TWI232107B - Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations - Google Patents

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TWI232107B
TWI232107B TW088102219A TW88102219A TWI232107B TW I232107 B TWI232107 B TW I232107B TW 088102219 A TW088102219 A TW 088102219A TW 88102219 A TW88102219 A TW 88102219A TW I232107 B TWI232107 B TW I232107B
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Henry K H Kwan
Varda E Sandweiss
Gary J Vellekamp
Pui-Ho Yuen
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Description

1232107 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關包含病毒之組合物，尤指病毒載體，其具 有-員著改良之女疋性。本發明組合物適用於在健存期間保 持病毋女定性，且本發明含病毒組合物特別適用於醫療用 込如基因療法。亦提供濃縮及純化病毒製劑之新方法。 【先前技術】 / 病毒之醫療用途（如··疫苗及基因療法）愈來愈重要，因 此需要發展及製備容易儲存及運送且仍保留充份安定性及 效力之安定之含病毒組合物。特定言之，由於基因療法中 普遍使用病毒載體，因此必需發展及製備彼等帶有醫療性 轉入之外來基因時可安定保存活重組病毒之調配物。 此外，極需要可在_8〇。。以上長期安定病毒製劑之調配 物。含病毒組合物通常需保持在·。c，無法在標準冷藏溫 度（例如· 2 C至8°C，或更高）保存相當長時間。這種限制不 僅嚴=妨礙儲存性，亦妨礙加工、配送及廣泛之臨床用途。 亦扃要發展可在冷藏溫度下長期保持^^在約7至約8·5範 圍内’即使文到嚴苛的條件（如··冷柬/解束，尤指因大規模 生產/配送所遇到之緩慢冷束/解束速率時），仍可保持此 pH祀圍之含病毒組合物。ρΗ之維持對病毒製劑很重要，因 為低於7·0及高於8·5之ΡΗ會使得病毒粒子因生物及物理不 安定性而容易喪失活性。 ,尚有其他問題與提高病毒濃度有關。特定言之，高病毒 /辰度,>、’貝著〜響病毒不安定性。然而’醫療用途卻要求更提
56946-930923.DOC l232l〇7 回之病毋w辰度。因此’極需要發展可安定相當高病毒濃度 (尤其在上述嚴苛條件下）之調配物。此外並特別需要發展濃 縮現有之病毒製劑之新方法，使之在更高濃度下成為安定 衣d右5式圖濃縮現有之病毒製劑，則與更高病毒濃度相 關之不安疋性問題嚴重性更顯著。此點部份歸因於在試圖 向見有之病母製劑?辰度時所出現之額外之機械切變力。 右此卷現種不需要顯著損害病毒安定性而能濃縮病毒製 刈之方法’則很容易製備（甚至當以低濃度原料製備時）任何 所需濃度之臨床劑量，且重要的是，濃縮病毒之能力使得 各種加工步驟期間（如：粒子大小排除層析法）之物料通過量 顯著提冋’而可能 >肖除造成有問題之瓶頸，及其他放大規 板之問題。 因此品要達成上述目的之材料與方法。 【發明内容】 為了滿足上述需求，本發明提供—種包含病毒之安定組 合物’其係呈包含多經基烴之調配物，該多經基煙則於 約2»c至坑之溫度範圍内經緩衝至保持阳約7至約請之 範圍内。 亦提供濃縮現有之病毒製劍之新古、七 衣N之新方法，因此很容易在所 需之廣泛濃度範圍内選擇及製借昨戍节丨θ ^ 士 士 I備^床劑量。濃縮病毒製劑 之較佳方法包括： (a) 添加多羥基烴至病毒製劑φ 表…中’使多羥基烴最終濃度達 約20%或以上；及 (b) 使病毒製劑過濾，其中病卷曲 届母之，辰縮法為對該製劑施加
56946-930923.DOC 1232107 [力丄由濾态排除病毒製劑中之稀釋劑，同時保留 病毒。 本文亦提供一種濃縮病毒製劑之方法： ⑷離〜組合物’其包含第—層含濃度至嶋(，之多 羥基烴，及覆蓋右楚 I第—層上之第二層含濃度5。/〇至 °七~)之义經基煙，再以含病毒之第三層蓋在 層上；及 (b)自第一層回收病毒。 —=外纟發明發現其提高病毒濃度之新方法尚有促進進 二= 理之優點(例如:在加工步驟期間(如:粒子大小 料法），經由顯著提高物料通過量來減 =:程中有問題之瓶頸)。因此，較佳具體實施例中 接在離排除層析法）。因此當粒子大小排除層析法 本析法之後進行，且病毒製劑之濃縮法(根據 法之前進行時，样、在粒子大小排除層析 析法之广^ 月方法特別有用。得自陰離子交換層 其他雜質濃包含高濃度的鹽及可能有 在特別佳具體實施例：二：響病毒安定性。因此 方法，其包括. 么明提供一種純化病毒製劑之 ⑷：病毒製劑進行陰離子交 毒製劑產物自陴齙…A w毋係呈病 (b)添加多經基烴：”二、層析介質中溶離出； 至步驟（a)之病毒製劑產物中，使製劑中
56946-930923.DOC 1232107 多羥基烴濃度達約25%或更高之最終濃度；及 (c) 提高步驟（b)之病毒製劑產物之病毒濃度，其係對製劑 施加壓力，經由濾器排除病毒製劑中之稀釋劑，同時 保留病毒；及 (d) 由步驟（c)之濃縮之病毒製劑產物再進行一個或多個 加工步驟。 本發明亦提供經上述方法濃縮及/或純化之病毒製劑。 【實施方式】 如上已述，本申請案揭示新穎之含病毒組合物，及濃縮 與純化含病毒組合物之新方法。 在組合物方面，本發明者已發展一種可保存病毒製劑並 加強安疋性之新穎之緩衝之調g己物。特定言之，調配物可 在遠高於-8(TC之溫度安定病毒製劑。更重要的是，本發明 組合物在例如：2。(：至之典型冷藏溫度，或更高溫度^， 可長期保存，以保存數個月或更久較佳。這點極為有利， 因為如上已述，為了滿足臨床需要，病毒製劑於儲存及運 送期間保持在-80°C下冷凍之作法並不實際。 本發明組合物之一項重要特色為添加多羥基烴。如本文 所採用，多羥基烴係指經2個或更多個（以2至6個較佳，2至 4個更佳m基取代之直鏈、分支或環狀化合物。本發明所 T用之多羥基烴為經多羥基取代之烷基化合物（分支或未 刀支）較佳，以含2至7個碳原子較佳，且可包括例如··甘油、 山梨糖醇及聚丙醇。以甘油特別佳。如下文數據所示，本 發明者發現，即使在標準之冷藏條件下，甘油仍可長期保
