KR20020013521A

KR20020013521A - 감염성 재조합 아데노바이러스 보존용 조성물

Info

Publication number: KR20020013521A
Application number: KR1020017012805A
Authority: KR
Inventors: 블랑셰프랑시스; 쉬쉬안-지운
Original assignee: 추후제출; 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2002-02-20
Also published as: US20040191909A1; MXPA01010124A; NO20014765D0; US20020061592A1; CN1347450A; WO2000061726A1; CA2364562A1; CZ20013560A3; HK1045716A1; NO20014765L; US6734008B2; NZ514731A; EP1194529A1; IL145447A0; HUP0200821A2; JP2002541792A; HUP0200821A3; AU778894B2; PL351553A1; IL145447A

Abstract

매질의 pH를 약 알칼리 수준에서 고정할 수 있는 완충용액을 포함하고, 글리세롤이 첨가되고 이가 금속 양이온 또는 알칼리 양이온이 첨가되지 않은, 아데노바이러스 입자를 함유하는 액체 또는 심냉동 조성물.

Description

감염성 재조합 아데노바이러스 보존용 조성물{COMPOSITION FOR THE PRESERVATION OF INFECTIOUS RECOMBINANT ADENOVIRUSES}

안정한 조성물에서 아데노바이러스의 보존은 다수 연구의 주제가 될 정도로 주지의 고민거리가 되고 있으면서도, 현재까지 실제로 만족스런 결과에 이르지는 않고 있다. 재조합 바이러스는 붕괴 없이 이의 감염력의 손실 없이 성공적으로 보관될 수 있는 경우에만 실제로 사용될 수 있다.

용액에서 아데노바이러스 입자의 물리적 상태는 시간에 따라 두 가지 형태의 동시에 빠른 손상을 경험한다: 한편으론, 비가역성으로 인해 극도로 심한 외상인 럼프 또는 필라멘트 형태로 입자의 응집(응고), 다른 한편으론, 캡시드 자체의 20면체 구조의 붕괴(매질중으로 캡시드의 용해 및 캡소머의 방출에 의해).

국제 출원 WO 98/02522에서, 수크로스를 포함하는 수용액에서 감염성 재조합 바이러스를 현탁액 형태로 보존하는 방법에 관해 기재하고 있다. 추천된 조성물은 글리세롤을 함유하지 않고 바람직한 측면에 따르면 적어도 하나의 이가 양이온 또는 일가 알칼리 금속 양이온 염을 함유한다.

그러나, 수크로스는 +4℃에서 체계적으로 안정화를 제공하지 못하고, 경우에 따라선, 이 온도에서 안정화는 2주를 초과하지 못하거나 기껏해야 2개월 이내인 것으로 나타났다.

J.Virology, 70(11), 7498-7509(1996)에서, 트리스 완충액과 글리세롤에 기초하면서 체계적으로 마그네슘 클로라이드를 함유하고 있는 완충액 형태의 아데노바이러스의 보존에 관해 기재하고 있다. 이들 제조물은 감염력 감소를 피하기 위해 -70℃ 정도로 매우 낮은 온도에서 보존을 요구한다.

Human Gene Therapy, 7, 1693-99 (1996)에서, 보관을 위해 트리스 완충액과 글리세롤에 기초하면서 마그네슘 클로라이드를 포함한 제형을 사용하고 있다. 이 제형은 -80℃에서 보관된다.

좀더 일반적으로 말해서, 지금까지 문헌에 기재된 트리스-계 제형은 체계적으로 마그네슘 클로라이드(일반적으로 1 mM) 및/또는 염을 생리학적 농도(일반적으로 NaCl 150 mM)로 함유하고 있다. 예를 들면, 문헌[참고: Cell, 68, 143-155(1992); Nature Genetics, 3, 229-234 (1993); Human Gene Therapy, 6, 5-11(1995); Human Gene Therapy, 6, 145-153(1995); Human Gene Therapy, 6, 277-287(1995); Human Gene Therapy, 6, 643-666(1995); Human Gene Therapy, 6, 1039-1044(1995); Human Gene Therapy, 6, 1317-1322(1995); Human Gene Therapy, 6, 1587-1593(1995); Human Gene Therapy, 7, 2177-2184(1996); J. Virology, 73, 1601-1608(1999)]이 언급될 수 있다. 저자들이 설명한 바에 따르면, 바이러스의 보존은 체계적으로 -70℃/-80℃에서 수행된다.

