JP2022547159A - 生物学的調製物のクロマチン含有量を低減する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

パルボウイルス及びアデノ随伴ウイルスからなる群から選択された所望の生物由来物質を含む細胞培養収穫物を提供すること、３．０Ｍ～飽和状態の範囲内の濃度のＮａＣｌに相当するイオン強度を有する３．０～４．０の範囲内のｐＨ値の水性媒体に細胞培養収穫物をインキュベーションすること、及び生産された固体から所望の生物由来物質を分離すること、を含む、細胞培養収穫物からクロマチンを除去する方法。

Description

最終製剤におけるＤＮＡの量は、全てのバイオ医薬品にとって最上位の安全上及び規制上の懸案事項である。
これは、例えば、遺伝子治療の分野における治療用のＤＮＡプラスミドの輸送媒体として用いられるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。安全上の懸案事項は、ＡＡＶカプシド中の治療用のＤＮＡではなく、むしろＡＡＶを生産するのに用いられる宿主細胞由来の残存ＤＮＡである。この宿主由来のＤＮＡを除去することは、予想よりも困難であることが判明したため、この分野の進展の障害として認識されてきた。その難題は、カプシドの外表面に結合した宿主由来のＤＮＡに部分的に由来する可能性がある。

ＡＡＶカプシド中の治療用のＤＮＡペイロードは一般にベクターＤＮＡと呼ばれる。このＤＮＡの一部は、不完全な挿入又は最初に充填されたカプシドへのその後の損傷により、カプシドの外側に存在することもある。このＤＮＡは最上位の安全上の懸案事項であると考えられていないが、様々なＤＮＡアッセイにより測定されるＤＮＡが充填されたカプシドの見かけの数を膨張させる潜在能力のために問題となる。余分なカプシドベクターＤＮＡの影響を抑えるためいくつかの試料調製方法が利用できるが、余分なカプシドベクターＤＮＡが単純に存在しないのであればそれが好ましい。

宿主由来のＤＮＡを分解するためのＡＡＶ収穫物のヌクレアーゼ酵素による処理は、ＡＡＶ精製手順の共通の特徴である。この手法の限界は、ヒストンタンパク質との強い会合により、宿主ＤＮＡが酵素分解から保護されていることである。かなりの量の宿主ＤＮＡが消化されず、ＡＡＶ調製物の中に残る。いくつかの精製手順では、宿主ＤＮＡの全体の低減を向上するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを追加で採用している。その原理は、ＤＮＡがＡＡＶよりも陰イオン交換体により強く結合しＡＡＶを溶出することを可能にする一方で、ＤＮＡは陰イオン交換体に残ることである。そのような処理は宿主ＤＮＡ含有量を低減するが完全に排除はせず、そのようにできないことは、酵素処理の有効性を制限する同じ問題、収穫物中の宿主細胞ＤＮＡがヒストンタンパク質と強く会合して存在していることと関連している。酵素分解からＤＮＡを物理的に守ることに加え、強く会合したヒストンが電荷中性の特性を有する混成の凝集物を作り、ＤＮＡの一部はやはりウイルスと共溶出する［１］。

あるいは、収穫物のｐＨを下げることにより、ヒストンとまだ会合している宿主ＤＮＡの一部を細胞培養収穫物から沈殿させることができる。この方法は１９９４年に記載され、生理学的な塩濃度のクエン酸緩衝液を用いて、ｐＨ２．６～ｐＨ５．０の範囲内にｐＨを滴定する［２］。この研究は哺乳動物の細胞培養収穫物に対して行われたが、その技術はその後、細菌、酵母、真菌、及び昆虫細胞にも適用された［３－５］。最近では、宿主ＤＮＡを含むＡＡＶ汚染物質の軟凝集のために、ｐＨ及び塩濃度の同じ範囲内で哺乳動物の細胞培養収穫物に適用された［６］。

カチオン性複素環化合物及び可溶性のカチオン性ポリマーを用いた収穫物の清澄化及び宿主細胞ＤＮＡ汚染の低減もまた記載されている［７－１０］。アニオン性脂肪酸及び複素環アニオンもまたＤＮＡレベルを低減することで知られている［１１－１６］。これらの手法の共通の特徴は、約１５～３００ｍＭの塩の範囲内、ほとんどの場合は５０～１００ｍＭの塩の範囲内などの０．５Ｍ（５００ｍＭ）未満の塩濃度を採用していることである。アラントインは単独で、並びにこれらの試薬及び条件の多くと組み合わせて用いられてきた［１、１５、１６］。アラントインはエンドトキシンに対して高い親和性を有することが知られている［１７］。

ＤＮＡは約２．６のｐＫ_ａを有することが知られている。細胞培養収穫物中の宿主ＤＮＡは様々な大きさのヌクレオソームアレイ中のヒストンタンパク質と最初に会合することが知られている。ヒストンタンパク質は極度の疎水性であり、約９～１１の範囲の等電点を有する。宿主ＤＮＡは、１ＭのＮａＣｌ中でヒストンタンパク質から部分的に解離し、ＮａＣｌ濃度が４Ｍまで高まるにつれ次第に解離するが、その濃度であっても完全には解離しない。ヒストンタンパク質は、１Ｍを超えるＮａＣｌ濃度で不溶性の凝集物を形成し始める。解離したＤＮＡは高い塩濃度条件下で可溶であるが、塩濃度が低下すると、ヒストンタンパク質と再び会合する。

第一級アミン配位子で被覆された表面は、第四級アミン配位子を有する表面よりも強く生体分子を結合することが知られている。生体分子は、ウイルス粒子、ＤＮＡ、エンドトキシン、及び酸性タンパク質を含む。第一級アミンは通常、適度に高い塩濃度で、類似の表面上の第四級アミンよりもこれらの分子を結合する。ＤＮＡはまた、適度に高いが１Ｍ未満の塩化ナトリウムの塩濃度で、第一級アミン配位子から溶出する。第四級アミンの表面及び第一級アミンの表面での実験は、ほとんどの場合、中性から弱アルカリ性のｐＨ（ｐＨ７．０～８．５）で行われる。中性のｐＨ及び５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウムの塩濃度での疎水性の第四級アミン（コレスチラミン）粒子を用いた哺乳動物の細胞培養収穫物の処理では、哺乳動物の細胞培養収穫物中のいくらかのＤＮＡを結合することが知られている［１８］。その後の粒子除去により、収穫物中のＤＮＡ含有量の対応する低減がもたらされる。

［１９］は、所望のタンパク質を含む試料を精製する方法を開示しており、その方法は（ｉ）正電荷の多孔質粒子を有する充填クロマトグラフィーカラムを提供すること、（ｉｉ）試料中の所望のタンパク質が溶出する条件にカラムを平衡化すること、（ｉｉｉ）充填クロマトグラフィーカラムに適用される試料体積が充填クロマトグラフィーカラム内の正電荷の多孔質粒子の粒子間空隙以下になるように試料を充填クロマトグラフィーカラムと接触させること、（ｉｖ）充填クロマトグラフィーカラムから所望のタンパク質を溶出させること、を含み、所望のタンパク質はより純粋な状態かつ充填クロマトグラフィーカラムを平衡化した条件下にあり、所望のタンパク質は抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、又は抗体融合タンパク質である。本質的に、［１９］はウイルスを除去すること及び所望のタンパク質を得ることに関し、ウイルスは不必要である。この参考文献は、ウイルスを保存する一方でＤＮＡを除去することに関しては言及していない。

［２０］は、タンパク質調製物を第一級アミン、第二級アミン、又はその両方を有する表面と接触させることにより、タンパク質調製物中のウイルス及びウイルスＤＮＡレベルの両方の低減を強化する方法を開示している。しかしながら、この参考文献は、ウイルスからＤＮＡを除去し、ウイルスＤＮＡから精製されたウイルスを残すことに関しては言及していない。