56946-930923.DOC 1232107 持驚人的高度安定性。 本發明組合物中有效量之多羥基烴為該含量足以安定本 發明調配物中之病毒，不會對所使用病毒之效力有不良影 響，尤其當病毒含有基因療法所使用之轉入之外來基因 時。多羥基烴之較佳最終濃度為約2〇至2〇〇毫克/毫升^更 狹窄之範圍為80至120毫克/毫升。可採用一種以上之多_ 基烴，使本發明組合物中多羥基烴總量達到所需含量。 本發明組合物中多羥基烴可視需要包含醛基。特定古 之，多經基烴可為雙聽如：蔗糖。此外，即使組合物制 之多羥基烴不含醛基，組合物亦可另包含雙醣（如··蔗糖） 作為安定劑及張力調整劑。當本發明組合物已包含合適多 羥基烴（如··甘油）且於較佳具體實施例中使用雙醣作為 之安定劑或張力調整劑時，雙醣之較佳含量為5至乃毫克/ 毫升之範圍内，以2〇毫克/毫升更佳，該雙糖為薦糖較^圭。 醫藥上可接受之二價金屬鹽安定劑(如：鎮鹽、鋅鹽與妈 鹽）係用於本發明組合物之較佳具體實施例中。較佳者，談 鹽為氯化物鹽、鎂冑，以鎂鹽特別佳。較佳#，鹽(例如·· 鎂鹽）之含量為約心丨至丨毫克/毫升，以約0·4毫克/毫升更佳。 醫藥上可接受之單價金屬鹽安定劑如··#、鈉、鋰及鉋 鹽類可包含在本發明較佳具體實施例中作為視需要選用之 安定劑。較佳者，該鹽為氣化鈉，含量為06至100毫克/ 毫升’更佳含量為約5.8毫克/毫升。 氣化鈉除了可安定組合物夕卜，尚可廢抑醱酵副產物之出 現速率及含量，產生醫藥上更美觀之製劑，以免因蛋白質
56946-930923.DOC -10- 1232107 凝聚而降低抗原性效力。氯化納之添加並不會影響調配物 之pH。 本發明組合物可長期保持pH在約7至約85之範圍内甚 至當受到嚴苛條件如：冷藏及冷束/解;東時。此外，即使遇 到大規模生產、配送及操作過程中可能發生之相當緩慢冷 東/解;東4 ’組合物仍可保持安定及維持所需之pH範圍。如 上述，PH之維持對病毒製劑很重要，因為在低於7掀高於 8.5之PHT，活病毒粒子可能變得不安定並降解。病毒之特 殊組成使得病毒很難安定化及保存。 為了在嚴苛條件下維持？11，本發明最好包含緩衝劑系 P使纟80 c至27 c下儲存及即使受到冷束/解;東條件， 二，持PH在約7·0至約8·5之最適當範圍内。由於pH可隨 /皿度炎化’下文中將提及明確之溫度範圍更明確說明。例 如：在冷藏溫度下（例如：約沈至代），較佳师圍為約
77至、、勺8·3 ’以約7·9至約8·2更佳。於室溫下（例如：約2(TC 至7C M22C至25°C較佳），較佳PH範圍為約7.3至約8·2, 以約7·4至約7·9更佳。 也本發月之&佳緩衝㈣統包括_鹼價碟酸納二水合物， 辰又=〇·5至1〇毛克/宅升，及三甲醇胺基甲烧，濃度約υ ,,〇 耄升（一甲醇胺基甲燒亦已知為，，TRIS”或 %職a”，來自希格馬化學公司⑻胸α⑽似1 a》。然 ,、可使用其匕緩衝劑系統。例如：若與他緩衝劑之酸 ::二：’可使用二鹼價磷酸鈉二水合物。在一項特別佳 -員她例中，緩衝劑系統包括濃度為約17毫克/毫升之一
56946-930923.DOC 1232107 驗價碟酸鈉二水合物及濃度約17毫克/毫升之三甲醇胺基 甲烷，且有能力使調配物於25<t下之？11維持在約7.3至約 7·9之最適當範圍内。 本發明調配物另一項優點為有能力在上述嚴苛條件下 (如：冷藏溫度及冷凍/解凍過程）安定高濃度病毒。特定言 之，本發明調配物可在至高lxl〇n個粒子/毫升之病毒濃度 下維$持病毒安定性。本發明所採用之較高病毒濃度範圍^ 1x10至lxl〇i3個粒子/毫升，以至高1χ1〇12個粒子/毫升更 佳’例如：1χ1〇9(或 1χ1〇1〇)至 1χ1〇12 個。 本文所採用”稀釋劑”一詞可包括溶劑（例如：水，以無菌 水較佳）或溶劑之混合物及其他成份如··其他溶劑、其他安 定劑、其他緩衝劑、及/或其他不會負面影響調配物之安全 性、效力及安定性之物質。有關稀釋劑、安定劑、緩衝劑， 等等可參考例如：雷氏醫藥學，第15版，馬克出版公司， 賓州伊斯頓市（Remington，s Pharmaceutical Science，⑸匕
Ed·，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。 本發明組合物中可視需要包含界面活性劑，以陰離子性 清潔劑較佳如：聚氧乙烯脂肪酸酯（例如：聚氧乙烯山梨糖 醇酐，如··聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯6〇、 或聚山梨酸酯80，來自狄拉瓦州威明頓市ICI美商公司（Ici
