MXPA00008008A - Composiciones que contienen virus y metodos para concentrar preparados de virus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que contiene virus en una formulación que contiene polihidroxihidrocarburo regulada para mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 a una temperatura en el orden de aproximadamente 2ºC a 27ºC;se dan a conocer también métodos para concentrar y purificar los preparados de virus.

Description

COMPOSICIONES QUE CONTIENEN VIRUS Y MÉTODOS PARA CONCENTRAR PREPARADOS DE VIRUS I. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones que contienen virus, especialmente vectores virales, que tienen una estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones de acuerdo con la presente invención son útiles en mantener la estabilidad de los virus durante el almacenamiento, siendo las composiciones que contienen virus de acuerdo con la presente invención particularmente útiles para usos terapéuticos como terapia genética. Se proporcionan también nuevos métodos para concentrar y purificar preparados de virus.

II. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los virus han desarrollado una importancia creciente para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y terapia genética y existe una necesidad de desarrollar y preparar composiciones estables conteniendo virus que puedan ser fácilmente almacenadas y transportadas, manteniendo aun suficiente seguridad y eficacia. En particular, dado el uso intenso de vectores virales en terapia genética, es importante desarrollar y preparar formulaciones que puedan preservar con estabilidad virus recombinantes vivos cuando son portadores de transgenes terapéuticos. Además, existe una necesidad crítica de formulaciones que puedan estabilizar preparados de virus a temperaturas por encima de -80°C por extensos períodos de tiempo. Las composiciones conteniendo virus normalmente requieren ser almacenadas a -80°C y no pueden ser mantenidas a temperaturas de refrigeración corrientes (por ejemplo, 2°C a 8°C o mayores) por períodos de tiempo significativos. Esta limitación representa un serio impedimento no solo para el almacenamiento, sino también para el procesado, la distribución y el uso clínico intenso. Existe también una necesidad de desarrollar composiciones conteniendo virus que puedan mantener el pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 durante extendidos períodos de tiempo a pesar de estar expuestas a temperaturas de refrigeración y a pesar de estar sometidas a condiciones tan severas tales como congelamiento/descongelamiento, especialmente las velocidades lentas de congelamiento/descongelamiento que puedan tener lugar con la producción, manipuleo o distribución a gran escala. El mantenimiento del pH es importante para los preparados virales porque a pH por debajo de 7.0 y superiores a 8.5 las partículas vivas de virus son susceptibles de perder viabilidad debido a la inestabilidad física y biológica. El incremento de las concentraciones de virus trae aparejados problemas adicionales. En particular, las altas concentraciones de virus contribuyen significativamente a la inestabilidad de los virus. Sin embargo, se requieren concentraciones cada vez más altas de virus y vectores virales para uso terapéutico. Existe por lo tanto una necesidad crítica de desarrollar formulaciones que estabilicen concentraciones de virus relativamente altas, especialmente bajo las severas condiciones mencionadas anteriormente. Existe, además, una necesidad particular de desarrollar nuevos métodos para concentrar un preparado de virus existente, obteniendo preparaciones estables a niveles de concentración más altos. Los problemas de la inestabilidad asociados con concentraciones altas de virus se exacerban significativamente al tratar de concentrar un preparado de virus existente. Esto se debe en parte a las fuerzas de corte mecánicas adicionales que surgen durante el proceso para aumentar la concentración de un preparado de virus existente. Si se pudiera encontrar un método para concentrar un preparado de virus sin perjudicar sustancialmente la estabilidad del virus, podrían prepararse entonces fácilmente dosis clínicas a cualquier concentración deseada (aun cuando se partiera de un material de concentración más baja) y, fundamentalmente, la capacidad de concentrar virus podría eliminar problemáticos cuellos de botella y otros problemas progresivos a lo largo del proceso de purificación, permitiendo rendimientos significativamente mayores en varias etapas de procesamiento tales como cromatografía de exclusión de tamaño. Existe por lo tanto la necesidad de materiales y métodos para lograr los objetivos anteriormente mencionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface las necesidades mencionadas anteriormente proporcionando una composición estable que contiene virus en una formulación que está constituida por un polihidroxihidrocarburo regulado para mantener un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 a una temperatura en el orden de aproximadamente 2°C a 7°C. También se proporcionan nuevos métodos para concentrar un preparado de virus existente que permiten seleccionar y preparar rápidamente dosis clínicas en una amplia gama de concentraciones deseadas. Un método preferido para concentrar un preparado de virus consiste en: a) adicionar un polihidroxi a un preparado de virus hasta una concentración final de polihidroxihidrocarburo de aproximadamente 20% o más. b) someter el preparado de virus a un proceso de filtración en el cual la concentración de virus se incrementa aplicando presión al preparado de modo tal que se elimine el diluyente del preparado de virus a través de un filtro mientras que el virus es retenido. También se proporciona en la presente un método para concentrar un preparado de virus que consiste en: a) centrifugar una composición que consta de una primera capa que contiene un polihidroxihidrocarburo en una concentración de 35% a 80% (v/v), estando la primera capa cubierta por una segunda capa que contiene un polihidroxihidrocarburo en una concentración de 5% a 30% (v/v), estando la segunda capa cubierta por una tercera que contiene virus y b) recuperar el virus de la primera capa. Además, los inventores de la presente han descubierto que su nuevo método para incrementar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de optimizar el procesado ulterior (por ejemplo, reduciendo o eliminando cuellos de botella problemáticos durante la purificación subsiguiente permitiendo un rendimiento significativamente mayor en etapas de procesamiento tales como la cromatografía de exclusión de tamaño). Por consiguiente, en una modalidad preferida, el método para concentrar preparados de virus de acuerdo con la presente invención comprende además una etapa de purificación subsiguiente (por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño). A este respecto, el método de acuerdo con la presente invención es particularmente útil cuando se realiza una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño después de una cromatografía de intercambio iónico, siendo el preparado de virus concentrado (de acuerdo con la presente invención) luego de la cromatografía de intercambio ¡ónico pero antes de la cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones virales obtenidas de la cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, contienen típicamente altos niveles de sales y posiblemente otras impurezas que después comprometen la estabilidad del virus durante los procedimientos de concentración. Por lo tanto, en una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para purificar un preparado de virus que consiste en: a) someter el preparado de virus a cromatografía de intercambio de iones, en el cual el virus es eluido como un producto de preparado de virus a partir de un medio de cromatografía de intercambio de iones; b) adicionar un polihidroxihidrocarburo al producto de preparado de virus de la etapa a) hasta que la concentración final de polihidroxihidrocarburo en el preparado alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; c) aumentar la concentración de virus en el producto de preparado de virus de la etapa b) aplicando presión al preparado de modo tal que se elimine el diluyente del preparado de virus a través de un filtro mientras que el virus es retenido y d) someter el producto de preparado de virus concentrado de la etapa c) a una o más etapas adicionales de procesamiento. La presente invención también proporciona preparados de virus concentrados y/o purificados por los métodos anteriormente descritos.

