JP4510180B2 - ウィルスによる汚染の浄化のための方法および薬剤 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養または組織において、またウィルスで汚染されうる材料および装置でのウィルスによる汚染を浄化する（Sanitization）ための方法および薬剤に関する。かかる汚染は知られたものでありうるか（ウィルス学での研究）、また知られてないものでありうる（例えば非感染細胞培養による研究または健全なヒトまたは動物からの組織／臓器の外移植片による研究）。
【０００２】
例えばＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶのようなヒト病原性ウィルスを取り扱っている際に、例えばＡＩＤＳや肝炎のような重篤な疾患が感受性のあるレシピエントに運搬された場合発症することがある。ヒト病原性ウィルスの研究を実施している検査・研究実験室ではこの危険が特に大きいものである。さらに、そこで利用される細胞培養物はウィルスの複製のための理想的な栄養培地となり得るもので、ウィルス汚染が起ってしまった後では使用した材料および装置を再度確実に浄化し得ないと、ウィルスが一つの培地から別の培地に容易に広がることになる。臓器移植中において、臓器中に存在するウィルスは移植体のレシピエントに運搬されうるものであるが、普通に行なわれており、また薬物でなされる方法であるレシピエントの免疫抑制のための拒絶反応を無力化することにより、このようにして生じるウィルス感染が重篤な障害となりうる。臓器移植の顕著なタイプとして輸血があるが、これは知られているとおりウィルスの運搬をもたらしうるものである。
【０００３】
物理的な浄化方法に加えて、化学的な浄化方法もすでに提案されている。殊にしばしば論議されている化学的方法はＳＤ（溶剤／洗浄剤）法である。この方法はコートを有するウィルス、すなわち脂質含有膜で取り囲まれているウィルスの不活性化に適してはいるが、すべての既知のコートを有していないウィルスに対しては全く効果がないという重大な欠点を有している。それで、安全のために、コートを有していないウィルスも確実に不活性化する化学的な浄化方法の入手への大きな必要性がある。
【０００４】
【従来の技術】
欧州特許出願第０７２０８５１号には、好ましくは塩化ベンザルコニウムと組み合わせたアクリジンまたはアクリジン誘導体の助けによるウィルスの不活性化方法が既に開示されていて、この方法はその生物学的活性が著しく損なわれることのないタンパク質の存在下に実施することができる。しかしながら、組織または細胞培養においてウィルスによる汚染を選択的に除去することができ、それによってこれらの組織または細胞培養物が清浄状態で再利用可能であり、且つよごされていない検査、研究結果をもたらすことのできる薬剤に対する強い要望がさらに存在している。それと同時に、一つの培地から別の培地へのウィルスの運搬が起り得ないようにするために、ウィルス学で用いられる材料および装置の浄化に対する要望も存在している。意外にも、ウィルスで汚染された細胞培養物の浄化およびウィルス学で用いられる材料、装置の浄化という相異なった要求が一つの同一の薬剤で充足されることが見い出された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、組織または細胞培養物、ウィルス学で用いられる材料および装置、または出発材料がウィルスで汚染されうる生物学的材料の製造におけるウィルスによる汚染の浄化方法に関するものであって、この方法では、浄化のために、置換基として各々の場合４個までの炭素原子を有しうる１個または２個の飽和または不飽和炭化水素基を有しうる置換フェノールまたは置換フェノールエーテルの溶液を使用するものである。この方法は、臓器移植体または輸血および血漿供与およびその他の血液成分または細胞血液成分の浄化にも使用することができる。
【０００６】
本発明の方法で使用される置換フェノールまたは置換フェノールエーテルは、被膜を有するウィルスのみならず、被膜を有していないウィルスに対しても有効に使用し得る広い作用スペクトルを有している。ここで使用されるフェノール性化合物は好ましくはオイゲノール、イソオイゲノール、チモール、カルバクロール、カルバクロールメチルエーテルおよびメントールからなる群から選択される化合物である。
【０００７】
ここで述べたフェノール性化合物は、適当な溶剤例えばエタノールと水との１：１０乃至１０：１の比の混合物に溶解し、そして汚染基質を基にして総量で０.１重量％より少ない量で汚染細胞培養物に加えられる。しかし、同じ溶液がウィルス汚染された実験装置、特にクロマトグラフィーカラムおよび樹脂の浄化にも著しく適している。一般に、ウィルス汚染の除去には、活性化合物を０.１ｇ／Ｌ乃至０.００１ｇ／Ｌの濃度で含有する溶液が使用される。浄化は好ましくは２〜７０℃の温度および５〜９のｐＨで実施される。２０〜６０℃の温度範囲が特別に好ましい。この温度範囲では、僅か１０分間の作用時間後でも、汚染された基質の浄化が始まったことが検知される。しかし、満足すべき浄化は通常２〜６時間の時間を必要とし、この時間はごく例外的には２４時間まで延長されるべきものとする。
【０００８】
一般に浄化実施後、置換フェノールまたはフェノールエーテルの残留量を除去する必要はない。もしもこのことが必要とあれば、このための既知の方法例えば活性炭への吸着、透析またはクロマトグラフィー方法を利用することができる。
【０００９】
ウィルスによる汚染を浄化するための本発明の方法による特別に有利な点は、細胞培養物または処理された細胞培養物が最大限度保存されることにある。細胞培養物の生物活性はこれによって不利な影響を蒙ることはない。本発明による浄化薬剤はレトロウィルス、トガウィルス、フラビウィルス、ピコルナウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、レオウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、カリチウィルス、コロナウィルスまたはアストロウィルスに対してその活性がすでに示されている。
本発明を下記の実施例により詳細に説明する。
【００１０】
【実施例】
実施例１：ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーカラムの浄化
１ｇのＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（予め膨潤済み）を、２０mlのＰＢＳ（pH 7.2）中のスラリーとして、ｌｏｇ₁₀ ５.５ウィルスタイター（ＣＣＩＤ₅₀）を有する５００mlのレオ−３−ウィルス含有水溶液（５％ＦＣＳを有する細胞培養上澄）に添加した。約２０℃で３０分攪拌した後、全ての材料をクロマトグラフィーカラムに移し、そして樹脂の沈降後にカラムを空にした。次いで樹脂を、１５０mlの洗浄緩衝液（0.2Ｍ NaCl，KH₂PO₄／NaOHによりpH 6.0）で洗浄し、そして最終的に溶出緩衝液（2.0Ｍ NaCl，KH₂PO₄／NaOHによりpH 6.8）で溶出した。浄化のために、カラムを、３カラム容量のカルバクロール（１：2000）含有洗浄緩衝液で洗浄し（向流にて）、そしてこのカルバクロール溶液下に約２０℃で一晩置いた。カラムは次いで洗浄緩衝液で再生した。様々なフラクションのウィルスタイターを表１に示す。
【００１１】
【表１】

