WO2021020446A1 - 単純ヘルペスウイルスを含む組成物 - Google Patents

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WO2021020446A1
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hsv
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herpes simplex
simplex virus
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大嗣 津田
朱純 河合
京子 上萩
多佳久 月原
蝶野　英人
舞紀 田中
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タカラバイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a composition containing a herpes simplex virus.
  • Herpes simplex virus is a type of virus belonging to the order Herpesvirus, Herpesvirus family, Alphaherpesvirus subfamily, and Simplex virus genus, and has a double-stranded DNA of 150 kbp as a genome.
  • HSV includes herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and herpes simplex virus type 2 (HSV-2).
  • HSV-1 presents gingival aphthous ulcer and facial herpes as primary infection symptoms, and herpes labialis, corneal conjunctivitis herpes, and herpes encephalitis as recurrent infection symptoms.
  • the latent infection site of HSV-1 is mainly the trigeminal ganglion.
  • HSV-2 presents genital herpes as a primary infection symptom, and genital herpes and neonatal herpes as recurrent infection symptoms.
  • the latent infection site of HSV-2 is mainly the sacral ganglion.
  • herpes simplex virus is pathogenic to humans, vaccines to prevent primary infection and recurrent onset are being developed.
  • herpes simplex virus since herpes simplex virus has strong neurogenicity and high tumor-killing ability, medical use is being attempted not only as a vaccine but also in the fields of gene therapy and virus therapy.
  • Oncolytic virus is a general term for viruses that selectively proliferate and spread in tumor cells and destroy tumor cells without causing excessive damage to normal cells.
  • Many viruses such as HSV, adenovirus, leovirus, measles virus, Newcastle disease virus, and bovine hemolytic virus have been studied as oncolytic viruses, but the most researched and clinically applied as oncolytic viruses. Is the HSV.
  • Non-Patent Document 1 the US Food and Drug Administration
  • T-VEC trade name IMLYGIC
  • HF10 the oncolytic virus preparation talimogene laherparepvec
  • HSV composition The composition containing herpes simplex virus (hereinafter referred to as HSV composition) used for these uses must be retained in a state of retaining desired biological activity (antigenicity, infectivity, cytotoxic activity, etc.). ..
  • desired biological activity antigenicity, infectivity, cytotoxic activity, etc.
  • cryopreservation or lyophilization is common.
  • a technique for storing the HSV composition in a liquid state is desired.
  • Patent Document 2 discloses a method for stabilizing an HSV vaccine with freeze-drying or liquid by using "inactivated or attenuated virus, cell culture medium, hydrolyzed gelatin, and sugar". ing.
  • the HSV vaccine is stabilized in liquid by using "inactivated or attenuated virus, cell culture medium, hydrolyzed gelatin, sugar, L-glutamic acid, and L-arginine". Discloses how to do this.
  • Patent Document 4 discloses stabilization of herpes simplex virus in a frozen state by a composition containing "hydrolyzed gelatin, sugar, sodium chloride, and sodium phosphate having a pH of 7.4".
  • the present invention is intended to solve the problems of the conventional HSV storage method, and is a composition for maintaining the activity of HSV for a long time, and a method for storing HSV using the composition.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention provides a composition comprising herpes simplex virus, hydrolyzed gelatin, and at least a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton.
  • the composition of the present invention can store HSV for a long period of time while maintaining the infectivity of HSV to cells even under freezing conditions or dry conditions.
  • the compositions of the present invention also prevent viral inactivation due to freeze-thaw damage. That is, even if freeze-thaw is repeated, HSV can be preserved while maintaining the infectivity of HSV to cells.
  • the present invention [1] A composition containing herpes simplex virus, hydrolyzed gelatin, and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain. [2] The composition according to [1], wherein the low molecular weight compound is a basic amino acid having an amino group, a guanidyl group or an imidazole group in the side chain. [3] The composition according to [2], wherein the basic amino acid is selected from the group consisting of lysine, ornithine, arginine, homoarginine and histidine.
  • a method for storing herpes simplex virus (A) A step of preparing a composition containing herpes simplex virus, hydrolyzed gelatin, and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group, and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton, and (b) the prepared composition.
  • a kit for storing herpes simplex virus which comprises hydrolyzed gelatin and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain.
  • the low molecular weight compound is a basic amino acid having an amino group, a guanidyl group or an imidazole group in the side chain.
  • the basic amino acid is selected from the group consisting of lysine, ornithine, arginine, homoarginine and histidine.
  • the kit according to any one of [14] to [16] further comprising glycerol.
  • the kit according to any one of [14] to [17] which does not contain sugar.
  • [20] Use of a composition containing hydrolyzed gelatin and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain for storing herpes simplex virus.
  • the low molecular weight compound is a basic amino acid having an amino group, a guanidyl group or an imidazole group in the side chain.
  • the basic amino acid is selected from the group consisting of lysine, ornithine, arginine, homoarginine and histidine.
  • the composition further comprises glycerol.
  • the present invention provides a composition containing a herpes simplex virus and a method for preserving the herpes simplex virus using the composition.
  • the composition can be stored for a long period of time while maintaining the infectivity of herpes simplex virus to cells under any of non-frozen (for example, liquid), frozen or dry conditions. ..
  • the composition obtained by the present invention is suitably used for medical treatment for, for example, cancer treatment. Therefore, the present invention is expected to make a great contribution to the medical field, such as reducing the burden on the medical staff who handles the herpes simplex virus and improving the convenience of the herpes simplex virus.
  • composition of the present invention is characterized by containing herpes simplex virus, hydrolyzed gelatin, and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group, and further having another nitrogen atom capable of accepting a proton.
  • Herpesvirus refers to any virus belonging to the herpesvirus family, which is a family of viruses.
  • Herpesviruses double chain linear DNA molecular weight 80 ⁇ 150 ⁇ 10 6 daltons around the core protein comprises 162 capsomeres, characterized by latent infection.
  • the virus particles are spherical with a diameter of about 100 to 200 nm, and there are icosahedron-shaped capsids with a diameter of about 100 nm in the envelope.
  • the genome is double-stranded DNA, the size of which is, for example, 152260 base pairs for herpes simplex virus type 1, 172,282 base pairs for EB virus, and 229,400 base pairs for cytomegalovirus.
  • Alpha herpesvirus subfamily Human herpesvirus-1 (herpes simplex virus type 1; HSV-1), human herpesvirus-2 (herpes simplex virus type 2; HSV) -2), Alerton virus (Allerton virus), B virus (B virus), bovine mammilitis virus (BMV), feline rhinotracheitis virus (feline herpesvirus virus), infectious throat.
  • HSV-1 human herpesvirus-1
  • HSV-2 human herpesvirus-2
  • Alerton virus Allerton virus
  • B virus B virus
  • BMV bovine mammilitis virus
  • feline rhinotracheitis virus feline herpesvirus virus
  • Beta herpesvirus subfamily Cytomegalovirus, human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 (HHV-7), etc.
  • Gamma Herpesvirus subfamily Human herpesvirus-4 (HHV-4), human herpesvirus-8 (HHV-8), EB virus (EBV), Marek's disease virus, etc.
  • the viral construct of the present invention is derived from the subfamily Alphaherpesvirinae.
  • herpes simplex virus or "HSV” means any virus belonging to the genus Simplex virus of the family Alphaherpesvirinae of the herpesvirus family.