IV. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se ha citado anteriormente, la presente invención da a conocer composiciones novedosas que contienen virus, así como también métodos novedosos para concentrar y purificar composiciones que contienen virus. Con respecto a las composiciones, la presente invención ha desarrollado una formulación novedosa de pH regulado que puede preservar preparados virales con estabilidad mejorada. En particular, la formulación puede estabilizar preparados virales a temperaturas bien por encima de -80°C. Más importante aún, las composiciones de acuerdo con la presente invención son estables a temperaturas de refrigeración típicas de, por ejemplo, 2°C a 8°C o superiores, durante significativos períodos de tiempo, preferiblemente durante varios meses o más. Esta es una ventaja crítica porque, como se ha mencionado anteriormente, el mantenimiento de preparados virales congelados a -80°C durante el almacenamiento y transporte es impráctico para satisfacer las necesidades clínicas. Una importante característica de las composiciones de acuerdo con la presente invención es la adición de polihidroxihidrocarburos. Tal como se lo emplea aquí, un polihidroxihidrocarburo significa un compuesto ramificado, lineal o cíclico sustituido con 2 o más (preferentemente 2 a 6, más preferentemente 2 a 4) grupos hidroxílo. Los polihídroxihidrocarburos para uso en la presente invención son preferentemente compuestos alquílicos (ramificados o no ramificados) polihidroxi-sustituídos, que tienen preferiblemente de 2 a 7 átomos de carbono y pueden incluir, por ejemplo, glicerina, sorbitoi y polipropanol. Se prefiere particularmente la glicerina. Como se demostrará mediante datos proporcionados más adelante, los inventores de la presente descubrieron que la glicerina posibilita niveles sorprendentemente altos de estabilidad durante extensos períodos de tiempo, aun en condiciones de refrigeración corrientes. Una cantidad efectiva de polihidroxihidrocarburos para las composiciones de acuerdo con la presente invención es una cantidad suficiente para estabilizar al virus en la formulación de acuerdo con la presente sin afectar adversamente la efectividad del virus para su uso posterior, especialmente en aquellos casos que el virus contiene un transgén para empleo en terapia genética. El polihidroxihidrocarburo está presente preferentemente en una concentración final de aproximadamente 20 a 200 mg/ml. Un intervalo más estrecho puede ser 80 a 120 mg/ml. Se puede utilizar más de un polihidroxihidrocarburo para lograr la cantidad total deseada de polihidroxihidrocarburo en la composición de acuerdo con la presente invención. El polihidroxihidrocarburo en las composiciones de acuerdo con la presente invención puede contener opcionalmente un grupo aldehido. En particular, el polihidroxíhidrocarburo puede ser disacárido tal como la sacarosa. Además, aun cuando el polihidroxihidrocarburo seleccionado para la composición no contenga un grupo aldehido, la composición puede incluir adicionalmente un disacárido, tal como la sacarosa, como un estabilizador y agente de ajuste de la tonicidad. Cuando la composición de acuerdo con la presente invención ya contiene un polihidroxihidrocarburo adecuado (tal como la glicerina) y se emplea un disacárido en realizaciones preferidas como un estabilizador y agente de ajuste de la tonicidad, el disacárido está preferentemente presente en el orden de 5 a 25 mg/ml, más preferiblemente 20 mg/ml, siendo el disacárido preferentemente sacarosa. En realizaciones preferidas de la composición de acuerdo con la presente invención se usan estabilizadores de sales de metales divalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales de magnesio, sales de zinc y sales de calcio. Preferentemente la sal es una sal de cloruro o una sal de magnesio, prefiriéndose particularmente una sal de magnesio. La sal (por ejemplo, la sal de magnesio) está presente preferiblemente en una concentración de desde aproximadamente 0.1 a 1 mg/ml, más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.4 mg/ml. En realizaciones preferidas de la presente invención se pueden incluir estabilizadores de sales o metales monovalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales de potasio, sodio, litio y cesio como estabilizadores opcionales. Preferentemente la sal es cloruro de sodio y está presente en una concentración de 0.6 a 10.0 mg/ml, más preferentemente en una concentración de aproximadamente mg/ml. Además de estabilizar la composición, el cloruro de sodio puede suprimir la velocidad y extensión de la aparición de subproductos de fermentación, resultando en una presentación farmacéuticamente más apta que puede tener potencial antigénico debido a agregados proteicos. La adición de cloruro de sodio no afecta el pH de la formulación.

