ES2290613T3 - Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. - Google Patents
Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2290613T3 ES2290613T3 ES04030395T ES04030395T ES2290613T3 ES 2290613 T3 ES2290613 T3 ES 2290613T3 ES 04030395 T ES04030395 T ES 04030395T ES 04030395 T ES04030395 T ES 04030395T ES 2290613 T3 ES2290613 T3 ES 2290613T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- preparation
- concentration
- product
- polyhydroxylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
Abstract
Un método de purificar una preparación de virus que comprende: (a) someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto de una preparación de virus de un medio de cromatográfico de intercambio aniónico; (b) añadir un hidrocarburo polihidroxilado a la preparación de producto de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; (c) aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se separe diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y (d) someter el producto de la preparación concentrada de virus de la etapa (c) a una o más etapas de tratamientos adicionales.
Description
Composiciones que comprenden virus y métodos
para concentrar preparaciones de virus.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden virus, especialmente vectores virales, que tienen
una estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones de la
presente invención son útiles en mantener la estabilidad de los
virus durante la conservación, y las composiciones que contienen
virus de la presente invención son particularmente útiles para usos
terapéuticos, tales como terapia de genes. También se proporcionan
nuevos métodos para concentrar y purificar preparaciones de
virus.
Los virus han llegado a ser cada vez más
importantes para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y
terapia génica, y existe la necesidad de desarrollar y preparar
composiciones estables que contengan virus que puedan ser
fácilmente conservadas y transportadas, pero reteniendo suficiente
seguridad y eficacia. En particular, dado el extensivo uso de los
vectores virales en terapia génica, es importante desarrollar y
preparar formulaciones que puedan conservar establemente virus
recombinantes vivos cuando llevan transgenes terapéuticos.
Además, hay una necesidad crítica de
formulaciones que puedan estabilizar las preparaciones de virus a
temperaturas superiores a -80ºC durante periodos prolongados de
tiempo. Las composiciones que contienen virus requieren normalmente
conservación a -80ºC y no pueden ser conservadas a temperaturas de
refrigeración estándares (por ejemplo, 2ºC a 8ºC, o superiores)
durante periodos sustanciales de tiempo. Esta limitación representa
un serio impedimento no solo para el almacenamiento, sino también
para el procesamiento, distribución y amplio uso clínico.
También existe la necesidad de desarrollar
composiciones que contengan virus que puedan mantener el pH en el
intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante
periodos prolongados de tiempo a pesar de estar expuestos a
temperaturas de refrigeración, y a pesar de ser sometidos a
condiciones duras, tales como congelación/descongelación,
especialmente las bajas velocidades de congelación/descongelación
que puede ocurrir en relación con la producción, manipulación o
distribución a gran escala. El mantenimiento del pH es importante
para las preparaciones virales debido a que a pH inferior a 7,0 y
superior a 8,5 las partículas virales vivas son vulnerables a
perder viabilidad debido a la inestabilidad física y biológica.
Otros problemas se refieren a aumentar las
concentraciones de virus. En particular, las altas concentraciones
de virus contribuyen significativamente a la inestabilidad de los
virus. Sin embargo, se requieren concentraciones progresivamente
crecientes de virus y vectores virales para uso terapéutico. Por
consiguiente, existe la necesidad crítica de desarrollar
formulaciones que estabilicen concentraciones relativamente altas de
virus, especialmente en las duras condiciones mencionadas
anteriormente. Y además, existe la necesidad particular de
desarrollar nuevos métodos de concentrar una preparación de virus
existente para conseguir preparaciones estables a niveles de
concentración superiores. Los problemas de inestabilidad asociados
con concentraciones superiores de virus se exacerban
significativamente si se intenta concentrar una preparación de virus
existente. Este se debe en parte a las fuerzas de cizallamiento
mecánico adicionales que vienen a producirse durante los esfuerzos
de aumentar la concentración de una preparación de virus. Si se
pudiera encontrar un método de concentrar, una preparación de virus
sin perjudicar sustancialmente la estabilidad del virus, entonces
podrían prepararse fácilmente dosis clínicas a cualquier
concentración deseada, (incluso cuando se parta de materiales que
tienen una menor concentración) e, importantemente, la capacidad de
concentrar virus podría eliminar problemáticos cuellos de botella y
otros problemas de aumento de escala durante el proceso de
purificación permitiendo rendimientos significativamente mayores
durante diversas etapas del proceso, tales como la cromatografía de
exclusión por tamaño molecular.
Existe por tanto la necesidad de materiales y
métodos para conseguir los anteriores objetivos.
Por tanto, en un primer aspecto la presente
invención proporciona un método de purificar una preparación de
virus que comprende:
- (a)
- someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto de una preparación de virus de un medio de cromatográfico de intercambio aniónico;
- (b)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado a la preparación de producto de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más;
- (c)
- aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se separe diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y
- (d)
- someter el producto de la preparación concentrada de virus de la etapa (c) a una o más etapas de tratamientos adicionales.
Preferiblemente, el hidrocarburo polihidroxilado
es un compuesto alquílico sustituido con polihidroxi ramificado o no
ramificado que tiene de 2 a 7 átomos de carbono.
Preferiblemente, el hidrocarburo polihidroxilado
es glicerol.
Preferiblemente, la etapa de proceso adicional
comprende cromatografía de exclusión por tamaño molecular.
Preferiblemente, la etapa de proceso (c)
comprende filtración con flujo tangencial.
Preferiblemente, la etapa de proceso (c) se
lleva a cabo usando un aparato que comprende un sistema de
filtración PelliconXL.
Preferiblemente, el virus es un virus
recombinante.
Preferiblemente el virus es un virus
recombinante que lleva un transgen terapéutico para uso en terapia
génica.
Preferentemente, el virus es un adenovirus.
Preferiblemente, la preparación de virus de la
etapa (b) comprende además un disacárido.
Preferiblemente, el disacárido es sacarosa.
Preferiblemente, la temperatura de la
preparación de virus está en el intervalo de aproximadamente 2ºC a
aproximadamente 27ºC
También se describe una composición estable que
comprende un virus en una formulación que contiene un hidrocarburo
polihidroxilado tamponado para mantener un pH en un intervalo de
aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una temperatura en el
intervalo de aproximadamente 2ºC a aproximadamente 27ºC.
También se describen nuevos métodos de
concentrar una preparación de virus existente que permite que se
puedan seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en
una amplia gama de concentraciones deseadas. Un método preferido de
concentrar una preparación de virus comprende:
- (a)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado a una preparación de virus hasta una concentración final de hidrocarburo polihidroxilado de aproximadamente 20% o más: y
- (b)
- someter la preparación de virus a un proceso de filtración en donde la concentración del virus se aumenta aplicando presión a la preparación, de tal modo que el diluyente se separa de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus.
También se describe en la presente memoria un
método para concentrar una preparación de virus que comprende:
- (b)
- centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 35% a 80% (v/v), teniendo la primer capa superpuesta una segunda capa que comprende hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 5% a 30% (v/v), teniendo la segunda capa superpuesta una tercera capa que comprende virus; y
- (b)
- recuperar el virus de la primera capa.