바이러스 구조의 변화(응집 및 용해)가 용액에 첨가된 특정 양이온성 카운터이온의 농도와 아데노바이러스 농도와 같은 요인에 매우 좌우되는 현상인 것으로 나타났다. 약 1E12 vp/㎖ 농도 이상에서, 사용된 약학 조성물에 따라, 수 시간 내지 수 일내에 캡시드의 응집 및 붕괴 (및 이에 따른 감염력 손실)이 관찰되지만, 이들 현상은 낮은 농도에선 좀더 서서히 진행된다. 이로 인해, 바이러스 입자의 높은 농도를 지닌 조성물은 장기간 동안 보관하기가 특히 어렵다.

본 발명은 안정되고 저장가능한 형태로 아데노바이러스의 보존 및 이러한 보존을 위한 액체 또는 동결 조성물에 관한 것이다.

감염성 재조합 아데노바이러스가 수성 매질에서, +4 내지 +20℃의 온도에서, 글리세롤이 보충되고 이가 금속 양이온 또는 알칼리 금속 양이온이 첨가되지 않은 약 알칼리 값으로 매질의 pH를 유지시킬 수 있는 완충액에서 현탁액 형태로 보존될 수 있음이 밝혀졌고, 이는 본 발명의 주제를 구성한다.

좀더 구체적으로 말하면, 매질의 pH는 8.0에서 9.6으로 유지된다.

글리세롤이 보충된 완충액에서 아데노바이러스 입자를 함유한 액체 또는 동결 조성물도 본 발명의 범위내이다. 이들 조성물은 우수한 안정성의 상당한 이점을 가지면서, 장기간 동안 고 농도의 바이러스 입자의 보존에 특히 적합하다.

본 발명에 따르면, 매질의 pH를 8.0에서 9.6으로 유지시킬 수 있는 완충액은 트리스(Tris)[트리스(하이드록시메틸)아미노메탄], 또는 라이신 및 강산(예:염산) 또는 약산(예: 말레산, 말산 또는 아세트산) 중에서 선택된 산을 포함하는 산/염기 시스템, 또는 Hepes[2-(4-(2-하이드록시에틸피페라진)-1-일)에탄술폰산]과 강 염기(예: 나트륨 하이드록사이드)를 포함하는 산/염기 시스템으로 구성된다.

바람직하게는, pH는 8.4 내지 8.8로 유지되고 좀더 구체적으로는 8.4(25℃에서 측정된 값)로 유지된다.

완충액의 농도를 측정하여 pH값에 영향을 미치지 않는 범위 및 용적내에서 완충 효과를 일으킨다. 산+염기의 몰 농도는 10 내지 500 mM, 바람직하게는 20 내지 100 mM로 달라질 수 있고, 좀더 구체적으로는 20 mM에서 유지된다. 본 발명에 따른 완충 시스템 중에서, 20 mM 농도의 트리스/HCl 완충액이 특히 만족스런 결과를 낳는다.

본 발명에 따르면, 조성물은 10 내지 50%의 글리세롤, 바람직하게는 20 내지 25%(용적/용적)의 글리세롤을 함유한다.

본 발명에 따른 조성물은 부가적으로 임의로 기타 보조제를 함유할 수 있다. 후자는 중합체(폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면 PEG 400, PEG 8000), 플루로닉(예: Pluronic F68), 특히 약 1 내지 20 중량%의 양으로, 폴리소르베이트(특히, Tween-20, 예를 들어 0.01 내지 1 중량%) 중에서 선택되거나, 수크로스, 만니톨 또는 덱스트로스와 같은 당(특히 약 5 내지 10% 양으로), 또는 1 내지 10 용적% 양의 알콜(특히 에탄올) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 고 농도의 아데노바이러스 제조물의 보존에 특히 적합하다. 실제로, 이렇게 안정화된 조성물은 바이러스 감염력을 유지하면서 바이러스 입자를 액체 수성 현탁액으로 유지시킬 수 있으며(특히 +4 내지 +20℃), 이는 매우 높은 바이러스 농도로 제공된다(1E8 vp/㎖에서 1E12 vp/㎖ 또는 1E13 vp/㎖에 이르는 값과, 심지어 5E13 vp/㎖만큼 높을 수도 있음).

본 발명의 또다른 양태에 따르면, 바이러스는 -20℃에서 동결되어, 수개월 또는 이보다 장기간 동안 보존된 다음 이의 구조 또는 감염력에 손상을 미침이 없이 이러한 제형에서 해동될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 조성물은 완충액에서 초기에 수용액에서 얻어진 아데노바이러스 입자를 현탁시킨 다음 정제하고 글리세롤을 첨가한 다음 임의로 앞서 인용된 보조제를 첨가하여 제조될 수 있다.

