CN100374551C - 含有病毒的组合物以及浓缩病毒制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在含有多羟基烃、在约2℃-27℃温度下缓冲维持pH在约7-约8.5范围的配方中含有病毒的组合物。本发明还公开了浓缩以及纯化病毒制剂的方法。

Description

含有病毒的组合物以及浓缩病毒制剂的方法
I.发明领域
本发明涉及含有病毒尤其是病毒载体、稳定性明显提高的组合物。本发明的组合物可用于保持病毒在保藏期间稳定性，本发明的含病毒组合物尤其可用于治疗用途如基因治疗。本发明还提供了浓缩以及纯化病毒制剂的新方法。
II.背景
病毒对于治疗用途如疫苗接种和基因治疗愈来愈重要，需要开发和制备易于保藏和运输而仍然保持足够安全性和功效的、稳定的含病毒组合物。具体地说，已知在基因治疗中广泛使用病毒载体，重要的是开发和制备能够稳定地保存携带有治疗转基因的活重组病毒配方(formulation)。
此外，极其需要能够在-80℃以上、长时间内能够稳定病毒制剂的配方。含病毒组合物通常需要贮藏于-80℃而不能够在标准冷藏温度(例如2℃-8℃或更高)贮藏足够长的时间。这种限制不仅对贮藏是一个严重的障碍，而且对生产、分销和广泛的临床使用也是一个严重的障碍。
也需要开发即使暴露于冷藏温度和经受苛刻的条件下，如冻/融尤其是与大规模生产、装卸或分销中可能发生的慢速冻/融时，仍然能够在长时间内保持pH范围约7-约8.5的含病毒组合物。因为在pH低于7.0及高于8.5时活病毒粒因物理和生物不稳定性而易于丧失活力，所以维持pH对病毒制剂是重要的。
另外的问题是涉及增加病毒浓度的问题。尤其是高病毒浓度是病毒不稳定性的主要原因。然而，临床应用需要渐增的高浓度病毒和病毒载体。所以，极其需要开发尤其是在上述苛刻条件下稳定的较高浓度病毒的配方。此外，特别需要开发浓缩现有病毒制剂的新方法，以实现高浓度水平的稳定制剂。如果人们试图浓缩现有病毒制剂，则显著加重与高病毒浓度有关的不稳定性问题。其部分原因是在努力增加现有病毒制剂浓度的过程中会承受另外的机械剪切力所致。如果人们能够找到浓缩病毒制剂而不会明显损害病毒稳定性的方法，则能够容易地制备任何需要浓度的临床剂量(即使使用较低浓度原料开始时)，而且更重要的是，浓缩病毒的能力能够解决瓶颈问题以及通过使在各种加工如尺寸排阻色谱法的步骤中的物料通过量明显增加，从而解决纯化过程中的其它放大问题。
因此需要完成上述目的的材料和方法。
III.发明概述
本发明通过提供在含有多羟基烃、在约2℃-27℃温度范围内将pH缓冲维持于约7-约8.5范围的配方中含有病毒的稳定组合物，从而满足上述需要。
还提供浓缩现有病毒制剂的新方法，该方法使得人们易于选择和制备宽范围的需要浓度的临床剂量。浓缩病毒制剂的优选方法包括：
(a)向病毒制剂中加入多羟基烃至多羟基烃终浓度约为20％或以上；以及
(b)使所述病毒制剂经受一个过滤过程，其中对所述制剂施加压力，以致通过滤器从病毒制剂去除稀释剂而同时保留病毒，从而增加病毒浓度。
本发明还提供浓缩病毒制剂的方法，包括：
(a)离心包括如下层的组合物：包含35％-80％(v/v)浓度的多羟基烃的第一层，所述第一层上覆盖含有5％-30％(v/v)浓度的多羟基烃的第二层，第二层上覆盖含有病毒的第三层；和
(b)从第一层回收病毒。
而且，本发明人发现其提高病毒浓度的新方法还具有进一步提高加工效率的优势(例如通过使在各种加工如尺寸排阻色谱法的步骤中的物料通过量明显增加从而减少或消除后续纯化过程中的瓶颈问题)。所以，在优选的实施方案中，按照本发明浓缩病毒制剂的方法进一步包括后续纯化步骤(例如尺寸排阻色谱法)。在这一方面，当在离子交换色谱法后进行尺寸排阻色谱法步骤时，本发明的方法特别有用，并且在离子交换色谱法之后但是在尺寸排阻色谱法之前(按照本发明)浓缩病毒制剂。例如由阴离子交换色谱法获得的病毒流分通常含有高浓度盐和在浓缩过程中进一步损害病毒稳定性的其它可能杂质。因此，在特别优选的实施方案中，本发明提供纯化病毒制剂的方法，包括：
(a)使病毒制剂经过阴离子交换色谱法，其中从阴离子交换色谱法的介质中洗脱作为病毒制剂产品的病毒；
(b)向步骤(a)病毒制剂产品中加入多羟基烃，使制剂中的多羟基烃浓度达到最终浓度约为25％或以上；以及
(c)通过对所述制剂施用压力以通过滤器从病毒制剂中去除稀释剂而保留病毒，从而提高步骤(b)病毒制剂产品中的病毒的浓度；和
(d)再使步骤(c)的浓缩病毒制剂产品经过一次或多次另外的加工步骤。
本发明还提供通过上述方法浓缩和/或纯化的病毒制剂。
IV.详细描述
如上所述，本申请公开了新的含病毒组合物以及浓缩和纯化含病毒组合物的新方法。
关于组合物，本发明者开发了一种新的能够使保藏的病毒制剂稳定性提高的缓冲配方。具体地说，该配方能够在明显高于-80℃的温度下稳定病毒制剂。更重要的是，本发明组合物能够在通常冷藏温度下例如2℃-8℃或更高，稳定足够长时间、优选为数月或更长时间。这是非常重要的优势，因为，如上所述，为了满足临床需要，在贮藏和运输过程中将病毒制剂冷冻于-80℃不是切实可行的。
