DE69933433T2

DE69933433T2 - Virus enthaltende zusammensetzungen und methoden zur konzentration von viruspräparaten

Info

Publication number: DE69933433T2
Application number: DE69933433T
Authority: DE
Inventors: Andreas Freehold FREI; K. Henry Summit KWAN; E. Varda Forest Hills SANDWEISS; J. Gary Glen Ridge VELLEKAMP; Pui-Ho Princeton Junction YUEN; L. Laureano Piscataway BONDOC; William Frederick Bridgewater PORTER; Chu-Tay John Sudbure TANG; Peter Brooklyn IHNAT
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-02-13
Also published as: ATE341614T1; HK1028416A1; JP2006166925A; KR20010072547A; CN100374551C; WO1999041416A2; KR100912362B1; ATE371020T1; KR20090038927A; EP1054955A2; EP1741777A1; EP1526173B1; AR020054A1; EP1741777B1; AU757976B2; EP1526173A2; DE69936948T2; NO20004104D0; BR9908015A; PE20000265A1

Description

I. BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die Viren enthalten, insbesondere virale Vektoren, die eine wesentlich verbesserte Stabilität aufweisen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind zum Erhalten der Stabilität von Viren während der Lagerung nützlich, und erfindungsgemäße, Virus-enthaltende Zusammensetzungen sind für therapeutische Zwecke, wie zum Beispiel Gentherapie besonders nützlich. Neue Verfahren zum Konzentrieren und Auf reinigen von Viruszubereitungen werden ebenfalls diskutiert.
II. HINTERGRUND
Für therapeutische Verwendungen, wie beispielsweise Impfungen und Gentherapie sind Viren zunehmend wichtig geworden, und es gibt eine Bedürfnis, stabile, Virus-enthaltende Zusammensetzungen zu entwickeln und zuzubereiten, die einfach gelagert und transportiert werden können, und dennoch ausreichend Sicherheit und Wirksamkeit behalten. Insbesondere ist es angesichts der intensiven Benutzung von viralen Vektoren in der Gentherapie wichtig, Formulierungen zu entwickeln und zuzubereiten, die lebende rekombinante Viren stabil aufbewahren können, wenn diese therapeutische Transgene tragen
Weiterhin gibt es ein entscheidendes Bedürfnis nach Formulierungen, die virale Zubereitungen bei Temperaturen über –80 °C für längere Zeiträume stabilisieren können. Virusenthaltende Zubereitungen benötigen normalerweise eine Lagerung bei –80 °C und können bei Standardkühlschranktemperaturen (z.B. 2 °C bis 8 °C oder höher) nicht für umfangreiche Zeiträume gelagert werden. Diese Einschränkung stellt ein ernstes Hindernis nicht nur für die Lagerung, sondern auch für das Weiterverarbeiten, den Vertrieb und die weit verbreitete klinische Verwendung dar.
Es gibt auch ein Bedürfnis, Virus-enthaltende Zusammensetzungen zu entwickeln, die für längere Zeiträume einen pH-Wert in dem Bereich von ungefähr 7 bis ungefähr 8,5 beibehalten können, obwohl sie Kühlschranktemperaturen ausgesetzt sind, und obwohl sie rauen Bedingungen ausgesetzt sind, wie beispielsweise Gefrieren/Tauen, insbesondere den langsamen Geschwindigkeiten des Gefrieren/Tauens, die in Verbindung mit Herstellen im großem Maßstab, Handhaben oder Verteilen auftreten können. Das Aufrechterhalten des pH ist für virale Zubereitungen wichtig, da bei einem pH unter 7,0 und über 8,5 die lebenden Viruspartikel wegen der physikalischen und biologischen Instabilität anfällig sind, an Lebensfähigkeit zu verlieren.
Zusätzliche Probleme sind mit dem Erhöhen der Viruskonzentration verbunden. Insbesondere tragen hohe Viruskonzentrationen wesentlich zur Virusinstabilität bei. Jedoch werden zunehmend höhere Konzentrationen an Virus und viralen Vektoren für therapeutische Zwecke benötigt. Daher gibt es ein entscheidendes Bedürfnis, Formulierungen zu entwickeln, die verhältnismäßig hohe Konzentrationen an Virus stabilisieren, insbesondere unter den rauen Bedingungen, die oben genannt werden. Und zusätzlich gibt es ein besonderes Bedürfnis, neue Verfahren des Konzentrierens einer bestehenden Viruszubereitung zu entwickeln, um stabile Zubereitungen bei höheren Konzentrationsniveaus zu erhalten. Die Probleme der Instabilität, die mit höheren Viruskonzentrationen in Verbindung stehen, werden entscheidend verschlimmert, wenn man versucht, eine bestehende Viruszubereitung aufzukonzentrieren. Dies liegt zum Teil an den zusätzlichen mechanischen Scherkräften, die während den Bemühungen zum Tragen kommen, die Konzentration einer bestehenden Viruspräparation zu erhöhen. Wenn es einem gelingen sollte, ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung zu finden, ohne die Virusstabilität wesentlich zu beeinträch tigen, dann könnten klinische Dosierungen mit jeder gewünschten Konzentration leicht hergestellt werden (sogar, wenn mit Material begonnen wird, das eine niedrigere Konzentration aufweist) und, wichtiger, das Vermögen, Virus aufzukonzentrieren, könnte problematische Engpässe und andere Probleme mit dem Herauf skalieren während des Aufreinigungsprozesses eliminieren, indem ein signifikant höherer Durchsatz während der verschiedenen Prozessierungsschritte, wie beispielsweise der Ausschlusschromatographie ermöglicht wird.
Folglich gibt es ein Bedürfnis für Materialien und Verfahren, um die vorangehend genannten Ziele zu erreichen.
III. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Erhaltung der Stabilität von Adenoviren zur Verfügung, umfassend Adenoviren in einer Formulierung, die 20 bis 200 mg/ml Glycerin, Saccharose und ein Puffersystem umfasst, das den pH-Wert in einem Bereich von ungefähr 7 bis etwa 8,5 bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 °C bis 27 °C erhält, wobei das Puffersystem Natriumphosphat-Dihydrat, einbasisch, in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 mg/ml und Trometamol in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 mg/ml enthält.
Neue Verfahren zum Konzentrieren einer bestehenden Viruszubereitung werden ebenfalls diskutiert, die es einem erlauben, klinische Dosierungen in einem weiten Bereich gewünschter Konzentrationen leicht auszuwählen und herzustellen. Ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung umfasst Schritte, bei denen man:

(a) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu einer Viruszubereitung bis zu einer Endkonzentration des Polyhydroxy kohlenwasserstoffs von ungefähr 20 % oder mehr zugibt, und
(b) die Viruszubereitung einem Filtrationsverfahren unterzieht, wobei die Viruskonzentration durch Anlegen von Druck an die Zubereitung erhöht wird, so dass das Lösungsmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter entfernt wird, während das Virus zurückgehalten wird.

