JP2002503484A - ウイルスを含む組成物、およびウイルス調製物を濃縮するための方法 - Google Patents
ウイルスを含む組成物、およびウイルス調製物を濃縮するための方法Info
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Abstract
Description
ウイルスベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、保存の間にウイル
スの安定性を維持するのに有用であり、そして本発明のウイルス含有組成物は、
治療的用途(例えば、遺伝子治療)に特に有用である。ウイルス調製物を濃縮お
よび精製するための新規な方法もまた提供される。
ますます重要になってきた。そして、容易に保存および輸送され得るが、なお十
分な安全性および効力を保持する、安定なウイルス含有組成物を開発および調製
する必要がある。特に、遺伝子治療におけるウイルスベクターの広範囲な使用を
考慮すると、生きた組換えウイルスが治療用導入遺伝子を保有する場合にそれら
を安定に保存し得る処方物を開発および調製することが重要である。
方物についての重要な必要が存在する。ウイルス含有組成物は、通常、−80℃
での保存を必要とし、そして標準的な冷蔵温度(例えば、2℃〜8℃、またはそ
れより高温)で実質的な期間の間、保存できない。この制限は、保存に対してだ
けでなく、処理、分配、および広範な臨床的用途に対してもまた深刻な障害を表
す。
産生、取り扱い、または分配に関連して起こり得る緩慢な速度の凍結/融解のよ
うな苛酷な条件に曝されているにもかかわらず、約7〜約8.5の範囲のpHを
長期の間維持し得るウイルス含有組成物を開発する必要性もまた存在する。pH
の維持は、ウイルス調製物に関して重要である。なぜなら、7.0未満のpHお
よび8.5を超えるpHでは、生きたウイルス粒子は、物理的および生物学的な
不安定性に起因して傷付きやすく、生存能力を失うからである。
、ウイルスの不安定性に有意に寄与する。しかし、ウイルスおよびウイルスベク
ターの濃度がますます高くなることが、治療的用途のために必要とされる。それ
ゆえ、比較的高濃度のウイルスを、特に上記で言及した厳しい条件下で安定化さ
せる処方物を開発する重要な必要性が存在する。そしてさらに、既存のウイルス
調製物を濃縮して安定な調製物をより高い濃度レベルで達成する新規な方法を開
発する具体的な必要性が存在する。より高いウイルス濃度に関連した不安定性の
問題は、既存のウイルス調製物を濃縮しようと試みる場合、有意に悪化する。こ
のことは部分的に、既存のウイルス調製物の濃度を増加させる努力の間に生じる
さらなる機械的剪断力に起因する。ウイルスの安定性を実質的に損なわずにウイ
ルス調製物を濃縮する方法を見出すことができれば、任意の所望の濃度での臨床
的投薬量が容易に調製され得(たとえ、より低い濃度を有する材料から出発した
場合であっても)、そして重要なことには、ウイルスを濃縮する能力は、種々の
処理工程(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)の間で有意により高い処理
量を可能にすることにより、精製プロセスの間の問題のあるネックおよび他の規
模拡大の問題を排除し得る。
する。
するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含
む安定な組成物を提供することにより、上記の必要性を満たす。
する、既存のウイルス調製物を濃縮する新規な方法もまた提供される。ウイルス
調製物を濃縮する好ましい方法は、以下の工程を含む: (a)ポリヒドロキシ炭化水素を、約20%以上の最終ポリヒドロキシ炭化水
素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程;および (b)このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、こ
のウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤
がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによ
り増加する、工程。
また提供される: (a)35%(v/v)〜80%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素
を含む第1層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第1層が、5%(
v/v)〜30%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第2層に重
層され、この第2層が、ウイルスを含む第3層に重層される、工程;ならびに (b)このウイルスをこの第1層から回収する工程。
が、さらなる処理を増強する(例えば、処理工程(例えば、サイズ排除クロマト
グラフィー)の間に有意により高い処理量を可能にすることにより、続いての精
製の間に問題のなるネックを低減または排除することによる)というさらなる利
点を有することを見出した。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウ
イルス調製物を濃縮する方法は、続く精製工程(例えば、サイズ排除クロマトグ
ラフィー)をさらに含む。このことについて、本発明の方法は、サイズ排除クロ
マトグラフィーの工程がイオン交換クロマトグラフィーに続いて行われ、そして