本发明组合物的一个重要特征是加入了多羟基烃。本文所用的多羟基烃是指2个或2个以上(优选2-6、更优选2-4个)羟基取代的支链、直链或环形化合物。用于本发明的多羟基烃优选为优选具有2-7个碳原子的多羟基取代的烷基化合物(支链或非支链)，可以包括例如甘油、山梨醇和聚丙醇。特别优选甘油。如以下提供的资料所示，本发明者发现甘油即使在标准冷藏条件下也可以用于保持长时间的令人惊奇的高水平的稳定性。
用于本发明组合物的多羟基烃的有效量足以稳定在本发明配方中的病毒而对病毒进一步应用的有效性无不利影响，尤其是在所述病毒含有用于基因治疗的转基因的情况下。多羟基烃优选存在的终浓度约20-200mg/mL。较窄范围可以为80-120mg/mL。可以使用一种以上的多羟基烃达到本发明组合物中需要的多羟基烃总量。
本发明组合物中的多羟基烃可以任选含有醛基。具体地说，所述多羟基烃可以为双糖如蔗糖。而且，即使选定用于所述组合物的多羟基烃不含有醛基，所述组合物也可以另含有作为稳定剂和张力调节剂的双糖如蔗糖。当本发明组合物已经含有合适的多羟基烃(例如甘油)和在优选的实施方案中使用双糖作为另外的稳定剂或张力调节剂时，双糖的优选存在范围为5-25mg/mL、更优选20mg/mL，而且所述双糖优选蔗糖。
在本发明组合物的优选实施方案中使用药学上可接受的二价金属盐稳定剂如镁盐、锌盐和钙盐。所述盐优选为盐酸盐或镁盐，特别优选镁盐。所述盐(例如镁盐)的优选存在量约为0.1-1mg/mL、更优选约0.4mg/mL。
在本发明的优选实施方案中可以包含作为任选稳定剂的药学上可接受的一价金属盐稳定剂如钾盐、钠盐、锂盐和铯盐。所述盐优选存在量为0.6-10.0mg/mL、更优选约5.8mg/mL的氯化钠。
除了稳定所述组合物外，氯化钠可以抑制发酵副产物出现的速率和程度，使得提供因蛋白聚集使抗原性降低的药学上的更佳形式。加入氯化钠不会影响所述配方的pH。
本发明组合物即使当经受苛刻条件如冷藏和冻/融时也能够长时间将pH维持在约7-约8.5范围。而且，即使经受较大规模生产、分销和装卸中可能发生的较慢速率的冻/融，本发明组合物仍然能够保持稳定和保持需要的pH范围。如上所述，维持pH对病毒制剂是重要的，因为在pH低于7.0及高于8.5时活病毒粒可能变得不稳定和降解。该特定的病毒组合物使病毒难于稳定和保存。
为了达到在苛刻条件下的pH维持，本发明优选包括一个缓冲体系，该体系即使在贮藏于-80℃至27℃之间以及即使经受冻/融条件也能够将pH维持于约7.0至约8.5的最适范围。因为pH随温度而变化，所以以下参考具体温度范围更具体地说明本发明的pH范围。例如冷藏温度(例如约2℃-8℃)时，优选pH范围约7.7至约8.3，更优选约7.9至约8.2。室温(例如约20℃-27℃，更优选22℃-25℃)下，优选pH范围约7.3至约8.2，更优选约7.4至约7.9。
本发明的优选缓冲体系包括约0.5-10mg/mL浓度的磷酸二氢钠二水合物和约0.5-10mg/mL浓度的氨基丁三醇。(氨基丁三醇也称为TRIS或“Trizma”，得自Sigma Chemical Co.)。然而，其它缓冲体系也可以使用。例如，如果与酸式氨基丁三醇缓冲液配对，也可以使用磷酸氢二钠二水合物。在特别优选的实施方案中，所述缓冲体系包括约1.7mg/mL浓度的磷酸二氢钠二水合物和约1.7mg/mL浓度的氨基丁三醇，具有在25℃下维持所述配方在最适pH范围约7.3至约7.9内的能力。
本发明配方的另一优势是能够在上述苛刻条件下(例如冷藏温度和冻/融加工)稳定高浓度的病毒。更具体地说，本发明配方能够维持病毒浓度范围高至1×1013粒/mL的稳定性。用于本发明的病毒浓度优选范围为1×109至1×1013粒/mL，更优选高至1×1012粒/mL，例如1×109(或1×1010)至1×1012。
本文所用的术语“稀释剂”可以包括溶剂(例如水，优选无菌水)或溶剂混合物和其它成分例如另外的溶剂、另外的稳定剂、另外的缓冲剂和/或不会负面影响所述配方的安全性、功效和稳定性的其它物质。关于稀释剂、稳定剂、缓冲剂等，参考例如Remington的Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。
在本发明组合物中可以任选包括表面活性剂、优选非离子洗涤剂如聚氧乙烯脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇酐，如得自ICI Americas，Inc.，Wilmington Delaware的Polysorbate 20、Polysorbate 40、Polysorbate60或Polysorbate 80，或得自Sigma，St.Louis，Mo.的吐温20、吐温40、吐温60和吐温80)。所述非离子洗涤剂优选聚氧乙烯脂肪酸酯，而所述聚氧乙烯脂肪酸酯优选可以用作本发明组合物中的稳定剂的Polysorbate 80。非离子洗涤剂的浓度范围优选0.03-0.3mg/mL；更优选0.15mg/mL。
本发明组合物还可以包括一种或多种“传递增强剂”。“传递增强剂”是指增强治疗基因如肿瘤抑制基因传递至癌组织或器官的任何因子。这类传递增强剂的实例包括但不限于洗涤剂、醇、二元醇、表面活性剂、胆盐、肝素拮抗剂、环氧合酶抑制剂、高渗盐溶液和乙酸盐。