本明細書において引用される全ての参考文献は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、参照によって組み込まれる。

参考文献
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［６］米国特許出願公開第２０１７／０１３０２０８（Ａ１）号明細書
［７］Ｄ． Ｓａｌｔ， Ｏ． Ｈａｙ， Ｏ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ． Ｈｏａｒｅ， Ｐ． Ｄｕｎｈｉｌｌ， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ： ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ． Ｅｎｚ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １７ （１９９５） １０７－１１３．
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［９］欧州特許第０２４０３４８号明細書
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［１１］Ａ． Ｃｈａｎｔｕｉｎ， Ｒ． Ｃｕｒｎｉｓｈ， Ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９ （１９６０） ２１８－２２０．
［１２］Ｍ． ＭｃＩｎｎｅｙ， Ａ． Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ， Ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｎｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔ．， ９６ （１９８７） ２７１－２７８．
［１３］米国特許第８０６３１８９（Ｂ２）号明細書
［１４］Ｙ． Ｂｒｏｄｓｋｙ， Ｃ． Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｙｉｇｓａｗ， Ｇ． Ｖｅｄａｎｔｈｕｍ， Ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ： ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０９ （２０１２） ２５８９－２５９８．
［１５］Ｐ． Ｇａｇｎｏｎ， Ｒ． Ｎｉａｎ， Ｙ－Ｓ． Ｙａｎｇ， Ｑ－Ｙ． Ｙａｎｇ， Ｃ－Ｌ． Ｌｉｍ， Ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｉｎｆｌａｔｅｓ ｈｏｓｔ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ， ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔ， ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｏｓｓ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ １４０８ （２０１５） １５１－１６０．
［１６］Ｒ． Ｎｉａｎ， Ｗ． Ｚｈａｎｇ， Ｌ． Ｔａｎ， Ｊ． Ｌｅｅ， Ｘ． Ｂｉ， Ｙ－Ｓ． Ｙａｎｇ， Ｈ－Ｔ． Ｇａｎ， Ｐ． Ｇａｇｎｏｎ， Ａｄｖａｎｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ １４３１ （２０１６） １－７．
［１７］米国特許第９６９５２１６（Ｂ２）号明細書
［１８］Ｐ． Ｇａｇｎｏｎ， １９９６， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ２９６ ｐｐ．
［１９］国際公開第２０１３／１８０６４７（Ａ１）パンフレット
［２０］国際公開第２０１５／１８３１８０（Ａ１）パンフレット

ＤＮＡ分解酵素による処理の従来の水準と直交し、可能性を伸ばす哺乳動物の細胞培養における宿主ＤＮＡ汚染を低減する方法が開発されてきた。それはまた、クエン酸による軟凝集の方法よりも効果的である。その方法は主にＡＡＶ含有の細胞培養収穫物、細胞溶解物、又は他のＡＡＶ含有調製物に向けられたものであるが、他のパルボウイルス及び細胞培養により生産された他の生物由来物質からのＤＮＡの低減に適用されてもよい。

本発明によると、細胞培養収穫物からクロマチンを除去する方法は、特に、パルボウイルス及びアデノ随伴ウイルスからなる群から選択された所望の生物由来物質を含む細胞培養収穫物を提供すること、３．０Ｍ～飽和状態の範囲内の濃度のＮａＣｌに相当するイオン強度を有する３．０～４．０の範囲内のｐＨ値の水性媒体に前記細胞培養収穫物をインキュベーションすること、及び生産された固体から前記所望の生物由来物質を分離すること、を含む。

本発明の方法の一実施形態において、所望の生物由来物質はパルボウイルス又はアデノ随伴ウイルスであってもよい。同様に、発明の方法はまた、組み換えタンパク質、抗体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又は抗体の抗原結合フラグメント形態の生産のため、細胞培養からクロマチンを除去するために用いることができる。

本発明の方法の他の実施形態において、収穫物は哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、又は細菌細胞の培養から得てもよい。

本発明の方法のさらに他の実施形態において、水性媒体は約３．０Ｍ～飽和状態までの範囲内の濃度の塩化ナトリウムを含んでもよい。

本発明の方法のさらに他の実施形態において、ｐＨは約３．５±０．３であり得る。

本発明の方法のさらなる実施形態において、インキュベーションの時間は２４時間まで、特に、３０分～２４０分、４５分～９０分、又は５５分～６５分の範囲内であり得る。

本発明の方法のなおさらなる実施形態において、固体は沈降又はろ過により可溶性生成物から分離され得る。

本発明の方法の他の実施形態において、インキュベーションは第一級アミン基を有する固相材料の存在下で行われ得る。

本発明の方法のさらに他の実施形態において、第一級アミンを有する固相は、ばらばらになった粒子の形、又はクロマトグラフィー装置の形態であり得る。

本発明の方法のさらに他の実施形態において、固相粒子は、水性媒体中の細胞培養収穫物の体積に対して、１％～１０％、２．５％～７．５％、又は４．５％～５．０％の範囲内の体積率で存在してもよい。

本発明の方法のさらなる実施形態において、第一級アミンを有する固相は、多孔性粒子が充填されたカラム、ナノ繊維が充填されたカラム、モノリシック材料が充填されたカラム、ヒドロゲル、多孔質膜フィルタ、及びデプスフィルタからなる群から選択された形態であり得る。

本発明の方法のなおさらなる実施形態において、固相の第一級アミンの表面に、他の特性の化学残基、例えば、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、疎水性残基、水素結合残基、金属親和性残基、又はこれらの組み合わせが付いてもよい。

本発明の方法の他の実施形態において、前記方法は、１又は複数の塩、糖、界面活性剤、二価金属イオン、アラントイン、ポリエチレングリコール、凝集剤、又はこれらの組み合わせの存在下で行われ得る。

本発明の方法の他の実施形態において、前記方法は、所望の生物由来物質を含む溶液のイオン強度を低減すること、溶液を陽イオン交換体と接触させ、陽イオン交換体が汚染物質と結合することにより汚染物質をさらに除去すること、所望の生物由来物質を含む溶液のイオン強度をさらに低減すること、及び溶液を陽イオン交換体と接触させ、陽イオン交換体が前記所望の生物由来物質と結合することにより所望の生物由来物質を精製すること、をさらに含む。

発明の対象はまた、発明の方法を行うためのキットの使用であり、前記キットは容器内の濃縮された媒体中の固相粒子及び前記方法を行うための説明書を含み、好ましくは、前記固相粒子は第一級アミン基を有する。

「ＮａＣｌに相当するイオン強度」は、細胞培養収穫物を含む水性媒体と同じ温度での純水中のＮａＣｌ溶液の導電率を比較することにより定義される。好ましい実施形態において、水性緩衝液は３．０～飽和状態のＮａＣｌを含む。

「クロマチン」は、宿主細胞の染色体のまとまりの残部である。その主な内容物はＤＮＡ及びタンパク質、特にヒストンからなるヌクレオソームである。

図１は、ｐＨ３．５でのクロマチンの低減へのＮａＣｌ濃度の影響を示す。 図２は、第一級アミンを有する粒子を含有することによる性能の改善を示す。 図３は、第一級アミンを有する固相粒子の存在下でのｐＨの影響を示す。 図４は、５ＭＮａＣｌでのＡＡＶ回収に対するｐＨの効果を示す。 図５は、陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。 図６は、ＤＮＡ抽出及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＡＡＶの陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。 図７は、ＤＮＡ抽出後の選択的排除クロマトグラフィーを示す。 図８は、５．０ＭのＮａＣｌの存在下、ｐＨ３．５で第一級アミンを有する粒子を用いた抽出後のＡＡＶ２／８の分析用陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。 図９は、クエン酸による軟凝集と、高塩濃度下、第一級アミンを有する粒子での固相抽出との比較を示す。 図１０は、ｐＨ反応の微調整を示す。 図１１は、陽イオン交換クロマトグラフィーでの固相抽出の間の塩濃度の影響を示す。 図１２は、様々な割合での第一級アミンを有する粒子の効果を示す。 図１３は、異なる塩の種類の効果を示す。