Americas，Inc.，Wilmington Delaware)，或 Tween 20、Tween 40、Tween 60及Tween 80，來自蒙大拿州聖路易市，希才夂 馬公司（Sigma，St· Louis，Mo.))。較佳者，非離子性清潔劑 為聚氧乙烯脂肪酸酯，且聚氧乙烯脂肪酸酯為聚山梨酸酉旨 56946-930923.DOC -12- 1232107 8〇較佳，其可作為本發明組合物之安定劑。非離子性清潔 叙較佳濃度為0.03至0.3毫克/毫升之範圍内，以〇克/ 耄升更佳。 ”本發明組合物可進一步包含一種或多種”傳送加強劑”。 ”傳送加強劑”指任何可加強醫療性基因（如··μ瘤抑制基因） 傳送至癌症組織或器官之製劑。此等傳送加強劑實例包括 (但不限於)：清潔劑、醇類、甘醇類、界面活性劑、膽鹽、 肝素拮抗劑、環氧化酶抑制劑、高張性鹽溶液及乙酸鹽孤。 清潔劑（如本文所採用之名詞）可包括陰離子性、陽離子 性、雙性離子性及非離子性清潔劑。清潔劑實例包括（但不 限於）··牛石黃膽酸鹽、去氧膽酸鹽、牛續去氧膽酸鹽、綠蝶 基吡啶鏘鹽、氯苄烷銨、ZWITTERGENT@ 3_14清潔劑、 CHAPS(3-[3-氯醯胺丙基）二甲基銨醇]_^丙磺酸酯水合 物，艾力奇公司（Alddch))、大型CHAP、去氧大型CHAp、 TRITON®_X-1〇〇清潔劑、C12E8、辛基_心〇_吡喃葡糖甞、 pluronic^fss清潔劑、TWEEN® 20清潔劑、及TWEEN(g) 80清潔劑（CALBIOCHEM⑧生化公司（Biochemicals)。 傳送加強劑之用法詳細說明於丨997年7月8日同在申請中 之美國專利申請案U.S.S.N 08/889，335，及1997年7月17曰 申請之國際申請案公告案號WO97/25072，及1998年7月8曰 申請之美國專利申請案U.S.S.N 09/112,074，國際申請案 PCT/US 98/14241。此外’好蛋白酶抑制劑與病毒載體之組 合於提高轉導效力上之用法說明於美國專利申請案 U.S.S.N 09/172,685及 60/104,321，1998年 10月 15 日申請。 56946-930923.DOC -13- 1232107 有許多種病毒可用於本發明組合物，包括（但不限於）·· 腺病毒、痘病毒、虹病毒（iridovirus)、癌療病毒、乳頭狀 瘤多瘤空泡外病毒、副黏液病毒（paramyxovirus)、正黏液 病毒（orthomyxovirus)、反轉錄病毒、·腺結合病毒、疫苗病 毒、旋病毒（rotavirus)，等等（參見例如··安德森（Anderson)， Science (1992)，256 ·· 808-813);以腺病毒特別佳。病毒為 重組病毒較佳，但可包括臨床單離株、減毒疫苗菌株，等 等。因此，例如：本發明組合物可使用之重組腺病毒實例 為A/C/N/53，其說明於PCT專利申請案No. W095/11984。 本發明調配物特別適用於安定用於基因療法之重組病 毒，如：活的重組腺病毒（或"病毒載體’f)。例如：本發明使 用之病毒可包括腫瘤壓抑基因，如：野生型p53基因或Rb 基因（例如：pll0RB4p5 6RB)，及含轉入之外來基因（如：野 生型p53)嵌入病毒載體中，本發明組合物可用為治療癌症 之醫藥組合物。 在這方面，本發明調配物對維持病毒（尤指已嵌插編碼轉 入之外來基因（如：p53)之核芬酸序列之病毒載體）之生命力 具有顯著能力。這個特色使得病毒得以維持其感染目標細 胞之能力，因此方可適當產生由嵌入之轉入之外來基因編 碼之醫療性蛋白質。 明確說明p53及其用法時，發現p53基因之突變為人類癌 症最常見之基因變化（巴狄克（Bartek)(l 991)，Oncogene，6 : 1699-1703，郝斯坦（Hollstein)(l991)，Science，253 ·· 49,53)。 在缺少内因性野生型p53蛋白質之哺乳動物癌細胞中引進 56946-930923.DOC -14- 1232107 野生型p53可壓抑彼等細胞新增生表型（參見例如：美國專 利案第5,532,220號）。 下列實例中，病毒為含野生型p53基因之活重組腺病毒。 此等實例採用之特定病毒載體構築體在本文中稱為 ’’A/C/N/53”，A/C/N/53(亦稱為"ACN 53，’）為述於 1994年 10 月25曰申請之同在申請中之申請案USSN 08/328,673及 WO 95/11 984(1 995年5月4日），其係以提及之方式併入本文 〇 本發明較佳具體實施例之含聚山梨酸酯80之代表性配方 如下： 代表性配方 活性物質 緩衝劑 安定劑/等張性劑 安定劑 A/C/N/53 一鹼價磷酸鈉 三甲醇胺基甲烷 蔗糖 lxlO9至lxl〇13個粒子/毫升 0.5至10毫克/毫升 0.5至10毫克/毫升 5至25毫克/毫升 溶劑 ^由 20至200毫克/毫升 氣化鎂 〇·ΐ至1毫克/毫升 聚山梨酸酯80 0.03至0.3毫克/毫升 /主射用水，適量加至1毫升
(該組合物主要呈10毫升劑量保存。上述配方中”適量加 至”係指添加足量溶劑至總體積1毫升）。 四種特別佳具體實施例示於下文。（聚山梨酸醋8〇出現在 貝例1與2，但不出現在實例3與4中）。
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A/C/N/53 一驗價磷酸納二水合物 三甲醇胺基甲烷 氯化鎮六水合物 蔗糖 聚山梨酸酯80 甘油 注射用水，適量加至 pH 實姐 實例2 7.5X1011個粒子/毫升7·5χΐ〇1()個粒子/毫升 1.7毫克/亳升 1.7毫克/毫升 0.4毫克/毫升 20毫克/毫升 0·15毫克/毫升 100毫克/毫升 1毫升 7.4 至 7.8 1.7毫克/毫升 1.7毫克/毫升 0.4毫克/毫升 20毫克/毫升 0.15毫克/毫升 100毫克/毫升 1毫升 7.4 至 7.8 A/C/N/53 一驗價構酸鈉二水合物 三甲醇胺基甲烷 氯化鎂六水合物 蔗糖 實-Ml 實例4 7·5χ10η個粒子/毫升7·5χ101()個粒子/毫升 甘油 注射用水，適量加至 1.7毫克/毫升 1_7毫克/毫升 0.4毫克/毫升 20毫克/毫升 100毫克/毫升 1毫升 1.7宅克/晕升 1·7宅克/¾升 0.4毫克/毫升 20毫克/毫升 100笔克/宅升 1毫升