Hier ebenfalls diskutiert wird ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung, die Schritte umfasst, bei denen man:

(a) eine Zubereitung zentrifugiert, die eine erste Schicht umfasst, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von 35 % bis 80 % (v/v) umfasst, wobei die erste Schicht mit einer zweiten Schicht überschichtet ist, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von 5 % bis 30 % (v/v) umfasst, wobei die zweite Schicht mit einer dritten Schicht überschichtet ist, die das Virus umfasst, und
(b) das Virus aus der ersten Schicht gewinnt.

Weiterhin haben die gegenwärtigen Erfinder herausgefunden, dass ihr neues Verfahren des Erhöhens der Viruskonzentration den zusätzlichen Vorteil des Verbesserns des weiteren Verarbeitens (z.B. durch Verringern oder Vermeiden problematischer Engpässe während der nachfolgenden Aufreinigung durch Ermöglichen eines wesentlichen höheren Durchsatzes während der Verarbeitungsschritte wie beispielsweise der Größenausschlusschromatographie) aufweist. Daher umfasst das Verfahren des Konzentrierens von Viruszubereitungen weiterhin einen nachfolgenden Aufreinigungsschritt (z.B. Größenausschlusschromatographie). In dieser Hinsicht ist das Verfahren besonders nütz lich, wenn ein Schritt der Größenausschlusschromatographie im Anschluss an Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird, und die Viruszubereitung nach der Ionenaustauschchromatographie, aber vor der Größenausschlusschromatographie aufkonzentriert wird. Virale Fraktionen, die beispielsweise über Anionenaustauschchromatographie erhalten werden, enthalten üblicherweise hohe Gehalte von Salzen und möglicherweise anderen Verunreinigungen, welche die Virusstabilität während der Konzentrierungsverfahren weiter beeinträchtigen. Daher wird auch ein Verfahren zum Auf reinigen einer Viruszubereitung diskutiert, das die Schritte umfasst, bei denen man:

(a) die Viruszubereitung einer Anionenaustauschchromatographie unterzieht, wobei das Virus als ein Viruszubereitungsprodukt aus einem Anionenaustauschchromatographiemedium eluiert wird,
(b) ein Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (a) zugeben wird, so dass die Konzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs in der Zubereitung eine Endkonzentration von ungefähr 25 oder mehr erreicht, und
(c) die Viruskonzentration in dem Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (b) durch Anlegen von Druck an die Zubereitung erhöht wird, so dass das Lösungsmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter entfernt wird, während das Virus zurückgehalten wird, und
(d) das konzentrierte Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (c) einem oder mehreren zusätzlicher Verarbeitungsschritten unterzogen wird.

