CN117298296A - 一种重组腺相关病毒x载体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体、药学上可接受的缓冲液、非离子表面活性剂以及糖类。其中重组腺相关病毒(rAAV)载体具有来源于AAVX的衣壳蛋白。本发明制剂在不同环境条件下均具有良好的稳定性。

Description

一种重组腺相关病毒X载体制剂
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，更具体地，涉及一种重组腺相关病毒X(rAAVX)载体制剂。
背景技术
基因治疗为治疗基因缺陷疾病以及病毒感染等引起的多种疾病提供了一种新的思路和解决方案，随着一些重大疾病的基因治疗获得成功，标志着基因治疗已取得重大突破。重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗载体，具有非常多的优势，如感染效率高、感染范围广、长期表达和高安全性等(David AF等，2007，BMC Bio 7:75)，已被广泛应用于临床试验。
根据衣壳蛋白的不同，腺相关病毒(AAV)可分为多种血清型，例如AAV1-AAV12(高光平等，2004，J Virolm 78:6381-6388；Mori S等，2004，Virology 330:375-383；SchmidtM等，2008，J Virol 82:1399-1406)，主要以人类和灵长类动物为宿主。其中AAV1-6是从人类组织中分离获得的；AAV7和AAV8是高光平等通过基因工程手段从猕猴心脏组织拯救得到的；而AAV9-12是利用同类技术路线分别从人和短尾猴的组织中制备的。尽管不同血清型的AAV病毒都具有正二十面体的结构，但其衣壳蛋白在序列与空间构象上存在多样性，使得其细胞表面的结合受体以及对细胞的感染嗜性存在显著差异(Timpe J等，2005，Curr GeneTher 5:273-284)。例如，在感染嗜性方面，AAV2的感染谱较广，尤对神经细胞效果最好；AAV1和AAV7在骨骼肌中的转导效率较高；AAV3易于转导巨核细胞；AAV5和AAV6感染呼吸道上皮细胞的优势显著；而AAV8转导肝细胞的效率优于其它血清型。
目前对于腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白改造的研究越来越多，改造的目的一方面能够增强病毒载体的靶向性，另一方面能够降低病毒载体的免疫原性。改造方法包括利用DNA改组(DNA shuffling)或易错PCR的方法，获得功能优化的新型AAV病毒载体的衣壳蛋白。例如，Grimm等人利用AAV构建的改组文库，在静脉注射免疫球蛋白的严格筛选情况下，得到一个AAV2，8，9组成的嵌合体AAV-DJ，该载体对成纤维细胞和肺等多种细胞系有更高的转导效率(Grimm D等，2008，J Virol 82：5887-5911)。Jang等人利用DNA改组文库筛选到了一个能高效感染神经干细胞的AAV变体r3.45(Jang J H，2011，Mol Ther 19：667-675)。AAVX即是利用DNA shuffling技术获得的新型AAV载体(Xiao Xiao等，US9186419B2)，研究表明AAVX对于肝脏靶向具有很好的转导效率(参见，例如WO2022/100748A1)。
虽然重组腺相关病毒(rAAV)作为一种基因治疗载体，在基因治疗方面具有广阔的应用前景，但是基于AAV基因治疗的制剂开发仍处于早期阶段(例如，Yu(Zoe)Zhang.International Journal of Pharmaceutics,2021,606:120912)，尤其对于rAAVX，其制剂目前尚无相关报道。
临床和商业化的AAV产品需要具有长期储存稳定性以维持其功效，大多数临床和商业AAV产品是冷冻储存的(Arvind Srivastava.Journal of Pharmaceutical Sciences,2021,000:1-16)。在冻融过程中，潜在的病毒颗粒聚集是AAV产品制剂开发的主要挑战之一，例如上市产品Zolgensma要求在-60℃以下保存，解冻后在2-8℃保存，且不可再次冻融(ZOLGENSMA,2019,Package Insert.Novartis Gene Therapies,Inc.)，这表明产品在冻融条件下的稳定性有待提高。
对于采用静脉注射的AAV产品来说，渗透压是需要考虑的另外一个因素。正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围为285-310mOsmol/kg(中国药典2020年版，0632渗透压摩尔浓度测定法，85-86)，超过这个范围，给药时病人会有痛感。Zolgensma的NaCl浓度为200mM，制剂渗透压约为400mOsmol/kg，因此给药时要求单剂量静脉输注60分钟以上。该制剂中采用了较高的离子强度，虽然可以在一定程度上防止AAV聚集，但同时也会带来渗透压方面的问题。
基于以上问题，仍然需要对rAAV制剂进行改进，尤其是对rAAVX制剂进行开发研究，以使AAV产品，尤其是rAAVX产品在储存和运输过程中，在不同的温度环境下都可以保持更高的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体、药学上可接受的缓冲液、非离子表面活性剂和糖类。
重组腺相关病毒(rAAV)载体
根据本发明中所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，在一些实施方案中，所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有来源于AAVX的衣壳蛋白。
在一些具体实施方案中，所述来源于AAVX的衣壳蛋白包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
糖类
根据本发明中所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，在一些实施方案中，所述制剂中的糖类包括蔗糖、海藻糖或其组合，优选为蔗糖。
