WO2022158097A1 - ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物 - Google Patents

ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物 Download PDF

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gelatin
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克郎 萩原
昌孝 井田
陽介 平岡
カジ フランソワ マリ ンガコ
知希 小谷
啓司 塚本
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新田ゼラチン株式会社
学校法人酪農学園
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Definitions

  • the present invention relates to virus stabilizers, gelatin hydrolysates for virus stabilizers, and virus-containing compositions.
  • Patent Document 1 discloses a refrigerator-stable influenza virus composition that is stable at refrigeration temperatures (eg, 2-8°C).
  • Patent Document 1 discloses that a composition containing 0.5 to 2% gelatin hydrolyzate and the like achieves stable storage and transportation of influenza virus strains at refrigeration temperatures. However, Patent Document 1 does not disclose whether or not stable storage and transportation of the virus strain can be achieved at room temperature around 25°C. According to Patent Document 1, since the gelatin hydrolyzate is obtained from porcine type A gelatin having an isoelectric point of about 9, the gelatin hydrolyzate strongly interacts with specific proteins on the virus surface. It is presumed that this makes it difficult to stably store and transport the virus at room temperature.
  • the present invention provides a virus-containing formulation, etc., without the need for a refrigeration apparatus, etc., by suppressing the decline in the ability of the virus at both the refrigeration temperature (2 to 8 ° C.) and the room temperature around 25 ° C.
  • An object of the present invention is to provide a virus stabilizer, a gelatin hydrolyzate for the virus stabilizer, and a virus-containing composition that enable storage and transportation of the virus.
  • the present inventors arrived at the present invention as a result of diligent studies. That is, attention was first focused on a gelatin hydrolyzate obtained by hydrolyzing gelatin having an isoelectric point of pH around 5 so as to have a predetermined weight-average molecular weight. Furthermore, when the virus is contained in a preparation containing the gelatin hydrolyzate at a predetermined concentration, the reduction in virus ability such as infectivity is suppressed both at refrigerated temperatures (2 to 8°C) and at room temperature around 25°C. The inventors have found that the virus-containing preparations can be stably stored and transported without the need for a freezer or the like, and have completed the present invention.
  • the present invention has the following features.
  • the virus stabilizer according to the present invention is a virus stabilizer comprising a gelatin hydrolyzate and an aqueous medium, and the virus stabilizer contains the gelatin hydrolyzate in an amount of 1% by mass or more and 20% by mass. % or less, the gelatin hydrolyzate has a weight average molecular weight of 10000 or less, and the gelatin hydrolyzate has an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the gelatin hydrolyzate preferably has a weight-average molecular weight of 6,000 or less.
  • the gelatin hydrolyzate is preferably a hydrolyzate of alkali-treated gelatin.
  • the virus stabilizer preferably contains more than 2% by mass and 10% by mass or less of the gelatin hydrolyzate.
  • the aqueous medium preferably contains a salt having a buffering action.
  • the aqueous medium preferably contains at least one sugar selected from the group consisting of sucrose, lactose, sorbitol, inositol, trehalose, mannitol, maltitol, xylitol, erythritol and glycerol.
  • the aqueous medium preferably contains at least one amino acid selected from the group consisting of methionine, arginine, tryptophan, glutamine and glutamic acid.
  • the hydrolyzate of gelatin for a virus stabilizer according to the present invention has a weight average molecular weight of 10000 or less and an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the gelatin hydrolyzate for virus stabilizer is preferably liquid or powder.
  • a virus-containing composition according to the present invention comprises the virus stabilizer and a virus.
  • the virus preferably contains at least one selected from the group consisting of enveloped DNA viruses, non-enveloped DNA viruses, enveloped RNA viruses and non-enveloped RNA viruses.
  • the virus is preferably gene-introduced.
  • the virus-containing composition has a difference of 1 between the logarithmic reduction in virus titer when stored at 25°C for 21 days and the logarithmic reduction in virus titer when stored at -80°C for 21 days. 0.5 log or less is preferred.
  • the virus-containing composition has a difference of 1 between the logarithmic reduction in virus titer when stored at 4°C for 210 days and the logarithmic reduction in virus titer when stored at -80°C for 210 days. .0 log or less is preferred.
  • the virus-containing composition preferably exhibits a logarithmic reduction in virus titer of 0.3 log or less when freeze-thaw is repeated three times.
