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I. BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die Viren enthalten,
insbesondere virale Vektoren, die eine wesentlich verbesserte Stabilität aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
sind zum Erhalten der Stabilität
von Viren während
der Lagerung nützlich,
und erfindungsgemäße, Virus-enthaltende
Zusammensetzungen sind für
therapeutische Zwecke, wie zum Beispiel Gentherapie besonders nützlich. Neue
Verfahren zum Konzentrieren und Aufreinigen von Viruszubereitungen
werden ebenfalls bereitgestellt.
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II. HINTERGRUND
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Für therapeutische
Verwendungen, wie beispielsweise Impfungen und Gentherapie sind
Viren zunehmend wichtig geworden, und es gibt ein Bedürfnis, stabile,
Virus-enthaltende Zusammensetzungen zu entwickeln und zuzubereiten,
die einfach gelagert und transportiert werden können, und dennoch ausreichend
Sicherheit und Wirksamkeit behalten. Insbesondere ist es angesichts
der intensiven Benutzung von viralen Vektoren in der Gentherapie
wichtig, Formulierungen zu entwickeln und zuzubereiten, die lebende
rekombinante Viren stabil aufbewahren können, wenn diese therapeutische
Transgene tragen.
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Weiterhin
gibt es ein entscheidendes Bedürfnis
nach Formulierungen, die virale Zubereitungen bei Temperaturen über -80 °C für längere Zeiträume stabilisieren
können.
Virus-enthaltende
Zubereitungen benötigen
normalerweise eine Lagerung bei -80 °C und können bei Standardkühlschranktemperaturen
(z.B. 2 °C bis
8 °C oder
höher)
nicht für
umfangreiche Zeiträume
gelagert werden. Diese Einschränkung
stellt ein ernstes Hindernis nicht nur für die Lagerung, sondern auch
für das
Weiterverarbeiten, den Vertrieb und die weit verbreitete klinische
Verwendung dar.
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Es
gibt auch ein Bedürfnis,
Virus-enthaltende Zusammensetzungen zu entwickeln, die für längere Zeiträume einen
pH-Wert in dem Bereich von ungefähr
7 bis ungefähr
8,5 beibehalten können,
obwohl sie Kühlschranktemperaturen
ausgesetzt sind, und obwohl sie rauen Bedingungen ausgesetzt sind,
wie beispielsweise Gefrieren/Tauen, insbesondere den langsamen Geschwindigkeiten
des Gefrieren/Tauens, die in Verbindung mit Herstellen im großen Maßstab, Handhaben
oder Verteilen auftreten können.
Das Aufrechterhalten des pH ist für virale Zubereitungen wichtig,
da bei einem pH unter 7,0 und über
8,5 die lebenden Viruspartikel wegen der physikalischen und biologischen
Instabilität
anfällig
sind, an Lebensfähigkeit
zu verlieren.
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Zusätzliche
Probleme sind mit dem Erhöhen
der Viruskonzentration verbunden. Insbesondere tragen hohe Viruskonzentrationen
wesentlich zur Virusinstabilität
bei. Jedoch werden zunehmend höhere
Konzentrationen an Virus und viralen Vektoren für therapeutische Zwecke benötigt. Daher
gibt es ein entscheidendes Bedürfnis,
Formulierungen zu entwickeln, die verhältnismäßig hohe Konzentrationen an
Virus stabilisieren, insbesondere unter den rauen Bedingungen, die
oben genannt werden. Und zusätzlich
gibt es ein besonderes Bedürfnis,
neue Verfahren des Konzentrierens einer bestehenden Viruszubereitung
zu entwickeln, um stabile Zubereitungen bei höheren Konzentrationsniveaus
zu erhalten. Die Probleme der Instabilität, die mit höheren Viruskonzentrationen
in Verbindung stehen, werden entscheidend verschlimmert, wenn man
versucht, eine bestehende Viruszubereitung aufzukonzentrieren. Dies
liegt zum Teil an den zusätzlichen
mechanischen Scherkräften,
die während
den Bemühungen
zum Tragen kommen, die Konzentration einer bestehenden Viruspräparation
zu erhöhen.
Wenn es einem gelingen sollte, ein Verfahren zum Konzentrieren einer
Viruszubereitung zu finden, ohne die Virusstabilität wesentlich
zu beeinträch tigen,
dann könnten
klinische Dosierungen mit jeder gewünschten Konzentration leicht
hergestellt werden (sogar, wenn mit Material begonnen wird, das eine
niedrigere Konzentration aufweist) und, wichtiger, das Vermögen, Virus
aufzukonzentrieren, könnte
problematische Engpässe
und andere Probleme mit dem Heraufskalieren während des Aufreinigungsprozesses eliminieren,
indem ein signifikant höherer
Durchsatz während
der verschiedenen Prozessierungsschritte, wie beispielsweise der
Ausschlusschromatographie ermöglicht
wird.
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Folglich
gibt es ein Bedürfnis
für Materialien
und Verfahren, um die vorangehend genannten Ziele zu erreichen.
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III. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur
Aufreinigung einer Viruszubereitung bereit, bei dem man:
- (a) die Viruszubereitung einer Anionenaustauschchromatographie
unterzieht, wobei das Virus als ein Viruszubereitungsprodukt aus
einem Anionenaustauschchromatographiemedium eluiert wird;
- (b) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem Viruszubereitungsprodukt
aus Schritt (a) zugibt, so dass die Konzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs
in der Zubereitung ein Niveau von 25 % oder mehr erreicht;
- (c) die Konzentration des Virus in dem Viruszubereitungsprodukt
aus Schritt (b) durch Anwenden eines Druckes auf die Zubereitung,
so dass ein Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter
entfernt wird, während
das Virus zurückgehalten
wird, steigert; und
- (d) das konzentrierte Viruszubereitungsprodukt aus Schritt
- (c) einem oder mehreren zusätzlichen
Verfahrensschritten unterzieht.
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Der
Polyhydroxykohlenwasserstoff ist vorzugsweise eine verzweigte oder
unverzweigte Polyhydroxy-substituierte Alkylverbindung, die 2 bis
7 Kohlenstoffatome aufweist.
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Der
Polyhydroxykohlenwasserstoff ist vorzugsweise Glycerin.
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Der
zusätzliche
Verfahrensschritt umfaßt
vorzugsweise eine Größenausschlußchromatographie.
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Der
Prozess aus Schritt (c) umfaßt
vorzugsweise eine Tangentialflussfiltration.
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Der
Prozess aus Schritt (c) wird vorzugsweise unter Verwendung eines
Geräts
ausgeführt,
das ein Pellicon XL Filtrationssystem umfaßt.
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Das
Virus ist vorzugsweise ein rekombinantes Virus.
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Das
Virus ist vorzugsweise ein rekombinantes Virus, welches ein therapeutisches
Transgen für
die Verwendung bei einer Gentherapie trägt.
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Das
Virus ist vorzugsweise ein Adenovirus.
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Die
Viruszubereitung aus Schritt (b) umfaßt vorzugsweise ferner ein
Disaccharid.
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Das
Disaccharid ist vorzugsweise Saccharose.
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Die
Temperatur der Viruszubereitung liegt vorzugsweise im Bereich von
ungefähr
2 0C bis ungefähr 27 0C.
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Ebenfalls
offenbart ist eine stabile Zusammensetzung, die Virus in einer Formulierung
umfaßt,
die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff umfaßt, der gepuffert ist, um den
pH in einem Bereich von ungefähr
7 bis ungefähr
8,5 bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 2 0C
bis 27 0C zu halten.
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Neue
Verfahren zum Konzentrieren einer bestehenden Viruszubereitung werden
ebenfalls offenbart, die es einem erlauben, klinische Dosierungen
in einem weiten Bereich gewünschter
Konzentrationen leicht auszuwählen
und herzustellen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Konzentrieren einer
Viruszubereitung umfasst Schritte, bei denen man:
- (a)
einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu einer Viruszubereitung bis
zu einer Endkonzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs von
ungefähr
20 % oder mehr zugibt, und
- (b) die Viruszubereitung einem Filtrationsverfahren unterzieht,
wobei die Viruskonzentration durch Anlegen von Druck an die Zubereitung
erhöht
wird, so dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter
entfernt wird, während
das Virus zurückgehalten
wird.
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Hier
ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung,
das Schritte umfasst, bei denen man:
- (a) eine
Zubereitung zentrifugiert, die eine erste Schicht umfasst, die einen
Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von 35 % bis
80 % (v/v) umfasst, wobei die erste Schicht mit einer zweiten Schicht überschichtet
ist, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration
von 5 % bis 30 % (v/v) umfasst, wobei die zweite Schicht mit einer
dritten Schicht überschichtet
ist, die das Virus umfasst, und
- (b) das Virus aus der ersten Schicht gewinnt.