  • Herpes simplex virus is 100-200 mm in diameter and has an envelope containing viral glycoprotein in the outermost layer, which contains an icosahedral capsid. What is a capsid? There is a structure called a segment between the envelope and the envelope, which contains a large number of viral proteins. Double-stranded linear DNA (about 150,000 base pairs) exists in the center (core) of the capsid.
  • HSV there are at least 74 types of genes in genomic DNA, and half of them are replication non-essential genes (accessory genes) that are not essential for proliferation in cultured cells.
  • the replication of genomic DNA and the formation of capsids are carried out in the nucleus, and the capsids containing DNA are transported from the nucleus to the cytoplasm by budding from the inner membrane.
  • HSV there are typically two closely related viral species named type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2).
  • HSV includes wild-type HSV and its derivatives, unless otherwise specified.
  • Mutant HSVs that are functionally different from the wild type are exemplified as the above-mentioned derivatives, and the mutant HSVs are HSVs that are artificially produced (for example, by mutagen treatment or recombinant DNA technology) or that appear in nature. Include. Functional differences include, for example, strains in which the gene function of wild-type HSV is enhanced, attenuated or deficient, or strains into which a foreign gene has been introduced. For strains lacking gene function, “attenuated HSV” with reduced toxicity, “restricted proliferative HSV” that can proliferate in specific cells, and "cell affinity modified HSV” with modified affinity with cells. Is included.
  • the HSV that can be used in the present invention is preferably HSV-1.
  • the present invention can preferably use therapeutic HSV that requires infectivity.
  • therapeutic HSV include HSV that can be used as a vaccine and oncolytic HSV that is useful as a cancer therapeutic agent.
  • the oncolytic HSV may be any one having the property of selectively proliferating in the tumor tissue and destroying the tumor, and the HSV spontaneously acquired selective oncolytic virus and artificially selectively oncolytic virus. Any of the sex-imparted HSVs can be used in the present invention. Known oncolytic HSV can be used in the present invention, and examples thereof include, but are not limited to, canerpaturev, talimogene laherparepvec, and G47 ⁇ .
  • C-REV cancerpathurev
  • T-VEC total herpes simplex virus
  • G47 ⁇ refers to Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98 (11): An oncolytic virus produced by modifying the HSV-1 gene reported in 6396-401.
  • the composition of the present invention is for maintaining the infectious activity of HSV contained in the composition on cells for a long period of time.
  • the present invention provides a composition capable of preserving the desired HSV while preserving the activity and properties it had prior to storage.
  • the composition of the present invention may be in a non-frozen, frozen or dried state, but is preferably in a non-frozen state, and is not particularly limited to the present invention, but for example, a liquid composition is suitable.
  • “liquid” is synonymous with “solution” and can be paraphrased as “liquid state”, “liquid shape”, “solution state”, and “solution shape”.
  • the amount of HSV is not particularly limited as long as it can exert the effect of the present invention, has a type and concentration of hydrolyzed gelatin, an amino group and a carboxyl group, and further accepts protons. It can be appropriately determined in consideration of the type and concentration of the low molecular weight compound having a nitrogen atom, the type and concentration of other components, the storage temperature and the like.
  • the concentration of HSV is not particularly limited, but is at least 1 ⁇ 10 5 TCID 50 / mL, preferably at least 2 ⁇ 10 5 TCID 50 / mL, at least 5 ⁇ 10 5 TCID 50 / mL, and at least 1 ⁇ 10 6 TCID 50.
  • ⁇ 10 6 TCID 50 / mL at least 5 ⁇ 10 6 TCID 50 / mL, at least 1 ⁇ 10 7 TCID 50 / mL, at least 2 ⁇ 10 7 TCID 50 / mL, at least 5 ⁇ 10 7 TCID 50 It is present in excess of / mL, at least 1 ⁇ 10 8 TCID 50 / mL, at least 2 ⁇ 10 8 TCID 50 / mL, or at least 5 ⁇ 10 8 TCID 50 / mL.
  • the appropriate amount varies depending on the situation in which it is used, and can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the state of the active ingredient present in the composition and the like.
  • the HSV manufacturing method is not particularly limited.
  • the method for producing HSV may be any method. In general, after culturing infected cells obtained by infecting an appropriate host cell with HSV, a culture solution supernatant and / or a disrupted product of infected cells can be obtained as a virus-containing sample. Purified HSV can be obtained by subjecting these virus-containing samples to a known virus purification operation.
  • Hydrolyzed gelatin is obtained by extracting collagen contained in the skin, bones, scales, etc. of living organisms and further reducing the molecular weight by hydrolysis. Hydrolysis can be carried out by heat treatment, enzymatic digestion treatment, acid treatment, alkali treatment, or a combination thereof.
  • the hydrolyzed gelatin contained in the composition of the present invention is preferably derived from porcine.
  • the composition of the present invention may contain one or more hydrolyzed gelatins. Further, as a means of hydrolysis, treatment by enzymatic digestion is preferable, and from the viewpoint of immunogenicity, the average molecular weight of the hydrolysis product is preferably 10,000 or less.
  • hydrolyzed gelatin manufactured by Nippi can be preferably used.
  • the concentration of hydrolyzed gelatin contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exert the effect of the present invention, and the type and concentration of HSV, the type and concentration of other components, the storage temperature, etc. Can be appropriately determined in consideration of.
  • the concentration of hydrolyzed gelatin is not particularly limited, but is 0.0001 to 10% (w / v), 0.0005 to 5% (w / v), 0.001 to 2.5% (w / v), and so on. 0.005-1% (w / v), 0.01-0.5% (w / v), 0.05-0.25% (w / v), or 0.1-0.15% ( w / v) is illustrated.
  • the low molecular weight compound is, for example, a compound having a molecular weight of 2000 or less or 1500 or less.
  • the "low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain" contained in the composition of the present invention is an amino group or a nitrogen atom-carbon atom-nitrogen atom in the side chain.
  • a low molecular weight compound containing the above structure is preferable, for example, a structure containing two or more nitrogen atoms with an amino group or a carbon atom sandwiched in the side chain, for example, a basic amino acid, and further, for example, an amino group, a guanidyl group or Basic amino acids having an imidazole group can be preferably used.
  • the basic amino acid for example, it can be selected from the group consisting of lysine, ornithine, arginine, homoarginine and histidine.
  • the low molecular weight compound contained in the composition of the present invention preferably contains only one kind.
  • the low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain those in the form of salts (for example, hydrochloride) or hydrates thereof are used. It may be included, for example, a salt form in which the basicity of the low molecular weight compound is weakened, a salt form in which the water solubility is increased, and the like. Further, the above-mentioned low molecular weight compound may be any of L-form, D-form or DL-form as long as the effect of the present invention can be obtained.
  • composition of the present invention may contain one or more of the low molecular weight compounds.
  • the concentration of the low molecular weight compound contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exert the effect of the present invention, and the type and concentration of HSV, the type and concentration of other components, and It can be appropriately determined in consideration of the storage temperature and the like.
  • histidine which is a basic amino acid
  • its concentration is not particularly limited, but is 0.01 to 2 mg / mL, 0.02 to 1.5 mg / mL, 0.03 to 1 mg / mL, 0.
  • Examples are 04 to 0.7 mg / mL, 0.05 to 0.5 mg / mL, 0.1 to 0.4 mg / mL, 0.15 to 0.3 mg / mL, or 0.2 to 0.25 mg / mL. Will be done.
