JP2002531418A - アデノ随伴ウイルスの薬学処方物における使用のための賦形剤、およびそれにより構成される薬学処方物 - Google Patents

アデノ随伴ウイルスの薬学処方物における使用のための賦形剤、およびそれにより構成される薬学処方物

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Abstract

(57)【要約】 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含む、安定な薬学組成物を記載する。この組成物は、凍結および融解のサイクルへの曝露ならびにガラスおよびポリプロビレンバイアルでの保存のような条件下での組換えＡＡＶベクターゲノムの欠失、ならびに形質転換能力に対する保護を提供する。この組成物は、１つ以上の二価アルコールまたは多価アルコール、および必要に応じてソルビタンエステルのような界面活性剤と組み合わせたＡＡＶウイルスを含む。この組成物の使用方法もまた、記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的にＤＮＡの送達方法に関する。より詳細には、本発明は、処
方物の操作、保存、輸送などに起因する形質転換能力の欠損に対する保護を提供
する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含む安定な薬学処方物に関
する。
【０００２】 （発明の背景） 薬剤としての使用のための任意の化合物の商業化は、処方物中で化合物が調製
、パッケージ、そして保存される処方物の慎重な研究を必要とする。当然ながら
、処方物は、ヒトおよび／または家畜の投与と両立できる。処方物は、薬剤が長
期間の有効性を保持するようでなければならない。実際に、処方物それ自体は、
長期間にわたって安定でなければない。処方物は、処方物の精製、ならびに処方
物中に含まれる薬剤の精製のために使用される技術と適合していなければならな
い。最終的に、処方物は、その中で薬剤が保存される物質と適合していなければ
ならない。薬剤が、安定性のために凍結されなければならない場合、処方物は、
凍結−融解に起因する不活性化または変性に対するいくつかの保護を提供するこ
とが好ましい。加えて、処方物は、薬剤の種々の希釈のための適当な環境を提供
するべきである。
【０００３】 代表的には、薬学的薬剤は、無菌の容器中に凍結乾燥された処方物として保存
される。薬学的薬剤処方物は、このような非水性状態で安定である場合、凍結乾
燥され得る。処方物が、凍結保存されなければならない場合、これは、特に重要
である。なぜなら、凍結乾燥は、水溶液中調製物が凍結され、後に融解される場
合、生じ得る有害な後遺症を最小にするからである。
【０００４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、多くのヒト組織および細胞型に容易に形質
転換するウイルスである。従って、ＡＡＶは、遺伝子治療および核酸の免疫化に
使用されてきた。これらの状況におけるＡＡＶの使用は、上記の薬学処方物の要
件の研究を必要とする。例えば、ＡＡＶを含むサンプルが凍結乾燥されないこと
好ましい。なぜなら、少量のウイルスが、エアロゾル化され、そして不注意に意
図されていない宿主に伝播する可能性があるからである。しかし、ＡＡＶは、ほ
とんどのウイルス、特にエンベロープ化したウイルスを不活性化する種々の条件
下で安定であることが公知であるから、ＡＡＶ処方物の調製は、問題があると以
前には考えられていなかった。
【０００５】 それゆえ、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの活性が、保存のために使用さ
れた処方物およびその処方物が曝露された条件に依存して、有意に低下したこと
を見出すとは予期されなかった。例えば、ｒＡＡＶ処方物の形質導入活性は、容
器の性質、処方物の組成、処方物の温度、ならびに温度の変化および保存された
ｒＡＡＶビリオンの濃度に依存し得ることが見出されている。
【０００６】 それゆえ、ガラスを含む種々の物質で作られた容器中で長期間のｒＡＡＶビリ
オンの活性を保存する、ｒＡＡＶビリオンを保存するための処方物を提供するこ
とは当該分野における有意な進歩である。
【０００７】 （発明の開示） 本発明は、種々の賦形剤組成物が、組換えＡＡＶビリオンを安定する効果を有
し、これにより本明細書中で記載される賦形剤を欠くＡＡＶ組成物と比較してｒ
ＡＡＶベクターゲノムの欠失がより少なくなり、そしてより高いレベルの形質転
換能力が達成されたという発見に基づく。本明細書中で記載される異なる実施形
態の種々の形態が、組み合わせられ得る。
【０００８】 １つの実施形態において、次いで、ｒＡＡＶビリオンを含む薬学組成物が提供
される。その組成物は、ｒＡＡＶベクターゲノムの欠失ならびに凍結および融解
のサイクルへの曝露、およびガラスまたはポリプロピレンバイアル中での保存の
ような条件下での形質転換能力に対する保護を提供する。その組成物は、１つ以
上のソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールのような二
価アルコールまたは多価アルコール、および必要に応じてソルビタンエステルの
ような界面活性剤を含む。
【０００９】 さらなる実施形態において、１以上の用量で与えられ、そしてソルビトールが
約１重量％〜約５重量％の濃度で存在し、ならびに界面活性剤が約０．１重量％
〜約１重量％で存在し、ここで、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−２０）またはポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレイン酸エステル（ HYPERLINK "mailto:TWEEN@80" ＴＷＥＥＮ−８
０）である場合、薬学組成物は、治療効果を提供するのに効果的な量でｒＡＡＶ
ビリオンを含む。
【００１０】 さらに他の実施形態において、凍結および融解のサイクルへのビリオンの曝露
から生じる活性の損失から組換えＡＡＶビリオンを保護する方法は、ガラス容器
中でのビリオンの保存から生じる活性の損失から組換えＡＡＶビリオンを保護す
るための方法として提供される。その方法は、ビリオンと二価アルコールまたは
多価アルコール含むビリオンを安定化組成物とを混ぜる工程を含む。特定の実施
形態では、アルコールは、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールお
よびソルビトールからなる群より選択された１つ以上のアルコールである。この
方法で使用される組成物は、必要に応じてソルビタンエステルのような界面活性
剤を含む。
【００１１】 特定の実施形態において、この方法において使用される組成物は、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−２０）およびポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ HYPERLINK "mailto:TWEEN@8
0" ＴＷＥＥＮ−８０）からなる群より選択されたソルビトールおよびソルビタ
ンエステルを含む。
【００１２】 本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当業者に
容易である。 （発明の詳細な説明） 本発明の実行は、他で示されない限り、当該技術分野の範囲内のウイルス学、
微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を利用する。このよ
うな技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（最新版）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ編、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；ＣＲＣ ＩＩａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第１巻および第２巻（Ｐ．Ｔｉ
ｊｓｓｅｎ編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第１巻
および第２巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、第３版）
；およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ、ＮＹ）を参照のこと。
【００１３】 本明細書および添付した特許請求の範囲において用いられるように、単数形「
ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その中身が他で明確に示されない限り、複数
についての言及を含む。
【００１４】 （Ａ．定義） 本発明を記載するにおいて、以下の用語が利用され、そして以下に示すように
規定されることが意図される。
【００１５】 「ベクター」は、任意の遺伝的エレメントを意味し、例えば、プラスミド、フ
ァージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどがある。
