JP2000106865A - ウィルスによる汚染の浄化のための方法および薬剤 - Google Patents

ウィルスによる汚染の浄化のための方法および薬剤

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウィルスによる汚染の浄化のための方法およ
び薬剤を提供する。 【解決手段】 組織または細胞培養物の浄化およびさら
にウィルスで汚染されうる材料並びに装置の浄化のため
の方法および薬剤を記載する。浄化のために、ここで置
換基として各々の場合４個までの炭素原子を有しうる１
個または２個の飽和または不飽和炭化水素基を有しうる
置換フェノールまたは置換フェノールエーテルの溶液を
使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞培養または組
織において、またウィルスで汚染されうる材料および装
置でのウィルスによる汚染を浄化する（Sanitization）
ための方法および薬剤に関する。かかる汚染は知られた
ものでありうるか（ウィルス学での研究）、また知られ
てないものでありうる（例えば非感染細胞培養による研
究または健全なヒトまたは動物からの組織／臓器の外移
植片による研究）。
【０００２】例えばＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶのよう
なヒト病原性ウィルスを取り扱っている際に、例えばＡ
ＩＤＳや肝炎のような重篤な疾患が感受性のあるレシピ
エントに運搬された場合発症することがある。ヒト病原
性ウィルスの研究を実施している検査・研究実験室では
この危険が特に大きいものである。さらに、そこで利用
される細胞培養物はウィルスの複製のための理想的な栄
養培地となり得るもので、ウィルス汚染が起ってしまっ
た後では使用した材料および装置を再度確実に浄化し得
ないと、ウィルスが一つの培地から別の培地に容易に広
がることになる。臓器移植中において、臓器中に存在す
るウィルスは移植体のレシピエントに運搬されうるもの
であるが、普通に行なわれており、また薬物でなされる
方法であるレシピエントの免疫抑制のための拒絶反応を
無力化することにより、このようにして生じるウィルス
感染が重篤な障害となりうる。臓器移植の顕著なタイプ
として輸血があるが、これは知られているとおりウィル
スの運搬をもたらしうるものである。
【０００３】物理的な浄化方法に加えて、化学的な浄化
方法もすでに提案されている。殊にしばしば論議されて
いる化学的方法はＳＤ（溶剤／洗浄剤）法である。この
方法はコートを有するウィルス、すなわち脂質含有膜で
取り囲まれているウィルスの不活性化に適してはいる
が、すべての既知のコートを有していないウィルスに対
しては全く効果がないという重大な欠点を有している。
それで、安全のために、コートを有していないウィルス
も確実に不活性化する化学的な浄化方法の入手への大き
な必要性がある。
【０００４】
【従来の技術】欧州特許出願第０７２０８５１号には、
好ましくは塩化ベンザルコニウムと組み合わせたアクリ
ジンまたはアクリジン誘導体の助けによるウィルスの不
活性化方法が既に開示されていて、この方法はその生物
学的活性が著しく損なわれることのないタンパク質の存
在下に実施することができる。しかしながら、組織また
は細胞培養においてウィルスによる汚染を選択的に除去
することができ、それによってこれらの組織または細胞
培養物が清浄状態で再利用可能であり、且つよごされて
いない検査、研究結果をもたらすことのできる薬剤に対
する強い要望がさらに存在している。それと同時に、一
つの培地から別の培地へのウィルスの運搬が起り得ない
ようにするために、ウィルス学で用いられる材料および
装置の浄化に対する要望も存在している。意外にも、ウ
ィルスで汚染された細胞培養物の浄化およびウィルス学
で用いられる材料、装置の浄化という相異なった要求が
一つの同一の薬剤で充足されることが見い出された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明は、組織または細胞培養物、ウィルス
学で用いられる材料および装置、または出発材料がウィ
ルスで汚染されうる生物学的材料の製造におけるウィル
スによる汚染の浄化方法に関するものであって、この方
法では、浄化のために、置換基として各々の場合４個ま
での炭素原子を有しうる１個または２個の飽和または不
飽和炭化水素基を有しうる置換フェノールまたは置換フ
ェノールエーテルの溶液を使用するものである。この方
法は、臓器移植体または輸血および血漿供与およびその
他の血液成分または細胞血液成分の浄化にも使用するこ