La composición de acuerdo con la presente invención es capaz de mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 por extensos períodos de tiempo, aun cuando sea sometida a condiciones severas tales como refrigeración y congelamiento/descongelamiento. Además, las composiciones pueden permanecer estables y mantener el intervalo de pH requerido aun cuando sean sometidas al régimen lento de congelamiento/descongelamiento que puede tener lugar en relación con la producción, distribución y manipuleo a gran escala. Como se ha mencionado anteriormente, el mantenimiento del pH es importante para preparados vírales, porque con pH por debajo de 7.0 y por encima de 8.5 las partículas de virus vivas se hacen inestables y se degradan. La particular composición de los virus hacen que los mismos sean difíciles de estabilizar y preservar. Para lograr el mantenimiento del pH en condiciones severas, la presente invención incluye preferentemente un sistema regulador del pH que puede mantener un pH óptimo en un intervalo de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.5 a pesar del almacenamiento entre -80°C y 27°C y a pesar de estar sometido a condiciones de congelamiento/descongelamiento. Debido a que el pH puede variar en función de la temperatura, los intervalos de pH de acuerdo con la presente invención son mostrados más específicamente a continuación con referencia a márgenes de temperatura específicos. Por ejemplo a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, aproximadamente 2°C a 8°C) un intervalo de pH preferido es de aproximadamente 7.7 a aproximadamente 8.3; más preferiblemente de aproximadamente 7.9 a aproximadamente 8.2. A temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20°C a 27°C, preferentemente 22°C-25°C) un intervalo de pH preferido es de aproximadamente 7.3 a aproximadamente 8.2, más preferentemente de aproximadamente 7.4 a aproximadamente 7.9. Un sistema de regulación de pH preferido de acuerdo con la presente invención está constituido por fosfato de sodio monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0.5 a 10 mg/ml y trometamina en una concentración de aproximadamente 0.5 a 10 mg/ml (la trometamina es también conocida como "TRIS" o "Trizma" obtenible de Sigma Chemical Co.). Sin embargo, se pueden utilizar otros sistemas reguladores de pH. Por ejemplo, se pueden emplear fosfato de sodio dibásico dihidratado si se asocia con una forma acida de un regulador de tris. En una modalidad particularmente preferida, el sistema regulador de pH está constituido por fosfato de sodio monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 1.7 mg/ml y trometamina en una concentración de aproximadamente 1.7 mg/ml y tiene la capacidad de mantener la formulación dentro de un intervalo de pH óptimo de aproximadamente 7.3 a aproximadamente 7.9 a 25°C. La formulación de acuerdo con la presente invención tiene la ventaja adicional de poseer la capacidad de estabilizar concentraciones elevadas de virus en las condiciones severas anteriormente mencionadas (tales como a las temperaturas de refrigeración y en los procesos de congelamiento/descongelamiento). En particular, la formulación de acuerdo con la presente invención puede mantener la estabilidad del virus a concentraciones que van hasta 1 x 1013 partículas/ml. Una gama preferida de concentraciones de virus para utilización en la presente invención está en el orden de 1 x 109 a 1 x 1013 partículas/ml, más preferiblemente hasta 1 x 1012 partículas/ml, por ejemplo 1 x 109 (ó 1 x 1010) a 1 x 1012. El término "diluyente" como se lo emplea en la presente incluye un solvente (por ejemplo, agua, preferentemente agua estéril) o una mezcla de un solvente y otros ingredientes tales como solventes adicionales, estabilizadores adicionales, reguladores de pH adicionales y/u otras sustancias que no afecten adversamente la seguridad, la eficacia y la estabilidad de la formulación. Con respecto a diluyentes, estabilizadores, reguladores de pH y similares se remite a, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ta. edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, E.U.A. Un agente tensíoactivo, preferentemente un detergente no iónico tal como un éster de ácido graso de polioxietileno (por ejemplo, polioxietilensorbitanos tales como Polysorbate 20, Polysorbate 40, Polysorbate 60 o Polysorbate 80 de ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware, E.U.A. o Tween 20, Tween 40, Tween 60 o Tween 80 de Sigma, St. Louis, Mo., E.U.A.) pueden incorporarse opcionalmente a la composición de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, el detergente no iónico es un éster de ácido graso de polioxietileno, siendo el éster de ácido graso de polioxietileno preferentemente Polysorbate 80, que actúa como un estabilizador en la composición de acuerdo con la presente invención. La concentración de detergente no iónico está preferentemente en el orden de 0.03 a 0.3 mg/ml, más preferentemente 0.15 mg/ml. Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden contener además uno o más "agentes reforzadores de transferencia" ("delivery-enhancing agents"). Un "agente reforzador de transferencia" designa cualquier agente que refuerza la transferencia de un gen terapéutico, tal como un gen supresor de un tumor a un tejido u órgano canceroso. Ejemplos de tales agentes reforzadores de transferencia incluyen, sin estar limitados a los mismos, detergentes, alcoholes, glicoles, agentes tensioactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de ciclooxigenasa, soluciones de sales hipertónicas y acetatos. Los detergentes (tal como el término se aplica en la presente) pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no iónicos. Como ejemplos de detergentes se pueden mencionar, sin estar limitados a los mismos, taurocolato, deoxicolato, cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, detergente ZWITTERGENT® 3-14, CHAPS (hidrato de [3(3-colamidopropil)dimetilamoniol]-1propansulfonato, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, detergente TRITON®-X-100, C12E8, Octil-B-D-glucopiranoside, detergente PLURONIC®-F68, detergente TWEEN® 20 y detergente TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals). El uso de agentes reforzadores de la transferencia se describe en detalle en la solicitud de patente de E.U.A. co-pendiente No. de acta 08/889.335 presentada el 8 de julio de 1997, en la publicación de solicitud internacional No. WO 97/25072 del 17 de julio de 1997 y en la solicitud de patente de E.U.A. No. de acta 09/112.074 presentada el 8 de julio de 1998, solicitud internacional PCT/US 98/14241. Además, el uso de inhibidores de calpaína en conjunción con vectores vírales para aumentar la eficiencia de la transducción se describe en las solicitudes de patente de E.U.A. No. de acta 09/172.685 y 60/104321 presentadas el 15 de octubre de 1998. En las composiciones de acuerdo con la presente invención se puede emplear una amplia gama de virus, incluyendo, pero sin limitarse a los mismos, adenovirus, virus de erupciones, iridovirus, virus de herpes, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adeno-asociados, virus de vaccinia, rotovirus, etc. (véase por ejemplo Anderson, Science, 1992, 256:808-813); siendo particularmente preferidos los adenovirus. Los virus son preferentemente virus recombinantes, pero pueden incluir cepas aisladas clínicas atenuadas para vacunas, etc. De este modo, por ejemplo, un ejemplo de adenovirus recombinante que se puede emplear en composiciones de acuerdo con la presente invención es el A/C/N/53, que se da a conocer en la solicitud de patente PCT No. WO 95/11984. La formulación de acuerdo con la presente invención se adecúa particularmente muy bien para estabilizar un virus recombinante, tal como un adenovirus recombinante vivo (o "vector viral") para su uso en terapia genética. Por ejemplo, el virus utilizado en la presente invención puede consistir en un gen supresor de tumor tal como el gen p-53 de tipo no cultivado o un gen Rb (por ejemplo, p110RB o p56RB) y con transgenes tales como el p53 de tipo no cultivado insertado en un vector viral, pudiendo emplearse la composición, de acuerdo con la presente invención como una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer. A este respecto, las formulaciones de acuerdo con la presente invención tienen una notable capacidad para mantener la viabilidad del virus vivo, en particular un vector viral en el cual fue insertada una secuencia de nucleótido codificando un transgén tal como p53. Esta característica permite que el virus mantenga su capacidad para infectar células "objetivo" de modo tal que se produzca adecuadamente la proteína terapéutica codificada por el transgén insertado. Con respecto específicamente al p53 y sus usos, es de destacar que la mutación del gen p53 es la alteración genética más común en los cánceres humanos (Bartek, 1991 , Oncogene, 6: 1699-1703; Holstein, 1991 , Science, 253: 49-53). La introducción del p53 de tipo cultivado en células cancerosas mamarias a las que les falta la proteína del p53 de tipo no cultivado endógena suprime el fenotipo neoplásico de dichas células (véase por ejemplo la patente de E.U.A. 5,532,220). En los ejemplos anteriores, el virus es un adenovirus recombinante vivo que contiene el gen p53 del tipo no cultivado. La estructura del vector viral en estos ejemplos es designada en ia presente "A/C/N/53" (al que se alude también como "ACN53") es una estructura de vector viral particularmente preferida descrita en la solicitud co-pendiente USSN 08/328,673 presentada el 25 de octubre de 1994 y en la WO 95/11984 (4 de mayo de 1995), la que se incorpora a la presente expresamente a título de referencia.