方法の１つの特徴は、３Ｍ～飽和状態などの特徴的かつ極めて高い塩濃度を用いることである。飽和濃度は塩種によって異なる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は約５Ｍの濃度で飽和する。極端な塩濃度はヒストンタンパク質からの宿主ＤＮＡの解離を促進することを意図しており、それにより宿主ＤＮＡが可溶となる。宿主由来のＤＮＡの一部がＡＡＶカプシド表面に結合し得る限り、極度の条件はカプシドからのＤＮＡの特定の部分母集団の解離及び可溶化を共同促進することを意図している。既存の会合から宿主ＤＮＡの意図的な解離及び可溶化の手法は、宿主ＤＮＡを除去する課題への直感に反しているため、注目に値する。軟凝集の分野において、例えば、可溶性汚染物質は可溶性生成物に残るため、汚染物質を沈殿させることにより利益が得られる。

発明の方法の他の特徴は、非常に高められた塩濃度と併せて、ｐＨ３．０～ｐＨ４．０の範囲内のｐＨ値を同時に用いることである。これらの条件は、ヒストン、転写因子、及び潜在的にはＡＡＶカプシドを含む他の種との既存の会合からの宿主ＤＮＡの解離にさらに有利に働くと考えられている。生物由来物質からの宿主ＤＮＡの低減のための高塩濃度と低ｐＨの組み合わせは、当技術分野では知られていない。しかしながら、さらなる工程へ進み、最も効果的な範囲を完全に予想不可能なものとする、高塩濃度でのｐＨへのＡＡＶ反応の予想外の特徴がある。ｐＨと方法の性能との間の関係は、ｐＨと共に低下する回収を有する線形の進行に従うと推測することは妥当であろう。その代わりに、実験データによると、５．０ＭのＮａＣｌの存在下で、ＡＡＶカプシドの回収はｐＨが低下すると共に改善し、ｐＨ３．５で最大となり、その後ｐＨ２．５で急落するということが分かり、ｐＨ３．０～４．０の狭い範囲内に、最高の性能の予想外の域を示す。実施例３及び４のデータ参照。

この狭い域に高められた塩濃度を適用する手法は、ＡＡＶ調製物からクロマチンを抽出する他の周知の方法よりも、それ自体でより効果的である。任意の拡張は、その有用性をさらに強化する。

高い塩濃度での狭いｐＨ域に加え、第一級アミンの表面化学を有する固相抽出材料の組み込みにより、方法を任意に規定してもよい。基本的な方法の高い塩濃度及び低いｐＨ条件で、第一級アミンの表面は、固相に予想外に高いＤＮＡに対する親和性を付与する。アミンベースの固相表面は、通常、正電荷を帯びているため、陰イオン交換体に分類される。陰イオン交換体は、０．１Ｍ未満の塩濃度かつｐＨ８．０～ｐＨ８．５などのわずかにアルカリ性のｐＨ値で、最も良いＤＮＡ結合特性を与えることが当技術分野では広く理解されている。このｐＨの範囲内であっても、約０．４～０．６ＭのＮａＣｌを超える塩濃度で、陰イオン交換体はＤＮＡと結合不可能であることが広く認識されている。非常に驚いたことに、３Ｍ～飽和状態などの高い塩濃度とｐＨ３．０～ｐＨ４．０などの強酸性のｐＨ条件との組み合わせにさらされると、方法を行うために使用した第一級アミンの固相がＤＮＡと結合できることを我々は発見した。

第一級アミンの固相の含有の有無にかかわらず、方法の最終工程は、方法により生産された固体からの試料の分離であり、その間もまだ３Ｍ～飽和状態の塩及びｐＨ３．０～４．０の条件下である。

ｐＨ、塩濃度、及び第一級アミンの固相の有無に加えて、特に、宿主ＤＮＡの汚染を可能な限り低いレベルに低減する強い願望があれば、試料をＤＮＡ分解酵素で任意に処理してもよい。そのような酵素、酵素を用いる基本的な方法、及び酵素の性能を最適化する方法は、ＡＡＶ精製の分野を含む当技術分野では広く知られている。ＤＮＡ分解酵素による処理は、本方法の前又は後、あるいは多段階精製順序のどの段階で存在してもよく、例えばタンジェンシャルフローろ過工程後、又はクロマトグラフィー工程後でもよい。

反応混合物は、１％～１０％に及ぶ濃度でスクロースなどの糖を任意に含んでもよい。あるいは、反応混合物は、２％～２０％の濃度の範囲にわたってソルビトールなどの糖を含んでもよく、あるいは、類似の濃度の範囲にわたってマンニトール又はキシリトールなどの糖を含んでもよい。あるいは、反応混合物は、他の糖又は糖の組み合わせを含んでもよい。糖を含有することは、ＡＡＶカプシドの安定性に有利に働くと考えられており、生成物のより高い回収に有利に働くかもしれない。実験データは、糖がＤＮＡ抽出の度合いを著しく変化させないことを示している。そのようないかなる場合でも、処理されている元の試料に含まれているかもしれない、あるいは本処理と共に加えられるかもしれないため、糖は存在してもよい。

反応混合物は、０．０１％～１．００％に及ぶ濃度で界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を任意に含んでもよい。あるいは、反応混合物は、類似の濃度の範囲にわたって界面活性剤Ｔｗｅｅｎ、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ、その他の非イオン性又は両性イオン性界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせを含んでもよい。界面活性剤を含有することは、容器及び／又は管壁に付着ことによりウイルスが失われる原因となり得る非特異的相互作用の抑制に役立つと考えられており、ウイルスのより高い回収に有利に働くかもしれない。実験データは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８が、おそらくこの機構を通じて、適度にかつ間接的にＤＮＡを抽出する方法の能力に貢献することを示唆している。そのようないかなる場合でも、処理されている元の試料に含まれているかもしれない、あるいは本方法と共に加えられるかもしれないため、界面活性剤は存在してもよい。

反応混合物は、マグネシウムイオンなどの二価金属陽イオンを任意に含んでもよい。あるいは、反応混合物は、カルシウムイオンを含んでもよい。あるいは、反応混合物は、マグネシウムイオンとカルシウムイオンとの組み合わせを含んでもよい。あるいは、反応混合物は、他の金属イオン又はイオンの組み合わせを含んでもよい。金属イオンを含有することは、ＡＡＶカプシドの安定性を改善すると考えられており、生成物の回収を改善するかもしれない。実験データは、金属イオンの添加が、間接的かつ適度に宿主ＤＮＡを除去する抽出方法の能力に貢献することを示唆している。いかなる場合でも、処理されている元の試料に含まれているかもしれない、あるいは本処理と共に加えられるかもしれないため、金属イオンは存在してもよい。

反応混合物は、１％～１０％又は２％～５％に及ぶ濃度で、あるいはより広いかより狭い、より高いかより低い範囲内の濃度でアラントインを任意に含んでもよい。実験データは、アラントインが直接的にＤＮＡの抽出には貢献しないが、ろ過又はクロマトグラフィー法を妨げ得る濁りを形成するナノ粒子の含有量を低減することにより、方法の全体的性能を間接的に強化するかもしれないことを示している。アラントインは、他の固体が試料から除去される前又は後に添加してもよい。