とができる。
【０００６】本発明の方法で使用される置換フェノール
または置換フェノールエーテルは、被膜を有するウィル
スのみならず、被膜を有していないウィルスに対しても
有効に使用し得る広い作用スペクトルを有している。こ
こで使用されるフェノール性化合物は好ましくはオイゲ
ノール、イソオイゲノール、チモール、カルバクロー
ル、カルバクロールメチルエーテルおよびメントールか
らなる群から選択される化合物である。
【０００７】ここで述べたフェノール性化合物は、適当
な溶剤例えばエタノールと水との１：１０乃至１０：１
の比の混合物に溶解し、そして汚染基質を基にして総量
で０.１重量％より少ない量で汚染細胞培養物に加えら
れる。しかし、同じ溶液がウィルス汚染された実験装
置、特にクロマトグラフィーカラムおよび樹脂の浄化に
も著しく適している。一般に、ウィルス汚染の除去に
は、活性化合物を０.１ｇ／Ｌ乃至０.００１ｇ／Ｌの濃
度で含有する溶液が使用される。浄化は好ましくは２〜
７０℃の温度および５〜９のｐＨで実施される。２０〜
６０℃の温度範囲が特別に好ましい。この温度範囲で
は、僅か１０分間の作用時間後でも、汚染された基質の
浄化が始まったことが検知される。しかし、満足すべき
浄化は通常２〜６時間の時間を必要とし、この時間はご
く例外的には２４時間まで延長されるべきものとする。
【０００８】一般に浄化実施後、置換フェノールまたは
フェノールエーテルの残留量を除去する必要はない。も
しもこのことが必要とあれば、このための既知の方法例
えば活性炭への吸着、透析またはクロマトグラフィー方
法を利用することができる。
【０００９】ウィルスによる汚染を浄化するための本発
明の方法による特別に有利な点は、細胞培養物または処
理された細胞培養物が最大限度保存されることにある。
細胞培養物の生物活性はこれによって不利な影響を蒙る
ことはない。本発明による浄化薬剤はレトロウィルス、
トガウィルス、フラビウィルス、ピコルナウィルス、ヘ
ルペスウィルス、アデノウィルス、レオウィルス、イン
フルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、カ
リチウィルス、コロナウィルスまたはアストロウィルス
に対してその活性がすでに示されている。本発明を下記
の実施例により詳細に説明する。
【００１０】
【実施例】実施例１：ＤＥＡＥ−セファデックスクロマ
トグラフィーカラムの浄化 １ｇのＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（予め膨潤済
み）を、２０mlのＰＢＳ（pH 7.2）中のスラリーとし
て、ｌｏｇ10 ５.５ウィルスタイター（ＣＣＩＤ 50）を
有する５００mlのレオ−３−ウィルス含有水溶液（５％
ＦＣＳを有する細胞培養上澄）に添加した。約２０℃で
３０分攪拌した後、全ての材料をクロマトグラフィーカ
ラムに移し、そして樹脂の沈降後にカラムを空にした。
次いで樹脂を、１５０mlの洗浄緩衝液（0.2Ｍ NaCl，KH
2PO4／NaOHによりpH 6.0）で洗浄し、そして最終的に溶
出緩衝液（2.0Ｍ NaCl，KH2PO4／NaOHによりpH 6.8）で
溶出した。浄化のために、カラムを、３カラム容量のカ
ルバクロール（１：2000）含有洗浄緩衝液で洗浄し（向
流にて）、そしてこのカルバクロール溶液下に約２０℃
で一晩置いた。カラムは次いで洗浄緩衝液で再生した。
様々なフラクションのウィルスタイターを表１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】試料が示しているように、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスクロマトグラフィーカラムの溶出後は、ウィ
ルスはカラム中に残留しており、浄化していないカラム
の再使用はその後の生成物のバッチのウィルスによる汚
染を導く。カルバクロールを用いての浄化は、検出限界
以下のレオ−３−ウィルスの完全な不活化を導いた。従
って、カラム材の再使用を中止することはない。
【００１３】実施例２：細胞培養物の浄化 試料のウィルス含量の決定は、細胞培養物の感染（試験
すべき試料の連続希釈を含有するインジケーター細胞）
およびウィルス特異的細胞変性効果（ＣＰＥ）による各
々の細胞培養容器中でのウィルス複製の検出によって実
施する。インジケーター細胞が外来のウィルスにより汚
染された場合、複製および／またはＣＰＥ発現は、低す
ぎるタイターが観察されるというような悪影響を受けう
る。細胞病原性ＢＶＤＶ株の複製は、細胞培養物、例え
ばＭＤＢＫの非細胞病原性株の邪魔なウィルスによる汚
