KR20180096775A

KR20180096775A - 탈지질화에 의한 바이러스의 불활성화

Info

Publication number: KR20180096775A
Application number: KR1020187021286A
Authority: KR
Inventors: 레일라 디아즈; 스티븐 우
Original assignee: 엘랑코 유에스 인코포레이티드
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2018-08-29
Also published as: CA3008965A1; EP3408280B1; NZ743601A; EA038712B1; TW201733615A; CN108602860B; AU2017211040A1; JP6648286B2; BR112018014542A2; CN108602860A; AU2017211040B2; PL3408280T3; CL2018001978A1; ZA201804025B; US20180360945A1; EA201891371A1; KR102202475B1; EP3408280A1; US10420831B2; CA3008965C

Abstract

본 발명은 외피보유 바이러스를 함유하는 백신으로서, 외피가 메틸 β-시클로덱스트린 (MBCD)을 사용하여 지질 고갈되어 있는 백신에 관한 것이다. 외피보유 바이러스의 탈지질화는 2-단계 프로세스에서 이들 바이러스의 감염성을 폐지하며, 이는 탈지질화된 바이러스가 백신에서 안전하게 사용되도록 한다. 지질 예컨대 콜레스테롤을 고갈시키기 위한 MBCD의 사용은, 다른 방법과 대조적으로, 비처리된 바이러스의 콜레스테롤의 20% 미만을 갖는 바이러스를 유발하지만 이러한 탈지질화된 바이러스는 비처리된 바이러스의 단백질 함량의 적어도 85%를 보유한다. MBCD에 의한 탈지질화는 또한 바이러스 단백질의 면역원성을 보존한다. 외피보유 바이러스를 탈지질화하기 위한 2-단계 프로세스에서 MBCD 처리를 사용하는 본 발명은 효과적인 백신에 혼입된 불활성화된 바이러스의 생성을 위한 새로운 대안을 제기한다.

Description

탈지질화에 의한 바이러스의 불활성화

본 발명은 외피보유 바이러스 입자를 함유하는 백신으로서, 외피가 메틸 β-시클로덱스트린 (MBCD)을 사용하여 탈지질화되어 있는 것인 백신에 관한 것이다.

바이러스는 자신에 대한 대사 활성이 없는 이동성 유전 요소이다. 대신에, 바이러스는 재생하기 위해 숙주 세포를 감염시키고 이들 숙주 세포의 에너지 및 프로세스를 사용해야만 한다. 일부 바이러스는 "네이키드"이며, 이는 개별 바이러스 입자, 또는 비리온이 단지 바이러스 게놈을 둘러싸고 있는 캡시드 및 아마도 몇 종의 바이러스-코딩된 비구조적 단백질로만 구성되었다는 것을 의미한다. 다른 바이러스에서, 캡시드는 막 또는 외피 내에 함유된다. 바이러스 게놈은 일반적으로 지질 합성에 수반된 단백질을 코딩하기에 너무 작기 때문에, 이러한 외피보유 바이러스는 그들의 외피를 숙주 세포 지질로부터 구축해야만 한다. 따라서 바이러스 외피의 지질 함량은 숙주 세포의 지질 특징에 따라 달라진다.

바이러스는 그의 숙주 유기체에 잘 적응되고 종종 병원성이어서, 그의 숙주에게 질환 및 심지어 사망을 야기한다. 바이러스는 인간 및/또는 그의 반려 동물을 감염시킴으로써, 또는 식품의 공급원인 식물 및 동물에 침범함으로써 큰 경제적 영향을 미칠 수 있다. 백신은 바이러스 감염으로부터 숙주 동물을 보호하는 바람직한 방법이다. 백신은 항체 및 세포성 면역을 포함하는 바이러스에 대한 방어 면역 반응을 생성한다. 양쪽 유형의 반응은 종종 숙주 세포의 새로운 감염을 감소시키고 바이러스 입자 및 숙주로부터의 감염된 세포를 제거하는데 요구된다.

거의 40년 전에, 무어(Moore) 등 (J. Virol. 27(2): 320 - 329, 1978)은 바이러스 외피로부터의 콜레스테롤의 고갈이 그의 표적 세포를 감염시키는 바이러스 입자의 능력을 감소시킬 수 있다는 것을 콜레스테롤-무함유 소포를 사용하여 입증하였다. 대조적으로, 다른 조사자들은 바이러스 감염성이 콜레스테롤의 존재를 표적 세포 막에서는 요구하였지만 바이러스 외피에서는 요구하지 않았음을 보고하였다. 또 다른 조사자들은 외피에서의 콜레스테롤의 결여보다는 오히려 콜레스테롤을 제거하는 프로세스가 감소된 감염성의 원인이라는 것을 상정한 바 있다. 바이러스 기능에서의 콜레스테롤의 역할에 상관없이, 감염성의 완전하고 영구적인 손실은 콜레스테롤-고갈된 바이러스에 대해서도 입증된 바도 없으며, 콜레스테롤-고갈된 바이러스가 안전하고 효과적인 백신에서 유용한 것으로 제시된 바도 없다.

콜레스테롤을 고갈시키는 화학적 수단, 예컨대, 예를 들어, 시클로덱스트린, n-부탄올, 디-이소프로필 에테르 (DIPE), 플루오로에테르 예컨대 세보플루란, 계면활성제 예컨대 트리톤(TRITON) X-100™ (폴리에틸렌 글리콜 p-(l,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르) 또는 트윈(TWEEN) 20™ (PEG (20) 소르비탄 모노라우레이트), 디에틸 에테르, 및 그의 조합의 사용은 보고된 바 있다. 비리온으로부터의 바이러스 단백질의 손실 또는 남아있는 단백질에 대한 구조적 변화를 초래하는 일부 화학적 수단은 너무 가혹한 것으로 판명된 바 있다. 단백질의 존재 및 천연 입체형태는, 콜레스테롤-고갈된 비리온이 백신, 특히 바이러스 외피 단백질에 대해 지시된 중화 항체의 생산을 자극하는 백신에서 유용하기 위해 필요한 것이다.

일부 경우에, 콜레스테롤의 고갈은 가역적인 것으로 제시된 바 있다. 외인성 콜레스테롤의 첨가는 바이러스 외피를 재구성하고 감염성을 회복시킬 수 있다. 이는, 혈액 또는 다른 체액에 존재하는 콜레스테롤 및 다른 지질, 또는 심지어 콜레스테롤-고갈된 비리온과 접촉하고 있는 숙주 세포 막이 잠재적으로 비리온을 재구성하고 감염성을 회복시킬 수 있으므로, 백신에서의 콜레스테롤-고갈된 바이러스의 사용에 관한 안전성 우려를 제기할 수 있다.

약독화 바이러스를 함유하는 백신은 통상적으로 방어 면역을 생성하는데 가장 효과적인 것으로 간주된다. 그러나, 약독화 바이러스가 돌연변이되거나 또는 재조합할 수 있고 따라서 병독성 상태로 복귀할 수 있는 안전성 우려가 있다. 불활성화된 (즉, 사멸된) 바이러스는 통상적으로 백신에서 사용하기에 더 안전한 것으로 간주되지만, 불활성화의 수단은 종종 항원성 에피토프를 변경시키거나 또는 파괴하여 방어 면역의 자극제로서 효과가 감소되거나 또는 손실된다.

효과적인 백신의 결여로 인해, 외피보유 바이러스는 인간 및 비인간 동물에게 건강 위험을 계속 제기하고, 외피보유 바이러스에 의해 야기된 질환은 막대한 경제적 영향을 미친다. 안전하면서도 또한 효과적인 개선된 백신이 요구된다. 예를 들어, 바이러스 항원의 면역원성을 보존하고, 비리온을 무손상 상태로 유지하고, 안전성 위험을 거의 또는 전혀 제기하지 않는, 외피보유 바이러스를 불활성화시키는 개선된 방법은 외피보유 바이러스에 의해 야기된 질환을 완화시키는데 유리할 것이다. 본 출원은 바이러스 외피의 MBCD로의 탈지질화를 포함하는, 바이러스 불활성화의 이러한 개선된 방법을 개시한다.