ベクターは、適切な制御エレメントと関連づけられる場合に複製を可能にし、そ
して細胞の間で遺伝子配列を移動し得る。したがって、この用語は、クローニン
グビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００１６】 「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターを意味し、
ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６な
どを制限なく含む。ＡＡＶベクターは、全体または一部を欠失する１つ以上のＡ
ＡＶ野生型遺伝子、好ましくは、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子（以
下に記載される）を有し得るが、機能的連接ＩＴＲ配列（以下にも記載される）
を残存する。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、ウイルスの複製およ
びパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、複製およびパ
ッケージングのためのｃｉｓにおいて要求される少なくともこれらの配列（例え
ば、機能的ＩＴＲ）を含むことを、本明細書中で規定される。ＩＴＲは、野生型
ヌクレオチド配列に必要でなく、そして、この配列が機能的な救出、複製および
パッケージングを提供する限り、変化され得る（例えば、ヌクレオチドの挿入、
欠失、または置換によって）。
【００１７】 「組換えウイルス」は、遺伝的に変化された（例えば、粒子中への異種核酸構
築物の付加または挿入によって）ウイルスを意味する。
【００１８】 「ＡＡＶビリオン」は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシド
タンパク質コートに関与する、直線状で、単鎖のＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のよ
うな完全なウイルス粒子を意味する。この点について、単鎖ＡＡＶ核酸分子のい
ずれかの相補的センス（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）が、
いずれか１つのＡＡＶビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は同等に感染性
である。
【００１９】 「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、感染性で、ＡＡＶ
ＩＴＲによって両側に隣接される目的のＤＮＡ分子をカプシド形成するＡＡＶ
タンパク質シェルを含む複製欠損ウイルスとして、本明細書中で規定される。ｒ
ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、および、そこに導入されたＡＡＶヘルパー
機能およびアクセサリー機能を有する適切な宿主細胞内で産生される。この様式
において、宿主細胞は、引き続く遺伝子送達のために、組換えビリオン粒子中に
ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）をパッケージングする
ために要求される、ＡＡＶポリペプチドをコードすることを可能にされる。
【００２０】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性ＤＮＡの取りこみを言及
するのに用いられる。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞は「トラ
ンスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、当該分野にお
いて公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２
：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９
８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参
照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分（例えば、プラスミ
ドベクターおよび他の核酸分子）を適切な宿主細胞中に導入するために使用され
得る。この用語は、遺伝的物質の安定的な取りこみと一過性の取りこみの両方を
言及する。
【００２１】 用語「形質導入」は、受容細胞へのインビボまたはインビトロのいずれかでの
、複製欠損ウイルスベクターを介する（例えば、組換えＡＡＶビリオンを介する
）ＤＮＡ分子の送達を示す。
【００２２】 「ＤＮＡ」は、弛緩型または高次コイルのいずれかの二本鎖形態または一本鎖
形態でのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシ
ン）の重合体形態を意味する。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみ
を言及し、任意の特定の三次構造に限定しない。したがって、この用語は、とり
わけ、直線状のＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミ
ド、および染色体において見出される一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
特定のＤＮＡ分子の構造の議論において、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち
、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向における配列の
みを与える通常の慣習に従って、本明細書中に記載され得る。この用語は、４塩
基（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）を含む分子、および当該分
野において公知の塩基アナログを含む分子を含む。
【００２３】 「遺伝子」または「コード配列」あるいは特定のタンパク質を「コードする」
配列は、適切な調節配列の制御下に置かれる場合、インビトロまたはインビボで
転写される（ＤＮＡの場合）およびポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡの場合）
核酸分子である。遺伝子の境界は、５’末端の開始コドン（コードされるタンパ
ク質のアミノ末端に対応する）および３’末端（コードされるタンパク質のカル
ボキシ末端に対応する）翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子は、以下を
含むが、これらに限定されない：原核生物もしくは真核生物のｍＲＮＡ由来のｃ
ＤＮＡ、原核生物ＤＮＡもしくは真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およ
び合成ＤＮＡ配列。転写終止配列は、通常遺伝子配列の３‘に位置される。
【００２４】 用語「制御エレメント」は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転
写終止配列、上流の調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「Ｉ
ＲＥＳ」）、エンハンサーなどをまとめて言及し、これは、受容細胞中のコード
配列の複製、転写および翻訳をまとめて提供する。適切な宿主細胞において、選
択されたコード配列が複製、転写および翻訳され得る限り、これらの制御エレメ
ントの全てが、常に存在する必要はない。
【００２５】 用語「プロモーター領域」は、本明細書中で、その通常の意味において、ＤＮ
Ａ調節配列を含むヌクレオチド領域を言及し、ここで、この調節配列は、ＲＮＡ
ポリメラーゼを結合し得、そして下流（３’−方向）のコード配列の転写を開始
し得る遺伝子由来である。
【００２６】 「作動可能に連結された」は、そのように記載された成分がそれらの通常の機
能を遂行するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配
列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響し得る。
この制御エレメントは、コード配列に連続する必要はなく、これらがその発現を
指向するように機能する限りは、このコード配列から同一の（ｃｉｓ）核酸分子
または異なる（ｔｒａｎｓ）核酸分子上にあり得る。従って、例えば、介在性で
、翻訳されていないが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間
に存在し得、そしてプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結された
」とまだ見なされ得る。
【００２７】 本願を通じて特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対的な位置を記載する
目的（例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に関して「上流」「下流」