Una fórmula representativa para realizaciones de la presente invención que contiene Polysorbate 80 se expone a continuación: Fórmula representativa Sustancia activa A C/N/53 1x109 a 1x1013 partículas/ml Regulador de pH fosfato de sodio 0.5 a 10 mg/ml monobásico trometamina 0.5 a 10 mg/ml Estabilizador/agente sacarosa 5 a 25 mg/ml tonificador Estabilizadores glicerina 20 a 200 mg/ml cloruro de 0.1 a 1 mg/ml magnesio Polysorbate 80 0.03 a 0.3 mg/ml Solvente agua para 1 ml inyección csp (La composición se guarda típicamente en dosis de 1.0 ml. "csp" en la fórmula anterior significa que se añade suficiente solvente par alcanzar el volumen total de 1 ml). Se exhiben a continuación cuatro realizaciones particularmente preferidas. (El Polysorbate 80 está presente en los ejemplo 1 y 2, pero los ejemplos 3 y 4 no lo contienen).

Ejemplo 1 Ejemplo 2 A/C/N/53 7.5 x 1011 7.5 x 1010 partículas/ml partículas/ml Fosfato de sodio 1.7 mg/ml 1.7 mg/ml monobásico dihidratado Trometamina 1.7 mg/ml 1.7 mg/ml Cloruro de magnesio 0.4 mg/ml 0.4 mg/ml hexahidratado Sacarosa 20 mg/ml 20 mg/ml Polysorbate 80 0.15 mg/ml 0.15 mg/ml Glicerina 100 mg/ml 100 mg/ml Agua para inyección csp 1 ml 1 ml PH 7.4 a 7.8 7.4 a 7.8 Ejemplo 3 Ejemplo 4 A C/N/53 7.5 x 1011 7.5 x 1010 partículas/ml partículas/ml Fosfato de sodio 1.7 mg/ml 1.7 mg/ml monobásico dihidratado Trometamina 1.7 mg/ml 1.7 mg/ml Cloruro de magnesio 0.4 mg/ml 0.4 mg/ml hexahidratado Sacarosa 20 mg/ml 20 mg/ml Glicerina 100 mg/ml 100 mg/ml Agua para inyección csp 1 ml 1 ml PH 7.4 a 7.9 7.3 a 7.8 Los siguientes ingredientes: Fosfato de sodio monobásico dihidratado, trometamina, cloruro de magnesio hexahidratado, sacarosa y glicerina se pueden adquirir todos, por ejemplo, en EM Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532, E.U.A. El Polysorbate 80 es obtenible de, por ejemplo, ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware 19897, E.U.A. Las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden preparar durante la purificación de virus en una columna de cromatografía de filtración de gel reuniendo los ingredientes (excluyendo el Polysorbate 80) en la concentración deseada en la columna de filtración de gel (con respecto a los métodos de filtración de gel, se remite a por ejemplo la sección V más adelante). Si se desea luego diluir la concentración del virus o incorporar Polysorbate 80, los diluyentes entonces se pueden preparar por medio de las técnicas corrientes. Un ejemplo ilustrativo se expone a continuación: Cargar y disolver fosfato de sodio monobásico dihidratado, trometamina, sacarosa, cloruro de magnesio hexahidratado y glicerina en aproximadamente 75% del volumen de agua de inyección del lote a temperatura ambiente en un recipiente de acero inoxidable equipado con un agitador. Llevar el volumen del diluyente resultante al volumen final con agua para inyección. Verificar el pH. Calcular el volumen requerido de sustancia de droga de A/C/N/53 (adenovirus con p53 tipo no cultivado como un transgén) en suspensión y el volumen requerido de diluyente para preparar inyección de A/C/N/53. Si la inyección de A/C/N/53 final va a contener Polysorbate 80, preparar una solución típica que contenga 10% de Polysorbate en exceso en diluyente. Cargar la cantidad calculada de sustancia de droga de A/C/N/53 en suspensión y el diluyente en una recipiente de acero inoxidable y mezclar. Cargar la solución de Polysorbate 80, antes de agregar todo el diluyente, basado en el 10% del volumen total de lote de inyección de A/C/N/53 si es necesario. Filtrar la suspensión asépticamente a través de un filtro esterilizado (0.22 µm o equivalente). Verificar la integridad dei filtro después de la filtración. Recoger la suspensión esterilizada vertiéndola en frascos que tengan el volumen apropiado. Taponar y sellar los frascos. Los datos de estabilidad para los ejemplos 1 , 2, 3 y 4 se indican, respectivamente, en las Tablas 1 , 2, 3 y 4 más adelante. En las tablas siguientes, el ensayo de antiproliferación es un ensayo biológico utilizado para medir la capacidad del producto para eliminar células cancerosas y se basa generalmente en procedimientos utilizados por Wills y colaboradores, 1994, Human Gene Therapy, 5 : 1079-1088. Los números expuestos denotan actividad, mientras que el control no tiene actividad. El "ensayo de placa" mide partículas de virus en cultivo registrando el número de placas virales como una función de la dilución y se basa generalmente en procedimientos descritos en Graham, F.L: y Preveo, L. Methods in Molecular Biology, vol 7: Gene Transfer and Expression Protocols, editor E. J. Murray (Humana Press Inc., Clifton, NJ), páginas 109-128 (1991); véase también Graham, F.L.; Smiley, J.; W.C. y Nairn, R.; J. Gen. Virol., vol.36, páginas 59-74 (1977). El ensayo de "FACS" demuestra la capacidad del virus para infectar células y estas mediciones se basan generalmente en métodos descritos en por ejemplo la solicitud de patente internacional PCT/US 97/11865 (WO 98/01582, publicada el 15 de enero de 1998). En la siguiente columna hacia ia derecha, los números asentados bajo el encabezamiento "Concentración" representan la concentración del número total de partículas virales. Finalmente, los números bajo el encabezamiento "Relación partículas/FACS" representan la relación del número total de partículas de virus comparado con el número de partículas de virus infecciosos, indicando por consiguiente la potencia relativa del preparado de virus. Los datos bajo el encabezamiento "UV" indican la agregación de las partículas de virus como es puesto de manifiesto mediante la relación de absorbencia UV para las longitudes de onda A32o A26o como una indicación de dispersión de luz. Básicamente, la absorbancia a una longitud de onda de 320 nm mide la cantidad de dispersión de luz, mientras que la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm se correlaciona con la cantidad de ADN. Las temperaturas sentadas en la segunda columna de las tablas en "condición" representan la temperatura de almacenamiento. Los ensayos fisiológicos se llevaron a cabo a 37°C y el pH en la última columna se mide a temperatura ambiente, aproximadamente a 25°C.

