、６：１５７
−１６７（１９９０）；Ｊａｃｋｓｏｎ、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．、１６５：１１４−１２７（１９８７）］の変法を使用して実施した。ＴＭ
ＰＥＧとの結合のために、カラムで精製されたＡＡＶを、１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液ｐＨ７．４中で透析した。ウイルスのバンドを、ＳＳ−ＰＥＧおよびＣ
Ｃ−ＰＥＧとの結合反応のために、それぞれ０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７
．２）および０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．２）緩衝液中に脱塩した。
発明者らは、各型のＰＥＧによる結合について、１０：１（３００μｇ／３ｍｇ
）のＰＥＧ：ウイルス比（ａｍｔＰＥＧ：ａｍｔＡＡＶタンパク質）が、高
度に効率的な反応時間を提供し、かつ、ウイルスの感染性の最小限の喪失を生じ
たことを見出した。ウイルスに共有結合することができないポリマー、活性化さ
れないＭＰＥＧと混合されたＡＡＶが、全部のインビトロおよびインビボ形質導
入実験の対照としてはたらいた。全部の結合反応は穏やかな攪拌下に室温で実施
した。反応を、１０倍過剰（ＰＥＧ濃度に関して）のＬ−リシンの添加により停
止した。反応されないＰＥＧ、過剰のリシンおよび反応副生成物は、調製物を、
１０ｍＭカリウム緩衝生理的食塩水（ＫＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化されたセフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０カラムを通過させることにより排除し
た。ウイルスを含有する画分を２６０ｎｍでのＵＶ分光測光的分析により同定し
、そしてさらなる研究のため合わせた。実施例２−結合されたおよび結合されないウイルスの感染性アッセイ結合されたおよび結合されないＡＡＶのアリコートを、２％ＦＢＳで補充され
たＤＭＥＭ中で連続的に希釈し、そして２９３細胞に添加した。感染２時間後に
調製物を除去しかつ完全培地で置き換えた。感染２０時間後に細胞をＰＢＳで洗
浄し、０．５％グルタルアルデヒドで固定し、そして１ｍＭＭｇＣｌ₂を含有
するＰＢＳで２回洗浄した。β−ガラクトシダーぜ発現を、３７℃で暗所で２時
間の、５ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆、５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆・３Ｈ₂Ｏおよび
１ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの基質、５−ブロモ−４
クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）とのインキュベーシ
ョンにより測定した。Ｌａｃ⁺細胞を、最少で２０顕微鏡野から被覆した。感染
性パーセントは、試験の開始時のＬａｃ⁺細胞の数に対する多様な時間点でのＬ
ａｃ⁺細胞の数の比を計算することにより決定した。

【００４６】結合されないＡＡＶは、反応期間全体にわたって力価の最も有意の喪失（２９
％）を経験した。ＣＣＰＥＧベクターは、天然のウイルスのものに類似の喪失を
伴い、全部のＰＥＧ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）調製物のうち最も少なく安
定であった。調製物へのＰＥＧの単純な添加はウイルス力価を損なわなかった。
ウイルス調製物への活性化されないＭＰＥＧの添加は感染性に有意に影響を及ぼ
さなかったからである。さらなる検討に際して、ＣＣＰＥＧベクターの感染性の
喪失が複数のビリオンの架橋による大型の凝集物の形成に帰される可能性がある
ことが見出された。しかしながら、より短い時間の期間、ベクターをＣＣＰＥＧ
と反応させることは、より少ない凝集物を生じ、そして、１００％未満の改変が
達成されたとしても、形質導入効率および安定性は大きく高められる。実施例３−フルオレスカミンアッセイフルオレスカミンアッセイを使用して、活性化されたポリエチレングリコール
によるＡＡＶキャプシドの改変の程度を推定した。該アッセイは確立された方法
［Ｓｔｏｃｋｓ、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．、１５４：２３２−
２３４（１９８６）］の変法を使用して実施した。サンプルを、結合反応の開始
後３０、６０、９０、１２０および４８０分に採取した。連続的希釈物を、１．
５ｍＬの容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中で各サンプルから
作成した。アセトン（０．５ｍｌ）中のフルオレスカミン（０．３ｍｇ／ｍｌ、
シグマケミカルズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ミズーリ州セントル
イス）を、ボルテックス攪拌しながら各希釈物に添加した。サンプルの蛍光を、
３９０ｎｍの励起波長および４７５ｎｍの発光で、分光蛍光計（フォトンテク
ノロジーインターナショナル（ＰｈｏｔｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ニュージャージー州マンモスジャンクション）で測定
した。生じる蛍光はウイルスキャプシド上の遊離アミノ基の濃度に比例する。標
準曲線を、タンパク質濃度対蛍光単位をプロットすることにより、各時間点につ
いて生成させた。改変の程度は、類似の時間点での結合されたウイルスの傾きと
結合されないウイルスの傾きの間の比として得た。

【００４７】

【表１】

【００４８】ＣＣＰＥＧとの反応は６０分後（力価が１０％未満だけ下落しかつ凝集物がほ
とんど形成していなかった時点）に完了した。ＡＡＶの形質導入効率は、反応期
間全体にわたってＴＭＰＥＧとの結合により高められた。この反応は３０分で完
了した。ＳＳＰＥＧとのＡＡＶの結合は、反応期間全体にわたる力価の最小限の
喪失を伴い、１５分以内で完了した。実施例４−ＰＥＧ化されたＡＡＶ調製物の特徴づけ数種の物理的試験を実施して、活性化されたＰＥＧ分子がＡＡＶキャプシドに
成功裏に結合されたことを確認した。Ａ．分配アッセイ天然のおよびＰＥＧ化されたウイルスの分配係数を、既に記述された［Ｄｅｌ
ｇａｄｏ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．、２９：２３
７−２５０（１９９４）］とおり測定した。分配アッセイは、０．１５ＭＮａ
Ｃｌを含有する０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中に、４．７５
％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ８０００（シグマケミカルズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）、ミズーリ州セントルイス）および４．７５％デキストランＴ５００（
アマーシャムファルマシアバイオテック（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）の二層系１ｇ
を含有する単一の微小遠心管中、２５℃で実施した。二層系は、４０％ＰＥＧ、
２０％デキストラン、０．４４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８および０
．６Ｍ塩化ナトリウムのストック溶液から調製した。ＡＡＶおよびＰＥＧ化され
たＡＡＶを、相を調製するのに使用された０．１ｇの水を０．１ｇの結合緩衝液
中のウイルスで置き換えることにより系中に組み込んだ。サンプルを倒置により
３０〜４０回混合し、そして層の完全な分離が達成されるまで重力下に静置した
ままとした。上層および下層からのアリコートを、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）タンパク質アッセイ試薬および標準としてウシ血清アルブミンを用いるマイ
クロプレートアッセイによりタンパク質濃度について分析した。分配係数（Ｋ）
は、上層および下層中のタンパク質濃度の間の比により決定する。

【００４９】

【表２】

【００５０】水性の二層系中のウイルス調製物の分配、および分配係数（Ｋ）の計算は、Ｐ
ＥＧ化がウイルスキャプシドを有意に改変したことを立証した。Ｋ値は、標識さ
れないウイルスについての０．６８から、ＣＣＰＥＧおよびＳＳＰＥＧ調製物に
ついてそれぞれ１．２６および１．０１に移動した。ＴＭＰＥＧ調製物は、１．
３７のＫ値を伴い、最高レベルの結合を立証した。Ｂ．ゼータ電位各ＰＥＧ化されたウイルス調製物のゼータ電子（電気泳動の移動度）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４中の２５倍希釈物で、既に記述されたとお
り、サーモスタットで調温された（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｚｅｄ）微小電気泳
動セル中でレーザードップラー風速測定（ゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ
）３０００、マルバーンインストゥルメンツ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ）、マサチューセッツ州サウスボロ）により測定した。各報告される
値は３回の別個の測定値の平均である。

【００５１】ＡＡＶキャプシドの表面電荷は、ＰＥＧ化過程により効果的に変えられた。ゼ
ータ電位レベルが、天然のベクターについて−９．２ｍＶから、ＴＭＰＥＧおよ
びＳＳＰＥＧに結合された場合にそれぞれ−６．４ｍＶおよび−５．９ｍＶまで
変化したからである。ＣＣＰＥＧ調製物は、−５．１ｍＶまでの中性に向かう最
大の移動を立証した。Ｃ．電子顕微鏡検査結合されたウイルス粒子のアリコートを、１％グルタルアルデヒド、０．０５
Ｍカコジル酸緩衝液ｐＨ７．４中、室温で１０分間固定した。溶液を２００メッ
シュの炭素被覆された格子（エレクトロンマイクロスコピーサイエンシーズ
（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）、フィラデル
フィア州フォートワシントン）の上に広げた。１０分後、過剰の懸濁液を濾紙で
格子から逃がした。格子を２％酢酸ウラニルで１分間染色し、すすぎ、かつ乾燥
させた。ウイルス粒子を、フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＣＭ−１０透過型電
子顕微鏡（オランダ・アイントホーフェン）を使用して見た。

【００５２】３回の別個の動物研究でのＰＥＧ化されたＡＡＶの平均粒子径を以下の表に提
供する。

【００５３】

【表３】

【００５４】実施例５−中和アッセイ本発明のＰＥＧ改変方法（すなわち「ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）」）
が中和抗体（ＮＡＢ）の存在下でＡＡＶ形質導入効率を保存することができたか
どうかを決定するため、結合されたＡＡＶ調製物を、複数用量のＡＡＶ（１×１
０¹²個の粒子）を既に与えられたＣ５７ＢＬ／６マウスからの血清、もしくは免
疫化されないＣ５７ＢＬ／６マウスからの血清の存在下でインキュベートした。

【００５５】２００マイクロリットルのアリコート（５０の感染多重度に同等）を、三重で
８４−３１細胞（２９３に基づくＥ１／Ｅ４を補完する細胞系）に適用した。２
時間のインキュベーション後にベクターを完全培地で置き換えた。感染４８時間
後に細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定し、
そして１ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するＰＢＳで２回洗浄した。形質導入レベルは
、非免疫血清とともにインキュベートされたウイルスにより形質導入された細胞
に対する、免疫血清とともにインキュベートされたウイルスにより形質導入され
た細胞の比として報告する。