감염성 재조합 아데노바이러스는 캡시드화 트랜스상보 계통의 세포, 예를 들면 293 계통 또는 PER-C6 계통의 세포에서 일반적인 생성방법에 따라 얻어질 수 있다. 바이러스 입자는 예를 들어, 문헌[참조: Journal of General Virology, 34, 19-35 (1977)]에 기재된 세슘 클로라이드 구배 원심분리에 의해 정제될 수 있다. 좀더 구체적으로 말하면, 바이러스 입자는 음이온-교환 방식의 액체 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 방식 또는 금속 킬레이트화에 의해 정제된다. 음이온 교환에 의한 정제가 특히 이로운데 그 이유는 단일 크로마토그래피 단계에서 단백질, 핵산과 기타 불순물 및 생산 세포에서 얻어진 대사물질 없이, 배양 배지에서 얻어진 화합물 없이 순수한 바이러스 제조물을 얻을 수 있기 때문이다. 크로마토그래피에 의한 바람직한 정제 방식은 예를 들면 국제 출원 WO 98/00524 또는 하기에 기재되어 있다. 아데노바이러스 입자는 특히 투석, 투석여과 또는 겔 여과 크로마토그래피 방법을 이용하여 보존 완충액에서 제형된다. 이렇게 얻어진 조성물은 임의로 원하는 저장 온도(예: -20℃)에서 동결되어 보관될 수 있지만, 이러한 작업이 장기간 보존에 필수적인 것은 아니고, 조성물은 +4 내지 +20℃에서 액체 상태로 안정화된다.

본 발명에 따른 조성물은 +4℃에서 적어도 6개월간, +20℃에서 적어도 5개월간 뚜렷한 붕괴 없이[물리적 및 생물학적 안정성 (감염력)] 안정하다. 물리적으로 안정한 용액은 좀더 구체적으로는 해당 보존 기간 후 응집, 입자의 침강 또는 침전물의 외관을 나타내지 않은 용액을 의미하는 것으로 해석한다(눈으로 판단, 광학 밀도 측정, 전자 현미경 분석, 또는 입자의 크기 분포 분석에 의해).

본 발명은 좀더 구체적으로는 감염성 아데노바이러스의 안정화된 형태로 보존과 이러한 보존을 위한 액체 또는 동결 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 제형은 고농도 바이러스의 가능성을 가지면서 +4 내지 +20℃의 온도에서 액체 형태로 아데노바이러스를 보존할 수 있도록 제조된 최초의 조성물이라는 점에서 관심이 집중된다. 본 발명은 재조합 아데노바이러스의 적용에 특히 유리하지만, 일반적으로 모든 아데노바이러스(야생형 또는 재조합)에 적용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 조성물에서 유리하게 보존될 수 있는 하기의 특정 아데노바이러스가 언급될 수 있다: A,B,C,D,E 및 F로 불리는 6종의 공지된 서브그룹에 속하는 모든 인간 야생형 아데노바이러스, 좀더 구체적으로 말하면 이들 6종의 서브그룹을 구성하는 인간 아데노바이러스의 49종의 모든 상이한 혈청형. 마찬가지로, 본 발명은 아데노비리대 과에 속하는 원숭이, 소, 말, 돼지, 양 또는 개 야생형 바이러스에 적용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 아데노비리대 과에 속하는 야생형 바이러스로부터 수득되는 돌연변이 바이러스에 적용될 수 있다.

본 발명이 적용될 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터로는, E1이라고 불리는 게놈의 영역에서, 또는 E2 영역에서, 또는 E3 영역 또는 E4 영역에서 1 이상의 결실이 일어난 모든 변형 아데노바이러스, 상기의 영역에서 다수의 결실이 함께 일어난 재조합 바이러스 및 완전히 결실된 재조합 바이러스(구트리스(gutless)라고 불림)가 언급될 수 있다[FASEB, 11, 615 (1997)].

마찬가지로, 본 발명은 또한 해당 핵산을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터도 적용된다. 해당 핵산은 아데노바이러스 게놈의 상이한 부위에 삽입될 수 있다. 유리하게는, 이는 E1, E3 또는 E4 영역의 수준에 삽입된다. 그러나, 다른 부위도 사용될 수 있음이 명백하다. 특히, 게놈의 뉴클레오타이드 서열에의 접근은 당업자가 해당 핵산을 삽입할 수 있는 영역을 동정하도록 한다. 해당 핵산은 도입된 임의의 DNA 서열, 특히 표적 세포에서의 전달 및/또는 발현이 발견되는 임의의 서열일 수 있다.