ウイルス調製物が(本発明に従って)イオン交換クロマトグラフィーの後だがサ
イズ排除クロマトグラフィーの前に濃縮される場合に特に有用である。陰イオン
交換クロマトグラフィーから得られたウイルス画分は、例えば、代表的に、高レ
ベルの塩、およびおそらく濃縮手順の間にウイルス安定性をさらに損なう他の不
純物を含む。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含む
ウイルス調製物を精製する方法を提供する: (a)このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程で
あって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウ
イルス調製産物として溶出される、工程; (b)この調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約25%以上に達
するように、工程(a)のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加す
る工程;および (c)このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイル
ス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程(
b)のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程;ならびに (d)工程(c)の濃縮されたウイルス調製産物を1以上のさらなる処理工程
に供する工程。
製物を提供する。
組成物を濃縮および精製する新規な方法を開示する。
得る新規な緩衝化された処方物を開発した。特に、この処方物は、ウイルス調製
物を−80℃よりもずっと高い温度で安定化し得る。なおさらに重要なことには
、本発明の組成物は、代表的な冷蔵温度で(例えば、2℃〜8℃以上で)でかな
りの期間、好ましくは数ヶ月以上の間安定である。これは、重要な利点である。
なぜなら、上記のように、臨床的必要性を満たすために、ウイルス調製物を保存
および輸送の間に−80℃で凍結して保存することは非実用的であるからである
。
。本明細書中で使用される場合、ポリヒドロキシ炭化水素とは、2個以上(好ま
しくは2〜6個、より好ましくは2〜4個)の水酸基で置換された、分枝状、直
鎖状、または環式の化合物を意味する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ
炭化水素は、好ましくは2〜7個の炭素原子を有する、ポリヒドロキシ置換アル
キル化合物(分枝状または非分枝状)であり、そして例えば、グリセロール、ソ
ルビトール、およびポリプロパノールを含み得る。グリセロールは、特に好まし
い。以下に提供されるデータにより示されるように、本発明者らは、グリセロー
ルが、標準的な冷蔵条件下でさえ、驚くほど高レベルの安定性を長期の間可能に
することを見出した。
遺伝子治療において使用される導入遺伝子を含む場合、さらなる使用のためのウ
イルスの有効性に有害な効果を及ぼさずに、本発明の処方物中のウイルスを、安
定化し得る量である。ポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、約20mg/m
L〜約200mg/mLの最終濃度で存在する。より狭い範囲は、80mg/m
L〜120mg/mLであり得る。1種より多くのポリヒドロキシ炭化水素を用
いて、本発明の組成物中での所望の合計量のポリヒドロキシ炭化水素を達成し得
る。
を含み得る。特に、ポリヒドロキシ炭化水素は、二糖(例えば、スクロース)で
あり得る。さらに、たとえ、組成物のために選択されたポリヒドロキシ炭化水素
がアルデヒド基を含まなくとも、組成物はさらに二糖(例えば、スクロース)を
安定剤および張度調節剤(tonicity−adjusting agent
)として含み得る。本発明の組成物がすでに適切なポリヒドロキシ炭化水素(例
えば、グリセロール)を含み、そして二糖がさらなる安定剤または張度調節剤と
して好ましい実施態様において用いられる場合、この二糖は、好ましくは、5m
g/mL〜25mg/mLの範囲で、より好ましくは20mg/mLで存在し、
そして好ましくはこの二糖はスクロースである。
よびカルシウム塩)は、本発明の組成物の好ましい実施態様において用いられる
。好ましくは、この塩は、塩化物塩またはマグネシウム塩であり、マグネシウム
塩が特に好ましい。この塩(例えば、マグネシウム塩)は、好ましくは約0.1
mg/mL〜約1mg/mLの量で、より好ましくは約0.4mg/mLの量で
存在する。
、リチウム塩、およびセシウム塩)は、本発明の好ましい実施態様において、必
要に応じて安定剤として含まれ得る。好ましくは、この塩は、0.6mg/ml
〜10.0mg/mlの量、より好ましくは約5.8mg/mlの量で存在する
塩化ナトリウムである。
速度および程度を抑制し得、おそらくタンパク質の凝集に起因して、抗原性の可
能性が低減し得る、より薬学的に優れた提示をもたらす。塩化ナトリウムの添加
は、処方物のpHに影響を与えない。
供された場合でさえ、約7〜約8.5の範囲のpHを長期間維持し得る。さらに
、この組成物は、たとえ、より大規模での産生、分配、および取り扱いに関連し
て生じ得る、比較的遅い速度の凍結/融解に供された場合でさえ、安定なままで
あり得、そして必要とされるpH範囲を維持し得る。上記のように、pHの維持
はウイルス調製物にとって重要である。なぜなら、7.0未満のpHおよび8.