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Weiterhin
haben die gegenwärtigen
Erfinder herausgefunden, dass ihr neues Verfahren des Erhöhens der
Viruskonzentration den zusätzlichen
Vorteil des Verbesserns des weiteren Verarbeitens (z.B. durch Verringern
oder Vermeiden problematischer Engpässe während der nachfolgenden Aufreinigung
durch Ermöglichen eines
wesentlich höheren
Durchsatzes während
der Verarbeitungsschritte wie beispielsweise der Größenausschlusschromatographie)
aufweist. Daher umfasst das Verfahren des Konzentrierens von Viruszubereitungen gemäß der vorliegenden
Offenbarung in einer bevorzugten Ausführungsform weiterhin einen
nachfolgenden Aufreinigungsschritt (z.B. Größenausschlusschromatographie).
In dieser Hinsicht ist das Verfahren besonders nützlich, wenn ein Schritt der
Größenausschlusschromatographie
im Anschluss an Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird,
und die Viruszubereitung nach der Ionenaustauschchromatographie,
aber vor der Größenausschlusschromatographie
aufkonzentriert wird (gemäß der vorliegenden
Offenbarung). Virale Fraktionen, die beispielsweise über Anionenaustauschchromatographie
erhalten werden, enthalten üblicherweise hohe
Gehalte von Salzen und möglicherweise
anderen Verunreinigungen, welche die Virusstabilität während der
Konzentrierungsverfahren weiter beeinträchtigen. Daher wird ein Verfahren
zum Aufreinigen einer Viruszubereitung bereitgestellt, das Schritte
umfasst, bei denen man:
- (a) die Viruszubereitung
einer Anionenaustauschchromatographie unterzieht, wobei das Virus
als ein Viruszubereitungsprodukt aus einem Anionenaustauschchromatographiemedium
eluiert wird,
- (b) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem Viruszubereitungsprodukt
aus Schritt (a) zugibt, so dass die Konzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs
in der Zubereitung eine Endkonzentration von ungefähr 25 %
oder mehr erreicht, und
- (c) die Viruskonzentration in dem Viruszubereitungsprodukt aus
Schritt (b) durch Anlegen von Druck an die Zubereitung erhöht wird,
so dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen Filter
entfernt wird, während
das Virus zurückgehalten
wird, und
- (d) das konzentrierte Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (c)
einem oder mehreren zusätzlichen
Verarbeitungsschritten unterzogen wird.
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Viruszubereitungen,
die durch das vorangehende Verfahren aufgereinigt worden sind, werden
ebenfalls bereitgestellt.
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IV. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Wie
oben angegeben, offenbart die vorliegende Anmeldung neue Virus-enthaltende
Zusammensetzungen ebenso wie neue Verfahren zum Konzentrieren und
Aufreinigen von Virus-enthaltenen Zusammensetzungen.
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Im
Hinblick auf Zusammensetzungen haben die gegenwärtigen Erfinder eine neue gepufferte
Formulierung entwickelt, die virale Zubereitungen mit erhöhter Stabilität konservieren
kann. Insbesondere kann die Formulierung virale Zubereitungen bei
Temperaturen deutlich über
-80 °C stabilisieren.
Es ist noch wichtiger, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bei üblichen
Kühlschranktemperaturen
von zum Beispiel 2 °C
bis 8 °C
oder mehr für
beträchtliche
Zeiträume,
bevorzugt für
meh rere Monate oder länger
stabil sind. Dies ist ein entscheidender Vorteil, da es, wie oben
erwähnt,
unpraktisch ist, virale Zubereitungen während der Lagerung und des
Transportes bei -80 °C
gefroren zu lagern, um klinische Bedürfnisse zu erfüllen.
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Ein
wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Zugabe eines
Polyhydroxykohlenwasserstoffs. Ein Polyhydroxykohlenwasserstoff,
wie er hier verwendet wird, meint eine verzweigte, lineare oder
zyklische Verbindung, die mit zwei oder mehr (vorzugsweise 2-6,
bevorzugter 2-4) Hydroxygruppen substituiert ist. Für die Verwendung
in der vorliegenden Erfindung sind Polyhydroxykohlenwasserstoffe
vorzugsweise Polyhydroxysubstituierte Alkylverbindungen (verzweigt
oder unverzweigt), die vorzugsweise 2-7 Kohlenstoffatome aufweisen,
und zum Beispiel Glycerin, Sorbitol und Polypropanol umfassen können. Glycerin
ist insbesondere bevorzugt. Wie durch die unten gezeigten Daten
gezeigt wird, haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, daß Glycerin überraschend
hohe Niveaus an Stabilität
für verlängerte Zeitperioden
selbst unter Standard-Kühlbedingungen
erlaubt.
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Eine
wirksame Menge eines Polyhydroxykohlenwasserstoffs für Zusammensetzungen,
die hier offenbart sind, ist eine Menge, die ausreichend ist, das
Virus in der Formulierung der vorliegenden Erfindung zu stabilisieren,
ohne die Wirksamkeit des Virus für
weitere Verwendungen ungünstig
zu beeinflussen, insbesondere in Fällen, in denen das Virus ein
Transgen für
die Verwendung bei einer Gentherapie enthält. Der Polyhydroxykohlenwasserstoff
ist vorzugsweise bei einer Endkonzentration von ungefähr 20 bis
200 mg/ml vorhanden. Ein engerer Bereich kann 80-120 mg/ml sein.
Mehr als ein Polyhydroxykohlenwasserstoff kann verwendet werden,
um die gewünschte
Gesamtmenge des Polyhydroxykohlenwasserstoffs in der Zusammensetzung,
die hier offenbart ist, zu erreichen.
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Der
Polyhydroxykohlenwasserstoff, der in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, kann optional eine Aldehyd-Gruppe enthalten. Insbesondere
kann der Polyhydroxykohlenwasserstoff ein Disaccharid wie beispielsweise
Saccharose sein. Des weiteren kann die Zusammensetzung zusätzlich ein
Disaccharid wie beispielsweise Saccharose als Stabilisator und Tonizität einstellendes
Agens umfassen, selbst wenn der Polyhydroxykohlenwasserstoff, der
für die
Zusammensetzung ausgewählt
ist, keine Aldehyd-Gruppe enthält.
Wenn die Zusammensetzung, die hier offenbart ist, bereits einen
geeigneten Polyhydroxykohlenwasserstoff (wie beispielsweise Glycerin)
enthält
und ein Disaccharid in bevorzugten Ausführungsformen als ein zusätzlicher
Stabilisator oder Tonizitäts-einstellendes
Agens eingesetzt wird, ist das Disaccharid vorzugsweise im Bereich
von 5 bis 25 mg/ml, mehr bevorzugt 20 mg/ml vorhanden und das Disaccharid
ist vorzugsweise Saccharose.
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Pharmazeutisch
verträgliche
divalente Metallsalzstabilisatoren, wie beispielsweise Magnesiumsalze, Zinksalze
und Calciumsalze werden in bevorzugten Ausführungsformen der hier offenbarten
Zusammensetzung verwendet. Bevorzugt ist das Salz ein Chloridsalz
oder ein Magnesiumsalz, wobei Magnesiumsalz besonders bevorzugt
wird. Bevorzugt liegt das Salz (zum Beispiel das Magnesiumsalz)
in einer Menge von ungefähr
0,1 bis 1 mg/ml, bevorzugt in einer Menge von ungefähr 0,4 mg/ml
vor.
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Pharmazeutisch
verträgliche
monovalente Metallsalzstabilisatoren, wie beispielsweise Kalium-,
Natrium-, Lithium- und Cäsiumsalze
können
in bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung als fakultative Stabilisatoren enthalten
sein. Bevorzugt ist das Salz Natriumchlorid, das in der Menge von
0,6 bis 10,0 mg/ml, bevorzugter in einer Menge von ungefähr 5,8 mg/ml
vorliegt.
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Zusätzlich zu
dem Stabilisieren der Zusammensetzung kann Natriumchlorid die Geschwindigkeit
und das Ausmaß des
Auftretens von Nebenprodukten der Fermentation unterdrücken, was
zu einer pharmazeutisch eleganteren Präsentation führt, die ein reduziertes Antigenitätspotential
durch Proteinaggregate aufweist. Die Zugabe von Natriumchlorid beeinflusst
den pH der Formulierung nicht.