反応混合物は、０．５％～５．０％の濃度でポリエチレングリコールなどの非イオン性有機ポリマーを任意に含んでもよい。

反応混合物は、様々な特性の一般的な凝集剤を任意に含んでもよい。そのような凝集剤の一分類として、０．１％～１．０％の濃度の６～１０個の炭素原子を有する脂肪酸がある。あるいは及び／又は加えて、反応混合物は、０．０１％～０．１％に及ぶ量で、キトサン、エタクリジン、メチレンブルー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ｐＤＡＤＭＡＣ）、クロルヘキシジン、又は塩化ベンザルコニウムなどのアニオン性凝集剤を含んでもよい。いかなる場合でも、処理されている元の試料に含まれているかもしれない、あるいは本処理と共に加えられるかもしれないため、そのような凝集剤は存在してもよい。

好ましい実施形態において、発明の方法に続いてさらなる精製工程がある。

処理後に残る高濃度の塩が試料の条件を後続の精製方法に適したものにする処理を必要とすることは明らかである。試料のｐＨは塩濃度の低減と共に変化し得る。ある状況下では、これらの変化をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により達成することは目的にかなっているかもしれない。ある状況下では、これらの変化を緩衝液交換クロマトグラフィーにより達成することは目的にかなっているかもしれない。ある状況下では、これらの変化を透析により達成することは目的にかなっているかもしれない。ある状況下では、これらの変化を希釈により達成することは目的にかなっているかもしれない。これらの選択肢をどのように選択しどのように行うかは、数十年もの間、当技術分野ではよく知られていることである。

場合によっては、単一の工程よりもむしろ２つの工程で試料の条件を変化させる方が有益であろう。限定はされないが１つの実例において、処理された試料を約１．０ＭのＮａＣｌの濃度に希釈する。この場合の希釈液は、約３．５のｐＨの５０ｍＭのギ酸などの緩衝液であってもよい。その後、クロマトグラフィー粒子などの、スルホ（ＳＯ_３）基を呈するために化学修飾された固相、又は同じ条件に事前に平衡化したクロマトグラフィー装置又はろ過装置に試料を接触させる。そのような条件下では、ＡＡＶウイルスは保持されないが、ＳＯ_３基に対するより高い親和性を有する汚染物質は保持され、この手段により試料から排除され得る。そのような汚染物質は、特に、ヒストンタンパク質及び操作しているｐＨで正電荷を帯びている他の汚染物質を含む。これらの汚染物質が試料から排除されると、ＳＯ_３陽イオン交換材料を含むがこれに限定されないクロマトグラフィー材料によりウイルスを保持できるように、試料を大幅に希釈してもよい。塩濃度の最初の低減を達成するための最も容易な方法は、記載したような単純な希釈によるものであることは明らかであるが、個人の好みに応じて、透析、ＴＦＦ、又は緩衝液交換クロマトグラフィーにより任意に達成してもよい。

実験データは、宿主由来のＤＮＡを除去することに加え、方法が、汚染している宿主由来のＲＮＡ及び宿主由来のタンパク質の大部分も除去することを示唆している。実際的な面では、これが、後続の精製工程の性能のさらなる改善という利益をもたらしている。ＤＮＡとＲＮＡが多くの化学的類似性を有するため、ＤＮＡを除去する方法によりＲＮＡが除去されるはずであるということは化学的観点から理にかなっているが、方法がどのようにタンパク質の汚染を低減するのかは説明しない。１つの仮説は、反応条件下でＤＮＡから解放されたヒストンタンパク質が沈殿し、その後、その極端な疎水性により、他のタンパク種の二次的な付着のための核生成中心の役割を果たすということである。

第一級アミンの固相へのＤＮＡの強い結合が、元の宿主細胞由来の細胞小器官又は膜の破片と共に、エンドトキシンを含む他の高度にリン酸化された汚染物質、脂質エンベロープウイルス、並びにエクソソーム、微小胞、及びアポトーシス小体などの細胞外小胞、又はウイルス若しくは小胞の破片の強い結合を同様に支持するであろうという意味を含むことは、当業者にとって明らかである。高い塩濃度及び低いｐＨは、個々にウイルス及び細胞外小胞に悪影響を及ぼすことが知られているため、これらの条件とウイルス及び小胞に結合する固相の能力との組み合わせにより、両方の汚染物質分類の排除が強化されることが期待される。

方法の最も効果的なバリアントは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は他のハロゲン化物塩などの中性塩を用いており、それらは全て１．０Ｍ～飽和状態の濃度で用いてもよい。より高い濃度の塩は、一般的に、ヒストンからのＤＮＡのより効果的な解離及び可溶化を促進するであろう。予備実験データは、ＮａＣｌが最も効果的であることを示している。宿主ＤＮＡがＡＡＶカプシドタンパク質の外表面に結合しているかもしれない限り、最も高い塩濃度がカプシド壁外側からの最も効果的な解離も促進するはずである。一般的なこととして、ＡＡＶ粒子が可溶のままの状態で、塩濃度は最も高くあるべきである。リン酸塩、クエン酸塩、及び硫酸塩などの多価陽イオンの塩は良い結果をもたらすことができるが、１Ｍを超える濃度でＡＡＶの沈殿を生じさせる。それらはまた、ＤＮＡを固相へ引きつける力を弱くする。

方法は、ｐＨ２．５～ｐＨ６．５、２．７５～６．０、３．０～５．０、３．５～４．５、３．３～３．７、３．４～３．６、ｐＨ３．５、ｐＨ３．５±０．１、３．５±０．２、３．５±０．３、３．５±０．４、３．５±０．５、又は３．５±１．０の範囲内の酸性ｐＨ値で行うことができる。低いｐＨ値はＡＡＶ粒子の損傷の潜在的な危険性を生み出すが、その分野における公表された研究は、ｐＨ２．５に至るまでの値が少なくとも数時間許容されることを示唆している。実験データは、３．０未満又は４．０を超えるｐＨ値で方法を行うことにより、方法の有効性は低減するが、試料調製における周知の代替手段よりもさらに良い結果をもたらすことを明確に示している。

優れたプロセス制御のための緩衝能の重要性は、当技術分野では広く知られている。特定のｐＨ範囲に対する適切な緩衝液を特定するために、多くのリソースが知られており、それらの利用は当業者によりよく知られている。方法を制限せずにいくつか例を挙げると、４．７１のｐＫ_ａを有する酢酸は、４．２５～５．２５の範囲にわたるｐＨ制御に適した緩衝液であり、ｐＨ４．５で優れた緩衝能を有する。３．７７のｐＫ_ａを有するギ酸は、３．２５～４．２５の範囲にわたるｐＨ制御に適した緩衝液であり、ｐＨ３．５～３．７５で優れた緩衝能を有する。２．９６のｐＫ_ａを有するグリシンは、２．５～３．５の範囲にわたるｐＨ制御に適した緩衝液であり、ｐＨ３．０で優れた緩衝能を有する。２．３４のｐＫ_ａを有するアラニンは、１．８～２．８の範囲にわたるｐＨ制御に適した緩衝液であり、ｐＨ２．０～ｐＨ２．５で優れた緩衝能を有する。ｐＨ３．５±０．５に滴定されたグリシン（ｐＫ_ａ ２．９６）とギ酸（ｐＫ_ａ ３．７７）との組み合わせは、この範囲内で優れた緩衝能とｐＨ制御を提供する特に適した組み合わせである。