Además, los autores de la presente invención
encontraron que su nuevo método de aumentar la concentración de
virus tiene la ventaja adicional de mejorar el tratamiento posterior
(por ejemplo, reduciendo o eliminado problemáticos cuellos de
botella durante la purificación subsiguiente permitiendo mayores
rendimientos durante etapas de proceso, tales como cromatografía de
exclusión por tamaño molecular). Por tanto, el método de concentrar
preparaciones de virus comprende además una etapa de purificación
subsiguiente (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño
molecular). Así, en una realización preferida, el método de
concentrar preparaciones de virus de acuerdo con la presente
descripción es particularmente útil cuando se realiza una etapa de
cromatografía de exclusión por tamaño molecular después de una
cromatografía de intercambio aniónico, y la preparación de virus se
concentra después de la cromatografía de intercambio aniónico, pero
antes de la cromatografía de exclusión por tamaño molecular. Las
fracciones virales obtenidas de la cromatografía de intercambio
aniónico, por ejemplo, contiene típicamente altos niveles de sales
y posiblemente otras impurezas que comprometen más la estabilidad
del virus durante los métodos de concentración. Por tanto, la
presente invención proporciona un método de purificar una
preparación de virus que comprende:
- (a)
- someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus es eluido como un producto de preparación de virus de una resina de intercambio aniónico;
- (b)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado al producto de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más;
- (c)
- aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se separe diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y
- (d)
- someter el producto de la preparación concentrada de virus de la etapa (c) a una o más etapas de tratamientos adicionales.
La presente invención también proporciona
preparaciones de virus purificadas por el método anterior.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
solicitud describe nuevas composiciones que contienen virus, así
como nuevos métodos de concentrar y purificar composiciones que
contienen virus.
Con respecto a las composiciones, los autores de
la presente invención han desarrollado una nueva formulación
tamponada que puede conservar las preparaciones virales con una
estabilidad mejorada. En particular, la formulación puede
estabilizar preparaciones virales a temperaturas muy por encima de
-80ºC. Más importante todavía, las composiciones de la presente
invención son estables a temperaturas de refrigeración típicas, por
ejemplo, 2º a 8ºC, o superiores, durante periodo sustanciales de
tiempo, preferiblemente durante varios meses o más. Esta es una
ventaja crítica porque, como se ha mencionado antes, para satisfacer
las necesidades clínicas no es práctico mantener las preparaciones
virales congeladas a -80ºC durante la conservación y transporte.
Un aspecto importante de las composiciones de la
presente invención es la adición de un hidrocarburo polihidroxilado,
concretamente glicerol. Como se emplea en la presente memoria,
hidrocarburo polihidroxilado significa un compuesto lineal,
ramificado o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente 2 a 6,
más preferiblemente 2 a 4) grupos hidroxi. Los hidrocarburos
polihidroxilados son compuestos de alquilo sustituido (lineal o
ramificado) sustituido con polihidroxi, que tienen preferiblemente
2 a 7 átomos de carbono, e incluyen, por ejemplo, glicerol, sorbitol
y polipropanol. Como muestran los datos proporcionados más
adelante, los autores de la presente invención encontraron que el
glicerol permite niveles sorprendentemente altos de estabilidad
durante periodos prolongados de tiempo incluso bajo condiciones de
refrigeración estándares.
Una cantidad eficaz de hidrocarburo
polihidroxilado para las composiciones descritas en la presente
memoria es una cantidad suficiente para estabilizar el virus en la
formulación de la presente invención sin afectar adversamente a la
eficacia del virus para uso posterior, especialmente en casos en los
que el virus contiene un transgen para uso en terapia génica. El
hidrocarburo polihidroxilado está presente a una concentración
final de aproximadamente 20 a 200 mg/mL. Un intervalo más estrecho
puede ser 80 a 120 mg/mL. Puede usarse más de un hidrocarburo
polihidroxilado para conseguir la cantidad total deseada de
hidrocarburo polihidroxilado en la composición descrita en la
presente memoria.
El hidrocarburo polihidroxilado usado en la
presente invención puede contener opcionalmente un grupo aldehído.
En particular, el hidrocarburo polihidroxilado puede ser un
disacárido, tal como sacarosa. Además, incluso si el hidrocarburo
polihidroxilado seleccionado para la composición no contiene un
grupo aldehído, la composición puede incluir adicionalmente un
disacárido, tal como sacarosa, como estabilizador y agente de ajuste
de la tonicidad. Cuando la composición descrita en la presente
memoria contiene un hidrocarburo polihidroxilado (tal como
glicerol) y se emplea un disacárido en las realizaciones preferidas
como un estabilizador o agente de ajuste de la tonicidad adicional,
el disacárido está presente preferiblemente en un intervalo de 5 a
25 mg/mL, más preferiblemente 20 mg/mL, y preferiblemente el
disacárido es sacarosa.
Los estabilizadores constituidos por sales
metálicas divalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales
de magnesio, sales de zinc y sales de calcio se usan en
realizaciones preferidas de la composición de la presente
invención. Preferiblemente, la sal es una sal cloruro o una sal de
magnesio, siendo las sales de magnesio particularmente preferidas.
Preferiblemente, la sal (por ejemplo, la sal de magnesio) está
presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 1 mg/mL, más
preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 0,4 mg/mL.
Los estabilizadores constituidos por sales
metálicas monovalentes farmacéuticamente aceptables, tales como
sales metálicas como sales de potasio, sodio, litio y cesio pueden
estar incluidos en las realizaciones preferidas de la presente
invención como estabilizadores opcionales. Preferiblemente, la sal
es cloruro de sodio presente en la cantidad de 0,6 a 10,0 mg/ml,
más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 5,8
mg/ml.
Además de estabilizar la composición, el cloruro
de sodio puede suprimir la velocidad y extensión de la aparición de
sub-productos de fermentación, dando como resultado
una presentación farmacéuticamente más elegante que puede tener un
potencial de antigenicidad reducido debido a los aglomerados de
proteínas. La adición de cloruro de sodio no afecta al pH de la
formulación.
La composición descrita en la presente memoria
puede mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a
aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados de tiempo, incluso
cuando se somete a condiciones duras, tales como refrigeración y
congelación/descongelación. Además, las composiciones pueden
permanecer estables y mantener el intervalo de pH requerido incluso
cuando se someten a una velocidad relativamente lenta de
congelación/descongelación lo que puede ocurrir en relación con la
producción, distribución y manipulación a gran escala. Como se ha
indicado antes, el mantenimiento del pH es importante para las
preparaciones virales, debido a que a un pH inferior a 7,0 y
superior a 8,5 las partículas de virus vivos pueden llegar a ser
inestables y degradarse. La composición particular de virus hace a
los virus difíciles de estabilizar y conservar.
Para conseguir un mantenimiento del pH en
condiciones duras, la presente invención comprende un sistema tampón
que puede mantener un pH óptimo en un intervalo de aproximadamente
7,0 a aproximadamente 8,5 a pesar de conservación entre -80ºC y
27ºC y a pesar de ser sometido a condiciones de
congelación/descongelación. Puesto que el pH puede variar
dependiendo de la temperatura, los intervalos de pH de la presente
invención se ilustran más específicamente mas adelante con
referencia a los intervalos de temperatura específicos. Por ejemplo,
a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, aproximadamente 2ºC a
8ºC) un intervalo de pH preferido es aproximadamente 7,7 a
aproximadamente 8,3, más preferiblemente aproximadamente 7,9 a
aproximadamente 8,2. A temperatura ambiente (por ejemplo,
aproximadamente 20ºC a 27ºC, preferiblemente 22ºC - 25ºC), un
intervalo de pH preferido es aproximadamente 7,3 a aproximadamente
8,2, más preferiblemente aproximadamente 7,4 a aproximadamente
7,9.
