KR100607836B1 - 바이러스에 의해 유발된 오염물을 위생 처리하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 조직 또는 세포 배양물 및 바이러스로 오염될 수 있는 물질과 장치를 위생 처리하는 방법 및 이를 위한 제제가 기술되어 있다. 위생 처리하기 위해, 치환체로서 각각 4개 이하의 탄소 원자를 가질 수 있는 1개 또는 2개의 포화 또는 불포화 탄화수소 라디칼을 보유하는, 치환된 페놀 또는 치환된 페놀 에테르의 용액이 사용된다.
위생 처리, 치환된 페놀, 치환된 페놀 에테르

Description

바이러스에 의해 유발된 오염물을 위생 처리하는 방법 및 이를 위한 제제 {Process and agent for the sanitization of contaminations caused by viruses}
본 발명은 세포 배양물 또는 조직에서 바이러스에 의해 유발된 오염물 및 바이러스에 의해 오염될 수 있는 물질과 장치를 위생 처리하는 방법 및 이를 위한 제제에 관한 것이다. 이러한 오염은 공지(바이러스학 분야에서의 연구)된 것이거나, 비공지(예를 들어, 건강한 사람 또는 동물로부터의 비감염된 세포 배양물 또는 조직/기관 이식체를 사용한 연구)된 것일 수 있다.
HIV, HBV 또는 HCV와 같은 사람 병인 바이러스를 사용하여 작업하는 경우, AIDS 또는 간염과 같은 심각한 질환이 감수성 수용체로의 전이시 발생할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 이러한 위험성은 사람 병인 바이러스를 사용하여 작업하는 조사 및 연구 실험실에서 특히 크다. 또한, 이때 이용가능한 세포 배양물은 바이러스의 복제를 위한 이상적인 영양 배지일 수 있고, 바이러스 오염이 발생한 후에 사용된 물질 및 장치를 확실히 위생 처리할 수 없는 경우 상기 바이러스는 특정한 배지에서 또다른 배지로 용이하게 전파될 수 있다. 기관 이식 중에, 기관 내에 존재하는 바이러스는 이식 수용체로 전이될 수 있으며; 의료상 통상 발생하는 수용체의 면역억제를 위해 거부 반응을 피하기 때문에, 상기 방식으로 발생된 바이러스 감염은 심각한 질병을 유발할 수 있다. 특정 유형의 기관 이식은 수혈이며, 이는 바이러스의 전이를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
물리학적 위생 처리 방법 이외에, 화학적 위생 처리 방법이 또한 이미 제안되어 있다. 특히 빈번히 논의되는 화학적 방법은 SD(용매/세정제) 방법이다. 이는 외피를 갖는 바이러스(coated virus), 즉 지질-함유 막으로 둘러싸여 있는 바이러스의 불활성화에 적합하지만, 공지된 모든 외피를 갖지 않는 바이러스에 대해서는 전적으로 비효과적이라는 결정적인 단점을 가지고 있다. 따라서, 안전성 측면에서, 외피를 갖지 않는 바이러스도 용이하게 불활성화시키는 이용가능한 화학적 위생 처리 방법의 개발이 크게 요구되고 있다.
유럽 특허원 제0 720 851호에는 바람직하게는 벤즈알코늄 클로라이드와 배합한 아크리딘 또는 아크리딘 유도체를 이용한 바이러스의 불활성화 방법이 이미 기술되어 있는데, 이는 생물학적 활성이 현저히 손상되지 않는 단백질의 존재하에 수행될 수 있다. 그러나, 또한 청정 조건하에 다시 이용할 수 있고 순수한 조사 및 연구 결과를 수득할 수 있도록 조직 또는 세포 배양물에서 바이러스에 의해 유발된 오염물을 선택적으로 제거할 수 있는 제제가 더욱 고도로 요구되고 있다. 동시에 이러한 제제에 의해, 특정한 배지에서 또다른 배지로 어떠한 바이러스도 전이하지 않도록 바이러스학에서 사용된 물질 및 장치를 위생 처리하는 것이 요구된다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 바이러스에 의해 오염된 세포 배양물의 위생 처리 및 바이러스학에 사용된 물질 및 장치의 위생 처리라는 상이한 요건이 하나의 동일한 제제에 의해 충족될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은, 치환체로서 각각 4개 이하의 탄소 원자를 가질 수 있는 1개 또는 2개의 포화 또는 불포화 탄화수소 라디칼을 보유할 수 있는, 치환된 페놀 또는 치환된 페놀 에테르의 용액을 위생 처리에 사용함을 특징으로 하여, 조직 또는 세포 배양물중의 바이러스에 의해 유발된 오염물, 및 바이러스학에 사용되거나 또는 출발 물질이 바이러스로 오염될 수 있는 생물학적 물질의 제조시에 사용된 물질 및 장치를 위생 처리하는 방법에 관한 것이다. 상술된 방법은 또한 기관 이식체 또는 수혈 및 혈장 공여의 위생 처리 및 기타 혈액 구성물 또는 세포 혈액 성분의 위생처리에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에 사용되는 치환된 페놀 또는 치환된 페놀 에테르는 다양한 작용 범위를 가져 외피를 갖는 바이러스뿐만 아니라 외피를 갖지 않는 바이러스에 대해서도 효과적으로 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 페놀계 화합물은 바람직하게는 유게놀, 이소유게놀, 티몰, 카르바크롤, 카르바크롤 메틸 에테르 및 멘톨로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물이다.