따라서, 본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 제1 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 5 mM 내지 약 100 mM이다. 추가로, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 보다 추가로, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도는 약 20 mM, 약 30 mM, 또는 약 40 mM이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, , 여기서 제2 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 10 mM 내지 약 100 mM인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 더 추가로, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도는 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제1 기간은 약 15분 내지 약 24시간인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 제1 기간은 약 4시간 내지 약 24시간이다. 보다 추가로, 제1 기간은 약 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24시간이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제2 기간은 약 4시간 내지 약 48시간인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 제2 기간은 약 24시간 내지 약 48시간이다. 보다 추가로, 제2 기간은 약 24, 30, 36, 40, 44, 또는 48시간이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제1 기간 동안 제1 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 제1 기간 동안 제1 혼합물의 온도는 약 22℃ 내지 약 24℃이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제2 기간 동안 제2 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 제2 기간 동안 제2 혼합물의 온도는 약 22℃ 내지 약 24℃이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 외피보유 바이러스는 제2 혼합물을 수득하는 단계 전에 제1 혼합물로부터 단리되는 것인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 대안적으로 및 비제한적으로, 제2 MBCD 용액은 제1 혼합물과 직접적으로 혼합될 수 있다. 직접 혼합은 제1 혼합과 동일한 불활성화 용기에서 수행될 수 있거나, 또는 제1 혼합물은 제2 MBCD 용액과 혼합하기 전에 새로운 불활성화 용기로 이동될 수 있다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제1 기간은 제1 혼합물의 혼합을 추가로 포함하는 것인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 교반은 약 40 rpm 내지 약 60 rpm일 수 있다. 가장 바람직하게는, 교반은 약 50 rpm일 수 있다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 제2 기간은 제2 혼합물의 혼합을 추가로 포함하는 것인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 교반은 약 50 rpm일 수 있다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 외피보유 바이러스는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 외피보유 바이러스는 또한 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)일 수 있다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스를 제공한다. 바람직하게는, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 5 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 바람직하게는, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 10 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM이다. 바람직하게는 제1 기간은 약 15분 내지 약 24시간, 또는 약 4시간 내지 약 24시간, 또는 약 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24시간이다. 바람직하게는 제2 기간은 약 4시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 24, 30, 36, 40, 44, 또는 48시간이다. 바람직하게는 제1 기간 동안 제1 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 심지어 약 22℃ 내지 약 24℃이다. 바람직하게는, 제2 기간 동안 제2 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 심지어 약 22℃ 내지 약 24℃이다. 바람직하게는, 외피보유 바이러스는 제2 혼합물을 수득하는 단계 전에 제1 혼합물로부터 단리된다. 대안적으로 및 비제한적으로, 제2 MBCD 용액은 제1 혼합물과 직접적으로 혼합될 수 있다. 직접 혼합은 제1 혼합과 동일한 불활성화 용기에서 수행될 수 있거나, 또는 제1 혼합물은 제2 MBCD 용액과 혼합 전에 새로운 불활성화 용기로 이동될 수 있다. 바람직하게는, 제1 기간은 제1 혼합물의 혼합을 추가로 포함하며, 여기서 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm, 약 40 rpm 내지 약 60 rpm, 또는 약 50 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 제2 기간은 제2 혼합물의 혼합을 추가로 포함하며, 여기서 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm, 약 40 rpm 내지 약 60 rpm, 또는 약 50 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 외피보유 바이러스는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 바람직하게는, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 5 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 바람직하게는, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도는 적어도 10 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM이다. 바람직하게는 제1 기간은 약 15분 내지 약 24시간, 또는 약 4시간 내지 약 24시간, 또는 약 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24시간이다. 바람직하게는 제2 기간은 약 4시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 24, 30, 36, 40, 44, 또는 48시간이다. 바람직하게는 제1 기간 동안 제1 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 심지어 약 22℃ 내지 약 24℃이다. 바람직하게는, 제2 기간 동안 제2 혼합물의 온도는 실온, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 심지어 약 22℃ 내지 약 24℃이다. 바람직하게는, 외피보유 바이러스는 제2 혼합물을 수득하는 단계 전에 제1 혼합물로부터 단리된다. 대안적으로 및 비제한적으로, 제2 MBCD 용액은 제1 혼합물과 직접적으로 혼합될 수 있다. 직접 혼합은 제1 혼합과 동일한 불활성화 용기에서 수행될 수 있거나, 또는 제1 혼합물은 제2 MBCD 용액과 혼합 전에 새로운 불활성화 용기로 이동될 수 있다. 바람직하게는, 제1 기간은 제1 혼합물의 혼합을 추가로 포함하며, 여기서 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm, 약 40 rpm 내지 약 60 rpm, 또는 약 50 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 제2 기간은 제2 혼합물의 혼합을 추가로 포함하며, 여기서 교반은 약 30 rpm 내지 약 100 rpm, 또는 약 50 rpm일 수 있다. 바람직하게는, 외피보유 바이러스는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스를 포함하는 백신이며, 여기서 백신은 아주반트, 안정화제, 보존제, 및 블렌딩 희석제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 백신을 제공한다. 바람직하게는, 아주반트는 수성 중합체 아주반트이며, 여기서 중합체는 아크릴레이트 또는 폴리아크릴레이트이다. 바람직하게는, 안정화제는 당, 탄수화물, 단백질, 및 젤라틴 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게는, 보존제는 미생물의 성장, 대사 활성, 또는 증식을 지연, 억제, 또는 방지하는 항생제 또는 정생물제 화합물이다. 바람직하게는, 블렌딩 희석제는 물, 포스페이트 완충 염수, 세포 배양 배지, 또는 생리학적 염도 및 pH를 포함하는 다른 용액이다.

본 발명은 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스의 용도이며, 여기서 용도는 외피보유 바이러스에 의해 야기된 질환 또는 증상의 치료를 포함하는 것인 용도를 제공한다.

본 발명은 외피보유 바이러스에 의해 야기된 질환 또는 증상의 치료를 위한 의약의 제조에서의 탈지질화된 외피보유 바이러스의 용도이며; 여기서 탈지질화된 외피보유 바이러스는 외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고; 제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고; 제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고; 상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 방법에 의해 수득되는 것인 용도를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, "외피보유 바이러스"는 핵단백질 코어를 둘러싸고 있는, 지질 이중층 막, 또는 외피를 갖는 임의의 바이러스이다. 바이러스 외피는 전형적으로 숙주 세포 막으로부터 유래되고, 인지질, 당지질, 스핑고지질 및 스테롤 예컨대 콜레스테롤을 함유한다. 외피보유 바이러스는 DNA 또는 RNA에 의해 코딩된 게놈을 갖는 바이러스를 포함한다. 외피보유 바이러스의 종은 비제한적으로 하기를 포함한다: 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 이리도바이러스, 헤파드나바이러스, 레트로바이러스, 오르토믹소바이러스, 아레나바이러스, 분야바이러스, 파라믹소바이러스, 모노네가바이러스, 랍도바이러스, 필로바이러스, 코로나바이러스, 아르테리바이러스, 플라비바이러스, 및 토가바이러스. 새로운 외피보유 바이러스가 발견되고 있으며, 외피보유 바이러스가 분류되고, 각각의 바이러스가 잘 특징화됨에 따라 재분류되고 있다. 외피보유 바이러스의 보다 완전한 기재는 텍스트 [예컨대, Fields Virology (D.M. Knipe and P.M. Howley, eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2013), 현재 제6판]에서 발견될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스"는 바이러스의 종 또는, 상호교환가능하게, 핵산, 단백질, 및 외피를 함유하는 개별 감염성 단위 또는 단위들을 의미할 수 있다. "바이러스 입자"는 개별 감염성 단위이고, 이러한 용어는 용어 "비리온"과 동의어이다.

"탈지질화"는 바이러스 외피로부터 지질을 제거 또는 고갈시키는 프로세스이다. 탈지질화는 MBCD에 의해 바이러스 입자로부터 제거된 콜레스테롤의 양에 의해 측정된다. 그러나, MBCD는 또한 다른 지질, 예컨대 인지질을 추출, 제거, 또는 고갈시킬 수 있다. 본원에 기재된 프로세스가 MBCD-매개된 탈지질화의 결과로서 바이러스 단백질로부터 단백질의 손실을 최소화할지라도, MBCD는 또한 일부 단백질과 상호작용하는 것으로 제시된 바 있다.

"감염성"은 바이러스의 복제를 지지할 수 있는 인간 또는 비-인간 동물로부터의 임의의 세포인 숙주 세포 내에서의 감염을 확립하는 바이러스의 능력이다. 감염성은, 예를 들어, 설정된 수의 바이러스 입자에 의해 감염된 숙주 세포의 수 또는 백분율에 의해, 또는 숙주 세포를 감염시키는데 필요한 바이러스 입자의 수 또는 백분율에 의해 측정될 수 있다. 바이러스 입자는 작동적으로, 예컨대 바이러스 입자의 부피 내에서의 플라크-형성 단위 (PFU)의 수의 결정에 의해 열거될 수 있다. 바이러스 입자는 또한 물리적으로, 예컨대 예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 검출된 특정한 바이러스 단백질의 존재에 의해, 또는 예를 들어, 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 검출된, 용액에 존재하는 바이러스 게놈의 카피의 수의 측정에 의해 측정될 수 있다.