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Die
hier offenbarte Zusammensetzung ist in der Lage, einen pH in dem
Bereich von ungefähr
7 bis ungefähr
8,5 für
längere
Zeiträume
zu erhalten, sogar wenn diese rauen Bedingungen wie (Tief)Kühlen und Gefrieren/Tauen
ausgesetzt ist. Zudem können
die Zusammensetzungen stabil bleiben und den gewünschten pH-Bereich erhalten,
sogar wenn sie den verhältnismäßig langsamen
Geschwindigkeiten des Gefrieren/Tauens unterzogen werden, die in
Verbindung mit großformatiger
Herstellung, Verteilung und Handhabung auftreten. Wie oben angegeben,
ist ein Erhalten des pH für
virale Zubereitungen wichtig, da bei einem pH unter 7,0 und über 8,5
die lebenden Viruspartikel instabil werden können und degradieren. Die besondere
Zusammensetzung von Viren macht es schwierig, Viren zu stabilisieren
und zu konservieren.
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Um
das Erhalten des pHs bei rauen Bedingungen zu erreichen, verwendet
die vorliegende Erfindung ein Puffersystem, das einen optimalen
pH in einem Bereich von ungefähr
7,0 bis ungefähr
8,5 trotz Lagerung zwischen -80 °C
und 27 °C
und trotz dem Aussetzten gegenüber
Bedingungen des Gefrieren/Tauens erhalten kann. Da der pH in Abhängigkeit
von der Temperatur variieren kann, werden die pH-Bereiche der vorliegenden Erfindung
unten mit Bezug auf spezifische Temperaturbereiche eingehender veranschaulicht.
Beispielsweise beträgt
bei Kühlschranktemperaturen
(zum Beispiel ungefähr
2 °C bis
8 °C) ein
bevorzugter pH-Bereich ungefähr
7,7 bis ungefähr
8,3, bevorzugter ungefähr
7,9 bis ungefähr
8,2. Bei Raumtemperatur (zum Beispiel ungefähr 20 °C bis 27 °C, bevorzugter 22 °C bis 25 °C) beträgt ein bevorzugter
pH-Bereich ungefähr
7,3 bis ungefähr
8,2, bevorzugter ungefähr
7,4 bis ungefähr
7,9.
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Ein
bevorzugtes Puffersystem der vorliegenden Erfindung umfaßt Natriumphosphat-Dihydrat,
monobasisch, in einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis 10 mg/ml und Trometamol
in einer Konzentration von ungefähr
0,5 bis 10 mg/ml. (Trometamol ist auch als TRIS oder "Trizma" bekannt, das von
Sigma Chemical Co. erhältlich
ist). Jedoch können
auch andere Puffersysteme verwendet werden. Beispielsweise kann
zweibasisches Natriumphosphatdihydrat verwendet werden, wenn es
mit einer sauren Form des Tris-Puffers gepaart ist. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Puffersystem Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch,
in einer Konzentration von ungefähr
1,7 mg/ml und Trometamol in einer Konzentration von ungefähr 1,7 mg/ml
und hat die Fähigkeit,
die Formulierung in einem optimalen pH-Bereich von ungefähr 7,3 bis ungefähr 7,9 bei
25 °C zu
halten.
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Die
hier offenbarte Formulierung hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie
die Fähigkeit
hat, hohe Viruskonzentrationen bei den oben genannten rauen Bedingungen
(wie beispielsweise Kühlschranktemperaturen und
Gefrier/Tau-Verarbeitung) zu stabilisieren. Insbesondere kann die
Formulierung die Stabilität
des Virus bei Konzentrationen erhalten, die bis zu 1 × 1013 Partikel/ml reichen. Ein bevorzugter Bereich
der Viruskonzentrationen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
liegt bei einer Menge von 1 × 109 bis 1 × 1013 Partikel/ml, bevorzugter bei bis zu 1 × 1012 Partikel/ml, zum Beispiel 1 × 109 (oder 1 × 1010)
bis 1 × 1012.
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Der
Begriff "Streckmittel", wie er hier verwendet
wird, kann ein Lösungsmittel
(zum Beispiel Wasser, bevorzugt steriles Wasser) oder eine Mischung
eines Lösungsmittels
mit ande ren Inhaltsstoffen, wie beispielsweise zusätzlichen
Lösungsmitteln,
zusätzlichen
Stabilisatoren, zusätzlichen
Puffern und/oder anderen Substanzen umfassen, welche die Sicherheit,
Wirksamkeit und Stabilität
der Formulierung nicht negativ beeinflussen. Hinsichtlich der Streckmittel,
Stabilisatoren, Puffer und dergleichen wird Bezug genommen auf zum
Beispiel Remington's
Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvania.
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Ein
Tensid, bevorzugt ein nicht-ionisches Detergens, wie beispielsweise
ein Polyoxyethylen-Fettsäureester
(zum Beispiel Polyoxyethylensorbitane wie beispielsweise Polysorbat
20, Polysorbat 40, Polysorbat 60 oder Polysorbat 80 von ICI Americas,
Inc., Wilmington Delaware oder Tween 20, Tween 40, Tween 60 und Tween
80 von Sigma, St. Louis, Mo.) können
wahlweise in die hier offenbarten Zusammensetzungen eingeschlossen
werden. Bevorzugt ist das nicht-ionische Detergens ein Palyoxyethylen-Fettsäureester
und der Polyoxyethylen-Fettsäreester
ist bevorzugt Polysorbat 80, das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
als ein Stabilisator wirken kann. Die Konzentration des nicht-ionischen
Detergens liegt bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,3 mg/ml,
bevorzugter 0,15 mg/ml.
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Die
hier offenbarten Zusammensetzungen können weiterhin ein oder mehrere "die Verabreichung
verbessernde(s) Mittel" enthalten.
Ein "die Verabreichung
verbesserndes Mittel" bezieht
sich auf jedes Mittel, das die Verabreichung eines therapeutischen
Gens, wie beispielsweise eines Tumorsuppressorgens an ein kanzeröses Gewebe
oder Organ verbessert. Beispiele solcher die Verabreichung verbessernder
Mittel beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Detergenzien, Alkohole,
Glykole, Tenside, Gallensalze, Heparinantagonisten, Cyclooxygenaseinhibitoren,
hypertonische Salzlösungen
und Acetate.
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Detergenzien
(wie der Begriff hier benutzt wird) können anionische, kationische,
zwitterionische und nicht-ionische Detergenzien einschließen. Beispielhafte
Detergenzien schließen
Taurocholat, Deoxycholat, Taurodeoxycholat, Cetylpyridium, Benalkoniumchlorid,
ZWITTERGENT® 3-14-Detergens,
CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol)-1-propansulfonathydrat,
Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, TRITON®-X-100-Detergens,
C12E8, Octyl-B-D-Glucopyranosid, PLURONIC®-F68-Detergens,
TWEEN® 20-Detergens
und TWEEN® 80-Detergens
(CALBIOCHEM® Biochemicals)
ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
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Die
Verwendung von die Verabreichung verbessernden Mitteln wird im Detail
in der ebenfalls anhängigen
US-Patentanmeldung U.S.S.N. 08/889,335, eingereicht am 8. Juli 1997,
und der Internationalen Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer
WO 97/25072 , 17. Juli 1997,
und in der US-Patentanmeldung U.S.S.N. 09/112,074, eingereicht am
8. Juli 1998, der Internationalen Anmeldung
PCT/US98/14241 beschrieben. Zusätzlich wird
die Verwendung von Calpain-Inhibitoren in Verbindung mit viralen
Vektoren zum Erhöhen
der Transduktionseffizienz in den US-Patentanmeldungen U.S.S.N. 09/172,685
und 60/104321, eingereicht am 15. Oktober 1998, beschrieben.
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Ein
großer
Bereich von Viren kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Adenoviren, Pockenviren, Iridoviren, Herpesviren, Papovaviren,
Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Retroviren, Adenoassoziiertes Virus,
Vaccinia-Virus, Rotaviren etc. (siehe zum Beispiel Anderson, Science
(1992) 256: 808-813), wobei Adenoviren insbesondere bevorzugt sind.
Die Viren sind bevorzugt rekombinante Viren, können aber klinische Isolate,
attenuierte Impfstoffstämme
und so weiter einschließen.
So ist beispielsweise A/C/N/53 ein exemplarisches rekombinantes
Adenovirus, das in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet
wer den kann, und das in der PCT-Patentanmeldung mit der Nummer
WO 95/11984 offenbart wird.
