KR20170004966A - 바이러스 감소 방법 - Google Patents

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KR20170004966A
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피터 스탠리 가그논
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

단백질 제제들 내의 바이러스 및 바이러스 DNA 레벨들의 감소를 향상시키기 위한 방법들이 제공된다.

Description

바이러스 감소 방법{VIRUS REDUCTION METHOD}
여기에 개시되는 실시예들은 정제되는 원하는 단백질을 함유하는 제제들 내의 바이러스들 및 바이러스 폴리뉴클레오티드들의 감소를 위한 방법들에 관한 것이다.
일부 바이러스 종들은 고도의 산성의 pH와 같은 극한의 조건들에 대한 노출에 의해 불활성화되는 것으로 알려져 있다. 이들은 지질 피막형 바이러스들의 대부분의 종들을 포함한다. 일부 바이러스 종들은 이러한 불활성화에 저항하는 것으로 알려져 있다. 이들은 단백질 코트 바이러스들로도 언급되는 많은 비지질 피막형 바이러스 종들을 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)가 오염시키는 바이러스 종들의 제거를 포함하여 단백질들의 정제를 위해 통상적으로 이용된다. 이러한 적용들을 위해 사용되는 음이온 교환체들은 흔히 사차 아민 이온 교환체들이다. 이들 적용들은 일반적으로 이들 조건들 하에서 가장 강한 바이러스 결합을 유지하기 때문에 중성에서 약간 알칼리성의 pH에서 수행되며(C. Curtis 등의 "Biotechnol. Bioeng."(84 (2003) 179-185)), 이러한 조건들은 바이러스들을 제거하는 것과 병행하여 오염시키는 숙주 세포 단백질들을 제거하기 위해 요구된다(P. Gagnon의 "J. Chromatogr. A"(1221 (2012) 57-70)). 일차 아민계 음이온 교환체들 또한 중성에서 알칼리성의 동작 pH에서 바이러스 및 숙주 세포 단백질의 제거에 대해 기술되어 있다(W. Riordan 등의 "Biotechnol. Prog."(25 (2009) 1695-1702)).
본 발명은 단백질 제제들 내의 바이러스 및 바이러스 DNA 레벨들의 감소를 향상시키기 위한 방법들을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질의 산성의 제제(preparation) 내의 바이러스 및 바이러스 DNA 레벨들을 감소시키기 위한 방법들이 여기에 개시되며, 상기 방법은 상기 원하는 단백질의 산성의 제제를 일차 아민, 이차 아민 또는 이들 모두를 지니는 표면과 접촉시키는 단계를 포함한다.
낮은 pH 처리 동안에 또는 후속하여 낮은 pH에서 제제를 일차 및/또는 이차 아민들을 지니는 고체 표면과 접촉시켜 원하는 단백질을 함유하는 제제로부터의 바이러스 및 바이러스 DNA의 향상된 제거를 위한 방법들이 제공된다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "낮은 pH" 처리는 바이러스 불활성화 처리의 일부로서 충분히 낮은 pH, 즉, 적어도 하나의 바이러스를 불활성화시키도록 충분히 낮은 pH를 언급한다. 따라서, 상기 pH 범위의 상단은 통상적으로 약 4.0보다 크지 않을 것이다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 낮은 pH는, 예를 들면, 약 1.0부터 약 4.0까지, 또는 일부 실시예들에서, 약 2.0부터 약 4.0까지, 또는 약 2.0부터 약 3.8까지의 범위가 될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자는 상기 pH가 규제 기준들에 따르도록 선택될 수 있는 점을 이해할 것이다. 통상적인 경우에 있어서, 상단 규제 한계 pH는 약 3.8이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질의 산성의 제제 내의 바이러스 및 바이러스 DNA 레벨들을 감소시키기 위한 방법들이 제공되며, 상기 방법은 상기 원하는 단백질의 산성의 제제를 일차 아민, 이차 아민, 또는 이들 모두를 지니는 표면과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 동안의 동작 pH는 (a) 약 2.0부터 약 4.0까지, (b) 약 2.25부터 약 3.75까지, (c) 약 2.5부터 약 3.5까지, (d) 약 2.75부터 약 3.25까지, (e) 약 3.5부터 약 3.75까지 및 (f) 약 3.25부터 약 3.5까지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 범위 이내일 수 있고, 중간 범위들 또는 그 사이의 중간의 개별적인 값들이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 동안의 염 농도는 (a) 약 0.0M 또는 영(zero)이 아닌 값으로부터 약0.5M까지, (b) 약 0.05M부터 약 0.3M까지 및 (c) 약 0.1M부터 약 0.2M까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다. 상기 염 농도는 임의의 중간 범위들 또는 이들 언급된 범위들 사이의 중간의 각각의 값들이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 접촉시키는 단계의 기간은 (a) 약 15분부터 약 120분까지, (b) 약 30분부터 약 60분까지, (c) 약 30분 이하의 영(zero)이 아닌 양, (d) 약 15분 이하의 영이 아닌 양, (e) 약 10분 이하의 영이 아닌 양, (f) 약 5분 이하의 영이 아닌 양, (g) 약 2분 이하의 영이 아닌 양, (h) 약 1분 이하의 영이 아닌 양, 그리고 (i) 상기 제제를 상기 일차 아민을 지니는 표면을 수용하는 장치로 통과시키는 데 요구되는 시간으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 표면은 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 디에틸아민트리아민(diethylaminetriamine), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetraamine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine) 및 폴리알킬아민(polyalkylamine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 모이어티(moiety)들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 표면은 임의의 일차 아민, 이차 아민 또는 이들의 결합들을 포함할 수 있다. 상기 표면은 기재의 표면에 부착되는 임의의 직쇄 또는 분지된 일차 모노아민 조각(monoamine fragment)으로부터 유래될 수 있거나, 이러한 형태를 취할 수 있다. 예시적인 일차 아민 모이어티들은, 제한되지 않고, 메틸아민(methylamine), 에틸아민(ethylamine), 프로필아민(propylamine), 이소프로필아민(isopropylamine), 부틸아민(butylamine), 이차 부틸아민(sec-butylamine), 이소-부틸아민(iso-butylamine), 헥실아민(hexylamine)의 임의의 이성체 구성, 헵틸아민(heptylamine)의 임의의 이성체 구성, 옥틸아민(octylamines), 노닐아민(nonylamine)의 임의의 이성체 구성, 데실아민(decylamine)의 임의의 이성체 구성, 또는 이들의 혼합물들이나 결합들에 기초하는 조각들을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 디아민(diamine) 조각들이 채용될 수 있다. 적합한 디아민들은 include, 제한되지 않고, 다음의 일반 화학식의 디아민들을 포함한다.