pH 7.45.7.9 7.3 至 7·8 下列成份··一驗價填酸鈉二水合物、三甲醇胺基曱烧、 氣化鎮六水合物、庶糖、及甘油可得自例如：ΕΜ工羋（ΕΜ Industries, INC, 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532)。聚山梨酸酉旨80來自例如：ICI美商公司（id Americas，Inc·，Wilmington Delaware，19897) 〇 本發明組合物可於病毒經凝膠過濾層析管柱純化期間製 備，其係由所需濃度之成份（聚山梨酸酯80除外）於凝膠過濾、 56946-930923.DOC -16 - 1232107 官柱中組合。（有關凝膠過濾法可參見例如：下文第v節）。 因此’若需要稀釋病毒濃度，或添加聚山梨酸酯-80時，則 可利用標準技術製備稀釋液，其實例如下·· 於含於附裝攪拌器的不銹鋼容器中且佔指定體積75〇/〇之 室溫之注射用水中添加及溶解一鹼價磷酸鈉二水合物、三 甲醇胺基曱烷、蔗糖、氯化鎂六水合物及甘油。以注射用 水加至所得稀釋液中達最終體積。檢查pH，計算所需之含 A/C/N/53(含野生型p53作為轉入之外來基因之腺病毒）藥物 之懸汁液體積及製成A/C/N/53注射劑時所需稀釋液體積。 若最終A/C/N/53注射劑含有聚山梨酸酯8〇時，則製備在稀 釋液中含有過量10%聚山梨酸酯8〇之母液。添加含計算量 A/C/N/53藥物之懸浮液，稀釋至不銹鋼容器中，並混合。 添加所有稀釋液之則，先添加聚山梨酸酯⑼溶液，若需要 夺佔A/C/N/53/主射液指定總體積之1〇%。懸浮液經無菌遽 紙（〇·22微米或同等物）過滤除g。過渡後測試滤紙之完整 性。收集及填充無㈣浮液至適當體積之小瓶中。加蓋並 密封小瓶。 實例1、2、3及4之安定性數據分別示於下表卜2、3與4 下表中h用抗增殖分析法作為測定產物壓抑癌症細 月b力之生物刀析法’且一般根據威爾斯（鹽⑷等人，密
Human Gene Therapy, 5· 107Q ιπ〇〇^ py，）.W79-l〇88採用之方法。所列出之 字代表活性，而對照組無活性。 菌 π溶|g斑分析法”測定培養物 斑數以稀釋度為函數計數 之病毒粒子，其係由病毒溶 ，且一般根據下列文獻之方
56946-930923.DOC -17- 1232107 法·· F.L.葛拉罕（Graham)及L.普維克（Prevec)述於”分子生物 學方法"（Methods in Molecular Biology)，Vol. 7 :基因轉移 及表現方法（Gene Transfer and Expression Protocols)，E. J. 慕瑞（Murray)編輯（胡馬納出版公司（Humana Press Inc·， Clifton NJ)，pp 109-128 (1991);亦參見 F. L·葛拉罕 (Graham)、J·史邁利（Smiley)，W.C.魯賽（Russel)、與 R.J.納 恩（Nairn)，J· Gen Virol. Vol· 36, pp59-74 (1977)。 ’’FACS”分析法顯示病毒感染細胞之能力，且此等測定法 係一般根據述於例如：國際專利申請案PCT/US 97/11865 (1998年1月5日公開之WO98/01582)中之方法。其右邊下一 列，’’濃度’’標題下出現之數字代表病毒粒子總數之濃度。 最後，”粒子/FACS比例”標題下之數字代表病毒粒子總數對 有感染力病毒粒子數目之比例，因此代表病毒製劑之相對 效力。 ’’UV”標題下之數據表示病毒粒子之凝聚性，由a32Q/a26() 波長之UV吸光度比例作為光散射之指標。基本上，320 nm 波長之吸光度測定光散射量，而260 nm波長之吸光度則與 DNA量呈相關性。 其中第二列"條件π下所示之溫度代表儲存溫度。生理分 析法係於37°C下進行，最後一列之pH係於室溫下（約25t) 測定。 56946-930923.DOC -18- 1232107 表1 安〜 實例1之安定性數據 二，，件抗增殖溶菌斑FACS 濃度毯土 UV pH $間。。分析法分析法χίο10 χΙΟ11粒A32〇/A260 xl〇5SPUxl08PFUU/毫升子/毫升比例 /毫升 /毫升 21 0.23 7.53 36 0.24 7.53 23 0.23 7.49 20 0.23 7.63 23 0.24 7.61 35 0.24 7.72 52 0.26 7.60 28 0.28 7.58 21 0.28 7.58 麵 0.29 nt 76 0.30 7.62 開始 3.3 1週 25 4.9 2週 4 3.1 5.8 3.86 7.95 10 2.27 8.06 6.6 3.41 7.84 17 3.91 7.79 8.8 3.38 7.80 36 2.24 7.80 未測試 1.57 8.21 7.6 2.74 7.68 4週 4 3.4 8週 4 5.8 12週 4 3.9 5個月 4 未測試 6個月 4 3.0 9個月 4 3.1 11個月 4 未測試 12個月 4 2.6 Α32〇/Α260=〇·28
19 3.47 7.19* 未測試 nt 6.71 10 0.81 6.13 9個月時之UV樣本重新測定：6.89 X 10"個粒子/毫升； 表2 實例2之安定性數據 巧性巧件抗增殖溶菌斑FACS濃度毯土 υγ pH 日可間 °C 分析法分析法xl〇9 χίο10粒A32〇/A260 a4〇t^tt ___ττζ 古 VI ... xl04SPUxl〇7PFUU/毫升 /毫升 /毫升 子/毫升 比例 開始 3.3 4.8 1.99 10.0 50 0.24 7.36 1週 25 2.4 7.1 1.64 nd* … 0.46 7.42 2週 4 2.4 6.9 2.13 9.79 46 0.24 7.51 4週 4 3.2 8.4 2.50 9.24 37 0.22 7.55