5を超えるpHでは、生きたウイルス粒子が不安定になり得、そして分解し得る
からである。ウイルスの特定の組成物は、ウイルスを安定化および保存すること
を難しくする。
℃と27℃との間での保存にかかわらず、そして凍結/融解条件に供されるにも
かかわらず、約7.0〜約8.5の範囲の最適pHを維持し得る緩衝液系を含む
。pHは温度に非常に依存し変化し得るので、本発明のpH範囲は、より詳細に
は、特定の温度範囲に関して以下に説明される。例えば、冷蔵温度(例えば、約
2℃〜8℃)では、好ましいpH範囲は約7.7〜約8.3、より好ましくは約
7.9〜約8.2である。室温(例えば、約20℃〜27℃、好ましくは22℃
〜25℃)では、好ましいpH範囲は約7.3〜約8.2、より好ましくは約7
.4〜約7.9である。
一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約0.5mg/mL〜10mg/mL
の濃度のトロメタミンを含む(トロメタミンはまた、TRISまたはSigma
Chemical Co.から入手可能な「Trizma」としても知られる
)。しかし、他の緩衝液系が用いられ得る。例えば、一塩基性リン酸ナトリウム
二水和物は、酸性形態のtris緩衝液と併用される場合に用いられ得る。特に
好ましい実施態様では、この緩衝液系は、約1.7mg/mLの濃度の一塩基性
リン酸ナトリウム二水和物および約1.7mg/mLの濃度のトロメタミンを含
み、そして25℃で約7.3〜約7.9の最適pH範囲で処方物を維持する能力
を有する。
理)で高濃度のウイルスを安定化する能力を有するというさらなる利点を有する
。特に、本発明の処方物は、1×1013粒子/mLまでの濃度でウイルスの安定
性を維持し得る。本発明において使用するための好ましいウイルス濃度範囲は、
1×109粒子/mL〜1×1013粒子/mL、より好ましくは1×1012粒子 /mLまで、例えば、1×109(または1×1010)〜1×1012の量である 。
菌水)、または溶媒と他の成分(例えば、さらなる溶媒、さらなる安定剤、さら
なる緩衝液、および/または処方物の安全性、効力、および安定性に有害な影響
を及ぼさない他の物質)との混合物を含み得る。希釈剤、安定剤、緩衝液などに
関して、例えば、Remington’s Pharmaceutical S
cience,第15版,Mack Publishing Company,
Easton,Pennsylvaniaに対して参照がなされ得る。
エステル(例えば、ICI Americas,Inc.,Wilmingto
n DelawareからのPolysorbate 20、Polysorb
ate 40、Polysorbate 60、もしくはPolysorbat
e 80、またはSigma,St.Louis,Mo.からのTween 2
0、Tween 40、Tween 60、およびTween 80のようなポ
リオキシエチレンソルビタン)が、必要に応じて、本発明の組成物中に含まれ得
る。好ましくは、この非イオン性洗剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルで
あり、そしてこのポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、好ましくはPolys
orbate 80であり、これは、本発明の組成物中で安定剤として作用し得
る。非イオン性洗剤の濃度は、好ましくは0.03mg/mL〜0.3mg/m
Lの範囲;より好ましくは0.15mg/mLである。
」とは、治療用遺伝子(例えば、腫瘍抑制遺伝子)の癌性組織または癌性器官へ
の送達を増強する任意の薬剤をいう。このような送達増強剤の例としては、洗剤
(detergent)、アルコール、グリコール、界面活性剤、胆汁酸塩、ヘ
パリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液、お
よびアセテートが挙げられるがこれらに限定されない。
ン性洗剤、双性イオン性洗剤、および非イオン性洗剤を含み得る。例示的な洗剤
としては、タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチ
ルピリジウム、塩化ベンザルコニウム(benalkonium chlori
de)、ZWITTERGENT(登録商標)3−14洗剤、CHAPS(3−
[3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオル]−1−プロパンスルホネート
水和物、Aldrich)、Big CHAP、Deoxy Big CHAP
、TRITON(登録商標)−X−100洗剤、C12E8、オクチル−B−D
−グルコピラノシド、PLURONIC(登録商標)−F68洗剤、TWEEN
(登録商標)20洗剤、およびTWEEN(登録商標)80洗剤(CALBIO
CHEM(登録商標)Biochemicals)が挙げられるがこれらに限定
されない。
08/889,335号、および国際出願公開第WO 97/25072号(1
997年7月17日)、および1998年7月8日出願の米国特許出願第09/
112,074号、国際出願第PCT/US 98/14241号に詳細に記載
される。さらに、形質導入効率を増加させるためのウイルスベクターに関連した
カルパインインヒビターの使用は、1998年10月15日出願の米国特許出願
第09/172,685号および同第60/104321号に記載される。