H2N-R-NH2
여기서, R은 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 선형이나 분지된 알킬(alkyl) 또는 알케닐(alkenyl) 기들, 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 시클로알케닐(cycloalkenyl) 기들 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 알킬시클로알케닐(alkylcycloalkenyl) 기들, 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 알카레닐(alkarenyl) 기, 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 아랄케닐(aralkenyl) 기, 또는 유사한 것들이나 이의 혼합물들 또는 결합들이다. 상기 R 기는 또한 산소, 질소, 불소 및/또는 염소와 같은 탄소와 수소 이외의 원자들을 포함할 수 있다.
적합한 표면 아민 모이어티들은, 제한되지 않고, 알킬 디아민들, 시클로알킬(cycloalkyl) 디아민들, 알카시클로알킬(alkacycloalkyl) 디아민들, 아랄킬(aralkyl) 디아민들, 아릴(aryl) 디아민들, 알카릴(alkaryl) 디아민들 및 유사한 것들과 이의 유사체들을 포함하는 디아민들 및 트리아민(triamine)들게 기초할 수 있으며. 여기서 상기 탄소 원자들의 하나 또는 그 이상은 질소 원자들, 산소 원자들 또는 이들의 혼합물들로 대체될 수 있고, 여기서 상기 산소 원자들은 카르복시(carboxy), 하이드록시(hydroxy)를 형성하거나 및/또는 모이어티들과 질소 원자들은 삼차 아민을 형성하거나 및/또는 아미드(amide) 모이어티들 및/또는 하나 또는 그 이상의 수소 원자들은 불소 원자들, 염소 원자들 또는 이들의 혼합물들로 대체될 수 있고, 약 3개 내지 약 15개의 탄소 원자들을 포함하고, 약 4개 내지 약 10개의 탄소 원자들을 포함하여 2개 내지 약 20개의 탄소 원자들을 구비한다. 예시적인 아킬 디아민들은, 제한되지 않고, 1,2-디아미노에탄(diaminoethane)(1,2-에틸렌 디아민(ethylene diamine)), 1,2-디아미노프로판(diaminopropane), 1,3-디아미노프로판, 1,2-디아미노부탄(diaminobutane), 1,3-디아미노부탄, 1,4-디아미노부탄, 1,2-디아미노펜탄(diaminopentane), 1,3-디아미노펜탄, 1,4-디아미노펜탄, 1,5-디아미노펜탄, 그리고 유사한 고급의 디아미노알칸(diaminoalkane)들, 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine), 아미노메틸시클로펜틸아민(aminomethylcyclopentylamine), 1,2-시클로펜탄디아민(cyclopentanediamine), 1,6-헥산디아민(hexanediamine), 1,2-디아미노벤젠(diaminobenzene), 리신(lysine)(또는 다른 디아민 아미노산들), 1,2-디아미노벤젠, 1,4-디아민 벤젠(diamine benzene), 1,2-디페닐(diphenyl)-1,2-에탄 디아민(ethane diamine), 페닐렌다아민(phenylenediamine), 2-하이드록시프로필렌 디아민(hydroxypropylene diamine), 히단토인(hydantoin), N,N-비스(Bis)(디하이드록시에틸(dihydroxyethyl))에틸렌디아민(ethylenediamine), 헥사하이드로트리아진(hexahydrotriazine), 아미노에틸피페라진(aminoethylpiperazine: AEP) 또는 이와 유사한 것들이나 이의 혼합물들 또는 결합들을 포함한다. 주제 조성물들을 만드는 데 충분히 사용될 수 있는 다른 지방족 디아민들 및 트리아민들의 예들은 1,4-디아미노시클로헥산(diaminocyclohexane) 및 비스(bis)-헥사메틸렌트리아민(hexamethylenetriamine)을 포함한다. 앞서 설명한 모든 실시예들에 있어서, 상기 기재의 표면상의 아민의 존재는 질소 자체를 포함하여 상기 조각들의 임의의 것의 임의의 원자들에 대한 연결성을 통해 구현될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 이차 아민 또한 채용될 수 있다. 이러한 이차 아민들은 다른 직쇄 또는 분지된 C1 내지 C20 조각을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 표면은 입자, 멤브레인, 모놀리스(monolith), 히드로겔(hydrogel) 코팅된 골격 구조(skeletal framework) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹들로부터 선택되는 하나의 형태이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 (a) 일차 및/또는 이차 아민을 지니는 입자들을 상기 제제 내에 분산시키는 단계, (b) 상기 제제를 상기 표면과 유체 접촉하는 장치로 통과시키는 단계, (c) 상기 제제를 상기 표면과 유체 접촉을 제공하는 장치를 통해 재순환시키는 단계, 그리고 (d) 이들의 결합들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 동작에 의해 수행된다.