CUADRO 1 Datos de estabilidad del ejemplo 1 M Reensayo de muestras UV de 9 meses: 6.89 x 1011 partículas/ml; A320/A26o = 0.28 CUADRO 2 Datos de estabilidad del ejemplo 2 t "No determinado debido a interferencias de ensayo "* Reensayo de muestras UV de 9 meses: 7.37 x 1010 partículas/ml; A320/A26o = 0.24 CUADRO 3 Datos de estabilidad del ejemplo 3 to Co CUADRO 4 Datos de estabilidad del ejemplo 4 t *no determinado debido a interferencias de ensayo EJEMPLO 5 Formulación para el ejemplo 5: A/C/N/53 (7.5 x 1011 partículas/ml); trometamina (TRIS) (1.7 mg/ml); fosfato de sodio monobásico dihidratado (1.7 mg/ml); sacarosa (20 mg/ml); cloruro de magnesio hexahidratado (0.4 mg/ml); glicerina (100 mg/ml); cloruro de sodio (5.8 mg/ml), volumen de relleno = 10 ml.

CUADRO 5 Datos de estabilidad del ejemplo 5 En algunos casos, se ha observado la formación de materiales en partículas en la formación durante el almacenamiento a 4°C. Los análisis de estos materiales por medio de SDS-PAGE sugieren que los mismos están compuestos de impurezas menores (por ejemplo, proteínas adicionales y algunas partículas virales inmaduras), no afectando por consiguiente estos materiales en partículas la viabilidad de la formulación. Sin embargo, en una modalidad preferida a fin de clarificar posteriormente la formulación (y evitar la posible formulación de materiales en partículas) se puede efectuar una tapa opcional de microfiltración para eliminar cualquier formación posible de partículas con escasa pérdida de partículas virales. (Cuando se efectúe una microfiltración, debe tenerse en cuenta que suficiente área de superficie de membrana de microfiltración por volumen de filtración es crítica para evitar la pérdida de virus al eliminar los materiales en partículas). Además, en una modalidad preferida, los inventores de la presente invención han descubierto que la agitación, tal como la acción de revolver, puede acelerar la formación de partículas y es por lo tanto una etapa opcional adicional en el proceso de clarificación. Por lo tanto, una remoción suave (por ejemplo, durante toda la noche a 10°C, utilizando una barra de agitación magnética) seguida por microfiltración ha demostrado que la eliminación de partículas es tal que no se vuelven a formar materiales en partículas al reagitar. También se ha encontrado que ciclos de congelamiento/descongelamiento promueven la formación de partículas durante la reagitación. Por consiguiente, en otro procedimiento preferido se pueden realizar opcionalmente uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento seguidos de agitación y luego de microfiltración para evitar la formación de materiales en partículas durante el almacenamiento de producto de virus final a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, 4°C), Métodos para concentrar y purificar composiciones conteniendo virus La presente solicitud da a conocer también un nuevo método para concentrar establemente un preparado de virus existente mediante el empleo de filtración de flujo tangencial (en lo sucesivo designado en algunos casos como "TFF"), permitiendo la selección y preparación rápida de dosis clínicas en una amplia gama de concentraciones deseadas. El nuevo método para concentrar un preparado de virus consistente en: a) adicionar un polihidroxihidrocarburo a un preparado de virus hasta alcanzar una concentración final de polihidroxihidrocarburo de aproximadamente 20% o más y b) someter al preparado de virus a un proceso de filtración en el cual la concentración de virus es incrementada aplicando presión al preparado de modo tal de eliminar el diluyente del preparado de virus a través del filtro, mientras que el virus es retenido. Los métodos de acuerdo con la presente invención son aplicables a una amplia gama de virus, incluyendo, pero sin limitarse a los mismos, adenovirus, virus de erupciones, iridovirus, virus de herpes, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adeno-asociados, virus de vaccinia, rotavirus, etc., siendo particularmente preferidos los adenovirus. Los virus son preferentemente virus recombinantes, pero pueden incluir cepas aisladas clínicas atenuadas para vacunas, etc. La presente invención es particularmente útil para concentrar virus recombinantes que portan un transgén heterólogo para uso en terapia genética. Tales virus son especialmente vulnerables a fuerzas potencialmente desestabilizadoras, tales como fuerzas mecánicas de corte adicionales asociadas a los métodos de concentración de preparados de virus. Un ejemplo de adenovirus recombinante que se puede concentrar mediante el método de acuerdo con la presente invención es el A/C/N/53, que se da a conocer en la solicitud de patente PCT N° W095/11984. El proceso de filtración utilizado para concentrar el virus de acuerdo con el método de la presente invención puede incluir cualquier proceso de filtración (por ejemplo, ultrafiltración) en el cual la concentración del virus se aumente forzando al diluyente a pasar a través de un filtro de modo tal que el diluyente se elimina del preparado de virus, a la vez que el virus no es capaz de pasar a través del filtro, permaneciendo por lo tanto, en forma concentrada, en el preparado de virus. La ultrafiltración se describe en detalle en, por ejemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principies and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New York, NY, E.U.A., 1996). Un proceso de filtración particularmente preferido es la filtración de flujo tangencial ("TFF") tal como se describe en, por ejemplo, en el catálogo de MILLEPORE titulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" páginas 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). El aparato preferido de TFF consiste en un sistema de filtrado Pellicon II o Pellícon XL de Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts, E.U.A. (dirección de Internet (www.millipore.com), siendo particularmente preferido un sistema Pellicon XL: En una modalidad preferida, los métodos de la presente invención se llevan a cabo a temperaturas en el orden de aproximadamente 2°C a 27°C. Se pueden emplear otros procedimientos de concentración para concentrar preparados de virus de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el empleo de polihidroxihidrocarburos se puede emplear ventajosamente para concentrar un preparado de virus por medio de centrifugación. Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para concentrar un preparado de virus que consiste en a) centrifugar una composición que consta de una primera capa que contiene un polihidroxihidrocarburo en una concentración de 35% a 80% (v/v), estando la primera capa cubierta por una segunda capa que contiene polihidroxihidrocarburo en una concentración de 5% a 30% (v/v), estando la segunda capa cubierta por una tercera capa que contiene virus y b) recuperar el virus de la primera capa. A título de ejemplo, un preparado de adenovirus se puede concentrar mediante centrifugación a baja velocidad a 3200 g utilizando rotores de cubeta oscilante de una centrifuga Beckman. Para lograr esto, el preparado de virus puede ser colocado en múltiples tubos de 5 ml, conteniendo cada tubo 6.25% en volumen de glicerina al 70% en una primera capa en el fondo de tubo, cubierta con 2.5% en volumen de glicerina al 20%, con el preparado de virus colocado en la parte superior. La preparación es entonces centrifugada a 3200 g a 4°C aproximadamente 16 horas para compactar el virus concentrado dentro de las capas de glicerina, siendo entonces el preparado de virus recientemente concentrado recolectado de la primera capa. Los virus concentrados por los procedimientos descritos anteriormente poseen buenas características de dispersión de luz y tienen propiedades de ¡nfectabilidad adecuadas. Con respecto a los polihidroxihidrocarburos usados en los métodos de acuerdo con la presente invención, un "polihidroxihidrocarburo" significa un compuesto ramificado, lineal o cíclico sustituido con dos o más (preferentemente de 2 a 6, más preferentemente de 2 a 4) grupos hidroxilo y una cantidad efectiva de polihidroxihidrocarburo en una cantidad suficiente para estabilizar al virus contra fuerzas potencialmente desestabilizantes, tales como las fuerzas mecánicas de corte que tienen lugar durante el proceso de concentración. Preferentemente los polihidroxihidrocarburos en los métodos de concentración de virus de acuerdo con la presente invención están presentes en una concentración mínima de 20%, preferiblemente 25%. Los polihidroxihidrocarburos para uso en la presente invención son preferentemente compuestos alquílicos (ramificados o no ramificados) polihidroxi-sustituidos, que tienen preferiblemente de 2 a 7 átomos de carbono, pudiendo incluir glicerina, sorbitol y polipropanol. La glicerina es particularmente preferida. El nuevo método de los inventores para aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de mejorar el procesado, por ejemplo, eliminando cuellos de botella problemáticos permitiendo un rendimiento significativamente más alto a lo largo de varias etapas de procesamiento tales como la cromatografía de exclusión de tamaño. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el método para concentrar preparados de virus de acuerdo con la presente invención puede aplicarse a métodos para la purificación de virus en los cuales se realiza una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración de gel) luego de una cromatografía de intercambio aniónico. En esta modalidad existen amenazas adicionales a la estabilidad del virus que no provienen solamente de las fuerzas mecánicas de corte requeridas para concentrar el virus antes de la etapa de cromatografía de exclusión de tamaño limitadora de la velocidad, sino también debido al hecho de que el preparado de virus eluido de la cromatografía de intercambio aniónico contiene típicamente altos niveles de sales y otras impurezas que comprometen posteriormente la estabilidad del virus. Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para purificar un preparado de virus que consiste en: a) someter el preparado de virus a cromatografía de intercambio de iones, en el cual el virus es eluido como un producto de preparado de virus a partir de un medio de cromatografía de intercambio de iones; b) adicionar un polihidroxihidrocarburo al producto de preparado de virus de la etapa a) hasta que la concentración final de polihidroxihidrocarburo en el preparado alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; c) aumentar la concentración de virus en el producto de preparado de virus de la etapa b) aplicando presión al preparado de modo tal que se elimine el diluyente del preparado de virus a través de un filtro mientras que el virus es retenido y d) someter el producto de preparado de virus concentrado de la etapa c) a una o más etapas adicionales de procesamiento. En la modalidad preferida descrita anteriormente en relación con la cromatografía de intercambio aniónico, el nivel mínimo de glicerina es de 25% (en lugar del nivel mínimo del 20% en aplicaciones generales de los métodos de concentración de acuerdo con la presente invención) debido a que en esta aplicación en particular debe tenerse en cuenta la amenaza adicional a la estabilidad representada por las concentraciones elevadas de sales en el producto eluido de la columna de intercambio aniónico. La adición de 25% de glicerina (preferentemente 30%) da como resultado una estabilización del baño de DEAE conteniendo sales durante >10 días a, por ejemplo, 4°C; por consiguiente, se pueden realizar etapas subsiguientes de concentración y/o filtración de gel en días separados con flexibilidad sustancial a través de un periodo de 10 días. Como se podrá apreciar, el empleo de polihidroxihidrocarburo en la concentración más elevada de 25% o más puede también ser aplicado en métodos de acuerdo con la presente invención cuando el preparado de virus contiene concentraciones elevadas de sales debido a otras condiciones de proceso.

V. EJEMPLOS DE MÉTODOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones preferidas de la presente invención, no debiendo interpretarse que los alcances de la presente invención están limitados por las mismas.