緩衝液の濃度は、反応混合物のｐＨが選択した目標のｐＨにできるだけ近いことを保証するのに充分であるべきである。試料の含有量及び緩衝特性に応じて、緩衝液の濃度は１０ｍＭ～５００ｍＭ、２０ｍＭ～２００ｍＭ、又は５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲内であってもよい。適切な緩衝液濃度を選択することは、生物由来物質を精製する技術においてよく知られた定形化された簡単な事柄である。便利な開始濃度は約１００ｍＭである。なぜなら、この濃度は、方法により処理される多くの試料の生来の緩衝特性を押さえ込むからである。目標のｐＨが達成される限り、より高い又はより低い緩衝液の濃度は、方法により得られた結果に影響しないであろう。

目標の高塩濃度及び低ｐＨ条件を達成した後のインキュベーションの時間は、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、それよりも長い、短い、又は中間の時間でもよい。実験結果は、６０分のインキュベーション時間が１２０分のインキュベーションと非常に類似した結果を達成することを示す。より長いインキュベーション時間は、ＤＮＡのヒストンからのより完全な解離及び／又はＤＮＡの固相へのより完全な結合を促進するかもしれない。より短い間隔はより便利であるかもしれない。ＡＡＶ生産培地間での周知の広範囲のばらつきを考えると、いかなる試料にとっても最善の結果を支持するインキュベーション時間を特定するためにインキュベーション時間の範囲を考えることは技術の規範内である。

一実施形態において、細胞がＡＡＶ粒子を細胞外の細胞培養培地に分泌する細胞培養収穫物に対して方法を行う。他の実施形態において、ＡＡＶ含有の細胞がＡＡＶ粒子を周囲の培地へ放出するように処理された細胞溶解物に対して方法を行う。他の実施形態において、過剰のＤＮＡを含む部分的に精製された調製物に対して方法を行う。

また、非ＡＡＶのパルボウイルスを含む収穫物又は溶解物に対して方法を行ってもよい。あるいは、モノクローナル抗体又は他の関心のあるタンパク質を含む抗体などの、細胞培養中で成長した非ウイルス性生成物に対して方法を行ってもよい。

いくつかの実施形態において、インキュベーションは固相、特に第一級アミンを有する固相を含む。

１つの操作フォーマットにおいて、第一級アミンを有する固相は、高い塩濃度と低いｐＨで、ＡＡＶの細胞培養収穫物又は細胞溶解物を有する混合物に存在する粒子の形である。他の操作フォーマットにおいて、第一級アミンを有する固相は、高い塩濃度と低いｐＨで、ＡＡＶの細胞培養収穫物又は細胞溶解物を通過させる装置の形である。他の操作フォーマットにおいて、第一級アミンを有する固相は、高い塩濃度と低いｐＨで、ＡＡＶの細胞培養収穫物又は細胞溶解物を有する混合物に存在する粒子の形であり、固相の除去後、上清はクロマトグラフィー装置の形の第一級アミンを有する固相を通過する。

操作フォーマットのそれぞれが相対的な強み又は弱みと見なされ得る特徴を示すことは明らかである。粒子のみのフォーマットは、後続のクロマトグラフィー又は他の精製工程を行う前に追加の工程を必要としないため、最も高い利便性を与える。固相の装置は粒子よりも高い表面接触効率を与え、それが、より短い接触時間及びより低いレベルへのＤＮＡ除去へ変換するはずである。２つのフォーマットの組み合わせは、いずれか１つの単独よりも効果的であるかもしれない。

方法を行うため、第一級アミンの表面化学を有するいずれの固相粒子を用いてもよい。固相粒子は無孔性であってもよく、大きさが１μｍまでの分子の拡散的及び／又は対流的侵入を許可する孔及び／又はチャネルを含んでもよい。実験データは、粒子の大きさ又は多孔性のいずれも処理の有効性に実質的には貢献しないことを示している。重要な特徴は、第一級アミンの化学を示す固相表面を反応溶液に提供することである。結果的に、粒子の大きさは、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～４００ｎｍ、４０ｎｍ～３００ｎｍ、８０ｎｍ～２００ｎｍ、若しくは１００ｎｍ～１５０ｎｍ、又は５ｎｍ～５００ｎｍの範囲内の他のいくつかの間隔に及んでもよい。孔及び／又はチャネルの平均の大きさは、１ｎｍ～１００００ｎｍ、１０ｎｍ～７５００ｎｍ、１００ｎｍ～５０００ｎｍ、若しくは１０００ｎｍ～２０００ｎｍ未満、又は１ｎｍ～１００００ｎｍ未満の他のいくつかの間隔に及んでもよい。

試料体積の約１％、試料体積の約２％、試料体積の約３％、試料体積の約４％、試料体積の約５％、若しくは試料体積の約１０％の体積率で、又はより大きいか異なる割合で固相粒子を加えてもよい。様々なＡＡＶ調製物中のＤＮＡの量が大幅に異なり得ることは、当業者に理解されるであろう。方法の全体が特にＤＮＡの除去に向けられているため、最も効果的にＤＮＡを除去する固相粒子の割合を判断するために、簡単な定形化された実験が必要であるかもしれない。５％などの過剰量の使用では、通常そのような実験を行う必要性を保留するが、より少ない量の有効性を明らかにするかもしれないため、プロセスの経済学的考察がそのような実験を望ましいものにするかもしれない。

方法を行うために使用される固相抽出装置は、あらゆるフォーマット又は形態の、多孔性粒子が充填されたカラム、ナノ繊維が充填されたカラム、モノリシック材料が充填されたカラム、ヒドロゲル、膜フィルタ、及びデプスフィルタで構成されてもよい。

あらゆる物理的フォーマットにおける固相の表面は、その表面に共有結合した少なくとも１つの第一級アミンを有するように化学修飾される。それは、単一の第一級アミンのみ、第一級アミンのポリマー、第一級アミンと第二級アミン、第三級アミン、若しくは第四級アミンとの組み合わせ、又はアミンのあらゆる組み合わせで構成された配位子を含んでもよい。固相は、疎水性部分、水素結合部分、金属結合部分、及び負電荷の部分を含むがこれらに限定されない他の化学部分を付加的に有してもよい。第一級アミンを欠く固相はまた、第一級アミンを有する固相粒子と共に存在してもよい。

優れたプロセス制御として、固相は、ばらばらになった粒子の形であろうとクロマトグラフィー装置の形であろうと、試料と接触させる前に反応条件に平衡化すべきである。

固体の除去はあらゆる簡便な手段により達成してもよい。多くのそのような方法及びそれらを選択する基準は、当技術分野では広く知られている。ＡＡＶの調製物中のＤＮＡの量を低減するという明確な目的を達成するために、方法の能力を変えることなくそのような手段のいずれかを用いてもよい。

一実施形態において、方法により生じた固体は重力沈降により除去してもよい。

他の実施形態において、固体の沈降を遠心により早めてもよい。

他の実施形態において、固体の沈降を音波により早めてもよい。

他の実施形態において、シリンダーを通じて混合物を上方向にポンプでくみ上げる間に固体の沈降を達成してもよく、ウイルスを含み、固体が欠乏したキャリア液が上行し、シリンダーから排出される一方で、より高密度の沈殿物が重力により沈殿することを可能にする。そのような一実施形態において、シリンダーから排出された後、その液体をろ過装置に通してもよい。

固体が沈降により除去されない他の実施形態において、固体はろ過により除去してもよい。

他の実施形態において、処理後に固体を除去するのに用いられるろ過法は、膜ろ過法又はデプスろ過法であってもよい。

他の実施形態において、多孔質膜が試料を収容する開口端と閉じられた他の端部を有するシリンダーとして構成された、いわゆるバグフィルタ又はソックフィルタの使用により固体の除去を促進してもよく、それにより液体が孔を通じて押し出される。