Un sistema tampón preferido de la presente
invención comprende fosfato sódico monobásico dihidratado en una
concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL y trometamina en una
concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL. (La trometamina
también es conocida como TRIS o "Trizma" disponible en Sigma
Chemical Co.). Sin embargo, se pueden usar otros sistemas tampones.
Por ejemplo, puede usarse fosfato sódico dibásico dihidratado si
está acoplado con una forma ácida de tampón Tris. En una realización
particularmente preferida, el sistema tampón comprende fosfato
sódico monobásico dihidratado en una concentración de
aproximadamente 1,7 mg/mL y trometamina en una concentración de
aproximadamente 1,7 mg/mL, y tiene la capacidad de mantener la
formulación en un intervalo de pH óptimo de aproximadamente 7,3 a
aproximadamente 7,9 a 25ºC.
La formulación descrita en la presente memoria
tiene la ventaja adicional de tener la capacidad de estabilizar
altas concentraciones de virus en las duras condiciones antes
mencionadas (tales como temperaturas de refrigeración y
procesamiento de congelación/descongelación). En particular, la
formulación de la presente invención puede mantener la estabilidad
del virus a concentraciones que llegan a ser de 1 x 10^{13}
partículas/mL. Un intervalo preferido de concentraciones de virus
para uso en la presente invención está en una cantidad de 1 x
10^{9} a 1 x 10^{13} partículas/mL., más preferiblemente, hasta
1 x 10^{12} partículas/mL, por ejemplo, 1 x 10^{9} (o 1 x
10^{10}) a 1 x 10^{12}.
El término "diluyente" tal como se usa en
la presente memoria puede comprender un disolvente (por ejemplo,
agua, preferiblemente agua estéril) o una mezcla de un disolvente y
otros ingredientes, tales como disolventes adicionales,
estabilizadores adicionales, tampones adicionales, y/o otras
sustancias que no afecten adversamente a la seguridad, eficacia y
estabilidad de la formulación. Con respecto a los diluyentes, los
estabilizadores, tampones y similares, se puede hacer referencia a,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed.,
Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
En la composición de la presente invención puede
incluirse opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente un
detergente no iónico, tal como un éster de ácido graso de
polioxitileno, tal como (por ejemplo, polioxietilensorbitanos tales
como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 o polisorbato 80
de ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, o Twen 20, Twen, 40,
Twen 60 y Twen 80 de Sigma, St. Louis, Mo.). Preferiblemente, el
detergente no iónico es un éster de ácido graso de polioxietileno,
y el éster de ácido graso de polioxietileno es preferiblemente
polisorbato 80, que puede actuar como estabilizador en la
composición descrita en la presente memoria. La concentración del
detergente no iónico está preferiblemente en un intervalo de 0,03 a
0,3 mg/mL; más preferiblemente,
0,15 mg/mL.
0,15 mg/mL.
Las composiciones de la presente invención
pueden contener además uno o más "agentes que mejoran la
administración". Un "agente que mejora la administración"
se refiere a cualquier agente que mejora la administración de un
gen terapéutico, tal como un gen supresor de tumor a un tejido u
órgano canceroso. Ejemplos de tales agentes que mejoran la
administración incluyen, pero sin limitación: detergentes,
alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales biliares, antagonistas de
heparina, inhibidores de ciclooxigenasa, soluciones hipertónicas de
sales y acetatos.
Los detergentes (tal como se usa el término en
la presente memoria) pueden incluir detergentes aniónicos,
catiónicos, de ion híbrido y no iónicos. Detergentes ilustrativos
incluyen pero sin limitación: taurocolato, desoxicolato,
taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benzalconio, y
detergente ZWITTERGENT® 3-14, CHAPS (hidrato de
3-[3-colamidopropil)dimetilamoniol]-1-propanosulfonato,
Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, el
detergenteTRITON®-X-100, C12E8,
Octil-B-D-glucopiranósido,
el detergente PLURONIC® - F68, el detergente TWEN® 20, y el
detergente TWEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).
El uso de agentes que mejoran la administración
se describe en detalle en la solicitud de patente de EE.UU. en
tramitación U.S.S.N. 08/889,335 presentada el 8 de julio de 1997, y
la Publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO
97/25072, del 17 de Julio de 1997, y en la solicitud de patente de
EE.UU. U.S.S.N 09/112,074 presentada el 8 de julio de 1998, la
solicitud de patente internacional PCT/US 98/14241. Además, se
describe el uso de inhibidores de uso de calpaína junto con
vectores virales para aumentar la eficacia de la transducción en
las solicitudes de patentes de EE.UU. U.S.S.N. 09/172685 y 60/104321
presentada el 15 de octubre de 1998.
En la presente invención puede usarse una amplia
gama de virus, incluyendo pero sin limitación: adenovirus, virus de
la viruela, iridovirus, virus del herpes, papovavirus,
paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adenoasociados,
virus vaccinia, rotavirus, etc. (véase, por ejemplo, Anderson,
Science (1992) 256: 808-813), siendo los
adenovirus particularmente preferidos. Los virus usado en la
presente invención son adenovirus preferiblemente virus
recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de
vacunas atenuadas, y similares. Así, por ejemplo, un adenovirus
recombinante ilustrativo que puede usarse en las composiciones de la
invención es A/C/N/53, que se describe en la solicitud de patente
PCT nº WO 95/11984.
La formulación descrita en la presente invención
es particularmente muy adecuada para estabilizar un virus
recombinante, tal como un adenovirus recombinante vivo (o "vector
viral "), para uso terapéutico en terapia génica. Por ejemplo,
el virus usado en la presente invención puede comprender un gen
supresor, tal como un gen p53 de tipo silvestre o un gen Rb (por
ejemplo, p110^{RB} o p56 ^{RB}),y con transgenes tales como p53
de tipo salvaje insertado en un vector viral, la composición
descrita en la presente memoria puede usarse como composición
farmacéutica para tratamiento de cáncer.
A este respecto, las formulaciones descritas en
la presente memoria tienen una notable capacidad de mantener la
viabilidad de virus vivos, en particular un vector viral en el cual
se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un
transgen tal como p53. Este aspecto permite al virus mantener su
capacidad de infectar células dianas de modo que se produce
adecuadamente la proteína terapéutica codificada por el gen
insertado.
Con relación específica a p53 y sus usos, se
advierte que la mutación del gen p53 es la alteración genética más
común en cánceres humanos (Bartek (1991) Oncogene, 6:
1699-1703, Hollestein (1991) Science, 253:
49-53). La introducción de p53 de tipo salvaje en
células cancerosas de mamíferos que carecen de la proteína p53 de
tipo salvaje endógena suprime el fenotipo neoplástico de estas
células (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.532.220).
En los ejemplos que siguen (Ejemplos
1-5 aunque no son métodos se retienen para
información básica) el virus es un adenovirus recombinante vivo que
contiene el gen p53 de tipo salvaje. La construcción de vector viral
particular usada en estos ejemplos se denomina en la presente
memoria "A/C/N/53". A/C/N/53 (también se denomina
"ACN53") es una construcción de vector viral particularmente
preferida descrita en la solicitud de patente de EE.UU. en
tramitación USSN 08/328,673 presentada el 25 de octubre de 1994 y en
la solicitud de patente internacional WO 95/11984 (del 4 de mayo de
1995), expresamente incorporadas en la presente memoria como
referencias.