Viruszubereitungen, die durch eines der vorangehenden Verfahren konzentriert und/oder aufgereinigt worden sind, werden ebenfalls diskutiert.
IV. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Wie oben angegeben, offenbart die vorliegende Anmeldung neue Virus-enthaltende Zusammensetzungen ebenso wie neue Verfahren zum Konzentrieren und Auf reinigen von Virus-enthaltenen Zusammensetzungen.
Im Hinblick auf Zusammensetzungen haben die gegenwärtigen Erfinder eine neue gepufferte Formulierung entwickelt, die virale Zubereitungen mit erhöhter Stabilität konservieren kann. Insbesondere kann die Formulierung virale Zubereitungen bei Temperaturen deutlich über –80 °C stabilisieren. Dennoch viel wichtiger ist, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bei üblichen Kühlschranktemperaturen von zum Beispiel 2 °C bis 8 °C oder mehr für beträchtliche Zeiträume, bevorzugt für mehrere Monate oder länger stabil sind. Dies ist ein entscheidender Vorteil, da es, wie oben erwähnt, unpraktisch ist, virale Zubereitungen während der Lagerung und des Transportes bei –80 °C gefroren zu lagern, um klinische Bedürfnisse zu erfüllen.
Eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist die Zugabe eines Polyhydroxykohlenwasserstoffs, nämlich Glycerin. Wie hier verwendet, steht ein Polyhydroxykohlenwasserstoff für eine verzweigte, lineare oder cyclische Verbindung, die mit zwei oder mehr (bevorzugt 2 bis 6, bevorzugter 2 bis 4) Hydroxygruppen substituiert ist. Polyhydroxykohlenwasserstoffe sind Polyhydroxy-substituierte Alkylverbindungen (verzweigt oder unverzweigt), die bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, und zum Beispiel Glycerin, Sorbitol und Polypropanol einschließen. Wie durch die unten be reitgestellten Daten gezeigt wird, haben die gegenwärtigen Erfinder herausgefunden, dass Glycerin überraschend hohe Stabilitätsniveaus für verlängerte Zeiträume sogar unter Standardkühlschrankbedingungen ermöglicht.
Eine wirksame Menge Glycerin für erfindungsgemäße Zusammensetzungen ist eine Menge, die ausreichend ist, um das Virus in der erfindungsgemäßen Formulierung zu stabilisieren, ohne die Wirksamkeit des Virus für weitere Verwendung negativ zu beeinflussen, insbesondere in Fällen, bei denen das Virus ein Transgen für Verwendungen in der Gentherapie enthält. Glycerin liegt in einer Endkonzentration von ungefähr 20 bis 200 mg/ml vor. Ein engerer Bereich kann 80 bis 120 mg/ml betragen. Mehr als ein Polyhydroxykohlenwasserstoff kann verwendet werden.
Polyhydroxykohlenwasserstoffe können wahlweise eine Aldehydgruppe enthalten. Insbesondere kann ein Polyhydroxykohlenwasserstoff ein Disaccharid, wie beispielsweise Saccharose sein. Weiterhin enthält Glycerin keine Aldehydgruppe und die Zusammensetzung beinhaltet zusätzlich ein Disaccharid, nämlich Saccharose, als einen Stabilisator und Tonizitäts-anpassendes Mittel. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält Glycerin und Saccharose als einen zusätzlichen Stabilisator und Tonizitäts-anpassendes Mittel. Die Saccharose liegt bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 25 mg/ml, bevorzugter 20 mg/ml vor.
Pharmazeutisch verträgliche divalente Metallsalzstabilisatoren, wie beispielsweise Magnesiumsalze, Zinksalze und Calciumsalze werden in bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet. Bevorzugt ist das Salz ein Chloridsalz oder ein Magnesiumsalz, wobei Magnesiumsalz besonders bevorzugt wird. Bevorzugt liegt das Salz (zum Beispiel das Magnesiumsalz) in einer Menge von ungefähr 0,1 bis 1 mg/ml, bevorzugt in einer Menge von ungefähr 0,4 mg/ml vor.
Pharmazeutisch verträgliche monovalente Metallsalzstabilisatoren, wie beispielsweise Kalium-, Natrium-, Lithium- und Cäsiumsalze können in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung als fakultative Stabilisatoren enthalten sein. Bevorzugt ist das Salz Natriumchlorid, das in der Menge von 0,6 bis 10,0 mg/ml, bevorzugter in einer Menge von ungefähr 5,8 mg/ml vorliegt.
Zusätzlich zu dem Stabilisieren der Zusammensetzung kann Natriumchlorid die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Auftretens von Nebenprodukten der Fermentation unterdrücken, was zu einer pharmazeutisch eleganteren Präsentation führt, die ein reduziertes Antigenitätspotential durch Proteinaggregate aufweist. Die Zugabe von Natriumchlorid beeinflusst den pH der Formulierung nicht.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind in der Lage, einen pH in dem Bereich von ungefähr 7 bis ungefähr 8,5 für längere Zeiträume zu erhalten, sogar wenn diese rauen Bedingungen wie (Tief)Kühlen und Gefrieren/Tauen ausgesetzt sind. Zudem können die Zusammensetzungen stabil bleiben und den gewünschten pH-Bereich erhalten, sogar wenn sie dem verhältnismäßig langsamen Geschwindigkeiten des Gefrieren/Tauens unterzogen werden, die in Verbindung mit großformatiger Herstellung, Verteilung und Handhabung auftreten. Wie oben angegeben, ist ein Erhalten des pH für virale Zubereitungen wichtig, da bei einem pH unter 7,0 und über 8,5 die lebenden Viruspartikel instabil werden können und degradieren. Die besondere Zusammensetzung von Viren macht es schwierig, Viren zu stabilisieren und zu konservieren.
Um das Erhalten des pHs bei rauen Bedingungen zu erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung ein Puffersystem, das einen optimalen pH in einem Bereich von ungefähr 7,0 bis ungefähr 8,5 trotz Lagerung zwischen –80 °C und 27 °C und trotz dem Aussetzten gegenüber Bedingungen des Gefrieren/Tauens erhalten kann. Da der pH in Abhängigkeit von der Temperatur variieren kann, werden die pH-Bereiche der vorliegenden Erfindung unten mit Bezug auf spezifische Temperaturbereiche eingehender veranschaulicht. Beispielsweise beträgt bei Kühlschranktemperaturen (zum Beispiel ungefähr 2 °C bis 8 °C) ein bevorzugter pH-Bereich ungefähr 7,7 bis ungefähr 8,3, bevorzugter ungefähr 7,9 bis ungefähr 8,2. Bei Raumtemperatur (zum Beispiel ungefähr 20 % bis 27 °C, bevorzugter 22 °C bis 25 °C) beträgt ein bevorzugter pH-Bereich ungefähr 7,3 bis ungefähr 8,2, bevorzugter ungefähr 7,4 bis ungefähr 7,9.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst ein Puffersystem, das Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch, in einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis 10 mg/ml und Trometamol in einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis 10 mg/ml umfasst. (Trometamol ist auch als TRIS oder "Trizma" bekannt, das von Sigma Chemical Co. erhältlich ist). Jedoch werden auch andere Puffersysteme diskutiert. Beispielsweise kann zweibasisches Natriumphosphatdihydrat verwendet werden, wenn es mit einer sauren Form des Tris-Puffers gepaart ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Puffersystem Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch, in einer Konzentration von ungefähr 1,7 mg/ml und Trometamol in einer Konzentration von ungefähr 1,7 mg/ml und hat die Fähigkeit, die Formulierung in einem optimalen pH-Bereich von ungefähr 7,3 bis ungefähr 7,9 bei 25 °C zu halten.
Die erfindungsgemäße Formulierung hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Fähigkeit hat, hohe Viruskonzentrationen bei den oben genannten rauen Bedingungen (wie beispielsweise Kühlschranktemperaturen und Gefrier/Tau-Verarbeitung) zu stabilisieren. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Formulierung die Stabilität des Virus bei Konzentrationen erhalten, die bis zu 1 × 10¹³ Partikel/ml reichen. Ein bevorzugter Be reich der Viruskonzentrationen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegt bei einer Menge von 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹³ Partikel/ml, bevorzugter bei bis zu 1 × 10¹² Partikel/ml, zum Beispiel 1 × 10⁹ (oder 1 × 10⁹) bis 1 × 10¹².
Der Begriff "Streckmittel", wie er hier verwendet wird, kann ein Lösungsmittel (zum Beispiel Wasser, bevorzugt steriles Wasser) oder eine Mischung eines Lösungsmittels mit anderen Inhaltsstoffen, wie beispielsweise zusätzlichen Lösungsmitteln, zusätzlichen Stabilisatoren, zusätzlichen Puffern und/oder anderen Substanzen umfassen, welche die Sicherheit, Wirksamkeit und Stabilität der Formulierung nicht negativ beeinflussen. Hinsichtlich der Streckmittel, Stabilisatoren, Puffer und dergleichen wird Bezug genommen auf zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Ein Tensid, bevorzugt ein nicht-ionisches Detergens, wie beispielsweise ein Polyoxyethylen-Fettsäureester (zum Beispiel Polyoxyethylensorbitane wie beispielsweise Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60 oder Polysorbat 80 von ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware oder Tween 20, Tween 40, Tween 60 und Tween 80 von Sigma, St. Louis, Mo.) können wahlweise in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Bevorzugt ist das nicht-ionische Detergens ein Polyoxyethylen-Fettsäureester und der Polyoxyethylen-Fettsäureester ist bevorzugt Polysorbat 80, das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung als ein Stabilisator wirken kann. Die Konzentration des nicht-ionischen Detergens liegt bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,3 mg/ml, bevorzugter 0,15 mg/ml.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können weiterhin ein oder mehrere "die Verabreichung verbesserndes) Mittel" enthalten. Ein "die Verabreichung verbesserndes Mittel" bezieht sich auf jedes Mittel, das die Verabreichung eines therapeuti schen Gens, wie beispielsweise eines Tumorsuppressorgens an ein kanzeröses Gewebe oder Organ verbessert. Beispiele solcher die Verabreichung verbessernder Mittel beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Detergenzien, Alkohole, Glykole, Tenside, Gallensalze, Heparinantagonisten, Cyclooxygenaseinhibitoren, hypertonische Salzlösungen und Acetate.