ては、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス
、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイル
ス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど(例えば、A
nderson,Science(1992)256:808−813を参照の
こと)を含むがこれらに限定されない;アデノウイルスが特に好ましい。このウ
イルスは、好ましくは、組換えウイルスであるが、臨床的単離体、弱毒化ワクチ
ン株などを含み得る。従って、例えば、本発明の組成物中で用いられ得る例示的
な組換えアデノウイルスは、A/C/N/53であり、これは、PCT特許出願
第WO 95/11984号に開示される。
または「ウイルスベクター」)を、遺伝子治療における治療的用途のために安定
化するために特に充分に適切である。例えば、本発明において用いられるウイル
スは、腫瘍抑制遺伝子(例えば、野生型p53遺伝子またはRb遺伝子(例えば
、p110RBまたはp56RB)を含み得、そしてウイルスベクター中に挿入され
た導入遺伝子(例えば、野生型p53)とともに、本発明の組成物は、癌の処置
のための薬学的組成物として用いられ得る。
えば、p53)をコードするヌクレオチド配列が挿入されたウイルスベクター)
の生存力を維持する著しい能力を有する。この特徴は、ウイルスが標的細胞に感
染する能力を維持することを可能にし、その結果、挿入された導入遺伝子により
コードされるその治療用タンパク質が適切に産生される。
ける最も普通の遺伝的変化である(Bartek(1991)Oncogene
,6:1699−1703、Hollstein(1991)Science,
253:49−53)ことが留意される。内因性野生型p53タンパク質を欠く
哺乳動物癌細胞への野生型p53の導入は、これらの細胞の新生物性表現型を抑
制する(例えば、米国特許第5,532,220号を参照のこと)。
換えアデノウイルスである。これらの実施例において使用される特定のウイルス
ベクター構築物を、本明細書中で「A/C/N/53」という。A/C/N/5
3(「ACN53」とも言われる)は、1994年10月25日出願の同時係属
中の出願米国特許出願第08/328,673号、およびWO 95/1198
4(1995年5月4日)(特に本明細書中に参考として援用される)に記載さ
れる、特に好ましいウイルスベクター構築物である。
的な処方を以下に示す:
、実施例1および実施例2において存在するが、実施例3および4においては存
在しない)。
ウム六水和物、スクロース、およびグリセロールは全て、例えば、EM Ind
ustries,INC.,7 Skyline Drive,Hawthor
ne,New York 10532から入手され得る。Polysorbat
e 80は、例えば、ICI Americas,Inc.,Wilmingt
on Delaware,19897から入手可能である。
rbate−80を除く)と合わせることにより、ゲル濾過クロマトグラフィー
カラムにおけるウイルスの精製の間に調製され得る(ゲル濾過法に関しては、例
えば、以下の第V節を参照し得る)。次いで、ウイルスの濃度を希釈することが
所望される場合、またはPolysorbate−80を組み込むことが所望さ
れる場合、希釈剤が標準的な技術によって調製され得る。例示的な例を以下に示
す。
シウム六水和物、およびグリセロールを、攪拌機を備えたステンレス鋼容器中の
約75%のバッチ容量の注射用水に室温にて充填し、そして溶解する。得られた
希釈剤のバッチを、注射用水を用いて最終容量に合わせる。pHをチェックする
。懸濁液中のA/C/N/53(導入遺伝子として野生型p53を有するアデノ
ウイルス)薬物物質の必要容量および必要容量の希釈剤を算出し、A/C/N/
53注射剤を作製する。最終的なA/C/N/53注射剤がPolysorba
te 80を含む場合、希釈剤中に10%過剰のPolysorbate 80
を含む貯蔵溶液を調製する。算出された量の懸濁液中のA/C/N/53薬物物
質および希釈剤をステンレス鋼容器に充填し、そして混合する。必要な場合は、
総A/C/N/53注射剤バッチ容量の10%に基づいて、希釈剤の全てを添加
する前にPolysorbate 80溶液を充填する。この懸濁液を滅菌フィ
ルター(0.22μmまたは等価物)を通して無菌的に濾過する。濾過後に、こ
のフィルターの完全性を試験する。滅菌した懸濁液を、適切な容量のバイアルに
収集し、そして充填する。バイアルに栓をつけ、そして密閉する。
、2、3、および4に示す。
めに用いられるバイオアッセイであり、そして一般に、Willsら,1994
,Human Gene Therapy,5:1079−1088により用い
られた手順に基づく。列挙された数は活性を示し、一方、コントロールは活性を
有さない。
ことによって培養物中のウイルス粒子を測定し、そして一般的に、Graham
,F.L.およびPrevec,L.,Methods in Molecul
ar Biology,第7巻:Gene Transfer and Exp
ression Protocols,E.J.Murray編(Humana
Press Inc.,Clifton NJ)109−128頁(1991
)に記載される手順に基づく;Graham,F.L.,Smiley,J.,
Russel,W.C.,およびNairn,R.,J.Gen.Virol.