Breve reseña: Un lote concentrado comienza con materiales virales crudos congelados procedentes de recuperación de fermentación. En una modalidad, el adenovirus es primero purificado por cromatografía de intercambio aniónico. Entonces, antes de cargar la preparación en una columna de exclusión de tamaño, el baño de intercambio aniónico puede ser concentrado mediante filtración de flujo tangencial (TFF) en presencia de 30% (v/v) de glicerina. Alternativamente, en otra modalidad, la etapa de concentración de TFF puede llevarse a cabo en presencia de 20% (v/v) o más (preferiblemente 25%) glicerina después de la cromatografía de exclusión de tamaño.

Preparación de materiales de partida mediante cromatografía de intercambio aniónico previo a la TFF En una modalidad preferida, un baño de intercambio aniónico de adenovirus se prepara para ser concentrado de la siguiente manera. El material viral congelado procedente de las etapas de recuperación y fermentación es descongelado y filtrado a través de una membrana hidrófila de 0.45 µm. La concentración de sal del filtrado se ajusta adicionando cloruro de sodio a 4M. Esta solución de alimentación es luego aplicada a una columna Fractogel EMD DEAE-650M preequilibrada con 50 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 260 mM de cloruro de sodio, cloruro de magnesio a 2 mM, de sacarosa a 2% (p/v) (regulador de pH A). El adenovirus se fija a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayoría de las impurezas del medio y de las células huéspedes pasan a través de la columna terminando en la carga agotada. La columna se lava inicialmente con 4 volúmenes de regulador de pH A seguido de un segundo lavado ¡socrático de 8 volúmenes de lecho de regulador de pH A al 94% y regulador de pH B al 6% (fosfato de sodio a 50 mM pH 7.5, cloruro de sodio a 600 mM, cloruro de magnesio a 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)) para eliminar impurezas adicionales. El virus es eluido de la columna con un volumen de 30 lechos de regulador de pH B con un gradiente lineal de 6% a 100%. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución según se determina mediante A28o. La glicerina se añade al baño de DEAE para alcanzar una concentración final de 30% (v/v) para procesamiento posterior.

Concentración del baño de DEAE utilizando filtración de flujo tangencial El baño de DEAE (preparado de acuerdo con la descripción anterior) se concentra de 10 a 20 veces utilizando una unidad Millipore TFF (sistema Pellicon XL) con membranas Biomax de corte de peso molecular 1 millón. El proceso se lleva a cabo a 2-10°C o a temperatura ambiente (25°C). Los siguientes parámetros de filtración se utilizaron en este procedimiento: presión promedio de entrada = 96.5 kPa (0.984 kg/cm2); presión de permeato promedio = o kPa; régimen de flujo promedio =13 litros/hora - metro cuadrado. La concentración final del adenovirus alcanza aproximadamente 1.0-2.0x1013 partículas por ml. Basado en el recurso Q-HPLC y en análisis de absorbancia UV (A26o), la recuperación de la etapa de concentración es >80% con agregación no significativa (ensayo de dispersión de luz A320/A26o)- Intercambio de regulador de pH mediante cromatografía de exclusión de tamaño (filtración de geO El preparado de adenovirus concentrado es llevado a una columna de exclusión de tamaño Superdex-200 preequilibrada con 20 mM de fosfato de sodio pH 8.0, cloruro de sodio a 100 mM, cloruro de magnesio a 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerina al 10% (regulador de pH C) o fosfato de sodio a 11 mM, Tris a 14 mM, cloruro de magnesio a 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerina al 10%, pH 7.8 (regulador de pH D). La columna se eluye con equilibrio de regulador de pH. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución según se determina mediante A28o y se reúne. El preparado de adenovirus concentrado se filtra a través de membrana Durapore hidrófila de 0.2 µm (Stericup, Millipore) a 2-10°C, pudiendo ser almacenada a -80°C o a temperaturas más altas (tales como de 2 a 10°C).

Concentración de baño de,Superdex-200 utilizando filtración de flujo tangencial Como se ha señalado anteriormente, una modalidad preferida de la presente invención consiste en concentrar el virus después de la cromatografía de intercambio aniónico, pero antes de la filtración de gel. Sin embargo, en otra modalidad, el método descrito para concentrar preparados de virus puede ser también usado después de la etapa de filtración de gel (aun cuando no se haya realizado una etapa de concentración de virus entre la etapa de intercambio aniónico y la etapa de filtración de gel). En este caso, los parámetros de filtración son los mismos que aquéllos para la concentración de un baño de DEAE, excepto que el polihidroxihidrocarburo (por ejemplo glicerol) se puede agregar al baño de Superdex-200 con una concentración final tan baja como 20% (v/v) dado que ya no es más necesario resolver el problema de las elevadas concentraciones salinas en el baño de DEAE. A este respecto, debe observarse que en los casos en los que la adición de polihidroxihidrocarburo se pospone hasta después de la filtración de gel, el baño de DEAE deberá ser tratado inmediatamente en la columna de filtración de gel (debido a la vulnerabilidad del baño de DEAE, con su alta concentración salina). Por consiguiente, puede verse que una ventaja adicional de la adición de polihidroxihidrocarburo al baño de DEAE (de acuerdo con la presente invención) es una flexibilidad aumentada en términos de intervalos de tiempo y opciones de almacenamiento durante el periodo de tiempo entre la cromatografía de intercambio aníónico y el subsiguiente procesamiento. Los métodos para concentrar preparados de virus se pueden emplear en asociación con una variedad de métodos de purificación. Para información adicional sobre métodos de purificación, se remite a, por ejemplo, Huyghe y colaboradores, Human Gene Therapy, Volumen 6, páginas 1403-1416, (1995) y la solicitud de patente estadounidense No. de acta 08/989.227, que se incorpora expresamente a la presente a título de referencia.

VI. DATOS DE ESTABILIDAD PARA MÉTODOS PARA CONCENTRACIÓN DE PREPARADOS DE VIRUS UTILIZANDO FILTRACIÓN DE FLUJO TANGENCIAL Como se demuestra mediante los datos experimentales más adelante, los métodos de la presente invención permiten una estabilidad de os virus mejorada, a pesar de los esfuerzos mecánicos de corte de concentración de virus y a pesar de las condiciones severas tales como los altos niveles salinos en el baño de DEAE. Por consiguiente, los métodos de la presente invención permiten, entre otras cosas, (1) la preparación rápida de dosis clínicas a cualquier concentración deseada (aun cuando el material de partida tenga una concentración menor), (2) mejorar el procesamiento (por ejemplo, permitiendo un rendimiento significativamente más alto durante la cromatografía de exclusión de tamaño) y (3) estabilizar el baño de DEAE conteniendo sales durante >10 días a 2-10°C (haciendo posible de este modo que las etapas subsecuentes de concentración de virus y/o filtración de gel se puedan llevar a cabo en días separados con flexibilidad sustancial a lo largo de un período de 10 días).