Detergenzien (wie der Begriff hier benutzt wird) können anionische, kationische, zwitterionische und nicht-ionische Detergenzien einschließen. Beispielhafte Detergenzien schließen auf Taurocholat, Deoxycholat, Taurodeoxycholat, Cetylpyridium, Benalkoniumchlorid, ZWITTERGENT° 3-14-Detergens, CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol]-1-propansulfonathydrat, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, TRITON^®-X-100-Detergens, C12E8, Octyl-B-D-Glucopyranosid, PLURONIC^®-F68-Detergens, TWEEN^® 20-Detergens und TWEEN^® 80-Detergens (CALBIO-CHEM^® Biochemicals) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Verwendung von die Verabreichung verbessernden Mitteln wird im Detail in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung U.S.S.N. 08/889,335, eingereicht am B. Juli 1997, und der Internationalen Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 97/25072, 17. Juli 1997, und in der US-Patentanmeldung U.S.S.N. 09/112,074, eingereicht am B. Juli 1998, der Internationalen Anmeldung PCT/US98/14241 beschrieben. Zusätzlich wird die Verwendung von Calpain-Inhibitoren in Verbindung mit viralen Vektoren zum Erhöhen der Transduktionseffizienz in den US-Patentanmeldungen U.S.S.N. 09/172,685 und 60/104321, eingereicht am 15. Oktober 1998, beschrieben.
Ein großer Bereich von Viren wird hier diskutiert, einschließlich Adenoviren, Pockenviren, Iridoviren, Herpesviren, Papovaviren, Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Retroviren, Adeno-assoziierter Viren, Rotaviren etc. (siehe zum Beispiel Anderson, Science (1992) 256: 808-813). Die in der vorliegenden Er findung verwendeten Viren sind Adenoviren, bevorzugt rekombinante Viren, können aber klinische Isolate, attenuierte Impfstoffstämme und so weiter einschließen. So ist beispielsweise A/C/N/53 ein exemplarisches rekombinantes Adenovirus, der in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden kann, der in der PCT-Patentanmeldung mit der Nummer WO 95/11984 offenbart wird.
Die erfindungsgemäße Formulierung ist zum Stabilisieren eines rekombinanten Virus, wie beispielsweise eines lebenden rekombinanten Adenovirus (oder "viralen Vektors") für therapeutische Zwecke in der Gentherapie besonders gut geeignet. Beispielsweise kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete Virus ein Tumorsuppressorgen, wie beispielsweise ein Wildtypp53-Gen oder ein Rb-Gen (zum Beispiel p110^RB oder p56^RB) umfassen, und mit Transgenen, wie beispielsweise dem Wildtyp-p53 inseriert in einem viralen Vektor kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln von Krebs verwendet werden.
In diesem Zusammenhang können die erfindungsgemäßen Formulierungen die bemerkenswerte Fähigkeit haben, die Lebensfähigkeit des lebenden Virus, insbesondere eines viralen Vektors, in den eine Nukleotidsequenz, die für ein Transgen, wie beispielsweise p53 kodiert, eingefügt worden ist, zu erhalten. Diese Eigenschaft erlaubt es dem Virus, seine Fähigkeit zu erhalten, Zielzellen zu infizieren, so dass das therapeutische Protein, das durch das therapeutische Protein, das durch das eingefügte Transgen kodiert wird, angemessen gebildet wird.
Unter besonderer Berücksichtigung des p53 und seiner Verwendungen wird angemerkt, dass Mutation des p53-Gens die häufigste genetische Veränderung bei humanen Krebserkrankungen ist (Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). Einführen des Wildtyp-p53 in Säugetier krebszellen, denen endogenes Wildtyp-p53-Protein fehlt, unterdrückt den neoplastischen Phänotyp dieser Zellen (siehe zum Beispiel US-Patent 5,5432,220).
In den unteren Beispielen ist das Virus ein lebendes rekombinantes Adenovirus, welches das Wildtyp-p53-Gen enthält. Das besondere in diesen Beispielen verwendete Virusvektorkonstrukt wird hier als "A/C/N/53" bezeichnet. A/C/N/53 (auch als "ACN53" bezeichnet) ist ein besonders bevorzugtes virales Vektorkonstrukt, das in der ebenfalls anhängigen Anmeldung USSN 08/328,673, eingereicht am 25. Oktober 1994, und in der WO 95/11984 (4. Mai 1995) beschrieben wird, die durch Bezugnahme ausdrücklich hierin aufgenommen werden.
Eine repräsentative Formel für bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen, die Polysorbat 80 enthalten, wird unten dargestellt: Repräsentative Formel
(Die Zusammensetzungen werden üblicherweise in Dosen von 1,0 ml gelagert. "q.s. ad" in der obigen Formel steht für das Zugeben von ausreichend Streckmittel, um das Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen).
Vier besonders bevorzugte Ausführungsformen werden unten dargestellt. (Polysorbat 80 liegt in den Beispielen 1 und 2 vor, fehlt aber in den Beispielen 3 und 4).
Die folgenden Inhaltsstoffe können alle erhalten werden von zum Beispiel EM Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532: Natriumphosphatdihydrat, monobasisch; Trometamol; Magnesiumchloridhexahydrat; Saccharose und Glycerin. Polysorbat 80 ist beispielsweise von ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, 19897 erhältlich.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können während der Aufreinigung des Virus in einer Gelfiltrationschromatographiesäule durch Verbinden der Inhaltsstoffe (mit Ausnahme von Polysorbat 80) in den gewünschten Konzentrationen in der Gelfiltrationssäule hergestellt werden. (Hinsichtlich der Gelfiltrationsverfahren kann Bezug genommen werden auf beispielsweise Abschnitt V unten). Wenn es dann gewünscht ist, die Konzentration des Virus zu verdünnen oder Polysorbat-80 zuzugeben, dann können die Streckmittel durch Standardtechniken hergestellt werden. Ein Beispiel wird nachfolgend angegeben:
Gebe bei Raumtemperatur Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch, Trometamol, Saccharose, Magnesiumchloridhexahydrat und Glycerin in ungefähr 75 % des Chargenvolumens Wasser für die Injektion in ein Gefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem Rührer ausgerüstet ist, und löse diese. Fülle die Charge des entstandenen Streckmittels mit Wasser zur Injektion auf das Endvolumen. Überprüfe den pH. Berechne die benötigte Menge der A/C/N/53- (Adenovirus mit Wildtyp-p53 als einem Transgen) Arzneisubstanz in Suspension ("drug substance in suspension") und das benötigte Volumen des Streckmittels, um die A/C/N/53-Injektion herzustellen. Wenn die endgültige A/C/N/53-Injektion Polysorbat 80 enthalten wird, bereite eine Stammlösung vor, die 10 % Überschuss Polysorbat 80 in Streckmittel enthält. Gebe die berechneten Mengen der A/C/N/53-Arzneisubstanz in Suspension und das Streckmittel in ein Gefäß aus rostfreiem Stahl und mische. Gebe die Polysorbat 80-Lösung vor der Zugabe des gesamten Streckmittels bezogen auf 10 % des Gesamtvolumens der A/C/N/53-Injektionscharge wenn nötig zu. Filtriere die Suspension aseptisch durch einen sterilisierten Filter (0,22 μm oder entsprechend). Überprüfe die Unversehrtheit des Filters nach der Filtration. Sammel und fülle die sterilisierte Suspension in Röhrchen, die das entsprechende Volumen aufweisen. Schließe und versiegle die Röhrchen.
Stabilitätsdaten für die Beispiele 1, 2, 3 bzw. 4 sind unten in den Tabellen 1, 2, 3 und 4 angegeben.
In den Tabellen unten ist das Antiproliferationsassay ein Bioassay, das verwendet wird, um die Fähigkeit des Produktes zu messen, Krebszellen zu unterdrücken, und beruht allgemein auf Verfahren, die von Wills et al., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088 verwendet wurden. Die aufgelisteten Zahlen geben die Aktivität an, während die Kontrolle keine Aktivität aufweist.
Der "Plaque-Assay" misst Viruspartikel in Kultur durch Auszählen der Anzahl der Virusplaques als eine Funktion der Verdünnung und beruht allgemein auf Verfahren, die in Graham F.L., und Prevec L., Methods in Molecular Biology, Band 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E.J. Murray, Hrsg. (Human Press Inc., Clifton NJ) S. 109-128 (1991) beschrieben sind; siehe auch Graham F.L., Smiley J., Russel W.C., und Nairn R., J. Gen. Virol. Band 36, S. 59-74 (1977).
Der "FACS"-Assay zeigt die Fähigkeit des Virus, Zellen zu infizieren, und diese Messungen beruhen allgemein auf den Verfahren, die zum Beispiel in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/11865 (WO 98/01582, veröffentlicht am 15. Januar 1998) beschrieben sind. In der nächsten Spalte zur Rechten stellen die unter der Überschrift "Konzentration" dargestellten Zahlen die Konzentration der Gesamtzahl an Viruspartikeln dar. Zuletzt stellen die Zahlen unter der Überschrift „Partikel/FACS-Verhältnis" das Verhältnis der Gesamtzahl von Viruspartikeln verglichen mit der Anzahl der infektiösen Viruspar tikeln dar und geben damit die relative Wirksamkeit der Viruspräparation an.
Die Daten unter der Überschrift "W" geben die Aggregation der Viruspartikel an, wie sie durch das UV-Absorptionsverhältnis für die Wellenlängen A₃₂₀/A₂₆₀ als ein Zeichen der Lichtstreuung angegeben wird. Grundsätzlich mißt die Absorption bei einer Wellenlänge von 320 nm die Menge des Streulichts, während die Absorption bei der Wellenlänge von 260 nm mit der Menge in der DNA korreliert.
Die in der zweiten Spalte der Tabelle unter "Bedingung" aufgelisteten Temperaturen geben die Lagertemperatur wieder. Die physiologischen Assays werden bei 37 °C durchgeführt und der pH in der letzten Spalte wird bei Raumtemperatur, ungefähr 25 °C, gemessen. Tabelle 1 Stabilitätsdaten für Beispiel 1