56946-930923.DOC -19- 1232107 8週 4 6.9 12週 4 5.5 5個月 4 未測試 6個月 4 3.3 9個月 4 2.3 11個月 4 未測試 ⑽ 8.6 2.60 8.10 8.3 1.09 8.60 未測試 1.74 8.03 7.3 2.10 8.25 13 1.97 7.59 未測試 nt 7.48 31 0.25 7.54 79 0.24 7.64 46 0.27 7.55 39 0.23 7.52 39 0.24** 7.53 - 0.23 nt 12個月 4 1.8 9.4 0.60 由於分析法受干擾而未測定 個月時之UV樣本重新測定 Α32〇/Α260=〇·24 4·94 82 0.26 7.59 • 7·37 χ l〇i〇個粒子/毫升； 表3 實例3之安定性數據 文^性條件抗增殖分溶菌斑FACS濃度粒子 uv pH 日守間°C 析法分析法Χίο10 Χίο11粒A320/A260 xl05SPU x108PFUU/毫升子/毫升比例 /毫升 /毫升 開始 3.2 6.3 1週 25 4.4 4.3 2週 4 2.3 8.0 4週 4 2.7 7.6 8週 4 5.9 8.7 12週 4 3.0 15 6個月 4 2.4 6.4 9個月 4 •2.8 9.4 11個月 4 未測試 ㈣ Nt 12個月 4 2.2 9.8 2.59 7.45 29 0.24 7.67 1.65 7.49 45 0.24 7.68 3.62 7.27 20 0.24 7.49 4.08 6.97 17 0.24 7.75 2.69 7.00 26 0.25 7.82 0.70 7.10 101 0.25 7.80 2.45 7.12 29 0.25 7.76 2.51 7.06 28 0.26 7.81 nt 6.71 - 0.25 nt 0.74 6.75 91 0.26 7.81 56946-930923.DOC -20- 1232107 表4 實例4之安定性數據 安定性 條件抗增殖分 溶菌斑 FACS 濃度 粒子 UV pH 時間 C 析法 分析法 xlO9 xlO10 粒 FACS A320/A260 xl04SPU xl07PFUU/毫升 子/毫 比例 /毫升 /毫升 升 開始 3.3 4.7 2.36 8.91 38 0.23 7.37 1週 25 2.3 9.3 1.40 8.25 59 0.24 7.37 2週 4 2.8 8.0 2.16 8.80 41 nd* 7.37 4週 4 2.9 6.6 2.54 9.35 37 0.20 7.63 8週 4 6.9 7.2 2.56 7.60 30 0.24 7.60 12週 4 4.4 8.6 1.45 7.20 50 0.23 7.73 6個月 4 3.6 7.1 2.85 7.92 28 0.21 7.58 9個月 4 2.9 11 1.87 7.26 39 0.20 7.60 11個月 4 未測試 nt nt 6.93 - 0.22 nt ㈣ 12個月 4 2.4 22 0.70 7.15 102 0.23 7.61 *因分析法受到干擾而未測定 實例5 實例5之調配物：A/C/N/53(7.5 X 1011個粒子/毫升）、三甲 醇胺基曱烷（TRIS)(1.7毫克/毫升）、一鹼價磷酸鈉二水合物 (1.7毫克/毫升）、蔗糠（20毫克/毫升）、氣化鎂六水合物（〇4 毫克/毫升）、甘油（100毫克/毫升）、氯化鈉（5.8毫克/毫升）、 填充體積=10毫升。 56946-930923.DOC -21 - 1232107 表5 4 4 抗增殖分 析法 xl05SPU /毫升 FACS xlO10 U/毫升 濃度 xlO11 粒 子/毫升 粒子 FACS 比例 UV A320/A260 pH 4.5 1.87 7.81 42 0.23 7.80 8.0 1.67 7.83 47 0.23 7.80 13.0 1.58 7.84 50 0.23 7.70 時間 開始 1個月 4個月 有枯候，凋配物於4°c下儲存時，會觀察到有微粒形成c 利用SDS PAGE法分析微粒時發現，微粒係由微量雜質（亦 I7 他蛋白質及一些未成熟病毒粒子）組成，因此此等微粒 不曰衫響凋配物之活性。儘管如此，在較佳具體實施例中， 可進一步澄清調配物（以防止可能之微粒形成），視需要進行 微過濾步驟，以排除任何可能出現之微粒及極少量流失之 病毒粒子（當進行微過濾法時，應注意每單位過濾體積應有 足量之微過濾膜表面積，以避免在排除微粒時流失病毒” 此外，本發明在較佳具體實施例t發現，攪動法（如··攪 拌）可加速微粒形成，因此可視需要成為澄清過程中另一個 步驟。因此溫和攪拌（例如··採用磁鐵攪拌棒攪拌一夜，1 ) 後微過濾可排除微粒，當再攪拌時不再有更多微粒形成。 亦發現冷凍/解凍之循環促使再攪拌期間形成微粒。因 此，另一個較佳方法中，可視需要進行一次或多次冷凍/解 凍循環，然後攪拌，再微過濾，以防止病毒終產物在冷藏 溫度（例如·· 4°C)下儲存時形成微粒。 含病毒組合物之濃縮與純化方法··
56946-930923.DOC -22- 1232107 本中5青案亦揭示 ▼ · 種女疋地遭縮現有l炳哥果削 < 新方 /、係採用切線流動過濾法（下文有時稱為"TFF")，彳艮容 易在所而之寬廣濃度範圍内選擇及製備臨床劑量。 》辰縮病毒製劑之新方法包括： ⑷添加多經基煙至病毒製劑中m多經基煙漢度約 20%或以上；及 (b)由病毒製劑進行過遽，其中對製劑施加壓力，病毒製 劑經由據器排除稀釋劑同時保留病毒，而提高 濃度。 =月方法適合許多種病毒’包括（但不限於）：腺病毒、 二病毋虹病毒、癌療病毒、乳頭狀瘤多瘤空泡化病毒、 病毒、正黏液病毒、反轉錄病毒、腺結合病毒、疫 :=、旋病#，等等；以腺病毒特別佳。病毒為重組病 發明拉[可包括㉔床單離株、減毒疫苗菌株，等等。本 別適用於漢縮帶有用於基因療法之異質性轉入之外 缺代 w種病毋尤其對潛在之去安定化力量 =用如病毒製劑濃縮法而來之外加之切變機械力。 纟明方法濃縮之重組腺病毒實例為a/c聰3，盆 亦揭示於PCT專利申請案N〇 w〇95峨4。 - 根據本發明方法用於濃縮病毒之過濾法可包括任何 2釋液通過滤器’排除病毒製劑中之稀釋液，來提高病 ::度之過濾法(例如··超濾法)其中病毒無 浪縮型保留在病毒製劑中 ^而呈 過遽法與m ^自 已柏㈣於例如·· ”微 m相與料，L.奇㈣
