CN114341152A - 用于降低生物制品的染色质含量的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

一种从细胞培养收获物中去除染色质的方法，包括以下步骤：—提供含有选自细小病毒或腺相关病毒的所需生物制品的细胞培养收获物，—在pH值在3.0至4.0范围内、离子强度对应于浓度在3.0M至饱和范围内的NaCl的水性培养基中孵育细胞培养收获物，和—将所需的生物制品与产生的固体分离。

Description

用于降低生物制品的染色质含量的组合物和方法
发明背景
最终药物配方中的DNA含量是所有生物药物的主要的安全性和监管问题。这包括例如在基因治疗领域中用作治疗性DNA质粒的递送载体的腺相关病毒(AAV)。安全问题不是AAV衣壳内的治疗性DNA，而是用于生产AAV的宿主细胞留下的DNA。去除这种宿主来源的DNA已被认为是该领域发展的障碍，因为已经证明它比预期的更难去除。存在这种困难可能部分源于宿主来源的DNA与衣壳的外表面结合的可能性。
AAV衣壳内的治疗性DNA有效载荷通常称为载体DNA。由于插入不完整或后来对最初填充的衣壳的损坏，这种DNA中的一些也可能在衣壳外。这种DNA并不被认为是主要的安全问题，但它是一个问题，因为它有可能增加通过各种DNA测试测量出的DNA填充衣壳的表观数量。一些样品制备方法可限制衣壳外载体DNA的影响，但如果它完全不存在则更好。
用核酸酶处理AAV收获物以裂解宿主来源的DNA是AAV纯化步骤的一个共同特征。这种方法的限制是宿主DNA通过与组蛋白的强结合而免受酶裂解。大量宿主DNA未被消化，它们仍保留在AAV制剂中。一些纯化步骤还使用阴离子交换色谱法来增加宿主DNA的整体减少。其基本原理是DNA应该比AAV更强烈地与阴离子交换剂结合，从而可以在DNA保留在阴离子交换剂上的同时洗脱AAV。这种处理确实减少了宿主DNA含量，但并没有完全消除它，它的失败与限制酶处理的有效性的同一问题有关：收获物中的宿主细胞DNA存在于与组蛋白的紧密结合中。除了在物理上保护DNA免受酶促裂解外，强结合的组蛋白还会产生具有中等电荷特征的混合聚集体，因此DNA的一个子集仍会与病毒共同洗脱[1]。
或者，通过降低收获物的pH值，可以从细胞培养收获物中沉淀出仍与组蛋白结合的宿主DNA的一个子集。1994年描述了这种方法，其通过使用生理盐浓度的柠檬酸盐缓冲液将pH滴定到pH 2.6至pH 5.0的范围内[2]。这项工作在哺乳动物细胞培养收获物上进行，但该技术已应用于细菌、酵母、真菌和昆虫细胞[3-5]。它最近已被应用于在相同pH值和盐浓度范围的哺乳动物细胞培养收获物，用于絮凝包括宿主DNA在内的AAV污染物[6]。
也描述了使用阳离子杂环化合物和可溶性阳离子聚合物得到澄清和减少宿主细胞DNA污染[7-10]。还已知阴离子脂肪酸和杂环阴离子可降低DNA水平[11-16]。这些方法的一个共同特征是它们使用的盐浓度小于0.5M(500mM)，例如在大约15-300mM盐的范围内，最常见的是在50-100mM盐的范围内。尿囊素已单独使用，以及与许多这些试剂和条件联合使用[1,15,16]。众所周知，它对内毒素具有高亲和力[17]。
已知DNA的pKa约为2.6。已知细胞培养收获物中的宿主DNA首先与各种大小的核小体阵列中的组蛋白结合。组蛋白具有极强的疏水性，其等电点在约9至11的范围内。宿主DNA在1M NaCl中与组蛋白部分解离，并且当NaCl浓度升高到4M时解离增加，但即使在该浓度下也没有完全解离。在NaCl浓度大于1M时组蛋白开始形成不溶性聚集体。解离的DNA在高盐条件下可溶，但如果盐浓度降低，则与组蛋白重新结合。
已知涂覆有伯胺配体的表面比具有季胺配体的表面更牢固地结合生物分子。这包括病毒颗粒、DNA、内毒素和酸性蛋白质。相比在类似表面上的季胺，它们通常在稍高的盐浓度下结合这些分子。DNA也可以在稍高的盐浓度但仍低于1M氯化钠时从伯胺配体上洗脱。季胺表面和伯胺表面的实验最常在中性至弱碱性pH(pH 7.0至8.5)下进行。已知在中性pH和50至150mM氯化钠盐浓度下，用疏水性季胺(消胆胺)颗粒处理哺乳动物细胞培养收获物会结合哺乳动物细胞培养收获物中的一些DNA[18]。随后去除颗粒会导致收获物中DNA含量相应减少。
[19]公开了一种纯化含有所需蛋白质的样品的方法，包括以下步骤：(i)提供具有带正电荷的多孔颗粒的填充色谱柱，(ii)平衡色谱柱至样品中所需蛋白质要洗脱的条件，(iii)使样品与填充色谱柱接触，其中施加到填充色谱柱的样品体积小于或等于填充色谱柱内带正电荷的多孔颗粒的颗粒间距，(iv)从填充色谱柱中洗脱所需蛋白质，其中所需蛋白质处于更纯的状态并且处于填充色谱柱平衡的条件下；其中所需蛋白质是抗体、抗体片段、抗体衍生物或抗体融合蛋白。本质上，[19]是关于去除病毒并产生所需蛋白质，而病毒是不需要的。该参考文献没有提及去除DNA的同时保留病毒。
[20]公开了通过使蛋白质制剂与带有伯胺、仲胺或两者都有的表面接触来增强蛋白质制剂中病毒和病毒DNA水平的降低的方法。然而，该参考文献没有提及从病毒中去除DNA并留下从病毒DNA中纯化的病毒。
本文引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中，其并入与本文的明确教导不矛盾。
参考文献
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[20]WO 2015/183180 A1.