Una formulación representativa para las
realizaciones preferidas de la presente invención que contiene
polisorbato 80 es como se expone a continuación:
Fórmula
representativa
(Las composiciones se conservan típicamente en
dosis de 1,0 mL, "q. s. ad" en la formulación anterior
significan añadir suficiente disolvente para alcanzar el volumen
total de 1 mL).
A continuación se exponen cuatro realizaciones
particularmente preferidas. (El polisorbato 80 está presente en los
Ejemplos 1 y 2, pero ausente en los Ejemplos 3 y 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ingredientes: fosfato sódico
monobásico dihidratado, trometamina, cloruro de magnesio
hexahidratado, sacarosa y glicerol pueden todos obtenerse de, por
ejemplo, en EM Industries, Inc., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New
York 10532. El polisorbato 80 está disponible en, por ejemplo, ICI
Americas, Inc., Wilmington Delaware,
19897.
19897.
Las composiciones pueden prepararse durante la
purificación del virus en una columna cromatográfica de filtración
por gel combinando los ingredientes (excluyendo el
Polisorbato-80) a las concentraciones deseadas en la
columna de filtración por gel. (Con respecto a los métodos de
filtración por gel, puede hacerse referencia, por ejemplo, al
apartado V más adelante). Luego, si se desea diluir la concentración
del virus, o incorporar polisorbato-80, entonces
pueden prepararse los diluyentes por técnicas estándares. A
continuación se expone un ejemplo ilustrativo:
Se carga y disuelve el fosfato sódico monobásico
dihidratado, la trometamina, la sacarosa, el cloruro de magnesio
hexahidratado y el glicerol en aproximadamente 75% de volumen de
lote de agua para inyecciones a temperatura ambiente en un
recipiente de acero inoxidable equipado con un agitador. El lote de
diluyente resultante se lleva hasta el volumen final con agua para
inyección. Se comprueba el pH. Se calcula el volumen requerido de
A/C/N/53 (adenovirus con p53 de tipo salvaje como transgen)
sustancia farmacéutica en suspensión y el volumen requerido de
diluyente para preparar una inyección de A/C/N/53. Si la inyección
de A/C/N/53 final contendrá polisorbato 80, se prepara una solución
madre que contiene 10% en exceso de polisorbato 80 en diluyente. Se
cargan las cantidades calculadas de A/C/N/53 sustancia farmacéutica
en suspensión y diluyente en un recipiente de acero inoxidable y se
mezcla. Se carga la solución de polisorbato 80, antes de añadir todo
el diluyente, basado en el 10% del volumen del lote de inyección de
A/C/N/53 si se requiere. Se filtra asépticamente la suspensión a
través de un filtro esterilizado (0,22 \mum o equivalente). Se
examina la integridad del filtro después de la filtración. Se
recoge y filtra la suspensión esterilizada en viales que tienen el
volumen apropiado. Se tapan y se cierran los viales.
Los datos de estabilidad para los Ejemplos 1, 2,
3, y 4 se exponen más adelante en la Tablas 1, 2, 3 y 4
respectivamente.
En las Tablas siguientes, el ensayo
anti-proliferación es un bioensayo usado para medir
la capacidad de los productos para suprimir células cancerosas y
está basado generalmente en los métodos usados por Wills, et
al., 1994, Human Gene Therapy,
5:1079-1088. Los números recogidos indican
actividad, mientras que el control no tiene actividad.
El "ensayo en placas" mide partículas de
virus en cultivo puntuando el número de placas virales en función
de la dilución y está basado generalmente en los métodos descritos
en Graham, F.L., y Prevec, L., Methods in Molecular Biology,
vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E. J. Murray,
ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pp. 109-128
(1991); véase también Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., y
Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pp.
59-74
(1977).
(1977).
\newpage
El ensayo FACS muestra la capacidad del virus
para infectar células, y estas medidas se basan generalmente en
métodos descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente
internacional PCT/US97/11865 (WO 98/01582, publicada el 15 de enero
de 1998). En la columna siguiente a la derecha, los números
presentados bajo el encabezamiento "Concentración" representan
la concentración del número total de partículas virales. Finalmente,
los números bajo el encabezamiento "relación partículas/FACS"
representan la relación del número total de partículas virales en
comparación con el número de partículas virales infecciosas,
indicando así la potencia relativa de la preparación de virus.
Los datos bajo el encabezamiento "UV"
indican la agregación de las partículas virales como es mostrada por
la relación de absorbancia UV para las longitudes de onda
A_{320}/A_{260} como una_{ }indicación de la dispersión de la
luz. Básicamente, la absorbancia a una longitud de onda de 320
nanómetros mide la cantidad de dispersión de luz, mientras que la
absorbancia a una longitud de onda de 260 nanómetros está
correlacionada con la cantidad de DNA.
Las temperaturas listadas en la segunda columna
de las tablas bajo el encabezamiento "condición" representan
la temperatura de conservación. Los ensayos fisiológicos se realizan
a 37ºC y el valor del pH en la última columna se mide a temperatura
ambiente, aproximadamente 25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación para el Ejemplo 5: A/C/N/53 (7,5 x
10^{11} partículas/mL), trometamina (TRIS) (1,7 mg/mL), fosfato
sódico monobásico dihidratado (1,7 mg/mL), sacarosa (20 mg/mL),
cloruro de magnesio hexahidratado (0,4 mg/mL), glicerol (100 mg/mL),
cloruro de sodio (5,8 mg/mL). Volumen de relleno = 10 mL.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En algunos casos se ha observado que se forman
partículas en la formulación durante el almacenamiento a 4ºC. El
análisis de las partículas por SDS-PAGE sugiere que
dichas partículas se componen de impurezas secundarias (es decir,
proteínas adicionales y algunas partículas virales inmaduras), y por
tanto estas partículas no afectan a la viabilidad de la
formulación. No obstante, en una realización preferida para
clarificar más la formulación (impedir la posible formación de
partículas), puede realizarse una etapa de microfiltración opcional
para separar cualesquiera partículas potenciales con poca pérdida de
partículas virales. (Cuando se lleva a cabo la microfiltración,
debe tenerse en cuenta que es crítica el área superficial de la
membrana de microfiltración por volumen de filtración para evitar
pérdidas de virus a medida que se separan las partículas).
\newpage
Además, en una realización preferida, los
autores de la presente invención han encontrado que la agitación,
tal como agitación circular, puede acelerar la formación de
partículas y por lo tanto es una etapa opcional adicional en el
proceso de clarificación. Así, la agitación suave (por ejemplo,
durante una noche, a 10ºC, usando una barra agitadora magnética)
seguida por microfiltración demostró separaba las partículas, de tal
modo que no podrían volverse a formar partículas por nueva
agitación.
También se encontró que los ciclos de
congelación/descongelación promovían la formación de partículas
durante la nueva agitación. Así, en una realización preferida se
pueden llevar a cabo opcionalmente uno o más ciclos de
congelación/descongelación, seguido por agitación, y luego
microfiltración, para impedir la formación de partículas durante la
conservación del producto de virus final a las temperaturas de
refrigeración (por ejemplo, 4ºC).