  • the composition of the present invention is prepared by mixing HSV, hydrolyzed gelatin, and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain in a solvent.
  • solvents for mixing HSV, hydrolyzed gelatin, and the low molecular weight compounds include, but are not limited to, water and buffers.
  • distilled water, sterilized water, distilled water for injection, or the like is used as the solvent for the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention preferably further contains a buffer component.
  • the "buffer component” refers to a compound or mixture having an action of softening fluctuations in the hydrogen ion concentration (pH) of a solution.
  • the buffer component contained in the composition of the present invention is not particularly limited, but for example, tris, bicine, tricine, Hepes, and phosphate (sodium phosphate, potassium phosphate, etc.) can be preferably used.
  • tris, bicine, tricine, Hepes, or phosphate is suitable for the present invention as a buffer component.
  • the concentration of the buffer component contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exert the effect of the present invention, and the type and concentration of herpesvirus, the type and concentration of other components, and storage. It can be appropriately determined in consideration of temperature and the like.
  • the pH of the composition of the present invention is, for example, in the range of pH 6.0 to 10.0, preferably pH 6.5 to 9.5, and more preferably pH 7.0 to 9.0. It is appropriate to be set.
  • the pH of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exert the effects of the present invention, and is appropriately determined in consideration of the type and concentration of HSV, the type and concentration of other components, the storage temperature, and the like. can do.
  • the composition of the present invention may contain a Tris buffer solution.
  • the preferred composition of Tris buffer in the present invention is Tris-HCl (pH 7.2-8.0) of 1-100 mM, preferably 2-50 mM, more preferably 5-20 mM.
  • the composition of the present invention contains other components in addition to HSV, hydrolyzed gelatin, and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain. May be good. On the other hand, it is desirable that it does not contain sugar.
  • the composition of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit the effects of the present invention.
  • the type and concentration of HSV, the type and concentration of hydrolyzed gelatin, the type and concentration of basic amino acids, and the type and concentration of other components can be appropriately determined in consideration of the purpose of use, storage temperature, and the like.
  • composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to: antioxidants, preservatives, colorants, stabilizers, diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, buffers, isotonic. Agents and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the composition of the present invention may contain glycerol.
  • glycerol When glycerol is contained, the present invention is not particularly limited, but is added to the composition of the present invention at a concentration of 0.1 to 2%, preferably 0.2 to 1%.
  • the composition of the present invention containing glycerol is preferable when the composition is repeatedly frozen and thawed during storage.
  • composition of the present invention can also be dried by means such as freeze-drying.
  • the composition of the present invention preferably does not contain glycerol.
  • the dry composition of the present invention may be redissolved in water or buffer before use.
  • the composition of the invention does not contain proteins and / or sugars other than hydrolyzed gelatin.
  • "not containing" the above-mentioned component means that the above-mentioned component is not contained at a concentration capable of exerting an effect on the storage stability of the virus, and a small amount of the above-mentioned component is unintentionally contained. The inclusion of the above components is acceptable.
  • the present invention is not particularly limited, but the composition of the present invention does not contain a protein other than hydrolyzed gelatin exceeding 0.1 mg / mL, and a sugar exceeding 0.1 mg / mL.
  • sugar refers to any type of sugar, including monosaccharide, disaccharide, or oligosaccharide forms of carbohydrates, as well as sugar alcohols.
  • sugars include, but are not limited to, sugar derivatives such as trehalose, saccharose, sucrose, glucose, lactose, mannitol, and sorbitol, or amino sugars, such as glucosamine or N-acetylglucosamine.
  • composition of the present invention may be any form, and examples thereof include, but are not limited to, injections, injections, and the like.
  • present invention is provided as an injection in the form of a vaccine.
  • composition of the present invention when formulated as a pharmaceutical composition, it can be administered parenterally.
  • the composition can be administered intravenous tissue (including intratumor) or subcutaneously.
  • the composition When administered systemically, the composition may be in the form of a pyrogen-free, acceptable aqueous solution for parenteral administration.
  • Such pharmaceutically acceptable aqueous solutions can be prepared using techniques in the art, subject to considerable attention to pH, isotonicity, stability and the like.
  • the present invention provides a method for storing herpes simplex virus, which comprises carrying out storage in the form of the composition of the present invention described above.
  • the method of the present invention is particularly suitable as a method for stably preserving herpes simplex virus type 1 and its derivatives.
  • the method for preserving the herpes simplex virus of the present invention comprises a step of preparing the composition of the present invention and a step of preserving the prepared composition.
  • the various components constituting the composition of the present invention are used as a general method in the production of a pharmaceutical composition, preferably aseptic preparation of a pharmaceutical composition. It may be carried out by mixing according to the law.
  • the prepared composition may be stored according to a conventional method and may be carried out under either frozen or non-freezing conditions.
  • the composition may be stored in either a dry state or a liquid state.
  • the composition is preferably stored under non-freezing conditions, more preferably in a liquid state.
  • the storage temperature is, for example, but not limited to, 0 ° C. to 37 ° C., preferably 0 ° C. to 30 ° C., and more preferably 0 ° C. to 20 ° C. Particularly preferably, it is over 0 ° C. to 10 ° C.
  • storage is usually carried out in a shaded environment.
  • herpes simplex virus is stored for 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more. It can be stored for 3 weeks or more, 1 month or more, 2 months or more, 3 months or more, 4 months or more, 5 months or more, or 6 months or more.
  • the composition of the present invention is stored in a suitable container.
  • the container is not particularly limited as long as the composition can be aseptically stored, and examples thereof include well-known containers for storing medicines such as vials, ampoules, and infusion bags.
  • the material may also be appropriately selected according to the type and concentration of the components contained in the composition.
  • the storage method of the present invention does not prevent the composition of the present invention from being frozen and stored for a part of the storage period.
  • the herpes simplex virus is stored, for example, for 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 1 week or more. It can be stored for 2, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 1 month or more, 2 months or more, 3 months or more, 4 months or more, 5 months or more, or 6 months or more.
  • the composition of the present invention that has been cryopreserved after preparation in a liquid state, for example, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 6 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more
  • the method of the present invention is carried out by storing for 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 5 days or more, or 7 days or more.
  • the storage method of the present invention can be used for storage of final preparations containing HSV and intermediate products in the preparation process.
  • the ability to freeze and thaw a formulation or intermediate product without diminishing its potency (or activity) allows for the manufacturing process, dispensing, labeling and packing of the formulation into containers, the distribution process of the formulation, and the formulation of the formulation. Increased flexibility in user handling. Furthermore, it is possible to refreeze and store a preparation or an intermediate product thawed by mistake or a surplus preparation that has not been administered to a patient, which is also useful from the economical point of view.
  • kits containing hydrolyzed gelatin and a low molecular weight compound having an amino group and a carboxyl group and having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain are provided for the storage method of the present invention.
  • the kit may contain other components in addition to hydrolyzed gelatin and low molecular weight compounds having an amino group and a carboxyl group and further having a nitrogen atom capable of accepting a proton in the side chain.
  • Other components are, for example, as described in (1) "Composition" of the present invention.