【００５６】ＰＥＧ化されたベクターの形質導入効率は、１００倍および１０００倍希釈の
免疫血清の存在により影響を及ぼされなかった一方、結合されない調製物のもの
はそれぞれ４９％および３２％だけ減少した。最高の希釈で、ＰＥＧ化されたベ
クターの形質導入効率はおよそ３０％だけ下降したが、しかし、結合されないウ
イルスのものより有意により高かった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検体、ｐ≦０．０１
）。

【００５７】マウス血清を、補体を不活性化するための５６℃で３０分間のインキュベーシ
ョン、次いで２０倍希釈から開始する２倍の増大でのＤＭＥＭでの希釈により、
ＮＡＢについて分析した。各希釈物（１００μｌ）をウイルスと混合し、３７℃
で１時間インキュベートし、そして９６穴プレート中の８４−３１細胞に適用し
た（ウェルあたり２×１０⁴個の細胞）。３７℃で１時間後に、２０％ＦＢＳで
補充されたＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルに添加した。細胞を２４時間インキュ
ベートし、そして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現をフルオロイメージング
（ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎｇ）（モレキュラーダイナミックス（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ））により測定する。ＮＡＢの力価を、細胞の５０
％が緑色に染色した最高の希釈として計算する。

【００５８】抗ＡＡＶＮＡＢは、ＴＭＰＥＧおよびＳＳＰＥＧに結合されたベクターの投
与後にそれぞれ２０％および５０％だけ低下した。ＣＣＰＥＧ調製物はこの応用
について最も少なく効率的なベクターであり、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｅ）のレベルは、全部の時点で他のベクターより１０倍下に、かつ注入６０日
後に検出不可能なレベルまで下降した。ＮＡＢレベルはこの調製物により穏やか
にのみ低下した。実施例６−免疫適格動物へのＰＥＧで改変されたベクターの投与以下の研究は、本発明のＰＥＧ化が、免疫適格動物の筋もしくは肝に投与され
る場合にＡＡＶの形質導入効率に影響を及ぼさないことを立証する。

【００５９】Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^b）マウス（６〜８週齢）はジャクソンラボラトリ
ーズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（メーン州バーハーバー）
から購入した。ＡＡＶ形質導入に対しＰＥＧ化が有するの影響を決定するために
、結合されない本来のＡＡＶａｌｂα１ＡＴもしくはＡＡＶＣＭＶｌａｃＺ（上
述されたと同一の、多様なポリエチレングリコールと結合されたウイルス）、お
よび活性化されないＭＰＥＧと混合されたウイルスを、筋肉内（５０μｌのＰＢ
Ｓ中５×１０¹⁰個の粒子）もしくは肝中（１００μｌのＰＢＳ中１×１０¹¹個の
粒子）のいずれかで投与した。動物を注入後１４日に剖検し、そして組織を半分
で分割し、ＯＴＣ化合物（マイルズディアグノスティックス（ＭｉｌｅｓＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナ州エクハート）を含有する剥離型（ｐｅ
ｅｌ−ａｗａｙｍｏｌｄ）中に迅速に浸積し、そして冷凍切片作成（ｃｒｙｏ
ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）のためにドライアイス／イソペンタン浴中で急速凍結し
た。残存する組織を冷ＤＭＥＭ中に入れ、そして下述されるとおり発現のアッセ
イのため処理した。Ａ．β−ｇａｌアッセイ処理された組織を、新たに安楽死された動物から摘出し、そして冷ＰＢＳ中で
２回洗浄する。多数のサンプルを処理する場合は、摘出された組織を冷ＤＭＥＭ
中で２時間を越えずに保存する。組織を、４ｍＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌ
ｏｃｋ）（ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ））、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルトニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭベンズア
ミジン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、５μｇ／ｍｌアプロチニン（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ））、１μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５ｍＭＥＤＴＡおよび０．５ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶解緩衝液（β−ｇａｌＥＬＩＳ
Ａキット、ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）とともに供給される）中ですすぐ。組織を、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａ
ｎ）ポリトロンを使用して１ｍｌの溶解緩衝液中でホモジェナイズする。均質化
後に、抽出物を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。澄明にされた上清
のタンパク質濃度を、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＤＣタンパク質アッセイ
試薬および標準としてウシ血清アルブミンを用いるマイクロプレートアッセイに
より測定した。抽出物をドライアイス／エタノール浴中で急速凍結し、そしてア
ッセイされるまで−８０℃で保存した。β−ｇａｌ濃度は、製造元の説明書に従
って、β−ｇａｌＥＬＩＳＡキット（ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に
より測定する。

【００６０】ＡＡＶＣＭＶｌａｃＺベクターの筋肉内注入後、ＴＭＰＥＧ、ＳＳＰＥＧおよ
び結合されないビリオンの初期形質導入効率は統計学的に有意でなく（Ｓｔｕｄ
ｅｎｔのｔ検体、ｐ≦０．０５）；各場合で、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｅ）の発現は一般に実験の期間の間安定であった。ＣＣＰＥＧ調製物は最も少
なく効率的であり、そして各時間点で他のベクターより１０倍下に低下したトラ
ンスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）レベルを生じ、遺伝子発現は注入後６０日に
検出不可能なレベルに下落した。本来のかもしくは結合されたかのいずれかの調
製物の筋肉内注入を受領した全部の動物は、ＡＡＶキャプシドタンパク質に対す
る高レベルの中和抗体を発生した。Ｂ．ヒトα−１アンチトリプシンアッセイマウス血清中のヒトα１ＡＴの濃度を、既に記述された［Ｗ．Ｄ．Ｘｉａｏら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：３９９４−４００３（１９９９）］ような酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。マイクロタイタープレート（マキシソー
プ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ））を、１００μｌのウサギ抗ヒト
α１ＡＴ抗体（１００倍、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で４℃で一夜被覆し、ブロッ
キングし、そして標準もしくはサンプルとともに４℃で一夜インキュベートした
。洗浄した後に、一次抗体（１０００倍、ヤギ抗ヒトα１ＡＴ、シグマ（Ｓｉｇ
ｍａ））を、捕捉された抗原とともに室温で２時間インキュベートした。二次抗
体（抗ヤギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１０，０
００倍）を室温で２時間添加した。ＡＢＴＳ試薬（ベーリンガーマンハイム（
ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））を添加し、そして濃度を４０５ｎ
ｍでの吸光度の読取りから決定した。アッセイの感度は０．３ないし３０ｎｇ／
ｍｌである。

【００６１】動物にＡＡＶａｌｂα１ＡＴベクターを静脈内に注入した場合、ＴＭＰＥＧお
よびＳＳＰＥＧ調製物のみが、遺伝子発現が安定状態に達した速度で本来のベク
ターと異なった。１×１０⁴ｎｇ／ｍｌのα１ＡＴに等しい遺伝子発現のピーク
レベルが、注入後１４日に評価される場合に、本来のベクター、ならびにＳＳＰ
ＥＧおよびＴＭＰＥＧ結合されたベクターについて示された。実施例７−ＡＡＶ特異的免疫グロブリンの分析マウスからの血清サンプルを、既に記述された［Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３：４４８−４５５（１９９９）］ようなＥＬＩＳＡ
によりＡＡＶ特異的なアイソタイプ特異的な免疫グロブリン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）について評価した。マイクロタイタープ
レート（マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）、ヌンク（Ｎｕｎｃ））を、０．１
重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中の１００μｌのＡＡＶ抗原（１ｍｌあたり５×１０ ¹⁰ 個の粒子）で４℃で一夜被覆し、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を
含有するＰＢＳで４回洗浄し、そして３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で室温で３
時間ブロッキングした。１００倍希釈の血清サンプルを、抗原で被覆されたプレ
ートに添加し、そして４℃で一夜インキュベートした。プレートを、０．０５％
トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有するＰＢＳで４回洗浄し、そして、１００
０倍希釈のビオチン結合ラット抗マウス抗ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、
ＩｇＧ３、ＩｇＭ（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア
州サンディエゴ）とともに室温で３時間インキュベートした。プレートを上のと
おり洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ結合アビジン（シグマケミカルカンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）、ミズーリ州
セントルイス）の１０，０００希釈物を室温で２時間添加した。４回洗浄の後に
、ジエタノールアミン緩衝液中のリン酸ｐ−ニトロフェニルを添加し（シグマ
ケミカルカンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）、ミ
ズーリ州セントルイス）、そして、光学密度を、マイクロプレートリーダー（ダ
イナテックラボラトリーズ（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
、ヴァージニア州シャンティイ）上で４０５ｎｍで読取った。

【００６２】抗ＡＡＶ抗体アイソタイプの特徴づけは、ＣＣＰＥＧ調製物がＩｇＧ１抗体（
Ｔｈ２経路に関連するもの）の産生を有意に高める唯一の製剤であったため、事
実はこのとおりであったことを示した。実施例８−免疫感作実験本発明によりペギル化されたｒＡＡＶを使用する免疫感作研究からの結果は、
本発明のペギル化されたｒＡＡＶが高められた遺伝子発現を可能にすることを立
証する。Ａ．ＰＥＧ化は本来のベクターへの前曝露後に免疫適格動物における有意の遺伝
子発現を見込む本明細書に示されるとおり、数種のＰＥＧ化されたベクターの形質導入効率は
、インビトロでの本来のベクターに対する中和抗体（ＮＡＢ）の存在により影響
を及ぼされない。この影響がインビボでもまた発生することができるかどうかを
決定するため、動物を、同一用量の天然のＡＡＶでの初期免疫感作後３０日に、
ＰＥＧ化されたベクター（１×１０¹¹個の粒子をｉ．ｖ．もしくは５×１０¹⁰個
の粒子をｉ．ｍ．）の第二の用量で攻撃した。第二のベクターは、筋肉内注入に
ついてＡＡＶＣＭＶｌａｃＺ、および静脈内注入についてＡＡＶａｌｂα１ＡＴ
であった。２用量の本来のベクターを筋肉内で受領した動物は、再攻撃に際して
有意のレベルの遺伝子発現を立証しなかった。ＴＭＰＥＧ調製物を受領した動物
は再投与に際して有意のレベルの遺伝子形質導入を有したとは言え、それは投与
を受けたことのない動物に比較しておよそ７．５倍低下した。ＳＳＰＥＧ調製物
で得られた遺伝子発現のレベルは実質的であったが、しかし投与を受けたことの
ない動物より１０倍より低かった。有意のレベルの遺伝子発現はＣＣＰＥＧ調製
物でもまたみられたが、しかしこれは最も少なく有効であった。