"항원"은 유기체의 면역계에 의해 특이적으로 검출될 수 있는 임의의 분자이다. 전형적으로 바이러스 항원은 바이러스 게놈에 의해 코딩된 바이러스 단백질이다. 바이러스 항원의 존재는 T 림프구 및 B 림프구 둘 다에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. "면역원성"은 면역 반응을 도출하는 항원의 능력을 지칭한다. 백신의 경우에, 바이러스 항원의 면역원성은 우선적으로 바이러스 감염을 감소, 완화, 또는 호전시킬 수 있는 동물에서 방어 면역을 유발할 것이다.

항원과 대조적으로, "아주반트"는 면역 반응의 비-특이적 자극제이다. 아주반트는 패턴 인식 수용체 (PRR)에 결합하고 그를 활성화함으로써 선천성 면역 반응을 자극할 수 있다. PRR의 이러한 자극제는, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 핵산, 박테리아 또는 기생충으로부터의 지질, 또는 박테리아 단백질 또는 독소, 또는 이러한 분자의 임의의 인공적으로 구축된 모방체일 수 있다. 아주반트는 또한 비제한적으로 하기를 포함한다: B 림프구에 의한 인식 또는 식세포에 의한 흡수를 용이하게 하는 항원을 응집시키는 무기 화합물, 예컨대 명반, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트 히드록시드 또는 암모늄 술페이트; 오일; 및 세제. 아주반트는 또한 면역 신호전달의 숙주 매개자, 예컨대, 비제한적으로, 시토카인, 림포카인, 케모카인, 인터페론, 아나필라톡신, 성장 인자, 분화 인자, 및 부착 분자일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하기 위해", 또는 "치료"는, 기존의 증상, 장애, 병태, 또는 질환의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 중지, 감소, 호전, 또는 역전시키는 것을 포함한다. 치료는 예방적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "동물에게 투여하는"은 피부, 피하, 근육내, 점막, 점막하, 경피, 경구 또는 비강내 투여를 포함한다. 투여는 주사 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.

하기 실험 실시예는 탈지질화 프로세스의 예시이다. 다른 실시양태 및 용도가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고 본 발명이 이들 구체적 예시 실시예 또는 바람직한 실시양태로 제한되지 않는 것으로 인지될 것이다. 외피보유 바이러스는, 예를 들어 비제한적으로, 외피보유 바이러스의 유형 및 종, 및 외피보유 바이러스가 복제하는 숙주 세포에 따라 그의 외피에 상이한 수준의 콜레스테롤을 함유한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 기재된 탈지질화 프로세스가 각각의 특정한 바이러스 스톡에 대한 최적화를 요구할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 미생물의 막은 콜레스테롤, 호파노이드, 또는 다른 스테롤 및 스테롤-유사 분자를 함유할 수 있고, 따라서 바이러스 이외의 병원체는 또한 본원에 개시된 방법에 의해 불활성화될 수 있다.

실시예 1

하기 절차를 사용하여 인간 인플루엔자 바이러스 H1N1 A/WSN/33 균주를 탈지질화한다. 하기 실시예에서, 인플루엔자 바이러스 (IFV)의 탈지질화는 감염성을 손상시킨다. 본 발명의 탈지질화 방법은 바이러스 외피 단백질을 보존하기 때문에, 탈지질화된 IFV로 접종된 동물은 병독성 바이러스의 병원성 용량의 감염으로부터 그들을 보호하는 면역원성 반응이 발생할 것으로 예상된다.

시약:

인간 인플루엔자 바이러스 H1N1 A/WSN/33 균주 및 그의 숙주 세포주 MDCK는 욱시 앱테크(Wuxi AppTec) (중국 상하이)로부터 입수가능하다. 다른 시약은 MEM (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드); EMEM (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스); 울트라MDCK(ULTRAMDCK)™ 혈청-무함유 배지 (론자, 인크.(Lonza, Inc.), 뉴저지주 앨런데일); 태아 소 혈청 (FBS; 인비트로젠); 0.25% 트립신-EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산; 인비트로젠); 메틸-β-시클로덱스트린 (MBCD, 시그마-알드리치); 암플렉스(AMPLEX) 레드 콜레스테롤 검정 키트 (인비트로젠); 피어스(PIERCE)™ BCA 단백질 검정 키트 (일리노이주 록포드); 및 MTT (시그마-알드리치)를 포함한다.

MDCK 세포주에서의 H1N1 A/WSN/33 인플루엔자 바이러스의 번식:

세포를 하기 절차에 따라 IFV와 함께 시딩한다. 배지를 T-75 플라스크에서 성장된 MDCK 세포로부터 제거하고, MDCK 세포 단층을 실온에서 5 mL의 PBS로 헹구고, 세포를 37℃에서 1.5 mL의 트립신/EDTA로 탈착한다. 세포를 10% FBS를 함유하는 10 mL MEM에 재현탁하고, 800 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화한다. 세포를 10% FBS를 함유하는 MEM에 재현탁하고, 세포 밀도를 2.5 x 10⁵개 세포/mL로 조정한다. 15 mL의 MDCK 세포 현탁액을 각각의 T-75 플라스크에 시딩하고, 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 두고, 밤새 인큐베이션한다.

MDCK 세포가 90% 초과 전면생장일 때, MEM을 T75 플라스크로부터 제거하고, 1% FBS 및 1 μg/mL 트립신을 함유하는 5 mL EMEM 유지 배지를 첨가하고, 세포를 인플루엔자 바이러스로 0.01의 감염 다중도 (MOI)로 감염시킨다. 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 60 - 90분 동안 인큐베이션하고, 15분마다 부드럽게 진탕시킨다. 1% FBS 및 1 μg/mL 트립신을 함유하는 10 mL EMEM 유지 배지를 각각의 플라스크에 첨가하고, 상기 플라스크를 37℃ 및 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 바이러스의 세포병변 효과 (CPE)의 대략 80%가 달성될 때 (일반적으로 약 48시간 후에), 배양 상청액을 수확하여 IFV를 수득한다.

H1N1 A/WSN/33 IFV의 정제 및 적정:

IFV를 하기 절차에 따라 정제한다. 수집된 배양 상청액을 3,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고, 상청액을 수집한다. 상청액을 38,000 rpm으로 60분 동안 원심분리하여 IFV를 펠릿화한다. IFV 펠릿을 적절한 부피의 생리학적 완충 염수 (PBS)에 재현탁하여 >1.0 x 10⁹ 플라크-형성 단위/mL (PFU/mL)의 최종 역가를 수득한다. 이러한 농축된 IFV 스톡 용액의 100 μL의 분취액을 -80℃에서 저장한다.

하기 절차를 사용하여 IFV를 시험관내 감염성에 대해 적정한다. 상기 세포 배양 및 전달 절차를 사용하여, MDCK 세포를 10% FBS를 함유하는 MEM에 2.5 x 10⁵개 세포/mL의 최종 밀도로 현탁한다. 2 mL의 MDCK 세포 현탁액을 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션한다. 바이러스 스톡을 37℃ 수조에서 해동시키고, 이어서 500 x g로 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 울트라MDCK™ 무혈청 배지 및 2.5 μg/mL 트립신을 희석 완충제로 사용하여 스톡 용액의 1/10 희석 시리즈를 제조하고, 사용까지 4℃에서 저장한다.

세포가 적어도 90% 전면생장일 때, 배지를 제거하고, 0.5 mL 희석 완충제 및 0.5 mL의 바이러스 희석물을 각각의 웰에 첨가한다. 음성 대조군의 경우에, 1.0 mL 희석 완충제를 사용한다. 각각의 희석물을 첨가한 직후에 플레이트를 부드럽게 진탕한다. 플레이트를 5% CO₂하에 37℃에서 60 - 90분 동안 인큐베이션하고, 15분마다 요동시킨다. 이어서 각각의 6-웰 플레이트의 각각의 웰을 37℃에서 PBS 용액 중 2.5% 저융점 아가로스 및 희석 완충제의 1:4 혼합물 3 mL로 오버레이한다. 상기 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 오버레이 혼합물을 고체화되도록 하고, 이어서 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한다.