  • HSV cryopreservation preparation The HSV strain described as HF10 in WO2002 / 092826 International Publication was infected with Vero cells (African green monkey kidney epithelial cells, ATCC No. CRL-1586). HSV was collected and purified from the obtained culture supernatant of infected cells. The resulting HSV was suspended in a solution containing 10% (w / v) glycerol (Merck) and 25 mM Tris (Merck), then dispensed in 1 mL / vial and at -80 ° C. It was cryopreserved. This is referred to as an "HSV cryopreservation preparation". Was dissolved HSV cryopreserved preparations was measured and the infectious titer in TCID50 method, infectious titer was 2.7 ⁇ 10 7 TCID 50 / mL .
  • Example 1 Storage stability test of HSV (1) Preparation and storage of a solution containing HSV 0.13% (w / v) hydrolyzed gelatin (manufactured by Nippi), 0.22 mg / mL L-histidine according to Table 1.
  • Vero cells were grown in RPMI1640 (SIGMA) culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Bioest) and 100 ⁇ g / mL antibiotic streptomycin and 100 Units / mL penicillin (Thermo Fisher Scientific). Vero cells were seeded on 96-well plates the day before sample infection. The stored sample prepared in Example 1- (1) was serially diluted with 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and added to Vero cells for infection. The cells were cultured at a temperature of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • FIG. 1 is a graph showing the cell-killing effect without medium washing, the vertical axis shows the survival rate (%) of cells infected with HSV under each storage condition, and the horizontal axis shows the sample name under each storage condition. is there.
  • "Standard” is a Vero cell that has not been infected with a sample. From FIG. 1, as a method of preserving herpes simplex virus (HSV), 2. HSV + gelatin + histidine, 3. HSV + gelatin + histidine + arginine, 4. HSV + gelatin + gelatin + histidine + glycerol, 5. HSV + gelatin + histidine + arginine + glycerol, 6. HSV + gelatin + arginine, 7.
  • the combination of HSV + gelatin + arginine + glycerol had a cell viability of 60% or less after infection.
  • the compositions of 2 to 6 above have a survival rate of 40% or less and are suitable as a preservation solution composition of HSV.
  • Vero cells were grown in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 100 ⁇ g / mL of the antibiotic streptomycin and 100 Units / mL of penicillin. Vero cells were seeded on 96-well plates the day before sample infection.
  • the stored sample prepared in Example 1- (1) was serially diluted with 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and added to Vero cells for infection. Two hours after the addition, the sample was removed, washed once with PBS, replaced with a culture medium, and cultured at a temperature of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • the culture broth was removed, the cells were washed once with PBS, and then a preparation solution obtained by diluting Premix WST-1 Cell Proflation Assay 10-fold with 10% fetal bovine serum-containing phenol red-free RPMI1640 was added to the wells. Then, the cells were cultured at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5% for 30 minutes. The absorbance at a wavelength of 450 nm after culturing was determined with an absorptiometer. The result is shown in FIG.
  • FIG. 2 is a graph showing the cell-killing effect of HSV after washing the medium, the vertical axis shows the survival rate (%) of the cells infected with HSV under each storage condition, and the horizontal axis shows the sample under each storage condition. It is a name.
  • "Standard" is a Vero cell that has not been infected with a sample.
  • the result of FIG. 2 is the same as the result of FIG. 1.
  • HSV + gelatin + histidine + arginine 4.
  • HSV + gelatin + histidine + glycerol 5.
  • HSV + gelatin + histidine + arginine + glycerol 5.
  • HSV + gelatin + histidine + arginine + glycerol 6.
  • HSV + gelatin + arginine, 7. It was confirmed that the combination of HSV + gelatin + arginine + glycerol had a cell viability of 40% or less after infection,
  • the formulation containing hydrolyzed gelatin provided excellent stability under all evaluated formulation conditions except rHSA. In particular, it was most prominent when stored in a composition containing herpes simplex virus, hydrolyzed gelatin, histidine, and glycerol.
  • the present invention provides a composition containing a herpes simplex virus and a method for preserving the herpes simplex virus using the composition.

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Abstract

本発明は、単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物を提供する。さらに、本発明は、単純ヘルペスウイルスの保存方法であって、（ａ）単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物を調製する工程、及び（ｂ）調製した組成物を保存する工程を含む、単純ヘルペスウイルスの保存方法を提供する。

Description

単純ヘルペスウイルスを含む組成物
　本発明は、単純ヘルペスウイルスを含む組成物に関する。