  • Virus-stabilizing agents, gelatin hydrolysates for virus-stabilizing agents, and virus-containing compositions can be provided.
  • the notation of the format “A to B” means the upper and lower limits of the range (that is, A to B or less), and when there is no unit description in A and only a unit is described in B , the units of A and B are the same.
  • virus titer refers to the lowest concentration at which the virus in the sample (herein, “virus-containing composition”) can infect cells, ie, the highest dilution factor.
  • “reduction” in virus titer means that the above-mentioned dilution rate is reduced, and means that the above-mentioned minimum concentration at which infection is possible is increased.
  • gelatin may be used when referring to the substance name, gelatin gel, and gelatin solution, respectively.
  • gelatin hydrolyzate may also be used to refer to a gelatin hydrolyzate solution in the same manner as the gelatin described above.
  • the virus stabilizer according to this embodiment is a virus stabilizer comprising a gelatin hydrolyzate and an aqueous medium.
  • the virus stabilizer contains 1% by mass or more and 20% by mass or less of the gelatin hydrolyzate.
  • the gelatin hydrolyzate has a weight average molecular weight of 10,000 or less.
  • the gelatin hydrolyzate has an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the virus stabilizers include gelatin hydrolysates as described above.
  • gelatin hydrolyzate refers to a peptide aggregate (hydrolyzate) obtained by hydrolyzing both or either one of gelatin and collagen. That is, “gelatin hydrolyzate” means the equivalent of an assembly of peptides commonly referred to as collagen peptides or collagen hydrolysates.
  • the gelatin hydrolyzate contained in the virus stabilizer according to the present embodiment has the weight average molecular weight and isoelectric point pH as described above.
  • the gelatin hydrolyzate means an assembly of peptides as described above, it has the same characteristics as collagen and gelatin, such as having a primary structure in which glycine is repeated every three residues in the amino acid sequence that constitutes the peptide chain. have.
  • the term "gelatin” means a polypeptide in which the triple helical structure of collagen is unwound by heat denaturation, acid denaturation, or the like, chemical modifications thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • collagen derived from at least one selected from the group consisting of Groups 1 to 6 below is subjected to conventionally known treatments such as degreasing treatment, decalcification treatment, acid or alkali treatment, and hot water extraction treatment. It can be obtained by applying the treatment of Gelatin may be a polypeptide obtained by fermentation using microorganisms, a recombinant polypeptide obtained by chemical synthesis or genetic recombination, or a synthesized polypeptide.
  • collagen refers to proteins derived from the extracellular matrix in the skin of vertebrates, which are classified into Groups 1 to 6 below.
  • Collagen has a right-handed helical structure consisting of three peptide chains, and the amino acid residues constituting the peptide chain have a primary structure in which glycine residues are repeated every three residues (so-called collagen-like sequence). have.
  • Group 1 Group consisting of hide, skin, bone, cartilage and tendon of cattle
  • Group 2 Group consisting of hide, skin, bone, cartilage and tendon of pig
  • Group 3 Hide, skin, bone, cartilage and tendon of sheep
  • Group 4 Group consisting of chicken skin, skin, bones, cartilage and tendons
  • Group 5 Group consisting of ostrich skin, skin, bones, cartilage and tendons
  • Group 6 Fish bones, skin and scales The group consisting of
  • the "chemically modified form" of the above polypeptide (gelatin) means a polypeptide in which the amino group, carboxyl group, hydroxy group, thiol group, etc. of the amino acid residues constituting gelatin are chemically modified.
  • Chemically modified gelatin can change its solubility in water, isoelectric point, and the like. Specifically, chemical modifications such as O-acetylation can be carried out on the hydroxy groups of hydroxyproline residues in gelatin. Chemical modifications such as esterification and amidation can be performed on the ⁇ -carboxyl group of glycine residues in gelatin.
  • Chemical modification of the hydroxy group of a hydroxyproline residue can be carried out, for example, by O-acetylation, such as by reacting acetic anhydride in an aqueous or non-aqueous solvent.
  • O-acetylation such as by reacting acetic anhydride in an aqueous or non-aqueous solvent.
  • esterification can be carried out, such as by bubbling dry hydrogen chloride gas after suspension in methanol.
  • amidation can be carried out by the action of carbodiimide or the like.