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Die
hier offenbarte Formulierung ist zum Stabilisieren eines rekombinanten
Virus, wie beispielsweise eines lebenden rekombinanten Adenovirus
(oder "viralen Vektors") für therapeutische
Zwecke in der Gentherapie besonders gut geeignet. Beispielsweise
kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete Virus ein Tumorsuppressorgen,
wie beispielsweise ein Wildtyp-p53-Gen
oder ein Rb-Gen (zum Beispiel p110RB oder p56RB) umfassen, und mit Transgenen, wie beispielsweise
dem Wildtyp-p53 inseriert in einem viralen Vektor kann die hier
offenbarte Zusammensetzung als eine pharmazeutische Zusammensetzung
zum Behandeln von Krebs verwendet werden.
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In
diesem Zusammenhang können
die hier offenbarten Formulierungen die bemerkenswerte Fähigkeit haben,
die Lebensfähigkeit
des lebenden Virus, insbesondere eines viralen Vektors, in den eine
Nukleotidsequenz, die für
ein Transgen, wie beispielsweise p53 kodiert, eingefügt worden
ist, zu erhalten. Diese Eigenschaft erlaubt es dem Virus, seine
Fähigkeit
zu erhalten, Zielzellen zu infizieren, so dass das therapeutische Protein,
das durch das eingefügte
Transgen kodiert wird, angemessen gebildet wird.
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Unter
besonderer Berücksichtigung
des p53 und seiner Verwendungen wird angemerkt, dass Mutation des
p53-Gens die häufigste
genetische Veränderung
bei humanen Krebserkrankungen ist (Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703,
Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). Einführen des Wildtyp-p53 in Säugetierkrebszellen,
denen endogenes Wildtyp-p53-Protein fehlt, unterdrückt den
neoplastischen Phänotyp
dieser Zellen (siehe zum Beispiel
US-Patent
5,532,220 ).
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In
den unteren Beispielen (Beispiele 1-5 werden als Hintergrund-Information
behalten, obwohl sie keine Verfahren sind) ist das Virus ein lebendes
rekombinantes Adenovirus, welches das Wildtyp-p53-Gen enthält. Das
besondere in diesen Beispielen verwendete Virusvektorkonstrukt wird
hier als "A/C/N/53" bezeichnet. A/C/N/53
(auch als "ACN53" bezeichnet) ist
ein besonders bevorzugtes virales Vektorkonstrukt, das in der ebenfalls
anhängigen
Anmeldung USSN 08/328,673, eingereicht am 25. Oktober 1994, und
in der
WO 95/11984 (4.
Mai 1995) beschrieben wird, die durch Bezugnahme ausdrücklich hierin
aufgenommen werden.
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Eine
repräsentative
Formel für
bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen,
die Polysorbat 80 enthalten, wird unten dargestellt: Repräsentative
Formel
Aktive
Substanz | A/C/N/53 | 1 × 109 bis 1 × 109 Partikel/ml |
Puffer | Natriumphosphat, | 0,5
bis 10 mg/ml |
monobasisch | |
| Trometamol | 0,5
bis 10 mg/ml |
Stabilisator/Tonizitäts-Mittel | Saccharose | 5
bis 25 mg/ml |
Stabilisatoren | Glycerin | 20
bis 200 mg/ml |
| Magnesiumchlorid | 0,1
bis 1 mg/ml |
| Polysorbat
80 | 0,03
bis 0,3 mg/ml |
Streckmittel | Wasser
für Injektionen
q.s. ad | 1
ml |
- (Die Zusammensetzungen werden üblicherweise
in Dosen von 1,0 ml gelagert. "q.s.
ad" in der obigen
Formel steht für
das Zugeben von ausreichend Lösungsmittel,
um das Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen).
-
Vier
besonders bevorzugte Ausführungsformen
werden unten dargestellt. (Polysorbat 80 liegt in den Beispielen
1 und 2 vor, fehlt aber in den Beispielen 3 und 4).
| Beispiel
1 | Beispiel
2 |
A/C/N/53 | 7,5 × 1011 | 7,5 × 1010 |
| Partikel/ml | Partikel/ml |
Natriumphosphat-Dihydrat,
monobasisch | 1,7
mg/ml | 1,7
mg/ml |
Trometamol | 1,7
mg/ml | 1,7
mg/ml |
Magnesiumchloridhexahydrat | 0,4
mg/ml | 0,4
mg/ml |
Saccharose | 20
mg/ml | 20
mg/ml |
Polysorbat
80 | 0,15
mg/ml | 0,15
mg/ml |
Glycerin | 100
mg/ml | 100
mg/ml |
Wasser
für Injektion
q.s. ad | 1
ml | 1
ml |
pH | 7,4
bis 7,8 | 7,4
bis 7,8 |
| Beispiel
3 | Beispiel
4 |
A/C/N/53 | 7,5 × 1011 | 5 × 1010 |
| Partikel/ml | Partikel/ml |
Natriumphosphat-Dihydrat,
monobasisch | 1,7
mg/ml | 1,7
mg/ml |
Trometamol | 1,7
mg/ml | 1,7
mg/ml |
Magnesiumchloridhexahydrat | 0,4
mg/ml | 0,4
mg/ml |
Saccharose | 20
mg/ml | 20
mg/ml |
Glycerin | 100
mg/ml | 100
mg/ml |
Wasser
für Injektion
q.s. ad | 1
ml | 1
ml |
pH | 7,4
bis 7,9 | 7,3
bis 7,8 |
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Die
folgenden Inhaltsstoffe können
alle erhalten werden von zum Beispiel EM Industries, INC., 7 Skyline
Drive, Hawthorne, New York 10532: Natriumphosphatdihydrat, monobasisch;
Trometamol; Magnesiumchloridhexahydrat; Saccharose und Glycerin.
Po lysorbat 80 ist beispielsweise von ICI Americas, Inc., Wilmington
Delaware, 19897 erhältlich.
-
Zusammensetzungen
können
während
der Aufreinigung des Virus in einer Gelfiltrationschromatographiesäule durch
Verbinden der Inhaltsstoffe (mit Ausnahme von Polysorbat 80) in
den gewünschten
Konzentrationen in der Gelfiltrationssäule hergestellt werden. (Hinsichtlich
der Gelfiltrationsverfahren kann Bezug genommen werden auf beispielsweise
Abschnitt V unten). Wenn es dann gewünscht ist, die Konzentration
des Virus zu verdünnen
oder Polysorbat-80 zuzugeben, dann können die Streckmittel durch
Standardtechniken hergestellt werden. Ein Beispiel wird nachfolgend
angegeben:
Gebe bei Raumtemperatur Natriumphosphat-Dihydrat,
monobasisch, Trometamol, Saccharose, Magnesiumchloridhexahydrat
und Glycerin in ungefähr
75 % des Chargenvolumens Wasser für die Injektion in ein Gefäß aus rostfreiem
Stahl, das mit einem Rührer
ausgerüstet
ist, und löse
diese. Fülle
die Charge des entstandenen Streckmittels mit Wasser zur Injektion
auf das Endvolumen. Überprüfe den pH.
Berechne die benötigte
Menge der A/C/N/53-(Adenovirus mit Wildtyp-p53 als einem Transgen)
Arzneisubstanz in Suspension ("drug
substance in suspension")
und das benötigte
Volumen des Streckmittels, um die A/C/N/53-Injektion herzustellen. Wenn die endgültige A/C/N/53-Injektion
Polysorbat 80 enthalten wird, bereite eine Stammlösung vor,
die 10 % Überschuss
Polysorbat 80 in Streckmittel enthält. Gebe die berechneten Mengen
der A/C/N/53-Arzneisubstanz in Suspension und das Streckmittel in
ein Gefäß aus rostfreiem
Stahl und mische. Gebe die Polysorbat 80-Lösung vor der Zugabe des gesamten
Streckmittels bezogen auf 10 % des Gesamtvolumens der A/C/N/53-Injektionscharge
wenn nötig
zu. Filtriere die Suspension aseptisch durch einen sterilisierten
Filter (0,22 μm
oder entsprechend). Überprüfe die Unversehrtheit
des Filters nach der Filtration. Sammel und fülle die sterilisierte Suspension in
Röhrchen,
die das entsprechende Volumen aufweisen. Schließe und versiegle die Röhrchen.
-
Stabilitätsdaten
für die
Beispiele 1, 2, 3 bzw. 4 sind unten in den Tabellen 1, 2, 3 und
4 angegeben.
-
In
den Tabellen unten ist das Antiproliferationsassay ein Bioassay,
das verwendet wird, um die Fähigkeit
des Produktes zu messen, Krebszellen zu unterdrücken, und beruht allgemein
auf Verfahren, die von Wills et al., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088
verwendet wurden. Die aufgelisteten Zahlen geben die Aktivität an, während die
Kontrolle keine Aktivität
aufweist.