A. Concentración de virus a continuación de la cromatografía DEAE En los siguientes tres ejemplos, se prepararon concentraciones estables de adenovirus concentrado baños DEAE en glicerina al 30% (de acuerdo con el método de la presente invención). Los preparados fueron luego sometidos a ulterior purificación mediante cromatografía de filtración de gel Superdex- 200 para obtener la formulación final para ensayar.

EJEMPLO D-1 EJEMPLO D-2 EJEMPLO D-3 B. Concentración de virus a continuación de la filtración de gel EJEMPLO S-1 En el siguiente ejemplo, el preparado de virus se concentró en % de glicerina luego de la filtración de gel.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en su totalidad a título de referencia en la misma extensión como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual hubiera sido específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referencia. Serán obvias para aquéllos con conocimientos en la especialidad modificaciones y variaciones de esta invención. Las realizaciones específicas descritas aquí se ofrecen solamente a título de ejemplo y no debe interpretarse que la invención está limitada por las mismas.

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una composición que contiene virus en una formulación que consiste en un polihidroxihidrocarburo regulada para mantener un pH en el intervalo de desde aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 a una temperatura en el orden de desde aproximadamente 2°C a 27°C.

2. La composición de la reivindicación 1 en la cual el virus es un virus recombinante

3. La composición de la reivindicación 1 en la cual el polihidroxihidrocarburo es glicerina.

4. La composición de la reivindicación 1 que contiene además un disacárido.

5. la composición de la reivindicación 1 en la cual la composición contiene un sistema regulador de pH que consiste en fosfato de sodio monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0.5 a 10 mg/ml.

6. La composición de la reivindicación 1 que contiene además una sal de metal divalente en una concentración de aproximadamente 0.1 a 1 mg/ml.

7. La composición de la reivindicación 1 que contiene además un diluyente que consiste en agua.

8. La composición de la reivindicación 1 en la cual el virus está presente en una concentración de aproximadamente 1x109 a 1x1013 partículas/ml.

9. La composición de la reivindicación 1 en la cual el virus es un adenovirus.

10. La composición de la reivindicación 2 en la cual el virus recombinante consiste en una gen p53 del tipo no cultivado.

11. La composición de la reivindicación 10 en la cual el virus recombinante es A/C/N/53.

12. La composición de la reivindicación 1 en la cual el virus es un adenovirus, el polihidroxihidrocarburo es glicerina, el sistema regulador de pH mantiene el pH en el intervalo de desde aproximadamente 7.3 a aproximadamente 7.9 a una temperatura que va de los 20 a los 27°C, conteniendo la composición además un disacárido.

13. La composición de la reivindicación 12 en la cual el adenovirus es A/C/N/53, el disacárido es sacarosa, el sistema regulador de pH contiene fosfato de sodio monobásico dihidratado y trometamina, conteniendo además la composición una sal de metal divalente y agua.

14. Un método para concentrar un preparado de virus que consiste en: a) adicionar un polihidroxihidrocarburo a un preparado de virus hasta una concentración final de polihidroxihídrocarburo de aproximadamente 20% o más, b) someter el preparado de virus a un proceso de filtración en el cual la concentración de virus se incrementa aplicando presión al preparado de modo tal que se elimine el diluyente del preparado de virus a través de un filtro mientras que el virus es retenido.

15. El método de la reivindicación 14 en el cual el proceso de filtración consiste en ultrafiltración.

16. El método de la reivindicación 14 en el cual el proceso de filtración consiste en filtración de flujo tangencial.

17. Un método para purificar una preparado de virus que consiste en: a)someter el preparado de virus a cromatografía de intercambio de iones, en el cual el virus es eluido como un producto de preparado de virus a partir de un medio de cromatografía de intercambio de iones; b) adicionar un polihidroxihidrocarburo al producto de preparado de virus de la etapa a) hasta que la concentración final de polihidroxihidrocarburo en el preparado alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; c)aumentar la concentración de virus en el producto de preparado de virus de la etapa b) aplicando presión al preparado de modo tal que se elimine el diluyente del preparado de virus a través de un filtro mientras que el virus es retenido y c) someter el producto de preparado de virus concentrado de la etapa b) a una o más etapas adicionales de procesamiento.

18. El método de la reivindicación 14 en el cual el virus es un virus recombinante.

19. El método de la reivindicación 14 en el cual el virus es un virus recombinante que porta un transgén terapéutico para uso en medicina genética.

20. El método de la reivindicación 17 en el cual una etapa de procesamiento adicional comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

21. El método de la reivindicación 17 en el cual el proceso de la etapa (c) consiste en filtración de flujo tangencial.

22. El método de la reivindicación 21 en el cual el proceso de la etapa (c) se lleva a cabo utilizando equipo que consiste en un sistema de filtración Pellicon XL.

23. Un preparado de virus concentrado mediante el método de la reivindicación 14.

24. Un preparado de virus purificado mediante el método de la reivindicación 17.

25. Un método para concentrar un preparado de virus que consiste en: a) centrifugar una composición que consta de una primera capa que contiene un polihidroxihidrocarburo en una concentración de 35% a 80% (v/v), estando la primera capa cubierta por una segunda capa que contiene un polihidroxihidrocarburo en una concentración de 5% a 30% (v/v), estando la segunda capa cubierta por una tercera capa que contiene virus y b) recuperar el virus de la primera capa.

26. La composición de la reivindicación 1 , en la cual la composición es sometida a una etapa de procesamiento adicional de agitación, seguida de microfiltración, para evitar la formación de conjuntos de partículas durante el almacenamiento de la composición.

27. La composición de la reivindicación 1 , en la cual la composición es sometida a uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento seguidos de agitación y luego microfiltración, para evitar la formación de materiales en partículas durante el almacenamiento de la composición.

28. La composición de la reivindicación 12 que contiene además una sal de metal monovalente en una concentración de aproximadamente 0.6 a 10.0 mg/ml. P00/1057F