　単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ；ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス目、ヘルペスウイルス科、アルファヘルペスウイルス亜科、シンプレックスウイルス属に属するウイルスの一種で、ゲノムとして１５０ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡを有する。ＨＳＶには、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）が含まれる。
　単純ヘルペスウイルスはヒトに感染する。ＨＳＶ－１は、初感染症状として、歯肉口内炎、顔面ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、口唇ヘルペス、角膜結膜炎ヘルペス、ヘルペス脳炎を呈する。ＨＳＶ－１の潜伏感染部位は、おもに三叉神経節である。一方、ＨＳＶ－２は、初感染症状として、性器ヘルペスを呈し、回帰感染症状として、性器ヘルペス、新生児ヘルペスを呈する。ＨＳＶ－２の潜伏感染部位は、おもに仙骨部神経節である。
　上記のように、単純ヘルペスウイルスはヒトに対して病原性を有することから、初感染や回帰発症を防ぐワクチンの開発が行われている。一方で、単純ヘルペスウイルスは強い神経指向性や高い殺腫瘍能力を有することより、ワクチンとしての利用のみならず、遺伝子治療やウイルス療法の分野でも、医学的利用が試みられている。
　例えば、癌に対する新たな治療方法として、腫瘍溶解性ウイルスを利用した方法が検討されている。腫瘍溶解性ウイルスとは、正常細胞に過度の損傷を与えることなく腫瘍細胞内で選択的に増殖、拡散し腫瘍細胞を破壊するウイルスの総称である。腫瘍溶解性ウイルスとして、ＨＳＶ、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛痘ウイルスなどの多くのウイルスが研究されているが、腫瘍溶解性ウイルスとして、最も研究および臨床応用が進んでいるのは、ＨＳＶである。
　例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、皮膚およびリンパ節のメラノーマ病変の治療に対し、腫瘍溶解性ウイルス製剤ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ　ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（略称：Ｔ－ＶＥＣ、商品名ＩＭＬＹＧＩＣ）を承認した（非特許文献１）。日本でも、２００３年に名古屋大学の西山らにより報告された、ＨＳＶ－１の突然変異種であるＨＦ１０について、臨床に向けた研究が進められている（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
　これらの利用に供される単純ヘルペスウイルスを含む組成物（以下、ＨＳＶ組成物）は、所望の生物活性（抗原性、感染性、細胞障害活性、等）を保持した状態で保持されなければならない。ウイルス製剤を安定に保存するためには、凍結保存や凍結乾燥保存が一般的である。しかしながら、凍結操作がウイルスに与える影響や投与における利便性の観点からは、液体状態でＨＳＶ組成物を保存する技術が望まれている。
　ＨＳＶ組成物を保存する技術として、さまざまな物質を使用した方法が開発されてきた。そのなかでも、加水分解ゼラチン及び糖を使用した方法がよく知られている。
　ＵＳ４１４７７７２（特許文献２）では、「不活化あるいは弱毒化したウイルス、細胞培養用培地、加水分解ゼラチン、及び糖」を使用することにより、ＨＳＶワクチンを凍結乾燥または液体で安定化する方法を開示している。
　ＵＳ４３３７２４２（特許文献３）では、「不活化あるいは弱毒化したウイルス、細胞培養用培地、加水分解ゼラチン、糖、Ｌ－グルタミン酸、及びＬ－アルギニン」を使用することにより、ＨＳＶワクチンを液体で安定化する方法を開示している。
　ＷＯ２０１６／１００３６４（特許文献４）では、「加水分解ゼラチン、糖、塩化ナトリウム、及びｐＨ７．４のリン酸ナトリウム」を含む組成物による単純ヘルペスウイルスの凍結状態での安定化を開示している。
　このように、ＨＳＶを安定化させるために、様々な組成物が開発されてきたが、ＨＳＶの安定性をさらに改善する製剤の必要性が存在することは明らかである。
ＷＯ２００２／０９２８２６号国際公開パンフレット 米国特許第４１４７７７２号 米国特許第４３３７２４２号 ＷＯ２０１６／１００３６４号国際公開パンフレット
Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２００３；１０，２９２－３０３ Ｈｅｐａｔｏ－Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　２００３；５０：９６１－９６６ Ｆｒｏｎｔ　Ｏｎｃｏｌ．　２０１７；７，１４９
　本発明は、従来のＨＳＶの保存方法が有していた問題を解決しようとするものであり、ＨＳＶの活性を長時間保持するための組成物、及び、該組成物を用いたＨＳＶの保存方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、液体条件下において、ＨＳＶの細胞への感染性を保ったまま、ＨＳＶを長期保存することが可能な組成を見出し、本発明を完成させた。本発明では、単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を少なくとも含む組成物が提供される。なお、本発明の組成物は、凍結条件あるいは乾燥条件下においても、ＨＳＶの細胞への感染性を保ったまま、ＨＳＶを長期保存することが可能である。また、本発明の組成物は、凍結融解の損傷によるウイルスの不活性化も防ぐ。すなわち、凍結融解を繰り返しても、ＨＳＶの細胞への感染性を保ったまま、ＨＳＶを保存することが可能である。
　すなわち、本発明は、
［１］単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物、
［２］低分子化合物が側鎖にアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、［１］に記載の組成物、
［３］塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、［２］に記載の組成物、
［４］組成物がグリセロールを更に含む、［１］～［３］のいずれかに記載の組成物、
［５］組成物が糖を含まない、［１］～［４］のいずれかに記載の組成物、
［６］組成物が液体である、［１］～［５］のいずれかに記載の組成物、
［７］単純ヘルペスウイルスの保存方法であって、
（ａ）単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物を調製する工程、及び
（ｂ）調製した組成物を保存する工程
を含む、単純ヘルペスウイルスの保存方法、
［８］低分子化合物がアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、［７］の保存方法、
［９］塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、［８］に記載の保存方法。
［１０］組成物がグリセロールを更に含む、［７］～［９］のいずれかに記載の保存方法、
［１１］組成物が糖を含まない、［７］～［１０］のいずれかに記載の保存方法、
［１２］（ｂ）工程が、調製した組成物を液体として保存することを特徴とする［７］～［１１］のいずれかに記載の保存方法、
［１３］（ｂ）工程が、調製した組成物を０℃超～１０℃で保存することを特徴とする［７］～［１２］のいずれかに記載の保存方法、
［１４］加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む、単純ヘルペスウイルスを保存するためのキット、
［１５］低分子化合物が側鎖にアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、［１４］に記載のキット、
［１６］塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、［１５］に記載のキット、
［１７］グリセロールを更に含む、［１４］～［１６］のいずれかに記載のキット、
［１８］糖を含まない、［１４］～［１７］のいずれかに記載のキット、
［１９］単純ヘルペスウイルスを液体中で非凍結状態で保存するための、［１４］～［１８］のいずれかに記載のキット、
［２０］単純ヘルペスウイルスを保存するための、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物の使用、
［２１］低分子化合物が側鎖にアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、［２０］に記載の使用、
［２２］塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、［２１］に記載の使用、
［２３］組成物がグリセロールを更に含む、［２０］～［２２］のいずれかに記載の使用、
［２４］組成物が糖を含まない、［２０］～［２３］のいずれかに記載の使用、
［２５］組成物が液体である、単純ヘルペスウイルスを液体中で非凍結状態で保存するための、［２０］～［２４］のいずれかに記載の使用、
に関する。
　本発明により、単純ヘルペスウイルスを含む組成物、及び、該組成物を用いた単純ヘルペスウイルスの保存方法が提供される。本発明の方法によれば、上記組成物は、非凍結（例えば、液体）、凍結あるいは乾燥条件下のいずれにおいても、単純ヘルペスウイルスの細胞への感染性を保ったまま長期保存することができる。本発明により得られる組成物は、例えば、癌治療の為の医療に好適に使用される。従って、本発明は、単純ヘルペスウイルスを取り扱う医療従事者の負担を軽減し、単純ヘルペスウイルスの利便性を向上させるなど、医療分野への多大な貢献が期待される。
実施例１－（２）における、殺細胞効果比較試験（洗浄なし）の結果を示す。 実施例１－（３）における、殺細胞効果比較試験（洗浄あり）の結果を示す。
　以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の「組成物」
　本発明の組成物は、単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる別の窒素原子を有する低分子化合物を含むことを特徴とする。