  • the "derivatives" of the above polypeptide include gelatin derivatives obtained by introducing functional groups into gelatin, copolymers of gelatin with lactic acid, glycolic acid, etc., and copolymers of gelatin with polyethylene glycol and propylene glycol. etc. may be included.
  • gelatin derivatives include derivatives obtained by introducing functional groups such as guanidyl groups, thiol groups, amino groups, carboxyl groups, sulfate groups, phosphoric acid groups, alkyl groups, acyl groups, phenyl groups, and benzyl groups into gelatin. be able to.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” of the above polypeptide (gelatin) means a salt that is pharmaceutically acceptable and has the desired activity (eg, gelling ability) of the original polypeptide (gelatin).
  • Pharmaceutically acceptable salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, phosphates and hydrobromides, acetates, methanesulfonates, benzenesulfonates, p-toluenesulfonates. , organic acid salts such as succinate, oxalate, fumarate and maleate; inorganic base salts such as sodium, potassium and calcium salts; and organic base salts such as triethylammonium salt. can.
  • a specific peptide in gelatin can be converted into a pharmaceutically acceptable salt according to a conventional method.
  • gelatin is a polypeptide derived from collagen that many organisms possess, it has excellent biocompatibility. Therefore, a gelatin hydrolyzate obtained by hydrolyzing the above collagen and gelatin also has excellent biocompatibility and is suitable as one component of a virus stabilizer for medical use.
  • the term "sol” means a dispersion system comprising a dispersoid and a dispersion medium, in which the dispersion medium is liquid.
  • “Gel” means a state in which the dispersoids form a crosslinked structure in a dispersion system composed of dispersoids and a dispersion medium, and the dispersion system as a whole loses fluidity.
  • a gelatin hydrolyzate is obtained by hydrolyzing either or both gelatin and collagen as described above.
  • “hydrolysis” includes hydrolysis using acids, hydrolysis using bases, hydrolysis using enzymes, and hydrolysis using heat. From the viewpoint of preventing contamination with impurities, the gelatin hydrolyzate is preferably obtained by hydrolysis using heat.
  • the enzyme include collagenase, thiol protease, serine protease, acid protease, alkaline protease, metalloprotease, and the like. The above enzymes can be used singly or in combination.
  • Examples of the thiol protease include plant-derived chymopapain, papain, bromelain, ficin, animal-derived cathepsin, calcium-dependent protease, and the like.
  • Examples of the serine protease include trypsin, cathepsin D, and the like.
  • Examples of the acid protease include pepsin and chymotrypsin.
  • Non-pathogenic microorganisms from which the above enzymes are derived include Bacillus iicheniforms, Bacillus subtillis, Aspergillus oryzae, Streptomyces, Bacillus amyloliquefaciens, and the like.
  • an enzyme derived from one of the above-described non-pathogenic microorganisms may be used, or a plurality of types of enzymes derived from the above-described non-pathogenic microorganisms may be used in combination.
  • a conventionally known method may be used as a specific method for enzymatic treatment.
  • the enzyme is preferably not collagenase. This is because when the above gelatin is hydrolyzed with collagenase alone, a specific peptide having an amino acid sequence with glycine at the N-terminus may be the main component (more than 50% by mass).
  • the above-mentioned gelatin hydrolyzate is an aggregate composed of two or more peptides, and the above-mentioned specific peptide is less than 50% by mass in its composition.
  • a gelatin hydrolyzate can be obtained as a liquid by hydrolyzing both or either one of gelatin and collagen by the method described above, followed by purification. Furthermore, it is also possible to obtain a powder by heat-drying or freeze-drying the above liquid by a known means.
  • the virus stabilizer contains 1% by mass or more and 20% by mass or less of the gelatin hydrolyzate.
  • concentration of the gelatin hydrolyzate contained in the virus stabilizer is less than 1% by mass, a decrease in virus titer is suppressed when a virus-containing composition containing the virus stabilizer and virus is constructed. Since the action becomes insignificant, it becomes difficult to achieve the desired effect. If the concentration of the gelatin hydrolyzate contained in the virus stabilizer exceeds 20% by mass, the virus stabilizer may deteriorate in operability.
  • the virus stabilizer preferably contains more than 2% by mass and 10% by mass or less of the gelatin hydrolyzate from the viewpoint of further suppressing a decrease in virus titer.