특히, 이는 1 이상의 치료 유전자 및/또는 항원성 단백질을 암호화하는 1 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 따라서 전달될 수 있는 치료 유전자는 표적 세포에서의 전사 및 임의의 해독이 치료 효능을 가지는 산물을 생산하는 모든 유전자이다. 치료 산물 중에서, 더욱 자세히 설명하면 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF 등(WO93/19191), 성장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등, 아포지단백질: ApoAⅠ, ApoⅣ, ApoE 등(WO94/25073), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(WO93/06223), 재협착증을 조절할 수 있는 유전자: GAX, NOS 등,종양-억제자 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(WO94/24297), 응집에 관여하는 인자를 암호화하는 유전자: 인자 Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ, 자살 유전자: TK 등, 천연 또는 인공 면역글로불린: Fab, ScFv(WO94/29446), 항-아폽토시스 유전자: AKT 등이 언급될 수 있다.

치료 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 특허 출원 EP 140 308에 설명된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보성인 RNA로 전사되어 이들의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명은 레트로바이러스의 생산을 허용하는 재조합 아데노바이러스 벡터[Tumor Targetting, 3, 59 (1998)], 바이러스 캡시드의 1 이상의 구성 단백질, 특히 섬유(단백질 Ⅳ) 및 헥손 단백질(단백질 Ⅱ)에 1 이상의 변형이 일어난 아데노바이러스 또는 섬유-없는 아데노바이러스[Journal of Virology, 73, 1601 (1999)]에 적용되고, 이들 변형은 각각 아데노바이러스의 천연 향성을 변형시킬 목적으로 일어난다[Current Opinion in Biotechnology,8, 583 (1997)].

더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 이들이 유전자 요법에 의한 치료 또는 예방 처리를 목적으로 하는 약제의 제조를 위해 사용될 수 있기 때문에 특히 유리하다.

감염성 바이러스는 다수로 적용되는데 이들 중에서 백신접종 분야 및 유전자 요법 분야에서의 이의 사용이 언급될 수 있다. 이들 적용에서, 이들의 유전 물질(RNA 또는 DNA)을 숙주세포에 전달한 후에, 바이러스는 감염된 세포의 세포 기구를 사용하여 그들 자신의 게놈에 의해 암호화되는 단백질의 합성을 수행하고, 추구하는 특이적 생물학적 효과를 유도한다. 유전자 요법 적용에서, 해당 치료 유전자를 옮기는 감염성 재조합 바이러스는 이 유전자를 치료할 환자 장기의 특정 세포에 전달하는 데 사용된다. 다양한 치료 프로토콜이 설명되었고 바이러스 벡터를 통한 치료 유전자의 전달 및 발현에 대해 현재 임상적으로 평가되고 있다. 이들 벡터 중에서, 비반복성 아데노바이러스 벡터가 치료 단백질을 암호화하는 유전자를 전달하기 위해 과거 수년간 다양하게 개발되었다. 이들 유전자 중에서, 세포 증식의 조절에 관여하는, 종양 억제자 유전자 p53이 언급될 수 있다. 인간에서 아데노바이러스를 통해 p53 유전자를 전달하기 위한 다양한 임상 시험 프로토콜이 항암 징후에서 현재 개발되고 있다. 개발되고 있는 다른 적용으로는, 낭포성 섬유증의 치료 사례가 언급될 수 있다.

치료제로서 아데노바이러스 벡터의 사용은 문제의 바이러스 감염력의 상당한 손실 없이 충분히 장기간 동안 제조물을 보존하고 저장할 수 있는 방법이 이용가능할 때만 관찰될 수 있다. 이것이 본 발명이 특히 주목받는 이유이다.

제한을 의미하지 않는, 하기의 실시예는 본 발명이 어떻게 수행되고, 이렇게 제형된 조성물의 안정성 및 입자의 감염력을 보여준다.

실시예 1

본 발명에 따른 조성물의 제조:

바이러스 현탁액을 다음 방법으로 제조한다: 293 세포를 10% 태 송아지 혈청이 보충된 DMEM 배지의 CellCube(Costar)에서 배양한다. 이들이 융합되면, 세포를 p53 유전자를 발현하는 아데노바이러스의 워킹 라이브러리로부터의 분취량으로 2 감염중복도로 감염시킨다. 감염 5일 후에, 생성 현탁액을 배수로 수확하고 감소하는 다공성 10/1/0.8-0.2 ㎛의 필터 세트를 통해 통과시킴으로써 정제한다. 이어서 이 상등액을 300 kDa의 컷-오프를 가지는 Millipore 막 상의 접선 한외여과로 용적으로 20배 농축한다. 이어서 바이러스를 평형화하고 20 mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.0) 중의 나트륨 클로라이드 구배로 용출하는 Source 15Q 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제한다. 바이러스 피크를 수집하고, 바이러스를 300 kDa의 컷-오프를 가지는 Millipore 막 상의 접선 한외여과로 농축한다. 이렇게 수득된 바이러스 제조물은 매우 고순도이고 1E12 바이러스 입자의 경우 혈청 소 알부민 < 50 ng 및 숙주세포 DNA < 10 ng을 함유한다. 이어서 바이러스를 선택된 다양한 완충액으로 제형한다. 이 작업을 수행하기 위해, 완충액의 변화는 공급자의 지시에 따라 선택된 완충액으로 평형화하고 용출하는 Sephadex G-25가 충진된 PD-10 컬럼(Amersham-Pharmacia Biotech) 상의 크로마토그래피로 이루어진다. 크로마토그래피에 의한 분석 후에, 바이러스의 농도는 필요시 선택된 제형 완충액으로 희석함으로써 목적하는 값으로 조절된다. 이어서 다양한 제형에서의 바이러스 안정성을 선택된 각 제형에 대해 연구 온도(-20℃, +4℃ 또는 +20℃)의 폴리프로필렌 관에 바이러스 현탁액 2 ㎖를 둠으로써 연구한다. 이어서 샘플을 문제의 각 실험에 대해 규정된 시간 동안 이 온도에서 보존한다(하기의 실시예 참조).

전자현미경에 의한 분석이 분석될 용액을 이어서 1.5% 우라닐 아세테이트로의 네가티브 염색으로 처리되는, 탄소 격자 상에 침착시킴으로써 수행된다. 이 분석을 위해 사용되는 장치는 50 kV 내지 100 kV의 전압으로 작동되는 Jeol 1010 전자현미경이다.

바이러스 입자의 크기 분포 분석은 Coulter N4+ 장치(Coultronics)를 통해 광자 상관성 분광학(PCS)으로 수행된다.

바이러스 입자를 정량할 수 있는 HPLC 분석(고성능 액체 크로마토그래피)이 하기에 설명된 것처럼 수행된다: Q Sepharose^RXL(45-165 ㎛; Amersham Pharmacia Biotech) 약 1 ㎖로 충진된 크로마토그래피 컬럼을 HR 5/5형 컬럼(Amersham Pharmacie Biotech)으로 준비한다. 200-300 nm 흡광 범위로 작동되는 UV/가시광선 검출 시스템이 장치된 HPLC 시스템에 설치된, 이 컬럼은 바이러스 입자의 분리 및 정량을 위해 사용된다. 각 분석 전에, 컬럼을 30℃에서 20 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.5)으로 1.5 ㎖/분의 유속으로 평형화한다. 바이러스 입자를 함유하는, 분석될 샘플을 컬럼에 주입한다. 주입 후에, 컬럼을 동일한 완충액 5 용적으로 세척하고, 결합된 종을 20 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.5) 중의 0 내지 1 M 나트륨 클로라이드의 직선 구배로 30 컬럼 용적에 걸쳐서 용출한다. 구배 후반에, 컬럼을 다음 분석을 위한 재평형화 전에 0.5 N 나트륨 하이드록사이드의 2 컬럼 용적으로 세척한다. 260 nm에서의 표준 곡선을 아데노바이러스 입자의 크로마토그래피에 의해 정제된 제조물로 구성한다. 이 표준 제조물을 260 nm에서의 흡광 단위당 1 ×10¹⁰입자의 전환계수를 사용하여 0.1% SDS 용액중 260 nm에서의 흡광도로 입자에 대해미리 적정한다. 샘플을 크로마토그래피에 의한 분석 전에 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과한다.

아데노바이러스의 적정 기술은 F. L. Graham et al., Molecular Biotechnology,3, 207 (1995)에 설명되어 있다. 면역적정, 이어서 유동 혈구계산에 의한 정량으로의 펜톤 단백질의 발현 측정기술은 "5th annual meeting of viral vector and vaccines, (1998)"에서 제출된 Boyle et al. "Determination of adenoviral vector activity using an immunotitration method"에 설명되어 있다.

