CN103173494B

CN103173494B - 一种含有重组腺病毒的制剂

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Publication number: CN103173494B
Application number: CN201310053160.8A
Authority: CN
Inventors: 杨艳艳; 付竞峰
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Beijing Kanghong Biomedical Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: CN103173494A

Abstract

本发明涉及一种含有重组腺病毒的制剂，所述制剂由重组腺病毒、缓冲液或缓冲体系和保护剂组成，其中，所述的缓冲液或缓冲体系选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种；所述的保护剂选自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亚砜。本发明制剂具有组分简单，不含有二价阳离子盐和非离子表面活性剂，如MgCl₂和吐温-80等，却能在2～8℃甚至室温很好保存腺病毒，并使其具有良好的稳定性等突出优点。

Description

一种含有重组腺病毒的制剂

技术领域

本发明涉及重组腺病毒，尤其涉及一种含有重组腺病毒的制剂。

背景技术

根据国家食品药品监督管理局发布的《关于发布化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求的通知》（国食药监注【2008】7号）中规定辅料选用的基本原则：在满足需要的前提下，注射剂所用辅料的种类及用量应尽可能少。重组腺病毒作为临床药物，在能维持其稳定性的前提下，原则上要求制剂辅料种类和用量越少越好。

已报道的现有技术中，美国专利US2006/0205080A1公开了一种包含Tris-HCl、MgCl₂、甘氨酸和选自丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氢呋喃、乙二醇醚的含水共溶剂的组合物，该制剂可在2～8℃较好地保持腺病毒的活性，但该组合物中的组分较多，导致产品生产较为复杂，甚至加大基因治疗药物的安全性风险。

此外，中国专利CN101163794A公开了一种腺病毒组合物，该组合物包含腺病毒颗粒及能维持pH在8.0-9.6的缓冲液和甘油，具有组分简单的优点，但其在2～8℃条件下长期保存腺病毒的稳定性不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有重组腺病毒的制剂，该制剂由包括重组腺病毒、缓冲液或缓冲体系、阻止腺病毒发生物理或化学变化而失活的保护剂组成，所述的缓冲液或缓冲体系选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种或其组合；适合于本发明的保护剂选自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亚砜的任一种或其组合。

进一步，所述的缓冲液或缓冲体系的pH为7.4-8.6。

进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为精氨酸-盐酸缓冲液。

进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为Tris-HCl缓冲液。

进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液。

进一步，所述的多羟基化合物为丙二醇，进一步，本发明制剂中丙二醇的浓度为5-20w/v%，优选为10-20w/v％。

本发明可根据稳定维持腺病毒活性的需要，调整和选择所需的缓冲液浓度。本发明制剂中缓冲液的浓度为10-100mM，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种。这样的选择可以取得令人满意的保存结果。

本发明的制剂由重组腺病毒、10-50mM缓冲液和10%丙二醇的组成，pH为7.8；所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种。

本发明的磷酸氢二钠–柠檬酸和精氨酸-盐酸缓冲液不仅具有很好的缓冲作用，还对腺病毒具有一定程度的保护作用。

本发明的制剂具有组分简单，不含有二价阳离子盐和非离子表面活性剂，如MgCl₂和吐温-80等，也能在2～8℃甚至室温很好保存腺病毒，并使其具有良好的稳定性等突出优点。

本发明制剂主要应用于保存基因治疗的重组腺病毒，还可应用于保存任何野生型腺病毒或其他用途的重组腺病毒。具体地说，包括所有利用重组DNA技术构建的复制缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或动物的野生型腺病毒或其突变腺病毒。

采用国际通用的TCID50法检定的病毒滴度值和紫外法检定的病毒颗粒数之比值（即比活度）来评价本发明的重组腺病毒的稳定性。

本发明采用TCID50方法测定重组腺病毒滴度，其原理是：将经过系列稀释的病毒样品感染293细胞，将每个稀释度所感染一定数量的细胞孔培养10天，在显微镜下观察各细胞孔中的细胞状况，统计病变细胞孔，利用TCID50计算公式，计算病毒滴度。

TCID50/ml=10^{-[-L-d(s-0.5)]+b}

其中，L：为最低稀释度的对数；d：为稀释对数之间的差；s：为病变阳性孔比率之和；b：为病毒接种量，换算为每毫升体积的倍数的对数。

本发明采用分光光度法检测腺病毒的颗粒数，其原理是：理论上，野生型5型腺病毒的成分是87%蛋白质和13%DNA。因此，腺病毒颗粒的浓度可直接用紫外分光光度计测量。蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基在277nm处有紫外吸收，而双链线性DNA在260nm有最大吸收值。本法采用含有0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）的制剂缓冲液，将病毒衣壳分解成蛋白质和DNA，再利用双链线性DNA在260nm处具有最大吸收值，在有去垢剂时，颗粒浓度与260nm吸光值成比例，用分光光度计于260nm处测定供试品的吸光度值，采用公式（1AU=1.1×10¹²VP/mL）计算病毒颗粒数。测试病毒颗粒数的适用范围为供试品病毒颗粒数≥2×10¹¹VP/mL。