发明内容
已经开发出一种用于减少哺乳动物细胞培养物中宿主DNA污染的方法，该方法与传统的DNA裂解酶处理标准正交并扩展了其能力。它也比柠檬酸絮凝的方法更有效。该方法主要针对含有AAV的细胞培养收获物、细胞裂解物或其他含有AAV的制剂，但也可用于减少来自于其他细小病毒和其他由细胞培养产生的生物制品中的DNA。
根据本发明，从细胞培养收获物中去除染色质的方法包括以下步骤：
—提供含有所需生物制品的细胞培养收获物，所述生物制品特别选自细小病毒或腺相关病毒，
—在pH值在3.0至4.0范围内、离子强度对应于浓度在3.0M至饱和范围内的NaCl的水性培养基中孵育细胞培养收获物，和
—将所需的生物制品与产生的固体分离。
在本发明方法的一个实施方式中，所需的生物制品可以是细小病毒或腺相关病毒。同样，本发明的方法也可用于从细胞培养物中去除染色质以产生重组蛋白、抗体、IgG和IgM，或抗体的抗原结合片段形式。
在本发明方法的另一个实施方式中，所述收获物可以从哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞的培养物中获得。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述水性培养基可包含浓度在约3.0M直至饱和范围内的氯化钠。
在本发明方法的又一个实施方式中，pH可为约3.5±0.3。
在本发明方法的又一个实施方式中，孵育期可以长达24小时，特别是在30分钟至240分钟、或45分钟至90分钟、或55分钟至65分钟的范围内。
在本发明方法的又一个实施方式中，固体可以通过沉降或过滤与可溶性产物分离。
在本发明方法的另一个实施方式中，可以在带有伯胺基团的固相材料存在下进行孵育。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述带伯胺的固相可以为松散颗粒的形式或为色谱装置的形式。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述固相颗粒可以以相对于在水性培养基中的细胞培养收获物体积的1％至10％、或2.5％至7.5％、或4.5％至5.0％范围内的体积比例存在。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述带有伯胺的固相的形式可以选自下组：填充有多孔颗粒的柱、填充有纳米纤维的柱、填充有整体材料的柱、水凝胶、多孔膜过滤器、和深度过滤器。
在本发明方法的又一个实施方式中，所述固相的伯胺表面可以伴随有替代特征的化学残基，例如仲胺、叔胺、季胺、疏水残基、氢键残基、金属亲和残基，或它们的组合。
在本发明方法的另一个实施方式中，所述方法可以在一种或多种的盐、糖、表面活性剂、二价金属离子、尿囊素、聚乙二醇、絮凝剂或它们的组合的存在下进行。
在本发明方法的另一个实施方式中，还包括以下步骤：
—降低包含所需生物制品的溶液的离子强度；
—使所述溶液与阳离子交换剂接触以去除更多污染物，其中所述阳离子交换剂与污染物结合；
—进一步降低包含所需生物制品的溶液的离子强度；
—使所述溶液与阳离子交换剂接触以纯化所需的生物制品，其中所述阳离子交换剂与所需的生物制品结合。
本发明的主题还在于用于实施本发明方法的试剂盒的用途，所述试剂盒包括在容器中的浓缩培养基中的固相颗粒和用于执行该方法的说明，优选其中所述固相颗粒带有伯胺基团。
“对应于NaCl的离子强度”是在与包含细胞培养收获物的水性培养基相同的温度下，通过比较在纯水中的NaCl溶液的电导率来定义。在一个优选的实施方式中，水性缓冲液包含3.0至饱和的NaCl。
“染色质”是宿主细胞染色体团的残余物。它的主要成分是核小体，由DNA和蛋白质组成，尤其是组蛋白。
附图说明
图1显示了在pH 3.5下NaCl浓度对染色质减少的影响。
图2显示了通过加入带伯胺颗粒的性能改进。
图3显示了在带伯胺的固相颗粒存在下pH值的影响。
图4显示了在5M NaCl时pH值对AAV回收率的影响。
图5显示了阳离子交换色谱的结果。
图6显示了通过DNA提取和阳离子交换色谱纯化的AAV的阴离子交换色谱。
图7显示了DNA提取之后进行优先排阻色谱。
图8显示了在5.0M NaCl存在下在pH 3.5时用带伯胺的颗粒提取后的AAV2/8的分析阴离子交换色谱。
图9显示了柠檬酸絮凝与高盐条件下带伯胺颗粒上的固相提取的比较。
图10显示了pH响应的细化。
图11显示了固相提取过程中盐浓度对阳离子交换色谱的影响。
图12显示了不同比例的带伯胺颗粒的影响。
图13显示了不同盐种类的影响。
发明详述
本方法的一个特点是它使用了独特且异常高的盐浓度，例如从3M到饱和。饱和浓度因盐的种类而各有不同。氯化钠(NaCl)在浓度为约5M时饱和。极端的盐浓度旨在促进宿主DNA与组蛋白解离，从而使宿主DNA变得可溶。就宿主来源的DNA的一个子集可能与AAV衣壳表面结合的程度而言，极端条件旨在共同促进特定DNA亚群从衣壳中的解离和溶解。从预先存在的结合体中专门解离和溶解宿主DNA的方法是值得注意的，因为它相对去除它的任务是反常的。例如，在絮凝领域，由于可溶性污染物保留在可溶性产物中，因此通过沉淀污染物来获得益处。