고체 표면상의 일차 및/또는 이차 아민들에 대한 바이러스 결합이 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)의 인정된 규칙들에 어긋나는 점이 예치기 않게 발견되었다. 상기 일차 아민을 지니는 표면으로부터 결합된 바이러스 또는 바이러스 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)들을 용리시키도록 요구되는 염의 농도에 의해 측정되는 경우에 결합력은 감소하는 pH의 함수로서, 일부 경우들에서는 pH 8에서 동일한 표면상의 결합과 비교해 2 이상의 인자에 의해, pH 8에서 사차 교환체(exchanger)들 상의 결합과 비교해 5 이상의 인자에 의해, 그리고 pH 6에서 사차 교환체들 상의 결합에 비해 거의 10 이상의 인자에 의해 증가된다. 결합은 보다 낮은 pH 값들에서 계속하여 강해지므로, pH 3에서 5M까지의 구아니딘(guanidine)이 상기 일차 및/또는 이차 아민을 지니는 표면으로부터 DNA를 제거하는 데 요구된다. 동시에, 실험 데이터는 약 150kDa 이하의 질량을 갖는 펩티드들 및 단백질들의 유지가 pH 8과 비교하여 향상되지 않으며, 이에 따라 대부분의 제제들 내의 상기 원하는 단백질이 바이러스 및 바이러스 DNA의 유지가 향상되는 조건들 하에서 상기 일차 및/또는 이차 아민을 지니는 표면과 결합하지 않는 윈도우를 생성하는 점을 보여준다. 실험 데이터는 이러한 점이 낮은 pH로의 처리에 의해서는 크게 불활성화되지 않는 A형 간염(Hepatitus A) 바이러스 및 미세 생쥐 바이러스(Minute virus of Mice)와 같은 비-지질 피막형 바이러스들의 700-폴드(fold) 이상의 감소로 해석되는 것을 나타낸다. 이는 사차 음이온 교환체들 상의 바이러스들, DNA 및 단백질들과 같은 용질들의 유지가 상기 용질들이 보다 전기양성(및/또는 덜 전기음성)으로 되는 결과로서 감소되는 pH와 함께 약화되기 때문에 예상되지 못하였다. 이는 일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 관례적으로 이용되는 조건들과 같이 산성의 pH 및 특히 강한 산성의 pH 값들에서 바이러스 제거에 대해 음이온 교환 크로마토그래피가 유용하지 않게 되는 것으로 이해된다. 어떤 특정한 이론에 제한되지 않고, 일차 및/또는 이차 아민-을 지니는 표면들 상의 바이러스들 및 바이러스 DNA의 반대되는 행동이 수소 결합에 의해 매개될 수 있다. 이는 수소 결합이 이온 교환 행동을 병행해야 하는 그 기여를 제시하는 경향이 있는 전정기적 구성 성분들을 수반하기 때문에 예상되지 않는다. 소르비톨(sorbitol)과 같은 선택적인 수소 공여자-수용자들로의 경쟁 실험들로부터의 데이터는 그럼에도 불구하고 수소 결합을 나타낸다. 상기 행동은 해당 기술 분야에서 알려진 결과들에 대한 다중의 관점들에서 구별되고 반대되기 때문에 더 예상되지 않으며, 유지가 18kDa부터 78kDa까지의 크기 범위의 단백질들에 대하여 pH 8에 비해 pH 6에서 실질적으로 증가하는 점을 나타내고, 감소되는 pH에 대한 증가하는 결합의 크기 연관성이 존재하지 않는 점을 나타내며, 유지가 약 pH 6에서 가장 강하게 되고, 보다 낮은 pH에서 약화되며, pH 4-5에서 손실되는 점을 나타낸다(미국 특허 제6,090,288호). 여기에 개시되는 방법들을 지지하도록, 실험 데이터는 약 66kDa의 단백질에 대한 유지의 향상이 실질적으로 존재하지 않지만, 크기와 향상 사이에 강한 연관성이 있으며, 유지가 약 1MDa 또는 그 이상에 근접하는 크기를 갖는 용질들에 대해 6 이하의 pH 값들, 특히 4보다 작은 pH 값들에서 보다 강하게 계속되고, 이들 모두가 필요한 허용 인자들인 것을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 동작 pH는 pH 5 또는 그 이하, 혹은 4 또는 그 이하, 혹은 3.9 또는 그 이하, 혹은 3.8 또는 그 이하, 혹은 3.7 또는 그 이하, 혹은 3.6 또는 그 이하, 혹은 3.5 또는 그 이하, 혹은 3.4 또는 그 이하, 흑은 3.3 또는 그 이하, 혹은 3.3 또는 그 이하, 혹은 3.2 또는 그 이하, 혹은 3.1 또는 그 이하, 혹은 3.0 또는 그 이하와 같이 6 이하가 될 수 있으며, 그 임상적 효능이나 안전성에 영향을 미칠 수 있는 영구적 손상을 지속시키지 않고 상기 원하는 단백질에 의해 용인될 수 있는 가장 낮은 pH까지 낮아질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 용인될 수 있는 pH는 2.5 또는 그 이하, 혹은 2.0 또는 그 이하, 혹은 약 1.0이 될 수 있다. 가장 낮은 용인될 수 있는 pH는 각각의 원하는 생성물에 특유하며, 폭넓은 일반적인 기준으로 표현하는 점은 가능하지 않은 것으로 이해될 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 심지어 지질 피막형 바이러스 종들의 불활성화도 4 이하의 pH를 요구하기 때문에 최대의 pH는 약 4보다 크지 않을 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 pH는 3.25와 3.75 사이가 될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 염들이 결핍될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 하나 또는 그 이상의 염들의 종들을 함유할 수 있으며, 여기서 이러한 염들의 농도는 영(zero)이 아닌 양부터 0.01M까지, 0.05M까지, 0.1M까지, 0.2M까지, 0.3M까지, 0.4M까지, 0.5M까지, 또는 그 이상, 잠재적으로는 1.0M까지이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 염의 종은 염화나트륨(NaCl)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 염의 존재는 일차 아민을 지니는 표면에 의한 바이러스 제거에 무시할 수 있는 영향을 미칠 수 있지만, 일부 실시예들에서, 염의 존재는 상기 일차 아민을 지니는 표면에 의해 구현되는 바이러스 제거의 정도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 염들의 존재는 바이러스 불활성화를 향상시킬 수 있거나, 상기 원하는 단백질의 용해도를 증진시킬 수 있거나, 상기 원하는 단백질들의 용해도를 감소시킬 수 있다. 