하기 절차를 사용하여 플라크를 가시화한다. 플라크가 완전히 발색된 후에 (감염후 3일), 1 mL 4% 파라포름알데히드를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 가용화된 아가로스를 폐기하고, 0.1 mL의 0.5% 크리스탈 바이올렛을 각각의 웰에 첨가한다. 15분의 인큐베이션 후에 플라크의 수를 카운팅하고, 희석 배율을 기반으로 하여 역가로 변환시킨다.

탈지질화:

정제된 IFV에 대한 탈지질화 프로세스를 2개의 병행 반응으로 실시한다: IFV를 MBCD와 접촉시키는 것을 포함하는 용매 처리, 및 IFV를 동일한 방식으로, 그러나 MBCD에 노출시키지 않으면서 처리하는 모의 처리. IFV의 동일한 역가를 모의 및 용매 처리 둘 다에 사용한다. 모의 처리에서의 IFV를 적정하여 용매 처리 후에 남아있는 탈지질화된 IFV의 양의 간접 측정치를 제공할 수 있다.

용매 및 모의 처리를 하기 절차에 따라 수행한다. 상기 제조된 IFV 스톡 (>1.0 x 10⁹ PFU/mL)의 분취물 (100 μL)을 에펜도르프 튜브에서 900 μL PBS에 희석하여 1.0 - 5.0 x 10⁸ PFU/mL의 최종 역가를 달성한다. PBS 중 MBCD를 용매 처리의 경우에 50 mM의 최종 농도까지 첨가하거나, 또는 동등한 부피의 PBS를 모의 처리에 첨가한다. 이어서 에펜도르프 튜브를 마개를 막고 파라필름으로 밀봉한다. 모든 샘플을 37℃로 예열된 SHZ-82 항온 오비탈 공기-조 진탕기 (창저우 구오후아 어플라이언스 캄파니(Changzhou Guohua Appliance Co.), 중국)에서 고정한다. 용매- 및 모의-처리된 샘플을 220 rpm의 오비탈 회전 속도로 37℃에서 30분 또는 45분 동안 회전시킨다. 샘플을 마이크로-원심분리기에서 1분 동안 회전시키고, IFV를 함유하는 상청액을 초원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 200,000 x g (옵티마(OPTIMA)™ L-100XP; 베크만 쿨터, 인크.(Beckman Coulter, Inc.), 인디애나주 인디애나폴리스)로 30분 동안 원심분리하여 IFV를 펠릿화하고, 상청액을 폐기한다. IFV 펠릿을 상기 각각의 에펜도르프 튜브에 첨가된 원래 부피의 1/10에 재현탁하고, 추가의 분석까지 -80℃에서 저장한다.

탈지질화된 IFV의 특징화:

탈지질화된 및 모의-처리된 IFV의 단백질 함량을 제조업체의 지침서에 따라 BCA 검정 (피어스™ BCA 단백질 검정 키트)을 사용하여 결정한다. 콜레스테롤 함량을 제조업체의 지침서에 따라 수행된 콜레스테롤 검정 (암플렉스® 레드 콜레스테롤 검정 키트, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 결정한다. 상기에 제시된 바와 동일한 적정 절차를 사용하여 시험관내 감염성을 측정한다.

적혈구응집 (HA) 활성을 하기와 같이 결정한다. 새롭게 단리된 닭 혈액을 PBS로 3회 세척하고, 적혈구 (RBC)를 1%의 농도로 PBS에 재현탁한다. 바이러스 희석물 (50 μL)을 PBS에서 제조하고, 50 μL의 RBC 현탁액과 혼합한다. 혼합물을 96-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가하고, RBC를 45분 동안 침강되도록 한다. RBC의 도트 또는 펠릿이 존재한다면 웰을 HA 음성 (즉 RBC의 응집 없음)인 것으로 판정하고, RBC의 부드러운 현탁액이 존재한다면 웰을 양성인 것으로 판정한다.

탈지질화된 및 모의-처리된 IFV 샘플의 2개의 배치를 상기 기재된 절차에 따라 제조한다. 시험을 위해 사용된 IFV 스톡은 2.2 x 10¹⁰ PFU/mL의 역가를 갖는다. 제1 배치 ("제조 A")에서, 탈지질화 기간은 30분이고; 제2 배치 ("제조 B")에서, 탈지질화 기간은 45분이다. 초원심분리 후에, 탈지질화된 및 모의-처리된 샘플을 특징화한다.

시험관내 감염성은 탈지질화된 샘플의 PFU가 상응하는 모의 샘플의 것의 약 ~1/7,000이라는 것을 제시하였다. 감염성 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다. 역가의 차이에도 불구하고, 다양한 샘플의 단백질 함량은 서로의 10% 내이다. 제조 A로부터의 탈지질화된 IFV의 단백질 함량은 모의 샘플의 97%이고; 제조 B로부터의 탈지질화된 IFV의 단백질 함량은 모의 샘플의 93%이다 (표 1 참조). 단백질 함량에 의해 결정된 바와 같이, 처리 후에 출발 물질의 대략 20%가 회수된다. 단백질 함량을 기반으로 하는 백분율 회수는 출발 물질 (2.2 x 10⁹ PFU/mL) 및 모의-처리된 샘플 (4.0 x 10⁸ PFU/mL, 이는 출발 역가의 18%임)의 측정된 역가와 필적할만하다. 탈지질화 후에, 모의 처리와 비교하여 2% 미만의 콜레스테롤이 남아있다 (표 1 참조).

표 1

주: ^a 모의 처리와 비교한 감염성의 분율;

^b 모의 처리와 비교한 백분율.

모의 처리는 물리적 처리 (진탕 및 원심분리)가 역가 및 단백질의 손실을 유발한다는 것을 지시한다. MBCD에 의한 탈지질화는 우선적으로 IFV로부터 콜레스테롤은 제거하지만 단백질은 제거하지 않는다. 추가로, MBCD로 처리된 IFV는 더 적은 시험관내 감염성을 갖지만, 감염성은 완전히 폐지되지 않았다.

디이소프로필 에테르 및 MBCD로의 IFV 탈지질화의 비교:

MBCD 이외에, 또 다른 지질 용매, 디이소프로필 에테르 (DIPE)를 사용하여 IFV를 탈지질화한다. 동일한 출발 물질의 IFV 샘플을 상이한 농도의 DIPE 또는 50 mM MBCD로 처리한다. 동일한 양의 IFV의 분취물을 2%, 4%, 8%, 또는 12% DIPE 또는 50 mM MBCD로 37℃에서 30분 동안 처리한다. 2,000 x g로 3분 동안 간단한 원심분리 후에, 가시적 용매를 제거하고, 수성 물질을 남겨 흄 후드에서 20분 동안 건조시킨다. 이어서 샘플을 200,000 x g로 30분 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 회수한다. IFV의 시험관내 감염성, HA 활성, 단백질 함량, 및 콜레스테롤 함량은 표 2에 제시되어 있다.

최대 12% 농도에서의 DIPE 처리는 동일한 조건 하에 50 mM MBCD만큼 콜레스테롤을 제거하는데 있어서 효과적이지 않다. 12% DIPE가 IFV로부터 약 80%의 콜레스테롤을 제거하는 반면, 50 mM MBCD는 98% 초과를 제거한다. 이들 2개 처리의 IFV 감염성은, PFU/mL를 비교함으로써 결정된 바와 같이, 모의-처리와 비교하여, 각각 32배 및 2250배 감소된다. 양쪽 용매에 의한 콜레스테롤의 제거는, 단백질 함량이 다양한 처리에서 20% 미만 감소되기 때문에, 비교적 특이적이다. 적혈구 응집반응 (HA) 활성을 정량화하기 위한 위한 능력 내에서, 50 mM MBCD는 2% - 8% DIPE만큼 동일한 정도로 HA 활성에 영향을 미친다.

표 2

주: ^a 모의 처리와 비교한 백분율.

45분 동안 용매로의 처리:

상기 처리를, MBCD 처리 지속기간이 30 내지 45분으로 확장되는 것을 제외하고는, 반복한다. 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.

표 3

주: ^a 37℃에서 30분 동안 빙글빙글 회전.

^b 37℃에서 45분 동안 빙글빙글 회전.

^c 모의 처리와 비교한 백분율.