　「ヘルペスウイルス」とは、ウイルスの一科であるヘルペスウイルス科に属する任意のウイルスをいう。ヘルペスウイルスは、コアタンパクのまわりに分子量８０～１５０×１０６ダルトンの複鎖線状ＤＮＡが１６２個のカプソメアを含み、潜伏感染を特徴とする。ウイルス粒子は直径約１００～２００ｎｍの球状であり、エンベロープ中には直径１００ｎｍ前後の正二十面体状のカプシドがある。ゲノムは二本鎖ＤＮＡであり、そのサイズは、例えば単純ヘルペスウイルス１型が１５２２６０塩基対であり、ＥＢウイルスが１７２２８２塩基対であり、サイトメガロウイルスが２２９４００基塩対である。細胞核内で増殖し、フォイルゲン反応陽性の封入体をつくる。自然宿主、実験動物の皮膚および粘膜などの上皮細胞、中枢神経組織などでよく増殖する。３亜科があり所属ウイルスは次のとおりである：アルファヘルペスウイルス亜科：ヒトヘルペスウイルス－１（単純ヘルペスウイルス１型；ＨＳＶ－１）、ヒトヘルペスウイルス－２（単純ヘルペスウイルス２型；ＨＳＶ－２）、アラートンウイルス（Ａｌｌｅｒｔｏｎ　ｖｉｒｕｓ）、Ｂウイルス（Ｂ　ｖｉｒｕｓ）、ウシ乳頭炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ　ｍａｍｍｉｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＢＭＶ）、ネコ鼻腔気管炎ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＩＬＴ　ｖｉｒｕｓ）、水痘－帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）など；ベータヘルペスウイルス亜科：サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、など；ガンマヘルペスウイルス亜科：ヒトヘルペスウイルス－４（ＨＨＶ－４）、ヒトヘルペスウイルス－８（ＨＨＶ－８）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルスなど。本発明のウイルス構築物は、アルファヘルペスウイルス亜科に由来する。
　本明細書において、「単純ヘルペスウイルス」または「ＨＳＶ」とは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科シンプレックスウイルス属に属する任意のウイルスをいう。単純ヘルペスウイルスは、直径１００～２００ｍｍの大きさで、最外層にはウイルス糖タンパク質を含むエンベロープをもち、その中に正２０面体のカプシドを含む。カプシドとはエンベロープとの間には、テグメントと名づけられる構造体が存在し、多数のウイルスタンパク質が含まれる。カプシドの中心部（コア）には２本鎖線状ＤＮＡ（約１５万基塩基対）が存在する。ゲノムＤＮＡには、少なくとも７４種類の遺伝子が存在し、その半数は、培養細胞での増殖に必須ではない複製非必須遺伝子（アクセサリー遺伝子）である。ゲノムＤＮＡの複製、カプシドの形成は、核内で行われ、ＤＮＡを含んだカプシドは核内膜から出芽することにより核内から細胞質へと輸送される。ＨＳＶとしては、代表的に、１型（ＨＳＶ－１）および２型（ＨＳＶ－２）と名づけられた２つの密接に関連するウイルス種がある。
　本明細書において、特に記載する場合を除き、ＨＳＶは野生型ＨＳＶ及びその派生物を含む。前記の派生物としては野生型とは機能的に異なる変異ＨＳＶが例示され、当該変異ＨＳＶは人為的に（例えば変異原処理や組換えＤＮＡ技術によって）作製された、または自然界で出現したＨＳＶを包含する。機能的に異なるとは、例えば、野生型ＨＳＶの遺伝子機能が増強された、減弱されたもしくは欠損した株や外来遺伝子が導入された株が挙げられる。遺伝子機能が欠損した株には、毒性が減少した「弱毒化ＨＳＶ」、特定の細胞で増殖可能な「制限増殖型ＨＳＶ」、細胞との親和性が改変された「細胞親和性改変型ＨＳＶ」が包含される。
　本発明に利用できるＨＳＶは、好適には、ＨＳＶ－１である。
　本発明は、感染性を必要とする治療用ＨＳＶを好適に使用することができる。治療用ＨＳＶとしては、ワクチンとして使用可能なＨＳＶや癌治療薬として有用な腫瘍溶解性ＨＳＶが例示される。
　腫瘍溶解性ＨＳＶとしては、腫瘍組織内で選択的に増殖し腫瘍を破壊する性質を有するものであればよく、自然発生的に選択的腫瘍溶解性を獲得したＨＳＶ、人為的に選択的腫瘍溶解性を付与されたＨＳＶのいずれであっても本発明に使用することができる。本発明には公知の腫瘍溶解性ＨＳＶを使用することができ、特に本発明を限定するものではないが、例えばｃａｎｅｒｐａｔｕｒｅｖ、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ　ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、Ｇ４７Δが挙げられる。
　本明細書において「ｃａｎｅｒｐａｔｕｒｅｖ（略称：Ｃ－ＲＥＶ）」とは、ＷＯ２００２／０９２８２６号国際公開パンフレット、Ｈｅｐａｔｏ－Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　２００３；５０：９６１－９６６、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　Ｉｎｆｅｃｔ．　２００７；１－８、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．　２００８　Ｊｕｎ；８（３）：２０８－２１あるいはＦｒｏｎｔ　Ｏｎｃｏｌ．　２０１７；７，１４９等で報告されている、ＨＳＶ－１の自然変異株ＨＦ１０である。
　本明細書において「ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ　ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（略称：Ｔ－ＶＥＣ）」とはＧｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２００３；１０，２９２－３０３で報告されているＨＳＶであり、遺伝子組換え１型単純ヘルペスウイルス（ＪＳ１／ＩＣＰ３４．５－／ＩＣＰ４７－／ｈＧＭ－ＣＳＦ）とも表示される。
　本明細書においてＧ４７ΔとはＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２００１，　９８　（１１）：６３９６－４０１で報告されている、ＨＳＶ－１の遺伝子を改変して作製された腫瘍溶解性ウイルスである。
　本発明の組成物は、当該組成物中に含まれるＨＳＶの細胞への感染活性を長期間に渡り保持するためのものである。言い換えれば、本発明は、所望のＨＳＶをそれが保存前に有していた活性や性質を保持したまま保存できる組成物を提供する。本発明の組成物は、非凍結、凍結あるいは乾燥状態のいずれでもよいが、非凍結状態であることが好ましく、特に本発明を限定するものではないが、例えば液体の組成物が好適である。ここで、「液体」は「溶液」と同義であり、「液体状態」、「液体形状」、「溶液状態」、「溶液形状」と言い換えることもできる。
　本発明の組成物において、ＨＳＶの量は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、加水分解ゼラチンの種類や濃度、アミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物の種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。ＨＳＶの濃度として、特に限定されないが、少なくとも１×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、好ましくは、少なくとも２×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも５×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも１×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも２×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも５×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも１×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも２×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも５×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも１×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、少なくとも２×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または少なくとも５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬを超えて存在する。適切な量は、使用する状況に応じて変動し、当業者であれば、組成物中に存在する活性成分の状態などにより応じて適宜決定することができる。
　ＨＳＶの製造方法は特に限定されない。ＨＳＶの製造方法は、いかなる方法であってもよい。一般的には、ＨＳＶを適切な宿主細胞に感染させて得られた感染細胞を培養した後、培養液上清及び／又は感染細胞破砕物をウイルス含有試料として得ることができる。これらのウイルス含有試料を公知のウイルス精製操作に供することにより、精製されたＨＳＶを得ることができる。
　加水分解ゼラチンは、生物の皮、骨、鱗などに含まれるコラーゲンを抽出し、さらに加水分解により低分子化したものである。加水分解は、熱による処理、酵素消化による処理、酸による処理、アルカリによる処理、もしくはこれらの組み合わせで実施することができる。本発明の組成物に含まれる加水分解ゼラチンは、好適にはブタ由来である。本発明の組成物は、１種または２種以上の加水分解ゼラチンを含んでいてもよい。また、加水分解の手段としては、酵素消化による処理が好ましく、免疫原性の観点から、加水分解産物の平均分子量は１００００以下であることが好ましい。本発明においては、ニッピ社製の加水分解ゼラチンを好適に使用することができる。
　本発明の組成物に含まれる加水分解ゼラチンの濃度は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、ＨＳＶの種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。加水分解ゼラチンの濃度として、特に限定されないが、０．０００１～１０％（ｗ／ｖ）、０．０００５～５％（ｗ／ｖ）、０．００１～２．５％（ｗ／ｖ）、０．００５～１％（ｗ／ｖ）、０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）、０．０５～０．２５％（ｗ／ｖ）、又は０．１～０．１５％（ｗ／ｖ）が例示される。