【００６３】２用量の天然のＡＡＶの投与は、静脈内で、第二のベクターに従う有意のレベ
ルの遺伝子発現を生じさせることに失敗した。静脈内で送達された全部のＰＥＧ
化された調製物は、本来のベクターでの静脈内免疫感作後に高レベルの遺伝子移
入を生じ、それは投与を受けたことのない動物で観察されたものに類似であり、
ＴＭＰＥＧについて投与を受けたことがないものの１００％から、ＣＣＰＥＧに
ついて本来のものの４０％までの範囲にわたった。Ｂ．ＰＥＧ化はＰＥＧ化されたウイルスへの前曝露後の免疫適格動物における結
合されないＡＡＶによる有意の遺伝子発現を見込む天然のウイルスでの遺伝子移入に対する、ＰＥＧ化されたベクターに対する体
液性免疫応答の影響を研究した。ＰＥＧ化されたＡＡＶの多様な調製物で免疫化
されたマウスに、５×１０¹⁰個の粒子の本来のベクターの第二の筋肉内注入を与
えた。有意のレベルの遺伝子発現が、抗ＡＡＶ抗体の存在にもかかわらず、ＣＣ
ＰＥＧおよびＳＳＰＥＧ調製物で免疫化された動物で検出された。ＴＭＰＥＧ調
製物で免疫化されたマウスは、天然のウイルスでの再攻撃に際して最も有意のレ
ベルの遺伝子発現を生じさせたが、しかし、なお、投与を受けたことのない動物
でみられるものよりいくぶん下であった。

【００６４】肝に向けられる天然のウイルスは、ＰＥＧ化されたＡＡＶで静脈内で免疫化さ
れた動物において、有意のレベルの遺伝子発現を生じさせた。ＳＳＰＥＧおよび
ＣＣＰＥＧ調製物で免疫化されたマウスは、α１ＡＴ血清レベルにより測定され
るような再投与に際しての有意のレベルの遺伝子発現を立証し、これは投与を受
けたことのない動物に投与された単回用量のベクターからみられるものより４２
％（ＳＳＰＥＧ）および２１％（ＣＣＰＥＧ）のみより低かった。本来のベクタ
ーは、ＴＭＰＥＧで免疫化された動物が投与前に本来のベクターに対する最高レ
ベルのＮＡＢを有したという事実にもかかわらず、それらの動物において最も有
意のレベルの遺伝子発現を生じさせた。Ｃ．ＰＥＧ化されたＡＡＶの反復される投与は肝で有意のレベルの遺伝子発現を
生じさせるが、しかし筋では生じさせないＣ５７ＢＬ／６は、ＰＥＧ化されたＡＡＶの２回の連続する筋肉内投与を受領
した。これらの実験の最終目標は、同一の型のＰＥＧ化されたベクターでの以前
の免疫感作後の特定の形態のＰＥＧ化されたＡＡＶでの遺伝子移入効率を評価す
ることであった。同一の型のＰＥＧ化されたベクターの再投与は、投与を受けた
ことのない動物への筋肉内注入に比較される場合に実質的に低下され、各ＰＥＧ
化されたベクターについて、ＣＣＰＥＧでの２０倍低下からＳＳＰＥＧでの２０
０倍低下までの範囲にわたった。全部の動物が有意の力価の抗ＡＡＶＮＡＢを
発生した。静脈内に投与される場合、ＣＣＰＥＧ調製物の２投与後の遺伝子発現
は、抗ＡＡＶＮＡＢの存在にもかかわらず、投与を受けたことのない動物でみ
られるものに同等のα１ＡＴ血清レベルを生じさせた。ＳＳＰＥＧ調製物は再投
与後にわずかに低下された遺伝子発現を生じさせた（すなわち投与を受けたこと
のない動物の５０％）。再投与に際してのＴＭＰＥＧ調製物の形質導入は、投与
を受けたことのない動物のものをしのいだ。実施例９−結合されたアデノウイルスベクターの製造 β−ガラクトシダーゼを発現するＥ１／Ｅ３を欠失されたアデノウイルスベク
ター（Ｈ５．０１０．ＣＭＶ．ＬａｃＺ）をこれらの研究に使用し、そして確立
された方法の変法を使用して２９３細胞中で増幅し、かつ、ＣｓＣｌ勾配上での
２回のバンド形成により細胞ライセートから精製した（ＧｒａｈａｍとＶａｎ
ｄｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６７（１９７３））。ウイルスの
アリコートを、エコノパック（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ）１０ＤＧ使い捨てクロマト
グラフィーカラム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキ
ュリーズ）上で脱塩し、そして至適の結合のためのそれぞれの緩衝液で平衡化し
た（下を参照されたい）。ウイルス濃度を、２６０ｎｍでのＵＶ分光測光的分析
により測定した。形質導入力価（すなわち、ＬａｃＺ形成単位もしくはｌｆｕ）
を、２９３細胞の限界希釈感染により決定した。結合されたおよび結合されない
双方のウイルスの粒子／ｌｆｕ比はおよそ１００であった。Ａｄ調製物のタンパ
ク質含量は、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＤＣタンパク質アッセイ試薬およ
び標準としてウシ血清アルブミンを用いるマイクロプレートアッセイにより測定
した。

【００６５】これらのアデノウイルスベクターを、実施例１Ｂに記述されるとおり、３つの
型の活性化されたＰＥＧと結合した。実施例１０−アデノウイルスキャプシドへの活性化されたＭＰＥＧの結合はウイ
ルス感染性の最小限の喪失を伴い迅速に起こるＴＭＰＥＧ−アデノウイルス（Ａｄ）調製物は、反応期間全体にわたってウイ
ルス力価を保持した一方、ＳＳＰＥＧ調製物は、結合反応が完了した場合に元の
力価の７０％を喪失した。ＳＳＰＥＧ反応の未熟な終了（すなわちそれが７０％
完了した７５分で）は、９０％の残余の活性をもつ調製物をもたらした。ＣＣＰ
ＥＧでのウイルスの改変は９０分で完了したが、しかしながら、元の感染性の１
１％のみが残存した。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ５０カラムでのこ
の調製物の分画は別個のウイルス集団を生じさせた。第一のピークは高感染性を
もつＰＥＧ化された単量体ウイルスを表した一方、第二のピークは低活性をもつ
凝集されたウイルス（電子顕微鏡検査および静的レーザー光散乱による、データ
は示されない）を含有した。第一のピークのみを単離し、そして付加的な研究で
使用した。Ａｄ調製物への活性化されないＭＰＥＧの添加は、緩衝液単独中での
ベクターに比較して、感染性に対する影響を有しなかった（データは示されない
）。

【００６６】ＣＣＰＥＧでの力価の有意の喪失は、ウイルスキャプシドでのポリマーの広範
囲の架橋による大型のウイルス凝集物の産生に帰することができる。これは２種
のアイソフォーム（単一のアミド結合によりタンパク質に結合することができる
１種、および標的タンパク質と２個のアミド結合を形成することが可能である別
の１種）の混合物として製造される。凝集物を除去すれば、残存するウイルス懸
濁物は、高度に感染性かつ多様な貯蔵条件下で極めて安定であると判明した。Ｓ
ＳＰＥＧ調製物もまた、室温で１時間の結合後に力価の有意の下落を経験した。
凝集現象はこの化合物で検出されなかったが、しかしながら、力価の喪失は単一
のリシン残基への複数のＳＳＰＥＧ分子の結合に帰することができた。有意の改
変を伴い実質的なウイルス感染性を維持するために、利用可能なリシン残基の７
０％を改変しかつ力価を維持した７５分の反応時間を選択した。これはウイルス
キャプシドを完全には改変しなかった唯一のプロトコルであった一方、結果とし
て生じるベクターは、免疫血清による中和を効率的に逃れかつ多様な貯蔵条件下
で他のＰＥＧ化された調製物に関して最高の力価を維持することができた。これ
らのデータは、このポリマーでのウイルスキャプシドの完全な改変が高度に効率
的なウイルスベクターの製造に対する厳格な要件でないことを示す。実施例１１−Ａｄ−ＰＥＧ複合物の特徴づけ活性化されたＰＥＧ分子がアデノウイルスキャプシドに成功裏に結合されたこ
とを確認するため、数種の物理的試験を実施した。分配アッセイおよびゼータ電
位は実施例４に記述されるとおり実施した。

【００６７】水性の二層系中でのウイルス調製物の分配、および分配係数（Ｋ）の計算は、
ウイルスキャプシドが有意に改変されたことを立証した。Ｋ値は、標識されない
ウイルスについて０．７から、ＴＭＰＥＧおよびＳＳＰＥＧ調製物についてそれ
ぞれ１．７６および１．９６まで移動した。ＣＣＰＥＧ調製物は、３．５６のＫ
値を伴い、最高レベルの結合を立証した。

【００６８】ゼータ電位分析は、アデノウイルスキャプシドの表面電荷が、ＴＭＰＥＧおよ
びＳＳＰＥＧに結合される場合に、−４８．１ｍＶからそれぞれ−２７．８およ
び−２４．２ｍＶまで有意に変化したことを示した。ＣＣＰＥＧ調製物は、−１
６．２ｍＶまでの中性に向かう最大の移動を立証した。実施例１２−アデノウイルス−ＰＥＧ複合物は免疫血清による中和から保護され
るＰＥＧ化された調製物を、アデノウイルスキャプシドタンパク質に対する中和
抗体の存在下でＨｅＬａ細胞に添加し、そして、形質導入レベルを、非免疫血清
中でインキュベートされた同一の調製物のものと比較した。この研究は、免疫血
清がアデノウイルスベクターの静脈内注入後２８日に収穫されたＣ５７ＢＬ／６
マウス由来であったことを除いて、本質的に上の実施例５に記述されるとおり実
施した。