* Erneuter Test der UV-Proben nach 9 Monaten: 6,89 × 10¹¹ Partikel/ml; A₃₂₀/A₂₆₀ = 0,28.

* Wegen Störungen im Assay nicht bestimmt.
* * Erneuter Test der UV-Proben nach 9 Monaten: 7,37 × 1010 Partikel/ml; A320/A260 = 0,24.

* Wegen Störungen im Assay nicht bestimmt.

BEISPIEL 5

Formulierung für Beispiel 5: A/C/N/53 (7,5 × 10¹¹ Partikel/ml), Trometamol (TRIS) (1,7 mg/ml), Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch (1,7 mg/ml), Saccharose (20 mg/ml), Magnesiumchloridhexahydrat (0,4 mg/ml), Glycerin (100 mg/ml), Natriumchlorid (5,8 mg/ml), Füllvolumen = 10 ml.

Tabelle 5 Stabilitätsdaten für Beispiel 5
In einigen Fällen wurden Schwebstoffe beobachtet, die sich während der Lagerung bei 4 °C in der Formulierung entwickeln. Analysen der Schwebstoffe durch SDS-PAGE legen nahe, daß diese Schwebstoffe aus kleineren Verunreinigungen (d.h. weiteren Proteinen und einigen unreifen Viruspartikeln) zusammengesetzt sind, und daß diese Schwebstoffe daher die Lebensfähigkeit der Formulierung nicht beeinflussen. Nichtsdestotrotz kann wahlweise ein Schritt der Mikrofiltration ausgeführt werden, um die Formulierung weiter zu klären (um mögliche Schwebstoffbildung zu verhindern), um alle möglichen potentiellen Schwebstoffe mit nur geringem Verlust an Viruspartikeln zu entfernen. (Wenn eine Mikrofiltration durchgeführt wird, sollte beachtet werden, daß eine ausreichende Oberfläche der Mikrofiltrationsmembran pro Filtrationsvolumen entscheidend ist, um eine Verlust an Viren zu vermeiden, wenn der Schwebstoff entfernt wird.)
Zusätzlich haben die Erfinder herausgefunden, daß Bewegung, wie beispielsweise Rühren, Schwebstoffbildung beschleunigen kann und daher ein weiterer optionaler Schritt in dem Klärverfahren ist. So zeigte sich, daß leichtes Rühren (zum Beispiel über Nacht bei 10 °C unter Verwendung eines magnetischen Rührfischs) gefolgt von Mikrofiltration die Schwebstoffe entfernt, so daß sich bei erneutem Rühren kein weiterer Schwebstoff bilden wird.
Es wurde auch gefunden, daß Zyklen des Einfrierens/Tauens Schwebstoffbildung während des erneuten Rührens fördern könnte. Daher können ein oder mehrere Zyklen des Einfrierens/Tauens gefolgt von Rühren, und dann Mikrofiltration zur Vermeidung einer Schwebstoffbildung während der Lagerung des Virusendproduktes bei Kühlschranktemperaturen (z.B. 4 °C) wahlweise ausgeführt werden.
Verfahren zum Konzentrieren und Aufreinigen von Virus-enthaltenden Zusammensetzungen:
Die vorliegende Anmeldung offenbart auch ein neues Verfahren des stabilen Konzentrierens einer bestehenden Viruszubereitung durch Anwenden von Tangentialflussfiltration (nachfolgend teilweise als "TFF" bezeichnet), die es einem ermöglicht, klinische Dosierungen in einem weiten Bereich gewünschter Konzentrationen einfach auszuwählen und herzustellen. Das neue Verfahren des Konzentrierens einer Viruszubereitung umfasst Schritte, bei denen man:

(a) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu einer Viruszubereitung bis zu einer Endkonzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs von ungefähr 20 % oder mehr zugibt; und
(b) die Viruszubereitung einem Filtrationsverfahren unterzieht, wobei die Konzentration des Virus durch Anlegen von Druck an die Zubereitung erhöht wird, so dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter entfernt wird, während das Virus zurückgehalten wird.