在一些具体实施方案中，所述糖类(例如，蔗糖、海藻糖或其组合)的浓度为0.5％-3.5％(w/v)，在一些具体实施方案中，所述糖类浓度优选为0.5％-3％(w/v)、0.8％-2.5％(w/v)更优选为1.0％-2.0％(w/v)。在某些具体实施方案中，所述蔗糖浓度为1.0％(w/v)，1.1％(w/v)，1.2％(w/v)，1.3％(w/v)，1.4％(w/v)，1.5％(w/v)，1.6％(w/v)，1.7％(w/v)，1.8％(w/v)，1.9％(w/v)，2.0％(w/v)，优选1.0％(w/v)，1.5％(w/v)，2.0％(w/v)，更优选1.5％(w/v)。
缓冲液
根据本发明中所述的重组腺相关病毒载体的制剂，在一些实施方案中，所述药学上可接受的缓冲液包含磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。在一些具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾。
在某些具体实施方案中，所述氯化钠的终浓度为4.0mg/ml-12.0mg/ml，优选为5.0mg/ml-11.0mg/ml，6.0mg/ml-10.0mg/ml，更优选7.0mg/ml-9.0mg/ml。在一些具体实施方案中，所述氯化钠的终浓度为7.0mg/ml，8.0mg/ml，9.0mg/ml，优选8.0mg/ml。
在某些具体实施方案中，所述氯化钾的终浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选为0.08mg/ml-0.4mg/ml，更优选为0.1mg/ml-0.3mg/ml，在一些具体实施方案中，所述氯化钾的终浓度为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，优选为0.2mg/ml。。
在某些具体实施方案中，所述磷酸氢二钠的终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml，优选为0.8mg/ml-1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml-1.2mg/ml。在一些具体实施方案中，所述磷酸氢二钠的终浓度为1.11mg/ml，1.12mg/ml，1.13mg/ml，1.14mg/ml，1.15mg/ml，1.16mg/ml，1.17mg/ml，1.18mg/ml，1.19mg/ml，1.20mg/ml，优选为1.15mg/ml。
在某些具体实施方案中，所述磷酸二氢钾的终浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选为0.08mg/ml-0.4mg/ml更优选为0.1mg/ml-0.3mg/ml，在一些具体实施方案中，所述磷酸二氢钾的终浓度为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，优选为0.2mg/ml。
非离子表面活性剂
根据本发明中所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，在一些实施方案中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80(PS80)或泊洛沙姆188(F68)，优选为泊洛沙姆188。
在一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80或泊洛沙姆188)的浓度为0.0005％-0.05％(w/v)。在一些具体实施方式中，所述泊洛沙姆188的浓度优选为0.0008％-0.03％(w/v)，进一步优选为0.001％-0.015％(w/v)，更优选为0.001％-0.01％(w/v)。在某些具体实施方案中，所述泊洛沙姆188的浓度为0.001％(w/v)，0.002％(w/v)，0.003％(w/v)，0.004％(w/v)，0.005％(w/v)，0.006％(w/v)，0.007％(w/v)，0.008％(w/v)，0.009％(w/v)，0.01％(w/v)，0.05％(w/v)，优选为0.001％(w/v)，0.005％(w/v)，0.01％(w/v)，更优选为0.005％(w/v)。
根据本发明所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，在一些实施方案中，所述重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组的滴度为1.0×109vg/ml-8.0×1013vg/ml，优选为1.0×1010vg/ml-5.0×1013vg/ml，1.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml，进一步优选为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml。在一些具体实施方案中，所述重组腺相关病毒(rAAV)载体的基因组滴度为1.0×109vg/ml，2.0×109vg/ml，3.0×109vg/ml，4.0×109vg/ml，5.0×109vg/ml，6.0×109vg/ml，7.0×109vg/ml，8.0×109vg/ml，9.0×109vg/ml，1.0×1010vg/ml，2.0×1010vg/ml，3.0×1010vg/ml，4.0×1010vg/ml，5.0×1010vg/ml，6.0×1010vg/ml，7.0×1010vg/ml，8.0×1010vg/ml，9.0×1010vg/ml，1.0×1011vg/ml，2.0×1011vg/ml，3.0×1011vg/ml，4.0×1011vg/ml，5.0×1011vg/ml，6.0×1011vg/ml，7.0×1011vg/ml，8.0×1011vg/ml，9.0×1011vg/ml，1.0×1012vg/ml，2.0×1012vg/ml，3.0×1012vg/ml，3.5×1012vg/ml，4.0×1012vg/ml，4.5×1012vg/ml，5.0×1012vg/ml，6.0×1012vg/ml，7.0×1012vg/ml，8.0×1012vg/ml，9.0×1012vg/ml，1.0×1013vg/ml，2.0×1013vg/ml，3.0×1013vg/ml，4.0×1013vg/ml，5.0×1013vg/ml，6.0×1013vg/ml，7.0×1013vg/ml，8.0×1013vg/ml，优选为2.0×1011vg/ml，3.5×1012vg/ml，5.0×1013vg/ml，更优选为3.5×1012vg/ml。