洗涤剂(作为本文所用的术语)可以包括阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、两性离子洗涤剂和非离子洗涤剂。典型的洗涤剂包括但不限于牛磺胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、十六烷基吡啶、benalkonium盐酸盐、ZWITTERGENT3-14洗涤剂、CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol]-1-丙磺酸盐水合物，Aldrich)、BigCHAP、Deoxy Big CHAP、TRITON-X-100洗涤剂、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷、PLURONIC-F68洗涤剂、TWEEN20洗涤剂和TWEEN80洗涤剂(CALBIOCHEMBiochemicals)。
传递增强剂的使用详细描述于同时待审的1997年7月8日提交的美国专利申请U.S.S.N.08/889,335和1997年7月17日的国际申请公布WO 97/25072号以及1998年7月8日申请的美国专利申请U.S.S.N.09/112,074号、国际申请PCT/US 98/14241。另外，联合使用钙蛋白酶抑制剂和病毒载体以增强转导效率描述于1998年10月15日申请的美国专利申请U.S.S.N.09/172,685和60/104321中。
各种病毒可以用于本发明组合物中，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒、反转录病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、轮状病毒等(参见例如Anderson，Science(1992)256：808-813)；特别优选腺病毒。所述病毒优选为重组病毒，但是可以包括临床分离物、减毒疫苗株等。因此，可用于本发明组合物中的典型重组腺病毒是公开于PCT专利申请WO 95/11984号中的A/C/N/53。
本发明的配方非常适用于稳定用于基因治疗用途的重组病毒如活的重组腺病毒(或“病毒载体”)。用于本发明的病毒含有例如肿瘤抑制基因如野生型p53基因或Rb基因(例如p110RB或p56RB)，以及带有转基因的肿瘤抑制基因如已经插入病毒载体中的野生型p53，所以本发明的组合物可以用作治疗癌症的药用组合物。
在该方面，本发明配方的一个值得注意的能力是能够维持活病毒尤其是已经插入编码转基因如p53的核苷酸序列的病毒载体的活力。该特征使得所述病毒保持其感染靶细胞的能力，从而可以足量产生由所插入的转基因编码的治疗蛋白。
关于p53和其用途，特别值得注意的是p53基因突变是人类癌症中最常见的遗传变化(Bartek(1991)Oncogene，6：1699-1703，Hollstein(1991)Science，253，49-53)。在缺乏内源性野生型p53蛋白的哺乳动物癌细胞中导入野生型p53可以抑制这些细胞的肿瘤表现型(参见例如美国专利5,532,220)。
在以下的实施例中，所述病毒为含有野生型p53基因的活重组腺病毒。用于这些实施例中的特定病毒载体构建物称为“A/C/N/53”。A/C/N/53(也称为“ACN53”)是描述于1994年10月25日申请的共同待审申请USSN 08/328,673和WO 95/11984(1995年5月4日)(特别通过引用结合到本文中)中的特别优选的病毒载体构建物。
含有Polysorbate 80的本发明优选实施方案的典型配方如下：
典型配方
活性物质            A/C/N/53            1×109-1×1013颗粒/mL
缓冲剂              磷酸二氢钠          0.5-10mg/mL
                    氨基丁三醇          0.5-10mg/mL
稳定剂/张力剂       蔗糖                5-25mg/mL
稳定剂              甘油                20-200mg/mL
                    氯化镁              0.1-1mg/mL
                    Polysorbate80       0.03-0.3mg/mL
溶剂                注射用水加至足量    1mL
(该组合物通常以1.0mL剂量保藏。上述配方中的“加至足量”是指加入足够的溶剂至1mL总体积)。
四个特别优选的实施方案如下。(在实施例1和2中存在Polysorbate 80，但是在实施例3和4中不存在)。
                    实施例1             实施例2
A/C/N/53            7.5×1011颗粒/mL    7.5×1010颗粒/mL
磷酸二氢钠二水合物  1.7mg/mL            1.7mg/mL
氨基丁三醇          1.7mg/mL            1.7mg/mL
氯化镁六水合物      0.4mg/mL            0.4mg/mL
蔗糖                20mg/mL             20mg/mL