30분 처리와 같이, 50 mM MBCD로의 45분 처리는 모의 처리와 비교하여, IFV에 대해 약 97%의 콜레스테롤을 제거하고, 바이러스를 시험관내에서 10,000배 초과로 덜 감염성이도록 만든다. 대조적으로, 10% DIPE (30분 처리)는 콜레스테롤을 제거하는데 있어서 덜 효과적이고 (약 80%) 시험관내 감염성에서 약 120배 감소를 유발한다. HA 활성은 MBCD에 의해 측정가능하게 영향받지 않지만, 10% DIPE에 의해 측정가능하게 감소되었다. 단백질 함량은 50 mM MBCD에 의한 6% 감소와 비교하여, 10% DIPE 처리 후에 50% 감소된다.

본원에 제시된 실험의 2개 세트는 50 mM MBCD가 콜레스테롤을 선택적으로 제거하고 탈지질화된 IFV를 덜 감염성이도록 만들면서 대부분의 단백질을 유지한다는 것을 입증한다. 그러나, 이들 처리 중 어느 것도 감염성을 완전히 폐지할 수 없고 따라서 바이러스를 완전히 불활성화시킬 수 없어서, 인플루엔자 바이러스를 완전히 불활성화시키기 위해 절차의 추가의 최적화가 요구된다. 추가의 최적화는, 비제한적으로, MBCD 처리의 기간을 증가시키는 것 및 바이러스를 제2 기간 동안 MBCD로 처리하는 것을 포함할 수 있다.

실시예 2

PRRSV의 MBCD로의 처리는 콜레스테롤을 선택적으로 제거하고, 바이러스 감염성을 감소시키고, 대부분의 바이러스 단백질 함량을 유지한다.

시약:

본 실시예에 사용된 PRRSV 바이러스 균주는 RESP (장쑤성 아카데미 오브 아그리컬쳐 사이언시스(Jiangsu Academy of Agriculture Sciences), 중국)이다. 사용된 숙주 세포는 Marc-145 (욱시 앱테크, 중국 상하이)이다. 사용된 다른 시약은, Marc-145 세포를 배양할 때 사용되는 DMEM (인비트로젠)을 제외하고는, 상기 실시예 1에서와 동일하다.

Marc-145 세포에서의 PRRSV의 번식:

세포를 하기 절차에 따라 PRRSV와 함께 시딩한다. 배지를 T-75 플라스크에서 성장된 Marc-145 세포로부터 제거하고, Marc-145 세포 단층을 5 mL의 PBS로 실온에서 헹구고, 세포를 37℃에서 1.5 mL의 트립신/EDTA로 탈착시킨다. 세포를 10% FBS를 함유하는 10 mL DMEM 배지에 재현탁하고, 800 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 재현탁하고, 세포 밀도를 2.5 x 10⁵개 세포/mL로 조정한다. 15 mL의 Marc-145 세포 현탁액을 각각의 T75 플라스크에 시딩하고, 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 두고, 밤새 인큐베이션한다.

Marc-145 세포가 90% 초과 전면생장일 때, DMEM을 T-75 플라스크로부터 제거하고, 2% FBS를 함유하는 5 mL EMEM 유지 배지를 첨가하고, 세포를 PRRSV로 0.1의 MOI로 감염시킨다. 플라스크를 5% CO₂ 하에37℃에서 60 - 90분 동안 인큐베이션하고, 15분마다 부드럽게 진탕한다. 2% FBS를 함유하는 10 mL EMEM 유지 배지를 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 37℃ 및 5% CO₂에서 96시간 동안 인큐베이션한다. 80%의 CPE를 달성했을 때 (일반적으로 96시간), 배양 상청액을 수확하여 PRRSV를 수득한다.

PRRSV의 정제:

PRRSV를 하기 절차에 따라 정제한다. 수집된 배양 상청액을 3,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고, 상청액을 수집한다. 상청액을 100,000 x g로 60분 동안 원심분리하여 PRRSV를 펠릿화한다. PRRSV 펠릿을 약 1 x 10⁹ PFU/mL의 역가로 적절한 부피의 생리학상 완충 염수 (PBS)에 재현탁한다. 100 μL 농축된 PRRSV의 분취물을 -80℃에서 저장한다.

하기 절차를 사용하여 PRRSV를 시험관내 감염성에 대해 적정한다. 상기 세포 배양 및 전달 절차를 사용하여, Marc-145 세포를 1.5 x 10⁵개 세포/mL의 최종 밀도로 10% FBS를 함유하는 DMEM에 현탁한다. 2 mL의 Marc-145 세포 현탁액을 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션한다. 바이러스 샘플을 37℃ 수조에서 해동시키고, 이어서 500 x g로 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. EMEM을 희석 완충제로서 사용하여, 바이러스의 1/10 희석 시리즈를 제조하고, 사용까지 4℃에서 저장한다.

Marc-145 세포가 적어도 90% 전면생장일 때, 배지를 제거하고, 0.5 mL 희석 완충제 및 0.5 mL의 바이러스 희석물을 각각의 웰에 첨가한다. 음성 대조군의 경우에, 1.0 mL 희석 완충제를 사용한다. 각각의 희석물을 첨가한 직후에 플레이트를 부드럽게 진탕한다. 플레이트를 5% CO₂하에 37℃에서 60 - 90분 동안 인큐베이션하고, 15분마다 요동시킨다. 이어서 각각의 6-웰 플레이트의 각각의 웰을 37℃에서 PBS 용액 중 2.5% 저융점 아가로스 및 희석 완충제의 1:4 혼합물 3 mL로 오버레이한다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 오버레이 혼합물을 고체화되도록 하고, 이어서 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션한다.

하기 절차를 사용하여 플라크를 가시화한다. 플라크가 완전히 발색된 후에 (감염후 96시간), 1 mL 4% 파라포름알데히드를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 가용화된 플레이트를 폐기하고, 0.5 mL의 0.5% 크리스탈 바이올렛을 각각의 웰에 첨가한다. 크리스탈 바이올렛과 함께 15분의 인큐베이션 후에 플라크의 수를 카운팅하고, 희석 배율을 기반으로 하여 역가로 변환시킨다.

PRRSV의 시험관내 번식:

1 x 10⁷ PFU/ml 초과의 PRRSV 역가가 단백질 및 콜레스테롤 검정에 대해 바람직하다. Marc-145 세포에서의 PRRSV-RESP 균주의 번식은 역가 > 1 x 10⁸ PFU/mL를 갖는 농축된 바이러스 샘플을 산출한다.

PRRSV의 탈지질화:

용매 및 모의 처리를 하기 절차에 따라 수행한다. 약 1 x 10⁹ PFU/ml로 농축된 PRRSV 스톡의 100 μL 분취물을 에펜도르프 튜브에서 900 μL PBS에 희석하여 1.0 - 5.0 x 10⁸ PFU/mL의 최종 역가를 달성한다. PBS 중 MBCD를 용매 처리를 위해 목적한 농도까지 첨가하거나, 또는 동일한 부피의 모의 처리를 위해 PBS를 첨가한다. 이어서 에펜도르프 튜브를 마개를 막고 파라필름으로 밀봉한다. 모든 샘플을 37℃로 예열된 SHZ-82 항온 오비탈 공기-조 진탕기 (창저우 구오후아 어플라이언스 캄파니, 중국)에서 고정한다. 용매- 및 모의-처리된 샘플을 220 rpm의 오비탈 회전 속도로 37℃에서 목적한 기간 동안 회전시킨다. 각각의 샘플을 마이크로-원심분리기에서 1분 동안 회전시키고, IFV를 함유하는 상청액을 초원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 100,000 x g (옵티마™ L-100XP 원심분리기; 베크만 쿨터, 인크., 인디애나주 인디애나폴리스)로 30분 동안 원심분리하여 PRRSV를 펠릿화하고, 상청액을 폐기한다. PRRSV 펠릿을 200 μL PBS에 재현탁하고, 추가의 분석까지 -80℃에서 저장한다.

탈지질화된 PRRSV의 특징화:

탈지질화된 및 모의-처리된 PRRSV의 단백질 함량을 제조업체의 지침서에 따라 BCA 검정 (피어스™ BCA 단백질 검정 키트)을 사용하여 결정한다. 콜레스테롤 함량을 또한 제조업체의 지침서에 따라 수행된 콜레스테롤 검정 (암플렉스® 레드 콜레스테롤 검정 키트, 라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 결정한다. 상기 제시된 바와 동일한 절차를 사용하여 시험관내 감염성을 측정한다.

MBCD의 농도 의존성:

제1 탈지질화 실험에서, PRRSV를 5, 10, 20, 30 및 50 mM MBCD로 37℃에서 60분 동안 탈지질화한다. 초원심분리 후에, 모의-처리된 및 탈지질화된 샘플을 Marc-145 세포에서 시험관내 감염성에 대해 시험하고, 상기 제시된 절차를 사용하여 단백질 및 콜레스테롤 함량을 결정한다. 탈지질화된 PRRSV의 감염성, 단백질 함량, 및 콜레스테롤 함량은 표 4에 제시되어 있다.

