ES2349106T3 - Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende: (a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y (b) recuperación del virus de la primera capa.

Description

Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales.

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden virus, especialmente vectores virales, que tienen estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones descritas en este documento son útiles para mantener la estabilidad de virus durante el almacenamiento, y las composiciones que contienen virus descritas en este documento son particularmente útiles para usos terapéuticos tales como terapia génica. También se proporcionan nuevos procedimientos para concentrar y purificar preparaciones virales.

II. Antecedentes

Los virus se han hecho importantes de forma creciente para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y terapia génica, y existe la necesidad de desarrollar y preparar composiciones que contienen virus estables que puedan almacenarse y transportarse fácilmente, reteniendo aún suficiente seguridad y eficacia. En particular, dado el uso extensivo de los vectores virales en terapia génica, es importante desarrollar y preparar una formulación que pueda conservar de forma estable virus recombinantes vivos cuando llevan transgenes terapéuticos.

Además, existe la necesidad crítica de formulaciones que puedan estabilizar preparaciones virales a temperaturas por encima de -80ºC durante periodos prolongados de tiempo. Las composiciones que contienen virus normalmente requieren almacenamiento a -80ºC y no pueden almacenarse a temperaturas de refrigeración convencionales (por ejemplo, de 2ºC a 8ºC, o mayores) durante periodos sustanciales de tiempo. Esta limitación representa un serio impedimento no solamente para el almacenamiento, sino también para el procesamiento, distribución, y uso clínico extendido.

También existe la necesidad de desarrollar composiciones que contienen virus que pueden mantener el pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados a pesar de exponerse a temperaturas de refrigeración, y a pesar de someterse a condiciones duras tales como congelación/descongelación, especialmente las lentas velocidades de congelación/descongelación que pueden existir en conexión con producción, manipulación, o distribución a mayor escala. El mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales porque a pH por debajo de 7,0 y por encima de 8,5 las partículas de virus vivo son vulnerables a la pérdida de viabilidad debido a la inestabilidad física y biológica.

Los problemas adicionales se refieren a concentraciones crecientes de virus. En particular, una concentración elevada de virus contribuye significativamente a la inestabilidad del virus. Sin embargo, son necesarias concentraciones crecientemente mayores de virus y vectores virales para uso terapéutico. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar formulaciones que estabilicen concentraciones relativamente elevadas de virus, especialmente en las duras condiciones mencionadas anteriormente. Y además, existe una necesidad particular de desarrollar nuevos procedimientos para concentrar una preparación de virus existente para conseguir preparaciones estables a niveles de concentración mayores. Los problemas de inestabilidad asociados con concentraciones mayores de virus se exacerban significativamente si se intenta concentrar una preparación de virus existente. Esto se debe en parte a las fuerzas mecánicas de cizalla adicionales que tiene que soportar durante los esfuerzos para aumentar la concentración de una preparación de virus existente. Si se pudiera encontrar un procedimiento para concentrar una preparación de virus sin alteración sustancial a la estabilidad del virus, entonces podrían prepararse fácilmente dosificaciones clínicas a cualquier concentración deseada (incluso cuando se parte de material que tiene una concentración inferior) y, de forma importante, la capacidad de concentrar el virus podría eliminar los atascos problemáticos y otros problemas del aumento en escala durante el procedimiento de purificación permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante diversas etapas de procesamiento tales como cromatografía por exclusión de tamaño.

Por tanto existe la necesidad de materiales y procedimientos para conseguir los objetivos anteriores.

III. Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende: (a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y (b) recuperación del virus de la primera capa. Preferiblemente, el virus es un virus recombinante, que lleva opcionalmente un transgén terapéutico para su uso en terapia génica. Preferiblemente, el virus es adenovirus, preferiblemente A/C/N/53. El polihidroxi hidrocarburo es preferiblemente glicerol.

Se describe en este documento una composición estable que comprende virus en una formulación que comprende un polihidroxi hidrocarburo tamponado para mantener un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.

Se proporcionan nuevos procedimientos para concentrar una preparación de virus existente que permitan seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en un amplio intervalo de concentraciones deseadas. Un procedimiento descrito para concentrar una preparación de virus comprende:

(a) añadir un polihidroxi hidrocarburo a una preparación de virus a una concentración final de polihidroxi hidrocarburo de aproximadamente el 20% o más; y

(b) someter la preparación de virus a un procedimiento de filtración en el que se aumenta la concentración de virus aplicando presión a la preparación de modo que se elimine el diluyente de la preparación de virus a través de un filtro al tiempo que se retiene el virus.

También se describe en este documento un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y

(b) recuperar el virus de la primera capa.