56946-930923.DOC -23- 1232107 赛狄克公司），1996，（Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekkar，Inc.，New York，NY，1996)。一種特別佳之 過濾法為切線流動過濾法（’’TFF”），如述於例如：標題為” 醫藥操作過濾法目錄"（Pharmaceutical Process Filtration Catalogue), ρρ· 177-202(麻省貝佛市（Bedford， Massachusetts), 1995/96)之米里坡公司（MILLIPORE)目 錄。較佳TFF設備包括來自米里坡公司（Millipore Corporation，80，Ashby Rd·, Bedford Massachusetts，網址 WWW. millipore. com)之 Pellicon II 或 Pellicon XL 過濾系 統，以Pellicon XL系統特別佳。較佳具體實施例中，本發 明方法係於約2°C至27°C之溫度範圍内進行。 可採用其他濃縮法來濃縮根據本發明之病毒製劑。例 如··宜使用多羥基烴，利用離心法濃縮病毒製劑，因此， 本發明亦提供一種濃縮病毒製劑之方法，其包括： (a) 離心組合物，其包含第一層含濃度35%至80%(v/v)之 多羥基烴，第一層上面覆蓋第二層含濃度5%至 30%(v/v)之多羥基烴，再以含病毒之第三層覆蓋第二 層；及 (b) 自第一層回收病毒。 例如：可採用貝克曼（Beckman)離心機之懸吊轉筒，於 3200 g進行低速離心法濃縮腺病毒製劑，病毒製劑可置入 多個5毫升管子中，每支管子底部含有佔6.25%體積之第一 層70%甘油，其上覆蓋佔2.5%體積之20%甘油，最上層為病 56946-930923.DOC •24- !2321〇7 毒製劑。製劑再於4°C，3200 g下離心16小時，使濃縮之病 毒集中在甘油層中，然後自第一層回收新濃縮之病毒製 劑。依上述方法濃縮之病毒具有良好之光散射特性且具有 合適之感染性質。 冬發明方法使用之多 ------丨 丞烴π指經2個或 個（以2至6個較佳，2至4個更佳）窥基取代之分支、直鍵旬 :化合物，且有效量多經基烴為其用量足以安定病她 ::在之去女疋性力量’如：在濃縮過程中之機械切變力‘ 二佳者，本發明病毒濃縮法中多羥基烴之最低濃度i 。’以25%更佳。本發明使用之多羥基烴 :貌基化合物(分支或未分支)較佳，以含⑴個碳二 太：了包合甘油、山梨糖醇及聚丙醇，以甘油特別佳。 點，ΓΓ者提高病毒濃度之新方法另有促進加工處理之優 析法），㈣n不同加卫步驟_如：粒子大小排除層 較佳具體實施例中，㈣太π除有問她瓦頸。因此在 用至純化病毒二：本發明漠縮病毒製劑之方法可應 著進行粒子大丨 Μ在陰離子交換層析法之後接 施例中，威脅==析法（例如：凝膠過_。此具體實 率之粒子大小：：：=之因素不僅來自病毒進行限制速 切變力m 前必需濃縮時所遭遇到之機械 製劑典型含有經陰離子交換層析步驟溶離出之病毒 定性。因a，在^鹽類及其他雜f會進—步破壞病毒安 化病毒製劑之方去別佳具體實施例中’本發明提供-種純 含’其包括：
56946-930923.DOC -25- 1232107 ⑷由病毒製劑進行陰離子交換層析法，其中病毒呈病毒 製劑產物自陰離子交換層析介質中溶離出； (b)添加多羥基烴至步驟&)病毒製劑產物中，使製劑中多 羥基烴》辰度達約25%或更高之最終濃度；及 ⑷提高步驟(b)病毒製劑產物中病毒濃度，其係對製劑施 加壓力，使病毒製劑經由濾器排除稀釋劑，同時保留 病毒；及 (d)使步驟（c)濃縮之病毒製劑產物繼續進行一項或多項 其他步驟。 上文述及有關陰離子交換層析法之較佳具體實施例中， 甘油之最低含量為25%(而非本發明濃縮方法一般應用之最 少20%)，因為這種特殊用途必須考慮陰料交換管柱所溶 離出產物中高鹽濃度對安定性之威脅。添加25%甘油（以 30%較佳）使含鹽之DEAE收集液於例如代下之安枝超過 10天；因此接續的病毒濃縮及/或凝膠㈣步料在此⑽ 期間擇一天彈性進行…解，當病毒製劑因其他加工條 二而包含高鹽量時，本發明方法亦可採用25%或以上之較 高濃度之多羥基烴。 下列實例說明本發明之較佳具體實施例；本發明之範圍 不受其限制。 自醱酵回收物取得冷;東之粗病毒材料作為濃 ㈣勿之原料。在一項具體實施例中，腺病毒產物先經陰離 子交換層析法純化。然後陰離子交換收集液在製劑加至粒 子大小排除管柱上之前，可先於鄕㈣甘油存在下，利
56946-930923.DOC -26 - 1232107 用切線流動過濾法（TFF)濃縮。或者，在另一項具體實施例 中，TFF濃縮步驟可繼粒子大小排除層析法之後，於 20%(Wv)或更多（以25%較佳）甘油之存在下進行。 •於TFF之前，利用陰離子交換層析法製備起始物 在較佳具體實施例中，依下列方法製備腺病毒陰離子交 換收集液供濃縮用。取來自醱酵及回收步驟之冷凍病毒材 料解凍，並經0.45微米親水性膜過濾。添加4M氣化鈉調整 濾液之鹽濃度。然後添加此進料溶液至已先經50 mM磷酸 鈉pH 7_5，260 mM氣化鈉，2 mM氯化鎂，2%(w/v)蔗糖（緩 衝液A)平衡之Fractogel EMD DEAE-650M管柱上。腺病毒 與陰離子交換樹脂結合，大多數介質及宿主細胞雜質則通 過管柱終點進入廢料中。管柱先以4倍體積緩衝液A洗滌， 然後以8倍床體積94%緩衝液A與6%緩衝液B(50 mM磷酸鈉 pH 7_5，600 mM氣化鈉，2 mM氣化鎂，2%(w/v)蔗糖）之第 二份等濃度洗液排除其他雜質。以30倍床體積6%至100%線 性梯度之緩衝液B，自管柱中溶離出病毒。收集由A280測得 溶離圖形之腺病毒高峰。然後添加甘油至DEAE收集液中， 使最終濃度達30%(v/v)供進一步加工用。 •採用切線流動過濾法濃縮DEAE收集液 取DEAE收集液（根據上述說明製備），使用米里坡TFF單 元（Pellicon XL系統，使用分子量阻斷值為一百萬之Biomax 膜）濃縮10至20倍。該方法係於2至10°C或室溫（25°C )下進 行。此方法採用下列過濾參數··平均入口壓力：14 psi ;平 均滲透壓力=0 psi ;平均通過率=13升/小時-平方米。腺 56946-930923.DOC -27- 1232107 病毒經濃度達約1.0-2.0 χ l〇13個粒子/毫升。根據 Resource Q_HPLC及UV吸光度（A26g)分析法，濃縮步驟 之回收率>8〇%，沒有顯著凝聚現象（由A32〇/A26g測定光 散射分析）。 #魏子大小排除層析法（凝膠過濾法）淮行縫衡_吞 取濃縮之腺病毒製劑加至已先經2〇 mM磷酸鈉pH 8.〇， 100mM氯化鈉，2mM氯化鎂，2%(w/v)蔗糖，1〇%甘油（緩 衝液 C)或 11 mM磷酸鈉，14 mM Tris，2 mM氣化鎂，2%(w/v) · 蔗糖，10%甘油，ρΗ 7·8(緩衝液D)平衡之Superdex_2〇〇粒子 大小排除管柱上。以平衡緩衝液溶離管柱。收集由測 得溶離圖形之腺病毒高峰。濃縮之腺病毒製劑於2至1〇艺 下，經0.2微米親水性Durap〇re膜（米里坡公司（staicup，
Mdhpore)過濾，且可保存在―⑼它下，或更高溫度下（如2 至 10〇C )。 使用切綿流動過渡法灌縮SUperdex_2〇〇收隼_ 如上文所討論，本發明較佳具體實施例在陰離子交換層 * 析法之後，但在凝膠過濾法之前濃縮病毒。然而，在另二 項具體實施例中，所揭示之濃縮病毒製劑之方法亦可在凝 膠過濾步狀後制（即使在陰離子交換步驟及凝膠㈣ 步驟之間未採用病毒濃縮步驟）。此時，㈣參數*濃冑 . DEAE收集液時之參數相同，但多减烴（例如··甘油）則改 加至Superdex-200收集液中，終濃度低達2〇%(v/v)，因為不 再受到DEAE收集液中之高鹽濃度影響。此方面應注意，若
56946-930923.DOC -28 · 1232107 其中延緩添加多經基烴亩至丨丨爲 、、 丨减膝過濾法之後時，DEAE收集 液應立即加至凝膠過滹營扣 、、曲 愿&往中（因為DEAE收集液含有高鹽 >辰度而易受破壞）。因此可旨， 、 先 添加多羥基烴至DEAE收集 液中（根據本發明）之另一項体 ^ 貝k點為在陰離子交換層析法與 接續加工法之間的時間内 ^ 了 N門曰加蛉間間隔及儲存選擇性之彈 性。 濃縮病毒製劑之方法可與多種純化法組合使用。有關純 化法之其他資料可參見例如：修格(Huyghe)等人之"人類基 因療法’丨（Human Gene Therapy)，第 6卷，pp 测⑷ 6 (19叫 及美國專财ff㈣⑽/989,227，其係以提及之方式併入 本文中。
广列實驗數據所示，本發明方法可以大幅加強病毒安 疋性’儘官m縮病毒時之機械切變力及儘管受到嚴苛 條件（如：DEAE收集液中之高鹽含量）亦然。因此，本發明 方法可以特別（1)容易製備任何所需濃度之臨床劑量（甚至 (2)^ ： 提同粒子大小排除層析法過程中之物料通過量），及（3)使含 鹽之DEAE收集液於山代下之安定性超過1()天（因此使 得接續之病毒濃縮與/或凝膠過濾步驟可以在此ι〇天内相 當有彈性地另擇一天進行）。 A.繼DEAE層析法後濃縮病毒 下列一項貫例中，由DEAE收集液於3〇%甘油中濃縮（根據
56946-930923.DOC -29- 1232107 本發明），製備安定之腺病毒濃縮物，製劑再經Superdex_200 凝膠過濾層析法純化，得到試驗用之最終調配物。 實例Μ
最終調配物：20 mM NaPi， 100 mM NaCl，2 mM
MgCl2，2%蔗糖，i〇%甘油，2至l〇°c時之pH 8 結果：粒子/FACS=24 光散射性（A32〇/A260) = 〇.22 濃度=1.6 x 1013個粒子/毫升 實例D-2 最終調配物：14 mM Tris 驗，11 mM NaPi，2 mM MgCl2，2°/。蔗糖，10%甘油，2至 l〇°C 時之pH 7.8 結果：粒子/FACS=17 光散射性（A32〇/A26〇) = 〇.25 濃度= 1·5 X 1013個粒子/毫升 實例D-3
最終調配物：20 mM NaPi， 100 mM NaCl，2 mM
MgCl2，2%蔗糖，10%甘油，2至l〇°C時之PH 8 結果：粒子/FACS=24
光散射性（Α32〇/Α26())=〇·25 濃度=1·3 χ 1013個粒子/毫升 b.i凝膠過瀘法德濃縮症A 樣本S _ 1 下列實例中，繼凝膠過濾法之後，由病毒製劑於20%甘 油中濃縮。 56946-930923.DOC -30 - 1232107
最終調配物：16 mM NaPi， 80 mM NaCl ? 1.6 mM
MgCl2，1.6%蔗糖，20%甘油，2至 l〇°C 時之pH 8 結果：粒子/FACS=72 光散射性（八32〇/八26〇) = 〇.26 濃度=1 ·66 x 1013個粒子/毫升 本文所摘錄之所有文獻、專利案及專利申請案均完全依 相同程度’以提及之方式併入本文中，如同各文獻、專利 案或專利申請案已明確且個別指明併入參考文獻。 相關技藝專家咸了解本發明之修飾與變化。本文說明之 明確之具體實施例僅供舉例說明，並未限制本發明。 56946-930923.DOC -31 -

Claims (1)

  1. i23m 8102219號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年12月）十、申請專利範圍： 曰修】£丨