실시예 2

+4℃에서 본 발명에 따른 조성물의 보존; 바이러스 입자의 물리적 안정성:

하기 표는 완충액 용액의 특성과 제조물의 크로마토그래피 분석에 의해 측정된 바이러스 입자의 물리적 안정성의 함수로서 얻어진 결과를 보여준다:

제형	초기 농도(×10¹²vp/㎖)	고려된 시간(일)에서의 바이러스 농도(×10¹²vp/㎖)
제형	초기 농도(×10¹²vp/㎖)	10	15	20	35	60	90
*트리스/HCl + 글리세롤 10%	8.9	9.8			9.7	10.1	10.2
*트리스/HCl + 글리세롤 10% + Pluronic F68 10%	8.3	9.0			8.4	9.0	8.9
*트리스/HCl + 글리세롤 10% + PEG 400 10%	6.6	7.2			7.2	6.9
*트리스/HCl + 글리세롤 10% + PEG 8000 10%	7.5	8.0			8.2	8.6	8.0
*트리스/HCl + 글리세롤 10% + 수크로스 5%	7.4		7.7		8.5	7.9	8.5
L-라이신 [20 mM, pH=8.4] + 글리세롤 10%	8.7	10.3			9.2
비교
*트리스/HCl + 수크로스 5%	6.3		5.7	1.9	0.015
*트리스/HCl + 수크로스 10%	10.5	8.4		0.7
*트리스/HCl: 20 mM; pH=8.4 - % 글리세롤:vol/vol - % 수크로스:vol/vol

실시예 3

+4℃에서 본 발명에 따른 조성물의 보존; 글리세롤 농도의 효과:

하기 표는 제형 중의 글리세롤 농도와 제조물의 크로마토그래피 분석에 의해 측정된 바이러스 입자의 물리적 안정성의 함수로서 얻어진 결과를 보여준다:

제형	고려된 시점에서 바이러스 농도(x 10¹²vp/㎖)
제형	0	15일	1개월	2개월	3개월	4.5개월	6개월	9개월	12개월
*트리스/HCl + 글리세롤 10% (용적/용적)	6.7	7.9	8.2	7.8	8.4	7.5	6.0	0.3	-
*트리스/HCl + 글리세롤 15% (용적/용적)	5.8	6.7	6.8	6.9	6.8	6.3	5.8	6.4	5.9
*트리스/HCl + 글리세롤 20% (용적/용적)	5.4	6.3	6.5	6.4	7.1	6.0	5.8	6.0	5.9
*트리스/HCl + 글리세롤 25% (용적/용적)	5.7	6.5	6.6	6.6	7.1	6.5	6.2	6.4	6.4
비교
트리스/HCl 10 mM + MgCl₂1 mM + 글리세롤 10% (용적/용적)	11.8	10.4	0.9	-	-	-	-	-	-
트리스/HCl 10 mM + MgCl₂1 mM + NaCl 150 mM + 글리세롤 10% (용적/용적)	10.3	5.0	0.8	-	-	-	-	-	-
트리스/HCl 10 mM + MgCl₂1 mM + 수크로스 1 M	6.9	7.7	7.6	5.9	0.58	0.47	0.15	0.25	-
*트리스/HCl: 20 mM, pH = 8.4

상기 표에 제시된 결과는 10%(용적/용적) 함량이 적어도 6개월의 기간에 걸쳐서 입자의 물리적 안정화에 효과적임을 명백히 확인시켜 준다. 효능은 또한 10% 이상의 글리세롤을 포함하는 제형에 대해 적어도 1년의 기간에 걸쳐서 확인된다. 기존 공지의 제형 어느 것도 그러한 장기간에 걸쳐서 안정화를 제공하지 않았다: 특히, 10 mM 트리스/HCl + 1 mM MgCl₂+ 1 M 수크로스를 포함하는 제형은 고농도(6.9 x 10¹²vp/㎖)에서 아데노바이러스 입자의 안정화에 적당한 것으로 입증되지 않으며, 바이러스 농도는 두 번째 달부터 신속히 감소한다.

실시예 4

+4 또는 +20℃에서 본 발명에 따라 보존된 아데노바이러스의 감염력:

바이러스 입자의 감염력은 이들이 함유하는 트랜스진을 발현하여 상응하는 단백질의 발현을 유도하는 입자의 능력에 의해 측정된다. 단백질은 여기에서 펜톤 단백질(단백질 III)이며 이는 항체(안티-펜톤)로 표지하는 방법을 사용하는 면역적정에 이어 유동 혈구계산 분석에 의해 검출된다. 수득된 결과는 용액 ㎖당 감염 단위(IU/㎖)로 표시된다. vp/IU 비의 계산은 시간 경과에 따른 감염 역가의 변동을 표현하는 두 번째 방안을 나타낸다. 사용된 실험 조건하에서, 이러한 비는 보존 전에 새로 수득된 바이러스 제조물에 대해 약 20 ± 10의 값을 갖는다.

하기의 표는 +4℃에서 보존 6개월 또는 12개월 후에 또는 +4℃에서 보존 1개월에 이어서 +20℃에서 보존 3.5개월 후에 글리세롤이나 수크로스에서 제형된 입자의 감염력을 나타낸다.