【００６９】結合されないウイルスの形質導入効率は中和抗体により有意に低下した。ＴＭ
ＰＥＧ調製物はウイルスを中和から部分的に遮蔽した一方、ＳＳＰＥＧおよびＣ
ＣＰＥＧ調製物の形質導入は中和抗体の存在により影響を及ぼされなかった。実施例１３−ＰＥＧ化されたアデノウイルスの安定性下の研究に示されるとおり、ＭＰＥＧは、ＰＥＧ化反応中で使用されるものに
類似の濃度で添加された場合、４２℃および２５℃で、結合されないアデノウイ
ルスのものを越えてウイルスの安定性を拡大したが、しかし、ウイルス力価はＰ
ＥＧ化されたビリオンのものより実質的により低かった。沈殿物が最終的にこれ
らの調製物中で検出され、これが形質導入の喪失に有意に寄与した。しかしなが
ら、４℃のアデノウイルス製剤へのこの賦形剤の添加は、この温度でのキャプシ
ド集成を維持するその能力により、５ヶ月までの間、天然のウイルスのものを越
えて安定性を有意に高めた。ＰＥＧ化された調製物へのグリセロールの添加は、
−２０℃でのウイルスの安定性に影響を及ぼさなかった。この結果は、臨床使用
のための調製物からグリセロール（およびその関連する毒性）を排除することが
できるため、有望である。各ＰＥＧ化された調製物は４ヶ月にわたって約１対数
の力価を喪失したとはいえ、それらをいずれかの付加的凍結保護物質の非存在下
で保存した。炭水化物、界面活性剤および他の安定剤の添加は、安定性を高めか
つ力価の喪失を無視できるレベルまで低下させることができる。Ａ．ＰＥＧ化されたアデノウイルスは、多様な貯蔵条件下で、結合されないウイ
ルスより有意により安定である広範な温度でのウイルスを安定化させるＰＥＧ化の能力を評価した。調製物を
、１０％グリセロールの添加を伴いもしくは伴わずにカリウム緩衝生理的食塩水
（ＫＰＢＳ）中で−２０℃および４℃で保存した。結合されないアデノウイルス
は、４℃、８時間の貯蔵後に１対数の力価の下落を受け、貯蔵７日後に検出され
ないレベルまで下降した。ウイルスキャプシドのこの迅速な分解は電子顕微鏡検
査により容易に検出される。４℃で２４時間後、結合されないウイルス調製物は
主として単一のウイルスキャプシドタンパク質、大部分はヘキソンより成り；い
くつかのみの無傷のウイルス粒子を検出することができた。ＣＣＰＥＧ調製物は
残りの調製物のなかで最も少なく安定であった。力価が４℃で２４時間のインキ
ュベーション後に１対数下落したためである。電子顕微鏡写真は、貯蔵１２日後
に撮影された写真が無傷のビリオンを示すため、この調製物が、結合されないウ
イルスより有意により安定であるという明白な証拠を表す。ＴＭＰＥＧ調製物は
４℃で１週間で力価の無視できる喪失を立証し；４２日後、力価は２対数だけ下
落し、そして研究の持続期間の間、このレベルに留まった。この時点で、調製物
は主として無傷のウイルスキャプシドより成り、数個のみの損なわれたビリオン
を伴った。ＳＳＰＥＧ調製物は４℃で８時間後に１対数の力価の初期下落を受け
、そして１５０日までの間力価を維持した。この調製物は、４℃で貯蔵１２０日
後の電子顕微鏡検査による検分に際して、新たに精製されたビリオンと区別がつ
かなかった。

【００７０】 −２０℃でのＰＥＧ化された調製物の安定性試験は、グリセロールの添加が力
価の維持に必要でなかったことを示した。グリセロールの非存在下で、結合され
ないビリオンの力価はＫＰＢＳ中で−２０℃で１５日後に５．５対数下落した。
ウイルスの分解は、試験の残余の間、１ヶ月あたり１対数の速度で一定に継続し
た。１０％グリセロールの添加は安定性を有意に高めた。力価の１対数単位のみ
が、４ヶ月にわたって−２０℃で保存された結合されない調製物中で喪失された
ためである。ＳＳＰＥＧを結合されたビリオンは、−２０℃で１２０日にわたっ
て０．８対数の力価の下落を伴い、試験された全部の調製物のうち最も安定であ
り；グリセロールの添加は安定性をわずかにのみ高めた。ＴＭＰＥＧ調製物の力
価はグリセロールの添加に対し最も感受性であった。グリセロールを含まない調
製物は、貯蔵において９０日後に１対数の下落を立証した一方、グリセロールを
含有した調製物の力価は０．５対数単位のみ下落した。ＣＣＰＥＧビリオンは、
−２０℃で９０日の貯蔵後に感染性ウイルスの４対数の減少を伴い、最も少なく
安定であり；グリセロールは助けとならなかった。Ｂ．ＰＥＧ化は極端な貯蔵条件下でのアデノウイルスの安定性を高める４℃および−２０℃でのＰＥＧ化されたウイルス調製物の安定性データが非常
に有望であったとしても、これらの条件はなお、多様な臨床的場所への氷上の発
送を必要とするとみられる。周囲条件下でのベクターの発送の可能性を評価する
ために、サンプルをＫＰＢＳ中、２５℃および４２℃で保存した。２５℃での貯
蔵に際して、結合されないアデノウイルスは１日あたり１対数の速度で力価が下
落した。アデノウイルス調製物へのモノメトキシポリ（エチレン）グリコールの
添加は、１日あたり０．６対数単位の平均速度の力価の喪失を伴い、結合されな
いアデノウイルス調製物の安定性をわずかに高めた。

【００７１】ＣＣＰＥＧ調製物は室温で非常に安定であった。５．８４×１０¹⁰ｌｆｕ／ｍ
ｌから３．１８×１０¹⁰ｌｆｕ／ｍｌまでの力価の初期下落が６時間後に検出さ
れ、これはその後１週間安定した。ＴＭＰＥＧ調製物は２４時間安定であった一
方、ＳＳＰＥＧ調製物の力価は５日までの間一定に留まり、これはドライアイス
の非存在下でのベクターの優先発送を見込むとみられる。４２℃で保存された場
合、結合されないアデノウイルス調製物の力価は、当初、４５分ごとにおよそ１
対数の定常的速度で下降した。不活性化されたＭＰＥＧの添加は喪失を遅延させ
、これは最終的に３時間にわたって２対数減少した。ＴＭＰＥＧおよびＣＣＰＥ
Ｇ調製物は、試験期間にわたって１．５対数単位下降する力価を伴い、類似の分
解速度を立証した。ＳＳＰＥＧ調製物は、この条件で１８時間、力価の無視でき
る喪失を伴い、最も安定であった。ＳＳＰＥＧ調製物は、４２℃で８時間までの
間、力価の無視できる喪失を立証した。従って、本調製物は、力価の有意の喪失
を伴わずに出荷に際しての極端な温度への曝露を生き延びることができた。実施例１４−免疫適格動物へのＰＥＧ化されたアデノウイルスベクターの投与Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^b）マウス（６〜８週齢）をジャクソンラボラトリ
ーズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（メーン州バーハーバー）
から購入した。調製物は、尾静脈を介して（１００μｌのＫＰＢＳ中１×１０¹¹ 個の粒子）もしくは気管内で（５０μｌのＫＰＢＳ中５×１０¹⁰個の粒子）のい
ずれかで投与した。動物を４日後に剖検し、そして組織を摘出し、冷ＰＢＳ中で
２回洗浄し、そして処理のため冷ＤＭＥＭ中で保存した。組織を、ブリンクマン
（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロンを使用して１ｍｌの溶解緩衝液中でホモジェナ
イズした。抽出物を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清のタンパ
ク質濃度を、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＤＣタンパク質アッセイ試薬およ
び標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。抽出物をドライアイス中で
急速凍結し、そしてアッセイされるまで−８０℃で保存した。β−ｇａｌ濃度は
、製造元の説明書に従ってβ−ｇａｌＥＬＩＳＡキット（ベーリンガー−マン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて測定した。

【００７２】肺に投与された場合、結合されないウイルスは、１ｍｇのタンパク質あたり１
．４２×１０⁴±３．６×１０³ｐｇのβ−ガラクトシダーゼを産生した。ＣＣＰ
ＥＧおよびＳＳＰＥＧ調製物は、結合されないウイルスより２倍より高いβ−ガ
ラクトシダーゼ発現レベルを生じた。ＴＭＰＥＧ調製物は、β−ガラクトシダー
ゼの２．５倍の増大を伴い、形質導入の最大の増大を立証した。Ａｄ調製物への
不活性化されたＭＰＥＧの添加は、結合されないウイルスのものの３倍のレベル
まで形質導入を上昇させた。

【００７３】結合されないアデノウイルスの投与は、静脈内で、肝においてタンパク質１ｍ
ｇあたり３．０×１０⁶±１．１×１０⁵ｐｇのβ−ガラクトシダーゼレベルを生
じた。肝のインビボ形質導入は、ＴＭＰＥＧ、ＣＣＰＥＧおよびＳＳＰＥＧで６
倍より高かった。ウイルス調製物へのＭＰＥＧの添加は、形質導入レベルを、結
合されないウイルスのものを越えてわずかに上昇させた。