La presente solicitud también describe un nuevo
método de concentrar establemente una preparación existente de
virus empleando filtración con flujo tangencial (en lo sucesivo
denominada "FTF"), permitiendo fácilmente seleccionar y
preparar dosis clínicas en un amplio intervalo de concentraciones
deseadas. El nuevo método de concentrar una preparación de virus
descrito en la presente memoria comprende:
- (a)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado a una preparación de virus hasta una concentración final de hidrocarburo polihidroxilado de aproximadamente 20% o más; y
- (b)
- someter la preparación de virus a un proceso de filtración, en donde se aumenta la concentración de virus aplicando presión a la preparación, de tal modo que se separa diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus.
Los métodos de la presente invención son
aplicables a una amplia gama de virus, incluyendo pero sin
limitación: adenovirus, virus de la viruela, iridovirus, virus de
herpes, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus,
virus adenoasociados, virus vaccinia, rotavirus, etc.; siendo los
adenovirus particularmente preferidos. Los virus son
preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados
clínicos, cepas de vacunas atenuadas, y similares. La presente
invención es particularmente útil para concentrar virus
recombinantes que llevan un transgen heterólogo para uso en terapia
génica. Dichos virus son especialmente vulnerables a fuerzas
potencialmente desestabilizantes, tales como las fuerzas de
cizallamiento mecánico adicionales que acompañan a los métodos de
concentrar preparaciones de virus. Un adenovirus recombinante
ilustrativo que puede concentrarse por el método de la invención es
A/C/N/53, que se describe en la solicitud de patente PCT nº WO
95/11984.
El proceso de filtración usado para concentrar
el virus en el método de la presente invención puede incluir
cualquier proceso de filtración (por ejemplo, ultrafiltración) en
donde la concentración de virus se aumenta forzando al diluyente a
pasar a través de un filtro, de modo que el diluyente se separa de
la preparación de virus, mientras que el virus es incapaz de pasar
a través del filtro y por tanto permanece, en forma concentrada, en
la preparación del virus. La ultrafiltración se describe en detalle
en, por ejemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles
and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New
York, NY, 1996). Un proceso de filtración particularmente preferido
es la filtración con flujo tangencial ("FFT") tal como se
describe, por ejemplo, en el catálogo de MILLEPORE titulado
"Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp.
177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). El
aparato de FFT comprende un sistema de filtro Pellicon II o
Pellicon XL de Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford,
Massachusetts (dirección de internet: www.millipore.com), siendo
particularmente preferido un sistema Pellicon XL. En una realización
preferida los métodos pueden llevarse a cabo a temperaturas en un
intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.
Pueden emplearse otros procesos de concentración
para concentrar preparaciones de virus de acuerdo con la presente
invención. Por ejemplo, el empleo de un hidrocarburo polihidroxilado
puede usarse ventajosamente para concentrar una preparación de
virus por centrifugación. Por tanto, también se describe en la
presente memoria un método para concentrar una preparación de virus
que comprende:
- (a)
- centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 35% a 80% (v/v), teniendo dicha primera capa superpuesta una segunda capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 5% a 30% (v/v), teniendo la segunda capa superpuesta una tercera capa que comprende virus; y
- (b)
- recuperar el virus de la primera capa.
A modo de ejemplo, una preparación de adenovirus
puede concentrarse por centrifugación a baja velocidad a 3200 g
usando rotores de cubo oscilante de una centrífuga Beckman. Para
conseguir esto, la preparación de virus puede colocarse en tubos
múltiples de 5 ml, que contiene cada tubo 6,25% en volumen de
glicerol al 70% en una primera capa en el fondo del tubo, que tiene
superpuesta una segunda capa de 2,5% en volumen de glicerol al 20%
y con la preparación de virus colocada encima. La preparación se
centrifuga luego a 3.200 g a 4ºC durante aproximadamente 16 horas
para peletizar el virus concentrado en las capas de glicerol y luego
se recupera la preparación de virus recién concentrada de la
primera capa. El virus concentrado por los métodos anteriormente
descritos tenía buenas características de difusión de la luz y tenía
adecuadas propiedades de infectividad.
Con respecto al hidrocarburo polihidroxilado
usado en los métodos descritos, un "hidrocarburo
polihidroxilado" significa un compuesto lineal, ramificado o
cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente 2 a 6, más
preferiblemente 2 a 4) grupos hidroxi, y una cantidad eficaz de
hidrocarburo polihidroxilado es una cantidad suficiente para
estabilizar el virus contra fuerzas potencialmente
desestabilizantes, tales como las fuerzas de cizallamiento mecánico
que ocurren durante el proceso de concentración. Preferiblemente, el
hidrocarburo polihidroxilado en los métodos de concentrar virus
descrito en esta invención está presente en una concentración mínima
de 20%, más preferiblemente 25%. Los hidrocarburos polihidroxilados
son preferiblemente compuestos alquílicos (ramificados o no
ramificados) sustituidos con polihidroxi que tienen preferiblemente
2 a 7 átomos de carbono, y pueden incluir glicerol, sorbitol y
polipropanol. El glicerol es particularmente preferido.
El nuevo método de los inventores para aumentar
la concentración de virus tiene la ventaja adicional de mejorar el
tratamiento, por ejemplo, eliminando problemáticos cuellos de
botella permitiendo significativamente un mejor rendimiento durante
las diversas etapas de tratamiento, tales como cromatografía de
exclusión por tamaño molecular. Por tanto, en una realización
preferida el método de concentrar preparaciones de virus puede
aplicarse a métodos de purificar virus en los que se realizar una
etapa de cromatografía de exclusión por tamaño molecular (por
ejemplo, filtración por gel) subsiguientemente a una cromatografía
de intercambio aniónico. En este método, hay amenazas adicionales
para la estabilidad del virus que proceden no solamente de las
fuerzas de cizallamiento mecánico necesarias para concentrar el
virus antes de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño
molecular limitante de la velocidad, sino también debido al hecho
de que la preparación de virus eluída de la etapa de cromatografía
de intercambio aniónico contiene típicamente altos niveles de sales
y otras impurezas que comprometen más la estabilidad del virus. Por
tanto, la presente invención proporciona un método de purificar una
preparación de virus, que comprende:
- (a)
- someter la preparación de virus a una cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto preparación de virus procedente de un medio cromatográfico de intercambio aniónico;
- (b)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado al producto de la preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; y
- (c)
- aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se retira diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y
- (d)
- someter la preparación concentrada de producto de virus de la etapa (c) a una o más etapas de proceso adicionales.
En el aspecto de la invención antes expuesto en
relación con la cromatografía de intercambio aniónico, el nivel
mínimo de glicerol es 25% (en lugar del nivel mínimo de 20% que es
el habitual en aplicaciones generales de los métodos de
concentración antes mencionados) debido a que esta aplicación
particular debe tener en cuenta la amenaza adicional a la
estabilidad planteada por las altas concentraciones de sales en el
producto eluído de la columna de cromatografía de intercambio
aniónico. La adición de glicerol al 25% (preferiblemente 30%) da
como resultado la estabilidad de las fracciones de elución reunidas
(en lo sucesivo denominadas simplemente mezcla de elución),
procedente de la columna de DEAE que contiene sal, de >10 días a,
por ejemplo, 4ºC; por lo tanto las etapas subsiguientes de
concentración de virus y/o filtración por gel pueden realizarse en
días separados con una sustancial flexibilidad a través de un
periodo de 10 días. Como se apreciará, el empleo del hidrocarburo
polihidroxilado en una concentración más elevada del 25% o más
también puede usarse en los métodos antes mencionados cuando la
preparación de virus contenga un alto contenido de sal debido a
otras condiciones del proceso.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones
preferidas de la presente invención; el alcance de la invención no
ha de entenderse como limitado por dichos ejemplos.