이러한 효과들은 원하는 단백질의 각 종들에 대해 결정될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 나타낸 범위들 내에서 증가되는 염 농도는 낮은 pH에서의 처리에 의해 단독으로 구현되는 불활성화의 정도에 대해 바이러스 제거가 상기 일차 아민을 지니는 표면에 의해 향상되는 정도를 제한할 수 있지만, 제거의 정도는 중요하게 남을 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 알렉시딘(alexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 트리(tri)(N-부틸(butyl))포스페이트(phosphate), 계면활성제, 킬레이트제(chelating agent), 또는 이러한 요소들의 결합들과 같은 바이러스 불활성화를 향상시키도록 의도되는 요소들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 이차 아민기들과 같은 전기양성의 화학 모이어티들의 다른 종들을 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 삼차 또는 사차 아민기들과 같은 전기양성의 화학 모이어티들의 다른 종들을 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 전기양성의 화학 모이어티들의 하나 이상의 종들을 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 임의의 상대적인 비율들로 이차 및 삼차 아민들; 이차 및 사차 아민들; 삼차 및 사차 아민들; 이차, 삼차 및 사차 아민들로 구성되는 전기양성의 화학 모이어티들의 결합을 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 포함하는 화학적 종들은 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이 될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 포함하는 화학적 종들은 에틸렌디아민이 될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 함유하는 화학적 종들은 폴리알릴아민(polyallylamine) 또는 다른 중합체성 일차 아민이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 상기 표면이 전체적으로 정전기적 상호작용들, 수소 결합들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합 및 금속 배위 상호작용들로 결속되게 허용하는 화학적 요소들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 상기 일차 아민들에 반대되는 전하를 갖는 요소들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 하전되지 않음에 의하거나 음성 및 양성 전하들, 또는 이들 모두의 균형을 이룬 비율들에 의해 전기적 중성인 요소들을 포함할 수 있다.
복수의 표면들이 존재하는 일부 실시예들에 있어서, 각각의 표면들은 동일한 일차 아민을 함유하는 종들을 지닐 수 있다. 복수의 표면들이 존재하는 일부 실시예들에 있어서, 각각의 표면들은 다른 일차 아민을 함유하는 종들을 지닐 수 있다. 복수의 표면들이 존재하는 일부 실시예들에 있어서, 각각의 표면들의 일부는 일차 아민들 이외의 종들을 지닐 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 아민을 지니는 표면은 입자, 멤브레인, 모놀리스, 거대 그물 모양의 골격(macro-reticulate skeleton) 상의 히드로겔(hydrogel)의 물리적인 형태가 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 복수의 입자들, 또는 복수의 멤브레인들, 또는 복수의 다른 물리적인 형태들, 또는 다른 물리적인 형태들의 결합들과 같은 단일 이상의 물리적 단위가 존재할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 복수의 입자들이 칼럼 내에 충진될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 복수의 일차 아민 표면들은 상기 원하는 단백질을 함유하는 제제 내에 현탁될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 현탁된 표면들은 침강, 또는 여과, 또는 부유 선별(flotation), 또는 자기장 내의 포착(entrapment), 또는 반대로 하전된 표면상의 포착, 또는 임의의 다른 편리한 수단들에 의한 처리 후에 제거될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질을 함유하는 제제는 바이러스 불활성화가 명목상으로 완료되었던 낮은 pH 처리 후에 하나 또는 그 이상의 일차 아민을 지니는 표면들을 포함하는 장치를 통해 흐를 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질 제제는 상기 낮은 pH 처리의 전체 기간에 이르는 시간까지의 기간 동안에 하나 또는 그 이상의 일차 아민 유체 접촉 표면들을 포함하는 장치를 통해 계속적으로 재순환될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질 제제는 앞서의 접촉의 모드들의 임의의 결합에 의해 표면들에 결합되는 하나 또는 그 이상의 일차 아민과 접촉될 수 있다.