Polysorbate80       0.15mg/mL           0.15mg/mL
甘油                100mg/mL            100mg/mL
注射用水加至足量    1mL                 1mL
pH                  7.4-7.8             7.4-7.8
                    实施例3             实施例4
A/C/N/53            7.5×1011颗粒/mL    7.5×1010颗粒/mL
磷酸二氢钠二水合物  1.7mg/mL            1.7mg/mL
氨基丁三醇          1.7mg/mL            1.7mg/mL
氯化镁六水合物      0.4mg/mL            0.4mg/mL
蔗糖                20mg/mL             20mg/mL
甘油                100mg/mL            100mg/mL
注射用水加至足量    1mL                 1mL
pH                  7.4-7.9             7.3-7.8
以下成分得自例如EM Industries，INC.，7 Skyline Drive，Hawthorne，New York 10532：磷酸二氢钠二水合物、氨基丁三醇、氯化镁六水合物、蔗糖和甘油。Polysorbate 80得自例如ICI Americas，Inc.，Wilmington Delaware，19897。
可以在凝胶过滤色谱柱纯化所述病毒过程中，将所述成分(不包括Polysorbate-80)在凝胶过滤柱中以需要的浓度混合，从而制备本发明的组合物。(关于凝胶过滤方法例如可以参考如以下第V部分)。然后，如果需要稀释所述浓度的病毒或加入Polysorbate-80，然后可以用标准技术制备稀释液。说明性实施例如下：
在配有搅拌器的不锈钢容器中，于室温下，将磷酸二氢钠二水合物、氨基丁三醇、蔗糖、氯化镁六水合物和甘油加入并溶解于约75％每批体积的注射用水中。用注射用水将所得的该批稀释液加至终体积。校验pH。计算所需要的A/C/N/53(含有作为转基因的野生型p53的腺病毒)药物悬浮液(Drug Substance in Suspension)体积以及制备A/C/N/53注射剂的所需要的稀释液体积。如果最终的A/C/N/53注射剂将含有Polysorbate 80，则制备含有10％以上Polysorbate 80的稀释液的储备溶液。将计算量的A/C/N/53药物悬浮液和稀释液加入到不锈钢容器中并混合。需要时，根据10％的A/C/N53的总注射批体积在加入所有稀释液前加入Polysorbate 80溶液。通过灭菌滤膜(0.22μm或相当)无菌过滤所述悬浮液。过滤后测试所述滤膜的完整性。收集并将灭菌悬浮液装入合适体积的管制瓶中。加盖并密封管制瓶。
实施例1、2、3和4的稳定性数据分别在下表1、2、3和4中给出。
在下表中，抗增殖测定是用来测定产品抑制癌细胞的能力的生物测定，而且一般是以Wills等(1994，Human Gene Therapy，5：1079-1088)所用的方法为基础。所列出的数字表示活性，而所述对照无活性。
“噬菌斑测定”通过计算随稀释度而变化的病毒噬菌斑数从而测量培养物中的病毒粒，而且一般是以描述于Graham，F.L.和Prevec，L.，Methods in Molecular Biology，第7卷：Gene Transfer and ExpressionProtocols，E.J.Murray编辑(Humana Press Imc.，Clifton NJ)第109-128页(1991)；此外参见Graham，F.L，Smiley，J.，Russel，W.C.和Naim，R，JGen.Virol.，第36卷，第59-74页(1977)的方法为基础。
“FACS”测定显示病毒感染细胞的能力，这些测定结果一般基于描述于例如国际专利申请PCT/US97/11865(WO 98/01582，1998年1月15日公布)中的方法。在向右的一栏中，在表目“浓度”下提供的数字是总病毒粒数的浓度。最后，在表目“颗粒/FACS比率”下的数字是总病毒粒数与感染病毒粒数的比率，由此表明所述病毒制剂的相对效价。
按指示光散射的波长A320/A260的UV吸光度比所示，在表目“UV”下的数据表示病毒粒的聚集。基本上，320nm波长的吸光度测量光散射量，而260nm波长的吸光度与DNA量有关。
在“条件“下的表第二栏所列的温度为贮藏温度。生理测定在37℃下进行，在最后一栏中是在室温约25℃下测定的pH。
表1
实施例1的稳定性数据
  稳定时间   条件℃   抗增殖测定×10<sup>5</sup>SPU/mL   噬菌斑测定×10<sup>8</sup>PFU/mL   FACS×10<sup>10</sup>U/mL   浓度×10<sup>11</sup>颗粒/mL   颗粒FACS比   UVA<sub>320</sub>/A<sub>26</sub>0   pH