제형	초기역가	+4℃에서 12개월 후의역가	+4℃에서 6개월 후의역가	+4℃에서 1개월, 이어서 +20℃에서 3.5개월 후의 역가
제형	vp/㎖(x10¹²)	vp/㎖(x10¹²)	IU/㎖(x10¹¹)	vp/IU	vp/㎖(x10¹²)	IU/㎖(x10¹¹)	vp/IU	vp/㎖(x10¹²)	IU/㎖(x10¹¹)	vp/IU
*트리스/HCl +10% 글리세롤	6.7				6.0	3.0	20	4.2	1.1	38
*트리스/HCl +15% 글리세롤	5.8	5.9	6.2	9.5	5.8	4.1	14	5.3	1.4	38
*트리스/HCl +20% 글리세롤	5.4	5.9	4.5	13	5.8	4.6	13	5.4	1.4	39
*트리스/HCl +25% 글리세롤	5.7	6.4	7.4	8.6	6.2	5.0	12	6.1	1.8	34
비교
10 mM 트리스/HCl +1 mM MgCl₂+ 1 M 수크로스	6.9	-	-	-	0.15	＜0.004	＞375	1.0	0.08	125
10 mM 트리스/HCl +1 mM MgCl₂+ 1 M 수크로스	0.36	0.33	0.33	10	0.30	0.36	9	0.32	＜0.004	＞800
*트리스/HCl: 20 mM, pH = 8.4

본 연구는 바이러스 활성이 10% 이상의 모든 글리세롤 농도에 대해, 좀더 구체적으로는 15% 이상인 모든 글리세롤 농도에 대해서 +4℃에서 특히 잘 보존됨을 보여준다. 이와 마찬가지로, +4℃에서 1개월간, 이어서 +20℃에서 3.5개월간 보존되고 적어도 10% 글리세롤을 함유하는 제조물은 자신의 감염능을 보존하였다. 고농축 아데노바이러스 제조물의 장기 보존 및 실온에서의 가능성이 최초로 입증되었다. 수크로스 및 마그네슘 클로라이드를 함유하는 비교용 제형은 +4℃에서 또는 +20℃에서 농축 바이러스(6.9 x 10¹²vp/㎖)의 보존을 허용하지 않는다. 저농도(0.36 x 10¹²vp/㎖)에서 제형의 역가는 +4℃에서 1개월 보존한 뒤에 +20℃에서 3.5개월 보존한 후 감소한다. 수크로스를 함유하는 제형은 농도가 증가할 때 완전히 부적합하다.

보존 3개월 후에, 다양한 제조물이 전자현미경으로 분석되었다. 이들 분석은 20%의 글리세롤 농도에서, 입자가 네이티브하고, 충진되며, 완전하고 대칭인 것으로 보인다. 실제로 어떠한 자유 서브유닛도 매질에서 검출불가이다. 한편, 높은 바이러스 농도의 비교용 제형에서, 대부분의 입자는 약 50개의 입자를 함유하는 덩어리로, 또는 사상 구조물로 응집되었다. 일부 입자는 그들의 캡소머 부분을 상실하였고 좀더 원형이거나 난형인 구조를 취하였다. 매질 중으로 방출된 캡소머 및 섬유는 완전히 분산된 채로 잔류하고 매우 용이하게 관찰될 수 있다. 이러한 현상은 +4℃ 및 +20℃ 모두에서 관찰된다.

4℃에서 12개월 후에, 20% 글리세롤에 보존된 입자는 불변한 것으로 보인다(충진, 완전 및 대칭).

실시예 5

트리스/HCl + 글리세롤에서 제형되고 -20℃에서 보존된 아데노바이러스 제조물의 감염력:

본 실시예에서, 입자의 감염력은 적정으로 측정된다(pfu/㎖). 용어 pfu{ "플라크 형성 단위"}는 아데노바이러스 용액의 감염력의 측정에 대응한다. 이러한 측정은 적당한 세포 배양액을 감염시킨 다음, 일반적으로 배양 15일 후에, 감염 세포의 플라크 수를 측정함으로써 수행된다. 이러한 분석은 생물학적 방법에 기초하고 수득된 값은 사용된 작업조건에 따라 광범위하다[J. Virol., 70, 7498 (1996)].

하기의 표는 pfu 시험으로 측정한, -20℃에서 2개월간 보존된 바이러스 제조물의 감염 역가를 보여준다.