本发明方法的另一个特点是，伴随盐浓度的高度升高，它同时采用pH 3.0至pH4.0范围内的pH值。这些条件被认为进一步有利于宿主DNA从预先存在的与其他物种(包括组蛋白、转录因子)的结合体中解离，并可能从AAV衣壳中解离。将高盐浓度和低pH组合以从任何生物制品中减少宿主DNA在本领域中是未知的。然而，AAV在高盐条件下对pH的响应有一个意想不到的特征，它更进一步并使最有效的范围完全不可预测。可以合理推测pH值与方法的性能之间的关系会遵循线性进展，即回收率随pH值降低。相反，实验数据表明，在5.0M NaCl存在下，AAV衣壳回收率随着pH值的降低而提高，在pH 3.5时达到最大值，然后在pH 2.5时急剧下降，揭示了在pH 3.0到4.0的窄范围内的最佳性能的意外窗口。参见实施例3和4中的数据。
在这个狭窄的窗口内使用升高的盐浓度的方法本身比从AAV制剂中提取染色质的其他已知方法更有效。可选的扩展进一步增强了它的实用性。
除了在高盐浓度下的窄pH窗口之外，本方法可以任选地通过将固相提取材料与伯胺表面化学结合来定义。在基本方法的高盐和低pH条件下，伯胺表面使固相对DNA具有出乎意料的高亲和力。基于胺的固相表面通常被归类为阴离子交换剂，因为它们带正电荷。本领域广泛理解阴离子交换剂在盐浓度低于0.1M和弱碱性pH值(例如pH 8.0至pH 8.5)时提供最佳的DNA结合特征。即使在这个pH值范围内，也熟知阴离子交换剂也因为其在盐浓度大于约0.4至0.6M NaCl时无法结合DNA。非常令人惊讶的是，我们发现用于执行该方法的伯胺固相当暴露于高盐浓度(如3M至饱和)和强酸性pH条件(如pH 3.0至pH 4.0)的组合时能够结合DNA。
本方法的最后一步(包含或不包含伯胺固相)是将样品与本方法产生的固体分离，此时仍处于3M至饱和盐和pH 3.0至4.0的条件下。
除了pH、盐浓度和伯胺固相的存在与否之外，特别是在强烈希望将宿主DNA污染降低到可能的最低水平的情况下，样品可以任选地用DNA裂解酶处理。在本领域中，包括在AAV纯化领域中广为人知此类酶、使用它们的基本方法以及优化其性能的方法。用DNA裂解酶处理可以在本方法之前或之后进行，或在多步纯化序列的任何阶段进行，例如在切向流过滤步骤之后或色谱步骤之后。
反应混合物可任选地包含糖，例如浓度范围为1％至10％的蔗糖。或者它可以包含糖，例如浓度范围为2％至20％的山梨糖醇，或浓度范围相似的甘露糖醇或木糖醇。或者它可以含有其他糖或糖的组合。包含糖被认为有利于AAV衣壳的稳定性并且可以有利于制品的更高回收率。实验数据表明糖不会显著改变DNA提取的程度。在任何这种情况下，糖因为它在正在被处理的原始样品中，或因为它与本处理一起添加而可能存在。
反应混合物可任选地包含浓度范围为0.01％至1.00％的表面活性剂PluronicF68。或者它可以包含类似浓度范围内的表面活性剂吐温，或表面活性剂曲拉通(Triton)，或任何其他非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂或表面活性剂的组合。包含表面活性剂被认为有助于抑制可能导致病毒通过粘附到容器和/或管壁上而损失的非特异性相互作用并且可以有利于病毒的更高回收率。实验数据表明，Pluronic F68可能通过这种机制适度和间接地有利于该方法提取DNA的能力。在任何这样的情况下，表面活性剂因为它在正在被处理的原始样品中，或因为它与本方法一起添加而可能存在。
反应混合物可以任选地包含二价金属阳离子，例如镁离子。或者它可以含有钙离子。或者它可以含有镁和钙离子的组合。或者它可以含有其他金属离子或离子组合。包含金属离子被认为提高了AAV衣壳的稳定性并且可以提高制品的回收率。实验数据表明，金属离子的添加间接和适度地有助于提取该方法去除宿主DNA的能力。在任何情况下，金属离子因为它们在正在被处理的原始样品中，或因为它们与本处理一起添加而可能存在。
反应混合物可以任选地包含浓度范围为1％至10％、或2％至5％、或在更宽或更窄、更高或更低范围内的尿囊素。实验数据表明，尿囊素不直接有助于DNA的提取，但可以通过减少会妨碍过滤或色谱方法的形成浑浊的纳米颗粒的含量来间接提高该方法的整体性能。可以在其他固体从样品中去除之前或之后添加尿囊素。
反应混合物可以任选地包含非离子有机聚合物，例如聚乙二醇，浓度为0.5％至5.0％。
反应混合物可以任选地包含各种特性的常用絮凝剂。一类这样的絮凝剂包括浓度为0.1％至1.0％的含有6至10个碳原子的脂肪酸。反应混合物可以可替代地和/或额外地含有含量范围为0.01％至0.1％的阴离子絮凝剂，例如壳聚糖、依吖啶、或亚甲基蓝、或聚乙烯亚胺(PEI)、或聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC)、或氯己定或苯扎氯铵。在任何情况下，此类絮凝剂因为它们在正在被处理的原始样品中，或因为它们与本处理一起添加而可能存在。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法之后进行进一步的纯化步骤。
很明显，处理后残留的高浓度盐需要处理以使样品条件适合后续纯化方法。样品的pH值可以随着盐浓度的降低而改变。在某些情况下，通过切向流过滤(TFF)实现这些变化可能是有利的。在某些情况下，通过缓冲液交换色谱法实现这些变化可能是有利的。在某些情况下，通过透析实现这些变化可能是有利的。在某些情况下，通过稀释来实现这些变化可能是有利的。几十年来，本领域已经众所周知这些选择、如何选择它们，以及如何执行它们。