「３’」または「５’」に位置すると記載される場合）のために、これは、当該
分野において慣用的であるように言及されるＤＮＡ分子の「センス」鎖または「
コード」鎖中の配列の位置であると理解される。
【００２８】 「多価アルコール」は、３つ以上の水酸基（３水酸基）を含むアルコールを意
味する。一般には、３つの水酸基を有するアルコールはグリセロールであり、 一方、３を超える水酸基を有するアルコールは、糖アルコールである。「二価ア
ルコール」は、２つの水酸基を有するアルコールである。多価アルコールおよび
二価アルコールの例を、以下に示す。
【００２９】 （Ｂ．一般的方法） 本発明は、ｒＡＡＶビリオンを含む安定な薬学的組成物を提供する。この組成
物は、凍結融解サイクルを受ける場合でさえ、および種々の材料（ガラスを含む
）によってできた容器内に保存される場合でさえ、安定かつ活性であり続ける。
【００３０】 目的の異種ヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶビリオンは、遺伝子送達のた
め（例えば、遺伝子治療適用において）、核酸ワクチン接種、リボザイム治療お
よびアンチセンスにおける治療トランスジェニック動物の作製のため、ならびに
インビトロでの種々の細胞型への遺伝子の送達のために用いられ得る。
【００３１】 一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボ形質導入技術またはインビトロ形質導
入技術をいずれかを用いて、被験体の細胞に導入される。インビトロで導入され
る場合、所望の受容細胞は、その被験体から除かれ、ｒＡＡＶビリオンで形質導
入され、そしてその被験体に再導入される。あるいは、同系の細胞あるいは異種
の細胞は、これらの細胞が被験体内の不適切な免疫応答を産生しないように用い
られ得る。
【００３２】 被験体に形質導入された細胞の送達および導入のための適切な方法が、記載さ
れている。例えば、細胞は、組換えｒＡＡＶビリオンをこれらの細胞に結合させ
ることによって（例えば、適切な培地中で）、そしてサザンブロットおよび／ま
たはＰＣＲのような慣用的技術を用いるかまたは適切なマーカーを用いることに
より、所望のＤＮＡを含むこれらの細胞をスクリーニングすることによって、イ
ンビトロで形質導入され得る。次いで、形質導入された細胞は、以下により十分
に記載される薬学的組成物に処方され得、そして種々の経路によって（例えば、
筋肉内、静脈内、動脈内、皮下および腹腔内の注射によって、または平滑筋内へ
の注射（例えば、カテーテルを用いて）または組織内への直接的な注射によって
、組成物を被験体に導入した。
【００３３】 インビボ送達に関して、ｒＡＡＶビリオンは、薬学的組成物に処方され、そし
て一般的には非経口的に投与される（例えば、骨格筋内への直接的な筋肉内注射
、動脈内、静脈内または組織への直接の注射によって）。
【００３４】 適切な用量は、他の因子の中で、処置される被験体（例えば、ヒトまたは非ヒ
ト霊長類または他の動物）、年齢および処置される被験体の体調、処置される状
態の重篤度、ｒＡＡＶビリオンの投与の方法に依存する。適切な有効量は、当業
者によって容易に決定され得る。
【００３５】 したがって、「治療的な有効量」は、臨床試験を通じて決定され得る相対的に
広い範囲になる。例えば、インビボ注射（すなわち、被験体への直接注射）のた
めに、治療的な有効用量は、約１０5〜１０16のｒＡＡＶビリオン、より好まし
くは１０8から１０14のｒＡＡＶビリオンの程度である。インビトロ形質導入の
ために、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０5〜１０13、好
ましくは１０8から１０13のｒＡＡＶビリオンの程度である。組成物が被験体に
送達し戻される形質導入された細胞を含む場合、形質導入された細胞の量は、薬
学的組成物中に１０4〜１０10の細胞であり、より好ましくは、１０5〜１０8の
細胞である。もちろん、用量は、形質導入の効率、プロモーターの強度、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ）およびそれによってコードされるタンパク質
の安定性などに依存する。有効投与量は、当業者によって用量応答曲線を確立す
る慣用的な治験を通じて容易に確立され得る。
【００３６】 投薬処置は、上記で特定された量を最終的に送達するための、単一の用量スケ
ジュールまたは複数の用量スケジュールであり得る。さらに被験体は、適切な用
量だけ投与され得る。したがって、被験体は、例えば、単一用量において１０5
〜１０16のｒＡＡＶビリオン、または、例えばまとめて１０5〜１０16のｒＡＡ
Ｖビリオンの送達を生じ得る、２、４、５、６以上の投与を与えられ得る。当業
者は、適切な投与する用量数を容易に決定し得る。
【００３７】 したがって、薬学的組成物は、十分な遺伝物質を含み、治療的な有効量（すな
わち、問題の疾患の状態の症状を減弱または回復させるために十分な量）、また
は所望の利益を与えるために十分な量の目的のタンパク質を産生する。したがっ
て、ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の用量で与えられる場合、本発明の組成物中
に十分量で存在し治療効果を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、凍結乾燥調製物と
して提供され得、そして即時の使用または将来の使用のためにビリオン安定化組
成物中に希釈される。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、産生後直ちに提供され得
、そして将来の使用のために貯蔵され得る。
【００３８】 薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は
、その組成物を受け取る個体に対して有害な抗体の産生をそれ自身が誘導せず、
そして過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に受容可
能な賦形剤は、液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール
）を含むが、それらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、そこに含まれ得
る。例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩など）
および有機酸塩（例えば、アセテート、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸
塩など）。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質な
ど）は、このようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底
的な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩ
ＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ，Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）に入手可能である
。
【００３９】 好ましい賦形剤は、ｒＡＡＶビリオン、および処方手順、パッケージング、貯
蔵、移動などから生じる形質導入能の喪失が最小化されるように、ｒＡＡＶビリ
オンに保護効果を与える。したがって、これらの賦形剤組成物は、標準アッセイ
（例えば、実施例の項に記載されるようなアッセイ）を用いて測定される場合、
これらが非保護化対応物に比べて、より高いｒＡＡＶビリオン力価およびより高
い形質導入能レベルを提供するという意味で、「ビリオン安定化」と見なされる
。したがって、これらの組成物は、本明細書中に記載される特定の賦形剤を欠く
組成物と比較して、「増加された形質導入能レベル」を示し、したがって、これ
らの非保護化対応物より、より安定的である。
【００４０】 活性分解的条件からｒＡＡＶビリオンを保護するために用いられる賦形剤とし
て、以下が挙げられるが、これらに限定されない：界面活性剤、タンパク質（例
えば、オブアルブミンおよびウシ血清アルブミン）、アミノ酸（例えば、グリシ
ン）、多価アルコールおよび二価アルコール（例えば、種々の分子量のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ−２００、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ
−６００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−１４５０、ＰＥＧ−３３５０、ＰＥＧ−
６０００、ＰＥＧ−８０００、およびこれらの値の間の分子量が挙げられるが、
これらに限定されない。好ましくは１５００〜６０００の分子量を有する）、プ
ロピレングリコール（ＰＧ）、糖アルコール（例えば、炭水化物、好ましくは、
ソルビトール）。存在する場合、界面活性剤は、アニオン生、カチオン性、双性
イオン性または非イオン性界面活性剤である。好ましい界面活性剤は、被イオン
性界面活性剤である。より好ましくは、この非イオン性界面活性剤は、ソルビタ
ンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（
ＴＷＥＥＮ−２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル
（ＴＷＥＥＮ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステ
ル（ＴＷＥＥＮ−６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアリン酸エス
テル（ＴＷＥＥＮ−６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エス
テル（ＴＷＥＥＮ−８０）ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステ
ル（ＴＷＥＥＮ−８５））であり、好ましくは、ＴＷＥＥＮ−２０および／また
はＴＷＥＥＮ−８０である。これらの賦形剤は、多くのメーカー（例えば、Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。
【００４１】 存在する種々の賦形剤の量は変動し、そして当業者によって容易に決定される
。例えば、存在する場合、タンパク質賦形剤（例えば、ＢＳＡ）は、一般に１．
０重量％〜約２０重量％の間、好ましくは１０重量％の濃度で存在する。グリシ
ンのようなアミノ酸が処方に用いられる場合、一般に約１重量％〜約５重量％の
濃度で存在する。ソルビトールのような炭水化物は、存在する場合、一般に０．
１重量％〜約１０重量％の間、好ましくは、約０．５重量％〜約１５重量％の間
、さらに好ましくは、約１重量％〜約５重量％の間の濃度で存在する。ＰＥＧが
存在する場合、一般に約２重量％〜約４０重量％、好ましくは、約１０重量％〜
約２５重量％の程度で存在する。プロピレングリコールが本処方物に用いられる
場合、代表的には、約２重量％〜約６０重量％、好ましくは、約５重量％〜約３
０重量％の濃度で存在する。ソルビタンエステル（ＴＷＥＥＮ）のような界面活
性剤が存在する場合、約０．０５重量％〜約５重量％、好ましくは、約０．１重
量％と約１重量％の間の濃度で存在する。
【００４２】 １つの実施形態において、水性ビリオン安定化処方物は、ソルビトールのよう
な炭水化物を、０．１重量％〜約１０重量％の間、好ましくは、約１重量％〜約
５重量％の間の濃度で含み、そしてソルビタンエステル（ＴＷＥＥＮ）のような
界面活性剤を、約０．０５重量％〜約５重量％の間、好ましくは、約０．１重量
％と約１重量％の間の濃度で含む。ビリオンは、一般的に組成物中に十分量で存
在し、上記に規定されるような１つ以上の用量で与えられる場合、治療効果を提
供する。
【００４３】 （Ｃ．実験） 以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、
図解の目的にのみ提供され、いずれにせよ、本発明の範囲を限定することを意図
しない。
【００４４】 用いられた数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように試みた
が、もちろん、いくらかの実験的誤差および偏差が、考慮されるべきである。
【００４５】 （材料および方法） （組換えＡＡＶビリオンの作製） 組換えＡＡＶビリオンは、Ｎａｔｓｏｕｌｉｓの共有に係る米国特許第５，６
２２，８５６号に記載される方法を用いて作製され得る。
【００４６】 簡単には、この方法は、以下の工程を含む：適切な宿主細胞中にＡＡＶベクタ
ーを導入する工程；宿主細胞にウイルスヘルパー構築物を導入し、基本的なＡＡ
Ｖヘルパー機能を発現する工程；宿主細胞中でウイルスヘルパー機能を発現する
工程；および細胞を培養しｒＡＡＶビリオンを産生する工程。ＡＡＶベクターお
よびＡＡＶヘルパー構築物を、当業者に公知の技術を用いて、連続的にかまたは
同時に宿主細胞中にトランスフェクトし得る。ウイルスヘルパー機能の発現を、
アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスの群から選択され
る適切なヘルパーウイルスで細胞を感染することによって提供し得る。ウイルス
ヘルパー機能は、ＡＡＶ ｒｅｐ領域およびＡＡＶ ｃａｐ領域の転写および翻
訳を指向するＡＡＶヘルパー構築物に存在するＡＡＶプロモーターをトランス活
性化する。したがって、選択された異種ヌクレオチド配列を有するｒＡＡＶビリ
オンを形成し、そして公知の方法を用いで、調製物から精製し得る。
【００４７】 宿主細胞から得られる上清を、ウイルスゲノムの数を計算するためのドットブ
ロットによってか、または産生かつ回収されたｒＡＡＶで細胞を形質導入し、そ
してｒＡＡＶ ＬａｃＺ形質導入能を示すような機能的単位を決定するためにβ
−ガラクトシダーゼについてアッセイすることによってかのいずれかで、ｒＡＡ
Ｖウイルス産生について滴定する。形質導入するベクター力価を、ｒＡＡＶビリ
オンの一連の希釈を用いて、２９３細胞、またはＡＡＶでのトランスフェクショ
ンにコンピテントな任意の細胞によって決定し得る。２４時間後、細胞を固定し
、そしてＸ−Ｇａｌで染色する。Ｓａｎｅｓら（１９８６）ＥＭＢＯ ５：３１
３３−３１４２。力価を、青い細胞の数を定領することによって計算する。
【００４８】 （ｐＡＡＶ ＬａｃＺの構築）ｌａｃＺ遺伝子を保有するＡＡＶベクター（ｐ
ＡＡＶ−ｌａｃＺ）を以下のように構築した。ｐＳｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１）の、ＸｂａＩ部
位の間のＡＡＶコード領域を、ＥｃｏＲＩリンカーで置き換え、プラスミドｐＡ
Ｓ２０３を作製した。ｐＣＭＶβ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）のＥｃｏＲＩ〜Ｈｉｎ
ｄＩＩＩのフラグメントを平滑末端化し、そしてｐＡＳ２０３のＫｌｅｎｏｗ処
理したＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＡＡＶ−ｌａｃＺを産生した。
【００４９】 （実施例１：組換えＡＡＶ活性に対する凍結／融解サイクルの効果） 本実施例を行って、ｒＡＡＶ活性に対する凍結／融解サイクルの効果を決定し
た。表に示すように、凍結前にｒＡＡＶに薬剤が添加されない場合、約７５％の
活性が失われる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ−２０）の単独での添加は、回収率を改善し
た（約５０％）。しかし、ソルビトールは、サンプルを凍結／融解不活化から完
全に保護した。これらの実験を、ポリプロピレンバイアルにおいて行った。
【００５０】 ＡＡＶ−ｌａｃＺを、イオン交換カラムでクロマトグラフィーした。カラムか
らの画分の各々からの小容量を、サンプルを凍結する前に同日に青色細胞活性に
ついてアッセイした。ピーク画分は、カラムでの最初の負荷量のうちの４７％を
含んでいた。
【００５１】 各々の画分の残りを４つの部分に分け、そして以下の賦形剤を各部分に添加し
た： 部分ａ−賦形剤なし； 部分ｂ−１０％の最終濃度になるようなＢＳＡ； 部分ｃ−５％の最終濃度になるようなソルビトール； 部分ｄ−０．５％の最終濃度になるようなＴＷＥＥＮ−２０； これらのサンプルを凍結し、数日後に融解し、そして青色細胞活性についてア
ッセイした。結果を、表１にまとめる。
【００５２】
【表１】 これらの結果は、１回の凍結／融解サイクルが、ｒＡＡＶ活性の有意な減少を
もたらし得ることを示す。活性におけるこの減少は、保護剤（例えば、タンパク
質、多価アルコールおよび界面活性剤；これらは全て異なる機構によって作用す
ると考えられる）の添加によって排除され得る。この実験では、ソルビトールは
、最大の保護効果を有した；凍結および融解の後に、ソルビトール含有サンプル
においては本質的に活性の喪失は観察されなかった。
【００５３】 （実施例２：組換えＡＡＶ活性に対するベクター希釈、温度およびガラスバイ
アルにおける保存の効果） 初期安定性実験を行って、保存安定性に対するベクター希釈の効果、ポリプロ
ピレン（ｐｐ）バイアルおよびガラス（ｇｌ）バイアルからの回収、ならびに温
度（−８０℃、２〜８℃、３７℃）の効果、ならびに安定性および回収に対する
ソルビトールの添加の効果を決定した。
【００５４】 リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ソルビトール溶液におけるｒＡＡ
Ｖのサンプルを、未希釈で、ならびに１％ソルビトール／ＤＰＢＳ緩衝液中に１
倍〜約１０倍（１．２５ｍｌ〜１２．５ｍｌ）希釈して、アッセイした。希釈シ
リーズの各メンバーの０．５ｍｌアリコートを、異なる保存条件に置いた。
【００５５】 凍結後、サンプルを凍結し、そしてベクターゲノムについて、および形質導入
性（ｔｒａｎｓｄｕｃｅａｂｉｌｉｔｙ）について、実施例１に記載の通りに分
析した。形質導入性研究については、本実験で用いたベクターゲノムの力価を、
未希釈のベクターの出発濃度を用いて算出した。各サンプルを、１×１０8また
は５×１０8個のベクターゲノムが、１０〜２０μＬの容量において２９８−Ｈ
ＥＫ細胞に添加され得るように、完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