Breve descripción general - Una tanda o
lote concentrado comienza con materiales virales brutos congelados
que proceden de la recuperación de caldos de fermentación. En un
método, el producto adenovirus se purifica primeramente por
cromatografía de intercambio aniónico. Luego, antes de cargar la
preparación sobre una columna de cromatografía de exclusión por
tamaño molecular, la mezcla de elución de la cromatografía de
intercambio aniónico puede ser concentrada por filtración por flujo
tangencial (FFT) en presencia de glicerol al 30% (v/v). También se
describe en la presente memoria un método, la etapa de concentración
por FFT puede llevarse acabo en presencia de glicerol al 20% (v/v)
o más preferiblemente al 25% (v/v) después de la cromatografía de
exclusión por tamaño molecular.
En un método preferido, la mezcla de elución de
cromatografía de intercambio aniónico de adenovirus se prepara para
concentración como sigue. El material viral congelado procedente de
las etapas de fermentación y recuperación se descongela y filtra a
través de una membrana hidrófila de 0,45 \mum. La concentración de
sal del filtrado se ajusta añadiendo cloruro de sodio 4M. Esta
solución de alimentación se aplica luego a una columna Fractogel EM
DDEAE-650M pre-equilibrada con
fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 260 mM, cloruro de
magnesio 2 mM, sacarosa al 2%(p/v) (Tampón A). Los adenovirus se
fijan a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayoría
de los medios y las impurezas de las células hospedantes pasan a
través de la columna que termina en la carga agotada. La columna se
lava inicialmente con 4 volúmenes de tampón A seguido por un segundo
lavado isocrático de 8 volúmenes de lecho de 94% de tampón A y 6%
de tampón B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 600
mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) para separar las
impurezas adicionales. El virus se eluye de la columna con un
gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho desde 6% a 100% de tampón
B. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución según se
determina por A_{280}. Luego se añade glicerol a la mezcla de
elución de la columna de DEAE hasta una concentración final de 30%
(v/v) para posterior tratamiento.
La mezcla de elución de la columna de DEAE
(preparada de acuerdo con la descripción anterior) se concentran 10
a 20 veces usando una unidad de FFT de Millipore (Pellicon XL
System) con membranas Biomax de un umbral de exclusión de peso
molecular de 1 millón. El proceso se lleva a cabo a
2-10ºC o temperatura ambiente (25ºC). En este
método se usaron los siguientes parámetros de filtración: presión
media en la entrada = 0,097 MPa (14 psi); presión media del
producto permeado = 0 MPa (0 psi); caudal medio = 13
litros/hora-metro cuadrado. La concentración final
de adenovirus consigue aproximadamente 1,0-2,0 x
10^{13} partículas por ml. Basándose en los recursos de
Q-HPLC y el análisis por absorbancia de UV
(A_{260}), la recuperación de la etapa de concentración es
>80% sin agregación significativa (análisis de dispersión de luz
para A_{320}/A_{260}).
La preparación de adenovirus concentrada se
aplica a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño
molecular Superdex-200
pre-equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 8,0,
cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2%
(p/v), glicerol al 10% (Tampón C) o fosfato de sodio 11 mM, Tris 14
mM, cloruro de magnesio 2mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10%,
pH 7,8 (Tampón D). La columna se eluye con tampón estabilizante del
equilibrio. Se recogen y reúnen las fracciones correspondientes al
pico de adenovirus del perfil de elución según se determina por
A_{280}. La preparación de adenovirus concentrada se filtra a
través de una membrana hidrófila de 0,2 \mum Durapore (Stericup,
Millipore) a 2 a 10ºC, y puede ser conservada a -80ºC o a
temperaturas superiores (tales como 2 a 10ºC).
Como se ha estudiado antes, un método preferido
implica concentrar el virus después de la cromatografía de
intercambio aniónico, pero antes de la filtración por gel. Sin
embargo, en otro método, los métodos descritos de concentrar
preparaciones de virus también pueden usarse después de la
etapa de filtración por gel (incluso si no se empleó etapa de
concentración del virus entre la etapa de cromatografía de
intercambio aniónico y la etapa de filtración por gel). En este
caso, los parámetros de filtración son los mismo que para la
concentración de la mezcla de elución de DEAE, excepto que el
hidrocarburo polihidroxilado (por ejemplo, glicerol) puede añadirse
a la mezcla de elución de Superdex-200 a una
concentración final tan baja como 20% (v/v), puesto que ya no es
necesario tratar con las altas concentraciones de sales en la mezcla
de elución de DEAE. A este respecto, debe advertirse que en casos
en los que la adición de hidrocarburo polihidroxilado se pospone
hasta después de la filtración por gel, la mezcla de elución
de DEAE deben aplicarse inmediatamente a la columna de filtración
(debido a la vulnerabilidad de las fracciones reunidas de DEAE con
su alta concentración de sal). Por tanto, puede verse que una
ventaja adicional de añadir hidrocarburo polihidroxilado a las
fracciones reunidas de DEAE es la mayor flexibilidad en términos de
intervalo de tiempo y opciones de conservación durante el periodo de
tiempo entre la cromatografía de intercambio aniónico y el
tratamiento subsiguiente.
Los métodos de concentrar preparaciones de virus
pueden aplicarse en relación con una variedad de métodos de
purificación. Para una información adicional de métodos de
purificación, puede hacerse referencia, por ejemplo, a Huyghe et
al., Human Gene Therapy, Vol. 6, pp. 1403-1416
(1995) y a la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie
08/989227.
Como muestran los datos experimentales indicados
más adelante, los métodos de la presente invención permiten una
estabilidad de virus grandemente aumentada, a pesar de las fuerzas
de cizallamiento mecánico empleadas en concentrar el virus, y a
pesar de las duras condiciones, tales como elevados niveles de sales
en la mezcla de elución de DEAE. Por tanto, los métodos de la
presente invención permiten, entre otras cosas:(1) fácil
preparación de dosis clínicas a cualquier concentración deseada
(incluso cuando se parte de un material que tiene una concentración
inferior), (2) mejora del procesamiento (por ejemplo, permitiendo
una producción significativamente superior durante la cromatografía
de exclusión por tamaños), y (3) estabilidad de la mezcla de elución
de DEAE durante >10 días a 2-10ºC (permitiendo
así que la etapa subsiguiente de concentración de virus y/o
filtración sea realizada en días separados con flexibilidad
sustancial a través de un periodo de 10 días).
\newpage
En los tres Ejemplos siguientes, se prepararon
concentraciones estables de adenovirus concentrando la mezcla de
elución de DEAE en glicerol al 30% (de acuerdo con los métodos antes
mencionados). Las preparaciones se sometieron a más purificación
por cromatografía de filtración por gel de
Superdex-200 para obtener la formulación final para
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
- Formulación final:
- NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, 10% de glicerol, pH 8 a 2-10ºC.
- Resultados:
- Partículas/FACS = Dispersión de luz 24 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,22 = 1,6 x 10^{13} partículas/ml
\vskip1.000000\baselineskip
- Formulación final:
- Tris base 14 mM, NaPi 11 mM, MgCl_{2}2 mM, sacarosa al 2%, 10% de glicerol, pH 7,8 a 2-10ºC.
- Resultados:
- Partículas/FACS = Dispersión de luz 17 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,25 = 1,5 x 10^{13} partículas/ml
\vskip1.000000\baselineskip
- Formulación final:
- NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a 2-10ºC.