개시되는 방법의 주요한 요소들을 예시하는 일 실시예에 있어서, IgG 단일클론성(monoclonal) 항체와 같은 부분적으로 정제된 원하는 단백질을 함유하는 제제는 3.5의 pH까지 적정되고, 이러한 pH에서 60분 동안 유지된다. 에틸렌디아민을 지니도록 변경된 표면을 갖는 모놀리스는 상기 항체 제제와 명목상으로 동일한 pH 및 염 조건들까지 평형화된다. 상기 제제는 이후에 상기 모놀리스를 통해 흐른다. 상기 모놀리스는 상기 원하는 단백질의 회수를 최대화하도록 pH 3.5에서 깨끗한 완충제로 선택적으로 세정될 수 있다. 상기 모놀리스는 이후에 선택적으로 폐기되거나 재생될 수 있다.
개시되는 방법의 주요한 요소들을 예시하는 또 다른 실시예에 있어서, 부분적으로 정제된 항체를 함유하는 제제는 3.5의 pH까지 적정된다. 에틸렌디아민을 지니도록 변경된 표면을 갖는 모놀리스는 상기 항체 제제와 명목상으로 동일한 pH 및 염 조건들까지 평형화된다. 상기 제제는 이후에 상기 원하는 단백질이 pH 3.5까지 60분 동안, 또는 일부 다른 특정된 시간 간격으로 노출되었을 때까지 상기 모놀리스를 통해 재순환된다.
개시되는 방법의 주요한 요소들을 예시하는 다른 실시예에 있어서, 부분적으로 정제된 항체를 함유하는 제제는 3.5의 pH까지 적정된다. 폴리알릴아민을 지니도록 변경된 표면을 갖는 멤브레인 흡착기(adsorber)는 상기 항체 제제와 명목상으로 동일한 pH 및 염 조건들까지 평형화된다. 상기 제제는 이후에 60분의 기간 동안 상기 멤브레인을 통해 재순환된다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, 상기 항체 제제는 pH 3.5에서 60분 동안 배양되고, 이후에 단일 경로로 멤브레인 흡착기를 통해 흐른다.
개시되는 방법의 주요한 요소들을 예시하는 또 다른 실시예에 있어서, 부분적으로 정제된 항체를 함유하는 제제는 3.5의 pH까지 적정된다. 에틸렌디아민, 또는 폴리알릴아민, 혹은 다른 일차 아민을 포함하는 리간드를 지니도록 변경된 표면들을 갖는 입자들은 상기 항체 제제와 명목상으로 동일한 pH 및 염 조건들까지 평형화된다. 상기 입자들은 60분의 기간 동안의 교반에 의해 현탁된 상태로 유지되며, 다음에 이들은 침강 또는 여과 또는 임의의 다른 편리한 방법에 의해 제거된다. 상기 입자들은 상기 원하는 단백질의 회수를 최대화하도록 pH 3.5에서 깨끗한 완충제로 선택적으로 세정될 수 있다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, 상기 항체 제제는 pH 3.5에서 60분 동안 배양되고, 이후에 에틸렌디아민, 폴리알릴아민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 또는 다른 일차 아민을 포함하는 리간드를 지니는 입자들로 충진된 칼럼을 통과한다.
다음의 용어들은 여기서의 실시예들이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.
"아민(amine)들"은 하나 또는 그 이상의 수소 원자들을 유기 라디칼들로, 흔히 메틸 또는 에틸기와 같은 탄화수소로 대체하여 암모니아로부터 유도되는 유기 화합물들로 정의된다. "일차 아민(primary amine)"에 대해, 하나의 수소 원자가 유기 라디칼로 대체된다. "이차 아민(secondary amine)"에 대해, 둘의 수소들이 유기 라디칼들로 대체된다. "삼차 아민(tertiary amine)"에 대해, 셋의 수소들이 유기 라디칼들로 대체된다. "사차 아민(quaternary amine)"에 대해, 셋의 수소들이 유기 라디칼들로 대체되고, 네 번째 유기 라디칼이 덜 치환된 아민들 상에 존재하는 전자쌍을 대체한다. 일차 아민을 함유하는 화합물들은 또한 다른 종류들의 아민들 또는 비아민 종들을 함유할 수 있다.
"수소 결합들(hydrogen bonds)은" 하나의 분자의 일부와 다른 분자의 전기음성의 원자 사이의 정전기적 이끌림의 일부로 및 공유결합 상호작용의 일부로 야기되는 두 분자들 사이의 약한 결합들로 정의된다.
"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되는 극히 미소한(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경), 대사적으로 불활성인 감염원을 언급하며, RNA 또는 DNA 코어(core), 단백질 코트 및 보다 복합한 유형들에서는 지질들의 하나 또는 두 개의 층들을 둘러싸는 외피로 구성된다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, (+)ssRNA 바이러스, (-)ssRNA 바이러스, ssRNA RT 바이러스 및 dsDNA-RT 바이러스; 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 파보바이러스(parvovirus), 레오바이러스(reovirus), 노로바이러스(norovirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 토가바이러스(togavirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤파단바이러스(hepadanvirus), 파필로바이러스(papillomavirus), 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus: HIV), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 그리고 박테리오파지(bacteriophage)들을 포함한다. 상기 바이러스라는 용어는 유전자 치료를 위한 벡터(vector)들로서의 사용, 백신들로서의 사용 및 항생물질들에 대한 대체로서의 사용을 위한 바이러스 입자들을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 이른바 가성비리온(pseudovirion)들을 포함하는 것으로 이해되며, 이들은 감염을 일으키는 이들의 능력을 제거하면서 방어 면역을 생성하는 이들의 능력을 보존하도록 재조합으로 변형되었던 바이러스 입자들로 기술될 수 있고, 또한 구분되는 바이러스 종들이 모두로 감염된 숙주 내에서 하나로부터 다른 하나로 자발적으로 유전자들을 전송하는 이종지향성(xenotropic) 바이러스 종들로서 기술될 수 있다.