Además, los presentes inventores descubrieron que su nuevo procedimiento de aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de potenciar el procesamiento adicional (por ejemplo, reduciendo o eliminando los atascos problemáticos durante la posterior purificación permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante las etapas de procesamiento tales como cromatografía por exclusión de tamaño). Por tanto, en una realización preferida, el procedimiento para concentrar las preparaciones de virus de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente una etapa de purificación posterior (por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño). A este respecto, el procedimiento de la presente invención es particularmente útil cuando se realiza cromatografía por exclusión de tamaño posterior a cromatografía de intercambio iónico, y se concentra la preparación de virus (de acuerdo con la presente invención) después de la cromatografía de intercambio iónico pero antes de la cromatografía por exclusión de tamaño. Las fracciones virales obtenidas de una cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, típicamente contienen elevados niveles de sales y posiblemente otras impurezas que comprometen adicionalmente la estabilidad del virus durante los procedimientos de concentración. Se describe en este documento un procedimiento para purificar una preparación de virus que comprende:

(a) someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye en forma de un producto de preparación de virus de un medio de cromatografía de intercambio aniónico;

(b) añadir un polihidroxi hidrocarburo al productor de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de polihidroxi hidrocarburo en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente el 25% o más; y

(c) aumentar la concentración de virus en el producto de preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de modo que se retire el diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras se retiene el virus; y

(d) someter el producto de preparación de virus concentrado de la etapa (c) a una o más etapas de procesamiento adicionales.

La presente invención también proporciona preparaciones de virus concentradas y/o purificadas por el procedimiento de la invención, que es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

IV. Descripción detallada

Como se ha indicado anteriormente, la presente solicitud describe nuevas composiciones que contienen virus, así como nuevos procedimientos para concentrar y purificar composiciones que contienen virus.

Con respecto a las composiciones, los presentes inventores han desarrollado una nueva formulación tamponada que puede conservar las preparaciones virales con estabilidad potenciada. En particular, la formulación puede estabilizar las preparaciones virales a temperaturas muy por encima de -80ºC. Aún más importante, las composiciones de la presente invención son estables a temperaturas de refrigeración típicas de, por ejemplo, 2ºC a 8ºC, o mayores, durante periodos sustanciales de tiempo, preferiblemente durante varios meses o más. Esto es una ventaja crítica porque, como se ha mencionado anteriormente, para cumplir las necesidades clínicas, es impracticable mantener las preparaciones virales congeladas a -80ºC durante el almacenamiento y el transporte.

Una característica importante de las composiciones descritas en este documento es la adición de un polihidroxi hidrocarburo. Como se usa en este documento, un polihidroxi hidrocarburo significa un compuesto ramificado, lineal, o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 4) grupos hidroxi. Los polihidroxi hidrocarburos para su uso en la presente invención preferiblemente son compuestos alquilo polihidroxi-sustituidos (ramificados o no ramificados), que tienen preferiblemente de 2 a 7 átomos de carbono, y pueden incluir, por ejemplo, glicerol, sorbitol y polipropanol. El glicerol es particularmente preferido. Como se muestra por los datos proporcionados a continuación, los presentes inventores descubrieron que el glicerol permite niveles sorprendentemente elevados de estabilidad durante periodos prolongados de tiempo incluso en condiciones de refrigeración convencionales.

Una cantidad eficaz de polihidroxi hidrocarburo para la composición descrita en este documento es una cantidad suficiente para estabilizar el virus en la formulación de la presente invención sin afectar de forma adversa a la eficacia del virus para su uso adicional, especialmente en casos en los que el virus contiene un transgén para su uso en terapia génica. El polihidroxi hidrocarburo está preferiblemente presente a una concentración final de aproximadamente 20 a 200 mg/ml. Un intervalo más estrecho puede ser de 80 a 120 mg/ml. Puede usarse más de un polihidroxi hidrocarburo para conseguir la cantidad total deseada de polihidroxi hidrocarburo en la composición descrita en este documento.

El polihidroxi hidrocarburo puede contener opcionalmente un grupo aldehído. En particular, el polihidroxi hidrocarburo puede ser un disacárido tal como sacarosa. Además, incluso si el polihidroxi hidrocarburo seleccionado para la composición no contiene un grupo aldehído, la composición puede incluir adicionalmente un disacárido, tal como sacarosa, como estabilizador y agente de ajuste de la tonicidad. Cuando la composición descrita en este documento ya contiene un polihidroxi hidrocarburo adecuado (tal como glicerol) y se emplea un disacáridos en las realizaciones preferidas como estabilizador adicional o agente de ajuste de la tonicidad, el disacárido está preferiblemente presente en un intervalo de 5 a 25 mg/ml, más preferiblemente 20 mg/ml, y preferiblemente el disacárido es sacarosa.

Se usan estabilizadores de sales de metales divalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales de magnesio, sales de zinc y sales de calcio, en realizaciones preferidas de la composición descrita en este documento. Preferiblemente, la sal es una sal cloruro o una sal de magnesio, siendo la sal de magnesio particularmente preferida. Preferiblemente, la sal (por ejemplo, la sal de magnesio) está presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 1 mg/ml, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 0,4 mg/ml.

Pueden incluirse estabilizadores de sales de metales monovalentes farmacéuticamente aceptables tales como sales de potasio, sodio, litio y cesio en realizaciones preferidas de la presente descripción como estabilizadores opcionales. Preferiblemente, la sal es cloruro sódico presente en la cantidad de 0,6 a 10,0 mg/ml, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 5,8 mg/ml.