-
Der "Plaque-Assay" misst Viruspartikel
in Kultur durch Auszählen
der Anzahl der Virusplaques als eine Funktion der Verdünnung und
beruht allgemein auf Verfahren, die in Graham F.L., und Prevec L.,
Methods in Molecular Biology, Band 7: Gene Transfer and Expression
Protocols, E.J. Murray, Hrsg. (Human Press Inc., Clifton NJ) S.
109-128 (1991) beschrieben sind; siehe auch Graham F.L., Smiley
J., Russel W.C., und Nairn R., J. Gen. Virol. Band 36, S. 59-74
(1977).
-
Der "FACS"-Assay zeigt die
Fähigkeit
des Virus, Zellen zu infizieren, und diese Messungen beruhen allgemein
auf den Verfahren, die zum Beispiel in der Internationalen Patentanmeldung
PCT/US97/11865 (
WO 98/01582 , veröffentlicht
am 15. Januar 1998) beschrieben sind. In der nächsten Spalte zur Rechten stellen
die unter der Überschrift "Konzentration" dargestellten Zahlen
die Konzentration der Gesamtzahl an Viruspartikeln dar. Zuletzt
stellen die Zahlen unter der Überschrift „Partikel/FACS-Verhältnis" das Verhältnis der
Gesamtzahl von Viruspartikeln verglichen mit der Anzahl der infektiösen Viruspartikeln
dar und geben damit die relative Wirksamkeit der Viruspräparation
an.
-
Die
Daten unter der Überschrift "UV" geben die Aggregation
der Viruspartikel an, wie sie durch das UV-Absorptionsverhältnis für die Wellenlängen A320/A260 als ein
Zeichen der Lichtstreuung angegeben wird. Grundsätzlich mißt die Absorption bei einer
Wellenlänge
von 320 nm die Menge des Streulichts, während die Absorption bei der
Wellenlänge
von 260 nm mit der Menge in der DNA korreliert.
-
Die
in der zweiten Spalte der Tabelle unter "Bedingung" aufgelisteten Temperaturen geben die
Lagertemperatur wieder. Die physiologischen Assays werden bei 37 °C durchgeführt und
der pH in der letzten Spalte wird bei Raumtemperatur, ungefähr 25 °C, gemessen. Tabelle
1 Stabilitätsdaten
für Beispiel
1
Stabilität | Bedingung | Antiproliferatonsassay | Plaqueassay | FACS | Konzentration | Partikel/FACS-Verhältnis | UV | |
Zeit | °C | × 105 SPU/ml | × 108 PFU/ml | × 1010 U/ml | × 1011 Partikel/ml | | A320/A260 | pH |
zu
Beginn | | 3,3 | 5,8 | 3,86 | 7,95 | 21 | 0,23 | 7,53 |
1 Woche | 25 | 4,9 | 10 | 2,27 | 8,06 | 36 | 0,24 | 7,53 |
2 Wochen | 4 | 3,1 | 6,6 | 3,41 | 7,84 | 23 | 0,23 | 7,49 |
4 Wochen | 4 | 3,4 | 17 | 3,91 | 7,79 | 20 | 0,23 | 7,63 |
8 Wochen | 4 | 5,8 | 8,8 | 3,38 | 7,80 | 23 | 0,24 | 7,61 |
12
Wochen | 4 | 3,9 | 36 | 2,24 | 7,80 | 35 | 0,24 | 7,72 |
5 Monate | 4 | nicht
getestet | nicht
getestet | 1,57 | 8,21 | 52 | 0,26 | 7,60 |
6 Monate | 4 | 3,0 | 7,6 | 2,74 | 7,68 | 28 | 0,28 | 7,58 |
9 Monate | 4 | 3,1 | 19 | 3,47 | 7,19* | 21 | 0,28 | 7,58 |
11
Monate | 4 | nicht
getestet | nicht
getestet | nicht
getestet | 6,71 | - | 0,29 | nicht
getestet |
12 Monate | 4 | 2,6 | 10 | 0,81 | 6,13 | 76 | 0,30 | 7,62 |
- * Erneuter Test der UV-Proben nach 9 Monaten:
6,89 × 1011 Partikel/ml; A320/A260 = 0,28.
Tabelle
2 Stabilitätsdaten
für Beispiel
2 Stabilität | Bedingung | Antiproliferationsassay | Plaqueassay | FACS | Konzentration | Partikel/FACS-Verhältnis | UV | |
Zeit | °C | × 105 SPU/ml | × 108 PFU/ml | × 1010 U/ml | × 1011 Partikel/ml | | A320/A260 | pH |
zu
Beginn | | 3,3 | 4,8 | 1,99 | 10,0 | 50 | 0,24 | 7,36 |
1 Woche | 25 | 2,4 | 7,1 | 1,64 | nicht
getestet* | - | 0,46 | 7,42 |
2 Wochen | 4 | 2,4 | 6,9 | 2,13 | 9,79 | 46 | 0,24 | 7,51 |
4 Wochen | 4 | 3,2 | 8,4 | 2,50 | 9,24 | 37 | 0,22 | 7,55 |
8 Wochen | 4 | 6,9 | 8,6 | 2,60 | 8,10 | 31 | 0,25 | 7,54 |
12
Wochen | 4 | 5,5 | 8,3 | 1,09 | 8,60 | 79 | 0,24 | 7,64 |
5 Monate | 4 | nicht
getestet | nicht
getestet | 1,74 | 8,03 | 46 | 0,27 | 7,55 |
6 Monate | 4 | 3,3 | 7,3 | 2,10 | 8,25 | 39 | 0,23 | 7,52 |
9 Monate | 4 | 2,3 | 13 | 1,97 | 7,59 | 39 | 0,24** | 7,43 |
11
Monate | 4 | nicht
getestet | nicht
getestet | nicht
getestet | 7,48 | - | 0,23 | nicht
getestet |
12 Monate | 4 | 1,8 | 9,4 | 0,60 | 4,94 | 82 | 0,26 | 7,59 |
- * Wegen Störungen im Assay nicht bestimmt.
- ** Erneuter Test der UV-Proben nach 9 Monaten: 7,37 × 1010 Partikel/ml;
A320/A260 = 0,24.
Tabelle
3 Stabilitätsdaten
für Beispiel
3 Stabilität | Bedingung | Antiproliferationsassay | Plaqueassay | FACS | Konzentration | Partikel/FACS-Verhältnis | UV | |
Zeit | °C | × 105 SPU/ml | × 108 PFU/ml | × 1010 U/ml | × 1011 Partikel/ml | | A320/A260 | pH |
zu
Beginn | | 3,2 | 6,3 | 2,59 | 7,45 | 29 | 0,24 | 7,67 |
1 Woche | 25 | 4,4 | 4,3 | 1,65 | 7,49 | 45 | 0,24 | 7,68 |
2 Wochen | 4 | 2,3 | 8,0 | 3,62 | 7,27 | 20 | 0,24 | 7,49 |
4 Wochen | 4 | 2,7 | 7,6 | 4,08 | 6,97 | 17 | 0,24 | 7,75 |
8 Wochen | 4 | 5,9 | 8,7 | 2,69 | 7,00 | 26 | 0,25 | 7,82 |
12
Wochen | 4 | 3,0 | 15 | 0,70 | 7,10 | 101 | 0,25 | 7,80 |
6 Monate | 4 | 2,4 | 6,4 | 2,45 | 7,12 | 29 | 0,25 | 7,76 |
9 Monate | 4 | 2,8 | 9,4 | 2,51 | 7,06 | 28 | 0,26 | 7,81 |
11
Monate | 4 | nicht
getestet | nicht
getestet | nicht
getestet | 6,71 | - | 0,25 | nicht
getestet |
12
Monate | 4 | 2,2 | 9,8 | 0,74 | 6,75 | 91 | 0,26 | 7,81 |
Tabelle
4 Stabilitätsdaten
für Beispiel
4 Stabilität | Bedingung | Antiproliferationsassay | Plaqueassay | FACS | Konzentration | Partikel/FACS-Verhältnis | UV | |
Zeit | °C | × 104 SPU/ml | × 107 PFU/ml | × 109 U/ml | × 1010 Partikel/ml | | A320/A260 | pH |
zu
Beginn | | 3,3 | 4,7 | 2,36 | 8,91 | 38 | 0,23 | 7,37 |
1 Woche | 25 | 2,3 | 9,3 | 1,40 | 8,25 | 59 | 0,24 | 7,37 |
2 Wochen | 4 | 2,8 | 8,0 | 2,16 | 8,80 | 41 | nb* | 7,37 |
4 Wochen | 4 | 2,9 | 6,6 | 2,54 | 9,35 | 37 | 0,20 | 7,63 |
8 Wochen | 4 | 6,9 | 7,2 | 2,56 | 7,60 | 30 | 0,24 | 7,60 |
12
Wochen | 4 | 4,4 | 8,6 | 1,45 | 7,20 | 50 | 0,23 | 7,73 |
6 Monate | 4 | 3,6 | 7,1 | 2,85 | 7,92 | 28 | 0,21 | 7,58 |
9 Monate | 4 | 2,9 | 11 | 1,87 | 7,26 | 39 | 0,20 | 7,60 |
11
Monate | 4 | nicht
getestet (nt) | nt | nt | 6,93 | - | 0,22 | nt |
12 Monate | 4 | 2,4 | 22 | 0,70 | 7,15 | 102 | 0,23 | 7,61 |
- * Wegen Störungen im Assay nicht bestimmt.