표 4

주: ^a 모의 처리와 비교한 백분율.

출발 PRRSV-RESP 스톡의 역가는 1.0 x 10⁸ PFU/mL이며, 그의 0.1 mL를 적절한 양의 MBCD와 함께, 0.9 mL PBS와 혼합한다. 220 RPM으로 37℃에서 60분 동안 오비탈 진탕 후에, 바이러스 샘플은 초원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.2 mL의 PBS의 최종 부피에 현탁한다. 모의-처리된 샘플의 역가는 1.6 x 10⁷ PFU/mL이며 (표 4), 이는 바이러스 활성의 30% 초과가 모의 처리 후에 회수된다는 것을 시사한다. MBCD 처리는 거의 농도 의존성 방식으로 감염성 및 콜레스테롤 함량을 감소시키지만, 총 단백질 함량의 88% - 98%는 모든 MBCD 농도로 회수된다 (표 4 참조). 50 mM MBCD로 처리 후에, 탈지질화된 PRRSV는 모의 샘플과 비교하여 출발 양의 약 28%를 유지하고, PRRSV 감염성은 약 380배까지 감소되지만, 다시 완전히 폐지되지는 않는다.

탈지질화된 PRRSV 샘플의 블라인드 계대 검정:

탈지질화된 PRRSV 샘플 중 하나 (90분 동안 100 mM MBCD)의 역가는 검출 한계 미만이다. 이는 샘플 중 임의의 감염성 바이러스 입자가 있는지 여부의 의문을 제기한다. 이러한 감염성 바이러스 입자가 존재하는지 여부의 의문을 다루기 위해, 새로운 샘플을 100 mM MBCD로 90분 동안 탈지질화하고, 하기 기재된 블라인드 계대 검정에 적용한다. 대조군 PRRSV-RESP 샘플은 1.6 x 10⁶ PFU/mL의 역가이지만, 어떠한 플라크도 100 mM MBCD로 90분 동안 탈지질화된 PRRSV 샘플로부터의 블라인드 계대 검정에 의해 검출되지 않는다. 100 mM MBCD로의 90분 동안 탈지질화는 PRRSV-RESP를 완전히 불활성화시킬 가능성이 있다.

블라인드 계대 검정을 하기 절차에 따라 수행한다. 100 μL의 탈지질화된 PRRSV 샘플을 상기 절차에 의해 제조된 Marc-145 세포를 함유하는 6-웰 플레이트의 각각의 웰로 옮긴다. 플레이트를 5% CO₂하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션한다. 3개의 연속적인 냉동-해동 사이클을 수행하여 세포를 용해시키고, PRRSV를 함유하는 상청액을 수확하고, 800rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 400 μL의 상청액을 Marc-145 세포의 플라스크로 옮긴다. 플라스크를 37℃ 및 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션한다. 냉동-해동 사이클을 반복하고, 상청액을 다시 수확하고, 원심분리하고, 이전과 같이 Marc-145 세포의 플라스크로 옮긴다. 냉동-해동 사이클을 1회 더 많이 반복하고, 상청액을 다시 수확하고, 원심분리하고, PRRSV를 함유하는 상청액을 추가의 사용까지 -80℃에서 동결시킨다. 최종, 수확된 샘플의 PRRSV 역가를 상기와 같이 Marc-145 세포를 사용하여 결정한다.

실시예 3

본 연구의 목적은 메틸 β 시클로덱스트린 (MBCD)을 활용하는 탈지질화 방법을 통해 PRRSV 균주 ND 99-14의 불활성화에 대한 기간 의존성을 결정하는 것이었다. MBCD를 CTD, 인크.(CTD, Inc.) (플로리다주 앨라추아)로부터 분말 형태로 구입하였다. 300 mM 스톡 용액을 1000 mL의 물을 280 g의 MBCD에 첨가함으로써 제조하여 스톡 용액을 생성하였다.

바이러스 탈지질화:

불활성화 동역학적 실험을, 2016년 2월 18일자로 출원된, 동시-계류 출원 US 일련 번호 62/296,628에 기재된, PRRSV 균주 ND99-14를 사용하여 수행하였다. 일반적으로 방법은 40 mM의 최종 농도로 MBCD의 첨가 및 일정한 혼합과 함께 실온에서 총 72시간의 인큐베이션 기간을 수반한다. MBCD의 첨가는 불활성화 프로세스를 시작하기 위해 2 단계, 20 mM에서 발생하고, MBCD의 추가적인 20 mM을 24시간 후에 첨가하고, 일정한 혼합과 함께 실온에서 추가적인 48시간 동안 인큐베이션한다. 실온은 약 20℃ 내지 약 25℃이고, 최적으로는 약 22℃ 내지 약 24℃이다.

567 mL의 MBCD 용액을 8.5 L의 바이러스 스톡에 첨가함으로써 300 mM 스톡의 MBCD 용액을 처음에 바이러스에 20 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 바이러스를 50 rpm으로 혼합 하에 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. MBCD 첨가후 0시간, 15분, 4, 8, 12, 16, 20 및 24시간째에 30 mL의 바이러스를 수집하였다. 각각의 시점에 대한 분취물을 추가의 사용까지 4℃ 및 -70℃에서 저장하였다.

24시간 후에 샘플을 수집하고, 바이러스를 새로운 용기로 옮겼다. 추가적인 20 mM의 MBCD를 첨가하여 (650 mL MBCD가 9.75 L의 바이러스 스톡에 첨가됨) 40 mM의 최종 농도에 도달하였다. 바이러스를 실온에서 추가적인 48시간 동안 인큐베이션하였다. 30 mL의 바이러스를 제1 MBCD 첨가 후 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84 및 96시간째에 수집하였다. 각각의 시점에 대한 분취물을 추가의 사용까지 4℃ 및 -70℃에서 저장하였다.

바이러스 측정:

모의 불활성화된 및 불활성화된 바이러스의 10배 연속 희석물 (10^-1-10^-9)을 96 웰 플레이트 상의 배양된 MARC145 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 96시간 동안 인큐베이션하여 생 바이러스가 세포를 감염시키도록 하였다. 바이러스 복제를 MARC145 세포의 바이러스 감염으로 인한 세포병변 효과 (CPE)의 관찰에 의해 결정하였다. 바이러스 희석물을 함유하는 각각의 웰을 CPE에 대해 양성 또는 음성으로 점수화하고, 각각의 희석물에 대한 양성 또는 음성 웰의 생성된 수를 사용하고 리드-뮌흐 TCID₅₀계산을 사용하여 TCID₅₀/mL를 결정하였다. 모의 불활성화된 바이러스를 불활성화 작용제의 첨가 없이 불활성화된 바이러스와 동일한 배지 및 온도 조건으로 처리하였다.

모의 불활성화된 및 불활성화된 바이러스 뿐만 아니라 배지 단독 대조군의 3개의 연속적인 블라인드 계대를 T-225 플라스크 상에서 배양된 MARC145 세포를 사용하여 수행하였다. 불활성화된 및 대조군 샘플을 MARC145 세포의 2일 배양물에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 7일 동안 인큐베이션하였다 (27 mL의 배지에 3 mL의 샘플). 플라스크를 CPE의 존재에 대해 시각적으로 조사하였다. 각각의 플라스크를 CPE에 대해 양성 (+) 또는 음성 (-)으로 점수화하였다. 플라스크로부터의 상청액을 수확하고, MARC-145 세포의 2일 배양물을 함유하는 새로운 세트의 T-225 플라스크에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 상기 프로세스를 2회 반복하여 3개의 연속적인 바이러스 계대에 대한 CPE 관찰을 수득하였다.