第36巻,59−74頁(1977)もまた参照のこと。
らの測定は一般に、例えば、国際特許出願PCT/US97/11865(19
98年1月15日に公開されたWO 98/01582)に記載される方法に基
づく。次の右側の欄では、「濃度」という見出しの下で表された数は、ウイルス
粒子の総数の濃度を表す。最後に、「粒子/FACS比」という見出しの下の数
は、感染性ウイルス粒子の数と比較した場合のウイルス粒子の総数の比を表し、
これにより、ウイルス調製物の相対的な能力を示す。
ついてのUV吸収の比によって示されたウイルス粒子の凝集を示す。基本的に、
320ナノメーターの波長での吸光度は、光散乱の量を測定し、一方、260ナ
ノメートルの波長での吸光度は、DNAの量と相関する。
セイは、37℃にて行われ、そして最後の欄におけるpHは、室温、約25℃に
て測定される。
トロメタミン(TRIS)(1.7mg/mL)、一塩基性リン酸ナトリウム二
水和物(1.7mg/mL)、スクロース(20mg/mL)、塩化マグネシウ
ム六水和物(0.4mg/mL)、グリセロール(100mg/mL)、塩化ナ
トリウム(5.8mg/mL)、最終容量=10mL。
観察された。SDS−PAGEによる微粒子の分析は、この微粒子が、微量の不
純物(すなわち、さらなるタンパク質およびいくらかの未成熟ウイルス粒子)か
ら構成され、従って、これらの微粒子は処方物の生存力に影響を及ぼさないこと
を示唆する。それにもかかわらず、処方物をさらに明澄化するための(起こり得
る微粒子形成を防止するための)好ましい実施態様では、必要に応じて微細濾過
の工程を行って、ウイルス粒子はほとんど失わずに、任意の潜在的な微粒子を除
去し得る(微細濾過を実施する場合、濾過容量あたりで十分な微細濾過膜表面積
が、微粒子を除去しながらもウイルスの損失は回避するために重要であることに
留意すべきである)。
(例えば、攪拌(stirring))が、微粒子形成を加速し得、それゆえ、
明澄化プロセスにおける必要に応じたさらなる工程であることを見出した。従っ
て、穏やかな攪拌(例えば、一晩、10℃、磁性攪拌子(magnetic s
tirbar)を用いて)に続いての微細濾過は微粒子を除去し、その結果、再
度攪拌してもそれ以上微粒子が再形成されないことが示された。
された。従って、別の好ましい手順では、1回以上の凍結/融解サイクルが必要
に応じて実施され得、冷蔵温度(例えば、4℃)でのウイルス最終産物の貯蔵の
間の微粒子形成を防止するために、続いて攪拌、次いで微細濾過が実施され得る
。
tion)(本明細書以下では時々、「TFF」という)を用いて既存のウイル
ス調製物を安定に濃縮する新規な方法を開示し、広範囲の所望の濃度で臨床的投
薬量を容易に選択および調製することを可能にする。ウイルス調製物を濃縮する
新規な方法は以下の工程を含む: (a)ポリヒドロキシ炭化水素を、約20%以上の最終ポリヒドロキシ炭化水
素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程;および (b)このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、こ
のウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介してこの希
釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけること
により増加する、工程。
入れられる:アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウ
イルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど;アデ
ノウイルスが特に好ましい。このウイルスは、好ましくは、組換えウイルスであ
るが、臨床的単離体、弱毒化ワクチン株などを含み得る。本発明は、遺伝子治療
における使用のための異種導入遺伝子を保有する組換えウイルスを濃縮するため
に特に有用である。このようなウイルスは、潜在的に不安定化にする力(例えば
、ウイルス調製物を濃縮する方法に伴うさらなる機械的剪断力)に対して特に傷
付きやすい。本発明の方法によって濃縮され得る例示的な組換えアデノウイルス
は、A/C/N/53であり、これは、PCT特許出願第WO 95/1198
4号に開示される。
任意の濾過プロセス(例えば、限外濾過)を含み得、ここで、ウイルスの濃度は
、希釈剤がウイルス調製物から除去されるが、ウイルスがこのフィルターを通過
できず、それゆえ、濃縮された形態でウイルス調製物中に残存するような様式で
、希釈剤をフィルターに通すことによって、増加し得る。限外濾過は、例えば、
Microfiltration and Ultrafiltration:
Principles and Applications,L.Zemanお
よびA.Zydney(Marcel Dekkar,Inc.,New Yo
rk,NY,1996)に詳細に記載される。特に好ましい濾過プロセスは、例
えば、「Pharmaceutical Process Filtratio
n Catalogue」と題されたMILLEPOREカタログの177−2
02頁(Bedford,Massachusetts,1995/96)に記
載されるような、接線流濾過(「TFF」)である。好ましいTFF装置は、M
illipore Corporation,80 Ashby Rd.,Be
dford,Massachusetts(インターネットアドレス:www.