【００７４】アデノウイルスベクターのＰＥＧ化は、気管内もしくは静脈内に投与された場
合に、形質導入効率を高めた。この効果はいくぶん予期されなかった。ウイルス
キャプシド上に存在するリシン残基の大多数が、ウイルスの標的細胞への結合お
よび進入に必要である繊維およびペントンタンパク質上に集中されるからである
［（Ａｄａｍら、ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａＡｃａｄｅｍｉａｅＳｃｉｅｎｔｉａｒｕｍＨｕｎｇａｒｉｃａｅ、２４：１８１−１８７（
１９７７）、Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：１３２０−１３
２３（１９９７）、Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ、７３：３０９−３１９（１９
９３））］。しかしながら、ＰＥＧ化されたウイルスの新たな物理的特徴は、ウ
イルスの形質導入の観察された増大に寄与するかもしれない。ゼータ電位測定は
、アデノウイルスがキャプシド上に有意の負の電荷を担持することを示している
。ウイルスベクターの表面電荷は、多様な標的組織における形質導入のレベルに
有意に影響を及ぼす可能性がある（Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：６４７９−６４８９（１９９７））。アデノウイルスの形質導
入は、細胞表面上の負に荷電したシアル酸残基とウイルスとの間の静的反発によ
り阻害されることが見出されている（Ａｒｃａｓｏｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１７：４２２−４３５（１９９７））
。ＰＥＧ化はこの電荷の原因である基を効果的に遮蔽して、細胞膜とのウイルス
の非特異的相互作用に好都合であるとみられる環境を生じさせる。最終的なＰＥ
Ｇ化された調製物の粒子径測定もまた、各方法が、細胞単層と接触されるビリオ
ンの数を高めかつ結果として形質導入効率を増大させる可能性のある単一ウイル
ス粒子の懸濁物を生じさせたことを示した。ＰＥＧ化されたビリオンの分配係数
は、改変されたベクターが、細胞膜を通って無分別に分配する増大された能力を
見込むとみられる疎水性の環境に対する増大された親和性を有することを示す。
それによりＰＥＧ化されたアデノウイルスの形質導入効率が高められる機構を評
価する初期の研究はこの理論を支持する。分化した単層を横切るＰＥＧ化された
ベクターの浸透性が有意に高められるからである（データは示されない）。実施例１５−凍結および凍結乾燥されたウイルス調製物での使用のための処方の
評価ヒトの使用に許容できる２種の緩衝液、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ＤＰＢＳ
）および１０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＢＳ）緩衝生理的食塩水を、低温でｐＨ
を維持するそれらの能力について評価した。Ａ．多様な処方に対する温度の影響材料：米国薬局方ショ糖、β−シクロデキストリン、米国薬局方Ｄ−マンニト
ール、Ｄ（＋）トレハロース、モノラウリン酸ソルビタン（スパン（Ｓｐａｎ）
２０）およびリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズ
ーリ州セントルイス）から購入した。リン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）、リ
ン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）および米国薬局方塩化カリウムはＪＴベイ
カー（ＪＴＢａｋｅｒ）（ニュージャージー州フィリップスバーグ）から購入
した。米国薬局方グリセロールはＥＭサイエンス（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）（ニ
ュージャージー州ギブスタウン）から購入した。三級アミンβ−シクロデキスト
リンはセレスターＵＳＡインク（ＣｅｒｅｓｔａｒＵＳＡ，Ｉｎｃ．）（
インディアナ州ハモンド）から購入した。プルロニックブロックコポリマーＦ６
８はＢＡＳＦ株式会社（ニュージャージー州マウントオリーブ）により快く提供
された。万能ｐＨ指示薬はフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（フィラデルフィア州ピッツバーグ）から購入した。

【００７５】サンプル調製：全部の処方はＧＬＰ条件下で製造し、かつ、０．２２μｍフィ
ルター（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を通す濾過により滅菌した。全部の研
究について、２５０〜１０００μｌのアリコートを、オートクレーブされた３ｍ
ｌの透明なホウケイ酸ガラスバイアル（ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）、ニュー
ジャージー州ミルビル）に添加した。バイアルに、１３ｍｍ未漂白（ｇｒａｙ）
ブチルゴム栓（ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ））でふたをし、そして切り取り（
ｔｅａｒ−ｏｆｆ）アルミニウムシール（ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ））で封
止した。ｐＨ試験のために、１０μｌの万能ｐＨ指示薬を添加して、凍結の間の
ｐＨ変化をモニターした。

【００７６】ｐＨ試験：８サンプルを、記述されるとおりに各処方について調製した。４サ
ンプルは万能ｐＨ指示薬［Ｍ．Ａ．Ｃｒｏｙｌｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅ
ｃｈｎｏｌ．、３（３）：３７３−３８３（１９９８）；Ｓ．ＮｅｍａとＫ．Ｅ
．Ａｖｉｓ、Ｊ．ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、４７（２）：７６−８３（１９９３）］。残存するサンプルは指示薬を
含有せず、そして凍結後のウイルス力価を測定するのに使用した。サンプルを−
２０および−８０℃で１２時間凍結させた。凍結された生成物のｐＨを視覚的に
測定し、そして各処方について書き留めた。指示薬を含有しないサンプルを２５
℃にゆっくりと加温し、そしてウイルスの効力について評価した。結果を下の表
４に示す。

【００７７】

【表４】

【００７８】リン酸ナトリウム緩衝生理的食塩水のｐＨは、−２０℃で凍結された場合にｐ
Ｈ７．４から５．０へ、また−８０℃でｐＨ４に下落した（上の表を参照された
い）。緩衝液へのグリセロールの添加は凍結に際してのｐＨの下落を予防しなか
った。示差走査熱量測定は、ｐＨのこの変化が凍結の間の緩衝剤成分の沈殿に関
連することを立証した。緩衝液へのショ糖もしくはトレハロースの添加は−８０
℃でこの現象を予防することができなかったが、しかし、１Ｍ濃度の各糖は−２
０℃で劇的なｐＨ変化を予防した。リン酸カリウム緩衝液は、−２０℃でリン酸
ナトリウム緩衝液（ＤＰＢＳ）でみられたようなｐＨの有意の変化を立証しなか
ったが、しかし、−８０℃でｐＨの類似の下落を経験した。凍結保護物質の添加
は調製物の最終的なｐＨに有意に影響を及ぼさなかった。しかしながら、各緩衝
系について、三級アミンβ−シクロデキストリン（ＴＭＢＣＤ）が凍結に際して
生理学的ｐＨを維持することができたことに注目することが重要である。Ｂ．ウイルスベクターを含有する多様な処方に対する温度の影響ウイルスを以下の様式で処方し、そしてそれぞれの温度で１２時間凍結させた
。サンプルを２５℃で融解し、そして、ｐＨの変化が物理的安定性に有意に影響
を及ぼすのかどうかを決定するためにウイルス力価を評価した。

【００７９】以下の実施例を通じて使用されるところのｌａｃ形成単位（ｌｆｕ）という用
語は、限界希釈、２９３細胞［もしくは、ＡＡＶの場合にアデノウイルスＥ１お
よびＥ４を発現する細胞系、８４−３１細胞（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９６））］の感染、組織化学的染色な
らびにｌａｃ⁺細胞の視覚的同定により測定されるような、β−ガラクトシダー
ゼ（ｌａｃＺ）を発現するウイルスの調製物中に存在する感染性のウイルス粒子
の数を定義する。サンプルは、２％ウシ胎児血清を補充されたＤＭＥＭで連続的
に希釈した。培地を、ウェルあたり１．５×１０⁴個の細胞を植え付けられた１
２穴プレートから除去し、そして０．２ｍｌの適切な希釈物を単層上に置いた。
３７℃で２時間後に、２ｍｌの完全培地を各ウェルに添加し、そして感染を３７
℃で１６時間継続した。この時点で培地を除去し、そして、細胞を以前に記述さ
れた［Ｍ．Ａ．Ｃｒｏｙｌｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３（
３）：３６５−３７２（１９９８）］とおりβ−ガラクトシダーゼ発現について
染色した。ｌａｃ⁺細胞を最少で２０顕微鏡野（およそ４８，０００個の細胞）
から数え上げた。ｌａｃ形成単位は以前に記述された［Ｍ．Ａ．Ｃｒｏｙｌｅら
、ＰｈａｒｍＤｅｖＴｅｃｈｎｏｌ、３（３）：３７３−３８３（１９９８
）］とおり計算した。アッセイの感度は１０ないし１×１０¹²ｌｆｕ／ｍｌであ
った。１．アデノウイルスの調製ＣＭＶプロモーターの制御下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダー
ゼを発現する第一世代のアデノウイルスを、確立された方法［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈ
ａｍとＡ．Ｊ．ｖａｎｄｅｒＥｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６
７（１９７３）］の変法を使用して２９３細胞中で増幅した。ウイルスを、Ｃｓ
Ｃｌ勾配上で２回バンド形成すること、次いで、各それぞれの処方で平衡化され
たエコノパック（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ）１０ＤＧ使い捨てクロマトグラフィーカ
ラム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上
で脱塩することにより、細胞ライセートから精製した。ウイルスの濃度を、２６
０ｎｍでのＵＶ分光測光的分析およびｌａｃ形成アッセイにより決定した。全部
の実験は新たに精製されたアデノウイルスで実施した。２．アデノ随伴ウイルスの調製ＣＭＶプロモーターの制御下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を発現する組換えＡＡＶ２の産生は、１：１：２の比のｃｉｓプラスミ
ド（ＡＡＶＩＴＲを含むｐＡＡＶｌａｃＺ）、ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＡＶ
２ＲｅｐおよびＡＡＶ１Ｃａｐを含有するｐ５Ｅ１８［Ｗ．Ｘｉａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（５）：３９９４−４００３（１９９９）］）、ならびに
ヘルパープラスミド（ｐｆΔ１３、欠失された後期遺伝子の大部分かつＥ２ｂ領
域の８ｋｂの欠失を伴うアデノウイルスプラスミド）で、１５０ｍｍ皿中の６０
％コンフルエントの２９３細胞をトランスフェクションすることを必要とした。
トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法により実施した。トランスフェ
クションの９６時間後に細胞を収穫し、そして以前に記述された［Ｋ．Ｊ．Ｆｉ
ｓｈｅｒら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、３：３０６−３１２（１９９７
）］ような２回のＣｓＣｌ勾配精製にかけた。ウイルスを、それぞれの処方に対
する透析により脱塩した。３．結果アデノウイルス調製物は、凍結に際してのｐＨ変化に対し極めて感受性であっ
た（図１Ａ）。当初のｐＨ（７．４）を維持した調製物は、融解に際しての力価
の有意の下落を経験しなかった。３ｐＨ単位の下落を受けた調製物は力価の１対
数の喪失を被った。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、凍結に際してのｐＨ変化
に対しアデノウイルスと同じくらい感受性ではなかった（図１Ｂ）。凍結に際し
て３ｐＨ単位の下落を経験したＡＡＶ調製物は０．５対数の感染性ウイルスを喪
失した。上に述べられたとおり、リン酸カリウム緩衝生理的食塩水は、−２０℃
で凍結される場合に、リン酸ナトリウム緩衝生理的食塩水より大きな程度までｐ
Ｈを維持した。この緩衝系中で１０％グリセロール中に保存されたアデノウイル
スは、リン酸ナトリウム緩衝調製物を上回る優れた安定性を立証した。結果とし
て、リン酸カリウム緩衝生理的食塩水は、別に示されない限り、全部の処方に選
択すべき緩衝液であった。実施例１６−−２０℃および４℃でのアデノウイルス製剤の安定性低温でｐＨを維持する能力について潜在的な処方および緩衝系をスクリーニン
グした後に、処方されたウイルスの大スケール調製物を２年の期間、−２０およ
び４℃で保存した。貯蔵前に、ウイルス力価をｌａｃ形成アッセイにより測定し
た（ｔ＝０）。各製剤中でのベクターの実時間安定性を評価するために、各ロッ
トからの４〜６本のバイアルを取り出し、そして形質導入効率について評価した
。各製剤のウイルス力価を、ＫＰＢＳ中で−２０℃で保存された同一ロット中で
生じられたウイルスからの力価と比較した。使用期限は、製薬工業での標準的実
務［Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．、ＤｒｕｇＳｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｓ．第２版、ＤｒｕｇｓａｎｄｔｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．Ｖｏｌ．６８．１
９９５、ニューヨーク州ニューヨーク：マルセルデッカーインク（Ｍａｒｃ
ｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）；整合化国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＨａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）、ＨａｒｍｏｎｉｚｅｄＴｒｉｐａｒｔｉｔｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅ，ＳｔａｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇｏｆＮｅｗＤｒｕｇＳｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｓ、１９９３；米国食品医薬品局薬物・生物製剤セン
ター（ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｒｕｇｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃｓＦＤ
Ａ）、ガイドライン（１９８７）：ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｆｏｒＳｕｂｍｉｔｔｉｎｇＤｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＨｕｍａｎＤｒｕｇｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、１９８７：メ
リーランド州ロックビル］がそうであるとおり、力価がその元の値の９０％に下
降した（すなわち１０％の喪失（０．１対数）を被った）時点で各調製物に割り
当てた。