Además de estabilizar la composición, el cloruro sódico puede suprimir la velocidad y grado de aparición de subproductos de fermentación, provocando una presentación farmacéuticamente más elegante que puede tener potencial reducido de antigenicidad debido a agregados proteicos. La adición de cloruro sódico no afecta al pH de la formulación.

La composición descrita en este documento es capaz de mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados de tiempo, incluso cuando se somete a condiciones duras tales como refrigeración y congelación/descongelación. Además, las composiciones pueden permanecer estables y mantener el intervalo de pH requerido incluso cuando se someten a la velocidad relativamente lenta de congelación/descongelación que puede suceder en conexión con la producción, distribución, y manipulación a mayor escala. Como se ha indicado anteriormente, el mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales, porque a pH por debajo de 7,0 y por encima de 8,5, las partículas de virus vivo pueden llegar a ser inestables y degradarse. La composición particular de virus hace que los virus sean difíciles de estabilizar y conservar.

Para conseguir el mantenimiento del pH en condiciones duras, la presente invención comprende preferiblemente un sistema tampón que puede mantener un pH óptimo en un intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5 a pesar del almacenamiento entre -80ºC y 27ºC y a pesar de someterse a condiciones de congelación/descongelación. Como el pH puede variar dependiendo de la temperatura, los intervalos de pH de la presente invención se ilustran más específicamente a continuación con referencia a intervalos de temperatura específicos. Por ejemplo, a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, de aproximadamente 2ºC a 8ºC) un intervalo de pH preferido es de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 8,3, más preferiblemente de aproximadamente 7,9 a aproximadamente 8,2. A temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 20ºC a 27ºC, preferiblemente de 22ºC - 25ºC), un intervalo preferido de pH es de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,2, más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,9.

Un sistema tampón preferido de la presente invención comprende fosfato sódico monobásico dihidrato en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml y trometamina en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml. (La trometamina también se conoce como TRIS o "Trizma" disponible en Sigma Chemical Co.). Sin embargo, pueden usarse otros sistemas tampón. Por ejemplo, puede usarse fosfato sódico dibásico dihidrato si está acoplado con una forma ácida de tampón tris. En una realización particularmente preferida, el sistema tampón comprende fosfato sódico monobásico dihidrato en una concentración de aproximadamente 1,7 mg/ml y trometamina en una concentración de aproximadamente 1,7 mg/ml, y tiene la capacidad de mantener la formulación en un intervalo de pH óptimo de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,9 a 25ºC.

La formulación descrita en este documento tiene la ventaja adicional de tener la capacidad de estabilizar concentraciones elevadas de virus en las duras condiciones mencionadas anteriormente (tales como temperaturas de refrigeración y procesamiento de congelación/descongelación). En particular, la formulación puede mantener la estabilidad del virus a concentraciones que varían hasta 1 x 10^{13} partículas/ml. Un intervalo preferible de concentraciones de virus para su uso en la presente invención está en una cantidad de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{13} partículas/ml, más preferiblemente, hasta 1 x 10^{12} partículas/ml, por ejemplo de 1 x 10^{9} (o 1 x 10^{10}) a 1 x 10^{12}.

El término "diluyente" como se usa en este documento, puede comprender un disolvente (por ejemplo, agua, preferiblemente agua estéril) o una mezcla de un disolvente y otros ingredientes tales como disolventes adicionales, estabilizadores adicionales, tampones adicionales, y/u otras sustancias que no afectan de forma adversa a la seguridad, eficacia y estabilidad de la formulación. Con respecto a los diluyentes, estabilizadores, tampones y similares, puede hacerse referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Science, 15ª Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Puede incluirse opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente un detergente no iónico tal como un éster de ácido graso de polioxietileno (por ejemplo, polioxietilenosorbitanos tales como Polysorbate 20, Polysorbate 40, Polysorbate 60, o Polysorbate 80 de ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, o Tween 20, Tween, 40, Tween 60 y Tween 80 de Sigma, St. Louis, Mo.) en la composición descrita en este documento. Preferiblemente, el detergente no iónico es un éster de ácidos graso de polioxietileno, y el éster de ácido graso de polioxietileno es preferiblemente Polysorbate 80, que puede actuar como estabilizador en la composición de la presente invención. La concentración del detergente no iónico está preferiblemente en un intervalo de 0,03 a 0,3 mg/ml; más preferiblemente, 0,15 mg/ml.

Las composiciones descritas en este documento pueden contener adicionalmente uno o más "agentes potenciadores de la administración". Un "agente potenciador de la administración" se refiere a cualquier agente que potencia la administración de un gen terapéutico, tal como un gen supresor tumoral a un tejido u órgano canceroso. Los ejemplos de dichos agentes potenciadores de la administración incluyen, aunque sin limitación, detergentes, alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de la ciclooxigenasa, soluciones salinas hipertónicas, y acetatos.