方法を行う際の基本的な工程を示すため、非限定例を挙げる。第一級アミンを有する粒子を１００ｍＭのギ酸、４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５で前もって平衡化する。規定体積の細胞溶解物又は細胞培養収穫物を適切な容器に入れる。塩化ナトリウムなどの乾燥塩を終濃度が４Ｍとなるのに充分な量加え、ギ酸を用いた滴定によりｐＨを３．５に調整する。固相粒子は、試料の条件が調整される時にすでに存在していてもよく、条件が調整される後に加えられてもよい。どちらの場合にも、粒子は元の試料体積の約５％の体積率で存在する。組み合わせたものを周囲温度で６０分間混合してインキュベーションしてもよい。その後、遠心又はろ過を含むがこれらに限定されないいずれかの簡便な手段により、固相抽出粒子を含む固体を除去する。強調すると、固体が使用液中にまだ内在している間は、固体を除去しなければならない。

方法を行う際の基本的な工程を示すため、他の非限定サンプルを挙げる。第一級アミンを有する粒子を１００ｍＭのギ酸、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５で前もって平衡化する。規定体積の細胞溶解物又は細胞培養収穫物を適切な容器に入れる。試料で希釈した時に５Ｍの濃度とするのに充分な塩化ナトリウム、試料で希釈した時に１００ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５とするのに充分なギ酸、ｐＨ３．５、及び試料で希釈した時に５％の体積率とするのに充分な第一級アミンを有する粒子を含む、同じ体積の２倍に濃縮した試薬混合物で他の容器を満たす。試料を濃縮した試薬に加え、周囲温度で６０分間混合してインキュベーションしてもよい。その後、遠心又はろ過を含むがこれらに限定されないいずれかの簡便な方法により、試料を高塩濃度及び低ｐＨにさらすことにより生産された固体を除去する。

方法を行うための材料及び説明書は、キットの形で提供されてもよい。一実施形態において、キットは、エンドユーザが試料を加えインキュベーションするであろうプレフィルド容器内の濃縮緩衝液中の固相粒子を提供する。インキュベーションされた試料は、０．２２μｍの膜を用いた提供された遠心スピンカートリッジで処理され、ＡＡＶ含有液体から固体を除去するであろう。キットの１つのバージョンは、各１０ｍＬの１０回の精製を行うのに充分な材料を含み得る。代替のバージョンは、より小さい又はより大きい試料体積及び／又はより少ない又はより多い精製を行うのに充分な材料で処理するよう構成されてもよい。キットの拡張バージョンは、精製を行うための１又は複数のクロマトグラフィー装置を含んでもよい。さらなる拡張バージョンは、細胞溶解緩衝液を含む調製済みのチューブを含んでもよい。

代替の実施形態において、キットは、エンドユーザが試料を加え適切な時間インキュベーションするであろうプレフィルド容器内に微粒子の固相がない緩衝液濃縮物を含み得る。インキュベーションされた試料は、０．２２μｍの膜を用いた提供された遠心スピンカートリッジで処理され、ＡＡＶ含有液体から固体を除去するであろう。その後、方法によりＤＮＡを抽出するための固相を含む、提供された再利用可能なクロマトグラフィー装置に液体を通過させるであろう。キットの１つのバージョンは、各１０ｍＬの１０回の精製を行うのに充分な材料を含み得る。代替のバージョンは、より小さい又はより大きい試料体積及び／又はより少ない又はより多い精製を行うのに充分な材料で処理するよう構成されてもよい。キットの拡張バージョンは、精製を行うための１又は複数のクロマトグラフィー装置を含んでもよい。さらなる拡張バージョンは、細胞溶解緩衝液を含む調製済みのチューブを含んでもよい。

クロマトグラフィーを必要としないさらなる代替の実施形態において、キットは、エンドユーザが試料を加え適切な時間インキュベーションするであろうプレフィルド容器内に固相を有する緩衝液濃縮物を含み得る。インキュベーションされた試料は、０．２２μｍの膜を用いた提供された遠心スピンカートリッジで任意に処理され、ＡＡＶ含有液体から固体を除去するであろう。その後、試料は、高分子量の汚染物質を保持できる一方でウイルスが膜を通過することができる３０００００ＭＷＣＯ（分画分子量）の膜を用いた、提供された遠心カートリッジに処理されるであろう。その後、試料は、ウイルスを保持できる一方で低分子量の汚染物質が膜を通過することができる１０００００ＭＷＣＯの膜を用いた、提供された遠心カートリッジに処理されるであろう。この工程はまた、ウイルスを濃縮し、最終処方への緩衝液交換を可能にするであろう。

発明を以下の非限定例によりさらに示す。

実施例１
ｐＨ３．５でのクロマチンの低減へのＮａＣｌ濃度の影響。図１は、０Ｍ～５Ｍに及ぶ異なる塩濃度のｐＨ３．５での実験の結果を示す。分析方法は、タンパク質中のトリプトファン残基の内在蛍光を検出するために蛍光モニタリングを用いたサイズ排除クロマトグラフィーである。この方法は、感度を増幅し、試料中のＡＡＶカプシドの検出を可能にする。２００ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５及び目標の濃度とするのに必要な二倍量の塩を用いて１：１の容量で希釈することでｐＨの滴定を行うことにより試料を調整した。実験結果は、ＮａＣｌ濃度が増加するにつれクロマチンの低減が向上することを示した。ＡＡＶは範囲全体を通して可溶のままであった。１Ｍ及び２Ｍの塩濃度はクロマチンの汚染をおそらく４０％低減したが、非クロマチンタンパク質による汚染の低減にはほとんど効果がなかった。３Ｍではクロマチンの低減にわずかに効果があったが、非クロマチンタンパク質の低減において著しい改善を示した。４ＭのＮａＣｌは、ＡＡＶは可溶のままで、少なくとも９０％のクロマチンの低減及び非クロマチンタンパク質のより大きな低減を示した。５ＭのＮａＣｌの効果は、汚染物質の低減にとってはわずかに良くなったが、ＡＡＶの回収をわずかに低減したかもしれない。

実施例２
第一級アミンを有する粒子を含有することによる優れた性能。全体としてのより良い結果に貢献する第一級アミンを有する粒子の能力が評価された。１つの試料を５．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのギ酸、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ３．５で平衡化した。他の試料を５％の第一級アミンを有する粒子を含むことを除き同じ条件で平衡化した。両方の試料を室温で１時間インキュベーションし、その後、固体を膜ろ過により除去した。図２で結果を未処理の対照群と比較する。粒子を欠いた条件では、クロマチン含有量は約４０％低減し、非クロマチンタンパク質は図から評価できないほどのかなりの量が低減した。粒子を含有することにより、クロマチンは９５％を超えて低減し、非クロマチンタンパク質もはるかに大きな程度まで低減した。ＡＡＶの回収は粒子の有無にかかわらずほぼ同じであった。