在某些情况下，分两步而不是一步改变样品条件会有用。在一个说明性但非限制性的例子中，将处理过的样品稀释至约1.0M NaCl的浓度。在这种情况下，稀释剂可以是缓冲液，例如pH为约3.5的50mM甲酸。然后样品与已化学改性以表现磺基(SO3)的固相接触，其中固相例如色谱颗粒、或色谱装置、或已预平衡至相同条件的过滤装置。在这种条件下，AAV病毒不会被保留，但对SO3基团具有更高亲和力的污染物可能会保留，并通过这种方式从样品中消除。此类污染物特别包括组蛋白和在操作pH下带正电荷的其他污染物。已经从样品中消除了这些污染物，样品可以被更大程度地稀释以使病毒能够被色谱材料保留，其包括但不限于SO3阳离子交换材料。显然，实现盐浓度初始降低的最简单方法是如所述的简单稀释，但可以根据个人偏好任选地通过透析、TFF或缓冲液交换色谱来实现。
实验数据表明，除了去除宿主来源的DNA外，该方法还去除了大部分污染的宿主来源的RNA和宿主来源的蛋白质。在实际水平上，这提供了进一步提升后续纯化步骤的性能的好处。从化学的角度来看，通过去除DNA的方法去除RNA是合乎逻辑的，因为它们具有许多化学相似性，但这并不能解释该方法如何减少蛋白质污染。一种假设是，在反应条件下组蛋白从DNA沉淀中被释放出来，然后由于它们的极端疏水性，它们充当其他蛋白质物种二次增殖的成核中心。
对本领域技术人员来说显而易见的是DNA与伯胺固相的强结合意味着它将支持与其他高度磷酸化的污染物的类似强结合，所述其他高度磷酸化的污染物包括内毒素，脂质包膜病毒和细胞外囊泡如外泌体、微泡和凋亡小体；或病毒或泡状碎片，以及来自原始宿主细胞的细胞器或膜碎片。由于已知高盐浓度和低pH值分别对病毒和细胞外囊泡具有破坏性，因此这些条件与固相结合病毒和囊泡的能力相组合有望增强对这两类污染物的消除。
该方法最有效的变体采用中性盐，例如氯化钠、氯化钾或其他卤化物盐，所有这些盐都可以在1.0M到饱和的浓度下使用。更高浓度的盐通常会促进DNA与组蛋白更有效地解离和溶解。初步实验数据表明NaCl是最有效的。就宿主DNA可能与AAV衣壳蛋白外表面结合的程度而言，最高的盐浓度也应促进其最有效地从衣壳外壁解离。一般来说，盐浓度应该是AAV颗粒保持可溶的最高浓度。多价阴离子盐如磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐可以产生积极效果，但它们会在浓度大于1M时导致AAV沉淀。它们还会削弱DNA对固相的吸引力。
该方法可以在酸性pH值在pH 2.5至pH 6.5、2.75至6.0、3.0至5.0、或3.5至4.5、或3.3至3.7、或3.4至3.6、或pH 3.5、或pH 3.5±0.1，或3.5±0.2，或3.5±0.3，或3.5±0.4，或3.5±0.5，或3.5±1.0的范围内实施。低pH值会造成AAV颗粒受损的潜在风险，但该领域已发表的研究表明，低至2.5的pH值至少可以耐受几个小时。实验数据清楚地表明，在低于3.0或高于4.0的pH值下实施该方法会降低该方法的有效性，但仍比已知的样品制备替代方法的结果更好。
本领域众所周知缓冲容量对于良好过程控制的重要性。已知许多资源可用于确定特定pH范围的合适缓冲液，并且它们的使用为本领域技术人员所熟知。仅举几例但不限制方法，pKa为4.71的乙酸是一种适合将pH控制在4.25至5.25范围内的缓冲液，在pH 4.5时具有良好的缓冲能力。pKa为3.77的甲酸是一种适合将pH控制在3.25至4.25范围内的缓冲液，在pH 3.5至3.75范围内具有良好的缓冲能力。pKa为2.96的甘氨酸是一种适合将pH控制在2.5至3.5范围内的缓冲液，在pH 3.0时具有良好的缓冲能力。pKa为2.34的丙氨酸是一种适合将pH控制在1.8至2.8范围内的缓冲液，在pH 2.0至pH 2.5时具有良好的缓冲能力。滴定至pH 3.5±0.5的甘氨酸(pKa 2.96)与甲酸(pKa 3.77)的组合是一个提供良好缓冲能力和将pH控制在此范围内的特别合适的组合。
缓冲液的浓度应足以确保反应混合物的pH值尽可能接近选择的目标pH值。根据样品的含量和缓冲特性，缓冲液的浓度可以在10mM到500mM，或20mM到200mM，或50mM到100mM的范围内。选择合适的缓冲液浓度是整个生物制品纯化领域众所周知的常规且简单的事情。一个方便的起始浓度约为100mM，因为该浓度将超过大多数要通过该方法处理的样品的天然缓冲特性。只要达到目标pH值，更高或更低的缓冲液浓度都不会影响通过该方法获得的结果。
在达到目标高盐低pH条件之后，孵育期可以是15分钟、或30分钟、或60分钟、或90分钟、或120分钟、或更长、或更短，或中间时间段。实验结果表明，60分钟的孵育期与120分钟的孵育期得到的结果非常相似。更长的孵育期可能促进DNA与组蛋白更完全地解离和/或DNA更完全地与固相结合。更短的间隔可能更方便。鉴于已知AAV制品培养基之间的广泛可变性，因此考虑一系列孵育期以确定对任何给定样品支持其最佳结果的孵育时间是在本领域的规范范围内的。
在一个实施方式中，该方法在细胞培养收获物上进行，其中细胞将AAV颗粒分泌到细胞外细胞培养基中。在另一个实施方式中，该方法在细胞裂解物上进行，其中含AAV的细胞已经被处理以将AAV颗粒释放到周围培养基中。在另一个实施方式中，该方法在含有过量DNA的部分纯化的制剂上进行。
该方法也可以在含有非AAV细小病毒的收获物或裂解物上进行。或者它可以在细胞培养基中生长的非病毒产物上进行，例如抗体，包括单克隆抗体或其他感兴趣的蛋白质。