"바이러스 불활성화(virus inactivation)"는 재생되는 능력을 중단시키는 방식으로 상기 바이러스를 손상시키는 프로세스를 언급한다. 열이 통상적으로 이러한 목적을 위해 이용되며, 화학 작용제들 또는 높은 산성이나 높은 염기성의 조건들과 같은 극한의 화학적 환경들에 대한 노출, 혹은 다른 것들 중에서 유기 용매들에 대한 노출도 이용된다.
"바이러스 제거(virus removal)"는 제제로부터 바이러스를 제거하는 프로세스를 언급한다. 이러한 제거는 여과 장치의 공극률이 바이러스의 통과를 방지하는 여과와 같은 물리적인 방법들, 또는 바이러스의 크기가 보다 작은 단백질들로부터 이를 분별되게 하는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로부터 야기될 수 있다. 제거는 또한 이온 교환, 친화도, 소수성 상호작용 또는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 혹은 다른 크로마토그래피 방법들에서와 같이 크로마토그래피 표면과 같은 상호보완적인 표면과 바이러스의 화학적 연관으로부터 야기될 수 있다.
"바이러스 감소(virus reduction)"는 불활성화 또는 제거에 의한 제제로부터의 바이러스 부하의 전체적인 감소를 언급한다.
"바이러스 폴리뉴클레오티드(viral polynucleotides)"는 바이러스의 유전 물질, 일부 경우들에서 DNA, 일부 경우들에서 RNA를 언급한다.
특정 실시예들에 있어서, 개시되는 방법은 바이러스 감소를 향상시키기 위한 앞서 기술한 일반적인 예들로부터 변화 없이 적용될 수 있다. 불활성화하는 용액의 pH는 상기 일차 아민을 지니는 고체 물질의 고려 없이 가능한 바이러스 불활성화의 가장 높은 정도를 구현하도록 선택되어야 한다. 관심의 대상인 생성물에 영구적인 손상이 없이 바이러스를 불활성화하는 것으로 알려진, pH 4보다 작은 값으로부터 약 pH 3의 값까지가 될 수 있는 pH 값들의 유효 범위 내에서, 고체 물질은 순 바이러스 감소를 실질적으로 향상시키는 것으로 예상될 수 있다. 노출의 시간 또한 상기 일차 아민을 지니는 고체 물질과 독립적으로 선택될 수 있다. 노출의 온도 또한 상기 일차 아민을 지니는 고체 물질과 독립적으로 선택될 수 있다. 항바이러스 성분들의 첨가가 고려될 수 있지만, 이는 이들의 개별적 및 총괄적 영향을 평가하기 위한 특정 변수들을 점검하는 점이 신중해질 것이다. 비이온성, 쌍성이온성 또는 양성으로 하전된 첨가제들은 바이러스 또는 바이러스 DNA를 유지하는 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질의 능력에 대한 상당한 방해 없이 용인되는 것으로 예상될 수 있다. 전기음성의 첨가제들은 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질에 결합하는 바이러스를 방해하는 경향을 가질 수 있다. 비록 일반적으로 대략적으로 생리적 전도도 또는 그 이하를 생성하는 염 농도들이 용인될 것이지만, 염들과 같은 도전성 첨가제들은 바이러스를 결합시키는 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질의 능력을 제한할 수 있으며, 일부 실시예들에서, 생리적 전도도의 두 배 또는 세 배인 염 농도들은 여전히 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질이 전체적인 바이러스 감소에 대한 가치 있는 향상을 가져오게 할 것이다. 간단한 실험들이 바이러스를 감소시키는 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질의 능력을 감소시킬 수 있는 정도를 결정하기 위해 첨가제들의 다양한 레벨들에서 수행될 수 있다. 실험 계획법(DoE)으로 알려진 기술은 변수들의 정해진 세트들에 대한 최적의 조건들을 확인하는 데이터의 통계적으로 유효한 요체를 얻기 위해 요구되는 테스트들의 숫자를 최소화하기 위한 것으로 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 일반적인 사실상, 상기 일차 아민들을 지니는 고체 물질과 독립적으로 가장 효과적인 바이러스 불활성화를 유지하는 조건들은, 일차 아민들을 지니는 고체 물질과 결합되어 보다 큰 바이러스의 전체적인 감소를 유지할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 개시되는 방법들은 바이러스 감소를 향상시키는 것과 병행하여 DNA 및/또는 오염시키는 단백질들의 제거를 향상시킬 것이다. 실험 데이터는 이러한 점이 바이러스 감소와 동일한 화학적 메커니즘을 통해 일어나고, 감소되는 pH로 예기치 않게 증가되는 것을 나타낸다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 예를 들면 상기 원하는 생성물이 상기 일차 아민을 지니는 표면과 결합하지 않는 경우, 바이러스의 가장 높은 감소를 선호하도록 가장 낮은 실제 염 농도를 채용하는 것이 유리할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 예를 들면 상기 원하는 단백질이 상기 일차 아민을 지니는 표면에 대해 이끌렸던 경우, 원하는 생성물의 손실을 방지하고, 결합된 원하는 단백질이 바이러스-결합 능력을 방해하는 것을 방지하기 위한 이중의 목적을 위해 염 농도를 증가시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 염 농도의 증가는 일반적으로 원하는 단백질 손실을 방지하고 및/또는 원하는 단백질의 바이러스 결합의 방해를 방지하도록 필요한 경우보다 크지 않아야 한다. 원하는 단백질의 각 종들이 다른 성질들을 제시하기 때문에, 염들이 요구되는 지를 결정하고, 이들의 최소 유효 농도들을 결정하기 위한 실험이 요구될 수 있는 점이 이해될 것이다. 간단한 실험들을 통해 상기 유효 농도를 결정하는 것은 해당 기술 분야의 숙련자의 능력 범위 이내이다.