実施例３
第一級アミンを有する固相粒子の存在下でのｐＨに応じたクロマチン除去の改善。図３は、ＡＡＶは可溶のままである一方で、クロマチン及び他の汚染物質の除去における第一級アミン粒子の含有及びｐＨの影響を示す。全ての実験を５ＭのＮａＣｌで、５％の第一級アミンを有する粒子、１００ｍＭのギ酸、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（界面活性剤）の存在下で行った。実施例１と組み合わせて、これらの結果は、高い塩濃度が主変数であることを強調しているが、ｐＨが全体的な有効性に大きな貢献をすることを示している。最も良いウイルス回収はｐＨ３．５で観察され、ｐＨ２．５での最も低いクロマチン及び非クロマチンタンパク質含有量も支持している。しかしながら、ｐＨ２．５は最も低いＡＡＶ回収をもたらす。ｐＨ４．５での回収はｐＨ３．５とほぼ同じくらい良いが、クロマチンの低減は適度に劣り、非クロマチンタンパク質の汚染はｐＨ３．５よりも２～３倍高い。ｐＨ５．５及び６．５での結果は全ての点で劣る。ｐＨ３．５でのより高いＡＡＶ回収は、方法を行うためにこのｐＨを特に推奨している。緩衝液としてギ酸とグリシンを比較する別の実験では、ギ酸での結果が明らかに優れていた。他の実験において、５ｍＭのＭｇＣｌ_２が、高いウイルス回収を維持する一方で、汚染物質の低減に小さいながらも明らかに前向きな貢献をすることが観察された。他の一連の実験では、１時間及び２時間のインキュベーション時間を比較した。１時間は２時間と同じ結果をもたらした。

実施例４
ＤＮＡ抽出後の陽イオン交換クロマトグラフィー
ＡＡＶ含有昆虫細胞溶解物を１００ｍＭのギ酸、５．０ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び５％の第一級アミンを有する粒子、ｐＨ３．５で平衡化した。その混合物を１時間室温でインキュベーションし、固体を膜ろ過により除去した。導電率が４０ｍＳ／ｃｍに到達するまで５０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５を加えることによりその上清を希釈した。陽イオン交換モノリス（ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＳＯ３、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を同じ条件で平衡化し、試料を装着した。図４に示すように、９０％を超える純粋なＡＡＶを含む濃縮されたピークが得られた。図４はｐＨに応じたＡＡＶ回収を描画しており、２つの主な予想外の発見を強調する。ウイルスが通常存在する生理環境に最も近いｐＨで回収が最も高くなるであろうと予想された。実際に最も低いｐＨ２．５が、全てのｐＨ値で最も低い回収をもたらした。１つ目の予想外の発見は、生理的に最も近い値であるｐＨ６．５で２番目に低い回収が観察され、ｐＨ６．５からｐＨ３．５にかけて回収が増加したことである。２つ目の予想外の発見は、最大のウイルス回収がｐＨ３．５で観察されたことである。これらの発見は、高い塩濃度、この場合は５ＭのＮａＣｌでシステムの予測不可能な性質を強調する。銀で染色したＰＡＧＥゲルを示す挿入画像と共に、クロマトグラムを図５に示す。

実施例５
ＤＮＡ抽出後の陽イオン交換クロマトグラフィーとその後の陰イオン交換クロマトグラフィー
完全な精製プロセスという観点からＤＮＡ抽出を示すために、実施例４においてＤＮＡ抽出及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより処理された試料を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＭｍａｃ ＡＡＶ、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によりさらに処理した。手短に言うと、画分Ｅ２及びＥ３（図５参照）をプールし、ｐＨを９．０に調整し、試料を約２．５ｍＳ／ｃｍの導電率まで希釈した。カラムを５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ９．０で平衡化し、試料をカラムに装着した。カラムをカラム体積の５倍の平衡化緩衝液で洗浄し、その後、最終的に５０ｍＭのビストリスプロパン、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０となるように、カラム体積の２０倍で直線勾配により溶出させた。溶出プロファイルを図６に示す。特徴的な２つのピークのＡＡＶプロファイルを示し、１つ目のピークは空のカプシドに対応し、２つ目のピークはベクターＤＮＡで満たされたカプシドに対応している。カプシドタンパク質は紫外線を透過するため、内部のＤＮＡは、完全なカプシドによる２６０ｎｍの吸光度の超過に貢献する。内部のＤＮＡを欠く空のカプシドは、タンパク質に特有の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度をもたらす。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度比はＡＡＶ純度の指標と考えられ、１．３０以下の値が不純物の混ざった調製物であることを示す。なお、この場合、完全なカプシドにおける比は約１．３５であり、高い純度を示す。これは、陽イオン交換クロマトグラフィー工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程の両方の精製の性能を強化するＤＮＡ抽出工程の効果に起因する。

実施例６
ＤＮＡ抽出後の選択的排除クロマトグラフィー
ＡＡＶ含有昆虫細胞溶解物を１００ｍＭのギ酸、５．０ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び５％の第一級アミンを有する粒子、ｐＨ３．５で平衡化した。その混合物を１時間室温でインキュベーションし、固体を膜ろ過により除去した。その上清を３．０Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．０で１：１に希釈し、１．５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．０で事前に平衡化したＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＯＨモノリス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）に適用した。試料の装着後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、未結合の汚染物質をカラムから移す。ＡＡＶは最終的に５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液となる下向きの直線塩勾配により溶出した。図７は、カラム画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析（銀染色）の結果を示す。元の処理された試料は、一番右端の最後のウェル中にある。左側の隣のウェルはＤＮＡ抽出後の試料を示す。一番左端は分子量マーカーであり、その次が、希釈されカラムに装着する準備ができたＤＮＡ抽出された試料である。他のウェルは、クロマトグラフィーが動作している間に収集された画分の含有量を示す。溶出ピークの含有量は、ゲルの中央でＯＨ ０１ Ｅ５のラベルで示される。なお、ＡＡＶのバンドは非常に強く染色されるが、汚染物質の染色は際だって弱く、高い純度を示している。

実施例７
ＤＮＡ抽出後のディファレンシャル膜ろ過
ＡＡＶ含有昆虫細胞溶解物を１００ｍＭのギ酸、５．０ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び５％の第一級アミンを有する粒子、ｐＨ３．５で平衡化した。その混合物を室温で１時間インキュベーションし、固体を膜ろ過により除去した。試料を６．５±０．５のｐＨに滴定し、その後、実施例４の試料に見られるように、残った高分子量のクロマチンを保持するために、３０００００ｋＤａの分画分子量を有する遠心式膜ろ過装置に適用した。ウイルスはろ過膜を通過し、その後、低分子量の汚染物質が膜を通過することを許容する一方でウイルスを保持するために、１０００００ｋＤａの分画分子量を有する遠心式膜ろ過装置に適用した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのアルギニン、１％のソルビトール、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．０を加えることにより初期の試料体積に戻され、再度遠心された。これにより新たな緩衝液中に約２０倍に濃縮された試料が残された。この生成物は分析用陰イオン交換クロマトグラフィーにより評価された。結果を図８に示す。参考までに、図６と比較すること。

実施例８
クエン酸による軟凝集と、高塩濃度下、第一級アミンを有する粒子での固相抽出との比較
Ｐｏｔｔｅｒ及びＢｙｒｎｅ［６］により記載されたクエン酸軟凝集法により、ＳＦ９細胞からのろ過されたＡＡＶ含有収穫物を処理し、本発明の相対的性能を強調した。終濃度が２０ｍＭとなるようにクエン酸を加え、緩衝をもたらすために加えられたクエン酸塩を頼りに、調製物のｐＨをｐＨ３．５になるよう滴定した。並行して、ろ過された収穫物の他の分割分にギ酸（１００ｍＭ）、塩化マグネシウム（９５ｍＭ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％）、及び第一級アミンを有する粒子（５％ｖ：ｖ）を加え、その後、３．５のｐＨに滴定した。ろ過により固体を除去する前に、両方の処理物を６０分間インキュベーションした。クエン酸軟凝集処理では、目に見える固体はほとんど観察されなかった。図９で結果を比較する。図のように、クエン酸軟凝集後の汚染物質プロファイルは処理前より悪くなっており、高塩濃度と第一級アミンを有する粒子での処理よりも劇的に劣っていた。