  • concentration of the gelatin hydrolyzate in the virus stabilizer can be measured by a known method such as hydroxyproline determination.
  • the gelatin hydrolyzate has a weight average molecular weight of 10,000 or less.
  • the gelatin hydrolyzate preferably has a weight-average molecular weight of 6,000 or less. More preferably, the gelatin hydrolyzate has a weight-average molecular weight of 5,000 or less.
  • the virus stabilizer can maintain a sol state in an environment of about 2 to 30°C.
  • the gelatin hydrolyzate in the composition can suppress virus aggregation, thereby suppressing a decrease in virus titer. can do.
  • the gelatin hydrolyzate can protect the surface of the virus by covering it because it is possible to interact with the surface of the virus with moderate strength regardless of the presence or absence of the virus. be.
  • the gelatin hydrolyzate has a weight-average molecular weight of more than 10,000, it may gel at 2-8°C.
  • the lower limit of the weight-average molecular weight of the gelatin hydrolyzate is not particularly limited, but is, for example, 75, which is the molecular weight of glycine.
  • the weight average molecular weight of the gelatin hydrolyzate can be determined by performing gel filtration chromatography under the following measurement conditions.
  • Equipment high performance liquid chromatography (HPLC) (manufactured by Tosoh Corporation) Column: TSKGel® G2000SW XL Column temperature: 30°C Eluent: 40 wt% acetonitrile (containing 0.05 wt% TFA) Flow rate: 0.5mL/min Injection volume: 10 ⁇ L Detection: UV220nm
  • Molecular weight marker Use the following three types Cytochrom C Mw: 12384 Aprotinin Mw: 6512 Bacitracin Mw: 1423.
  • the weight-average molecular weight of the gelatin hydrolyzate can be obtained by measuring the substance to be measured under the gel filtration chromatography conditions described above.
  • the gelatin hydrolyzate has an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the pH of the isoelectric point of the gelatin hydrolyzate is preferably from 4.0 to 5.5, more preferably from 4.0 to 4.8.
  • a gelatin hydrolyzate having an isoelectric point pH in such a range is obtained by hydrolyzing alkali-treated collagen or gelatin obtained from alkali-treated collagen (so-called alkali-treated gelatin). It can be efficiently obtained by hydrolysis. That is, the gelatin hydrolyzate is preferably a hydrolyzate of alkali-treated gelatin.
  • the gelatin hydrolyzate is preferably a hydrolyzate of alkali-treated gelatin having an isoelectric point of about pH 4.8 to 5.5.
  • gelatin obtained by treating collagen with an inorganic acid is called acid-treated gelatin
  • gelatin obtained by treating collagen with an inorganic base is called alkali-treated gelatin.
  • Alkali-treated gelatin can be specifically obtained by treating collagen with an inorganic base such as sodium hydroxide, calcium hydroxide or potassium hydroxide.
  • Acid-treated gelatin has an isoelectric point of pH 8-9.
  • alkali-treated gelatin has an isoelectric point pH of 4.0 to 7.0. Examples of such alkali-treated gelatin include pig skin-derived alkali-treated gelatin (trade name: "beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H", manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.).
  • a virus-containing composition is composed of a virus stabilizer containing a gelatin hydrolyzate having an isoelectric point pH within the above range and a virus
  • the gelatin hydrolyzate in the composition causes the virus to aggregate. can be suppressed, thereby suppressing a decrease in virus titer.
  • the gelatin hydrolyzate having an isoelectric point pH in such a range has relatively more negative charges than positive charges in the molecule, so as a whole Although it exhibits a negative charge, it will have both positively charged and negatively charged sites. Therefore, the gelatin hydrolyzate exhibits a weak electrostatic interaction between the positively charged site and the negatively charged capsid protein, spike protein, envelope protein on the virus surface, etc. in the virus.
  • the gelatin hydrolyzate repels each other with the virus and other peptide chains that make up the gelatin hydrolyzate at the negatively charged sites. From the above, it is presumed that the gelatin hydrolyzate can protect the virus surface by covering it while suppressing virus aggregation.