Die Verfahren sind für eine große Vielfalt von Viren zugänglich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Adenoviren, Pockenviren, Iridoviren, Herpesviren, Papovaviren, Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Retroviren, Adeno-assoziierte Vi ren, können aber auch klinische Isolate, attenuierte Impfstoffstämme usw. einschließen. Die Verfahren sind zum Konzentrieren rekombinanter Viren, die ein heterologes Transgen für die Verwendung in der Gentherapie tragen, besonders geeignet. Solche Viren sind gegenüber potentiell destabilisierenden Kräften, wie beispielsweise den zusätzlichen mechanischen Scherkräften, die Verfahren zum Konzentrieren von Viruspräparationen begleiten, besonders anfällig. Ein beispielhaftes rekombinantes Adenovirus, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konzentriert werden kann, ist A/C/N/53, das in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/11984 offenbart wird.
Das Filtrationsverfahren, das zum Konzentrieren des Virus verwendet wird, kann jedes Filtrationsverfahren (zum Beispiel Ultrafiltration) einschließen, bei der die Konzentration des Virus erhöht wird, indem ein Streckmittel gezwungen wird, durch einen Filter in einer Weise zu passieren, dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung entfernt wird, während das Virus nicht in der Lage ist, durch den Filter zu gelangen, und so, in konzentrierter Form, in der Viruszubereitung verbleibt. Die Ultrafiltration wird beispielsweise in Microfiltration and Ultrafiltration: Principles und Applications, L. Zeman und A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New York, 1996) beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Filtrationsverfahren ist die Tangentialflussfiltration ("TFF"), wie sie beispielsweise im MILLEPORE-Katalog beschrieben ist, der mit "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" betitelt ist, S. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). Bevorzugte TFF-Apparate umfassen entweder ein Pellicon II- oder Pellicon XL-Filtersystem der Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, Massachusetts (Internetadresse: www.millipore.com), wobei ein Pellicon XL-System besonders bevorzugt ist. Die Verfahren können bei Temperaturen in einem Bereich von ungefähr 2 °C bis 27 °C durchgeführt werden.
Andere Konzentrationsverfahren können angewendet werden, um Viruszubereitungen aufzukonzentrieren. Beispielsweise kann die Anwendung von Polyhydroxykohlenwasserstoff vorteilhaft genutzt werden, um eine Viruszubereitung durch Zentrifugation aufzukonzentrieren. Daher wird hier ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung beschrieben, das Schritte umfasst, bei denen man:

(a) eine Zusammensetzung zentrifugiert, die eine erste Schicht umfasst, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von 35 % bis 80 % (v/v) umfasst, wobei die erste Schicht mit einer zweiten Schicht überschichtet ist, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von 5 % bis 30 % (v/v) umfasst, wobei die zweite Schicht mit einer dritten Schicht überschichtet ist, die ein Virus umfasst, und
(b) das Virus aus der ersten Schicht gewinnt.

Als Beispiel kann eine Adenoviruszubereitung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bei 3200 g unter Verwendung von Ausschwingrotoren einer Beckman-Zentrifuge aufkonzentriert werden. Um dies zu erreichen, kann die Viruszubereitung in mehrere 5 ml-Röhrchen gegeben werden, wobei jedes Röhrchen 6,25 Vol.-% von 70 % Glycerin in einer ersten Schicht am Röhrchenboden enthält, überschichtet mit 2,5 Vol.-% von 20 ° Glycerin mit der Viruszubereitung, die obenauf geschichtet wird. Die Zubereitung wird dann bei 3200 g bei 4 °C für ungefähr 16 Stunden zentrifugiert, um das konzentrierte Virus in die Glycerinschichten zu sedimentieren, und die neu aufkonzentrierte Viruszubereitung wird dann nachfolgend aus der ersten Schicht gewonnen. Virus, das durch die oben beschriebenen Verfahren aufkonzentriert wurde, hat gute Lichtstreueigenschaften und brauchbare Infektivitätseigenschaften.
Im Hinblick auf das Polyhydroxykohlenwasserstoff, das in den beschriebenen Verfahren verwendet wird, steht ein "Polyhydroxykohlenwasserstoff" für eine verzweigte, lineare oder cyclische Verbindung, die mit 2 oder mehr (bevorzugt 2 bis 6, bevorzugter 2 bis 4) Hydroxygruppen substituiert ist, und eine wirksame Menge des Polyhydroxykohlenwasserstoffs ist eine Menge, die ausreicht, um das Virus gegen potentiell destabilisierende Kräfte, wie beispielsweise die mechanischen Scherkräfte, die während des Konzentrationsprozesses auftreten, zu stabilisieren. Bevorzugt liegt das Polyhydroxykohlenwasserstoff in den Virus-konzentrierenden Verfahren in einer Minimalkonzentration von 20 %, bevorzugter 25 % vor. Polyhydroxykohlenwasserstoffe sind bevorzugt Polyhydroxy-substituierte Alkylverbindungen (verzweigt oder unverzweigt), die bevorzugt 2 bis 7 Kohlenstoffatome aufweisen, und können Glycerin, Sorbitol und Polypropanol einschließen. Glycerin ist besonders bevorzugt.
Das neue Verfahren der Erfinder zum Erhöhen der Viruskonzentration hat den zusätzlichen Vorteil, daß es das Verarbeiten verbessert, beispielsweise durch beseitigen problemati scher Engstellen, indem ein wesentlich höherer Durchfluss während verschiedener Verarbeitungsschritte, wie beispielsweise der Größenausschlusschromatographie ermöglicht wird. Daher kann das Verfahren zum Konzentrieren von Viruszubereitungen auf Verfahren zum Auf reinigen von Viren angewendet werden, bei denen ein Größenausschlusschromatographieschritt (z.B. Gelfiltration) im Anschluss an Anionenaustauschchromatographie durchgeführt wird. In diesem Verfahren gibt es zusätzliche Gefahren für die Virusstabilität, die nicht nur von den mechanischen Scherkräften herrühren, die benötigt werden um das Virus vor dem Geschwindigkeits-beschränkenden Größenausschlußchromatographieschritt zu konzentrieren, sondern die auch aus der Tatsache herrühren, daß die aus dem Anionenaustauschchromatographieschritt eluierte Viruszubereitung üblicherweise hohe Gehalte von Salz und anderen Unreinheiten enthält, welche die Virusstabilität weiter verschlechtern. Daher ist ein weiteres Verfahren ein Verfahren zum Auf reinigen einer Viruszubereitung, dass die Schritte umfasst, bei denen man:

(a) die Viruszubereitung einer Anionenaustauschchromatographie unterzieht, wobei das Virus als ein Viruszubereitungsprodukt aus dem Anionenaustauschchromatographiemedium eluiert wird;
(b) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (a) zugibt, so daß die Konzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs in der Zubereitung eine Endkonzentration von ungefähr 25 % oder mehr erreicht, und
(c) die Konzentration des Virus in dem Viruszubereitungsprodukt von Schritt (b) durch Anlegen eines Drucks an die Zubereitung erhöht, so daß das Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter entfernt wird, während das Virus zurückgehalten wird, und
(d) das konzentrierte Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (c) einem oder mehreren zusätzlichen Verarbeitungsschritten unterzogen wird.