millipore.com)からのPellicon II濾過系またはPe
llicon XL濾過系のいずれかを含み、Pellicon XL系が特に
好ましい。好ましい実施態様では、本発明の方法は、約2℃〜27℃の範囲の温
度で実施される。
れ得る。例えば、ポリヒドロキシ炭化水素の使用は、遠心分離によってウイルス
調製物を濃縮するために有利に用いられ得る。従って、本発明はまた、以下の工
程を含む、ウイルス調製物を濃縮するための方法を提供する: (a)35%(v/v)〜80%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素
を含む第1層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第1層が、5%(
v/v)〜30%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第2層に重
層され、この第2層が、ウイルスを含む第3層に重層される、工程;ならびに (b)このウイルスをこの第1層から回収する工程。
バケットローターを用いる低速遠心分離によって3,200gで濃縮し得る。こ
のことを達成するために、このウイルス調製物は、複数の5mlチューブに入れ
られ得る。各チューブは、チューブの底の第1層において6.25容量%の70
%グリセロールを含有し、この層に2.5容量%の20%グリセロールが重層さ
れ、このウイルス調製物が頂部に置かれ得る。次いで、この調製物は、3,20
0gにて4℃で約16時間遠心分離されて、濃縮されたウイルスがグリセロール
層中にペレット化され、次いで新たに濃縮されたウイルス調製物は続いて第1層
から回収される。上記の手順によって濃縮されたウイルスは、良好な光散乱特性
を有しており、適切な感染特性を有していた。
ドロキシ炭化水素」とは、2個以上(好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜
4個)の水酸基で置換された、分枝状、直鎖状、または環式の化合物を意味し、
そして有効量のポリヒドロキシ炭化水素は、本発明の処方物中のウイルスを、潜
在的に不安定化する力(例えば、濃縮プロセスの間に生じる機械的剪断力)に対
して安定化するのに充分な量である。好ましくは、本発明のウイルス濃縮方法に
おけるポリヒドロキシ炭化水素は、20%、より好ましくは25%の最少濃度で
存在する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、ポ
リヒドロキシ置換アルキル化合物(分枝状または非分枝状)(好ましくは2〜7
個の炭素原子を有する)であり、そしてグリセロール、ソルビトール、およびポ
リプロパノールを含み得る。グリセロールが、特に好ましい。
工程(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)の間で有意に高い処理量を可能
にすることにより、問題のあるネックを排除することによって処理を増強すると
いうさらなる利点を有する。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウ
イルス調製物を濃縮する方法を、ウイルスを精製する方法に適用し得、ここでサ
イズ排除クロマトグラフィー工程(例えば、ゲル濾過)が、陰イオン交換クロマ
トグラフィーに続いて実施される。この実施態様では、速度制限(rate−l
imiting)サイズ排除クロマトグラフィー工程の前にウイルスを濃縮する
ために必要となる機械的剪断力に由来するウイルス安定性に対するさらなるおそ
れだけでなく、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から溶出されたウイルス調
製物が代表的に、ウイルス安定性をさらに損なう高レベルの塩および他の不純物
を含むという事実に起因するウイルス安定性に対するさらなるおそれもまた存在
する。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含む、ウイ
ルス調製物を精製する方法を提供する: (a)このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程で
あって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウ
イルス調製産物として溶出される、工程; (b)この調製物中の該ポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約25%以上に
達するように、工程(a)のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加
する工程;および (c)このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイル
ス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程(
b)のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程;ならびに (d)工程(c)の濃縮されたウイルス調製産物を1以上のさらなる処理工程
に供する工程。
では、最少レベルのグリセロールは、(本発明の濃縮方法の一般的な適用におけ
る20%という最少濃度ではなく)25%である。なぜなら、この特定の適用は
、陰イオン交換カラムから溶出された産物における高い塩濃度によって与えられ
る、安定性に対するさらなるおそれを考慮に入れればならないからである。25
%グリセロール(好ましくは、30%)の添加は、例えば、4℃にて10日間を
超える、塩含有DEAEプールの安定性を生じる;それゆえ、続いてのウイルス
濃縮および/またはゲル濾過の工程は、10日間にわたりかなりの融通性を伴っ
て、別の日に実施され得る。認識されるように、25%以上のより高い濃度のポ
リヒドロキシ炭化水素の使用もまた、本発明の方法において用いられ得、ここで
、このウイルス調製物は、他の処理条件に起因して高い塩含量を含む。
れによって限定されるとは解釈されるべきでない。
イルス材料を用いて開始する。1つの実施態様では、アデノウイルス産物を、陰
イオン交換クロマトグラフィーによって最初に精製する。次いで、この調製物を
サイズ排除カラムにロードする前に、陰イオン交換プールを、30%(v/v)
グリセロールの存在下で接線流濾過(TFF)によって濃縮し得る。あるいは、
別の実施態様では、TFF濃縮工程を、20%(v/v)以上(好ましくは、2
5%)のグリセロールの存在下で、サイズ排除クロマトグラフィー後に実施し得