中で希釈した。
【００５６】 用いた、安定性を示すアッセイは、形質導入性の喪失であった。形質導入性の
喪失を、２９３ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞のｒＡＡＶでの形質導入後のヒト第
ＩＸ因子タンパク質（ｈＦＩＸ）産生によって測定した。このアッセイでは、異
なる量のｒＡＡＶ−ｈＦＩＸベクターをＨＥＫ細胞に添加し、そして形質導入す
る能力を測定した。感染の結果産生され、そして分泌された第ＩＸ因子タンパク
質は、ＥＬＩＳＡ技術を用いて測定された。結果を、ヒト第ＩＸ因子タンパク質
（ｈＦＩＸ）のｎｇ／ｍＬにおいて報告する。
【００５７】 図１に示した結果からわかり得るように、ガラス中でｒＡＡＶを保存すること
は、ｒＡＡＶを保存した温度にかかわらず、ｒＡＡＶ活性の低下を引き起こした
。本実施例では、活性および温度は、逆に関連するようである−−すなわち、温
度が低くなるほど、活性が高くなる。
【００５８】 （実施例３：組換えＡＡＶ活性に対するガラス中での保存の効果） 実施例２において記載された実験の結果は、ガラスにおけるｒＡＡＶの保存が
、活性の喪失をもたらすことを示す。これが単に、ｒＡＡＶがガラスバイアルに
吸着されるというという事実に起因するか否かを試験するために、本実施例を設
計した。
【００５９】 この可能性を除外するために、ガラスバイアルおよびポリプロピレンバイアル
に添加したゲノム数（サザンブロットドットによって決定した場合の、ＡＡＶ中
にカプセル化されたＤＮＡ分子の数）を決定した。ｒＡＡＶを、種々の処方およ
び温度においてガラスバイアル中およびポリプロピレンバイアル中で静置した。
ｒＡＡＶウイルスの２つのアリコートを採取した：回収されたゲノムの数を再度
計数するために用いた第１のもの、および実施例１において決定したような活性
（ゲノムとは対照的な機能的単位）を決定するための第２のもの。この結果は、
ｒＡＡＶがガラス中で保存される場合、活性が有意に低下することを示す。これ
は、種々の希釈のｒＡＡＶで生じる。
【００６０】 ｒＡＡＶサンプルを、未希釈で、ならびに５倍、５０倍または１００倍に希釈
して凍結した。用いた希釈剤は、ソルビトールの最終濃度が５％または１％のい
ずれかであるような希釈剤であった。２連のサンプルを、ガラスバイアル中およ
びポリプロピレンチューブ中に置いた。サンプルを、−８０℃または周囲温度に
置いた。凍結後、サンプルを融解し、そして上記のようにベクターゲノムおよび
形質導入性について分析した。形質導入性研究については、本実験に用いたベク
ターゲノム力価を、未希釈のベクターの出発濃度を用いて算出した。各サンプル
を、１×１０8または５×１０8個のベクターゲノムが１０μＬ〜２０μＬの容量
において２９３−ＨＥＫ細胞に添加され得るように、完全ＤＭＥＭ中に希釈した
。
【００６１】 用いた、安定性を示すアッセイは、ベクターゲノムの喪失および形質導入性の
喪失であった。ベクターゲノムの喪失を、ドットブロットアッセイを用いて測定
した。このアッセイは、ベクターＤＮＡをサンプルから抽出する工程、このＤＮ
Ａを変性させる工程、およびこのＤＮＡをナイロンメンブレンにローディングす
る工程を包含する。このＤＮＡを相補的な放射性ＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズすることにより、ベクターゲノムの数が、標準への比較によって算出され得る
。形質導入性の喪失を、実施例２に記載される通りに測定した。
【００６２】 表２は、１×１０8個のベクターゲノムで形質導入された２９３−ＨＥＫ細胞
について得られたデータを列挙する。−８０℃でインキュベートしたサンプルに
ついてのデータを示す。第２欄は形質導入性を示し、第３欄は測定されたベクタ
ーゲノム／ｍｌであり、そして第４欄は希釈倍数を掛けた第３欄のデータである
。この表では、「ｐｐＳ」は、ポリプロピレンストック容器を示し、そして「ｐ
ｐＣ」は、ポリプロピレン容器を示す。
【００６３】
【表２】 図２は、ベクターゲノムおよび形質導入性の結果についてのデータを示し、こ
こで、１×１０8個のベクターゲノムを形質導入性アッセイに用いた。経験的に
得られたベクターゲノムは、形質導入性の結果と比較するために希釈について正
規化された。さらに、ベクターゲノムの結果を、１×１０11によって除算して、
グラフのために扱い易い数を得た。
【００６４】 表３および図３は、５×１０8個のベクターゲノムで形質導入した２９３−Ｈ
ＥＫ細胞についての形質導入性アッセイ以外は上記の通りに行った実験の結果を
示す。
【００６５】
【表３】 図４および図５は、ベクターゲノム数および形質導入性アッセイについて−８
０℃または周囲温度で行った実験の結果を示し、ここで、形質導入性を、１×１
０8個のベクターゲノム（図４）および５×１０8個のベクターゲノム（図５）を
用いて行った。
【００６６】 形質導入性実験からのこれらの結果は、ベクターが希釈されるにつれて、感染
能力が減少することを示す。１％ソルビトール中で調製されたサンプルが、５％
ソルビトール中で調製されたサンプルと比較して減少した形質導入性を有するこ
ともまたわかり得る。これらの結果はまた、−８０℃でのガラス中での保存が、
ポリプロピレンと比較して減少した形質導入性をもたらすことを示す。
【００６７】 従って、これらの実験において調べた条件下で容器におけるベクターの物理的
喪失が存在し得るようである。しかし、ベクターゲノムのデータからは、ベクタ
ーゲノムの数において観察可能な変化が存在しないことが観察され得る。ベクタ
ーゲノムの範囲（表２および表３を参照のこと）における分散の相関の％（％Ｃ
Ｖ）は２２．４であり、ドットブロットアッセイの変動性の充分な範囲内である
。しかし、両方の力価についての形質導入性についての％ＣＶ、すなわち、１×
１０8個のベクターゲノムおよび５×１０8個のベクターゲノムは、形質導入性ア
ッセイの変動性（約３０％）よりも大きい。従って、ベクターゲノム数の喪失よ
りも、ベクター自体が形質導入性を失うようである。
【００６８】 （実施例４：組換えＡＡＶ−Ｉの安定性に対する添加された賦形剤の効果） これらの実験を、１％ソルビトールならびに種々の濃度のＴＷＥＥＮ−２０、
ＴＷＥＥＮ−８０、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリシンおよびそれら
の組み合わせを含む異なる処方の効果について試験するために設計した。増殖培
地中に置かれたウイルスを、ベースラインとして用いた。初めから終わりまで用
いたチューブは、ポリプロピレン製であった。サンプルを、処方物中で１時間、
室温にて維持した後、培養細胞を形質導入した。
【００６９】 ＡＡＶベクターの安定性を、実施例２に記載の形質導入性の喪失のアッセイを
用いて測定して、添加した賦形剤の効果をさらに調べた。サンプルを、培地中ま
たは緩衝液賦形剤中に希釈して、１５μＬにおいて１×１０8、５×１０8、１×
１０9または５×１０9の濃度を得た。サンプルを、ポリプロピレンチューブ中に
約１時間置き、次いで２９３−ＨＥＫ細胞を形質導入するために用いた。
【００７０】 賦形剤の処方および結果を、表４中にヒト第ＩＸ因子のｎｇ／ｍｌで与え、そ
してその中に列挙した結果を図６および図７に示す。全ての場合、賦形剤は、１
％ソルビトールを含んでいた。
【００７１】
【表４】 これらのデータは、ＴＷＥＥＮの添加が、安定化されたｒＡＡＶを有するよう
であり、そしてＰＥＧおよびグリシンがほとんど有さず、そしてｒＡＡＶの全体
の活性をさらに減少させ得ることを示す。
【００７２】 （実施例５：組換えＡＡＶ−ＩＩの安定性に対する添加された賦形剤の効果） ＡＡＶベクターの安定性を、実施例４に記載のように測定した。賦形剤の処方
および結果を表５に示し、そしてその中で列挙した結果を図８に示す。全ての場
合、賦形剤は１％ソルビトールを含んでいた。
【００７３】
【表５】 （実施例６：組換えＡＡＶの安定性に対する添加された賦形剤の効果：ガラス
バイアルとポリプロピレンバイアルとの比較） 本実施例を、２つの温度で（４℃および−８０℃）、ポリプロピレンバイアル
中で保存したｒＡＡＶの活性に対する効果と比較した、ガラスバイアル中で保存
したｒＡＡＶの活性に対する１％ソルビトールおよびＴＷＥＥＮ−８０の効果を
研究するために設計した。
【００７４】 ＡＡＶベクターの安定性を、５×１０7、１×１０8または５×１０8個の粒子
／ウェルを用いて、記載されたように測定した。各サンプルを、ガラスバイアル
（ＧＶ）またはポリプロピレンチューブ（ＰＴ）中で行い、そして室温（＋４℃
）または−８０℃で一晩保存した。賦形剤の処方および結果を表６に示し、そし
てその中に列挙した結果を図９に示す。
【００７５】
【表６】 これらのデータは、ガラスバイアルにおいて保存された場合、１％ソルビトー
ルがｒＡＡＶ活性についての有意な防御効果を提供しないことを示す。ソルビト
ールを単独で用いた場合、ソルビトールはポリプロピレンバイアル中で保存され
たｒＡＡＶに対して保護効果を提供する。サンプルを−８０℃ではなく４℃にて
保存した場合、見かけの保護効果もまた存在する。処方物中にＴＷＥＥＮを含む
ことは、ガラスバイアル中のｒＡＡＶサンプルの保存によって引き起こされた減
少した活性を逆転させる。
【００７６】 （実施例７：組換えＡＡＶ−ＩＩＩの安定性に対する添加された賦形剤の効果