  • a gelatin hydrolyzate obtained from an acid-treated gelatin having an isoelectric point of pH around 9 (for example, the gelatin hydrolyzate disclosed in Patent Document 1 above) has a positive charge, so exhibits a negative charge. There is a possibility that viruses aggregate by exhibiting strong electrostatic interactions with capsid proteins and the like. It is presumed that the gelatin hydrolyzate obtained from acid-treated gelatin exhibits a marked effect of coagulating viruses, especially in a temperature environment of around 25°C.
  • the pH of the isoelectric point of the gelatin hydrolyzate can be obtained by measuring the pH of the isoelectric point of either or both of gelatin and collagen, which are raw materials of the gelatin hydrolyzate, using a conventionally known method. However, it is preferable to use the following method for measuring the isoelectric point using the zeta potential as an index, since the isoelectric point value can be obtained more accurately. First, a gelatin hydrolyzate to be measured is dissolved in an acetate buffer (pH 4.0 to 5.5) to obtain a 0.4 w/v % solution to be measured.
  • the solution to be measured is filtered through a 0.22 ⁇ m filter (manufactured by Merck), and then 0.8 mL of the solution to be measured is filled into a capillary cell while preventing air bubbles from entering.
  • the capillary cell filled with the solution to be measured is set in a zeta potential measuring device (manufactured by Malvern Panalytical) to measure the zeta potential at each pH at 25°C.
  • the pH value at which the zeta potential becomes 0 can be obtained as the isoelectric point of the solution to be measured (the gelatin hydrolyzate to be measured).
  • Virus stabilizers include aqueous media as described above.
  • aqueous medium refers to a medium that dissolves or disperses the gelatin hydrolyzate, and means a medium that can contain components other than water, such as amino acids, sugars, and salts with buffering properties, which will be described later.
  • the aqueous medium may be a buffer solution containing a buffering salt.
  • the aqueous medium may be GTS buffer. That is, the aqueous medium preferably contains a salt having a buffering action. Accordingly, when a virus-containing composition is formed by containing a virus, the virus-stabilizing agent can contribute to the stabilization of the virus by the above-mentioned buffering action.
  • salts having a buffering action examples include sodium phosphate, potassium phosphate, calcium phosphate, magnesium phosphate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate, magnesium hydrogen phosphate, sodium chloride, potassium chloride, and the like. can do.
  • the aqueous medium may contain one of the above salts having a buffering action, or may contain two or more of them in combination.
  • Examples of the aqueous medium containing a salt having a buffering action include the GTS buffer, PBS buffer, Tris buffer, HEPES buffer, citrate buffer, and the like.
  • the composition of the GTS buffer can be, for example, 2.5 mass % glycerol, 20 mM Tris pH 8, and 25 mM NaCl.
  • the aqueous medium preferably contains at least one amino acid selected from the group consisting of methionine, arginine, tryptophan, glutamine and glutamic acid.
  • the aqueous medium may contain one type of amino acid selected from these groups alone, or may contain two or more types in combination. More preferably, the aqueous medium contains methionine and/or arginine amino acids.
  • the virus-stabilizing agent can further contribute to the stabilization of the virus when the virus-containing composition is constituted by containing the virus.
  • the aqueous medium preferably contains at least one sugar selected from the group consisting of sucrose, lactose, sorbitol, inositol, trehalose, mannitol, maltitol, xylitol, erythritol and glycerol.
  • the aqueous medium may contain one type of saccharide selected from these groups alone, or may contain two or more types in combination. More preferably, the aqueous medium contains at least one of sucrose, lactose or sorbitol.
  • the virus-stabilizing agent can further contribute to the stabilization of the virus when the virus-containing composition is constituted by containing the virus.
  • the compounds included in "sugars” include not only organic compounds generally classified as sugars, but also organic compounds classified as sugar alcohols.
  • Organic compounds classified as sugar alcohols in the above group of sugars are the above sorbitol, mannitol, maltitol, xylitol, erythritol and glycerol.
  • the aqueous medium may contain other components as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Other ingredients include growth factors, differentiation factors, hormones, chemokines, cytokines, cell adhesion molecules, chemotactic factors, enzymes, enzyme inhibitors, coenzymes (vitamins), minerals, fats, lipids, stabilizers and preservatives. etc. can be mentioned.
  • the virus stabilizer according to the present embodiment comprises an aqueous medium and gelatin hydrolyzate contained at a concentration of 1% by mass or more and 20% by mass or less, as described above.