る。
以下の通りに調製する。発酵工程および回収工程由来の凍結したウイルス材料を
、融解し、そして0.45μm親水性膜を通して濾過する。濾液の塩濃度を、4
M塩化ナトリウムを添加することにより調整する。次いで、この供給溶液を、5
0mMリン酸ナトリウム(pH 7.5)、260mM塩化ナトリウム、2mM
塩化マグネシウム、2%(w/v)スクロース(緩衝液A)で予め平衡化したF
ractogel EMD DEAE−650Mカラムに適用する。アデノウイ
ルスは、この陰イオン交換樹脂に結合し、一方、媒体の大部分および宿主細胞の
不純物はカラムを通過して、結局、電荷を消費する。このカラムを最初に4容量
の緩衝液Aで洗浄し、続いて8ベッド容量の94%緩衝液Aおよび6%緩衝液B
(50mMリン酸ナトリウム(pH 7.5)、600mM塩化ナトリウム、2
mM塩化マグネシウム、2%(w/v)スクロース))という第2のイソクラテ
ィク(isocratic)洗浄液で洗浄してさらなる不純物を除去する。この
ウイルスを、30ベッド容量の、6%〜100%の緩衝液Bの線形勾配を用いて
カラムから溶出させる。A280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデ ノウイルスピークを回収する。次いで、グリセロールを、さらなる処理のために
30%(v/v)の最終濃度でDEAEプールに添加する。
オフのBiomax膜を備えたMillipore TFFユニット(Pell
icon XL System)を用いて10倍〜20倍濃縮する。このプロセ
スを、2〜10℃または室温(25℃)のいずれかで実施する。以下の濾過パラ
メーターをこの手順において用いる:平均入口圧=14psi;平均透過圧=o psi;平均流速=13リットル/時間平方メートル。アデノウイルスの最終
濃度は、約1.0〜2.0×1013粒子/mlに達する。Resource Q
−HPLCおよびUV吸光度(A260)分析に基づくと、濃縮工程の回収率は、 有意な凝集を伴わずに、>80%である(A320/A260による光散乱アッセイ)
。
0)、100mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)ス
クロース、10%グリセロール(緩衝液C)または11mMリン酸ナトリウム、
14mM Tris、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)スクロース、1
0%グリセロール(pH 7.8)(緩衝液D)で予め平衡化したSuperd
ex−200サイズ排除カラムに適用する。このカラムを、平衡化緩衝液で溶出
させる。A280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデノウイルスピー クを回収し、そしてプールする。濃縮されたアデノウイルス調製物を、0.2μ
mの親水性Durapore膜(Stericup,Millipore)を通
して2〜10℃にて濾過し、そして−80℃またはより高い温度(例えば、2〜
10℃)にて貯蔵し得る。
グラフィー後だがゲル濾過前にウイルスを濃縮する工程を含む。しかし、別の実
施態様では、ウイルス調製物を濃縮する開示された方法はまた、(たとえウイル
ス濃縮工程が、陰イオン交換工程とゲル濾過工程との間で用いられない場合であ
っても)ゲル濾過工程の後に用いられ得る。この場合、濾過パラメーターは、ポ
リヒドロキシ炭化水素(例えば、グリセロール)が20%(v/v)程度の低い
最終濃度でSuperdex−200プールに添加され得ること以外は、DEA
Eプールの濃縮のための濾過パラメーターと同じである。なぜなら、このDEA
Eプールにおいて高い塩濃度を扱う必要性がもうないからである。このことにつ
いて、ポリヒドロキシ炭化水素の添加がゲル濾過後まで延期される場合、このD
EAEプールは(その高い塩濃度によるこのDEAEプールの傷付き易さに起因
して)すぐにゲル濾過カラムに適用されるべきであることに留意すべきである。
従って、(本発明に従って)ポリヒドロキシ炭化水素をこのDEAEプールに添
加することのさらなる利点が、陰イオン交換クロマトグラフィーと続く処理との
間の期間の時間間隔の選択肢および貯蔵の選択肢に関して増加した融通性である
ことが理解され得る。
製方法についてのさらなる情報に関しては、例えば、Huygheら,Huma
n Gene Therapy,第6巻,1403−1416頁(1995)お
よび米国特許出願第08/989,227号(特に本明細書中に参考として援用
される)を参照し得る。
データ) 以下の実験データによって示されるように、本発明の方法は、ウイルスを濃縮
する機械的剪断力にもかからわず、そしてDEAEプール中での高い塩レベルの
ような厳しい条件にもかかわらず、大いに増強されたウイルス安定性を可能にす
る。従って、本発明の方法は、とりわけ、以下を可能にする:(1)任意の所望
の濃度での臨床投薬量の容易な調製(たとえ、より低い濃度を有する材料で始め
た場合でさえも)、(2)処理の増強(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー
の間の有意に多い処理量を可能にすることによる)、および(3)2〜10℃で
10日間を超える塩含有DEAEプールの安定性(これにより、ウイルス濃縮お
よび/またはゲル濾過という続きの工程が、10日間の期間にわたるかなりの融
通性を伴って別の日に実施されることを可能にする)。
従って)30%グリセロール中のDEAEプールを濃縮することにより調製した
。次いで、この調製物を、Superdex−200ゲル濾過クロマトグラフィ
ーによるさらなる精製に供して、試験するための最終処方物を得た。
中で濃縮した。
の刊行物、特許、または特許出願が、参考として援用されると具体的に、そして
個々に示された場合と同じ程度に、その全体が参考として援用される。
特定の実施態様は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、それによって
制限されると解釈されるべきでない。
Claims (28)
- 【請求項1】 約2℃〜27℃の範囲の温度で約7〜約8.5の範囲のpH
を維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイル
スを含む、組成物。 - 【請求項2】 前記ウイルスが組換えウイルスである、請求項1に記載の組
成物。 - 【請求項3】 前記ポリヒドロキシ炭化水素がグリセロールである、請求項