  开始1周2周4周8周12周5个月6个月9个月11个月12个月 25444444444   3.34.93.13.45.83.9未测试3.03.1未测试2.6   5.8106.6178.836未测试7.619未测试10   3.862.273.413.913.382.241.572.743.47nt0.81   7.958.067.847.797.807.808.217.687.19<sup>*</sup>6.716.13   213623202335522821-76   0.230.240.230.230.240.240.260.280.280.290.30   7.537.537.497.637.617.727.607.587.58nt7.62
*重复试验9个月UV样品：6.89×1011颗粒/mL；A320/A260＝0.28。
表2
实施例2的稳定性数据
  稳定时间   条件℃   抗增殖测定×10<sup>4</sup>SPU/mL   噬菌斑测定×10<sup>7</sup>PFU/mL   FACS×10<sup>9</sup>U/mL   浓度×10<sup>10</sup>颗粒/mL   颗粒FACS比   UVA<sub>320</sub>/A<sub>26</sub>0   pH
  开始1周2周4周8周12周5个月6个月9个月11个月12个月 25444444444   3.32.42.43.26.95.5未测试3.32.3未测试(nt)1.8   4.87.16.98.48.68.3未测试7.313未测试9.4   1.991.642.132.502.601.091.742.101.97nt0.60   10.0nd<sup>*</sup>9.799.248.108.608.038.257.597.484.94   50-46373179463939-82   0.240.460.240.220.250.240.270.230.24<sup>**</sup>0.230.26   7.367.427.517.557.547.647.557.527.53nt7.59
*因检测干扰而不能确定。
**重复试验9个月UV样品：7.37×1010颗粒/mL；A320/A260＝0.24。
表3
实施例3的稳定性数据
  稳定时间   条件℃   抗增殖测定×10<sup>5</sup>SPU/mL   噬菌斑测定×10<sup>8</sup>PFU/mL   FACS×10<sup>10</sup>U/mL   浓度×10<sup>11</sup>颗粒/mL   颗粒FACS比   UVA<sub>320</sub>/A<sub>26</sub>0   pH
  开始1周2周4周8周12周6个月9个月11个月12个月 2544444444   3.24.42.32.75.93.02.42.8未测试(nt)2.2   6.34.38.07.68.7156.49.4nt9.8   2.591.653.624.082.690.702.452.51nt0.74   7.457.497.276.977.007.107.127.066.716.75   29452017261012928-91   0.240.240.240.240.250.250.250.260.250.26   7.677.687.497.757.827.807.767.81nt7.81
表4
实施例4的稳定性数据
  稳定时间   条件   抗增殖测定×10<sup>4</sup>SPU/mL   噬菌斑测定×10<sup>7</sup>PFU/mL   FACS×10<sup>9</sup>U/mL   浓度×10<sup>10</sup>颗粒/mL   颗粒FACS比   UVA<sub>320</sub>/A<sub>26</sub>0   pH
  开始1周2周4周8周12周6个月9个月11个月12个月 2544444444   3.32.32.82.96.94.43.62.9未测试(nt)2.4   4.79.38.06.67.28.67.111nt22   2.361.402.162.542.561.452.851.87nt0.70   8.918.258.809.357.607.207.927.266.937.15   3859413730502839-102   0.230.24nd<sup>*</sup>0.200.240.230.210.200.220.23   7.377.377.377.637.607.737.587.60nt7.61
*因检测干扰而不能确定。
实施例5
实施例5的配方：A/C/N/53(7.5×1011颗粒/mL)、氨基丁三醇(TRIS)(1.7mg/mL)、磷酸二氢钠二水合物(1.7mg/mL)、蔗糖(20mg/mL)、氯化镁六水合物(0.4mg/mL)、甘油(100mg/mL)、氯化钠(5.8mg/mL)，灌装体积＝10mL。
表5
实施例5的稳定性数据
  稳定时间   条件℃   抗增殖测定×10<sup>5</sup>SPU/mL   FACS×10<sup>10</sup>U/mL   浓度×10<sup>11</sup>颗粒/mL   颗粒FACS比   UVA<sub>320</sub>/A<sub>26</sub>0   pH