在一些实施方式中，孵育包括固相，尤其是具有伯胺的固相。
在一种操作形式中，带伯胺的固相为颗粒形式，其存在于高盐和低pH下的AAV细胞培养收获物或细胞裂解物的混合物。在另一种操作形式中，带伯胺的固相为装置形式，其中高盐和低pH下的AAV细胞培养收获物或细胞裂解物通过该装置。在另一种操作形式中，带伯胺的固相是存在于与高盐和低pH下的AAV细胞培养收获物或细胞裂解物的混合物中的颗粒的形式，并且在除去固相后，上清液通过色谱装置形式的带伯胺固相。
显而易见每种操作形式都具有可以被视为相对优势或劣势的特征。仅颗粒形式最方便，因为它在进行后续色谱或其他纯化步骤之前不需要额外的步骤。固相装置表面接触效率比颗粒高，其应该转化为更短的接触时间和更低水平的DNA去除。两种形式的组合可能比单独使用一种更有效。
任何具有伯胺表面化学性质的固相颗粒均可用于实施该方法。固相颗粒可以是无孔的，或者它们可能包含允许尺寸达1μm的分子扩散和/或对流进入的孔和/或通道。实验数据表明，颗粒的大小和孔隙率对处理的有效性都没有显著影响。关键特征是它们提供了一个将伯胺化学物质呈现给反应溶液的固相表面。因此颗粒尺寸可在5nm至500nm、或10nm至400nm、或40nm至300nm、或80nm至200nm、或100nm至150nm、或一些其他的在5nm至500nm范围内的中间值。平均孔和/或通道尺寸的范围可以在小于1nm到10,000nm，或10nm到7,500nm，或100nm到5000nm，或1000nm到2000nm，或任何其他的在小于1nm到10,000nm的中间值。
固相颗粒可以以样品体积的约1％、或样品体积的2％、或样品体积的3％，或样品体积的4％、或样品体积的5％、或样本体积的10％，或更大或不同比例的体积比例添加。本领域技术人员应理解，它们在不同AAV制剂中的DNA量可以有很大差异。由于整个方法专门针对DNA去除，因此可能需要简单的常规实验来确定最有效地去除DNA的固相颗粒的比例。使用过量的量，例如5％，通常可以暂停进行此类实验的需要，但工艺经济考虑可能使这种实验成为可取的，因为它们可能证明较少量的有效性。
用于执行该方法的固相提取装置可由任何形式或配置的填充有多孔颗粒的柱、填充有纳米纤维的柱、填充有整体材料的柱、水凝胶、膜过滤器和深度过滤器组成。
任何物理形式的固相的表面都经过化学改性以使其表面共价连接有至少一种伯胺。它可以包含仅由单一伯胺，或伯胺聚合物，或伯胺与仲胺、或叔胺、或季胺的组合，或胺的任何组合而构成的配体。固相还可以带有其他化学基团，包括但不限于疏水基团、氢键基团、金属结合基团和带负电基团。缺少伯胺的固相也可以与带有伯胺的固相颗粒一起存在。
作为良好的过程控制，固相，其无论是以松散颗粒形式还是色谱装置中，在与样品接触之前都应与反应条件平衡。
可以通过任何方便的方式去除固体。本领域中众所周知许多这样的方法和选择它们的标准。可以使用任何这样的方法而不改变该方法实现其减少AAV制剂中DNA量的明确目的的能力。
在一个实施方式中，该方法产生的固体可以通过重力沉降去除。
在另一个实施方式中，可以通过离心来加速固体的沉降。
在另一个实施方式中，可以通过声波来加速固体的沉降。
在另一个实施方式中，可以在将混合物以上升方向泵送通过圆筒时进行固体的沉降，其可以使得密度更大的沉淀物在重力作用下沉降，同时含有病毒的缺乏固体的载体液体向上流出圆筒。在一个这样的实施方式中，液体可以在其流出圆筒之后通过过滤装置。
在不通过沉降去除固体的另一个实施方式中，它们可以通过过滤去除。
在另一个实施方式中，用于在处理后去除固体的过滤方法可以是膜过滤方法或深度过滤方法。
在另一个实施方式中，可以使用所谓的袋式过滤器或滤袋帮助去除固体，其中多孔膜配置为圆柱体，其具有开口端以允许样品进入但另一端封闭，以使液体被迫通过孔。
本发明给出一个非限制性的示例以说明执行该方法的基本步骤。带伯胺颗粒预先平衡至100mM甲酸、4M NaCl、pH 3.5。将确定体积的细胞裂解物或细胞培养收获物置于合适的容器中。加入足量的干燥盐如氯化钠，使最终浓度达到4M，并通过用甲酸滴定将pH值调节至3.5。固相颗粒可以在调整样品条件时就已经存在，或者可以在条件调整后添加。在任何一种情况下，颗粒以大约原始样品体积的5％的体积比例存在。该组合在环境温度下孵育混合60分钟。然后通过任何方便的方法(包括但不限于离心或过滤)去除包括固相提取颗粒的固体。出于强调，固体必须在它们仍然留在工作溶液中时被去除。
本发明给出另一个非限制性示例以说明执行该方法的基本步骤。带伯胺颗粒预先平衡至100mM甲酸、5M NaCl、pH 3.5。将确定体积的细胞裂解物或细胞培养收获物置于合适的容器中。另一个容器中装有相同体积的两倍浓缩试剂混合物，其中含有氯化钠，其足以在用样品稀释时达到5M浓度；含有甲酸，pH3.5足以在用样品稀释时产生pH 3.5的100mM甲酸；并且含有带伯胺的颗粒，其足以在用样品稀释时达到5％的体积比例。将样品添加到浓缩试剂中，并在环境温度下孵育混合60分钟。然后通过任何方便的方法(包括但不限于离心或过滤)去除样品暴露于高盐和低pH值所产生的固体。
可以以试剂盒的形式提供用于执行该方法的材料和说明。在一个实施方式中，试剂盒提供了在预填充容器中的浓缩缓冲液中的固相颗粒，最终用户可以将样品添加到预填充容器中并孵育。孵育的样品使用提供的采用0.22μm膜的离心旋转筒进行处理，从而从含有AAV的液体中去除固体。试剂盒的一种版本包含足够的材料以进行10次纯化，每次纯化10mL。替代的版本可以配置为处理更小或更大的样品体积，和/或使用可以进行更少或更多纯化的材料。试剂盒的扩展版本可以包括一个或多个色谱装置以进行纯化。进一步的扩展版本可以包括准备好的含有细胞裂解缓冲液的试管。