Los detergentes (como se usa el término en este documento) pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos, y no iónicos. Los detergentes ejemplares incluyen, aunque sin limitación taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, octilpiridio, cloruro de benzalconio, detergente ZWITTERGENT® 3-14, CHAPS (3-[3-Colamidopropil)dimetilamoniol]-1-propanosulfonato hidrato, Aldrich), Big CHAP, Deoxi Big CHAP, detergente TRITON®-X-100, C12E8, Octil-B-D-Glucopiranósido, detergente PLURONIC® - F68, detergente TWEEN® 20, y detergente TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).

El uso de agentes potenciadores de la administración se describe con detalle en la solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada U.S.S.N. 08/89.335 presentada el 8 de julio de 1997, y la Publicación de Solicitud Internacional Nº WO 97/23072, 17 de julio de 1997, y en la solicitud de Patente de Estados Unidos U.S.S.N. 09/112.074 presentada el 8 de julio de 1998, Solicitud Internacional PCT/US 98/14241. Además, se describe el uso de inhibidores de calpaína junto con vectores virales para aumentar la eficacia de transducción en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos U.S.S.N. 09/172.685 y 60/104321 presentadas el 15 de octubre de 1998.

Puede usarse un amplio intervalo de virus incluyendo, aunque sin limitación, adenovirus, poxvirus, iridovirus, herpesvirus, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adeno-asociados, virus vaccinia, rotavirus, etc. (véase, por ejemplo, Anderson, Science (1992) 256: 808-813); siendo los adenovirus particularmente preferidos. Los virus son preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacuna atenuadas, y etcétera. Por tanto, por ejemplo, un adenovirus recombinante ejemplar que puede usarse es A/C/N/53, que se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 95/11984.

La formulación descrita en este documento es particularmente muy adecuada para estabilizar un virus recombinante, tal como un adenovirus recombinante vivo (o "vector viral"), para uso terapéutico en terapia génica. Por ejemplo, el virus usado en la presente invención puede comprende un gen supresor tumoral, tal como un gen p53 de tipo silvestre o un gen Rb (por ejemplo, p110^{RB} o p56^{RB}), y con transgenes tales como p53 de tipo silvestre insertados en un vector viral, la composición puede usarse como una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

A este respecto, las formulaciones descritas en este documento tienen una capacidad remarcable de mantener la viabilidad de virus vivos, en particular un vector viral en el que se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un transgén tal como p53. Esta característica permite al virus mantener su capacidad de infectar células diana de modo que la proteína terapéutica codificada por el transgén insertado se produzca adecuadamente.

Específicamente respecto a p53 y sus usos, se aprecia que la mutación del gen p53 es la alteración genética más habitual en cánceres humanos (Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). La introducción de p53 de tipo silvestre en células cancerosas de mamífero que carecen de la proteína p53 de tipo silvestre endógena suprime el fenotipo neoplásico de esas células (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.532.220).

En los siguientes ejemplos (Ejemplos 1-5, aunque no son procedimientos, se mantienen para información de los antecedentes), el virus es un adenovirus recombinante vivo que contiene el gen p53 de tipo silvestre. La construcción de vector viral particular usada en estos ejemplos se menciona en este documento como "A/C/N/53". A/C/N/53 (también mencionada como "ACN53") es una construcción de vector viral particularmente preferida descrita en la solicitud relacionada USSN 08/328.673 presentada el 25 de octubre de 1994, y en el documento WO 95/11984 (4 de mayo de 1995).

Una fórmula representativa para las realizaciones preferidas de la presente invención que contienen Polysorbate 80 se expone a continuación

Fórmula Representativa

1

(Las composiciones se almacenan típicamente en dosificaciones de 1,0 ml. "añ. c.s." en la fórmula anterior significa añadir suficiente disolvente para alcanzar el volumen total de 1 ml).

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A continuación se exponen cuatro realizaciones particularmente preferidas. (El Polysorbate 80 está presente en los Ejemplos 1 y 2, pero ausente en los Ejemplos 3 y 4)

2

Los siguientes ingredientes: fosfato sódico monobásico dihidrato, trometamina, cloruro de magnesio hexahidrato, sacarosa, y glicerol pueden obtenerse todos de, por ejemplo, EM Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, Nueva York 10532. El Polysorbate 80 está disponible en, por ejemplo, ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, 19897.

Composiciones: pueden prepararse durante la purificación del virus en una columna de cromatografía de filtración en gel combinando los ingredientes (excluyendo Polysorbate-80) a las concentraciones deseadas en la columna de filtración en gel. (Con respecto a los procedimientos de filtración en gel, puede hacerse referencia, por ejemplo, a la siguiente Sección V). Después, si se desea diluir la concentración del virus, o incorporar Polysorbate-80, entonces pueden prepararse diluyentes por técnicas convencionales. Se expone un ejemplo ilustrativo a continuación:

Se carga y disuelve fosfato sódico monobásico dihidrato, trometamina, sacarosa, cloruro de magnesio hexahidrato y glicerol en aproximadamente el 75% del volumen del lote de agua para inyección a temperatura ambiente en un recipiente de acero inoxidable equipado con un agitador. El lote del diluyente resultante se lleva al volumen final con agua para inyección. Se comprueba el pH. Se calcula el volumen necesario de sustancia de fármaco A/C/N/53 (adenovirus con p53 de tipo silvestre como transgén) en suspensión y el volumen necesario de diluyente para preparar una inyección de A/C/N/53. Si la inyección de A/C/N/53 final va a contener Polysorbate 80, se prepara una solución madre que contiene un exceso del 10% de Polysorbate 80 en diluyente. Se cargan las cantidades calculadas de sustancia de fármaco A/C/N/53 en suspensión y diluyente en un recipiente de acero inoxidable y se mezclan. Se carga la solución de Polysorbate 80, antes de añadir todo el diluyente, en base al 10% del volumen de lote de inyección de A/C/N/53 total si se requiere. Se filtra asépticamente la suspensión a través de un filtro esterilizado (0,22 \mum o equivalente). Se ensaya la integridad del filtro después de la filtración. Se recoge y se carga la suspensión esterilizada en viales que tienen el volumen apropiado. Se tapan y se precintan los viales.

Se exponen los datos de estabilidad de los Ejemplos 1, 2, 3, y 4, respectivamente, en las siguientes Tablas 1, 2, 3, y 4.

En las siguientes Tablas, el ensayo de antiproliferación es un bioensayo usado para medir la capacidad del producto de suprimir las células cancerosas y se basa en líneas generales en el procedimiento usado por Wills, y col., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088. Los números enumerados indican la actividad mientras que el control no tiene actividad.

El "Ensayo de Placa" mide las partículas virales en cultivo valorando la cantidad de placas virales como función de la dilución y se basa en líneas generales sobre procedimientos descritos en Graham, F.L., y Prevec, L., Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E.J. Murray, ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pág. 109-128 (1991); véase también Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., y Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pág. 59-74 (1977).

El ensayo "FACS" muestra la capacidad del virus de infectar células, y estas mediciones se basan en líneas generales en los procedimientos descritos en, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/11865 (documento WO 98/01582, publicado el 15 de enero de 1998). En la siguiente columna a la derecha, los números presentados bajo el encabezado "Concentración" representan la concentración de la cantidad total de partículas virales. Finalmente, los números bajo el encabezado "Proporción Partícula/FACS" representan la proporción de la cantidad total de partículas virales en comparación con la cantidad de partículas virales infecciosas, que indica por tanto la potencia relativa de la preparación viral.

Los datos bajo el encabeza "UV" indican la agregación de las partículas virales mostrada por la proporción de absorbancia UV para las longitudes de onda A_{320}/A_{260} como una indicación de la dispersión de luz. Básicamente, la absorbancia a longitud de onda de 320 nanómetros mide la cantidad de dispersión de luz, mientras que la absorbancia a longitud de onda de 260 nanómetros se correlaciona con la cantidad de ADN.

Las temperaturas enumeradas en la segunda columna de las tablas bajo "condición" representan la temperatura de almacenamiento. Los ensayos fisiológicos se realizan a 37ºC y el pH en la última columna se mide a temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

4

5

6

7

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Ejemplo 5

Formulación para el Ejemplo 5: A/C/N/53 (7,5x10^{11} partículas/ml), Trometamina (TRIS) (1,7 mg/ml), Fosfato sódico monobásico dihidrato (1,7 mg/ml), Sacarosa (20 mg/ml), Cloruro de magnesio hexahidrato (0,4 mg/ml), Glicerol (100 mg/ml), Cloruro sódico (5,8 mg/ml), Volumen de carga = 10 ml.

8

\newpage

En algunos casos, se ha observado que se forman particulados en la formulación durante el almacenamiento a 4ºC. El análisis de los particulados por SDS-PAGE sugiere que los particulados están compuestos por impurezas minoritarias (es decir, proteínas adicionales y algunas partículas virales inmaduras), y por tanto estos particulados no afectan a la viabilidad de la formulación. No obstante, en una realización preferida para aclarar adicionalmente la formulación (para evitar la posible formación de particulados), puede realizarse una etapa opcional de microfiltración para eliminar cualquier particulado potencial con poca pérdida de partículas virales. (Cuando se realiza la microfiltración, debe apreciarse que es crítica una suficiente área superficial de la membrana de microfiltración por volumen de filtración para evitar la pérdida de virus según se retira el particulado).

Además, en una realización preferida, los presentes inventores han descubierto que la agitación, tal como batido, puede acelerar la formulación de particulados y por lo tanto es una etapa opcional adicional en el procedimiento de aclarado. Por tanto, la agitación suave (por ejemplo, durante una noche, 10ºC, usando una barra de agitación magnética) seguido de microfiltración demostró eliminar los particulados de modo que no volviera a formarse más particulado después de re-agitación.

También se descubrió que ciclos de congelación/descongelación podrían promover la formación de particulado durante la re-agitación. Por tanto, en otro procedimiento preferido, pueden realizarse opcionalmente uno o más ciclos de congelación/descongelación, seguido de agitación, y después microfiltración, para la prevención de formación de particulado durante el almacenamiento del producto viral final a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, 4ºC).