本发明重组腺病毒稳定性的最终的判断指标为，根据检测所得病毒滴度和颗粒数计算所得的病毒比活度，即病毒比活度=病毒滴度/病毒颗粒数×100%。

国家药品食品监督管理局（SFDA）在《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》中规定，临床重组腺病毒比活度应高于3.3%；张晓志等（《中华医学杂志》，2004年，第84卷第10期），在“重组腺病毒临床级基因治疗制品的质量控制”中提到，评价腺病毒制剂的稳定性时，制剂中腺病毒的比活度应该大于3.3%。”

除非另有说明，本发明所述百分含量均为重量体积百分含量。

本发明的重组腺病毒的制备方法可以采用本领域通常的重组腺病毒制备方法所得，一般来说包括细胞复苏、种子细胞制备、病毒感染、扩增、细胞裂解、澄清过滤、浓缩换液、原液制备等过程

本发明的重组腺病毒制剂的制备方法可以采用本领域通常制备重组腺病毒的方法，一般来说包括如下步骤：将原液进行换液、检测浓度、用配比好浓度的制剂辅料进行稀释、除菌、分装得到成品。

本发明的另一目的在于提供重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的重组腺病毒制剂具有下述优点：

本发明的重组腺病毒制剂不仅可以很好保存重组腺病毒的活性，有效地防止腺病毒的聚集或分裂，而且组分简单，不含有二价阳离子盐，如MgCl₂，利于重组腺病毒的生产和临床使用。因而，本发明的重组腺病毒制剂不仅可以良好保存重组腺病毒及其其他腺病毒，还具有易于生产控制和产业化，制造成本低，制剂安全性更高更好等优点。本发明的制剂在重组腺病毒的保存上具有突出的优势。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不是对本发明的进一步限制。

实施例1 pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

为了研究pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，在25℃条件下，我们研究了pH6.8～8.6范围内，pH值分别为6.8、7.2、7.4、7.6、7.8、8.2、8.6时，pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

发明人通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了pH值对重组腺病毒稳定性的影响，结果见表1。

表1 pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：制剂的组成为10mMTris+10%丙二醇（w/v），用HCl调节pH。

由表1可见，在pH低于7.4时，制剂中的重组腺病毒较不稳定，而pH过高，刺激性较大。因此，本发明制剂选择pH为7.4～8.6。其中PH值为7.8时，腺病毒的稳定性很好，且接近于人体的PH值，药品不良反应较少。

实施例2 MgCl₂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

为了研究MgCl₂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，在25℃条件下，本发明采用对比试验，研究了制剂中存在MgCl₂与否对重组腺病毒稳定性的影响。其中，实验组制剂为本发明的重组腺病毒制剂，包含重组腺病毒、Tris-HCl缓冲液和选自丙二醇、聚乙二醇400、二甲基亚砜等保护剂，制剂中不含有MgCl₂；对照组制剂除了含有相同组分和相同含量的本发明重组腺病毒制剂外，制剂中还包含MgCl₂。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了MgCl₂对重组腺病毒稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表2。

表2 MgCl₂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为50mM，用HCl调节pH78；各保护剂的浓度百分比为w/v%。

由表2可见，本发明的重组腺病毒制剂与添加了MgCl₂的对照制剂相比，在25℃条件下，二者对保持重组腺病毒的稳定性基本没有差异。众所周知，作为治疗用药物，制剂中添加的辅料种类和用量越少越好。可见，本发明的简化制剂在重组腺病毒的保存上与现有技术相比具有优势。

实施例3 本发明重组腺病毒制剂25℃条件下的稳定性研究

在25℃条件下，研究了本发明的重组腺病毒制剂与现有技术制剂（即CN101163794A1所公开的制剂）中重组腺病毒的稳定性。其中，实验组制剂为本发明的重组腺病毒制剂，包含重组腺病毒、Tris-HCl缓冲液和选自丙二醇、聚乙二醇400、二甲基亚砜等保护剂，不含有MgCl₂；对照制剂为CN101163794A1所公开的制剂。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了本发明重组腺病毒制剂25℃条件下的稳定性，制剂的组成和检测结果见表3。

表3 本发明重组腺病毒制剂25℃条件下的稳定性研究

注：Tris浓度为50mM，用HCl调节pH78，各保护剂的浓度百分比为w/v%。

由表3可见，与对照组制剂相比，本发明的重组腺病毒制剂具有更加优异的稳定性，在25℃条件下，可保存重组腺病毒3个月，且比活度均在3.3%以上，而对照组制剂的比活度仅为2.48%，低于合格标准（基因治疗重组腺病毒的比活度应不低于3.3%）。