- Resultados:
- Partículas/FACS = Dispersión de luz 24 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,25= 1,3 x 10^{13} partículas/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
En el siguiente Ejemplo la preparación de virus
se concentró en glicerol al 20% después de la filtración por
gel.
- Formulación final:
- NaPi 16 mM, NaCl 80 mM, MgCl_{2} 1,6 mM, sacarosa al 1,6%, glicerol al 20%, pH 8 a 2-10ºC.
- Resultados:
- Partículas/FACS = Dispersión de la luz 72 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,26 = 1,66 x 10^{13} partículas/ml
Las realizaciones específicas descritas en la
presente memoria se ofrecen solamente a modo de ejemplo, y la
invención no ha de entenderse como limitado por ellas.
Claims (12)
1. Un método de purificar una preparación de
virus que comprende:
- (a)
- someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto de una preparación de virus de un medio de cromatográfico de intercambio aniónico;
- (b)
- añadir un hidrocarburo polihidroxilado a la preparación de producto de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más;
- (c)
- aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se separe diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y
- (d)
- someter el producto de la preparación concentrada de virus de la etapa (c) a una o más etapas de tratamientos adicionales.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el
hidrocarburo polihidroxilado es un compuesto alquílico sustituido
con polihidroxi ramificado o no ramificado que tiene 2 a 7 átomos de
carbono.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en
donde el hidrocarburo polihidroxilado es glicerol.
4. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde la etapa de proceso
opcional comprende cromatografía de exclusión por tamaño
molecular.
5. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde la etapa de proceso
c) comprende filtración con flujo tangencial.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la
etapa de proceso (c) se lleva a cabo usando un aparato que comprende
un sistema de filtración Pellicon XL.
7. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde el virus es un virus
recombinante.
8. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde el virus es un virus
recombinante que lleva un transgen terapéutico para uso en terapia
génica.
9. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde el virus es un
adenovirus.
10. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde la preparación de
virus de la etapa (b) comprende además un disacárido.
11. El método de la reivindicación 10, en donde
el disacárido es sacarosa.
12. El método de una cualquiera de la
reivindicaciones 1-3, en donde la temperatura de la
preparación de virus está en el intervalo de aproximadamente 2ºC a
aproximadamente 27ºC.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2446298A | 1998-02-17 | 1998-02-17 | |
| US24462 | 1998-02-17 | ||
| US7964398A | 1998-05-15 | 1998-05-15 | |
| US79643 | 1998-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2290613T3 true ES2290613T3 (es) | 2008-02-16 |
Family
ID=26698472
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04030395T Expired - Lifetime ES2290613T3 (es) | 1998-02-17 | 1999-02-12 | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. |
| ES99906690T Expired - Lifetime ES2272053T3 (es) | 1998-02-17 | 1999-02-12 | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99906690T Expired - Lifetime ES2272053T3 (es) | 1998-02-17 | 1999-02-12 | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP1526173B1 (es) |
| JP (3) | JP4358434B2 (es) |
| KR (5) | KR100918187B1 (es) |
| CN (2) | CN101164623B (es) |
| AR (3) | AR020054A1 (es) |
| AT (3) | ATE341614T1 (es) |
| AU (1) | AU757976B2 (es) |
| BR (1) | BR9908015A (es) |
| CA (2) | CA2320419C (es) |
| CO (1) | CO4820440A1 (es) |
| DE (3) | DE69933433T2 (es) |
| DK (1) | DK1054955T3 (es) |
| ES (2) | ES2290613T3 (es) |
| HK (3) | HK1073481A1 (es) |
| HU (1) | HU226015B1 (es) |
| ID (1) | ID28298A (es) |
| IL (2) | IL137510A0 (es) |
| MY (1) | MY141641A (es) |
| NO (1) | NO20004104L (es) |
| PE (1) | PE20000265A1 (es) |
| PL (1) | PL197747B1 (es) |
| PT (1) | PT1054955E (es) |
| SK (1) | SK11842000A3 (es) |
| TW (1) | TWI232107B (es) |
| WO (1) | WO1999041416A2 (es) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
| JP4492826B2 (ja) | 1996-11-20 | 2010-06-30 | イントロジェン セラピューティクス，インコーポレイテッド | アデノウイルスベクターの産生および精製のための改良された方法 |
| EP1133316B1 (en) * | 1998-11-16 | 2009-01-21 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
| US6689600B1 (en) | 1998-11-16 | 2004-02-10 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
| EP1263461A4 (en) * | 2000-03-07 | 2009-08-12 | Merck & Co Inc | ADENOVIRUS FORMULATIONS |
| US7456009B2 (en) | 2000-03-07 | 2008-11-25 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus formulations |
| US20020064860A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Schering Corporation | Method for purifying adenoviruses |
| AU2002218535A1 (en) * | 2000-12-12 | 2002-06-24 | Japan Tobacco Inc. | Pharmaceutical composition containing an active with a hemolytic action and a surfactant |
| CA2469491A1 (en) | 2001-12-12 | 2003-06-19 | Kerrie Setiawan | Composition for viral preservation |
| US20030153065A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-08-14 | Genvec, Inc. | Composition and method for maintaining non-enveloped viral vectors |
| MXPA04006995A (es) * | 2002-01-18 | 2005-07-13 | Schering Ag | Formulaciones estabilizadas de adenovirus. |
| ATE435906T1 (de) | 2004-02-23 | 2009-07-15 | Crucell Holland Bv | Verfahren zur reinigung von viren |
| CA2586107A1 (en) | 2004-11-03 | 2006-05-18 | Introgen Therapeutics Inc. | A novel method for the production and purification of adenoviral vectors |
| EP1831352B1 (en) | 2004-12-13 | 2011-07-13 | CANJI, Inc. | Cell lines for production of replication-defective adenovirus |
| DK1869171T4 (en) | 2005-04-11 | 2016-01-18 | Crucell Holland Bv | Virus cleaning using ultrafiltration |
| CN1961961B (zh) * | 2005-11-11 | 2010-05-26 | 深圳市源兴生物医药科技有限公司 | 一种药物制剂及其制备方法 |
| WO2007070392A2 (en) | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Canji, Inc. | Adenoviral expression vectors having an expression cassette in the e1 region and an inactivated e2b polymerase |
| WO2007123961A2 (en) * | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Wyeth | Purification processes for isolating purified vesicular stomatitis virus from cell culture |
| US10041049B2 (en) | 2008-11-03 | 2018-08-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method for the production of adenoviral vectors |
| MX356669B (es) | 2009-05-02 | 2018-06-08 | Genzyme Corp | Terapia genica para trastornos neurodegenerativos. |
| CA2786835C (en) | 2010-02-15 | 2021-08-31 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of ad26 adenoviral vectors |
| WO2012038367A1 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active tuberculosis |
| WO2012041669A1 (en) | 2010-09-27 | 2012-04-05 | Crucell Holland B.V. | Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria |
| US9045728B2 (en) * | 2010-12-02 | 2015-06-02 | Oncolytics Biotech Inc. | Liquid viral formulations |
| TW201233803A (en) | 2010-12-02 | 2012-08-16 | Oncolytics Biotech Inc | Lyophilized viral formulations |
| SG194449A1 (en) * | 2011-04-29 | 2013-12-30 | Oncolytics Biotech Inc | Methods of purifying viruses using gel permeation chromatography |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| KR102044051B1 (ko) | 2012-03-12 | 2019-11-12 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 터미널 말단이 변경된 재조합 아데노바이러스의 배치 |
| US9125870B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-08 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
| WO2013139916A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against rsv |
| DK2988780T3 (en) | 2013-04-25 | 2019-04-08 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | STABILIZED SOLVEN RSV-F PREFUSION POLYPTIDES |
| US10294279B2 (en) | 2013-06-17 | 2019-05-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| KR20170004966A (ko) * | 2014-05-28 | 2017-01-11 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 바이러스 감소 방법 |