【００８０】

【表５】

【００８１】グリセロール調製物は−２０℃で最も少なく安定であった。リン酸ナトリウム
緩衝調製物は２日で元の力価の１０％を喪失した（表５）。リン酸カリウム緩衝
液はウイルスの貯蔵寿命を１２日に延長した。グリセロールを除去しかつショ糖
を調製物に添加した場合に、力価はおよそ１ヶ月間下落しなかった。製剤へのシ
クロデキストリンの添加は、貯蔵寿命を、３６０（β−シクロデキストリン）お
よび６９０（三級アミンβ−シクロデキストリン）日に延長し、これは−８０℃
でのグリセロール中のウイルスのもの（〜３７日、報告されない観察結果）より
有意により長い。

【００８２】

【表６】

【００８３】４℃で保存された全部の製剤はウイルスの安定性を有意に高めた（表２）。β
−シクロデキストリンおよび界面活性剤を含有するショ糖製剤は、およそ１ヶ月
間、力価の有意の下落を表さなかった。実施例１７−ＡＡＶ製剤の安定性アデノ随伴ウイルスを用いた初期安定性の研究は、このウイルスがアデノウイ
ルスより有意により安定であることを立証した。

【００８４】

【表７】

【００８５】リン酸ナトリウム緩衝生理的食塩水中４℃で保存された調製物が０．１対数の
感染性ウイルスを喪失するのにおよそ４ヶ月かかった（表７）。類似の結果が２
５℃でみられた。ショ糖、マンニトール、スパン（Ｓｐａｎ）２０およびプロタ
ミンより成る製剤は、４および２５℃でＡＡＶの安定性を５ヶ月に延長した。類
似の有効期限が、この製剤で−２０および−８０℃でもまた示された。実施例１８−インビボでの形質導入効率に対する製剤の影響アデノウイルスベクターは多くの遺伝子治療の応用に適するため、われわれは
Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの筋肉内、静脈内および気管内注入後の形質導入効率に
対するこれらの製剤の影響を研究した。処方されたウイルスの形質導入効率を、
リン酸緩衝生理的食塩水、およびウイルスベクターの前臨床試験で普遍的に使用
される標準的な２％グリセロール調製物中のベクターと比較した［Ｆ．Ｂｏｒｅ
ｌｌｉｎｉとＪ．Ｍ．Ｏｓｔｒｏｖｅ、“ＴｈｅＴｒａｎｓｆｅｒｏｆＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｒｏｍｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｔｏｔｈｅ
Ｃｌｉｎｉｃ：ＩｎＰｒｏｃｅｓｓＣｏｎｔｒｏｌｓａｎｄＦｉｎａ
ｌＰｒｏｄｕｃｔＴｅｓｔｉｎｇ”，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ａ．Ｍｅａｇｅｒ、編者、１９９９、ジョンワイリーアンドサンズ（
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）：英国ウェストサセックス中、ｐ．３５
９−３７３］。５％グリセロール製剤もまた、それによりわれわれの製剤を比較
するための半毒性対照として包含した。Ａ．処方されたウイルスのインビボ試験Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）はジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃ
ｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（メーン州バーハーバー）から購入した
。調製物は、尾静脈を介して（１００μｌの製剤中１×１０¹¹個の粒子）、気管
内（５０μｌ中５×１０¹⁰個の粒子）もしくは筋肉内（５０μｌ中５×１０¹⁰個
の粒子）のいずれかで投与した。各群からの４匹の動物を、注入後４日（静脈内
および気管内）もしくは７日（筋肉内）のいずれかに剖検した。組織を、ブリン
クマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロンを使用して１ｍｌの溶解緩衝液中でホモ
ジェナイズした。抽出物を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清中
のタンパク質濃度を、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＤＣタンパク質アッセイ
試薬および標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。抽出物をドライア
イス中で急速凍結させ、そしてアッセイされるまで−８０℃で保存した。β−ｇ
ａｌ濃度は、製造元の説明書に従ってβ−ｇａｌＥＬＩＳＡキット（ベーリン
ガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて測定
した。血液サンプルを、外部の契約試験所（アンテック（Ａｎｔｅｃｈ）、ニュ
ーヨーク州ニューヨーク）による肝機能の評価のため、注入後４および７日に眼
窩後洞を介して、各群の残存する動物から収集した。全部の動物は、基礎のＬＦ
Ｔの評価のため、研究の開始前に採血した。Ｂ．結果トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）発現の有意の増大が、ショ糖／β−シ
クロデキストリンおよび５％グリセロール製剤の筋肉内注入後に検出された。他
の製剤は筋中での遺伝子発現を果たさず、かつ、十分に耐えられた。ショ糖／三
級アミンβ−シクロデキストリン製剤が肺でのウイルスの形質導入効率を高めた
一方、形質導入効率は５％グリセロール調製物により低下された。急性の炎症の
兆候が、この調製物を与えられたマウスからの肺で検出された（データは示され
ない）。この影響は他の製剤を与えられた動物で検出されなかった。試験された
全部の製剤は、静脈内に投与された場合に形質導入効率をわずかに高めた。５％
グリセロール調製物は、ベクターの投与後に慣例に観察されたものを越えるＳＧ
ＯＴ／ＳＧＴＰレベルの顕著な増大を生じさせた。これは他の製剤ではみられな
かった。実施例１９−凍結乾燥されたウイルスベクターの開発本明細書に記述される処方の努力が−２０および４℃でのアデノウイルスの安
定性を有意に高めたとしても、それらはなお氷上での発送を必要とするとみられ
る。凍結乾燥（周囲温度での不安定な化合物の化学的および物理的安定性を拡大
するのに普遍的に使用される技術）を実務的一代替として考慮した。凍結乾燥工
程は３段階、すなわち凍結、一次乾燥および二次乾燥より成る。凍結段階の間に
、サンプルを−４０ないし−５０℃の範囲で凍結させる。生成物を完全に凍結す
る場合に、凍結乾燥チャンバー中の圧を低下させ、そして熱を生成物に適用する
。これらの条件下で、水が昇華（中間の液相の出現を伴わない、固体状態から直
接蒸気状態への相変化）により除去される。凍結乾燥が進行する際に、凍結され
た層の厚さが減少する。これが一次乾燥期である。一次乾燥後、付加的な乾燥が
、生成物中に残存するいかなる水も除去するために必要である。二次乾燥の間に
、熱を生成物の実現性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を維持するための最高許容可能温
度までゆっくりと加え、そして該工程が完了するまでこのレベルで維持する。

【００８６】大型のバッチのアデノウイルスを精製し、そして５個の別個の群に分割した。
各群を多様な処方に脱塩した。賦形剤は、Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ、Ｃａｒｐｅｎｔ
ｅｒおよび他者［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．とＪ．Ｈ．Ｃｒｏｗｅ、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５：２４４−２５５（１９８８）；Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｈ．
ら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、２７：２１９−２３１（１９９０）；Ｃａｒｐｅ
ｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．とＪ．Ｈ．Ｃｒｏｗｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：
３９１６−３９２２（１９８９）；Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．、ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｐｈｙｓＢｉｏｍｏｌＳｔｒｕｃｔ．、２２：６７−９７（
１９９３）］により記述されるとおり、凍結および乾燥工程の間にタンパク質の
コンホメーションを維持するために、水を置き換えかつウイルスキャプシドの周
囲に保護的な殻を形成するそれらの能力に従って選択した。該ロットの初期力価
は１×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌであった。１ミリリットルのアリコートをガラスバイ
アル中に入れ、そして標準的プロトコル（３０ｍｔｏｒｒの圧で−４０℃２時間
、−３３℃１２時間、−２５℃５時間、１０℃４時間および２０℃８時間）下で
凍結乾燥した。