  开始1个月4个月 44   4.58.013.0   1.871.671.58   7.817.837.84   424750   0.230.230.23   7.807.807.70
在某些情况下，于4℃贮藏期间在所述配方中观察到颗粒形成。
经SDS-PAGE分析颗粒表明，所述颗粒含有少量杂质(即：其他蛋白和部分未成熟病毒颗粒)，因此这些颗粒不影响所述配方的活力。尽管如此，在进一步使所述配方澄清(防治可能的颗粒形成)的优选实施方案中，可以进行一个任选的微量过滤步骤以去除任何潜在颗粒而少丢失病毒颗粒。(当进行微量过滤时，值得注意的是，关键是单位过滤体积有足够的微量过滤膜表面面积以避免随着颗粒去除而丢失病毒)。
此外，在一个优选的实施方案中，本发明人发现搅拌作用能够加速颗粒形成，所以它是澄清过程中的另一个任选步骤。因此，轻轻搅拌(例如用磁性搅拌棒于10℃搅拌过夜)，然后微量过滤表明，可以去除颗粒以致在再搅拌时不再有颗粒形成。
还发现在重复搅拌期间冻/融循环能够促进颗粒形成。因此，在另一个优选方法中，可以任选进行一个或多个冻/融循环，然后搅拌、微量过滤以防止所述病毒成品在冷藏温度(例如4℃)下贮藏期间的颗粒形成。
浓缩以及纯化含病毒组合物的方法
本申请还公开了一种新的使用切向流过滤(此后有时称为“TFF”)稳定地浓缩现有病毒制剂的方法，该方法使人们易于选择和制备各种需要浓度的临床剂量。浓缩病毒制剂的新方法包括：
(a)将多羟基烃加入病毒制剂中至多羟基烃终浓度约为20％或以上；和
(b)使所述病毒制剂经过一个过滤过程，其中对所述制剂施加压力，以致通过滤器使稀释剂从病毒制剂中去除而保留病毒，从而提高病毒浓度。
本发明方法适用于各种病毒，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒、反转录病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、轮状病毒等；特别优选腺病毒。所述病毒优选为重组病毒，但是可以包括临床分离物、减毒疫苗株等。本发明特别适用于浓缩携带用于基因治疗的异种转基因的重组病毒。这类病毒特别易受潜在的去稳定力的损害，如另外的伴随浓缩病毒制剂方法的剪切机械力。能够用本发明方法浓缩的典型重组腺病毒是A/C/N/53，它公开于PCT专利申请WO 95/11984号中。
用来按照本发明方法浓缩病毒的过滤方法可以包括任何过滤方法(例如超滤)，其中加压使稀释剂通过一个滤器，该方式使得所述稀释剂从所述病毒制剂中去除，而所述病毒不能通过滤器而由此以浓缩形式留存于所述病毒制剂中，从而提高病毒浓度。在例如微量过滤和超滤：原理和应用，L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekkar，Inc.，NewYork，NY，1996)中有关于超滤的详细描述。特别优选的过滤方法是描述于例如MILLEPORE目录标题为“Pharmaceutical Process FiltrationCatalogue”第177-202页(Bedford，Massachusetts，1995/96)中的切向流过滤(“TFF”)。优选的TFF装置包括Millipore公司，80 Ashby Rd.，Bedford，Massachusetts(国际互联网网址：www.millipore.com)的Pellicon II或Pellicon XL过滤系统，特别优选Pellicon XL系统。在优选的实施方案中，本发明方法在约2℃-27℃温度范围内进行。
可以使用其它浓缩方法来浓缩按照本发明的病毒制剂。例如，可以有利地使用多羟基烃来通过离心浓缩病毒制剂。因此，本发明也提供浓缩病毒制剂的方法，包括：
(a)离心包括如下层的组合物：包含35％-80％(v/v)浓度的多羟基烃的第一层，所述第一层上覆盖含有5％-30％(v/v)浓度的多羟基烃的第二层，第二层上覆盖含有病毒的第三层；和
(b)从第一层回收病毒。
例如，可以采用Beckman离心机的吊桶式转子以3,200g低速离心浓缩腺病毒制剂。为此，将所述病毒制剂放入多个5ml试管中，每一试管在管底的第一层中含有6.25％体积的70％甘油，其上为2.5％体积的20％甘油，最上层为病毒制剂。然后，以3,200g于4℃离心所述制剂约16小时，以把浓缩的病毒沉淀入甘油层，然后将新浓缩的病毒制剂从第一层回收。用上述方法浓缩的病毒具有良好的光散射特性以及合适的感染特性。
关于用于本发明方法中的多羟基烃，“多羟基烃”是指2个或2个以上(优选2-6、更优选2-4个)羟基取代的支链、直链或环状化合物。多羟基烃的有效量是足以稳定病毒抗潜在去稳定力如在浓缩过程中产生的机械剪切力的量。在本发明浓缩病毒方法中的多羟基烃最低浓度最好为20％，更优选25％。用于本发明的多羟基烃优选为优选具有2-7个碳原子的多羟基取代的烷基化合物(支链或直链)，可以包括甘油、山梨醇和聚丙醇。特别优选甘油。