Procedimiento para Concentrar y Purificar Composiciones que Contienen Virus

La presente solicitud también describe un nuevo procedimiento para concentrar de forma estable una preparación de virus existente empleando una función de flujo tangencial (a partir de ahora mencionado a veces como "TFF"), que permite seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en un amplio intervalo de concentraciones deseadas. El nuevo procedimiento para concentrar una preparación de virus descrito en este documento comprende:

(a) añadir un polihidroxi hidrocarburo a una preparación de virus a una concentración final de polihidroxi hidrocarburo de aproximadamente el 20% o más; y

(b) someter la preparación de virus a un procedimiento de filtración en el que se aumenta la concentración de virus aplicando presión a la preparación de modo que el diluyente se elimine de la preparación de virus a través de un filtro mientras se retiene el virus.

Los procedimientos de la presente invención son susceptibles a un amplio intervalo de virus incluyendo, aunque sin limitación, adenovirus, poxvirus, iridovirus, herpesvirus, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adeno-asociados, virus vaccinia, rotavirus, etc.; siendo los adenovirus particularmente preferidos. Los virus son preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacuna atenuadas, y etcétera. La presente invención es particularmente útil para concentrar virus recombinantes que llevan un transgén heterólogo para su uso en terapia génica. Dichos virus son especialmente vulnerable a fuerzas potencialmente desestablizantes, tales como las fuerzas mecánicas de cizalla adicionales que acompañan a los procedimientos para concentrar preparaciones de virus. Un adenovirus recombinante ejemplar que puede concentrarse por el procedimiento de la invención es A/C/N/53, que se describe en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 95/11984.

El procedimiento de filtración usado para concentrar el virus de acuerdo con el procedimiento de la presente descripción puede incluir cualquier procedimiento de filtración (por ejemplo, ultrafiltración) en el que se aumente la concentración del virus forzando a un diluyente a pasar a través de un filtro de tal modo que el diluyente se retire de la preparación de virus mientras que el virus es incapaz de pasar a través del filtro y por lo tanto permanece, en forma concentrada, en la preparación de virus. La ultrafiltración se describe con detalle en, por ejemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., Nueva York, NY, 1996). Un procedimiento de filtración particularmente preferido es la filtración de flujo tangencial ("TFF") como se describe en, por ejemplo, el catálogo MILLEPORE titulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pág. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). El aparato de TFF preferido comprende un sistema de filtro Pellicon II o Pellicon XL de Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts (dirección web: www.millipore.com), siendo particularmente preferido un sistema Pellicon XL. En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención se realizan a temperaturas en un intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.

Pueden emplearse otros procedimientos de concentración para concentrar preparaciones de virus de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, puede usarse ventajosamente el empleo de polihidroxi hidrocarburo para concentrar una preparación de virus por centrifugación. Por tanto, la presente invención también proporciona un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y

(b) recuperación del virus de la primera capa.

A modo de ejemplo, puede concentrarse una preparación de adenovirus por centrifugación a baja velocidad a 3.200 g usando rotores de cubeta giratoria de una centrífuga Beckman. Para conseguir esto, la preparación de virus puede colocarse en múltiples tubos de 5 ml, conteniendo cada tubo un volumen del 6,25% del glicerol al 70% en una primera capa en la parte inferior del tubo, cubierto con un volumen del 2,5% de glicerol al 20%, con la preparación de virus superpuesta sobre la parte superior. La preparación después se centrifuga a 3.200 g a 4ºC durante aproximadamente 16 horas para sedimentar el virus concentrado en las capaz de glicerol y después la preparación de virus recién concentrada se recupera posteriormente de la primera capa. El virus concentrado por los procedimientos descritos anteriormente tenía buenas características de dispersión de luz y tenía propiedades de infectividad adecuadas.

Con respecto al polihidroxi hidrocarburo usado en los procedimientos de la presente invención, un "polihidroxi hidrocarburo" significa un compuesto ramificado, lineal, o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 4) grupos hidroxi, y una cantidad eficaz de polihidroxi hidrocarburo es una cantidad suficiente para estabilizar el virus frente a fuerzas potencialmente desestabilizantes, tales como las fuerzas mecánicas de cizalla que existen durante el procedimiento de concentración. Preferiblemente, el polihidroxi hidrocarburo en los procedimientos de concentración de virus descritos en este documento está presente en una concentración mínima del 20%, más preferiblemente del 25%. Los polihidroxi hidrocarburos para su uso en la presente invención preferiblemente son compuestos alquilo polihidroxi-sustituidos (ramificados o sin ramificar), que tienen preferiblemente de 2 a 7 átomos de carbono, y pueden incluir glicerol, sorbitol y polipropanol. El glicerol es particularmente preferido.

El nuevo procedimiento de los inventores para aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de potencial el procesamiento, por ejemplo, eliminando los atascos problemáticos permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante diversas etapas de prensado tales como cromatografía por exclusión de tamaño. Por tanto, en una realización preferida, el procedimiento para concentrar preparaciones de virus de acuerdo con la presente invención puede aplicarse a procedimientos para purificar virus en los que se realiza una etapa de cromatografía por exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración en gel) después de cromatografía de intercambio aniónico. En esta realización, existen amenazas adicionales contra la estabilidad del virus provenientes no solamente de las fuerzas mecánicas de cizalla necesarias para concentrar el virus antes de la etapa de cromatografía por exclusión de tamaño limitante de la velocidad, sino también debido al hecho de que la preparación de virus eluida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico típicamente contiene elevados niveles de sales y otras impurezas que comprometen adicionalmente la estabilidad del virus.