：ガラスバイアルにおける保存とポリプロピレンバイアルにおける保存との比較
） ＡＡＶベクターの安定性を、実施例５に記載の通りに測定した。賦形剤の処方
および結果を図１０に示す。このデータは、プロピレングリコール（ＰＧ）もソ
ルビトールも単独では、ガラスバイアル中で保存されたｒＡＡＶサンプルの活性
の喪失に対して保護しないことを示す。ＰＧおよびＴＷＥＥＮを組み合わせた場
合、活性の喪失は最少であった。そして、実際、ＰＧおよびＴＷＥＥＮは一緒に
なって、活性に対して相乗効果を有し得るようである． （実施例８：組換えＡＡＶの安定性に対する添加した賦形剤の効果：５％ソル
ビトールの効果） これらの実験を、ｒＡＡＶの活性に対する、種々の濃度のＴＷＥＥＮと組み合
わせた、５％ソルビトールの効果を研究するために設計した。
【００７７】 凍結／融解サイクル後のＡＡＶベクターの安定性を、１×１０8、５×１０8ま
たは１×１０9個の粒子／ウェルを用いて実施例６に記載されるように測定した
。各サンプルを、ガラスバイアル中またはポリプロピレンチューブ中で行い、そ
して−８０℃にて一晩保存した。賦形剤の処方および結果を図１１に示す。
【００７８】 ５％ソルビトールを含む処方物は、サンプルをガラスバイアル中で保存した場
合、ｒＡＡＶ活性の喪失に対する部分的な保護効果を提供した。しかし、ＴＷＥ
ＥＮの添加は、有意に大きな保護効果を提供した。
【００７９】 従って、組換えＡＡＶ調製物の安定性を増強するための処方物が記載される。
本発明の好ましい実施形態を幾分詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲によ
って規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、明らかな改変が
行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例中に記載されたような組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ｈＦ
ＩＸ）の形質導入能力におけるガラスバイアル中での温度、ベクターの希釈およ
び保存の効果を示す棒グラフである。ｘ軸における数値は、保存温度を示し；ｐ
ｐバイアルは、ポリプロピレンバイアル中に保存されたサンプルを示し、そして
ｇｌバイアルは、ガラス中に保存されたサンプルを示す。
【図２】 図２は、実施例３に記載されるように行われた実験の結果を示す。ここで、２
９３−ＨＥＫ細胞は、記載された種々の希釈で、ポリプロピレンまたはガラス中
に１％または５％ソルビトール中に、保存されたサンプルを使用する１×１０8
ベクターゲノムを用いて形質導入された。棒グラフは、ｒＡＡＶ−ｈＦＩＸのｎ
ｇ／ｍｌを表し、そして棒グラフの上の線グラフは、希釈について正規化したデ
ータを表す。
【図３】 図３は、実施例３に記載されるように行われた実験の結果を示す。ここで、２
９３−ＨＥＫ細胞は、記載された種々の希釈で、ポリプロピレンまたはガラス中
に１％または５％ソルビトール中に、保存されたサンプルを使用する５×１０8
ベクターゲノムを用いて形質導入された。棒グラフは、ｒＡＡＶ−ｈＦＩＸのｎ
ｇ／ｍｌを表し、そして棒グラフの上の線グラフは、希釈について正規化したデ
ータを表す。
【図４】 図４は、ベクターゲノムの計算および形質導入能力のアッセイのために−８０
℃または環境温度（室温）で行われた実験の結果を示す。ここで、形質導入は、
実施例３に記載されるように１×１０8ベクターゲノムを用いてなされた。栗色
（右上り斜線）のバーは、室温でなされた実験の結果を示し、そして明るい青（
右下り斜線）のバーは、−８０℃でなされた実験を示す。
【図５】 図５は、ベクターゲノムの計算および形質導入能力のアッセイのために−８０
℃または環境温度（室温）で行われた実験の結果を示す。ここで、形質導入は、
実施例３に記載されるように５×１０8ベクターゲノムを用いてなされた。栗色
（右上り斜線）のバーは、室温でなされた実験の結果を示し、そして明るい青（
右下り斜線）のバーは、−８０℃でなされた実験を示す。
【図６】 図６は、表４に与えられたバラメーターを使用する実施例４に記載されたよう
に実験で得られた結果を示す。緑（右上り斜線）のバーは、１×１０8ベクター
ゲノムを使用して行われた実験を示し；赤（右下り斜線）のバーは、５×１０8
ベクターゲノムを使用して行われた実験を示し；ピンク（右下り太線入り斜線）
のバーは、１×１０9ベクターゲノムを使用して行われた実験を示し；暗い青（
右上り太線入り斜線）のバーは、５×１０8ベクターゲノムを使用して行われた
実験を示す。
【図７】 図７は、表４に与えられたパラメーターを使用して実施例４に記載された実験
で得られ、そしてベクターゲノムとして再グラフ化された結果を示す。暗い青（
右上り斜線）のバーは、希釈剤として培地を使用して行った実験を表し；ピンク
（右下り斜線）のバーは、希釈剤として０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を使用して行
った実験を表し；黄（縦線）のバーは、希釈剤として０．２％ＴＷＥＥＮ−２０
を使用して行った実験を表し；赤（横線）のバーは、希釈剤として０．５％ＴＷ
ＥＥＮ−２０を使用して行った実験を表し；緑（右下り破線）のバーは、希釈剤
として０．１％ＴＷＥＥＮ−８０を使用して行った実験を表し；茶（右上り破線
）のバーは、希釈剤として０．２％ＴＷＥＥＮ−８０を使用して行った実験を表
し；ラベンダー（横破線）のバーは、希釈剤として０．５％ＴＷＥＥＮ−８０を
使用して行った実験を表し；暗い灰色がかった青（縦破線）のバーは、希釈剤と
して２％ＰＥＧ−３３５０を使用して行った実験を表し；明るい緑がかった青（
右下り太線入り斜線）のバーは、希釈剤として３％ＰＥＧ−３３５０を使用して
行った実験を表し；紫−ストライプ（右上り太線入り斜線）のバーは、希釈剤と
して２．２５％グリシンを使用して行った実験を表し；明るい青（黒ぬり）のバ
ーは、希釈剤として０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０＋２％ ＰＥＧ−３３５０＋２
．２５％グリシンを使用して行った実験を表し；青（白ぬき）のバーは、希釈剤
として０．１％ＴＷＥＥＮ−８０＋２％ ＰＥＧ−３３５０＋２．２５％グリシ
ンを使用して行った実験を表す。すべての事例において、賦形剤は、１％ソルビ
トールを含む。
【図８】 図８は、表５に記載されたようにパラメーターを使用する組換えＡＡＶベクタ
ーの安定性における処方物組成物の効果を決定するために実施例５に記載された
実験において得られた結果を示す。明るい青（右下り斜線）のバーは、希釈剤と
して培地を使用して行われた実験を表し；黄（右上り斜線）のバーは、希釈剤と
して１０％プロピレングリコールを使用して行われた実験を表し；ピンク（縦線
）のバーは、希釈剤として２５％プロピレングリコールを使用して行われた実験
を表し；明るい緑がかった青（横線）のバーは、希釈剤として５０％プロピレン
グリコールを使用して行われた実験を表し；暗い青（横破線）のバーは、希釈剤
として１８％ＰＥＧ−４００を使用して行われた実験を表し；明るい茶（縦破線
）のバーは、希釈剤として２５％プロピレングリコール＋０．２％ＴＷＥＥＮ−
２０を使用して行われた実験を表し；青（右上り破線）のバーは、希釈剤として
２５％プロピレングリコール＋０．２％ＴＷＥＥＮ−８０を使用して行われた実
験を表す。
【図９】 図９は、表６に記載されたように組換えＡＡＶベクターの安定性における種々
の賦形剤および保存条件の効果を決定するために実施例６に記載された実験にお
いて得られた結果を示す。明るい青（右上り斜線）のバーは、希釈剤として、培
地そして−８０℃ガラス中保存を使用して行われた実験を表し；赤（右下り斜線
）のバーは、希釈剤として、０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中
保存を使用して行われた実験を表し；緑−ストライプ（縦線）のバーは、希釈剤
として、１％ソルビトールそして−８０℃ガラス中保存を使用して行われた実験
を表し；黄（横線）のバーは、希釈剤として、培地そして−８０℃ポリプロピレ
ン中保存を使用して行われた実験を表し；灰色（右上り破線）のバーは、希釈剤
として、０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ポリプロピレン中保存を使用
して行われた実験を表し；紫−ストライプ（右下り破線）のバーは、希釈剤とし
て、１％ソルビトールそして−８０℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた
実験を表し；暗い青（縦破線）のバーは、希釈剤として、培地そして＋４℃ガラ
ス中保存を使用して行われた実験を表し；青（横破線）のバーは、希釈剤として
、０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして＋４℃ガラス中保存を使用して行われた実験
を表し；青−ストライプ（右上り破線入り斜線）のバーは、希釈剤として、１％
ソルビトールそして＋４℃ガラス中保存を使用して行われた実験を表し；からし
色（右下り破線入り斜線）のバーは、希釈剤として、培地そして＋４℃ポリプロ