    一種在pH自約7至約8·5、溫度自約2〇c至約27°c範圍内濃 縮重組腺病毒製劑之方法，其包括： (a)添加多羥基烴至病毒製劑中，使多羥基烴之最終濃度 達20%或更高；及 (b)使病毒製劑進行一過濾方法，其中係對該製劑施加壓 力以使稀釋剑經由渡裔自病毒製劑中排除，然保留病 毒，而提高病毒濃度， 其中該多羥基烴係具2至7個碳原子之分支或未分支之 經多羥基取代之烷基。 2.根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該多羥基烴係甘油。 3·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中過濾法包括超 渡0 4·根據申請專利範圍第i或2項之方法，其中過濾、法包括切線 流動過濾。 V 5·根據申請專利範圍第丨或2項之方法，其中病毒為重組病 毒。 / 6·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中病毒為帶有用於 基因療法之醫療性轉入之外來基因。 7·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中病毒為腺病毒。 8’根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中步驟a)之疒主制 劑進一步包含雙·。 ’ 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該雙醣係蔗糖。 10·種在自約2°C至約27°C範圍内之溫度下純化病毒萝，之 56946-93l210.DOC 1232107 方法，其包括 (a) 使病毒製劑進行陰離子交換層析法，其中病毒係呈〉 毒製劑產物自陰離子交換層析介質中溶離出； 丙 (b) 添加多羥基烴至步驟（a)之病毒製劑產物中，使製劑中 多羥基烴濃度達25%或更高之濃度； ⑷提高步驟⑻之病毒製劑產物之病毒濃度，其係對製劑 施加壓力，以使稀釋劑經由濾器自病毒製劑中排除，然= 留病毒，及 (d)由步驟（c)之濃縮之病毒製劑產物再進行一個或多個 加工步驟； 其中該多羥基烴係具2至7個碳原子之分支或未分支之 經多羥基取代之烷基。 11·根據申請專利範圍第10項之方法，其中該多羥基烴係甘 油。 12·根據申請專利範圍第丨〇或η項之方法，其中另外進行之加 工步驟包括粒子大小排除層析法。 13 ·根據申請專利範圍第丨〇或丨丨項之方法，其中步驟（C)之方 法包括切線流動過濾。 14·根據申睛專利範圍第13項之方法，其中步驟（c)之方法係 使用包括Pellicon XL過濾系統之設備。 15·根據申請專利範圍第1〇或丨丨項之方法，其中病毒為重組病 毒。 16·根據申請專利範圍第1〇或11項之方法，其中病毒為帶有用 於基因療法之醫療性轉入之外來基因。 56946-931210.DOC 1232107 17·根據中請專利範圍第1G或叫之方法，其中病毒為腺病 毒。 18·根據申請專利範圍第1〇或丨丨項之方法，其中步驟勾之病毒 製劑進一步包含雙醣。 19·根據申請專利範圍第18項之方法，其中該雙醣係蔗糖。 20·—種在自約2°C至約27°C範圍内之溫度下濃縮病毒製劑之 方法，其包括： (a) 低速離心3200克之組合物，該組合物包含第一層，其 係含濃度35%至80°/〇(ν/ν)之多羥基烴，覆蓋在第一層之上 之第二層，其係含濃度5%至30%(ν/ν)之多羥基烴，及覆蓋 在第二層上之含病毒之第三層；及 (b) 自第一層回收病毒； 其中該多羥基烴係具2至7個碳原子之分支或未分支之 經多羥基取代之烷基。 21. 根據申晴專利範圍第20項之方法，其中該多經基烴係甘 油。 22. —種維持腺病毒之安定性之組合物，其包含存在於調配物 中之腺病毒，該調配物係包含自20至200 mg/mL之甘油， 蔗糖，及於自約2°C至27°C範圍内之溫度下維持pH值於自 約7至約8.5範圍内之緩衝系統，其中該緩衝系統包含濃度 為自0.5至10 mg/mL之一鹼價磷酸鈉二水合物，及濃度為 自0.5至10 mg/mL之三甲醇胺基曱烧。 23. 根據申請專利範圍第22項之組合物，其中該蔗糖之濃度為 自 5 至 25 mg/mL 〇 56946-931210.DOC 1232107 2 4.根據申請專利範圍第2 2項之組合物，其進一步包含二價金 屬鹽。 5 ·根據中明專利範圍第24項之組合物，其中該二價金屬鹽為 鎮鹽。 6·根據申明專利範圍第25項之組合物，其中該鎂鹽之濃度為 自 〇· 1 至 1 mg/mL。 27·根據中請專利範圍第26項之組合物，其中該餘之濃度為 自 5 至 25 mg/mL。 28·根據申請專利範圍第27項之組合物，其中該甘油之濃度為 〇〇 mg/mL，5亥蔗糖之濃度為自2〇 mg/mL，該一驗價填酸 鈉一水合物之濃度為1 ·7 mg/mL，該三曱醇胺基曱烷之濃 度為1 · 7 mg/mL，及該鎂鹽為氯化鎂，其濃度為自〇. 4 mg/mL。 29·根據申請專利範圍第22項之組合物，其進一步包含界面活 性劑。 3〇·根據申請專利範圍第29項之組合物，其中該界面活性劑為 聚氧乙稀山梨糖醇酐。 3 1 ·根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該聚氧乙烯山梨 糖醇酐為山梨糖醇8〇。 32·根據申請專利範圍第31項之組合物，其中該山梨糖醇㈣ 之/辰度為自〇·〇3至〇.3 mg/mL。 33·根據申請專利範圍第22項之組合物，其中該腺病毒之濃户 為約1x1 〇9至1x1013病毒粒子/mL。 34·根據申請專利範圍第22項之組合物，其中該腺病毒為活的 重組腺病毒。 56946-931210.DOC 1232107 3 5 ·根據申請專利範圍第22項之組合物，其中該腺病毒於自約 2°C至8°C之溫度下於組合物中可安定至少2星期。 36.根據申請專利範圍第22項之組合物，其中該腺病毒於自約 25 C之溫度下於組合物中係安定1星期。 56946-931210.DOC
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