実施例９
ｐＨ反応の微調整
実施例１及び３は、第一級アミンを有する粒子の非存在下で最適なｐＨが約３．５±０．５であったことを明らかにした。第一級アミンを有する粒子の存在下でｐＨの最適条件の推定を微調整するため追加の一連の実験を行った。ろ過されたＡＡＶ含有収穫物を５．０Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び５％ｖ：ｖの第一級アミンを有する粒子で処理した。試料をそれぞれｐＨ３．３、３．４、３．５、３．６、及び３．７に滴定した。それらを６０分間インキュベーションし、固体をろ過により除去し、試料を内在蛍光によるモニタリングを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図１０に示すように、ＡＡＶ粒子の明らかな損失なしで最も効果的な汚染物質の低減をもたらすｐＨはｐＨ３．３であり、ｐＨ値が高いほど汚染が増加した。

実施例１０
極端な塩濃度の利用の代替の実演
実施例１は、第一級アミンを有する粒子の非存在下で塩化ナトリウム濃度が増加するにつれ汚染物質の割合の増加が除かれ、４ＭのＮａＣｌでは１Ｍより汚染が低くなり、５Ｍでは４Ｍより汚染が著しく低くなったことを示した。第一級アミンを有する粒子の存在下でもＮａＣｌの効果が残ることを明らかにするため、それを代替の分析フォーマットにより明らかにするため、一連の実験を行った。新しい一連の実験では、処理された試料を陽イオン交換体で分画することにより固相抽出の間の塩濃度の影響を判断した。５０ｍＭのギ酸、５ｍＭの塩化マグネシウム、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、５％の第一級アミンを有する粒子、及び１Ｍ、４Ｍ、及び５Ｍの濃度の塩化ナトリウムの存在下、ｐＨ３．５で試料を調製した。結果を図１１に示す。１ＭのＮａＣｌでの固相抽出に相当するプロファイルは、主なＡＡＶのピークにつながる重度の汚染を示す。４ＭのＮａＣｌを用いた固相抽出後に汚染物質レベルが強く低減され、５ＭのＮａＣｌでの固相抽出後に最も低いレベルが得られる。これらの結果によれば、極端な塩濃度は、第一級アミンを有する粒子の非存在下（実施例１）よりも存在下の方がさらにいっそう有益である。

実施例１１
第一級アミンを有する粒子に比例した反応
第一級アミンを有する最も好ましい割合を判断するため、一連の実験を行った。ろ過されたＡＡＶ２／８含有の細胞培養収穫物を５０ｍＭのギ酸、５．０Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び２％、３％、４％、及び５％の体積率の第一級アミンを有する粒子、ｐＨ３．５で処理した。その混合物を６０分間インキュベーションし、その後、固体を膜ろ過により除去した。試料を内在蛍光によりモニタしたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図１２に示すように、粒子の割合の増加により、５％で著しい改善を有する明らかにより良い汚染物質の低減がもたらされた。

実施例１２
異なる塩の種類の効果
実施例１は、ＡＡＶを保存する一方で汚染物質を除去することに関して、塩化ナトリウムのレベルの上昇が方法の有用性を向上させたことを示した。追加の塩の種類を調査し、それらの相対的有用性を評価した。他の実験で用いたＳＦ９細胞からの同じろ過されたＡＡＶ２／８の収穫物を用いて全ての実験を行った。５ｍＭの塩化マグネシウム、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び５％の第一級アミンを有する粒子の存在下、５０ｍＭのギ酸、ｐＨ３．５を用いて全ての実験を行った。１つの実験では、終濃度が１．０Ｍとなるように塩化リチウムを加えた。他の実験では、終濃度が１．０Ｍとなるように塩化アンモニウムを加えた。他の実験では、終濃度が１．０Ｍとなるようにグルタミン酸ナトリウムを加えた。他の実験では、終濃度が１．０Ｍとなるように酢酸ナトリウムを加え、他の実験では、終濃度が１．５Ｍとなるように酢酸カリウムを加えた。全てを５．０Ｍの塩化ナトリウムの実験対照群と比較した。図１３に示すように、そして図１３と図１を比較すると、酢酸ナトリウム及び酢酸カリウムは、類似の濃度の塩化ナトリウムと類似するがより良い結果をもたらした。クロマチン及び非クロマチンタンパク質の低減は、両者とも極めて優れており、これらの塩のより高い濃度が塩化ナトリウム以上の有用性を示すかもしれないことを示唆している。しかしながら、ＡＡＶの見かけの回収はより低いように見えた。塩化リチウム及び塩化アンモニウムは、塩化ナトリウムよりも極めて優れたＡＡＶの回収と非クロマチンタンパク質のより良い低減を示すが、クロマチンタンパク質の劣った低減を示すと見えた。グルタミン酸ナトリウムも、同じ濃度の塩化ナトリウムよりもタンパク質の汚染のより良い低減をもたらしたが、この濃度範囲において全ての他の塩よりも明らかに劣っていた。塩化ナトリウム以外の塩のさらなる調査の示唆を超えて、これらの結果は２つ以上の塩の組み合わせの潜在的な有用性を示唆している。

Claims (14)

1. パルボウイルス及びアデノ随伴ウイルスからなる群から選択された所望の生物由来物質を含む細胞培養収穫物を提供すること、
   ３．０Ｍ～飽和状態の範囲内の濃度のＮａＣｌに相当するイオン強度を有する３．０～４．０の範囲内のｐＨ値の水性媒体中で前記細胞培養収穫物をインキュベーションすること、及び
   生産された固体から前記所望の生物由来物質を分離すること、を含む、細胞培養収穫物からクロマチンを除去する方法。
2. 前記収穫物が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、又は細菌細胞の培養から得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記水性媒体が３．０Ｍ～飽和状態までの範囲内の濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記ｐＨが３．５±０．３である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. インキュベーションの時間は２４時間まで、好ましくは３０分～２４０分、４５分～９０分、又は５５分～６５分の範囲内である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 固体は沈降又はろ過により可溶性生成物から分離される、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. インキュベーションは第一級アミン基を有する固相材料の存在下で行われる、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記第一級アミンを有する固相は、ばらばらになった粒子の形態、又はクロマトグラフィー装置の形態である、請求項７に記載の方法。
9. 固相粒子が、前記水性媒体中の前記細胞培養収穫物の体積に対して、１％～１０％、２．５％～７．５％、又は４．５％～５．０％の範囲内の体積率で存在する、請求項７又は請求項８に記載の方法。
10. 前記第一級アミンを有する固相は、多孔性粒子が充填されたカラム、ナノ繊維が充填されたカラム、モノリシック材料が充填されたカラム、ヒドロゲル、多孔質膜フィルタ、及びデプスフィルタからなる群から選択された形態である、請求項７又は請求項８に記載の方法。
11. 固相の第一級アミンの表面に、代替の特性の化学残基、例えば、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、疎水性残基、水素結合残基、金属親和性残基、又はこれらの組み合わせが附随する、請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記方法は、１又は複数の塩、糖、界面活性剤、二価金属イオン、アラントイン、ポリエチレングリコール、凝集剤、又はこれらの組み合わせの存在下で行われる、請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記所望の生物由来物質を含む溶液のイオン強度を低減すること、
    前記溶液を汚染物質と結合する陽イオン交換体と接触させ、前記汚染物質をさらに除去すること、
    前記所望の生物由来物質を含む前記溶液の前記イオン強度をさらに低減すること、
    前記溶液を、前記所望の生物学的製剤生物由来物質と結合する陽イオン交換体と接触させ、前記所望の生物由来物質を精製すること、をさらに含む、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 容器内の濃縮された媒体中の固相粒子、及び前記方法を行うための説明書を含み、好ましくは、前記固相粒子は第一級アミン基を有するキットの、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の方法を行うための使用。
    

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