在一个替代实施方式中，试剂盒包括在预填充容器中的缺少颗粒固相的缓冲浓缩物，最终用户将样品添加到预填充容器中并孵育适当的一段时间。孵育的样品使用提供的采用0.22μm膜的离心旋转筒进行处理，从而从含有AAV的液体中去除固体。然后将液体通过所提供的包含固相的可重复使用的色谱装置以根据本方法提取DNA。试剂盒的一种版本包含足够的材料以进行10次纯化，每次纯化10mL。替代的版本可以配置为处理更小或更大的样品体积，和/或使用可以执行更少或更多纯化的材料。试剂盒的扩展版本可以包括一个或多个色谱装置以进行纯化。进一步的扩展版本可以包括准备好的含有细胞裂解缓冲液的试管。
在另一个不需要色谱的替代实施方式中，试剂盒包括在预填充容器中的含有固相的缓冲浓缩物，最终用户将样品添加到预填充容器中并孵育适当的一段时间。孵育的样品可选地使用提供的采用0.22μm膜的离心旋转筒进行处理，从而从含有AAV的液体中去除固体。然后使用提供的采用300,000MWCO(截留分子量)膜的离心管处理样品，其保留高分子量污染物同时允许病毒通过膜。然后使用提供的采用100,000MWCO膜的离心管处理样品，其将病毒(保留)同时允许低分子量污染物通过膜。此步骤还浓缩病毒并使缓冲液能够交换成最终制剂。
本发明通过以下非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1
在pH 3.5下NaCl浓度对染色质减少的影响。图1显示了在pH 3.5条件下使用0M到5M不同浓度的盐的实验结果。分析方法是尺寸排阻色谱法，其带有荧光监测以检测蛋白质中色氨酸残基的固有荧光。该方法提高了灵敏度并能够检测样品中的AAV衣壳。通过用200mM的pH 3.5甲酸和需要产生目标浓度的两倍量盐进行1:1体积稀释滴定pH值来制备样品。实验结果表明，随着NaCl浓度的增加，染色质减少得越来越多。AAV在整个范围内保持可溶。盐浓度1M和2M时染色质污染减少了大约40％，但对减少非染色质蛋白的污染几乎没有影响。3M对减少染色质的效果稍显逊色，但在减少非染色质蛋白方面表现出显著改善。4MNaCl显示染色质减少了至少90％，非染色质蛋白减少甚至更多，使得AAV可溶。5M NaCl的污染物减少效果略好，但AAV的回收率可能略有降低。
实施例2
通过包含带伯胺的颗粒表现出卓越的性能。评估了带伯胺颗粒有助于获得更好的整体结果的能力。将一个样品平衡至5.0M NaCl、50mM甲酸、5mM MgCl2和0.1％PluronicF68，pH3.5。另一个平衡到相同的条件，除了包括5％带伯胺颗粒。两个样品在室温下孵育1小时，然后通过膜过滤去除固体。图2中将结果与未处理对照进行了比较。缺少颗粒的条件使染色质含量降低了约40％，并且非染色质蛋白质减少了从图中无法估计的非常可观的量。包含这些颗粒使染色质减少了95％以上，并且在更大程度上减少了非染色质蛋白质。有或没有颗粒时，AAV的回收率大致相同。
实施例3
在带伯胺固相颗粒存在下，染色质清除率随pH值变化的改善。图3显示了包含伯胺颗粒和pH值对去除染色质和其他污染物同时保持AAV可溶的影响。所有实验均在5M NaCl、5％带伯胺颗粒、100mM甲酸、5mM MgCl2和0.1％Pluronic F68(表面活性剂)存在下进行。结合实施例1，这些结果强调了高盐浓度是主要变量，但表明pH值对整体效果有很大贡献。在pH 3.5时病毒回收率最好，这也支持了pH 2.5时染色质和非染色质蛋白质含量最低。然而，pH 2.5的AAV回收率最低。pH 4.5时的回收率几乎与pH 3.5一样好，但染色质减少稍差，非染色质蛋白污染是pH 3.5时的2-3倍。pH 5.5和6.5的结果在所有方面都较差。在pH 3.5时较高的AAV回收率建议使用此pH，特别是对于使用该方法。在比较甲酸和甘氨酸作为缓冲液的单独实验中，使用甲酸的结果明显更胜一筹。在其他实验中，观察到5mM MgCl2在保持高病毒回收率的同时对减少污染物做出了微小但清晰的积极贡献。在另一系列实验中，比较了1小时和2小时的孵育期。1h的结果与2h的结果相同。
实施例4
DNA提取之后进行阳离子交换色谱
将含有AAV的昆虫细胞裂解物平衡至100mM甲酸、5.0M NaCl、5mM MgCl2、0.1％Pluronic F68、5％带伯胺颗粒、pH 3.5。混合物在室温下孵育1小时并通过膜过滤除去固体。添加50mM甲酸(pH 3.5)稀释上清液直至电导率达到40mS/cm。将阳离子交换整体柱(CIMmultus SO3,BIA Separations(比亚分离))平衡至相同条件并上样。如图4所示，得到一个含有大于90％纯AAV的浓缩峰。图4绘制了AAV回收率与pH值的关系，并突出了两个主要的意外发现。之前预计在最接近病毒正常生存的生理环境的pH值下回收率最高。事实上，最低的pH值，2.5，是所有pH值的最低回收率。第一个意外发现是，在pH 6.5(最接近生理值)下观察到第二低的回收率，并且从pH 6.5到pH 3.5回收率逐渐增加。第二个意外发现是在pH3.5时观察到病毒回收率最高。这些发现突出了系统在高盐浓度下的不可预测性，在本实施例中为5M NaCl。色谱图如图5所示，插图显示了银染色的PAGE凝胶。