Se describe en este documento un procedimiento para purificar una preparación de virus que comprende:

(a) someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye en forma de un producto de preparación de virus de un medio de cromatografía de intercambio aniónico;

(b) añadir un polihidroxi hidrocarburo al producto de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de polihidroxi hidrocarburo en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente el 25% o más; y

(c) aumentar la concentración de virus en el producto de preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de modo que se retire el diluyente de la preparación de virus o a través de un filtro mientras se retiene el virus; y

(d) someter el producto de preparación de virus concentrado de la etapa (c) a una o más etapas de procesamiento adicionales.

En el procedimiento expuesto anteriormente en relación con la cromatografía de intercambio aniónico, el nivel mínimo de glicerol es del 25% (en lugar del nivel mínimo del 20% en aplicaciones generales de los procedimientos de concentración descritos en este documento debido a que esta aplicación particular debe tener en cuenta las amenazas adicionales a la estabilidad presentadas por las elevadas concentraciones salinas en el producto eluido de la columna de intercambio aniónico. La adición de glicerol al 25% (preferiblemente el 30%) provoca la estabilidad de la combinación DEAE que contiene sales durante >10 días a, por ejemplo, 4ºC; por lo tanto puede realizarse etapas posteriores de concentración de virus y/o filtración en gel en días diferentes con flexibilidad sustancial a través de un periodo de 10 días. Como se apreciará, el empleo de polihidroxi hidrocarburo en la concentración más elevada del 25% o más también puede usarse more en procedimientos de la presente invención cuando la preparación de virus contiene elevado contenido salino debido a otras condiciones de procesamiento.

V. Ejemplos del procedimiento descrito en este documento

Breve resumen - Se inicia un lote concentrado con materiales virales brutos congelados que se originan de la recuperación de fermentación. En una realización, el producto de adenovirus primero se purifica por cromatografía de intercambio aniónico. Después, antes de cargar la preparación en una columna de exclusión de tamaño, puede concentrarse la combinación de intercambio aniónico por filtración de flujo tangencial (TFF) en presencia de glicerol al 30% (v/v). Como alternativa, en otra realización, la etapa de concentración por TFF puede realizarse en presencia de glicerol al 20% (v/v) o más (preferiblemente el 25%) después de cromatografía por exclusión de tamaño.

\bullet Preparación de materiales de partida por cromatografía de intercambio aniónico antes de TFF

En un caso preferido, se prepara una combinación adenoviral de intercambio aniónico para su concentración del siguiente modo. Se descongela el material viral congelado de las etapas de fermentación y recuperación y se filtra a través de una membrana hidrófila de 0,45 \mum. La concentración salina del filtrado se ajusta añadiendo cloruro sódico 4 M. Esta solución de suministro se aplica después a una columna Fractogel EMD DEAE-650M pre-equilibrada con fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro sódico 260 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) (tampón A). El adenovirus se une a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayor parte del medio y las impurezas de las células huésped pasan a través de la columna acabando en la carga gastada. La columna se lava inicialmente con 4 volúmenes de tampón A seguido de un segundo lavado isocrático de 8 volúmenes de lecho de tampón A al 94% y tampón B al 6% (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro sódico 600 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)) para retirar las impurezas adicionales. El virus se eluye de la columna con un gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho de tampón B del 6% al 100%. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución determinado por A_{280}. Después se añade glicerol a la combinación DEAE a una concentración final del 30% (v/v) para el procesamiento adicional.

\bullet Concentración de la combinación DEAE usando filtración de flujo tangencial

La combinación DEAE (preparada de acuerdo con la descripción anterior) se concentra a factor 10 a 20 usando una unidad Millipore TFF (Pellicon XL System) con membranas Biomax de punto de corte de peso molecular 1 millón. El procedimiento se realiza a 2-10ºC o temperatura ambiente (25ºC). Se usan los siguientes parámetros de filtración en este procedimiento: presión promedio de entrada = 96,50 kPa (14 psi); presión promedio de filtración = 0 kPa (0 psi); caudal promedio average = 13 litros/hora-metro cuadrado. La concentración final de adenovirus consigue aproximadamente 1,0-2,0 x 10^{13} partículas por ml. En base al análisis Resource Q-HPLC y de absorbancia UV (A_{260}), la recuperación de la etapa de concentración es de >80% sin agregación significativa (ensayo de dispersión de luz por A_{320}/A_{260}).

\bullet Intercambio de tampón por cromatografía de exclusión de tamaño (filtración en gel)

La preparación de adenovirus concentrada se aplica a una columna de exclusión de tamaño Superdex-200 pre-equilibrada con fosfato sódico 20 mM pH 8,0, cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10% (tampón C) o fosfato sódico 11 mM, Tris 14 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10%, pH 7,8 (tampón D). La columna se eluye con tampón de equilibrado. Se recoge y se combina el pico de adenovirus del perfil de elución determinado por A_{280}. La preparación concentrada de adenovirus se filtra a través de una membrana hidrófila de 0,2 \mum Durapore (Stericup, Millipore) de 2 a 10ºC, y puede almacenarse a -80ºC, o a temperaturas mayores (tal como de 2 a 10ºC).