ピレン中保存を使用して行われた実験を表し；明るい黄（黒ぬり）のバーは、希
釈剤として、０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして＋４℃ポリプロピレン中保存を使
用して行われた実験を表し；ピンク−ストライプ（白ぬき）のバーは、希釈剤と
して、１％ソルビトールそして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用し行われた実
験を表す。
【図１０】 図１０は、ガラスバイアルまたはポリプロピレンバイアル中に保存されたサン
プルにおけるｒＡＡＶベクターの活性の欠失における種々の賦形剤の効果を決定
するために実施例７に記載されたように実験において得られた結果を示す。ラベ
ンダー色（右上り斜線）のバーは、希釈剤として、培地そして−８０℃ガラス中
保存を使用して行われた実験を表し；明るい青−ストライプ（右下り斜線）のバ
ーは、希釈剤として、１％ソルビトールそして−８０℃ガラス中保存を使用して
行われた実験を表し；暗い青−ストライプ（縦線）のバーは、希釈剤として、１
０％ポリピレングリコール（ＰＧ）そして−８０℃ガラス中保存を使用して行わ
れた実験を表し；灰色（横線）のバーは、希釈剤として、２５％ＰＧそして−８
０℃ガラス中保存を使用して行われた実験を表し；青（右下り破線）のバーは、
希釈剤として、１０％ＰＧ＋０．２％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中
保存を使用して行われた実験を表し；黄（右上り破線）のバーは、希釈剤として
、２５％ＰＧ＋０．２％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用し
て行われた実験を表し；茶−ストライプ（横破線）のバーは、希釈剤として、１
０％ＰＧ＋０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用して行
われた実験を表し；紫−ストライプ（縦破線）のバーは、希釈剤として、２５％
ＰＧ＋０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用して行われ
た実験を表し；暗い紫（右上り太線入り斜線）のバーは、希釈剤として、培地そ
して＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表し；ピンク（右下
り太線入り斜線）のバーは、希釈剤として、１％ソルビトールそして＋４℃ポリ
プロピレン中保存を使用して行われた実験を表し；明るい黄（右下り破線入り斜
線）のバーは、希釈剤として、１０％ＰＧそして＋４℃ポリプロピレン中保存を
使用して行われた実験を表し；明るい青緑色（右上り破線入り斜線）のバーは、
希釈剤として、２５％ＰＧそして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行われ
た実験を表し；暗い緑（太線入り横線）のバーは、希釈剤として、１０％ＰＧ＋
０．２％ＴＷＥＥＮ−８０そして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行われ
た実験を表し；明るい青（破線入り横線）のバーは、希釈剤として、２５％ＰＧ
＋０．２％ＴＷＥＥＮ−８０そして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行わ
れた実験を表し；緑（黒ぬり）のバーは、希釈剤として、１０％ＰＧ＋０．５％
ＴＷＥＥＮ−８０そして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を
表し；暗い青（白ぬき）のバーは、希釈剤として、２５％ＰＧ＋０．５％ＴＷＥ
ＥＮ−８０そして＋４℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表す。
図中の番号「１１８」は、特定の実施形態の番号を表す。
【図１１】 図１１は、ガラスバイアルまたはポリプロピレンチューブに保存されたサンプ
ルの凍結／融解サイクル後の組換えＡＡＶベクターの安定性において５％ソルビ
トール単独、および種々の賦形剤と組み合わされた５％ソルビトールの効果を決
定するために実施例８に記載されたように実験において得られた結果を示す。明
るい青（右下り斜線）のバーは、希釈剤として、培地（ソルビトールは含まない
）そして−８０℃ガラス中保存を使用して行われた実験を表し；ピンク（右上り
斜線）のバーは、希釈剤として、５％ソルビトールそして−８０℃ガラス中保存
を使用して行われた実験を表し；黄（横線）のバーは、希釈剤として、５％ソル
ビトール＋０．１％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用して行
われた実験を表し；緑（縦線）のバーは、希釈剤として、５％ソルビトール＋０
．２５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用して行われた実験
を表し；明るい茶（右上り破線）のバーは、希釈剤として、５％ソルビトール＋
０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃ガラス中保存を使用して行われた実験
を表し；明るい青緑（右下り破線）のバーは、希釈剤として、培地（ソルビトー
ルは含まない）そして−８０℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を
表し；灰色（縦破線）のバーは、希釈剤として、５％ソルビトールそして−８０
℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表し；青（横破線）のバーは
、希釈剤として、５％ソルビトール＋０．１％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃
ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表し；黄緑（黒ぬり）のバーは
、希釈剤として、５％ソルビトール＋０．２５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０
℃ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表し；赤（白ぬき）のバーは
、希釈剤として、５％ソルビトール＋０．５％ＴＷＥＥＮ−８０そして−８０℃
ポリプロピレン中保存を使用して行われた実験を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C076 AA16 BB11 CC07 DD08 DD09 DD38 DD46 FF11 FF63 4C084 AA13 CA01 MA01 MA05 MA17 MA66 NA03 NA04 ZB071 4C087 AA02 AA05 BC83 CA12 MA01 MA05 MA17 MA66 NA03 ZB07

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンおよび少なく
    とも１つの二価アルコールまたは多価アルコールを含む、薬学組成物。
  2. 【請求項２】 前記二価アルコールまたは多価アルコールがポリエチレング
    リコール、プロピレングリコールおよびソルビトールからなる群より選択される
    １つ以上のアルコールである、請求項１に記載の薬学組成物。
  3. 【請求項３】 前記１つ以上のアルコールがソルビトールであり、そして該
    ソルビトールが約０．１重量％〜約１０重量％の濃度で存在する、請求項２に記
    載の薬学組成物。
  4. 【請求項４】 ソルビトールが約１重量％〜約５重量％の濃度で存在する、
    請求項３に記載の薬学組成物。
  5. 【請求項５】 前記１つ以上のアルコールがポリエチレングリコールであり
    、そして該ポリエチレングリコールが約２重量％〜約４０重量％の濃度で存在す
    る、請求項２に記載の薬学組成物。
  6. 【請求項６】 ポリエチレングリコールが約１０重量％〜約２５重量％の濃
    度で存在する、請求項５に記載の薬学組成物。
  7. 【請求項７】 前記１つ以上のアルコールがプロピレングリコールであり、
    そして該プロピレングリコールが約２重量％〜約６０重量％の濃度で存在する、
    請求項２に記載の薬学組成物。
  8. 【請求項８】 プロピレングリコールが約５重量％〜約３０重量％の濃度で
    存在する、請求項７に記載の薬学組成物
  9. 【請求項９】 界面活性剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の
    薬学組成物。
  10. 【請求項１０】 前記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤である、請求項
    ９に記載の薬学組成物。
  11. 【請求項１１】 前記界面活性剤がソルビタンエステルである、請求項１０
    に記載の薬学組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の薬学組成物であって、ここで前記界面
    活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ
    −２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ＴＷＥＥ
    Ｎ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ＴＷＥ
    ＥＮ−６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアリン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−８０）およびポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル（
    ＴＷＥＥＮ−８５）からなる群より選択される、薬学組成物。
  13. 【請求項１３】 前記界面活性剤が約０．０５重量％〜約５重量％の濃度で
    存在するポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−
    ２０）である、請求項１２に記載の薬学組成物。
  14. 【請求項１４】 前記界面活性剤が約０．０５重量％〜約５重量％の濃度で
    存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−
    ８０）である、請求項１２に記載の薬学組成物。
  15. 【請求項１５】 １以上の用量で与えられる場合に、治療効果を提供するた
    めに十分な量で存在する組換えＡＡＶビリオンを含む薬学組成物であって、ソル
    ビトールが約１重量％〜約５重量％の濃度で存在し、そして界面活性剤が約０．
    １重量％〜約１重量％の濃度で存在し、ここで該界面活性剤がポリオキシエチレ
    ンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−２０）またはポリオキシエ
    チレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−８０）である、薬学組
    成物。
  16. 【請求項１６】 凍結および融解のサイクルへのビリオンの曝露から生じる
    活性の損失から組換えＡＡＶビリオンを保護するための方法であって、該方法は
    該ビリオンと二価アルコールまたは多価アルコールを含むビリオン安定化組成物
    とを混ぜる工程を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 前記二価アルコールまたは多価アルコールが、ポリエチレ
    ングリコール、プロピレングリコールおよびソルビトールからなる群より選択さ
    れる１つ以上のアルコールである、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記１つ以上のアルコールがソルビトールである、請求項
    １７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記１つ以上のアルコールがポリエチレングリコールであ
    る、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記１つ以上のアルコールがプロピレングリコールである
    、請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ビリオン安定化組成物がさらに界面活性剤を含む、請
    求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記界面活性剤がソルビタンエステルである、請求項２１
    に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法であって、ここで前記ソルビタン
    エステルがポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ
    −２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ＴＷＥＥ
    Ｎ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ＴＷＥ
    ＥＮ−６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアリン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−８０）およびポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル（
    ＴＷＥＥＮ−８５）からなる群より選択される、方法。
  24. 【請求項２４】 前記組換えＡＡＶビリオンが凍結乾燥された調製物として
    提供される、請求項１６〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 凍結および解凍のサイクルへのビリオンの曝露から生じる
    活性の損失から組換えＡＡＶビリオンを保護する方法であって、該方法は該ビリ
    オンとビリオン安定化組成物（ソルビタンならびにポリオキシエチレンソルビタ
    ンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−２０）、およびポリオキシエチレンソ
    ルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−８０）からなる群より選択され
    るソルビタンエステルを含む）とを混ぜる工程を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 ガラス容器中でのビリオンの保存から生じる活性の損失か
    ら組換えＡＡＶビリオンを保護する方法であって、該ビリオンとを二価アルコー
    ルまたは多価アルコールを含むビリオン安定化組成物とを混ぜる工程を包含する
    、方法。
  27. 【請求項２７】 前記二価アルコールまたは多価アルコールが、ポリエチレ
    ングリコール、プロピレングリコールおよびソルビトールからなる群より選択さ
    れる１つ以上のアルコールである、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記１つ以上のアルコールがソルビトールである、請求項
    ２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記１つ以上のアルコールがポリエチレングリコールであ
    る、請求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記１つ以上のアルコールがプロピレングリコールである
    、請求項２７に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ビリオン安定化組成物がさらに界面活性剤を含む、請
    求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記界面活性剤がソルビタンエステルである、請求項３１
    に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法であって、ここで前記ソルビタン
    エステルがポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ＴＷＥＥＮ
    −２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ＴＷＥＥ
    Ｎ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ＴＷＥ
    ＥＮ−６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアリン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ＴＷ
    ＥＥＮ−８０）およびポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル（
    ＴＷＥＥＮ−８５）からなる群より選択される、方法。
  34. 【請求項３４】 前記組換えＡＡＶビリオンが凍結乾燥された調製物として
    提供される、請求項２６〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ガラス容器中でのビリオンの保存から生じる活性の損失か
    ら組換えＡＡＶビリオンを保護する方法であって、該ビリオンをビリオン安定化
    組成物（ソルビトール、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸
    エステル（ＴＷＥＥＮ−２０）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレイ
    ン酸エステル（ＴＷＥＥＮ−８０）からなる群より選択されるソルビタンエステ
    ルを含む）とを混ぜる工程を包含するむ、方法。
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