【００１２】
試料が示しているように、ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーカラムの溶出後は、ウィルスはカラム中に残留しており、浄化していないカラムの再使用はその後の生成物のバッチのウィルスによる汚染を導く。カルバクロールを用いての浄化は、検出限界以下のレオ−３−ウィルスの完全な不活化を導いた。従って、カラム材の再使用を中止することはない。
【００１３】
実施例２：細胞培養物の浄化
試料のウィルス含量の決定は、細胞培養物の感染（試験すべき試料の連続希釈を含有するインジケーター細胞）およびウィルス特異的細胞変性効果（ＣＰＥ）による各々の細胞培養容器中でのウィルス複製の検出によって実施する。インジケーター細胞が外来のウィルスにより汚染された場合、複製および／またはＣＰＥ発現は、低すぎるタイターが観察されるというような悪影響を受けうる。細胞病原性ＢＶＤＶ株の複製は、細胞培養物、例えばＭＤＢＫの非細胞病原性株の邪魔なウィルスによる汚染によって非常に強く阻害（干渉）されうる。細胞培養物の感染は、特に細胞培養に必要な（胎児）ウシ血清によるものと理解される。
非細胞病原性の邪魔なウィルス株に感染するＭＤＢＫ細胞培養物を慣例（分割比１：５、５％ＦＣＳを含有するイーグルス最小必須培地［Eagles Minimal Essential Medium]）のように継代して、そして２つの細胞培養フラスコを調製した。１つの細胞培養フラスコ未処理で残し、２つ目の細胞培養フラスコをチモール（１：50,000）で処理した。両方の細胞培養フラスコを毎週継代して、細胞培養物の処理を３継代について実施した。処理せずに１回継代した後に、各細胞培養フラスコからの細胞をマイクロタイタープレートに接種し、そして細胞病原性ＢＶＤＶ株（デンマーク）の滴定（終点希釈法）を各インジケーター細胞について実施した。細胞変性効果（ＣＰＥ）はウィルス複製の指標として評価し、そしてウィルスタイターを算出した（Spaerman-Kaerber法；表２）。
【００１４】
【表２】

【００１５】
チモールでＭＤＢＫ細胞を処理したことにより、非細胞病原性の邪魔なウィルスは不活化され、再び細胞は細胞病原性ＢＶＤＶ株に対して至適な感受性を有した。

Claims (7)

1. 汚染の他に細胞、血液もしくは血漿成分またはクロマトグラフィーカラム材を含む水性液体中のウィルスにより引き起こされた当該汚染を浄化する方法であって、浄化がカルバクロール、メントール及びチモールを含む群から選択された置換フェノールの溶液を用いて達成され、当該フェノールは汚染された基質を基にして総量で０.１重量％よりも少ない量でエタノールと水の混合物に添加され、当該細胞、血液もしくは血漿成分またはクロマトグラフィーカラム材はその本来の機能を保持することを特徴とする、方法。
2. コートまたは非コートウィルスにより生じる汚染の浄化に使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 浄化を１５〜７０℃の範囲の温度および５〜９の範囲のｐＨで実施することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 浄化を１０分間から２４時間までにわたって実施することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 使用される置換フェノールを、浄化の完了後に基質から再度除去することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ウィルスで汚染されたクロマトグラフィーカラム／樹脂の浄化に使用されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. レトロウィルス、トガウィルス、フラビウィルス、ピコルナウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、レオウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、カリチウィルス、コロナウィルスまたはアストロウィルスにより生じた汚染の浄化に使用されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。