根据本发明中所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体的制剂，在一些实施方案中，所述制剂的pH值为6.0-9.0。在一些实施方案中，所述制剂的pH值为6.0-8.8，优选为6.5-8.5，更优选为7.3-8.5。在一些实施方案中，所述制剂的pH值为6.5、7.3、8.0、8.5，优选为7.3。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类。所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有优选来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳，所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选地，所述磷酸盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，所述糖类为蔗糖或海藻糖。所述rAAV制剂的pH值为6.0-9.0，优选为7.3-8.5。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类。其中：
所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有优选来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳蛋白，优选的，所述衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。；
所述rAAV载体的基因组滴度为1.0×109vg/ml-8.0×1013vg/ml，优选为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml；
所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，其中所述氯化钠的浓度为4.0mg/ml-12.0mg/ml，优选为7.0mg/ml-9.0mg/ml，更优选为8.0mg/ml；氯化钾的浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选为0.1mg/ml-0.3mg/ml，更优选为0.2mg/ml；磷酸氢二钠的浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml，优选为1.0mg/ml-1.2mg/ml，更优选1.15mg/ml；磷酸二氢钾的浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选为0.1mg/ml-0.3mg/ml，更优选0.2mg/ml；
所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，其浓度为0.0005％-0.05％(w/v)，优选为0.001％-0.01％(w/v)，更优选为0.005％(w/v)；
所述糖类为蔗糖或海藻糖，其浓度为0.5％-3.5％(w/v)，优选为1.0％-2.0％(w/v)，更优选为1.5％(w/v)；
所述rAAV制剂的pH值为6.0-9.0，优选为7.3-8.5，更优选为7.3。
在一些优选实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类，其中，
所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有优选来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
所述rAAV载体的基因组滴度为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml；
所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，其中所述氯化钠的浓度为7.0mg/ml-9.0mg/ml，氯化钾的浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml，磷酸氢二钠的浓度为1.0mg/ml-1.2mg/ml，磷酸二氢钾的浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml；
所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，其浓度为0.001％-0.01％(w/v)；
所述糖类为蔗糖或海藻糖，其中所述蔗糖或海藻糖的浓度为1.0％-2.0％(w/v)；
所述rAAV制剂的pH值为7.3-8.5，优选为7.3。
在一些优选实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类，其中，
所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有优选来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