-
BEISPIEL 5
-
- Formulierung für
Beispiel 5: A/C/N/53 (7,5 × 1011 Partikel/ml), Trometamol (TRIS) (1,7 mg/ml),
Natriumphosphat-Dihydrat, monobasisch (1,7 mg/ml), Saccharose (20
mg/ml), Magnesiumchloridhexahydrat (0,4 mg/ml), Glycerin (100 mg/ml),
Natriumchlorid (5,8 mg/ml), Füllvolumen
= 10 ml.
-
Tabelle
5 Stabilitätsdaten
für Beispiel
5
Stabilität | Bedingung | Antiproliferationsassay | FACS | Konzentration | Partikel/FACS-Verhältnis | UV | |
Zeit | °C | × 104 SPU/ml | × 109 U/ml | × 1010 Partikel/ml | | A320/A260 | pH |
zu
Beginn | | 4,5 | 1,87 | 7,81 | 42 | 0,23 | 7,80 |
1 Monat | 4 | 8,0 | 1,67 | 7,83 | 47 | 0,23 | 7,80 |
4 Monate | 4 | 13,0 | 1,58 | 7,84 | 50 | 0,23 | 7,70 |
-
In
einigen Fällen
wurden Schwebstoffe beobachtet, die sich während der Lagerung bei 4 °C in der
Formulierung entwickeln. Analysen der Schwebstoffe durch SDS-PAGE
legen nahe, daß diese
Schwebstoffe aus kleineren Verunreinigungen (d.h. weiteren Proteinen
und einigen unreifen Viruspartikeln) zusammengesetzt sind, und daß diese
Schwebstoffe daher die Lebensfähigkeit
der Formulierung nicht beeinflussen. Nichtsdestotrotz kann in einer
bevorzugten Ausführungsform
wahlweise ein Schritt der Mikrofiltration ausgeführt werden, um die Formulierung
weiter zu klären
(um mögliche
Schwebstoffbildung zu verhindern), um alle möglichen potentiellen Schwebstoffe
mit nur geringem Verlust an Viruspartikeln zu entfernen. (Wenn eine
Mikrofiltration durchgeführt
wird, sollte beachtet werden, daß eine ausreichende Oberfläche der
Mikrofiltrationsmembran pro Filtrationsvolumen entscheidend ist,
um einen Verlust an Viren zu vermeiden, wenn der Schwebstoff entfernt wird.)
-
Zusätzlich haben
die Erfinder in einer bevorzugten Ausführungsform herausgefunden,
daß Bewegung, wie
beispielsweise Rühren,
die Schwebstoffbildung beschleunigen kann und daher ein weiterer
optionaler Schritt in dem Klärverfahren
ist. So zeigte sich, daß leichtes
Rühren
(zum Beispiel über
Nacht bei 10 °C
unter Verwendung eines magnetischen Rührfischs) gefolgt von Mikrofiltration
die Schwebstoffe entfernt, so daß sich bei erneutem Rühren kein
weiterer Schwebstoff bilden wird.
-
Es
wurde auch gefunden, daß Zyklen
des Einfrierens/Tauens Schwebstoffbildung während des erneuten Rührens fördern könnte. Daher
können
in einem anderen bevorzugten Verfahren ein oder mehrere Zyklen des
Einfrierens/Tauens gefolgt von Rühren,
und dann Mikrofiltration zur Vermeidung einer Schwebstoffbil dung während der
Lagerung des Virusendproduktes bei Kühlschranktemperaturen (z.B.
4 °C) wahlweise
ausgeführt werden.
-
Verfahren zum Konzentrieren und Aufreinigen
von Virus-enthaltenden Zusammensetzungen:
-
Die
vorliegende Anmeldung offenbart auch ein neues Verfahren des stabilen
Konzentrierens einer bestehenden Viruszubereitung durch Anwenden
von Tangentialflussfiltration (nachfolgend teilweise als "TFF" bezeichnet), die
es einem ermöglicht,
klinische Dosierungen in einem weiten Bereich gewünschter
Konzentrationen einfach auszuwählen
und herzustellen. Das neue Verfahren des Konzentrierens einer Viruszubereitung, das
hier offenbart wird, umfasst Schritte, bei denen man:
- (a) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu einer Viruszubereitung
bis zu einer Endkonzentration des Polyhydroxykohlenwasserstoffs
von ungefähr
20 % oder mehr zugibt; und (b) die Viruszubereitung einem Filtrationsverfahren
unterzieht, wobei die Konzentration des Virus durch Anlegen von
Druck an die Zubereitung erhöht
wird, so dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung durch einen
Filter entfernt wird, während das
Virus zurückgehalten
wird.
-
Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für eine große Vielfalt von Viren zugänglich,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Adenoviren, Pockenviren, Iridoviren, Herpesviren, Papovaviren,
Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Retroviren, Adeno-assoziiertes Virus,
Vakzinia-Virus, Rotaviren, etc., wobei Adenoviren besonders bevorzugt
sind. Die Viren sind bevorzugt rekombinante Viren, können aber
auch klinische Isolate, attenuierte Impfstoffstämme usw. einschließen. Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere für Viren, die heterologe Transgene
tragen für
die Verwendung bei Gentherapie geeignet. Solche Viren sind gegenüber potentiell destabilisierenden
Kräften,
wie beispielsweise den zusätzlichen
mechanischen Scherkräften,
die Verfahren zum Konzentrieren von Viruspräparationen begleiten, besonders
anfällig.
Ein beispielhaftes rekombinantes Adenovirus für die Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist A/C/N/53, das in der PCT-Patentanmeldung Nr.
WO 95/11984 offenbart wird.
-
Das
Filtrationsverfahren, das zum Konzentrieren des Virus in dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jedes Filtrationsverfahren
(zum Beispiel Ultrafiltration) einschließen, bei dem die Konzentration
des Virus erhöht
wird, indem ein Streckmittel gezwungen wird, durch einen Filter
in einer Weise zu passieren, dass das Streckmittel aus der Viruszubereitung
entfernt wird, während
das Virus nicht in der Lage ist, durch den Filter zu gelangen, und
so, in konzentrierter Form, in der Viruszubereitung verbleibt. Die Ultrafiltration
wird beispielsweise in Microfiltration and Ultrafiltration: Principles
und Applications, L. Zeman und A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New
York, 1996) beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Filtrationsverfahren ist
die Tangentialflussfiltration ("TFF"), wie sie beispielsweise
im MILLEPORE-Katalog beschrieben ist, der mit "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" betitelt ist, S.
177-202 (Redford, Massachusetts, 1995/96). Bevorzugte TFF-Apparate
umfassen entweder ein Pelli con II- oder Pellicon XL-Filtersystem
der Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Redford, Massachusetts
(Internetadresse: www.millipore.com), wobei ein Pellicon XL-System
besonders bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Verfahren bei Temperaturen in einem Bereich von ungefähr 2 °C bis 27 °C durchgeführt werden.
-
Andere
Konzentrationsverfahren können
angewendet werden, um Viruszubereitungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung aufzukonzentrieren. Beispielsweise kann der Einsatz von
Polyhydroxykohlenwasserstoff vorteilhaft genutzt werden, um eine
Viruszubereitung durch Zentrifugation aufzukonzentrieren. Daher
wird hier ebenfalls ein Verfahren zum Konzentrieren einer Viruszubereitung
offenbart, das Schritte umfasst, bei denen man:
- (a)
eine Zusammensetzung zentrifugiert, die eine erste Schicht umfasst,
die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration von
35 % bis 80 % (v/v) umfasst, wobei die erste Schicht mit einer zweiten Schicht überschichtet
ist, die einen Polyhydroxykohlenwasserstoff in einer Konzentration
von 5 % bis 30 % (v/v) umfasst, wobei die zweite Schicht mit einer
dritten Schicht überschichtet
ist, die ein Virus umfasst, und
- (b) das Virus aus der ersten Schicht gewinnt.