本发明人提高病毒浓度的新方法的另外一个优势是：例如通过使在各种加工步骤如尺寸排阻色谱法中的物料通过量明显增加从而解决瓶颈问题，提高加工效率。所以，在优选的实施方案中，浓缩按照本发明的病毒制剂的方法适用于纯化病毒的方法，其中在阴离子交换色谱法后进行尺寸排阻色谱法步骤(例如凝胶过滤)。在该实施方案中，对病毒稳定性的另外的威胁不仅来自在限制速率的尺寸排阻色谱法步骤前浓缩病毒需要的机械剪切力，而且由于这样的事实：从阴离子交换色谱法步骤洗脱的病毒制剂通常含有高浓度盐和其它进一步危及病毒稳定性的可能杂质。因此，在特别优选的实施方案中，本发明提供纯化病毒制剂的方法，包括：
(a)使病毒制剂经过阴离子交换色谱法，其中从阴离子交换色谱的介质中洗脱作为病毒制剂产品的病毒；
(b)向步骤(a)病毒制剂产品中加入多羟基烃，使制剂中的多羟基烃浓度达到最终浓度约25％或以上；以及
(c)通过对所述制剂施以压力，以致通过滤器从病毒制剂中去除稀释剂而保留病毒，从而提高步骤(b)病毒制剂产品中的病毒的浓度；和
(d)再使步骤(c)的浓缩病毒制剂产品经过一次或一次以上另外的加工步骤。
在以上关于阴离子交换色谱法的优选实施方案中，最小甘油浓度为25％(而不是在本发明浓缩方法的普通应用中的20％最小浓度)，因为该特定应用必须考虑从阴离子交换柱洗脱的产物中的高盐浓度对稳定性造成的另外的威胁。加入25％甘油(优选30％)使含盐的DEAE合并部分(pool)在例如4℃下稳定10天以上；所以病毒浓缩和/或凝胶过滤的后续步骤可以在具有显著灵活性的10天时间内的不同时间进行。将会认识到的是，当所述病毒制剂因其它加工条件含盐量高时，25％或以上较高浓度的多羟基烃也可以用于本发明的方法中。
V.本发明方法的实施例
以下实施例说明本发明的优选实施方案；不能认为本发明范围受其限制。
简要综述-用来自发酵回收的冷冻粗病毒物质开始成批浓缩。在一个实施方案中，首先用阴离子交换色谱法纯化腺病毒制品。然后，在将所述制剂加样至尺寸排阻柱之前，在30％(v/v)甘油存在下经切向流过滤(TFF)可以浓缩阴离子交换合并部分。或者，在另一实施方案中，所述TFF浓缩步骤可以在尺寸排阻色谱法之后，在存在20％(v/v)或以上(优选25％)甘油的情况下进行。
·在TFF之前经阳离子交换色谱法制备原料
在优选的实施方案中，制备腺病毒阴离子交换合并部分用于如下浓缩。解冻得自发酵以及回收步骤的冷冻病毒物质，通过0.45μm亲水性膜过滤。加入4M氯化钠调节滤液的盐浓度。然后将该原料液加样于Fractogel EMD DEAE-650M柱，该柱已经用50mM磷酸钠pH7.5、260mM氯化钠、2mM氯化镁、2％(w/v)蔗糖(缓冲液A)预平衡。腺病毒结合到阴离子交换树脂上，而大部分介质和宿主细胞杂质通过柱，成为废料。该柱开始用4体积的缓冲液A洗涤，然后用8柱床体积的94％缓冲液A和6％缓冲液B(50mM磷酸钠pH7.5、600mM氯化钠、2mM氯化镁、2％(w/v)蔗糖)第二等度洗液洗涤，以去除另外的杂质。用30柱床体积的线性梯度的6％-100％缓冲液B从所述柱洗脱出病毒。收集通过A280确定的洗脱分布的腺病毒峰部分。向所述DEAE合并部分中加入甘油至终浓度为30％(v/v)以进一步加工。
·采用切向流过滤浓缩DEAE合并部分
采用Millipore TFF单元(Pellicon XL System)，带有1,000,000分子量截留Biomax膜将DEAE合并部分(按以上所述制备)浓缩至10-20倍。该过程在2-10℃或室温(25℃)下进行。该方法中使用以下过滤参数：平均入口压力＝14磅/平方英寸；平均渗透压＝0磅/平方英寸；平均流速＝13升/小时-平方米。腺病毒终浓度约1.0-2.0×1013颗粒/ml。根据Resource Q-HPLC和UV吸光度(A260)分析，浓缩步骤的回收率高于80％，并具有明显的聚集(用A320/A260进行光散射测定)。
·经尺寸排阻色谱法(凝胶过滤)进行缓冲剂交换
将浓缩的腺病毒制剂加样于用20mM磷酸钠pH 8.0、100mM氯化钠、2mM氯化镁、2％(w/v)蔗糖、10％甘油(缓冲液C)或11mM磷酸钠、14mM Tris、2mM氯化镁、2％(w/v)蔗糖、10％甘油pH 7.8(缓冲液D)预平衡的Superdex-200尺寸排阻柱上。用平衡缓冲液洗脱柱。收集并合并通过A280确定的洗脱分布的腺病毒峰部分。将所浓缩的腺病毒制剂于2-10℃通过0.2μm亲水性Durapore膜(Stericup，Millipore)过滤，并可贮藏于-80℃或较高的室温(如2-10℃)下。
·用切向流过滤浓缩Superdex-200合并部分
如上所述，本发明的优选实施方案包括在阴离子交换色谱法之后，但是在凝胶过滤之前浓缩病毒。然而，在另一实施方案中，所公开的浓缩病毒制剂的方法也可以在凝胶过滤步骤之后使用(即使在阴离子交换步骤和凝胶过滤步骤之间不使用病毒浓缩步骤)。在这种情况下，过滤参数与浓缩DEAE合并部分的过滤参数相同，不同的是向Superdex-200合并部分加入的多羟基烃(例如甘油)的终浓度可以低至20％(v/v)，因为不必再处理DEAE合并部分中的高盐浓度。在该方面，应该注意的是，在加入多羟基烃被推迟至凝胶过滤之后的情况下，DEAE合并部分应该立即加样于凝胶过滤柱(因为含有高浓度盐，DEAE合并部分易受损害)。由此可见，向DEAE合并部分(按照本发明)加入多羟基烃的另外的优势是增加了阴离子交换色谱法和后续加工之间的时间间隔和贮藏条件选择方面的灵活性。