所述rAAV载体的基因组滴度为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml；
所述药学上可接受的缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，其中所述氯化钠的浓度为8.0mg/ml，氯化钾的浓度为0.2mg/ml，磷酸氢二钠的浓度为1.15mg/ml，磷酸二氢钾的浓度为0.2mg/ml；
所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，其浓度为0.001％-0.01％(w/v)；
所述糖类为蔗糖或海藻糖，其中所述蔗糖或海藻糖的浓度为1.0％-2.0％(w/v)；
所述rAAV制剂的pH值为7.3-8.5，优选为7.3。
在一些优选实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类，其中：
所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；所述rAAV载体的基因组滴度为2.0×1011vg/ml、1×1012vg/ml、3.5×1012vg/ml、1×1013vg/ml或5.0×1013vg/ml；所述药学上可接受的缓冲液包含浓度为8.0mg/ml的氯化钠，浓度为0.2mg/ml的氯化钾，浓度为1.15mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为0.2mg/ml的磷酸二氢钾；所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，其浓度为0.001％(w/v)、0.005％(w/v)或0.01％(w/v)；所述糖类为蔗糖或海藻糖，其浓度为1.0％(w/v)、1.5％(w/v)或2.0％(w/v)；所述rAAV制剂的pH值为7.3-8.5，优选为7.3。
在一些更优选的实施方案中，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体，药学上可接受的缓冲液，非离子表面活性剂和糖类。所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有来源于腺相关病毒X(AAVX)的衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；所述rAAV载体的基因组滴度为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml；所述药学上可接受的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲液，其包含浓度为8.0mg/ml的氯化钠，浓度为0.2mg/ml的氯化钾，浓度为1.15mg/ml的磷酸氢二钠，浓度为0.2mg/ml的磷酸二氢钾；所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆188或PS80，其浓度为0.005％(w/v)；所述糖类为蔗糖或海藻糖，其浓度为1.5％(w/v)；所述rAAV制剂的pH值为7.3-8.5，优选为7.3。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常所理解相同的含义。为了促进对所公开内容的理解，在下文中定义多个术语和短语。
本文所述的“腺相关病毒(AAV)”是指一种能感染人和其他一些物种的小的复制缺陷型无包膜病毒。已知AAV不造成疾病并且只引起非常轻微的免疫应答。AAV可以感染分裂期细胞和静止细胞，并且可以保持游离染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使得AAV成为用于基因疗法的强有力的病毒载体。
本文所述的“重组”用在重组核酸分子是指其具有非天然存在的序列，或者具有两个或多个序列片段的人为组合制备的序列。这种人为组合可以通过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。术语“重组”还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失而改变的核酸、蛋白质和病毒。
本文所述的“重组病毒”包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人为组合制备的序列的病毒。本文使用的“重组腺相关病毒(rAAV)”或“重组腺相关病毒(rAAV)载体”是指其中包装有重组核酸分子的AAV颗粒。其包括至少一种AAV衣壳蛋白和所包裹的重组核酸分子，所述重组核酸分子包含异源多核苷酸序列(即除野生型AAV基因组序列之外的多核苷酸序列，例如待递送至哺乳动物的转基因序列)。rAAV可具有任何血清型AAV的衣壳蛋白或其变体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVX等或其变体。此类AAV衣壳蛋白或其变体以及相关制备方法是本领域已知的。本文中所称的rAAVX或rAAVX载体是指其衣壳蛋白含有或来源于AAVX衣壳蛋白(例如，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示)的rAAV或rAAV载体(例如，rAAV2/X)。
本文所述的“载体”是指能够转运、转导或以其他方式充当异源分子载体的任何分子或实体。
本文所述的“病毒载体”是指能够将核酸分子转移到细胞中的病毒或病毒粒子。病毒质粒载体指能转移的核酸本身(例如，转移质粒，包装质粒等)。病毒载体和病毒质粒载体含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。
本文所用术语“储存”意指组合物或制剂在制备后不立即向受试者施用，而是在使用之前的特定条件下(例如特定温度等)下保存一段时间。例如，液体或冻干组合物或制剂可保持数天、数周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年或更长时间，随后再施用于受试者。