　低分子化合物は、例えば、分子量２０００以下、または１５００以下の化合物である。本発明の組成物に含まれる「アミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物」は、側鎖にアミノ基あるいは窒素原子－炭素原子－窒素原子の構造を含む低分子化合物が好ましく、例えば側鎖にアミノ基や炭素原子を挟んで２つ以上の窒素原子が含まれる構造、例えば塩基性アミノ酸、さらに例えば、側鎖にアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸が好適に使用できる。塩基性アミノ酸としては、例えば、リシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択することができる。本発明の組成物に含まれる前記の低分子化合物は、好ましくは１種類のみが含まれる。また、本発明では、アミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物は、それらの塩（例えば塩酸塩）や水和物の形態のものを使用してもよく、例えば当該低分子化合物の塩基性を弱めた塩形態、あるいは水溶性を上げるための塩形態等のいずれもが含まれる。また、前述の低分子化合物は、本発明の効果が得られるものであれば、Ｌ体、Ｄ体又はＤＬ体のいずれであってもよい。特に限定はされないが例えば、Ｌ体、Ｄ体又はＤＬ体のいずれかの塩基性アミノ酸であってもよく、例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジンが好ましい。本発明の組成物は、１種または２種以上の前記低分子化合物を含んでいてもよい。
　例えば、本発明の組成物に含まれる前記低分子化合物の濃度は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、ＨＳＶの種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。例えば、塩基性アミノ酸であるヒスチジンを使用する場合、その濃度として、特に限定されないが、０．０１～２ｍｇ／ｍＬ、０．０２～１．５ｍｇ／ｍＬ、０．０３～１ｍｇ／ｍＬ、０．０４～０．７ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．１５～０．３ｍｇ／ｍＬ、又は０．２～０．２５ｍｇ／ｍＬが例示される。
　ＨＳＶ、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を溶媒中で混合することにより、本発明の組成物が調製される。ＨＳＶ、加水分解ゼラチン、及び前記の低分子化合物を混合する溶媒の例として、限定するものではないが、水およびバッファーが挙げられる。好ましくは、本発明の組成物の溶媒としては、蒸留水、滅菌水、注射用蒸留水等が使用される。
　本発明の組成物は、さらに緩衝成分を含むことが好ましい。本発明において「緩衝成分」は、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。本発明の組成物に含まれる緩衝成分として、特に限定はないが、例えば、トリス、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特にトリス、ビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩が緩衝成分として本発明に好適である。また、本発明の組成物に含まれる緩衝成分の濃度は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、ヘルペスウイルスの種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。
　本発明を特に限定しないが、本発明の組成物のｐＨは、例えばｐＨ６．０～１０．０、好ましくはｐＨ６．５～９．５、さらに好ましくはｐＨ７．０～９．０、の範囲に設定されるのが適当である。本発明の組成物のｐＨは、本発明の効果を奏し得る範囲であれば、特に限定されず、ＨＳＶの種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。
　例えば、本発明の組成物は、トリス緩衝液を含んでもよい。本発明における好適なトリス緩衝液の組成は、１～１００ｍＭ、好ましくは２～５０ｍＭ、さらに好ましくは５～２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２～８．０）である。
　本発明の組成物は、ＨＳＶ、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物に加えて、その他の成分を含有していてもよい。その一方で、糖は含まないことが望ましい。本発明の組成物の組成は、本発明の効果を奏し得る組成であれば、特に限定はない。ＨＳＶの種類や濃度、加水分解ゼラチンの種類や濃度、塩基性アミノ酸の種類や濃度、及びその他の成分の種類や濃度はその使用目的や保存温度等を考慮して適宜決定することができる。
　本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、安定剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、緩衝剤、等張化剤および／または薬学的アジュバント。
　本発明の組成物はグリセロールを含んでいてもよい。グリセロールを含む場合、特に本発明を限定するものではないが、０．１～２％、好ましくは０．２～１％の濃度で本発明の組成物に添加される。例えば、グリセロールを含む本発明の組成物は、保存中に該組成物の凍結融解を繰り返す場合に好ましい。
　本発明の組成物は、凍結乾燥等の手段により乾燥物とすることもできる。この場合、本発明の組成物は好ましくはグリセロールを含まない。乾燥状態の本発明の組成物は、使用する前に水や緩衝液で再溶解すればよい。
　当業者は、日本薬局方、米国薬局方、その他対応する他の国の薬局方、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照することによって、容易に薬学的に受容可能なキャリアを選択することができる。
　本発明の好適な態様においては、本発明の組成物は加水分解ゼラチン以外のタンパク質及び／又は糖を含有しない。ここで、前記の成分を「含有しない」とは、前記成分をウイルスの保存安定性に効果を発揮しうるような濃度で含有しないことを意味し、意図せず含まれることとなった微量の前記成分の含有については許容される。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物は０．１ｍｇ／ｍＬを超える加水分解ゼラチン以外のタンパク質、ならびに０．１ｍｇ／ｍＬを超える糖を含有しない。
　本明細書において、「糖」とは、任意のタイプの糖を指し、すなわち炭水化物の単糖、二糖、またはオリゴ糖形態、ならびに糖アルコールを包含する。糖の例として、トレハロース、サッカロース、スクロース、グルコース、ラクトース、マンニトール、およびソルビトール、またはアミノ糖などの糖誘導体、例えばグルコサミンもしくはＮ－アセチルグルコサミンが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の組成物の形態はどのようなものでもよく、例えば、注射剤、注入剤、などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、ワクチンのような形態にした注射剤として本発明は提供される。
　本発明の組成物が、薬学的組成物として処方される場合、非経口的に投与され得る。あるいは、組成物は、静脈内組織内（腫瘍内を含む）または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、組成物は、発熱物質を含まない、非経口的投与に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な水溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当該分野の技術を用いて調製され得る。
（２）本発明の「方法」
　本発明は、前記の本発明の組成物の形態で保存を実施することを特徴とする、単純ヘルペスウイルスの保存方法を提供する。本発明の方法は特に単純ヘルペスウイルス１型ならびにその派生物を安定に保存する方法として好適である。
　本発明の単純ヘルペスウイルスの保存方法は、本発明の組成物を調製する工程、ならびに調製した組成物を保存する工程からなる。本発明の組成物を調製する工程は、前記の、本発明の組成物を構成する各種の成分を、薬学的組成物の製造における一般的な手法、好ましくは無菌的な薬学的組成物の製造法に従って混合することにより、実施すればよい。調製した組成物の保存は、常法に従って行えばよく、凍結または非凍結条件下のいずれで実施されてもよい。また、当該組成物は乾燥または液体状態のいずれで保存されてもよい。当該組成物は、好ましくは非凍結条件下、さらに好ましくは液体状態で保存される。当該組成物を液体状態で保存する場合、保存温度は、例えば、限定するものではないが、０℃超～３７℃、好ましくは０℃超～３０℃、さらに好ましくは０℃超～２０℃、特に好ましくは０℃超～１０℃である。また、通常は遮光した環境下で保存が実施される。本発明の保存方法によれば、単純ヘルペスウイルスを例えば、１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、又は６か月以上保存することができる。
　本発明の組成物は適切な容器に封入して保存される。組成物を無菌的に保存できるものであれば容器には特に限定はないが、例えばバイアル、アンプル、輸液用バッグ等、医薬保存用の容器として周知のものが例示される。その材質も、組成物に含有される成分の種類や濃度に応じて適切に選択すればよい。
　なお、本発明の保存方法は、保存期間の一部において本発明の組成物を凍結させて保存することを妨げない。本発明の組成物を凍結させて保存する場合、単純ヘルペスウイルスを例えば、１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、又は６か月以上保存することができる。一つの態様としては、調製後に凍結保存された本発明の組成物を溶解した後、液体状態で例えば１時間以上、２時間以上、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、５日以上、又は７日以上保存することにより、本発明の方法が実施される。
　本発明の保存方法は、ＨＳＶを含有する最終製剤及び製剤製造過程における中間生成物の保存に利用することができる。効力（又は活性）を低下させることなく製剤又は中間生成物を凍結及び融解できることにより、製造の過程、製剤の容器への分注・ラベリング・梱包の各作業、製剤の流通の過程、及び製剤の使用者の取り扱いにおける柔軟性が向上する。さらに、過失により融解した製剤又は中間生成物や、患者に投与されなかった余剰の製剤を再凍結して保存することが可能となり、経済性の面からも有用である。
　さらに、本発明の保存方法のための、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含むキットが提供される。該キットは、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物に加えて、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、例えば、（１）本発明の「組成物」において記載したとおりである。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
調製例１　ＨＳＶ凍結保存製剤の調製