언급된 페놀계 화합물을 적합한 용매, 예를 들면, 1:10 내지 10:1의 에탄올 및 물의 혼합물에 용해시키고, 오염된 기질을 기준으로, 0.1중량% 미만의 총량으로 오염된 세포 배양물에 가한다. 그러나, 동일한 용액은 또한 바이러스로 오염된 실험실용 장치, 특히 크로마토그래피 칼럼 및 수지의 위생 처리에 특히 적합하다. 일반적으로, 바이러스 오염물의 제거를 위해 활성 화합물을 함유하는 용액을 0.1g/l 내지 0.001g/l의 농도로 사용한다. 위생 처리는 바람직하게는 2 내지 70℃의 온도 및 5 내지 9의 pH에서 수행한다. 20 내지 60℃의 온도 범위가 특히 매우 바람직하다. 이러한 온도 범위에서, 단지 10분의 작용 시간 후에도 오염된 기질의 위생 처리 개시가 검출될 수 있다. 그러나, 만족스러운 위생 처리는 통상 2 내지 6시간이 요구되며, 예외적으로만 24시간 이하까지 연장되어야 한다.
일반적으로, 위생 처리후 치환된 페놀 또는 페놀 에테르의 잔류량을 제거할 필요는 없다. 그러나, 잔류량 제거가 필요하다면, 이를 위한 공지된 방법, 예를 들면, 활성탄 상의 흡수, 투석 또는 크로마토그래피 방법을 이용할 수 있다.
바이러스에 의해 유발되는 오염물의 위생 처리를 위한 본 발명에 따르는 방법의 특정한 이점은 가장 많은 양의 세포 배양물이 보존되거나 이에 의해 처리된다는 것이다. 세포 배양물의 생물학적 활성은 이에 의해 악영향을 받지 않는다. 본 발명에 따르는 위생 처리제는 레트로바이러스(retrovirus), 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 아데노바이러스(adenovirus), 레오바이러스(reovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 칼리시바이러스(calicivirus), 코로나바이러스(coronavirus) 또는 아스트로바이러스(astrovirus)에 대한 이의 활성을 나타낸다.
본 발명을 다음 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1: DEAE-세파덱스 크로마토그래피 칼럼의 위생 처리
DEAE-세파덱스 A-50(예비 팽윤) 1g을 PBS(pH 7.2) 20ml중의 슬러리로서 바이러스 역가(CCID50)가 5.5 log10인 레오-3-바이러스-함유 수용액(5% FCS를 함유하는 세포 배양 상층액) 500ml에 첨가하였다. 30분 동안 약 20℃에서 교반한 후, 모든 물질을 크로마토그래피 칼럼에 옮기고, 수지를 침강시킨 후, 칼럼을 비웠다. 이후에 수지를 세척 완충액(0.2M NaCl, KH2PO4/NaOH를 사용하여 pH 6.0) 150ml로 세척하고, 용출 완충액(2.0M NaCl, KH2PO4/NaOH를 사용하여 pH 8.0)으로 최종적으로 용출시켰다. 위생 처리를 위해, 칼럼을 카르바크롤 용액을 함유하는 세척 완충액(1:2000)의 3배 칼럼 용적으로 세척(역류로)하고, 이러한 카르바크롤 용액하에 약 20℃에서 밤새 정치시켰다. 이어서 칼럼을 세척 완충액으로 재생시켰다. 각종 분획물의 바이러스 역가를 표 1에 나타내었다.