일부 실시예들에 있어서, 가장 효과적인 접촉 및 바이러스 감소에 대한 가장 높은 능력을 제공하는 지를 결정하기 위해 일차 아민을 지니는 표면들 및 다양한 형태들과 조성의 장치들을 평가하는 것이 유익할 것이다. 일반적인 사실상, 멤브레인들은 모놀리스들보다 나은 흐름 저항을 제공하지만, 모놀리스들은 보다 높은 바이러스 결합 능력을 제공한다. 상기 원하는 단백질 제제 내에 현탁되는 다공성 입자들은 일반적으로 바이러스들 및 하전된 입자들 사이의 큰 분자 거리들로 인하여 낮은 용량과 지연되는 바이러스 결합 운동력들의 문제가 있다. 다공성 입자들로 충전된 칼럼들은 비록 이들이 여전히 멤브레인 및 모놀리스들에 비해 느리고, 여전히 낮은 용량의 문제가 있지만, 현탁된 입자들보다 빠른 운동력을 제공하며, 다공성 입자들은 그렇더라도 바이러스 감소의 가치 있는 향상을 구현할 수 있다.
실험예들
실험예 1. pH의 함수로서 에틸렌디아민을 지니는 모놀리스(CIM EDA, BIA 세퍼레이션즈(Separations)) 상에 결합하는 DNA. 연어 정자로부터의 게놈 DNA가 바이러스 DNA의 대용으로 사용되었다. EDA 모놀리스는 별도의 실험들에서 pH 8.0부터 3.5까지의 범위의 완충제들로 평형화되었다. pH 8의 50mM의 트리스(Tris) 내에 현탁되었던 DNA가 상기 모놀리스 상으로 주입되었다. 결합되지 않은 샘플 성분들을 변위시키는 세척 단계 후, 상기 DNA가 NaCl 또는 구아니딘의 선형의 차이로 용리되었다. 양 경우들에 있어서, 결과들은 pH 4에서 개시되는 유지의 강도에서 불균형적인 증가를 나타낸다. 실험 결과들은 표 1에 제공된다.
[표 1]
pH 완충시키는 종들 M NaCl 용리 M 구아니딘 용리
8.0 50mM의 트리스 1.65 1.84
7.0 50mM의 헤페스(Hepes) 2.00 2.15
6.0 50mM의 MES 2.82 2.79
5.0 50mM의 아세트산염 3.35 3.06
4.0 50mM의 아세트산염 4.85 5.39
3.0 50mM의 아세트산염 4.85 5.41
실험예 2. 사차 아민을 지니는 표면상의 약화된 유지에 대한 일차 아민을 지니는 표면상의 DNA 유지의 향상. 연어 정자로부터의 게놈 DNA가 바이러스 DNA의 대용으로 사용되었다. DNA의 유지는 사차 아민을 지니는 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)에 대해 일차 아민을 지니는 모놀리스(CIM EDA, BIA 세퍼레이션즈) 상에서 pH 8, 7 및 6에서 평가되었다. DNA는 pH 8.0에서 0.6M의 NaCl로 QA로부터 용리되었고, pH 7.0에서 0.55M의 NaCl로 약화시켰으며, pH 6.0에서 0.47M의 NaCl로 더 약화시켰다. DNA는 pH 8.0에서 0.83M의 NaCl, pH 7.0에서 1.11M의 NaCl 및 pH 6.0에서 1.8M의 NaCl로 EDA로부터 용리되었다. 이들 결과들은 일차 아민을 지니는 표면상의 유지가 추세에 반대되고, 사차 아민을 지니는 표면으로 관찰된 것보다 현저하게 큰 양인 사실을 강조한다.
실험예 3. 사차 아민을 지니는 표면상의 약화된 유지에 대한 일차 아민을 지니는 표면상의 바이러스 유지의 향상. 박테리오파지 M13이 테스트 바이러스로 사용되었다. DNA의 유지는 사차 아민을 지니는 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)에 대해 일차 아민을 지니는 모놀리스(CIM EDA, BIA 세퍼레이션즈) 상에서 pH 8, 7 및 6에서 평가되었다. DNA는 pH 8.0에서 0.7M의 NaCl로 QA로부터 용리되었고 at pH 8.0, pH 7.0에서 0.61M의 NaCl로 약화시켰으며, pH 6.0에서 0.53M의 NaCl로 더 약화시켰다. DNA는 pH 8.0에서 1.02M의 NaCl, pH 7.0에서 1.47M의 NaCl 및 pH 6.0에서 2.5M의 NaCl로 EDA로부터 용리되었다. 이들 결과들은 상기 일차 아민을 지니는 표면상의 유지가 추세에 반대되고, 상기 사차 아민을 지니는 표면으로 관찰된 것보다 현저하게 큰 양인 사실을 강조한다.