1に記載の組成物。 - 【請求項4】 二糖をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 【請求項5】 前記組成物が、約0.5〜10mg/mLの濃度の一塩基性
リン酸ナトリウム二水和物および約0.5〜10mg/mLの濃度のトロメタミ
ンを含む緩衝液系を含む、請求項1に記載の組成物。 - 【請求項6】 約0.1〜1mg/mLの濃度の二価金属塩をさらに含む、
請求項1に記載の組成物。 - 【請求項7】 水を含む希釈剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 【請求項8】 前記ウイルスが、約1×109〜1×1013粒子/mLの濃 度で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 【請求項9】 前記ウイルスが、アデノウイルスである、請求項1に記載の
組成物。 - 【請求項10】 前記組換えウイルスが、野生型p53遺伝子を含む、請求
項2に記載の組成物。 - 【請求項11】 前記組換えウイルスが、A/C/N/53である、請求項
10に記載の組成物。 - 【請求項12】 前記ウイルスがアデノウイルスであり;前記ポリヒドロキ
シ炭化水素がグリセロールであり;前記緩衝液系が、20℃〜27℃の範囲の温
度で約7.3〜約7.9の範囲のpHを維持し;そして前記組成物が二糖をさら
に含む、請求項1に記載の組成物。 - 【請求項13】 前記アデノウイルスがA/C/N/53であり;前記二糖
がスクロースであり;前記緩衝液系が一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および
トロメタミンを含み;そして前記組成物が二価金属塩および水をさらに含む、請
求項12に記載の組成物。 - 【請求項14】 ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工
程: (a)ポリヒドロキシ炭化水素を、約20%以上の最終ポリヒドロキシ炭化水
素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程;および (b)該ウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、該ウ
イルスの濃度を、該ウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウ
イルス調製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることにより増加させ
る、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項15】 前記濾過プロセスが限外濾過を含む、請求項14に記載の
方法。 - 【請求項16】 前記濾過プロセスが接線流濾過を含む、請求項14に記載
の方法。 - 【請求項17】 ウイルス調製物を精製する方法であって、以下の工程: (a)該ウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であ
って、ここで、ウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス
調製産物として溶出される、工程; (b)該調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の濃度が約25%以上のレベルに
達するように、工程(a)のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加
する工程;および (c)該ウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウイルス調
製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることによって、工程(b)の
ウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程;ならびに (d)工程(c)の濃縮されたウイルス調製産物を1以上のさらなる処理工程
に供する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項18】 前記ウイルスが組換えウイルスである、請求項14に記載
の方法。 - 【請求項19】 前記ウイルスが遺伝子治療で使用するための治療用導入遺
伝子を保有する組換えウイルスである、請求項14に記載の方法。 - 【請求項20】 さらなる処理工程がサイズ排除クロマトグラフィーを含む
、請求項17に記載の方法。 - 【請求項21】 前記工程(c)のプロセスが、接線流濾過を含む、請求項
17に記載の方法。 - 【請求項22】 前記工程(c)のプロセスが、Pellicon XL濾
過系を含む装置を用いて実施される、請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 請求項14に記載の方法により濃縮された、ウイルス調製
物。 - 【請求項24】 請求項17に記載の方法により精製された、ウイルス調製
物。 - 【請求項25】 ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工
程: (a)35%(v/v)〜80%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素
を含む第1層を含む組成物を遠心分離する工程であって、該第1層が、5%(v
/v)〜30%(v/v)の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第2層に重層
され、該第2層が、ウイルスを含む第3層に重層される、工程;ならびに (b)該ウイルスを該第1層から回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項26】 前記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組
成物をさらなる攪拌処理工程に供し、続いて微細濾過に供する、請求項1に記載
の組成物。 - 【請求項27】 前記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組
成物を1以上の凍結/融解サイクルに供し、続いて攪拌に供し、次いで微細濾過
に供する、請求項1に記載の組成物。 - 【請求項28】 約0.6〜10.0mg/mLの濃度の一価の金属塩をさ
らに含む、請求項12に記載の組成物。
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