-
Als
Beispiel kann eine Adenoviruszubereitung durch Zentrifugation mit
niedriger Geschwindigkeit bei 3200 g unter Verwendung von Ausschwingrotoren
einer Beckman-Zentrifuge aufkonzentriert werden. Um dies zu erreichen,
kann die Viruszuberei tung in mehrere 5 ml-Röhrchen gegeben werden, wobei
jedes Röhrchen 6,25
Vol.-% von 70 % Glycerin in einer ersten Schicht am Röhrchenboden
enthält, überschichtet
mit 2,5 Vol.-% von 20 % Glycerin mit der Viruszubereitung, die obenauf
geschichtet wird. Die Zubereitung wird dann bei 3200 g bei 4 °C für ungefähr 16 Stunden
zentrifugiert, um das konzentrierte Virus in die Glycerinschichten
zu sedimentieren, und die neu aufkonzentrierte Viruszubereitung
wird dann nachfolgend aus der ersten Schicht gewonnen. Virus, das
durch die oben beschriebenen Verfahren aufkonzentriert wurde, hat
gute Lichtstreueigenschaften und brauchbare Infektiositätseigenschaften.
-
Im
Hinblick auf den Polyhydroxykohlenwasserstoff, der in den beschriebenen
Verfahren verwendet wird, steht ein "Polyhydroxykohlenwasserstoff" für eine verzweigte,
lineare oder cyclische Verbindung, die mit 2 oder mehr (bevorzugt
2 bis 6, bevorzugter 2 bis 4) Hydroxygruppen substituiert ist, und
eine wirksame Menge des Polyhydroxykohlenwasserstoffs ist eine Menge,
die ausreicht, um das Virus gegen potentiell destabilisierende Kräfte, wie
beispielsweise die mechanischen Scherkräfte, die während des Konzentrationsprozesses auftreten,
zu stabilisieren. Bevorzugt liegt der Polyhydroxykohlenwasserstoff
in den Virus-konzentrierenden Verfahren, die hier offenbart sind,
in einer Minimalkonzentration von 20 %, bevorzugter 25 % vor. Polyhydroxykohlenwasserstoffe
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Polyhydroxy-substituierte
Alkylverbindungen (verzweigt oder unverzweigt), die bevorzugt 2
bis 7 Kohlenstoffatome aufweisen, und können Glycerin, Sorbitol und
Polypropanol einschließen.
Glycerin ist besonders bevorzugt.
-
Das
neue Verfahren der Erfinder zum Erhöhen der Viruskonzentration
hat den zusätzlichen
Vorteil, daß es
das Verarbeiten verbessert, beispielsweise durch Beseitigen problematischer
Engstellen, indem ein wesentlich höherer Durchfluss während verschiedener
Verarbeitungsschritte, wie beispielsweise der Größenausschlusschromatographie
ermöglicht
wird. Daher kann in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zum
Konzentrieren von Viruszubereitungen, das hier offenbart wird, auf
Verfahren zum Aufreinigen von Viren angewendet werden, bei denen
ein Größenausschlusschromatographieschritt
(z.B. Gelfiltration) im Anschluss an Anionenaustauschchromatographie
durchgeführt
wird. In diesem Verfahren gibt es zusätzliche Gefahren für die Virusstabilität, die nicht
nur von den mechanischen Scherkräften
herrühren,
die benötigt
werden, um das Virus vor dem Geschwindigkeits-beschränkenden
Größenausschlußchromatographieschritt
zu konzentrieren, sondern die auch aus der Tatsache herrühren, daß die aus
dem Anionenaustauschchromatographieschritt eluierte Viruszubereitung üblicherweise
hohe Gehalte von Salz und anderen Unreinheiten enthält, welche
die Virusstabilität
weiter verschlechtern. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Aufreinigen einer Viruszubereitung bereit, das Schritte
umfasst, bei denen man:
- (a) die Viruszubereitung
einer Anionenaustauschchromatographie unterzieht, wobei das Virus
als ein Viruszubereitungsprodukt aus dem Anionenaustauschchromatographiemedium
eluiert wird;
- (b) einen Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem Viruszubereitungsprodukt
aus Schritt (a) zugibt, so daß die Konzentration
des Polyhydroxykohlenwasserstoffs in der Zube reitung eine Endkonzentration
von ungefähr 25
% oder mehr erreicht, und
- (c) die Konzentration des Virus in dem Viruszubereitungsprodukt
von Schritt (b) durch Anlegen eines Drucks an die Zubereitung erhöht, so daß das Streckmittel
aus der Viruszubereitung durch einen Filter entfernt wird, während das
Virus zurückgehalten
wird, und
- (d) das konzentrierte Viruszubereitungsprodukt aus Schritt (c)
einem oder mehreren zusätzlichen
Verarbeitungsschritten unterzogen wird.
-
In
dem Gesichtspunkt der Erfindung, der oben in Zusammenhang mit der
Anionenaustauschchromatographie dargestellt wurde, ist das minimale
Niveau des Polyhydroxykohlenwasserstoffs, z.B. Glycerin, 25 % (eher
als das 20 minimale Niveau in allgemeinen Anwendungen der Konzentrierungsverfahren,
die hier offenbart sind), da diese besondere Anwendung die zusätzliche
Gefährdung
der Stabilität,
die durch die hohen Salzkonzentration in dem Produkt, das von der
Anionenaustauschsäule
eluiert wird, verursacht wird, berücksichtigen muß. Die Zugabe
von 25 % Glycerin (vorzugsweise 30 %) führt zu einer Stabilität des Salz
enthaltenen DEAE Pools für > 10 Tage bei zum Beispiel
4 °C; daher
können
die nachfolgenden Schritte der Viruskonzentration und/oder Gelfiltration
an getrennten Tagen mit einer beachtlichen Flexibilität über einen
Zeitraum von 10 Tagen durchgeführt
werden. Es wird geschätzt,
dass der Einsatz von Polyhydroxykohlenwasserstoff in der höheren Konzentration
von 25 % oder mehr ebenfalls in Verfahren der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann, wenn die Viruszubereitung einen hohen Salzgehalt
als Folge anderer Verarbeitungsbedingungen enthält.
-
V. BEISPIELE FÜR VERFAHREN DER VORLIEGENDEN
ERFINDUNG
-
Die
folgenden Beispiele zeigen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung; der Bereich der Erfindung ist nicht dahin auszulegen,
daß er
dadurch begrenzt wird.
-
Kurzer Überblick – Eine konzentrierte
Charge geht von gefrorenen groben Virusmaterialien aus, die aus
der Gewinnung aus der Fermentation herrühren. In einem Verfahren wird
das Adenovirusprodukt zuerst durch Anionenaustauschchromatographie
aufgereinigt. Dann kann der Anionenaustausch-Pool vor dem Laden
der Zubereitung auf eine Größenausschlusssäule durch
Tangentialflußfiltration
(TFF) in Gegenwart von 30 % (v/v) Glycerin konzentriert werden.
Ebenfalls wird hier ein Verfahren offenbart, bei dem der TFF-Konzentrationsschritt
in der Gegenwart von 20 % (v/v) oder mehr (bevorzugt 25 %) Glycerin
nach der Größenausschlußchromatographie
durchgeführt
wird.
-
• Zubereitung
von Startmaterialien durch Anionenaustauschchromatographie vor der
TFF
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein Adenovirus-Anionenaustausch-Pool
für das
Aufkonzentrieren wie folgt zubereitet. Gefrorenes virales Material
aus Fermentations- und Gewinnungsschritten wird aufgetaut und durch
eine hydrophile Membran von 0,45 μm
gefiltert. Die Salzkonzentration des Filtrats wird durch Zugeben
von 4 M Natriumchlorid eingestellt. Diese Beschickungslösung wird
dann auf eine Fractogel EMD DEAE-650M-Säule gegeben, die mit 50 mM
Natriumphosphat pH 7,5, 260 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid,
2 % (w/v) Saccharose (Puffer A) prä-equilibriert wurde. Das Adenovirus
bindet an das Anionenaustauschharz, wobei der Großteil des
Medi ums und der Wirtszellverunreinigungen durch die Säule passieren
und in dem verbrauchten Durchfluss enden. Die Säule wird anfänglich mit
4 Volumen von Puffer A gewaschen, gefolgt von einer zweiten isokratischen
Waschung mit 8 Bettvolumen von 94 % Puffer A und 6 % Puffer B (50
mM Natriumphosphat pH 7,5, 600 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid,
2 % (w/v) Saccharose), um zusätzliche
Verunreinigungen zu entfernen. Das Virus wird mit einem linearen
Gradienten aus 30 Bettvolumen von 6 % bis 100 % Puffer B aus der
Säule eluiert.
Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils, wie er mittels A280 bestimmt wird, wird gesammelt. Dann wird
Glycerin zu dem DEAE-Pool bis zu einer Endkonzentration von 30 %
(v/v) für
das weitere Bearbeiten zugegeben.
-
• Konzentrieren
des DEAE-Pools unter Verwendung von Tangentialflußfiltration
-
Der
DEAE-Pool (der in Übereinstimmung
mit der obigen Beschreibung hergestellt wurde) wird durch Verwenden
einer TFF-Einheit
von Millipore (Pellicon XL-System) mit Biomax-Membranen, die einen Molekulargewichts-Cut-off
von 1 Million aufweisen, 10- bis 20-fach aufkonzentriert. Das Verfahren
wird entweder bei 2 bis 10 °C
oder Raumtemperatur (25 °C)
durchgeführt.
Die folgenden Filtrationsparameter werden in diesem Verfahren verwendet:
durchschnittlicher Einlaßdruck
= 14 psi; durchschnittlicher Permeatdruck = 0 psi; durchschnittliche
Flußrate
= 13 1/h-m2. Die Endkonzentration des Adenovirus
erreicht ungefähr
1,0 – 2,0 × 1013 Partikel pro ml. Auf Grundlage der Resource
Q-HPLC- und UV-Absorptions (A260)-Analysen
ist die Rückgewinnung des
Konzentrationsschritts > 80
% ohne signifikante Aggregation (Streulichtassay mittels A320/A260).
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• Pufferwechsel
durch Größenausschlusschromatographie
(Gelfiltration)
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Die
konzentrierte Adenoviruszubereitung wird auf eine Superdex-200-Größenausschlusssäule gegeben,
die mit 20 mM Natriumphosphat pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 2 mM
Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose, 10 % Glycerin (Puffer C)
oder 11 mM Natriumphosphat, 14 mM Tris, 2 mM Magnesiumchlorid, 2
% (w/v) Saccharose, 10 % Glycerin, pH 7,8 (Puffer D) prä-equilibriert
wurde. Die Säule
wird mit Equilibrierungspuffer eluiert. Der mittels A280 bestimmte
Adenoviruspeak des Elutionsprofils wird gesammelt und vereint. Die konzentrierte
Adenoviruszubereitung wird durch eine hydrophile Durapore-Membran
von 0,2 μm
(Stericup, Millipore) bei 2 bis 10 °C filtriert und kann bei -80 °C oder höheren Temperaturen
(wie beispielsweise 2 bis 10 °C) gelagert
werden.
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• Aufkonzentrierung
des Superdex-200-Pools unter Verwendung von Tangentialflußfiltration
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Wie
oben diskutiert schließt
eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung das Aufkonzentrieren des Virus nach Anionenaustauschchromatographie
aber vor Gelfiltration ein. Es werden hier jedoch auch Verfahren
des Aufkonzentrierens von Viruszubereitungen offenbart, die auch
nach dem Gelfiltrationsschritt verwendet werden können (sogar
wenn kein Viruskonzentrierungsschritt zwischen dem Anionenaustauschschritt
und dem Gelfiltrationsschritt angewendet wurde). In diesem Fall
sind die Filtrationsparameter die gleichen wie die, die für die Konzentrierung
eines DEAE-Pools verwendet werden, mit der Ausnahme, daß der Polyhydroxykohlenwasserstoff
(z.B. Glycerin) dem Superdex-200-Pool in einer Endkonzentration
zugegeben werden kann, die so niedrig ist wie 20 % (v/v), da es
nicht länger
notwendig ist, die hohen Salzkonzentrationen in dem DEAE-Pool zu
bewältigen.
In dieser Hinsicht sollte beachtet werden, daß in Fällen, bei denen die Zugabe
des Polyhydroxykohlenwasserstoffs bis nach der Gelfiltration verschoben
wurde, der DEAE-Pool sofort auf die Gelfiltrationssäule gegeben
werden sollte (wegen der Empfindlichkeit des DEAE-Pools mit seiner hohen
Salzkonzentration). Somit ist erkennbar, dass ein zusätzlicher
Vorteil des Zugebens von Polyhydroxykohlenwasserstoff zu dem DEAE-Pool
(gemäß der vorliegenden
Erfindung) eine erhöhte
Flexibilität
hinsichtlich der Zeitintervalle und Lagerungsoptionen während der
Zeiträume
zwischen der Anionenaustauschchromatographie und dem nachfolgenden
Verarbeiten ist.
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Die
Verfahren des Konzentrierens der Viruszubereitungen können in
Verbindung mit einer Vielzahl von Aufreinigungsverfahren angewendet
werden. Für
zusätzliche
Informationen zu Aufreinigungsverfahren kann Bezug genommen werden
auf zum Beispiel Huyghe et al., Human Gene Therapy, Band 6, S. 1403-1416
(1995) und die US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/989,227.
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VI. STABILITÄTSDATEN FÜR VERFAHREN DES KONZENTRIERENS
VON VIRUSZUBEREITUNGEN UNTER VERWENDUNG VON TANGENTIAL-FLUßFILTRATION
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Wie
durch die experimentellen Daten unten gezeigt wird, verleihen die
oben diskutierten Verfahren eine stark erhöhte Virusstabilität trotz
der mechanischen Scherkräfte
beim Konzentrieren des Virus und trotz der rauen Bedingungen, wie
beispielsweise der hohen Salzgehalte in einem DEAE-Pool. Daher gewährleisten die
oben genannten Verfahren unter anderem (1) die schnelle Zubereitung
von klinischen Dosierungen mit jeder gewünschten Konzentration (sogar
wenn von Material mit einer niedrigeren Konzentration ausgegangen wird),
(2) eine Verbesserung des Verarbeitens (zum Beispiel durch Ermöglichen
eines signifikant höheren Durchsatzes
während
der Größenausschlusschromatographie)
und (3) Stabilität
des Salz-enthaltenden DEAE-Pools für > 10 Tage bei 2-10 °C (und ermöglichen dadurch, nachfolgende
Schritte des Viruskonzentrierens und/oder Gelfiltrierens an getrennten
Tagen mit wesentlicher Flexibilität über einen 10 Tage-Zeitraum durchzuführen).
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A. Konzentrieren des Virus nach DEAE-Chromatographie
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In
den folgenden drei Beispielen wurden stabile Konzentrationen von
Adenoviren durch Konzentrieren von DEAE-Pools in 30 % Glycerin (in Übereinstimmung
mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung) zubereitet. Die Zubereitungen
wurden dann einer weiteren Aufreinigung durch Superdez-200-Gelfiltrationschromatographie
unterzogen, um die Endformulierung zum Testen zu erhalten. Beispiel
D-1
Endformulierung: | 20
mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose,
10 % Glycerin, pH 8 bei 2-10 °C. |
Ergebnisse: | Partikel/FACS
= 24 Lichtstreuung (A320/A260)
= 0,22 Konz. = 1,6 × 1013 Partikel/ml |
Beispiel
D-2
Endformulierung: | 14
mM Tris-Base, 11 mM NaPi, 2 mM MgCl2, 2
% Saccharose, 10 % Glycerin, pH 7,8 bei 2-10 °C. |
Ergebnisse: | Partikel/FACS
= 17 Lichtstreuung (A320/A260)
= 0,25 Konz. = 1,5 × 1013 Partikel/ml |
Beispiel
D-3
Endformulierung: | 20
mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose,
10 % Glycerin, pH 8 bei 2-10 °C. |
Ergebnisse: | Partikel/FACS
= 24 Lichtstreuung (A320/A260)
= 0,25 Konz. = 1,3 × 1013 Partikel/ml |
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B. Konzentrieren des Virus im Anschluss
an die Gelfiltration
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Beispiel S-1
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In
dem folgenden Beispiel wurde die Viruszubereitung in 20 % Glycerin
im Anschluss an die Gelfiltration konzentriert.
Endformulierung: | 16
mM NaPi, 80 mM NaCl, 1,6 mM MgCl2, 1,6 %
Saccharose, 20 % Glycerin, pH 8 bei 2-10 °C. |
Ergebnisse: | Partikel/FACS
= 72 Lichtstreuung (A320/A260)
= 0,26 Konz. = 1,66 × 1013 Partikel/ml |
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Die
hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen werden nur als
Beispiele dargestellt und die Erfindung ist dadruch nicht als begrenzt
anzusehen.