PRRS 바이러스 역가를 제시된 바와 같은 2개의 상이한 온도에서 저장된 샘플을 사용하여 96시간 인큐베이션 기간 동안 수집된 모든 시점에 대해 결정하였다. 0은 역가가 PRRS 라이브 바이러스TCID₅₀ 결정 검정에 의해 검출불가능하나 또는 결정되지 않았음을 지시한다. 표 5에 나타난 결과는 2 단계 프로세스에서 첨가된 40 mM이 적어도 8 log₁₀ TCID₅₀/mL의 역가로 PRRS 바이러스를 불활성화시킬 수 있었다는 것을 입증하였다. 더 높은 역가는 20 mM MBCD로는 불완전한 불활성화이지만, 바이러스는 농도를 40 mM까지 올린 MBCD의 제2 첨가 후에는 검출불가능하였음을 입증하였다. 결과는 또한 기간이 불활성화에 대해 덜 기여하는 요인이었다는 것을 제시하였다. MBCD의 주어진 농도에서의 더 긴 인큐베이션 기간은 불활성화의 수준을 증가시키지 않았다. MBCD의 20 mM 농도는 15분의 인큐베이션 후에 대략 2.5 로그까지 생 바이러스를 감소시켰고, 검출된 생 바이러스의 수준은 24시간 동안 일정하게 유지되었다. 24시간의 인큐베이션에서 20 mM MBCD의 제2 첨가는 수집된 후속 시점 샘플 (30시간)에 의해 검출불가능한 수준으로 바이러스를 불활성화시켰다. 생존율에서의 차이는 또한 상이한 저장 온도에서 40 mM MBCD의 존재 하에 관찰하였다. 검출가능한 생 바이러스가 있는 시점 샘플은 4℃에 비해 -70℃에서 저장될 때 적어도 100배 적은 바이러스를 가졌다.

표 5

^a Log₁₀ TCID₅₀/mL

실시예 4

본 연구의 목적은 백신접종-시험감염 연구에서 실험적 불활성화된 PRRSV의 안전성 및 효능을 평가하는 것이었다. 백신을 폐 병변 및 바이러스혈증 수준을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 관심 백신 특징은 저장 온도, 용량의 수 (1회 vs 2회) 및 아주반트 첨가를 포함하였다. 연구를 아이오와주 캠브리지 소재의 베터리너리 리소시즈, 인크.(Veterinary Resources, Inc.)의 BSL-2 설비에서 수행하였다. 실험실 검정을 아이오와주 아메스 소재의 아이오와 스테이트 유니버시티 베터리너리 디아그노스틱 래보러토리 및 사우스 타코타주 브루킹스 소재의 사우스 다코타 스테이트 유니버시티 베터리너리 디아그노스틱 래보러토리에서 수행하였다. PRRSV에 대해 혈청음성인 약 3주령의 60마리의 임상적으로 건강한, 젖을 뗀 돼지를 연구에 등록하였다. 돼지를 체중 감소에 의해 등급화하고, 각각 6마리의 10개 블록으로 형성하였다. 돼지를 6개 처리 그룹 (그룹당 10마리 돼지) 중 하나에 무작위로 할당하였다. 처리 그룹은 비-백신접종된 대조군 그룹 (T01) 및 5개의 실험적 불활성화된 PRRSV 백신으로 백신접종된 그룹을 포함하였다. 백신을 메틸-베타-시클로덱스트린 (MBCD)을 사용한 탈지질화에 의해 불활성화시켰다. 그룹 T02 및 T03 백신은 아주반트를 함유하지 않았고, 2-8℃ (T02) 또는 -20℃ (T03)에서 저장되었다. 그룹 T04 및 T05 백신은 몬타니드(MONTANIDE)™ 겔 01 아주반트 (세픽(Seppic))를 함유하였고, 1회 (T04) 또는 2회 (T05) 투여되었다. 그룹 T06 백신은 몬타니드™ IMS 1313 VG N PR 아주반트 (세픽)를 함유하였고, 2회 제공되었다.

돼지는 탑-로드 피더를 통해 표준 상업적 약물첨가 (CTC/데나가르드(DENAGARD)®) 스타터 식이 (NRC, 2012)를 자유롭게 공급받았다. 돼지는 니플 급수기를 통해 깨끗한 음용수에 자유롭게 접근하였다. 모든 연구 돼지를 백신 접종후 10일 (DPV)에 엑세드(EXCEDE)®로 처리하였다. 추가적으로, 모든 돼지를 바이탈 E(VITAL E)®-500의 단일 용량 및 엑세드® 21 DPV의 또 다른 처리로 처리하였다. 모든 의약을 라벨 지시에 따라 투여하였다.

백신

PRRSV 균주 SD 11-21 (계대 수준 84)을 현재 연구에서 항원으로서 사용하였다. SD11-21은, 2016년 2월 18일자로 출원된, 동시-계류 출원 US 일련 번호 62/296,658에 기재된 바와 같이, MARC-145 세포주를 통한 84개 계대 뿐만 아니라 3개 라운드의 플라크 정제 및 수크로스 구배 원심분리를 통해 세포 배양물에서의 성장에 적합화된 필드 균주이다. 계대 85 (p85)를 2% 태아 소 혈청 (시그마, 미주리주 세인트 루이스) 및 50 ug/mL의 겐타마이신 (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)이 보충된 OPTI-MEM 배지 (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 중 힐렉스 II 마이크로캐리어 (폴 코포레이션(Pall Corporation), 뉴욕주 포트 워싱톤)에 부착된 MARC-145로 시딩된 5 L BioBLU 단일 사용 생물반응기 (에펜도르프(Eppendorf), 독임 함부르크)에서 생산하였다. 수확된 p85 바이러스 스톡의 역가는 실시예 3에 기재된 바이러스 적정 검정에 의해 측정된 바와 같은 7.3 log₁₀TCID₅₀이었다.

1L 병에서, 19.7 mL의 300 mM MBCD (시그마, 미주리주 세인트 루이스) 스톡 용액을 300 mL의 SD11-21 바이러스 스톡에 첨가하였다. 혼합물을 50 rpm으로 24시간 동안 일정한 혼합 하에 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션 후에 추가적인 9.8 mL의 MBCD 스톡 용액을 첨가하고, 혼합물을 50 rpm으로 추가적인 24시간 동안 일정한 혼합 하에 실온에서 인큐베이션하였다. MBCD의 최종 농도는 총 48시간의 실온 인큐베이션으로 30 mM이었다. 모의 불활성화된 바이러스 스톡을 또한 MBCD 대신에 등량의 물을 첨가하여 제조하였으며, 인큐베이션 기간 및 혼합은 불활성화된 바이러스와 동일하였다. 모의 불활성화된 바이러스를 바이러스 측정 검정에 대한 대조군으로서 사용하였다. 처리 후에, 모의 불활성화된 바이러스는 6.5 log₁₀TCID₅₀/mL로 존재하였던 반면, 생 바이러스는 MBCD-불활성화된 바이러스 용액에서 전혀 검출되지 않았다. 바이러스 스톡을 추가의 사용까지 4℃에서 저장하였다.

백신을 안정화제 및 보존제를 포함하도록 제제화하였다. OPTI-MEM® I 감소된 혈청 배지를 블렌딩 희석제로서 사용하였다. 아주반트는 몬타니드™ 겔 01 (세픽) 및 몬타니드™ 1313 VG N PR (세픽)의 상업적 제제를 포함하였다. 대조군 생성물은 포스페이트 완충 염수 (PBS)의 상업적 제제 (코닝 셀그로(Corning Cellgro), 미디어테크 인크.(Mediatech Inc.))였다. 아주반트가 없는 백신은 탈지질화된 바이러스, 25% 안정화제 B, 보존제로서의 25 μg/ml 겐타마이신, 및 블렌딩 희석제를 함유하였다. 아주반트가 있는 백신은 20%의 지시된 아주반트를 함유하였다. 안정화제 B는 pH 7.0 - 7.2에서 초순수 물 (라이프 테크놀로지스) 중 2.5% D-만니톨 (시그마), 1.2% 젤라틴 유형 A (피셔(Fisher), 펜실베니아주 피츠버그), 1% NZ 아민 카세인 히드로실레이트 (시그마), 5% 수크로스 (시그마), 및 6.2% 트레할로스 (피셔)를 함유하였다.

백신접종 및 시험감염

연구에 등록된 60마리 돼지 각각에 시험감염 전 제-35일에 백신접종하였다. T01-T05에서의 돼지에 목 우측에서 1.0 mL 근육내 용량으로서 그의 할당된 치료제를 주사하였다. T06에서의 돼지에 1.5 mL를 주사하였다. T01-T03 및 T05 및 T06에서의 돼지에 14일 후에 (시험감염 전 제-21일) 동일한 방식으로 다시 백신접종하였다. 0 DPC에, 시험감염 직전에 균주 NADC-20의 동결된 분취물을 해동시켜 시험감염 물질을 제조하였다. 역가를 미디어테크, 인크.(Mediatech, Inc.)로부터의 이글 염 및 L-글루타민을 함유하는 최소 필수 배지 이글 (MEM)에의 희석 후 1.26x10^5.0 TCID₅₀/ml인 것으로 결정하였다. 각각의 돼지를 시험감염을 위해 머리를 위쪽으로 향하게 물리적으로 구속하였다. 3 mL 비-루어 락 시린지를 사용하여 2 mL 용량을 비공당 대략 1mL로 비강내로 전달하였다.