实施例5
DNA提取之后进行阳离子交换色谱，然后是阴离子交换色谱
实施例4中经过DNA提取和阳离子交换色谱处理的样品进一步通过阴离子交换色谱(CIMmac AAV，BIA Separations(比亚分离))处理，以说明在完整纯化过程中的DNA提取。简而言之，合并馏分E2和E3(参见图5)，pH值调节至9.0，样品稀释至电导率约为2.5mS/cm。将柱平衡至50mM双三丙烷，pH 9.0，然后上样至色谱柱。用5CV平衡缓冲液洗涤柱子，然后20CV线性梯度洗脱，以50mM双三丙烷、200mM NaCl、pH 9.0结束。洗脱曲线如图6所示。它显示了特征性的双峰AAV曲线，其中第一个峰对应于空衣壳，第二个峰对应于载体DNA填充的衣壳。衣壳蛋白透过紫外线，因此内部DNA会导致满衣壳的吸光度超过260。缺乏内部DNA的空衣壳得到蛋白质更典型的260/280吸光度。260nm和280nm处的吸光度比被认为是AAV纯度的指标，值为1.30或更低时表示制备不纯。请注意，在这种情况下，满衣壳中的比率约为1.35，表明纯度高。这归因于DNA提取步骤的效果提高了阳离子交换和阴离子交换色谱步骤的纯化性能。
实施例6
DNA提取之后进行优先排阻色谱
将含有AAV的昆虫细胞裂解物平衡至100mM甲酸、5.0M NaCl、5mM MgCl2、0.1％Pluronic F68、5％带伯胺颗粒、pH 3.5。混合物在室温下孵育1小时并通过膜过滤除去固体。用3.0M pH 7.0的磷酸钾以1:1稀释上清液。并应用于CIMmultus OH整体柱(BIASeparations(比亚分离))，其之前已平衡至1.5M磷酸钾，pH 7.0。上样后，用平衡缓冲液洗涤柱子以置换柱子上未结合的污染物。AAV用以50mM磷酸钾缓冲液结束的递减线性盐梯度洗脱。图7说明了柱级分的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析(银染)的结果。原始处理过的样品位于最右侧的最后一个孔中。左边的下一个孔显示DNA提取后的样本。最左边是分子量标记，然后是DNA提取样品稀释并准备装载到色谱柱上。其他孔显示了色谱运行期间收集的级分的含量。洗脱峰的内容显示在凝胶的中间，标签为OH01E5。请注意，AAV条带染色非常强，但污染物染色非常弱，表明纯度很高。
实施例7
DNA提取后差速膜过滤
将含有AAV的昆虫细胞裂解物平衡至100mM甲酸、5.0M NaCl、5mM MgCl2、0.1％Pluronic F68、5％带伯胺颗粒、pH 3.5。混合物在室温孵育1小时并通过膜过滤除去固体。样品滴定至pH 6.5±0.5，然后应用于具有300,000kDa截留分子量的离心膜过滤装置以保留残留的高分子量染色质，如实施例4的样品中所见。病毒通过过滤膜，并将它们应用于具有100,000kDa截留分子量的离心膜过滤装置以保留病毒，同时允许低分子量污染物通过膜。通过添加50mM Hepes、50mM NaCl、50mM精氨酸、1％山梨糖醇、2mM氯化镁、pH 7.0以恢复初始样品体积并重新离心。这使得样品浓缩了大约20倍并在新的缓冲液中。通过分析阴离子交换色谱法评价产物。结果如图8所示。以图6做参考进行比较。
实施例8
高盐条件下用带伯胺颗粒固相提取和柠檬酸絮凝的比较
用Potter和Byrne[6]描述的柠檬酸絮凝方法处理从SF9细胞过滤的含有AAV的收获物以突出本发明的相对性能。添加柠檬酸至终浓度为20mM，并将制剂的pH滴定至pH 3.5，其依靠添加的柠檬酸盐提供缓冲。同时，将甲酸(100mM)、氯化镁(95mM)、Pluronic F68(0.1％)和带伯胺颗粒(5％v:v)添加到另一等分的过滤后的收获物中，然后滴定至pH 3.5。两种处理均孵育60分钟，然后过滤除去固体。柠檬酸絮凝处理几乎没有观察到可见的固体。结果在图9中进行比较。如图所示，柠檬酸絮凝后的污染物曲线比处理前更差，并且显著低于用高盐和带伯胺颗粒处理。
实施例9
细化pH响应
实施例1和3表明，在不存在带伯胺颗粒的情况下，最适pH约为3.5±0.5。进行了一系列额外的实验以细化在带伯胺颗粒存在下对最佳pH值的估计。用5.0M氯化钠、5mM氯化镁、1％Pluronic F68、5％v:v带伯胺颗粒处理过滤过的含有AAV的收获物。将样品分别滴定至pH 3.3、3.4、3.5、3.6和3.7。将它们孵育60分钟，过滤除去固体，并通过尺寸排阻色谱监测固有荧光来分析样品。如图10所示，在没有明显损失AAV颗粒的情况下提供最有效的污染物减少的pH值为3.3，在更高的pH值下污染会增加。
实施例10
极端盐浓度效用的替代验证
实施例1表明，在没有带伯胺颗粒的情况下，随着氯化钠浓度的增加，去除的污染物比例增加，其中4M NaCl提供的污染低于1M，而5M提供的污染明显低于4M。进行了一系列实验以证明NaCl的作用在有带伯胺颗粒时仍然存在，并通过另一种分析形式得到证明。在新的一系列实验中，固相提取过程中盐浓度的影响通过在阳离子交换器上分离处理的样品来确定。在50mM甲酸、5mM氯化镁、1％Pluronic F68、5％带伯胺颗粒和浓度为1M、4M和5M的氯化钠存在下，在pH 3.5下制备样品。结果如图11所示。对应于在1M NaCl下固相提取的曲线显示导致主要AAV峰的重度污染。用4M NaCl固相提取后污染物水平显著降低，在5M NaCl固相提取后达到最低水平。根据这些结果，极端盐浓度在带伯胺颗粒存在时甚至比在它们不存在时(实施例1)更有利。