실험예 4. 일차 아민을 지니는 모놀리스로의 미세 생쥐 바이러스(MVM)의 향상된 감소. MVM을 함유하는 바이러스 세포 배양(cell culture)이 pH 3.5에 60분 동안 노출되었다. MVM은 이들 조건들에 의해 불활성화되지 않는 것으로 알려져 있다. 고체들은 여과에 의해 제거되었고, 여과물은 pH 3.5까지 평형화된 EDA 모놀리스를 통과하였다. MVM 함량은 2.85의 log10 인자로 감소하였다. 이는 바이러스 감소의 약 700-폴드 향상을 나타내며, 특히 MVM과 같은 레트로바이러스 종들을 포함하여 비피막형 바이러스 종들의 제거를 향상시키는 개시되는 방법의 능력을 특히 강조한다.
실험예 5. 일차 아민을 지니는 모놀리스로의 A형 간염 바이러스(HAV)의 향상된 감소. HIV를 함유하는 바이러스 세포 배양이 pH 3.5에 60분 동안 노출되었다. HAV는 이들 조건들에 의해 불활성화되지 않는 것으로 알려져 있다. 고체들은 여과에 의해 제거되었고, 여과물은 pH 3.5까지 평형화된 EDA 모놀리스를 통과하였다. MVM 함량은 2.85의 log10 인자로 감소하였다. 이는 바이러스 감소의 약 700-폴드 향상을 나타내며, 비피막형 바이러스 종들의 제거를 향상시키는 개시되는 방법의 능력을 더 강조한다.
해당 기술 분야의 숙련자에게는 개시되는 방법들이 또한 바이러스들, 특히 비지질 피막형 바이러스들의 정제를 위해 이용될 수 있는 점이 분명해질 것이며, 여기서 낮은 pH의 결합은 정제와 함께 지질 피막형 바이러스들을 불활성화시키는 이차적인 이점을 제공할 수 있다. 동일한 이유로, 개시되는 방법들이 또한 지질 피막형 바이러스들에 의해 오염될 수 있는 제제들로부터 DNA의 분리를 위해 이용될 수 있는 점이 동등하게 분명해질 것이다. 양 경우들에 있어서, 이들의 크기들에 따라 목표 생성물들의 유지를 불균형적으로 향상시키는 개시되는 방법들의 능력은 또한 단백질들과 같은 보다 작은 오염물들의 제거를 선호한다.
여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 모든 목적들을 위해 그 전체 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것과 같은 정도까지 그 전체 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항에 모순되지 않는 정도까지 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 문제를 대체하거나 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 구성 성분들, 크로마토그래피 조건들 등을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 기재되지 않는 한, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 설정되는 수치적 변수들은 본 발명의 개시되는 방법들에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
여기에 개시되는 실시예들의 많은 변형들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 분명한 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 개시되는 특정 실시예들은 단지 예로써 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것들로 간주되도록 의도된다.

Claims (7)

  1. 원하는 단백질의 산성의 제제(preparation) 내의 바이러스 및 바이러스 DNA 레벨들을 감소시키기 위한 방법에 있어서, 상기 원하는 단백질의 산성의 제제를 일차 아민, 이차 아민 또는 이들 모두를 지니는 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 동안에 동작 pH는 (a) 약 2.0부터 약 4.0까지, (b) 약 2.25부터 약 3.75까지, (c) 약 2.5부터 약 3.5까지, (d) 약 2.75부터 약 3.25까지, (e) 약 3.5부터 약 3.75까지 및 (f) 약 3.25부터 약 3.5까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 동안에 염 농도는 (a) 약 0.0M부터 약 0.5M까지, (b) 약 0.05M부터 약 0.3M까지 및 (c) 약 0.1M부터 약 0.2M까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계의 기간은 (a) 약 15분부터 약 120분까지, (b) 약 30분부터 약 60분까지, (c) 약 30분 이하의 영(zero)이 아닌 양, (d) 약 15분 이하의 영이 아닌 양, (e) 약 10분 이하의 영이 아닌 양, (f) 약 5분 이하의 영이 아닌 양, (g) 약 2분 이하의 영이 아닌 양, (h) 약 1분 이하의 영이 아닌 양, 그리고 (i) 상기 제제를 상기 일차 아민을 지니는 표면을 수용하는 장치로 통과시키기 위해 요구되는 시간으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 표면은 에틸렌디아민(ethylenediamine), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 디에틸아민트리아민(diethylaminetriamine), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetraamine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine) 및 폴리알릴아민(polyallylamine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 모이어티(moiety)들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 표면은 입자, 멤브레인, 모놀리스(monolith), 히드로겔(hydrogel) 코팅된 골격 구조(skeletal framework) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 (a) 일차 또는 이차 아민을 지니는 입자들을 상기 제제 내에 분산시키는 단계, (b) 상기 제제를 상기 일차 아민을 지니는 표면과 유체 접촉하는 장치로 통과시키는 단계, (c) 상기 제제를 상기 일차 아민을 지니는 표면과 유체 접촉을 제공하는 장치를 통해 재순환시키는 단계 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동작에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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