本文所用术语“一种”或“一个”是指一种(个)或多种(个)。由此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。
本文所用术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”应解释为包含性的而非排他性的。术语“由……组成”或“基本上由……组成”应解释为排他性的而非包含性的。
本文所用术语“约”是指与给定参考值相差10％(±10％)的近似范围，除非另行规定。
本文所用的术语“和/或”是指涵盖相关的所列项目中的一种或多种的任何和所有可能的组合，以及当在替代方案(“或”)中解释为不具有组合。
本文所用术语“或”是指所列项目中的任何一个成员，并且还包括所述项目成员的任何组合。
本文所述的“药学上可接受的”是指生理上可耐受的并且当向受试者施用时通常不会产生不良反应的此类组合物的分子实体或其他成分。优选地，“药学上可接受的”意指由政府的管理机构批准或在中国药典或其它一般公认的药典中列出的可用于哺乳动物，更明确地说是可用于人类。“药学上可接受的盐”为可调配成用于药物用途的化合物或共轭物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和/或于药物组合物中施用于受试者的氨盐或有机铵盐等(参见例如Berge等人，1977，“药物盐(Pharmaceutical Salts)”，《药物科学杂志(J.Pharm.Sci)》，66:1)。在一些实施方案中，本文所公开的制剂是适合于需经由已知方法向患者施用的药学上可接受的组合物，所述已知方法例如静脉内施用(例如推注或连续输注一段时间)，或通过肌肉内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。在一些实施方式中，本文所公开的制剂适合于全身性或局部性施用。
本发明制剂的积极效果在于：
本发明制剂可使重组腺相关病毒(rAAV)载体，尤其是rAAVX载体在不同的环境条件下保持高的稳定性。在反复冻融、2-8℃加速条件下、以及37℃等极端条件下，本发明制剂相对于现有技术中的其他制剂均能保持更好的稳定性，可使rAAVX载体能耐受至少5次的反复冻融，在2-8℃加速条件下能保持至少8个月的良好稳定性，在37℃极端条件下能保持至少6天的良好稳定性，本发明制剂可使rAAVX在-80℃及-20℃温度下，均可保持至少2年良好稳定性。
具体实施方式：
以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。
本发明实施例中使用的示例性rAAVX载体是携带外源基因(shRNA编码序列)且衣壳蛋白为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的重组腺相关病毒载体rAAV2/X，具体参见WO2022/100748A1，其构建及包装方法也是本领域技术人员所熟知的。
实施例1制剂的筛选
1、pH值的选择
将具有AAVX衣壳蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的重组腺相关病毒载体(下称rAAVX)配制到不同pH(6.5、7.3、8.0和8.5)的缓冲液中。通过差式扫描荧光法(DSF)检测rAAVX在不同pH条件下的溶解温度(Tm)和聚集温度(Tagg 266)，以表征其热稳定性。Tm和Tagg 266均是反映热稳定性的良好指标，Tm和Tagg266越高，表明其热稳定性更好。不同pH值制剂中rAAVX的热稳定性检测结果如表1所示。
表1不同pH值下rAAVX制剂的检测结果
以上结果显示，pH值在6.5-8.5范围内，Tm值均没有明显变化。相对而言，pH值为6.5时Tagg266最低，表明在pH值为6.5时，rAAVX相对更易发生聚集。因此，本发明制剂选择pH值范围为7.3-8.5，其中pH值7.3接近人体的pH值，最终选择pH值为7.3。
2、缓冲液的选择
在反复冻融条件下研究两种不同缓冲液(磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液)对rAAVX制剂稳定性的影响。其中，通过检测rAAVX的基因组滴度和生物学活性变化来反映其稳定性。测定基因组滴度的方法是本领域技术人员所已知的，即通过Q-PCR方法进行检测(例如，可参见WO2022/100748A1)。生物学活性是通过报告基因法检测，其检测原理为利用本领域熟知的siRNA抑制基因表达的原理，在报告基因(如EGFP、Luc等)的3’非翻译区插入siRNA识别的靶序列，如果细胞中高效表达产生上述siRNA，则会降低或抑制报告基因的表达水平，该方法通过对报告基因的表达抑制率来反映rAAV的生物学活性。具体操作方法是本领域所已知的(可参见，例如：单志新等，2009，南方医科大学学报，8(29)：1577-1581)。简而言之，通过将靶序列连接在荧光素酶报告基因的3’非翻译区，构建稳转细胞系。用携带shRNA编码序列的rAAVX样品感染细胞，其所携带的编码序列在细胞中转录生成shRNA，进一步产生针对上述靶序列的siRNA，从而抑制荧光素酶的表达。利用荧光素酶检测试剂检测荧光强度，与对照组的荧光强度对比，其生物学活性表现为对荧光素酶表达的抑制率。不同缓冲液制剂配制如下表2：
表2含有不同缓冲液的rAAVX制剂
其中本发明实施例中所使用的示例性磷酸盐缓冲液中各成分及其浓度如下表3：
表3本发明实施例中所使用的示例性磷酸盐缓冲液的组成
成分 浓度(mg/ml)
NaCl 8.0
KCl 0.2
KH2PO4 0.2
Na2HPO4 1.15
在反复冻融条件下检测不同缓冲液中rAAVX的基因组滴度(vg/ml)和生物学活性的变化。冻融过程：冻：-80℃±10℃过夜冷冻；融：室温(平均22℃)，冻融0、1、3、5次。