　ＷＯ２００２／０９２８２６号国際公開パンフレットにＨＦ１０として記載されたＨＳＶ株をＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１５８６）に感染させた。得られた感染細胞の培養上清よりＨＳＶを採取・精製した。得られたＨＳＶを、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール（Ｍｅｒｃｋ社製）と２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（Ｍｅｒｃｋ社製）とを含む溶液中で懸濁した後、１ｍＬ／バイアルで分注し、－８０℃で凍結保存した。これを、「ＨＳＶ凍結保存製剤」と称する。ＨＳＶ凍結保存製剤を溶解し、その感染力価をＴＣＩＤ５０法で測定したところ、感染力価は２．７×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。
実施例１　ＨＳＶの保存安定性試験
（１）ＨＳＶを含む溶液の調製及び保存
　表１に従い、０．１３％（ｗ／ｖ）加水分解ゼラチン（ニッピ社製）、０．２２ｍｇ／ｍＬ　Ｌ－ヒスチジン（富士フィルム和光純薬社製）、０．４ｍｇ／ｍＬ　Ｌ－アルギニン塩酸塩（富士フィルム和光純薬社製）、１％（ｗ／ｖ）グリセロール（ＳＩＧＭＡ社製）、及び１ｍｇ／ｍＬ　ｒＨＳＡ（組換え体ヒト血清アルブミン、バイオベルデ社製）を含む又は含まない、溶液を調製した。なお、調製した全ての溶液は、緩衝成分として１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５（ニッポンジーン社製）を含む。調製したそれぞれの溶液を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に２００μＬ／ウェルで分注（Ｎ＝６）した後、調製例１のＨＳＶ凍結保存製剤（２．７×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）の溶解液を２０μＬ／ウェルで添加して撹拌した。また、上記化合物の細胞毒性を確認するための対照として、ＨＳＶを含まない条件も設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ポリプロピレン製プレート粘着シール（Ｗａｔｓｏｎ社製）で封をした後、３５℃で４日間保存する加速試験を実施した。保存後のＨＳＶの感染力価を、以下の殺細胞効果比較試験（洗浄なし、及び、洗浄あり）にて求めた。
（２）殺細胞効果比較試験（洗浄なし）
　１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、ならびに抗生物質ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ及びペニシリン１００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製）培養培地中でＶｅｒｏ細胞を増殖させた。試料感染前日にＶｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに播種した。実施例１－（１）で調製した、保存後の試料を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５を用いて系列希釈し、Ｖｅｒｏ細胞に添加感染させた。温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養４日後に培養液を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄後、Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ－１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（タカラバイオ社製）を１０％ウシ胎児血清含有フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて１０倍希釈した調製液をウェルに添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で３０分培養した。培養後の波長４５０ｎｍにおける吸光度を吸光度計（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて求めた。その結果を図１に示す。
　すなわち図１は、培地洗浄なしにおける殺細胞効果を示すグラフであり、縦軸は各保存条件におけるＨＳＶを感染させた細胞の生存率（％）を示し、横軸は各保存条件におけるサンプル名称である。図１中、「Ｓｔａｎｄａｒｄ」は、試料を感染させていないＶｅｒｏ細胞である。図１から、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の保存方法としては、２．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン、３．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋アルギニン、４．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋グリセロール、５．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋アルギニン＋グリセロール、６．ＨＳＶ＋ゼラチン＋アルギニン、７．ＨＳＶ＋ゼラチン＋アルギニン＋グリセロール、の組み合わせがいずれも感染後の細胞生存率６０％以下であった。特に上記２～６の組成は、生存率４０％以下であり、ＨＳＶの保存液組成として好適であることを確認した。
（３）殺細胞効果比較試験（洗浄あり）
　保存溶液自体の影響を排除するため、Ｖｅｒｏ細胞への試料添加２時間後に、試料を除去し、洗浄する工程を追加した。
　１０％ウシ胎児血清、ならびに抗生物質ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ及びペニシリン１００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬを補充したＲＰＭＩ１６４０培養培地中でＶｅｒｏ細胞を増殖させた。試料感染前日にＶｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに播種した。実施例１－（１）で調製した、保存後の試料を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５を用いて系列希釈し、Ｖｅｒｏ細胞に添加感染させた。添加２時間後、試料を除去してＰＢＳで１回洗浄し、培養培地に置換して、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養４日後に培養液を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄後、Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ－１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙを１０％ウシ胎児血清含有フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０にて１０倍希釈した調製液をウェルに添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で３０分培養した。培養後の波長４５０ｎｍにおける吸光度を吸光度計にて求めた。その結果を図２に示す。
　すなわち図２は、培地洗浄後のＨＳＶの殺細胞効果を示すグラフであり、縦軸は各保存条件におけるＨＳＶを感染させた細胞の生存率（％）を示し、横軸は各保存条件におけるサンプル名称である。図２中、「Ｓｔａｎｄａｒｄ」は、試料を感染させていないＶｅｒｏ細胞である。図２の結果は、図１の結果と同様に２．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン、３．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋アルギニン、４．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋グリセロール、５．ＨＳＶ＋ゼラチン＋ヒスチジン＋アルギニン＋グリセロール、６．ＨＳＶ＋ゼラチン＋アルギニン、７．ＨＳＶ＋ゼラチン＋アルギニン＋グリセロール、の組み合わせがいずれも感染後の細胞生存率４０％以下であり、ＨＳＶの保存液組成として好適であることを確認した。
　加水分解ゼラチンを含有する配合物は、ｒＨＳＡを除く評価した全ての配合条件で優れた安定性をもたらした。特に、単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、ヒスチジン、及びグリセロールを含む組成物で貯蔵した場合に最も顕著であった。
　本発明により、単純ヘルペスウイルスを含む組成物、及び、該組成物を用いた単純ヘルペスウイルスの保存方法が提供される。

Claims (13)

  1. 　単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらに側鎖にプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物。
  2. 　低分子化合物が側鎖にアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
  4. 　組成物がグリセロールを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　組成物が糖を含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　組成物が液体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　単純ヘルペスウイルスの保存方法であって、
    （ａ）単純ヘルペスウイルス、加水分解ゼラチン、及びアミノ基とカルボキシル基を有し、さらにプロトンを受容できる窒素原子を有する低分子化合物を含む組成物を調製する工程、及び
    （ｂ）調製した組成物を保存する工程
    を含む、単純ヘルペスウイルスの保存方法。
  8. 　低分子化合物がアミノ基、グアニジル基又はイミダゾール基を有する塩基性アミノ酸である、請求項７に記載の保存方法。
  9. 　塩基性アミノ酸がリシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される、請求項８に記載の保存方法。
  10. 　組成物がグリセロールを更に含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の保存方法。
  11. 　組成物が糖を含まない、請求項７～１０のいずれか一項に記載の保存方法。
  12. 　（ｂ）工程が、調製した組成物を液体として保存することを特徴とする請求項７～１１のいずれか一項に記載の保存方法。
  13. 　（ｂ）工程が、調製した組成物を０℃超～１０℃で保存することを特徴とする請求項７～１２のいずれか一項に記載の保存方法。
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