\bullet Concentración de combinación Superdex-200 usando filtración de flujo tangencial

Como se ha analizado anteriormente, una realización preferida de la presente invención implica concentrar el virus después de cromatografía de intercambio aniónico, pero antes de filtración en gel. Sin embargo, en otra realización, los procedimientos descritos para concentrar preparaciones de virus también pueden usarse después de la etapa de filtración en gel (incluso si no se emplea una etapa de concentración de virus entre la etapa de intercambio aniónico y la etapa de filtración en gel). En este caso, los parámetros de filtración son los mismos que para la concentración de una combinación DEAE, excepto en que puede añadirse polihidroxi hidrocarburo (por ejemplo, glicerol) a la combinación Superdex-200 a una concentración final tan baja como del 20% (v/v) ya que ya no es necesario ocuparse de las elevadas concentraciones salinas en la combinación DEAE. A este respecto, debe apreciarse que en casos en los se pospone la adición de polihidroxi hidrocarburo hasta después de la filtración en gel, la combinación DEAE debe aplicarse inmediatamente a la columna de filtración en gel (debido a la vulnerabilidad de la combinación DEAE - con sus elevada concentración salina). Por tanto, puede observarse que una ventaja adicional de añadir polihidroxi hidrocarburo a la combinación DEAE (de acuerdo con la presente invención) es la flexibilidad aumentada en términos de intervalo de tiempo y opciones de almacenamiento durante el periodo de tiempo entre la cromatografía de intercambio aniónico y el posterior procesamiento.

Los métodos para concentrar preparaciones de virus pueden aplicarse en conexión a una diversidad de procedimientos de purificación. Para información adicional sobre procedimientos de purificación, puede hacerse referencia, por ejemplo, a Huyghe y col., Human Gene Therapy, Vol. 6, pág. 1403-1416 (1995) y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de serie 08/989.227.

VI. Datos de estabilidad para los procedimientos para concentrar preparaciones de virus usando filtración de flujo tangencial

Como se muestra por los siguientes datos experimentales, los procedimientos de la presente descripción permiten potenciar enormemente la estabilidad de los virus, a pasear de las fuerzas mecánicas de cizalla para concentrar el virus, y a pesar de las duras condiciones tales como elevados niveles salinos en una combinación DEAE. Por tanto, los procedimientos de la presente invención permite, inter alia, (1) la preparación fácil de dosificaciones clínicas a cualquier concentración deseada (incluso cuando se parte de material que tiene una concentración inferior), (2) la potenciación del procesamiento (por ejemplo, permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante la cromatografía por exclusión de tamaño), y (3) la estabilidad de la combinación DEAE que contiene sales durante >10 días a 2-10ºC (permitiendo por tanto que se realicen posteriores etapas de concentración de virus y/o filtración en gel en días diferentes con flexibilidad sustancial a través de un periodo de 10 días).

A. Concentración de virus después de cromatografía en DEAE

En los siguientes tres ejemplos, se prepararon concentraciones estable de adenovirus concentrando combinaciones DEAE en glicerol al 30% (de acuerdo con los procedimientos de la presente invención). Las preparaciones después se sometieron a purificación adicional por cromatografía por filtración en gel Superdex-200 para obtener la formulación final para el ensayo.

Ejemplo D-1

Formulación final: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados: Partículas/FACS = 24 Dispersión de luz (A320/A260) = 0,22 Conc. = 1,6 x 10^{13} partículas/ml

Ejemplo D-2

Formulación final: Tris base 14 mM, NaPi 11 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 7,8 a 2-10ºC.

Resultados: Partículas/FACS = 17 Dispersión de luz (A320/A260) = 0,25 Conc. = 1,5 x 10^{13} partículas/ml

Ejemplo D-3

Formulación final: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados: Partículas/FACS = 24 Dispersión de luz (A320/A260) = 0,25 Conc. = 1,3 x 10^{13} partículas/ml.

B. Concentración de virus después de filtración en gel

Ejemplo S-1

En el siguiente ejemplo, la preparación de virus se concentró en glicerol al 20% después de filtración en gel.

Formulación final: NaPi 16 mM, NaCl 80 mM, MgCl_{2} 1,6 mM, sacarosa al 1,6%, glicerol al 20%, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados: Partículas/FACS = 72; Dispersión de luz (A320/A260) = 0,26 Conc. = 1,66 x 10^{13} partículas/ml

Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invención no debe interpretarse como limitada por las mismas.

Claims (6)

1. Un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y

(b) recuperación del virus de la primera capa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es un virus recombinante.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es un virus recombinante que lleva un transgén a terapéutico para su uso en terapia génica.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polihidroxi hidrocarburo es glicerol.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es adenovirus.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el virus recombinante es A/C/N/53.