结果如表4所示，在反复冻融条件下，随着冻融次数的增加，在磷酸盐缓冲液中，rAAVX的基因组滴度和生物学活性基本保持稳定；而在Tris缓冲液中，rAAVX的基因组滴度显著下降，在1个月后即降至2.0E+12vg/ml，相比起0天时下降约46％；生物学活性也显著下降，1个月后，从0天时的85.3％下降到43.4％。上述结果表明，在反复冻融条件下，相比起Tris缓冲液，rAAVX在磷酸盐缓冲液中具有更好的稳定性，因此，优选磷酸盐缓冲液。
表4含有不同缓冲液的制剂在反复冻融条件下的检测结果
3、泊洛沙姆188(F68)浓度选择
研究不同浓度的泊洛沙姆188(0.001％、0.005％、0.01％，w/v)对rAAVX制剂稳定性的影响。在反复冻融的条件下来进行稳定性的研究和测定(冻融过程：冻：-80℃±10℃过夜冷冻；融：室温(平均22℃)，冻融0、3、5次)。具有不同浓度泊洛沙姆188的制剂如下表5所示。
表5含有不同浓度泊洛沙姆188的rAAVX制剂
通过动态光散射法检测病毒颗粒的粒径，以表征冻融过程rAAV的粒径大小和分布情况(其中PDI为多分散系数，代表样品中粒径分布的分散程度)；通过流式颗粒成像法检测不溶性微粒，以在亚可见范围内表征制剂中的不溶性微粒数；体积排阻色谱法(SEC)检测结果反映病毒的聚集情况。同时还检测了冻融次数过程中对rAAVX的基因组滴度和生物学活性的影响(检测方法如上所述)。
结果如表6所示，制剂中的泊洛沙姆188浓度在0.001％-0.01％范围内，在冻融5次后，rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、基因组滴度和生物学活性均没有明显差异。上述结果表明，制剂中泊洛沙姆188的浓度在0.001％-0.01％的范围内时，rAAVX制剂均具有良好的稳定性。
表6含有不同浓度泊洛沙姆188的rAAVX制剂在反复冻融条件下的检测结果
4、蔗糖浓度选择
研究不同蔗糖浓度(1.0％、1.5％、2.0％，w/v)对rAAVX制剂稳定性的影响。在反复冻融的条件下(冻融过程：冻：-80℃±10℃过夜冷冻；融：室温(平均22℃)，冻融0、1、3、5次)进行稳定性的测定。含有不同蔗糖浓度的制剂如下表7所示。
表7含有不同蔗糖浓度的rAAVX制剂
检测冻融次数对rAAVX制剂的粒径大小和分布情况、制剂中的不溶性微粒数、rAAVX的聚集情况、以及rAAVX的基因组滴度和生物学活性的影响(检测方法同上)。
结果如表8所示，蔗糖浓度在1.0％-2.0％范围内，冻融5次后，rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、基因组滴度和生物学活性均没有明显差异。上述结果表明，蔗糖浓度在1.0％-2.0％的范围内时，rAAVX制剂均具有良好的稳定性。
表8含有不同蔗糖浓度的rAAVX制剂在反复冻融条件下的检测结果
综合上述实验结果，缓冲液体系为磷酸盐缓冲液，pH值为7.3-8.5，蔗糖浓度为1％-2％(w/v)，泊洛沙姆188浓度为0.001％-0.01％(w/v)的rAAVX制剂在各种条件下均具有良好的稳定性。选择pH为7.3，蔗糖浓度为1.5％，泊洛沙姆188浓度为0.005％的rAAVX制剂进行以下研究。
实施例2制剂稳定性对比研究
本实施例涉及本发明制剂与现有技术中示例性制剂进行的对比研究。
1、制剂的配制
按下表9配制相应的制剂。
表9制剂的组成
备注：对比制剂3中磷酸盐缓冲液(Modified)的NaCl浓度为5.84mg/ml，其余成分及其浓度与表3中相同。
2、稳定性研究
(1)冻融条件下稳定性研究
对比研究表9中所列的rAAVX制剂在冻融条件下的稳定性。冻融过程：冻：-70℃以下过夜冷冻；融：5℃±3℃，融5-7小时，冻融0、1、3、5次。
通过动态光散射法检测病毒颗粒的粒径，以表征冻融过程rAAVX的粒径大小和分布情况；通过流式颗粒成像法检测不溶性微粒，以在亚可见范围内表征制剂中的不溶性微粒数；体积排阻色谱法(SEC)结果反映病毒的聚集情况；同时还检测了冻融次数对渗透压(渗透压摩尔浓度测定法)、游离DNA(％)(荧光染料测定法，方法参见例如WO2021/071835A1)、rAAVX的基因组滴度和生物学活性的影响(检测方法同上)。检测结果见表10-表13。
本发明制剂(制剂9)的检测结果如表10中所示：冻融5次后，rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均没有明显变化。上述结果再一次表明，在本发明的制剂中，rAAVX对于反复冻融具有良好的耐受性，在至少5次冻融之后均具有良好的稳定性。
对比制剂1的检测结果如表11所示：冻融5次后，不溶性颗粒(≥10μm的颗粒和≥25μm的颗粒)均明显高于本发明的制剂。聚体(％)明显升高，相比起第0次时，上升了约290.2％，表明在对比制剂1中，病毒颗粒发生了明显聚集。游离DNA(％)也随冻融次数增加逐渐上升，相比起第0次时，上升了266.7％。这表明多次冻融后，病毒颗粒出现了裂解，释放出来的游离DNA增多。
对比制剂2-3的检测结果分别如表12和13所示：相比起本发明的制剂，对比制剂2和3中的不溶性颗粒(≥10μm的颗粒和≥25μm的颗粒)均有所上升；聚体(％)均升高，相比第0次时，在冻融5次后对比制剂2的聚体升高95.5％，对比制剂3的聚体升高97.8％；游离DNA(％)随冻融次数增加明显上升，相比第0次时，对比制剂2上升了181.3％，对比制剂3上升了186.7％。这表明多次冻融后，病毒颗粒裂解增多，释放出的游离DNA也相应增多。
上述结果总体表明，在冻融条件下，相对于对比制剂1-3，本发明的rAAVX制剂具有更加优异的稳定性。
表10本发明的制剂9在冻融条件下的检测结果
表11对比制剂1在冻融条件下的检测结果
表12对比制剂2在冻融条件下的检测结果
表13对比制剂3在冻融条件下的检测结果
(2)2-8℃加速条件下的稳定性研究
对比研究表9中所列的rAAVX制剂在2-8℃加速条件下(放置0月、2月、4月、8月)的稳定性。检测rAAVX制剂的的粒径大小和分布情况、不溶性微粒数、病毒的聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性，检测方法同上。检测结果见表14-表17。