제형	초기 역가vp/㎖(x 10²)	D60에서의 역가vp/㎖(x 10¹²)	D60에서의 역가pfu/㎖(x 10¹¹)	D60에서의vp/pfu 비
20 mM 트리스/HCl(pH 8.4) + 10% 글리세롤	7.7	7.7	3.0	26

감염 역가의 측정을 위한 값, 및 좀더 구체적으로는 vp/pfu 비는 바이러스 입자가 동결-해동 단계에 의해 또는 -20℃에서 2개월간 보존에 의해 손상되지 않았음을 시사한다. (이러한 비는 초기 바이러스 제조물의 경우에 약 20 내지 30의 값을 갖는다).

실시예 6

본 발명에 따른 조성물의 +4℃에서의 보존; 바이러스 입자의 물리적 안정성:

하기의 표는 완충용액의 성질 및 제조물의 크로마토그래피 분석으로 측정한 바이러스 입자의 물리적 안정성의 함수로서 수득된 결과를 보여준다:

제형	초기 농도(x 10¹²vp/㎖)	고려된 시점에서의 바이러스 농도(일수)(x 10¹²vp/㎖)
제형	초기 농도(x 10¹²vp/㎖)	30	60	90
20 mM 트리스/HCl(pH 8.4) + 글리세롤 20%	29.2	31.4	32.1	33.7
100 mM 트리스/HCl(pH 8.4) + 글리세롤 20%	7.7	8.4	6.0	8.3
20 mM 트리스/HCl(pH 8.4) + 글리세롤 20% + 에탄올 10%	13.9	14.8	14.7	15.0
20 mM 라이신/HCl(pH 8.4) + 글리세롤 20%	7.8	8.4	6.8	7.7
20 mM Hepes/Na(pH 8.4) + 글리세롤 20%	7.9	8.4	7.0	8.6

실시예 7

본 발명에 따른 조성물의 +4℃에서의 보존; 완충용액의 pH의 효과:

하기의 표는 보존 3개월 후, 20 mM 트리스, 10% 글리세롤에 제형된 입자의 감염력에 대한 완충용액의 pH 효과를 보여준다:

20 mM 트리스/HCl + 10% 글리세롤 제형	초기 역가(x 10¹²vp/㎖)	+4℃에서 3개월 후의 역가
20 mM 트리스/HCl + 10% 글리세롤 제형	초기 역가(x 10¹²vp/㎖)	vp/㎖ (x 10¹²)	IU/㎖(x 10¹¹)	vp/IU
pH = 7.5	3.1	2.5	0.18	136
pH = 8.0	6.7	6.1	1.1	56
pH = 8.5	7.2	7.0	1.6	44
pH = 9.0	6.4	5.8	1.2	48
pH = 9.5	6.0	5.5	2.0	28

본 연구는 바이러스 활성이 8.0 내지 9.5 범위의 pH 값에서 10% 글리세롤을 함유하는 20 mM 트리스/HCl 제형 중 +4℃에서 특히 잘 보존되었음을 보여준다.

pH가 8.0 이하일 때, 안정성은 +4℃에서 더 이상 유지되지 않는다.

Claims

글리세롤로 보충되고 이가 금속 양이온 또는 알칼리 금속 양이온을 첨가하지 않은, 8.0 내지 9.6의 매질 pH를 유지할 수 있는 완충용액을 포함함을 특징으로 하는, 아데노바이러스 입자를 함유하는 액체 또는 동결 조성물.
제 1 항에 있어서, 완충용액이 8.4 내지 8.8의 매질 pH를 유지할 수 있는 용액임을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
제 2 항에 있어서, 완충용액이 매질 pH를 8.4로 유지할 수 있는 용액임을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
제 1 항에 있어서, 완충용액이 트리스 또는 라이신 및 강산이나 약산 중에서 선택된 산을 포함하는 산/염기 시스템, 또는 이와 달리 Hepes 및 강 염기를 포함하는 산/염기 시스템으로 이루어짐을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
제 4 항에 있어서, 완충용액이 트리스/HCl, 라이신/HCl, 트리스/말레산, 트리스/말산, 트리스/아세트산 및 Hepes/나트륨 하이드록사이드 시스템 중에서 선택된 산/염기 시스템으로 이루어짐을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체, 당 또는 알콜 중에서 선택된 보조제를 추가로 함유함을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
제 6 항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 플루로닉 또는 폴리소르베이트 중에서 선택되고, 당이 수크로스, 덱스트로스 또는 만니톨 중에서 선택되며 알콜이 에탄올임을 특징으로 하는 액체 또는 동결 조성물.
아데노바이러스 보존을 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
유전자 요법에 의한 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아데노바이러스 입자 조성물의 치료 또는 예방적 용도.