浓缩病毒制剂的方法可以与各种纯化方法结合使用。对于其它纯化方法的资料，可以参考例如Huyghe等，Human Gene Therapy，第6卷，第1403-1416页(1995)和美国专利申请系列号08/989,227，所述文献特别通过引用结合到本文中。
VI.用切向流过滤浓缩病毒制剂的方法的稳定性数据
如以下实验数据所示，本发明的方法尽管存在浓缩病毒的机械剪切力以及苛刻的条件如DEAE合并部分中的高盐浓度，但是可以显著增强病毒稳定性。所以，本发明方法尤其可用于(1)预制备任何需要浓度的临床剂量(甚至使用较低浓度的原料开始时)，(2)提高加工效率(例如通过使在尺寸排阻色谱法期间的物料通过量明显提高)，以及(3)使含盐DEAE合并部分在2-10℃下稳定保藏10天以上，由此使得病毒浓缩和/或凝胶过滤的后续步骤可以在具有显著灵活性的10天内的不同时间进行。
A.在DEAE色谱法后浓缩病毒
在以下3个实施例中，通过在30％甘油中浓缩DEAE合并部分(按照本发明方法)制备稳定浓度的腺病毒。然后使所述制剂经Superdex-200凝胶过滤色谱法进一步纯化，获得供测试的最终配方。
实施例D-1
最终配方：20mM NaPi，100mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖，10％
          甘油，pH 8，2-10℃。
结果：颗粒/FACS＝24
      光散射(A320/A260)＝0.22
      浓度＝1.6×1013颗粒/ml
实施例D-2
最终配方：14mM Tris碱，11mM NaPi，2mM MgCl2，2％蔗糖，
          10％甘油，pH 7.8，2-10℃。
结果：颗粒/FACS＝17
      光散射(A320/A260)＝0.25
      浓度＝1.5×1013颗粒/ml
实施例D-3
最终配方：20mM NaPi，100mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖，
          10％甘油，pH 8，2-10℃。
结果：颗粒/FACS＝24
      光散射(A320/A260)＝0.25
      浓度＝1.3×1013颗粒/ml
B.在凝胶过滤后浓缩病毒
实施例S-1
在以下实施例中，于凝胶过滤后在20％甘油中浓缩病毒制剂。
最终配方：16mM NaPi，80mM NaCl，1.6mM MgCl2，1.6％蔗糖，
          20％甘油，pH8，2-10℃。
结果：颗粒/FACS＝72
      光散射(A320/A260)＝0.26
      浓度＝1.66×1013颗粒/ml
本发明所引用的所有公开出版物、专利和专利申请整体通过引用结合到本文中，其引用程度与单独将各个单独的出版物、专利或专利申请引用结合的程度相同。
对本发明进行的各种改进和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅仅作为实例给出，不能认为本发明受其限制。

Claims (17)

1.一种用来维持腺病毒稳定性的、含腺病毒的组合物，其中腺病毒存在于含有20-200mg/mL甘油、蔗糖和一个在2℃-27℃温度范围内维持pH7-8.5的缓冲系统的配方中，该缓冲系统含有磷酸二氢钠二水合物和氨基丁三醇。
2.权利要求1的组合物，其中蔗糖的浓度为5-25mg/mL。
3.权利要求1的组合物，其中所述磷酸二氢钠二水合物浓度为0.5-10mg/mL，所述氨基丁三醇浓度为0.5-10mg/mL。
4.权利要求1的组合物，还含有二价金属盐。
5.权利要求4的组合物，所述二价金属盐为氯化镁。
6.权利要求5的组合物，所述氯化镁的浓度为0.1-1mg/mL。
7.权利要求6的组合物，其中所述蔗糖的浓度为5-25mg/mL。
8.权利要求7的组合物，其中所述磷酸二氢钠二水合物浓度为0.5-10mg/mL，所述氨基丁三醇浓度为0.5-10mg/mL。
9.权利要求8的组合物，其中所述甘油浓度为100mg/mL，所述蔗糖的浓度为20mg/mL，所述磷酸二氢钠二水合物浓度为1.7mg/mL，所述氨基丁三醇浓度为1.7mg/mL，所述氯化镁的浓度为0.4mg/mL。
10.权利要求1的组合物，还含有表面活性剂。
11.权利要求10的组合物，所述表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇酐。
12.权利要求11的组合物，所述聚氧乙烯山梨醇酐为Polysorbate80。
13.权利要求12的组合物，所述Polysorbate 80的浓度为0.03-0.3mg/mL。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，所述腺病毒的浓度为1×109-1×1013病毒颗粒/mL。
15.权利要求1的组合物，其中所述腺病毒为重组腺病毒。
16.权利要求1的组合物，其中在该组合物中的腺病毒在4℃下在两个星期内是稳定的。
17.权利要求1的组合物，其中在该组合物中的腺病毒在25℃下在一个星期内是稳定的。
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