本发明制剂的检测结果如表14所示：在2-8℃加速条件下放置8个月，本发明rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均没有明显变化。上述结果表明，2-8℃加速条件下，本发明rAAVX制剂能在至少8个月内保持良好的稳定性。
对比制剂1的检测结果如表15所示：在该对比制剂中，2-8℃加速条件下，随着时间推移，≥10μm的不溶性颗粒逐渐升高，≥25μm的不溶性颗粒也均明显多于本发明制剂；相比起0个月时，聚集体和游离DNA都显著升高，在第8个月分别上升了266.7％和222.2％；基因组滴度和生物学活性均显著降低，与第0个月相比，在第8个月分别下降了47.4％和45.1％。
对比制剂2-3的检测结果分别如表16和表17所示：相对于本发明制剂，在2-8℃加速条件下，随着时间的推移，≥10μm和≥25μm的不溶性颗粒均逐渐升高；聚体均逐渐增多，相比起0个月时，在第8个月，对比制剂2和3的聚体分别升高了102.3％和111.1％；游离DNA(％)均逐渐升高，相比第0个月，在第8个月，对比制剂2和3分别升高了100％和120％。对比制剂2和3中，基因组滴度和生物学活性也均发生明显下降，其中，与第0个月相比，在第8个月，基因组滴度分别下降了37.8％和36.4％，生物学活性分别下降了31.4％和31.3％。
以上结果表明，在2-8℃加速条件下，相比起对比制剂1-3，本发明rAAVX制剂具有更加优异的稳定性。
表14本发明制剂9在2-8℃加速条件下的检测结果
表15对比制剂1在2-8℃加速条件下的检测结果
表16对比制剂2在2-8℃加速条件下的检测结果
表17对比制剂3在2-8℃加速条件下的检测结果
(3)37℃极端条件下的稳定性研究
对比研究表9中所列的rAAVX制剂在37℃极端条件下(放置0天、2天、4天、6天)的稳定性。检测rAAVX制剂的粒径大小和分布情况、不溶性微粒数、病毒的聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性，检测方法同上。检测结果见表18-表21。
本发明制剂的检测结果如表18所示：在37℃极端条件下放置6天，本发明rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均没有明显变化。上述结果表明，在37℃极端条件下，本发明rAAVX制剂能在至少6天内保持良好稳定性。
对比制剂1的检测结果如表19所示：在对比制剂1中，在37℃极端条件下，随着时间的推移，不溶性颗粒数显著上升(包括≥10μm和≥25μm的不溶性颗粒)；聚集体和游离DNA(％)显著升高，相比起0天时，在第6天分别上升了876.5％和333.3％；基因组滴度和生物学活性均显著下降，与0天相比，第6天时分别下降了50％和65.7％。
对比制剂2和3的检测结果分别如表20和表21所示：相对于本发明制剂，在37℃极端条件下，随着时间的推移，≥10μm和≥25μm的不溶性颗粒均明显升高；聚体明显增多，相比第0天，在第6天分别上升了684.1％和682.2％；游离DNA(％)逐渐升高，在第6天分别上升了162.5％和153.3％。对比制剂2和3的基因组滴度和生物学活性也均出现明显下降，与第0天相比，基因组滴度在第6天时分别下降32.4％和36.4％，生物学活性分别下降48.4％和49.2％。
以上结果表明，在37℃极端条件下，相比于对比制剂1-3，本发明rAAVX制剂中具有更加优异的稳定性。
表18本发明制剂9在37℃极端条件下的检测结果
表19对比制剂1在37℃极端条件下的检测结果
表20对比制剂2在的37℃极端条件下的检测结果
表21对比制剂3在37℃极端条件下检测结果
实施例3长期稳定性研究
(1)-80℃条件下的长期稳定性研究
研究本发明rAAVX制剂在-80℃长期储存条件下(储存0月、2月、4月、8月、12月、18月、24月)的稳定性。分别检测rAAVX制剂的粒径大小和分布情况、不溶性微粒数、病毒聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性，检测方法同实施例2。
检测结果如表22所示：在-80℃长期储存2年内，本发明rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均未发生明显变化。上述结果表明，在-80℃条件下，本发明rAAVX制剂能在至少2年内保持良好的稳定性。
表22本发明制剂在-80℃长期条件下的检测结果
(2)-20℃条件下的长期稳定性研究
研究本发明rAAVX制剂在-20℃长期储存条件下(储存0月、2月、4月、8月、12月、18月、24月)的稳定性。分别检测rAAVX制剂的粒径大小和分布情况、不溶性微粒数、病毒聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性，检测方法同上。
检测结果如表23所示：在-20℃储存2年内，本发明rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均无明显变化。上述结果表明，在-20℃条件下，本发明rAAVX制剂能在至少2年内具有良好的稳定性。
表23本发明制剂在-20℃长期条件下的检测结果
(3)不同病毒滴度下在-80℃条件下的长期稳定性研究
研究包含不同rAAVX病毒滴度(分别为5×1013vg/ml、3.5×1012vg/ml、2×1011vg/ml)的本发明制剂在-80℃长期条件下(储存0月、2月、4月、8月、12月、18月、24月)的稳定性。检测rAAVX制剂的粒径大小和分布情况、不溶性微粒数、病毒聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性，检测方法同实施例2。
检测结果如表24-表26所示：在-80℃储存2年内，包含不同病毒滴度(分别为5×1013vg/ml、3.5×1012vg/ml、2×1011vg/ml)的本发明rAAVX制剂的粒径大小和分布、不溶性微粒数、聚集情况、渗透压、游离DNA(％)、基因组滴度和生物学活性均无明显变化。上述结果表明，在-80℃条件下，本发明rAAVX制剂在不同病毒滴度的的情况下，在至少2年内均可保持良好的稳定性。