In dem oben in Verbindung mit Anionenaustauschchromatographie dargestellten Verfahren beträgt der Mindestgehalt an Glycerin 25 % (statt des Mindestgehalts von 20 % in allgemeinen Anwendungen der oben genannten Konzentrationsverfahren), da diese besondere Anwendung die zusätzliche Gefahr für die Stabilität berücksichtigen muss, die durch die hohen Salzkonzentrationen in dem Produkt, das aus der Anionenaustauschsäule eluiert wird, ausgehen. Die Zugabe von 25 % Glycerin (bevorzugt 30 %) führt zu einer Stabilität des Salz-enthaltenden DEAE-Pools für > 10 Tagen bei zum Beispiel 4 °C, wodurch nachfolgende Schritte der Viruskonzentrierung und/oder Gelfiltration an getrennten Tagen mit wesentlicher Flexibilität über einen Zeitraum von 10 Tagen durchgeführt werden können. Es wird anerkannt werden, dass die Verwendung von Polyhydroxykohlenwasserstoff in der höheren Konzentration von 25 % oder mehr auch in den oben genannten Verfahren verwendet werden kann, wenn die Viruszubereitung wegen anderer Verarbeitungsbedingungen einen hohen Salzgehalt aufweist.
V. BEISPIELE FÜR VERFAHREN
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verfahren, wie sie oben diskutiert werden.
Kurzer Überblick – Eine konzentrierte Charge geht von gefrorenen groben Virusmaterialien aus, die aus der Gewinnung aus der Fermentation herrühren. In einem Verfahren wird das Adenovirusprodukt zuerst durch Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt. Dann kann der Anionenaustausch-Pool vor dem Laden der Zubereitung auf eine Größenausschlusssäule durch Tangentialflußfiltration (TFF) in Gegenwart von 30 % (v/v) Glycerin konzentriert werden. Alternativ kann in einem anderen Verfahren der TFF-Konzentrationsschritt in der Gegenwart von 20 (v/v) oder mehr (bevorzugt 25 %) Glycerin nach der Größenausschlußchromatographie durchgeführt werden.
• Zubereitung von Startmaterialien durch Anionenaustauschchromatographie vor der TFF
In einem bevorzugten Verfahren wird ein Adenovirus-Anionenaustausch-Pool für das Aufkonzentrieren wie folgt zubereitet. Gefrorenes virales Material aus Fermentations- und Gewinnungsschritten wird aufgetaut und durch eine hydrophile Membran von 0,45 um gefiltert. Die Salzkonzentration des Filtrats wird durch Zugeben von 4 M Natriumchlorid eingestellt. Diese Beschickungslösung wird dann auf eine Fractogel EMD DEAE-650M-Säule gegeben, die mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 260 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose (Puffer A) prä-equilibriert wurde. Das Adenovirus bindet an das Anionenaustauschharz, wobei der Großteil des Medi ums und der Wirtszellverunreinigungen durch die Säule passieren und in dem verbrauchten Durchfluss enden. Die Säule wird anfänglich mit 4 Volumen von Puffer A gewaschen, gefolgt von einer zweiten isokratischen Waschung mit 8 Bettvolumen von 94 % Puffer A und 6 % Puffer B (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 600 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose), um zusätzliche Verunreinigungen zu entfernen. Das Virus wird mit einem linearen Gradienten aus 30 Bettvolumen von 6 % bis 100 % Puffer B aus der Säule eluiert. Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils, wie er mittels A₂₈₀ bestimmt wird, wird gesammelt. Dann wird Glycerin zu dem DEAE-Pool bis zu einer Endkonzentration von 30 % (v/v) für das weitere Bearbeiten zugegeben.
• Konzentrieren des DEAE-Pools unter Verwendung von Tangen tialflußfiltration
Der DEAE-Pool (der in Übereinstimmung mit der obigen Beschreibung hergestellt wurde) wird durch Verwenden einer TFF-Einheit von Millipore (Pellicon XL-System) mit Biomax-Membranen, die einen Molekulargewichts-Cut-off von 1 Million aufweisen, 10- bis 20-fach auf konzentriert. Das Verfahren wird entweder bei 2 bis 10 °C oder Raumtemperatur (25 °C) durchgeführt. Die folgenden Filtrationsparameter werden in diesem Verfahren verwendet: durchschnittlicher Einlaßdruck = 14 psi; durchschnittlicher Permeatdruck = 0 psi; durchschnittliche Flußrate = 13 l/h – m². Die Endkonzentration des Adenovirus erreicht ungefähr 1,0 – 2,0 × 10¹³ Partikel pro ml. Auf Grundlage der Resource Q-HPLC- und W-Absorptions (A₂₆₀)-Analysen ist die Rückgewinnung des Konzentrationsschritts > 80 % ohne signifikante Aggregation (Streulichtassay mittels A₃₂₀/A₂₆₀)
• Pufferwechsel durch Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration)
Die konzentrierte Adenoviruszubereitung wird auf eine Superdex-200-Größenausschlusssäule gegeben, die mit 20 mM Natriumphosphat pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose, 10 % Glycerin (Puffer C) oder 11 mM Natriumphosphat, 14 mM Tris, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose, 10 % Glycerin, pH 7,8 (Puffer D) prä-equilibriert wurde. Die Säule wird mit Equilibrierungspuffer eluiert. Der mittels A₂₈₀ bestimmte Adenoviruspeak des Elutionsprofils wird gesammelt und vereint. Die konzentrierte Adenoviruszubereitung wird durch eine hydrophile Durapore-Membran von 0,2 μm (Stericup, Millipore) bei 2 bis 10 °C filtriert und kann bei –80 °C oder höheren Temperaturen (wie beispielsweise 2 bis 10 °C) gelagert werden.
• Aufkonzentrierung des Superdex-200-Pools unter Verwendung von Tangentialflußfiltration
Wie oben diskutiert schließt ein bevorzugten Verfahren das Aufkonzentrieren des Virus nach Anionenaustauschchromatographie aber vor Gelfiltration ein. In einem anderen Verfahren können die offenbarten Verfahren des Aufkonzentrierens von Viruszubereitungen jedoch auch nach dem Gelfiltrationsschritt verwendet werden (sogar wenn kein Viruskonzentrierungsschritt zwischen dem Anionenaustauschschritt und dem Gelfiltrationsschritt angewendet wurde). In diesem Fall sind die Filtrationsparameter die gleichen wie die, die für die Konzentrierung eines DEAE-Pools verwendet werden, mit der Ausnahme, daß der Polyhydroxykohlenwasserstoff (z.B. Glycerin) dem Superdex-200-Pool in einer Endkonzentration zugegeben werden kann, die so niedrig ist wie 20 % (v/v), da es nicht länger notwendig ist, die hohen Salzkonzentrationen in dem DEAE-Pool zu bewältigen. In dieser Hinsicht sollte beachtet werden, daß in Fällen, bei denen die Zugabe des Polyhydroxykohlenwasserstoffs verschoben wurde bis nach der Gelfiltration, der DEAE-Pool sofort auf die Gelfiltrationssäule gegeben werden sollte (wegen der Empfindlichkeit des DEAE-Pools mit seiner hohen Salzkonzentration). Somit ist erkennbar, dass ein zusätzlicher Vorteil des Zugebens von Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem DEAE-Pool eine erhöhte Flexibilität hinsichtlich der Zeitintervalle und Lagerungsoptionen während der Zeiträume zwischen der Anionenaustauschchromatographie und dem nachfolgenden Verarbeiten ist.
Die Verfahren des Konzentrierens der Viruszubereitungen können in Verbindung mit einer Vielzahl von Aufreinigungsverfahren angewendet werden. Für zusätzliche Informationen zu Aufreinigungsverfahren kann Bezug genommen werden auf zum Beispiel Huyghe et al., Human Gene Therapy, Band 6, S. 1403-1416 (1995) und die US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/989,227, die hier durch Bezugnahme ausdrücklich aufgenommen werden.
VI. STABILITÄTSDATEN FÜR VERFAHREN DES KONZENTRIERENS VON VIRUSZUBEREITUNGEN UNTER VERWENDUNG VON TANGENTIAL-FLUßFILTRATION
Wie durch die experimentellen Daten unten gezeigt wird, verleihen die oben diskutierten Verfahren eine stark erhöhte Virusstabilität trotz der mechanischen Scherkräfte beim Kon zentrieren des Virus und trotz der rauen Bedingungen, wie beispielsweise der hohen Salzgehalte in einem DEAE-Pool. Daher gewährleisten die oben genannten Verfahren unter anderem (1) die schnelle Zubereitung von klinischen Dosierungen mit jeder gewünschten Konzentration (sogar wenn von Material mit einer niedrigeren Konzentration ausgegangen wird), (2) eine Verbesserung des Verarbeitens (zum Beispiel durch Ermöglichen eines signifikant höheren Durchsatzes während der Größenausschlusschromatographie) und (3) Stabilität des Salz-enthaltenden DEAE-Pools für > 10 Tage bei 2-10 °C (und ermöglichen dadurch, nachfolgende Schritte des Viruskonzentrierens und/oder Gelfiltrierens an getrennten Tagen mit wesentlicher Flexibilität über einen 10 Tage-Zeitraum durchzuführen).
A. Konzentrieren des Virus nach DEAE-Chromatograhie