| PL3283634T3 (pl) | 2015-04-14 | 2019-10-31 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Rekombinowany adenowirus eksprymujący dwa transgeny z dwukierunkowym promotorem |
| BR112017027448A2 (pt) | 2015-07-07 | 2018-09-04 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | vacina contra rsv |
| BR112017028449A2 (pt) | 2015-07-07 | 2018-09-04 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | polipeptídeos rsv f pré-fusão solúveis estabilizados |
| CA3018139A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-10-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
| SG11201807913XA (en) | 2016-04-05 | 2018-10-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
| SG11201810078PA (en) | 2016-05-30 | 2018-12-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| EP3472327B1 (en) | 2016-06-20 | 2020-08-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| US10744196B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-08-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HPV vaccines |
| WO2018210871A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| US11229692B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| WO2019021305A1 (en) * | 2017-07-24 | 2019-01-31 | Ella Foundation | VACCINE AGAINST FOOT AND MOUTH DISEASE |
| EP3681533A1 (en) | 2017-09-15 | 2020-07-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method for the safe induction of immunity against rsv |
| EP3990031A4 (en) * | 2019-06-28 | 2023-08-09 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | METHODS FOR PURIFYING ADENO-ASSOCIATED VIRUS |
| JP2023512519A (ja) | 2020-01-31 | 2023-03-27 | ベス イスラエル ディーコネス メディカル センター インコーポレイテッド | コロナウイルス感染症を予防および処置するための組成物および方法－ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ワクチン |
| JP2024509756A (ja) | 2021-02-19 | 2024-03-05 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 安定化された融合前ｒｓｖ ｆｂ抗原 |
| WO2023020939A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
| CN115989321A (zh) * | 2021-08-17 | 2023-04-18 | 上海行深生物科技有限公司 | 病毒制剂、用于配制病毒制剂的溶液及其用途 |
| WO2023111725A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Sars-cov-2 vaccines |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE299213C (es) * | ||||
| US4147772A (en) * | 1976-02-03 | 1979-04-03 | Merck & Co., Inc. | Vaccine stabilizer |
| GB1575155A (en) * | 1978-04-11 | 1980-09-17 | Merck & Co Inc | Vaccine stabilizer |
| BE866330A (fr) * | 1978-04-25 | 1978-10-25 | Merck & Co Inc | Procede de fabrication d'un agent de stabilisation de vaccin |
| US5532220A (en) | 1987-08-31 | 1996-07-02 | The Regents Of The University Of California | Genetic mechanisms of tumor suppression |
| DD299213A7 (de) * | 1988-05-04 | 1992-04-09 | Saechsische Landesgewerbefoerderungsgesellschaft M.B.H.,De | Verfahren zur stabilisierung eines lebendvirusimpfstoffes gegen temperatureinwirkung |
| DD295927A5 (de) * | 1988-05-06 | 1991-11-14 | Saechsisches Serumwerk Gmbh Dresden, | Immobilisiertes immunologisch aktives reagens |
| EP2113569A1 (en) | 1993-10-25 | 2009-11-04 | CANJI, Inc. | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
| KR100368686B1 (ko) * | 1994-12-29 | 2003-12-01 | 주식회사 엘지생명과학 | 수크로즈를이용한세포와바이러스의분리방법 |
| FR2742756B1 (fr) * | 1995-12-22 | 1998-04-03 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Stabilisants pour vaccins vivants, vaccins les contenant et procedes pour leur preparation |
| US5789244A (en) * | 1996-01-08 | 1998-08-04 | Canji, Inc. | Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems |
-
1999
- 1999-02-12 ES ES04030395T patent/ES2290613T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 DE DE69933433T patent/DE69933433T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 KR KR1020087008929A patent/KR100918187B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 DK DK99906690T patent/DK1054955T3/da active
- 1999-02-12 WO PCT/US1999/001873 patent/WO1999041416A2/en active IP Right Grant
- 1999-02-12 CN CN2007101670867A patent/CN101164623B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-12 EP EP04030394A patent/EP1526173B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 EP EP04030395A patent/EP1526174B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 KR KR1020007008878A patent/KR100862169B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 DE DE69936948T patent/DE69936948T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 HU HU0100670A patent/HU226015B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 KR KR1020097022935A patent/KR101018992B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 DE DE69942708T patent/DE69942708D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 PL PL342847A patent/PL197747B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 CA CA2320419A patent/CA2320419C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-12 EP EP99906690A patent/EP1054955B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 BR BR9908015-0A patent/BR9908015A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-02-12 AU AU26538/99A patent/AU757976B2/en not_active Ceased
- 1999-02-12 CN CNB998050989A patent/CN100374551C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-12 AT AT99906690T patent/ATE341614T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 CA CA2723040A patent/CA2723040A1/en not_active Abandoned
- 1999-02-12 SK SK1184-2000A patent/SK11842000A3/sk unknown
- 1999-02-12 ID IDW20001574A patent/ID28298A/id unknown
- 1999-02-12 PT PT99906690T patent/PT1054955E/pt unknown
- 1999-02-12 AT AT04030395T patent/ATE371020T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 JP JP2000531596A patent/JP4358434B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-02-12 IL IL13751099A patent/IL137510A0/xx unknown
- 1999-02-12 AT AT06019642T patent/ATE478945T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 EP EP06019642A patent/EP1741777B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-12 TW TW088102219A patent/TWI232107B/zh not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 KR KR1020097004676A patent/KR100991683B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 KR KR1020087008928A patent/KR100912362B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-12 ES ES99906690T patent/ES2272053T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-15 MY MYPI99000542A patent/MY141641A/en unknown
- 1999-02-16 PE PE1999000137A patent/PE20000265A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-02-16 CO CO99009282A patent/CO4820440A1/es unknown
- 1999-02-23 AR ARP990100656A patent/AR020054A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-07-25 IL IL137510A patent/IL137510A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-16 NO NO20004104A patent/NO20004104L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-01 HK HK05106734A patent/HK1073481A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-12-01 HK HK00107727A patent/HK1028416A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-07 JP JP2006030336A patent/JP2006166925A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-05-10 HK HK07104995.0A patent/HK1097413A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-10-16 AR ARP070104577A patent/AR063315A2/es unknown
- 2007-10-16 AR ARP070104576A patent/AR063314A2/es unknown
-
2010
- 2010-07-08 JP JP2010156257A patent/JP2010213727A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2290613T3 (es) | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. | |
| US20120093777A1 (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| CZ302895A3 (en) | The use of recombinant adenovirus of animal origin for preparing a pharmaceutical preparation | |
| US20080261289A1 (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| ES2349106T3 (es) | Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. | |
| MXPA00008008A (es) | Composiciones que contienen virus y metodos para concentrar preparados de virus | |
| NZ505952A (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| CZ20002864A3 (cs) | Prostředek obsahující virus, způsoby jeho koncentrace a purifikace |