实施例11
对带伯胺颗粒比例的响应
进行了一系列实验以确定最有利的伯胺负载比例。在pH 3.5下，用50mM甲酸、5.0M氯化钠、5mM氯化镁、1％Pluronic F68和体积比例为2％、3％、4％和5％的带伯胺颗粒处理过滤过的含有AAV2/8的细胞培养收获物。混合物孵育60分钟，然后通过膜过滤除去固体。通过由固有荧光监测的尺寸排阻色谱分析样品。如图12所示，增加颗粒比例可以可测量地改善污染物的减少，在5％时明显改善。
实施例12
不同盐种类的影响
实施例1表明，增加氯化钠水平提高了该方法在去除污染物同时保留AAV方面的效用。调查了其他种类的盐以评估它们的相对效用。所有实验均使用相同的过滤过的AAV2/8收获物进行，其来自于其他实验使用的SF9细胞。所有实验均在5mM氯化镁、1％PluronicF68和5％带伯胺颗粒存在下，使用pH 3.5，50mM甲酸进行。在一个实验中添加氯化锂至终浓度为1.0M。在另一个实验中添加氯化铵终浓度为1.0M。在另一个实验中添加谷氨酸钠至终浓度为1.0M。在另一个实验中添加乙酸钠至终浓度为1.0M，在另一个实验中添加乙酸钾至1.5M。全部都与使用5.0M氯化钠的实验对照进行比较。如图13所示，并将图13与图1进行比较，乙酸钠和乙酸钾的结果相似但优于相似浓度的氯化钠。染色质和非染色质蛋白的减少在这两种情况下都很突出，这表明更高浓度的这些盐可能提供等于或大于氯化钠的效用。然而，AAV的明显回收率似乎较低。与氯化钠相比，氯化锂和氯化铵似乎提供了出色的AAV回收率且更好地减少非染色质蛋白，但染色质蛋白的减少效果较差。谷氨酸钠在相同浓度下也比氯化钠更好地减少蛋白质污染，但在该浓度范围内明显不如所有其他盐。除了建议进一步探索除氯化钠之外的盐之外，这些结果还表明使用两种或多种盐的组合的潜在效用。

Claims (14)

1.一种从细胞培养收获物中去除染色质的方法，包括以下步骤：
—提供含有选自细小病毒或腺相关病毒的所需生物制品的细胞培养收获物，
—在pH值在3.0至4.0范围内、离子强度对应于浓度在3.0M至饱和范围内的NaCl的水性培养基中孵育所述细胞培养收获物，和
将所需的生物制品与产生的固体分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收获物从哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞的培养物中获得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述水性培养基包含浓度在3.0M至饱和范围内的氯化钠。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，pH为3.5±0.3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，孵育期长达24小时，优选在30分钟至240分钟、或45分钟至90分钟、或55分钟至65分钟的范围内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体通过沉降或过滤与可溶性制品分离。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在带有伯胺基团的固相材料的存在下进行孵育。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述带有伯胺的固相为松散颗粒的形式或为色谱装置的形式。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相颗粒以相对于在水性培养基中的细胞培养收获物体积的1％至10％、或2.5％至7.5％、或4.5％至5.0％范围内的体积比例存在。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述带有伯胺的固相的形式选自下组：填充有多孔颗粒的柱、填充有纳米纤维的柱、填充有整体材料的柱、水凝胶、多孔膜过滤器、和深度过滤器。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述固相的伯胺表面伴随有替代特征的化学残基，例如仲胺、叔胺、季胺、疏水残基、氢键残基、金属亲和残基，或它们的组合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在一种或多种的盐、糖、表面活性剂、二价金属离子、尿囊素、聚乙二醇、絮凝剂，或它们的组合的存在下进行。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
—降低包含所需生物制品的溶液的离子强度；
—使所述溶液与阳离子交换剂接触以去除更多污染物，其中所述阳离子交换剂与污染物结合；
—进一步降低包含所需生物制品的溶液的离子强度；
—使所述溶液与阳离子交换剂接触以纯化所需的生物制品，其中所述阳离子交换剂与所需的生物制品结合。
14.用于执行权利要求1至13中任一项所述的方法的试剂盒的用途，所述试剂盒包括在容器中的浓缩培养基中的固相颗粒和用于执行该方法的说明，优选地，其中所述固相颗粒带有伯胺基团。
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