In den folgenden drei Beispielen wurden stabile Konzentrationen von Adenoviren durch Konzentrieren von DEAE-Pools in 30 % Glycerin (in Übereinstimmung mit den oben genannten Verfahren) zubereitet. Die Zubereitungen wurden dann einer weiteren Aufreinigung durch Superdex-200-Gelfiltrationschromatographie unterzogen, um die Endformulierung zum Testen zu erhalten. Beispiel D-1

Endformulierung:	20 mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2%
	Saccharose, 10 % Glycerin, pH 8 bei
	2-10 °C.
Ergebnisse:	Partikel/FACS = 24
	Lichtstreuung (A₃₂₀/A₂₆₀) = 0, 22
	Konz. = 1,6 × 10¹³ Partikel/ml

Beispiel D-2

Endformulierung:	14 mM Tris-Base, 11 mM NaPi, 2 mM MgCl₂,
	2 % Saccharose, 10 % Glycerin, pH 7,8
	bei 2-10 °C.
Ergebnisse:	Partikel/FACS = 17
	Lichtstreuung (A₃₂₀/A₂₆₀) = 0, 25
	Konz. = 1,5 × 10¹³ Partikel/ml

Beispiel D-3

Endformulierung:	20 mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2%
	Saccharose, 10 % Glycerin, pH 8 bei
	2-10 °C.
Ergebnisse:	Partikel/FACS = 24
	Lichtstreuung (Aszo/Azso) = 0, 25
	Konz. = 1,3 × 10¹³ Partikel/ml

B. Konzentrieren des Virus im Anschluss an die Gelfiltration
Beispiel S-1

In dem folgenden Beispiel wurde die Viruszubereitung in 20 % Glycerin im Anschluss an die Gelfiltration konzentriert.

Endformulierung:	16 mM NaPi, 80 mM NaCl, 1,6 mM MgCl₂,
	1,6 % Saccharose, 20 % Glycerin, pH 8
	bei 2-10 °C.
Ergebnisse:	Partikel/FACS = 72
	Lichtstreuung (A₃₂₀/A₂₆₀) = 0, 26
	Konz. = 1,66 × 10¹³ Partikel/ml

Claims

Zusammensetzung zur Erhaltung der Stabilität von Adenoviren, umfassend Adenoviren in einer Formulierung, die 20 bis 200 mg/ml Glyzerin, Saccharose und ein Puffersystem umfaßt, daß den pH Wert im Bereich von etwa 7 bis etwa 8,5 erhält, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2°C bis 27°C, wobei das Puffersystem Natriumphosphat-Dihydrat, einbasisch, in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 mg/ml und Trometamol in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 mg/ml enthält.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, in der die Saccharose in einer Konzentration von 5 bis 25 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, die ferner einen divalenten Metallsalzstabilisator umfaßt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei der divalente Metallsalzstabilisator Magnesiumchlorid ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, bei dem das Magnesiumchlorid in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 1 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, die ferner ein Tensid umfaßt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, bei der das Tensid Polyoxyethylensorbitan ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, bei der das Polyoxyethylensorbitan Polysorbat 80 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, bei der das Polysorbat 80 in einer Konzentration von etwa 0,03 bis 0,3 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, die ferner ein Streckmittel umfaßt, das Wasser umfaßt.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, bei der das Adenovirus in einer Konzentration von etwa 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹³ Viruspartikel/ml vorliegt.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei der das Adenovirus ein rekombinantes Adenovirus ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, bei der das Adenovirus in der Zusammensetzung für mindestens zwei Wochen bei Kühlschranktemperaturen stabil ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, bei der die Kühlschranktemperatur im Bereich von etwa 2°C bis 8°C liegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, bei der die Kühlschranktemperatur etwa 4°C beträgt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, bei der das Adenovirus in der Zusammensetzung für mindestens eine Woche bei Raumtemperatur stabil ist.
Zusammensetzung des Anspruchs 16, bei der die Raumtemperatur etwa 25°C beträgt.