染によって非常に強く阻害（干渉）されうる。細胞培養
物の感染は、特に細胞培養に必要な（胎児）ウシ血清に
よるものと理解される。非細胞病原性の邪魔なウィルス
株に感染するＭＤＢＫ細胞培養物を慣例（分割比１：
５、５％ＦＣＳを含有するイーグルス最小必須培地［Ea
gles Minimal Essential Medium]）のように継代して、
そして２つの細胞培養フラスコを調製した。１つの細胞
培養フラスコ未処理で残し、２つ目の細胞培養フラスコ
をチモール（１：50,000）で処理した。両方の細胞培養
フラスコを毎週継代して、細胞培養物の処理を３継代に
ついて実施した。処理せずに１回継代した後に、各細胞
培養フラスコからの細胞をマイクロタイタープレートに
接種し、そして細胞病原性ＢＶＤＶ株（デンマーク）の
滴定（終点希釈法）を各インジケーター細胞について実
施した。細胞変性効果（ＣＰＥ）はウィルス複製の指標
として評価し、そしてウィルスタイターを算出した（Sp
aerman-Kaerber法；表２）。
【００１４】
【表２】
【００１５】チモールでＭＤＢＫ細胞を処理したことに
より、非細胞病原性の邪魔なウィルスは不活化され、再
び細胞は細胞病原性ＢＶＤＶ株に対して至適な感受性を
有した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ (72)発明者 アルブレヒト・グレーナー ドイツ連邦共和国デー−64342ゼーハイム −ユーゲンハイム．ファザーネンヴェーク ６

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 置換基として各々の場合４個までの炭素
    原子を有しうる１個または２個の飽和または不飽和炭化
    水素基を有する置換フェノールまたは置換フェノールエ
    ーテルの溶液を浄化に使用することからなる、組織もし
    くは細胞培養物、血液、血漿または血液もしくは血漿成
    分におけるウィルスによる汚染、および更にウィルス学
    において用いられる材料並びに装置を浄化する方法。
  2. 【請求項２】 コートまたは非コートウィルスにより生
    じる汚染の浄化に使用される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 溶液が、汚染された基質を基にして０.
    １重量％より少ない量で置換フェノールまたはフェノー
    ルエーテルを含有することを特徴とする請求項１または
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 浄化を１５〜７０℃の範囲の温度および
    ５〜９の範囲のｐＨで実施することを特徴とする請求項
    １〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 浄化を１０分間から２４時間までにわた
    って実施することを特徴とする請求項１〜４のいずれか
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 使用される置換フェノールまたはフェノ
    ールエーテルを、浄化の完了後に基質から再度除去する
    ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 ウィルスで汚染されたクロマトグラフィ
    ーカラム／樹脂の浄化に使用される請求項１〜６のいず
    れかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 レトロウィルス、トガウィルス、フラビ
    ウィルス、ピコルナウィルス、ヘルペスウィルス、アデ
    ノウィルス、レオウィルス、スインフルエンザウィル
    ス、パラインフルエンザウィルス、カリチウィルス、コ
    ロナウィルスまたはアストロウィルスにより生じた汚染
    の浄化に使用される請求項１〜７のいずれかに記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 置換体として、各々の場合４個までの炭
    素原子を有しうる１個または２個の飽和または不飽和炭
    化水素残基を有する置換フェノールまたは置換フェノー
    ルエーテルの溶液を含有する、組織もしくは細胞培養
    物、血液、血漿または血液もしくは血漿成分におけるウ
    ィルスによる汚染、および更にウィルス学において用い
    られる物質並びに装置の浄化用の薬剤。
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