결과

14 DPC에, 동물을 부위 절차에 따라 인도적으로 안락사시켰다. 폐를 절제하고, 처리에 블라인딩된 연구 조사자에 의해 점수화하였다. 7개의 폐엽 각각을 PRRSV에 기인된 총 특징적 병변에 대해 시각적 및 촉진 둘 다에 의해 조사하였다. 각각의 폐엽에서의 병변/경화의 양을 0 내지 100% 폐엽의 실제 값으로 점수화하였다. 각각의 폐엽에 대한 점수를 병변이 있는 폐의 백분율을 계산하도록 가중 식에 도입하였다. 병변이 있는 총 폐의 백분율을 하기 식에 따라 계산하였다: 병변이 있는 총 폐의 백분율 = {(0.10 x 좌측 정단) + (0.10 x 좌측 심엽) + (0.25 x 좌측 횡격막) + (0.10 x 우측 정엽) + (0.10 x 우측 심엽) + (0.25 x 우측 횡격막) + (0.10 x 중엽)}.

추가적으로, 병변이 있는 총 폐의 백분율을, 추가의 분석 전에, 아크사인 제곱근을 사용하여 변환하였다. 처리의 고정 효과 (SAS에서의 혼합 절차) 및 블록의 무작위 효과를 포함한 혼합 선형 모델에 의해 분석하였다.

폐 병변 점수의 통계적 분석의 결과는 표 6에 요약된다. 처리의 주요 효과는 통계적으로 유의하였다 (P = 0.0003). 대조군 그룹 (T01)과의 비교는 겔 01 아주반트 함유된 그룹 (T04 및 T05)에서 유의하게 더 낮은 (P<0.05) 퍼센트 폐 침범을 지시하였다. 또한, 2회 투여되고 2-8℃에서 저장된 아주반트-비함유된 백신 (T02)은 -20℃에서 저장된 백신 (T03)으로 처리된 유사한 그룹보다 유의하게 더 낮은 (P<0.05) 병변 점수를 유발하였다.

표 6. 평균 폐 병변 점수 - 아크사인 변환된 퍼센트 폐 침투 (처리의 주요 효과: P = 0.0003)

*T01 대 T04 및 T05는 P < 0.05에서 유의하게 상이함

¹비변환된 평균

²역변환된 평균

바이러스혈증 수준의 결정을 위한 혈액 샘플을 형질감염 전 제-35일 및 제-21일에 수집하였다. 추가적으로, 바이러스혈증 수준의 결정을 위한 혈액 샘플을 0, 3, 7, 10 및 14 DPC에 수집하였다. 샘플을 qRT-PCR 기술을 사용하여 PRRS 바이러스 핵산의 존재에 대해 시험하였다.

혈청학 및 바이러스혈증 데이터를, 비-정규 분포를 고려하면서, 분석 전에 log₁₀ 단위로 변환하였다. 변환된 값을 반복 측정 혼합 모델 (혼합 절차)을 사용하여 분석하였다. 통계적 모델은 처리, 기간, 및 고정 효과로서 기간 상호작용에 의한 처리를 포함하였다. 블록을 무작위 효과로서 모델에 포함하였다. 기간 상호작용에 의한 처리가 유의하면 (P<0.05), 기간내 처리의 효과를 평가하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 처리의 주요 효과를 평가하였다. 최소 제곱 평균 (역변환됨) 및 표준 오차를 제시하였다.

바이러스혈증 수준의 분석은 표 7에 요약된다. 바이러스혈증은 PRRSV 시험감염 전에 어느 돼지에서도 관찰되지 않았으며, 이는 백신 바이러스가 불활성화되었다는 것을 확증한다. 시험감염 전 시점을 통계적 분석에서 배제하였다. 시험감염후에, 일 상호작용에 의한 처리는 유의하지 않았고 (P=0.0974), 따라서 처리의 주요 효과를 평가하였다. 처리의 효과는 유의하였다 (P = 0.0107). 대조군 그룹 (T01)과의 비교는 아주반트 함유된 모든 백신 그룹 (T04, T05 및 T06)에서 유의하게 더 낮은 (P<0.05) 수준을 지시하였다. 사전-계획된 대조는 통계적으로 전혀 유의하지 않았다.

표 7. 바이러스혈증 - 3, 7, 10 및 14 DPC에서의 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균 (log₁₀ 변환됨) (처리의 주요 효과: P = 0.011; 일 상호작용에 의한 처리: P = 0.097)

*T01 대 T04, T05, T06, P < 0.05에서 유의하게 상이함

¹비변환된 log10 평균

²역변환된 평균

결론

1 또는 2회 용량의 MBCD 불활성화된, Gel 01 아주반트 함유된 백신으로 돼지를 백신접종하는 것은 대조군 그룹과 비교하여 폐 병변 및 바이러스혈증 수준 둘 다를 유의하게 감소시키는데 있어서 효과적이었다. 폐 병변은 2-8℃에서 저장된 다른 MBCD 불활성화된 백신 (T02 및 T06)으로 백신접종된 돼지에서 수적으로 감소되었다. 폐 병변 점수에서의 변이로 인해, 이들 차이는 P<0.05 수준에서 유의하지 않았다. 아주반트 (몬타니드™ 겔 01 또는 1313)를 함유한 모든 MBCD 백신은 바이러스혈증을 유의하게 감소시켰다. 미래 연구에서, NADC-20 균주가 폐 병변 및 바이러스혈증 둘 다에서 의미있는 생물학적 차이를 검출하기 위한 시험감염 물질로서 활용될 때 더 큰 샘플 크기가 요구될 수 있다.

저장 온도는 백신 효능에 대해 영향을 미치는 것으로 보인다. -20℃에서 백신을 저장하는 것은 2-8℃에서 저장된 백신과 비교하여 백신 효능에 대한 부정적 효과를 가졌다.

1차 백신접종 후 제14일에 추가적인 백신접종을 추가하는 것은 겔 01로 아주반트 함유된 MBCD 불활성화된 백신으로 백신접종된 돼지에서의 백신 효능을 추가로 개선시키지 않았다.

MBCD 불활성화된 백신에의 겔 01 아주반트의 포함은 백신 효능에 영향을 미치지 않았다.

MBCD 불활성화된 백신은 백신접종후 전신 반응 전혀 없음, 주사 부위 병변 전혀 없음, 및 2차 백신접종 후 세픽 몬타니드™ 겔 01 아주반트 함유된 그룹에서 단지 일시적인 (1 또는 2일) 발열 반응에 의해 입증된 바와 같이 돼지를 성장시키는데 안전하였다.

Claims

외피보유 바이러스를 포함하는 용액을 제1 MBCD 용액과 혼합하여 제1 혼합물을 수득하고;
제1 혼합물을 제1 기간 동안 인큐베이션하고;
제1 혼합물로부터의 외피보유 바이러스를 제2 MBCD 용액과 혼합하여 제2 혼합물을 수득하고;
상기 제2 혼합물을 제2 기간 동안 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 불활성화된 외피보유 바이러스를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도가 적어도 5 mM 내지 약 100 mM 인 방법.
제1항에 있어서, 제1 혼합물 중 MBCD의 농도가 약 20 mM 내지 약 40 mM인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도가 약 10 mM 내지 약 100 mM인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 혼합물 중 MBCD의 농도가 약 30 mM 내지 약 50 mM인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 기간이 약 15분 내지 약 24시간인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 기간이 약 4시간 내지 약 24시간인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 기간이 약 4시간 내지 약 48시간인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 기간이 약 24시간, 약 36시간, 또는 약 48시간인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 기간 및 제2 기간 중 적어도 하나의 온도가 약 20℃ 내지 약 25℃인 방법.
제10항에 있어서, 온도가 약 22℃ 내지 약 24℃인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 외피보유 바이러스가 제2 혼합물을 수득하는 단계 전에 제1 혼합물로부터 단리되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 외피보유 바이러스가 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 기간 및 제2 기간 중 적어도 하나가 제1 혼합물 및/또는 제2 혼합물의 교반을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스.
제15항의 탈지질화된 외피보유 바이러스를 포함하는 백신.
제16항에 있어서, 아주반트, 안정화제, 보존제, 및 블렌딩 희석제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 백신.
외피보유 바이러스에 의해 야기된 질환의 치료에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 탈지질화된 외피보유 바이러스의 용도.