实施例4 缓冲体系对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了三种缓冲体系（柠檬酸-Na₂HPO₄、精氨酸-HCl、Tris-HCl）对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了缓冲体系对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表4。

由表4可见，在25℃条件下，Tris-HCl、柠檬酸-Na₂HPO₄、精氨酸-HCl缓冲体系都可以较好保持制剂中重组腺病毒的稳定性。

表4 缓冲体系对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为50mM，用HCl调节pH78；柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中柠檬酸浓度为50mM，用Na₂HPO₄调节pH78；精氨酸-HCl缓冲液中精氨酸浓度为50mM，用HCl调节pH78；各保护剂的浓度百分比为w/v%。

实施例5 本发明重组腺病毒制剂4℃条件下的稳定性研究

在4℃条件下，研究了本发明的重组腺病毒制剂与现有技术制剂（即CN101163794A所公开的制剂）中重组腺病毒的稳定性。其中，实验组制剂为本发明的重组腺病毒制剂，对照组制剂为现有技术制剂。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了本发明重组腺病毒制剂在4℃条件下的稳定性，制剂的组成和研究结果见表5。

由表5可知，与对照组制剂相比，在4℃条件下，本发明的重组腺病毒制剂中重组腺病毒的稳定性远高于现有技术中腺病毒的稳定性。

另外，表5数据还显示，同一缓冲体系中不同保护剂对重组腺病毒的稳定性影响也有差异，保护剂优选顺序为丙二醇、聚乙二醇400、二甲亚砜，较差的是丙三醇。

表5 本发明重组腺病毒制剂的稳定性研究

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为50mM，用HCl调节pH78；柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中柠檬酸浓度为50mM，用Na₂HPO₄调节pH78；精氨酸-HCl缓冲液中精氨酸浓度为50mM，用HCl调节pH78；组氨酸-HCl缓冲液中组氨酸浓度为50mM，用HCl调节pH78；各保护剂的浓度百分比为w/v%。

实施例6 丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了丙二醇浓度（5％、10％、15％、20%）对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表6。

由表6可见，丙二醇浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关，即丙二醇浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且，当丙二醇的浓度不低于10w/v%时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性。

表6 丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为50mM，用HCl调节pH78；柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中柠檬酸浓度为50mM，用Na₂HPO₄调节pH7.8；精氨酸-HCl缓冲液中精氨酸浓度为50mM，用HCl调节pH7.8；丙二醇的浓度百分比为w/v％。

实施例7 缓冲盐浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了缓冲体系中缓冲盐浓度（10mM、50mM、100mM）对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度（TCID50/mL）和比活度，研究了缓冲盐浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表7。

表7 缓冲盐浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：pH7.8，丙二醇的浓度百分比为w/v％。

由表7可见，缓冲体系中柠檬酸浓度与制剂中重组腺病毒的稳定性呈明显的线性关系，柠檬酸的浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好，当缓冲体系中柠檬酸的浓度不低于50mM时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性；缓冲体系中精氨酸浓度与制剂中重组腺病毒的稳定性呈明显的线性关系，精氨酸的浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好，当缓冲体系中精氨酸的浓度不低于50mM时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性；缓冲体系中Tris的浓度与制剂中重组腺病毒的稳定性相关性不强，当缓冲体系中Tris的浓度不低于10mM时，本发明制剂在不同Tris浓度下，制剂中重组腺病毒的稳定性差异不大。

实施例8 本发明制剂保存高浓度重组腺病毒稳定性的影响

为测试本发明制剂保存更高浓度重组腺病毒稳定性，设计了2、4、6、8、10E12vp/mL六个重组腺病毒浓度梯度，样品制备后于25℃保存，分别于0、1、2、3个月取样检测病毒滴度和颗粒数，计算比活度，结果见表8。

表8 本发明制剂保存高浓度重组腺病毒稳定性的影响

注：pH7.8，丙二醇的浓度百分比为w/v％。

由表8可见，在本发明的三种制剂缓冲液中，腺病毒的稳定性和其浓度都呈显著的线性关系，本发明制剂保存2～6E12vp/mL浓度以下重组腺病毒有较好的稳定性，保存8～10E12vp/mL浓度的重组腺病毒在25℃条件也能维持1～2个月的稳定性。

Claims

1.一种含有重组腺病毒的制剂，所述制剂由重组腺病毒、缓冲液和聚乙二醇-400组成，其中，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸缓冲液的任一种或其组合；所述缓冲液的pH为7.4-8.6；所述制剂中聚乙二醇-400的浓度为5-20w/v％，所述缓冲液的浓度为10-100mM。

2.根据权利要求1所述的制剂，所述制剂中聚乙二醇-400的浓度为10-20w/v％。

3.根据权利要求1或2所述的制剂，所述制剂由重组腺病毒、50mM缓冲液和10％聚乙二醇-400的组成，pH为7.8，其中，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸缓冲液的任一种。