【００８７】各凍結乾燥研究において、多数のウイルスを２群に分割し、１つの半分を所望
の処方に脱塩し、かつ他者は１０％グリセロールを含有するＫＰＢＳに脱塩した
。後者の調製物を−２０℃で保存し、そしてそれによりウイルスの安定性を高め
る凍結乾燥の能力を評価するための対照としてはたらいた。ウイルス力価を−２
０℃での貯蔵および凍結乾燥の前に評価した（ｔ＝０）。処方された調製物を含
有するバイアルを、単一棚の研究等級の凍結乾燥機（ＦＴＳシステムズ（ＦＴ
ＳＳｙｓｔｅｍｓ）、ニューヨーク州ストーンリッジ）中に入れ、そして１℃
／分の速度で−４０℃に冷却した。ウイルスを含まない処方の３バイアルに鉛白
金ＲＴＤ温度プローブ（ＦＴＳ）を装着し、そして、凍結乾燥装置の前部、中央
および後部に入れて、工程の間の生成物の温度変化をモニターした。冷却した後
、全サンプルを、研究中の特定の製剤について特別に作成された方法に従って凍
結乾燥した［Ｍ．Ｊ．Ｐｉｋａｌ、Ｆｒｅｅｚｅ−ＤｒｙｉｎｇｏｆＰｒｏ
ｔｅｉｎｓ、Ｐａｒｔ１：ＰｒｏｃｅｓｓＤｅｓｉｇｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、１９９０年９月：ｐ．１８−２７］。乾燥が完了した後に、サンプルに真空
下で栓をし、そして１３ｍｍの切り取りアルミニウムシール（ウィートン（Ｗｈ
ｅａｔｏｎ））で封止した。サンプルはウイルス力価についてアッセイされるま
で４℃で保存した。凍結乾燥されたウイルスは、１ｍｌの滅菌注射用蒸留水（米
国薬局方）で再構成し、そしてＫＰＢＳおよび１０％グリセロール中で−２０℃
で保存されたサンプルとともにアッセイした。

【００８８】リン酸ナトリウムもしくはカリウム緩衝液単独中で凍結乾燥された調製物は、
それぞれ５および４対数の感染性ウイルスの有意の喪失を被った（図２）。ショ
糖、マンニトールおよびスパン（Ｓｐａｎ）２０を製剤に添加した場合、力価は
およそ１対数だけ下降した。力価は、１Ｍショ糖中で凍結乾燥された調製物にお
いて、１対数未満だけ下降した。実施例２０−凍結乾燥のための製剤のガラス転移温度（Ｔｇ’）に対するウイル
ス濃度の影響全部の賦形剤が凍結乾燥後のアデノウイルスの回収を有意に向上させたとして
も、各調製物はなお、工程それ自身に帰された力価の下落を被った。従って、製
剤を、凍結乾燥周期の完了に際してのウイルス回収を最大にするためにさらに特
徴づけした。必要とされる処理条件を確かめるために重要である１パラメータは
、ガラス転移温度（Ｔｇ’）（凍結された溶液中で残余の氷でない相がガラスを
形成する最大凍結濃度の温度）である［Ｆ．Ｆｒａｎｋｓ、Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１：９３−１００（１９９０）］。一次乾燥をＴｇ’より上で実施す
る場合、凍結濃縮物は粘性の液体として挙動し、凍結に際して形成される氷の微
小構造が喪失されることができ、かつ、生成物の回収が有意に妨げられる。乾燥
がＴｇ’より下で起こる場合、水は、凍結に際して確立された微小構造を混乱さ
せることなく迅速に除去されることができ、それは凍結乾燥の間の生成物の喪失
を最小限にする［Ｆ．Ｆｒａｎｋｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．、７４：９−１９（１９９１）］。従って、調製物のＴｇ’は一次乾燥の間の安
全な温度上限を設定する。Ｔｇ’は巨大な範囲（−１ないし−５０℃）にわたっ
て変動することができるため、提案される製剤のこの値の決定は極めて重要かつ
工程開発の第一段階である。

【００８９】調製物のＴｇ’は非常に濃縮依存性である。すなわち、緩衝剤の塩、アミノ酸
、炭水化物、および製剤に添加される他の成分がＴｇ’に影響する可能性がある
［ｔｅＢｏｏｙ，Ｍ．Ｐ．Ｗ．Ｍ．ら、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓ．、９（１）：１０９−１１４（１９９２）］。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
はＴｇ’の直接測定値を与える［Ｈｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、１１（１）：５４−５９（１９９４）；Ｈａｔｌｅ
ｙ，Ｒ．Ｈ．Ｍ．、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、７４：１０５−１２２（１９９０）；Ｈａｔ
ｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．Ｍ．ａ．Ｆ．、Ｆ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｅｒｍａｌＡｎａｌｙｓｉｓ、３７：１９０５−１９１４（１９９１）］。

【００９０】ＤＳＣ分析は、液体窒素冷却を装備されたＭＤＳＣ２９２０（ＴＡインス
トゥルメンツ（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デラウェア州ニューカッスル
）で実施した。熱量計はインジウムを使用して温度およびセル定数について較正
した。５０マイクロリットルの各製剤は、密封して封止されたアルミニウム皿（
ＴＡインストゥルメンツ（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））中で分析した。
冷却速度は１℃／分であった。温度範囲は−６０ないし＋２５℃であった。ガラ
ス転移値（Ｔｇ’）は観察された転移の中点として報告する。実験は二重で実施
した。

【００９１】リン酸カリウム緩衝生理的食塩水中のショ糖（１Ｍ）は−３４．５℃のガラス
転移を有する（下の表８を参照されたい）。

【００９２】

【表８】

【００９３】アデノウイルスを１ｍｌあたり１×１０¹¹個の粒子の濃度で添加した場合、Ｔ
ｇ’は−３３．９℃に上昇した。別の１対数のウイルスの添加はガラス転移温度
を−３２．０℃に押し進めた。この影響はタンパク質で普遍的にみられる［Ｍ．
Ｊ．Ｐｉｋａｌ、Ｂｉｏｐｈａｒｍ、９月：１８−２７（１９９０）；Ｍ．Ｊ．
Ｐｉｋａｌ、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓ．、８（４）：４２７−４
３７（１９９１）］。タンパク質が調製物中で水を置き換える際にガラス転移が
上昇する。アデノ随伴ウイルスは、０．５Ｍショ糖製剤のＴｇ’に対し異なる影
響を有した。１ｍｌあたり１．５５×１０¹¹個のゲノムコピーの濃度でのウイル
スの添加は、ガラス転移温度を−３３．５から−３４．７１℃まで低下させた。
別の１対数のウイルスの添加はＴｇ’を−３５．３７℃に下落させた。これらの
結果は、このウイルスが凍結状態で伝統的なタンパク質と異なって賦形剤と相互
作用するかもしれないことを示唆する。この情報に基づき、Ａｄ調製物の一次乾
燥温度を−３５℃に設定した。ＡＡＶは−３８℃で乾燥した。実施例２１−アデノウイルスの回収に対する凍結乾燥されたケーキの最終水分含
量の影響ショ糖およびマンニトールの多様な混和物を、標準的凍結乾燥周期（３０ｍｔ
ｏｒｒの圧で−４０℃２時間、−３５℃１１時間、−１０℃２時間、０℃２時間
および２５℃３時間）後の最終水分含量について試験した。

【００９４】凍結乾燥された製剤の水分含量はカールフィッシャー滴定により測定し［Ｊ．
Ｃ．Ｍａｙら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ、７４：１５３−１６４（１９９
２）］、そして熱重量測定分析（ＴＧＡ）［Ｊ．Ｃ．Ｍａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、１０：２４９−２５９（１９８２）］により
確認した。カールフィッシャー滴定のために、フリットなしセルを装備されたア
クアスター（ＡｑｕａＳｔａｒ）カールフィッシャー滴定装置（モデルＣ３０
００、ＥＭサイエンシーズ（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅｓ））を、カールフィッシ
ャー水標準（２−メトキシエタノール）で較正し、かつ、１ｍｌの無水メタノー
ル（ＥＭサイエンシーズ（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅｓ））の添加でブランクをと
った（ｂｌａｎｋｅｄ）。凍結乾燥されたサンプルは、無水メタノールで再構成
し、そして滴定装置に添加した。ＴＧＡは、パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ）ＴＧＡ７系列の熱重量測定系を用いて実施した。３ないし５ミ
リグラムの凍結乾燥された調製物を、２５から２００℃まで１０℃／分で走査し
た。

【００９５】下の表９に提供されるデータは、単一の凍結乾燥運転（ｒｕｎ）からの１０バ
イアルの平均値である。

【００９６】

【表９】

【００９７】アデノウイルスを５．１２×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌの濃度でこれらの調製物に添
加した場合、感染性のウイルスの回収は生成物の最終水分含量に対し極めて感受
性であった（表９）。１：４のショ糖：マンニトールの調製物は０．６％の最終
水分含量を有し、そしてウイルス力価の１．１対数の喪失を被った。１．３％の
水分含量を伴う３：４の比は、１対数未満の感染性ウイルスを喪失した。ショ糖
：マンニトールの１：１の比より成る調製物は、凍結乾燥工程全体の間で力価の
いかなる喪失も経験しなかった。この調製物の水分含量は１．４％であった。水
分含量がこれを０．２％越えて１．６％に上昇した場合、力価は２．２対数単位
だけ下降した。これらのデータは、アデノウイルスが凍結乾燥された生成物中の
最終水分含量に対し感受性であることのみならず、しかしウイルス力価を維持す
ることができる比較的狭い領域が存在することを示す。結果として、全部のアデ
ノウイルス凍結乾燥工程を、ウイルスの最大の回収を提供するために、１．３〜
１．５％の最終水分含量を生じさせるように特別に作成した。実施例２２−凍結乾燥後のウイルス力価の回収に対するウイルス濃度の影響凍結乾燥後のウイルス力価の至適の回収を助長するアデノウイルスの最大の許
容可能な濃度を評価するため、アデノウイルスを２種の別個の処方中で２種の異
なる濃度で凍結乾燥した。表１０に提供される結果は各調製物の１０バイアルの
平均値である。