表24本发明制剂的rAAVX病毒滴度为3.5×1012vg/ml在-80℃条件下的检测结果
表25本发明制剂的rAAVX病毒滴度为5×1013vg/ml在-80℃条件下的检测结果
表26本发明制剂的rAAVX病毒滴度为2×1011vg/ml在-80℃条件下的检测结果
以上所述本发明的实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体制剂，其特征在于，所述制剂包含重组腺相关病毒(rAAV)载体、药学上可接受的缓冲液、非离子表面活性剂以及糖类。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述重组腺相关病毒(rAAV)载体具有来源于AAVX的衣壳蛋白。
3.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述AAVX衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％以上序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的制剂，其特征在于，所述糖类为蔗糖、海藻糖或其组合，优选为蔗糖。
5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述糖类的浓度为0.5％-3.5％(w/v)，优选为1.0％-2.0％(w/v)，更优选为1.5％(w/v)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的制剂，其特征在于，所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾。
8.如权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述氯化钠的终浓度为4.0mg/ml-12.0mg/ml，优选7.0mg/ml-9.0mg/ml，更优选为8.0mg/ml；
所述氯化钾的终浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选0.1mg/ml-0.3mg/ml，更优选为0.2mg/ml；
所述磷酸氢二钠的终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml，优选为1.0mg/ml-1.2mg/ml，更优选为1.15mg/ml；
所述磷酸二氢钾的终浓度为0.05mg/ml-0.5mg/ml，优选0.1mg/ml-0.3mg/ml，更优选为0.2mg/ml。
9.如权利要求1-8任一项所述的制剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯80、泊洛沙姆188或其组合，优选为泊洛沙姆188。
10.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂的浓度为0.0005％-0.05％(w/v)，优选为0.001％-0.01％(w/v)，更优选为0.005％(w/v)。
11.如权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的基因组滴度为1.0×109vg/ml-8.0×1013vg/ml，优选为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml。
12.如权利要求11所述的制剂，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的基因组滴度为2.0×1011vg/ml、3.5×1012vg/ml或5.0×1013vg/ml，更优选为3.5×1012vg/ml。
13.如权利要求1-12中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂的pH值为6.0-9.0，优选为7.3-8.5，更优选为7.3。
14.如权利要求1-13中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含：
基因组滴度为1.0×109vg/ml-8.0×1013vg/ml的重组腺相关病毒X(rAAVX)载体；
0.0005％-0.05％(w/v)，优选0.001-0.01％(w/v)的泊洛沙姆188；
0.5％-3.5％(w/v)，优选1.0％-2.0％(w/v)的蔗糖；
磷酸盐缓冲液；
制剂的pH值为6.0-9.0，优选7.3-8.5。
15.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含：
基因组滴度为2.0×1011vg/ml-5.0×1013vg/ml的重组腺相关病毒X(rAAVX)载体；
0.001％-0.01％(w/v)的泊洛沙姆188；
1.0％-2.0％(w/v)的蔗糖；
磷酸盐缓冲液；
制剂的pH值为7.3-8.5。
16.如权利要求15所述的制剂，其特征在于，所述制剂包含：
基因组滴度为2.0×1011vg/ml、3.5×1012vg/ml或5.0×1013vg/ml的重组腺相关病毒X(rAAVX)载体；
0.001％(w/v)、0.005％(w/v)或0.01％(w/v)的泊洛沙姆188；
1.0％(w/v)、1.5％(w/v)或2.0％(w/v)的蔗糖；
磷酸盐缓冲液；
制剂的pH值为7.3。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN118240775A (zh) * 2024-05-29 2024-06-25 丽山健康(山东)集团有限公司 一种腺相关病毒储存方法

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