크로마토그래피로부터의 각종 분획물의 바이러스 함량
샘플 바이러스 역가 CCID50/ml[log10] 바이러스 하중 (역가 × 용적) [log10]
바이러스 함유 출발물질 (500ml) 5.5 8.2
유량 (510ml) 5.2 7.9
세척 완충액 (150ml) 4.7 6.9
용출 완충액 (20ml) 5.0 6.3
카르바크롤 용액*[제1 칼럼 용적] (12ml) 4.2 5.3
카르바크롤 용액 [약 16시간 항온처리 후] (12ml) 1.5 이하 2.6 이하
위생 처리후의 세척 완충액 [제2 칼럼 용적] (12ml) 1.5 이하 2.6 이하
* 샘플 수득 직후의 역가 측정
상기 실시예가 보여주는 바와 같이, DEAE-세파덱스 크로마토그래피 칼럼의 용출 후, 바이러스가 칼럼에 잔존한다; 위생 처리를 하지 않고서 칼럼을 재사용한 결과, 후속적인 생성물 배치가 바이러스로 오염되었다. 카르바크롤로 위생 처리함으로써 레오-3-바이러스가 검출 한계 이하로 완전히 불활성화된다. 따라서, 칼럼 물질의 재사용을 중단할 이유는 없다.
실시예 2: 세포 배양물의 위생 처리
샘플의 바이러스 함량의 측정은 세포 배양물(지표종 세포를 함유하는 시험 샘플의 단계적인 희석액)를 감염시키고, 바이러스 특이적 세포변성 효과(CPE)에 의한 각 세포 배양 용기 내의 바이러스 복제를 검출함으로써 수행한다. 지표종 세포가 외래 바이러스로 오염되는 경우, 복제 및/또는 CPE의 발현은 역효과를 받아 매우 낮은 역가가 관찰될 수 있다. 세포병원성 BVDV 주의 복제는 세포 배양물(예: MDBK)이 페스티바이러스(pestivirus)의 비세포병원성 주로 오염됨으로써 강력하게 억제(간섭)될 수 있다. 이후 세포 배양물이 특히 세포 배양물에 필요한 (태아) 송아지 혈청에 의해 감염될 수 있다.
비세포병원성 페스티바이러스 주로 감염된 MDBK 세포 배양물을 통상적인 방법으로 계대 배양시키고(분열 비율 1:5; 5% FCS를 함유하는 이글 최소 필수 배지), 2개의 세포 배양 플라스크를 준비한다. 하나의 세포 배양 플라스크는 처리되지 않은 채로 두고, 두 번째 세포 배양 플라스크는 티몰(1:50,000)로 처리한다. 2개의 세포 배양 플라스크를 매주 계대 배양시키고, 세포 배양물의 처리는 3 계대 중에 수행한다. 처리하지 않은 1계대 후, 각 세포 배양 플라스크로부터의 세포를 미세역가 평판에 접종하고, 세포병원성 BVDV 주(덴마크)의 역가측정(종말점 희석법)을 각 지표종 세포에 대하여 수행한다. 세포병원성 효과는 바이러스 복제의 지시로서 평가하고, 바이러스 역가를 산출한다[스파에르만-쾌버법(Spaerman-Karber method); 표 2].
무처리 및 처리(티몰) 세포 배양물중의 바이러스 함량 측정
세포 배양물 바이러스 역가 (CCID50 /ml) [log10 ]
출발 세포 배양물 4.3
3계대 후, 무처리 3.9
3계대 후, 티몰 처리 7.6
MDBK 세포를 티몰로 처리함으로써 비세포병원성 페스티바이러스는 불활성화되어, 세포는 다시 세포병원성 BVDV 주에 대하여 최적 감수성을 갖는다.
본 발명에 따라, 조직 또는 세포 배양물중의 바이러스에 의해 유발된 오염물, 및 바이러스학에 사용되거나 또는 출발 물질이 바이러스로 오염될 수 있는 생물학적 물질의 제조시에 사용된 물질 및 장치를 위생 처리할 수 있다.

Claims (9)

  1. 카르바크롤, 멘톨 및 티몰로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환된 페놀의 용액을 위생 처리에 사용하는 것을 포함하여, 레트로바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 피코르나바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스 또는 아스트로바이러스에 의해 오염될 수 있는 조직 또는 세포 배양물, 혈액, 혈장, 혈액 또는 혈장의 구성물, 또는 크로마토그래피 컬럼/수지를 위생 처리하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 용액이 오염된 기질을 기준으로 하여 0.1중량% 미만의 양으로 카르바크롤, 멘톨 및 티몰로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환된 페놀을 함유하는 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 위생 처리를 15 내지 70℃ 온도 및 pH 5 내지 9에서 수행하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 위생 처리를 10분 내지 24시간에 걸쳐 수행하는 방법.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 사용되는 카르바크롤, 멘톨 및 티몰로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환된 페놀이 위생 처리 완료 후 기질로부터 다시 제거되는 방법.
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