【００９８】

【表１０】

【００９９】一般に、より高い初期力価をもつ調製物は、凍結乾燥後に活性のウイルスのよ
り良好な回収を生じさせた。低ウイルス濃度（２〜５×１０¹⁰ｌｆｕ／ｍｌ）の
調製物は、処方に関係なくウイルスのおよそ１対数の喪失を被った。力価の喪失
は、より高いアデノウイルス濃度（２〜５×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌ）で１対数未満
であった。これは、部分的に、高濃度での凍結に際しての調製物の最終的な凍結
されるｐＨの維持において補助するウイルス自身の能力によると考えられる（デ
ータは示されない）。１〜５×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌのアデノウイルス調製物を付
加的な凍結乾燥研究で使用した。実施例２３−凍結乾燥されたウイルスベクターの安定性工程および処方の影響の慎重な評価後に、アデノウイルスの大スケール調製物
（１×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌ）を、以下のプロトコル、すなわち３０ｍｔｏｒｒの
圧で−４０℃２時間、−３５℃９時間，−１０℃４時間、０℃４時間および２５
℃８時間下で１Ｍショ糖製剤中で凍結乾燥した。凍結乾燥後、若干のバイアルを
再構成した。

【０１００】４℃で１年後にこの調製物中で検出された唯一の喪失は、該工程それ自身によ
る０．５対数のウイルスの初期喪失であった。１０％グリセロール中で調製され
かつ−２０℃で保存された同一ロットからのウイルスは、同一の時間の期間にわ
たっておよそ２対数の力価の下落を被った。４℃で保存された再構成された調製
物の安定性もまた評価した。ウイルス力価は４日の期間にわたって０．５対数／
日の定常的速度で下落し、該ベクターは再構成後すぐに使用しなければならない
ことを示した。この分解速度は、処方に関係なく他の凍結乾燥された調製物につ
いて類似であった（データは示されない）。力価のこの迅速な低下の性質を解明
し、かつ、ウイルスの安定性を促進する再構成のための新規混合状態を開発する
ための研究が、現在進行中である。

【０１０１】ＡＡＶベクターのための製剤の開発および凍結乾燥工程の至適化に関しては研
究がほとんどなされていない。単一の実験において、ＡＡＶ調製物（８．７×１
０⁸ｌｆｕ／ｍｌ）の半分を、リン酸カリウム緩衝生理的食塩水に脱塩した。残
存する半分は、０．４％ショ糖、０．４％マンニトールおよびプロタミンの処方
に脱塩した。各調製物を、以下のプロトコル、すなわち、３０ｍｔｏｒｒの圧で
−４０℃２時間、−３８℃１１時間、−１０℃２時間、０℃２時間および２５℃
３時間下で凍結乾燥した。

【０１０２】凍結乾燥工程による力価の０．３対数の初期喪失後、処方された調製物は２５
℃で９０日間、感染性のいかなる喪失も経験しなかった。いかなる付加的な賦形
剤（緩衝剤）も含まない緩衝液中で製造された調製物が、凍結乾燥後に力価の類
似の喪失を経験したことに注目することもまた重要である。これは、ＡＡＶが凍
結乾燥工程のストレスに対し抵抗性であるかもしれないことを示唆する。

【０１０３】本明細で引用される全部の刊行物は本明細書に引用することにより本明細書に
組み込まれる。本発明はとりわけ好ましい一態様に関して記述された一方、改変
を、本発明の技術思想から離れることなくなすことができることが認識されるで
あろう。こうした改変は、付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあること
を意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】発明にかかる、アデノウイルスの安定性に対する製剤の最終的な凍結されるｐ
Ｈの影響についての研究の結果を具体的に説明する（相関係数、ｒ²＝０．９８
）。実施例１５を参照されたい。結果は、２回の別個の実験からの４〜６サンプ
ルの平均力価として報告する。誤差の棒はデータの標準偏差を反映する。

【図１Ｂ】発明にかかる、アデノ随伴ウイルスの安定性に対する製剤の最終的な凍結され
るｐＨの影響についての研究の結果を具体的に説明する（相関係数、ｒ²＝０．
９８）。実施例１５を参照されたい。結果は、２回の別個の実験からの４〜６サ
ンプルの平均力価として報告する。誤差の棒はデータの標準偏差を反映する。

【図１Ｃ】発明にかかる、リン酸ナトリウム（ＤＰＢＳ）もしくはカリウム（ＫＰＢＳ）
いずれかの緩衝生理的食塩水および１０％グリセロール中で調製されたアデノウ
イルスの−２０℃での安定性の研究の結果を具体的に説明する。

【図２】発明にかかる、凍結乾燥後の活性のベクターの回収に対するアデノウイルス調
製物への賦形剤の添加の影響の研究の結果を具体的に説明する。ロット全体の凍
結乾燥前（Ｐｒｅ−ｌｙｏ）力価は１×１０¹¹ｌｆｕ／ｍｌであった。Ｓｕｃ／
Ｍａｎ／Ｓｐａｎ製剤中のショ糖、マンニトールおよびスパン（Ｓｐａｎ）２０
の濃度はそれぞれ４０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬおよび０．００１％である。
Ｋ＝ＫＰＢＳ、Ｄ＝ＤＰＢＳ。データは２回の別個の実験からの８個のバイアル
の平均である。誤差の棒はデータの標準誤差を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｋ 47/42 47/48 47/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウイルソン，ジエイムズ・エムアメリカ合衆国ペンシルベニア州19035グラドウイン・ノースアビニヨンドライブ 1350 Ｆターム(参考） 4C076 AA12 AA95 BB01 BB13 BB15 BB16 BB27 BB29 BB30 DD22 DD26 DD38 DD46 DD67 EE39 EE41 EE49 EE59 4C084 AA13 MA05 MA17 MA52 MA55 MA56 MA60 MA66 NA13 4C087 AA03 BC83 MA05 MA17 MA52 MA55 MA56 MA60 MA66 NA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）活性化されたポリエチレングリコールおよび組換えウイ
ルスを、周囲温度で約１ないし約２時間反応させること；ならびにｂ）反応を停止して、それによりポリエチレングリコールが結合されたウイルス
を得ることの段階を含んで成る、その形質導入効率を高めるためのポリエチレングリコール
との組換えウイルスの結合方法。
【請求項２】活性化されたポリエチレングリコールおよび組換えウイルス
が、約１０：１のポリエチレングリコール対ウイルスの比で反応される、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】反応が溶液中で起こり、かつ、組換えウイルスが溶液１ｍｌ
あたり約１×１０¹⁰ないし約１×１０¹⁵個の粒子の濃度で存在する、請求項１も
しくは請求項２に記載の方法。
【請求項４】ポリエチレングリコールが、塩化トレシル、コハク酸スクシ
ンイミジルおよび塩化シアヌルより成る群から選択される化合物で活性化される
、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】ポリエチレングリコールが５０００の分子量を有する、請求
項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】ポリエチレングリコールがモノメチオキシポリエチレングリ
コールである、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記組換えウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項１
ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記組換えウイルスがアデノウイルスである、請求項１ない
し６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】請求項１ないし７のいずれかの方法により製造される、ポリ
エチレングリコールが結合されたウイルス。
【請求項１０】前記ウイルスが、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイル
スより成る群から選択される、請求項９に記載のウイルス。
【請求項１１】前記ウイルスがモノメチオキシポリエチレングリコールと
結合される、請求項９に記載のウイルス。
【請求項１２】請求項９に記載の改変された組換えウイルスを宿主細胞に
送達させることの段階を含んで成る、組換えウイルスの形質導入効率の増大方法。
【請求項１３】（ａ）請求項９に記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）で改変されたウイルスと宿主細胞を接触させること（前記ウイルスは宿主細胞
への送達のための分子を含んで成り）；および（ｂ）宿主細胞を、該分子を含んで成る組換えウイルスと接触させることの段階を含んで成る、選択された宿主細胞へのウイルスベクターを介する分子の
再投与方法。
【請求項１４】宿主細胞が、該分子を含んで成る組換えウイルスと該宿主
細胞を接触させた後に、ＰＥＧで改変されたウイルスと接触される、請求項１３
に記載の方法。
【請求項１５】該分子を含んで成る組換えウイルスが第二のＰＥＧで改変
されたウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】第一のＰＥＧで改変されたウイルスおよび第二のＰＥＧで
改変されたウイルス中で、ＰＥＧがモノメトキシＰＥＧ（ＭＰＥＧ）であり、か
つ、各ウイルスについてＭＰＥＧが異なる基により活性化された、請求項１５に
記載の方法。
【請求項１７】ＭＰＥＧが、塩化トレシル、コハク酸スクシンイミジルお
よび塩化シアヌルより成る群から選択される化合物で活性化される、請求項１６
に記載の方法。
【請求項１８】請求項１ないし７のいずれかの方法により製造されるポリ
エチレングリコールが結合されたウイルス、および生理学的に許容できる担体を
含んで成る、宿主細胞への選択された分子の送達に有用な組成物。
【請求項１９】（ａ）宿主細胞への送達のための分子を含んで成る組換え
ウイルスベクター；（ｂ）ショ糖；および（ｃ）マンニトール（ショ糖対マンニトールの比は約１対約１である）を含んで成る、ウイルスベクターの物理的安定性を高める組成物。
【請求項２０】組成物が、約１．２％ないし約１．７％の最終水分含量ま
で凍結乾燥される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】溶液中の組成物が、１ミリリットルの溶液あたり約１×１
０¹⁰ないし約１×１０¹⁵個の粒子の組換えウイルスを含んで成る、請求項１９に
記載の組成物。
【請求項２２】 β−シクロデキストリンをさらに含んで成る、請求項１９
に記載の組成物。
【請求項２３】プロタミンをさらに含んで成る、請求項１９に記載の組成
物。