  • the gelatin hydrolyzate has a weight average molecular weight of 10000 or less and an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the gelatin hydrolyzate for a virus stabilizer has a weight average molecular weight of 10000 or less and an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less.
  • the gelatin hydrolyzate for virus stabilizer preferably has a weight-average molecular weight of 6000 or less, or an isoelectric point of pH of 4.0 to 5.5.
  • the gelatin hydrolyzate for a virus stabilizer has the same characteristics as described in the ⁇ Gelatin hydrolyzate> section, so redundant description will not be repeated.
  • the gelatin hydrolyzate for virus stabilizer has a previously unknown attribute of the gelatin hydrolyzate, i.e., an unknown attribute.
  • the gelatin hydrolyzate for virus stabilizer can be used as a virus stabilizer, and the virus-containing composition can be frozen at both refrigeration temperature (2 to 8 ° C.) and room temperature around 25 ° C. can be stably stored and transported without requiring
  • the gelatin hydrolyzate for the virus stabilizer is preferably liquid or powder.
  • the virus-containing composition can be easily prepared by adding the virus together with the aqueous medium.
  • the gelatin hydrolyzate for virus stabilizer is powder, the virus stabilizer is prepared by dissolving or dispersing it in an aqueous medium, and the virus is added to the virus stabilizer to easily prepare the virus-containing composition. can be done.
  • a gelatin hydrolyzate for a virus stabilizer can be prepared as a liquid by hydrolyzing gelatin and/or collagen followed by purification.
  • the gelatin hydrolyzate for a virus stabilizer can be prepared as a powder by heat-drying or freeze-drying the liquid gelatin hydrolyzate for a virus stabilizer prepared as described above by a known method. can.
  • the virus-containing composition according to this embodiment contains the virus stabilizer and a virus.
  • the virus-containing composition can suppress aggregation of the virus in the composition, thereby suppressing a decrease in virus titer. Therefore, the virus-containing composition can be stably stored and transported both at a refrigeration temperature (2 to 8° C.) and at room temperature around 25° C. without the need for a freezer or the like.
  • the virus stabilizer contained in the virus-containing composition specifically has the characteristics as described in the [Virus Stabilizer] section, so redundant description will not be repeated.
  • a virus-containing composition comprises a virus as described above.
  • the virus preferably contains at least one selected from the group consisting of enveloped DNA viruses, non-enveloped DNA viruses, enveloped RNA viruses and non-enveloped RNA viruses. That is, the type of virus that constitutes the virus-containing composition is not limited to use.
  • the virus-containing composition may contain one type of virus selected from the above group alone, or may contain two or more types of virus in combination. Even in such a case, the virus-containing composition contains a virus stabilizer so that the virus can be stably stored and transported both at a refrigeration temperature (2 to 8°C) and at room temperature around 25°C. can be done.
  • viruses used as live or inactivated vaccines such as influenza virus and rotavirus, oncolytic viruses that have the effect of lysing tumors, herpes simplex virus, vaccinia virus, adenovirus, and coxsackievirus. , poxvirus, paramyxovirus, picornavirus, rapdovirus, reovirus, parvovirus, bracken virus, orthomyxovirus, retrovirus, and the like.
  • the virus may be gene-introduced.
  • the virus-containing composition may contain other components as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Other ingredients include growth factors, differentiation factors, hormones, chemokines, cytokines, cell adhesion molecules, chemotactic factors, enzymes, enzyme inhibitors, coenzymes (vitamins), minerals, fats, lipids, stabilizers and preservatives. etc. can be mentioned.
  • the virus-containing composition is the logarithmic reduction value of the virus titer when stored at 25° C. for 21 days (hereinafter also referred to as “LRV”) and the virus titer LRV when stored at ⁇ 80° C. for 21 days.
  • the difference is 1.5 log or less, more preferably, the difference is 1.0 log or less, and the virus-containing composition preferably has a lower limit of 0 for the difference.
  • the virus-containing composition preferably has a difference of 1.0 log or less between the LRV of the virus titer when stored at 4°C for 210 days and the LRV of the virus titer when stored at -80°C for 210 days. . More preferably, the difference is 0.5 log or less.
  • the virus-containing composition preferably has a lower limit of 0 for the above difference.
  • the virus-containing composition has the LRV characteristics of the virus titer as described above, it can stably store and transport the virus both at refrigerated temperatures (2-8°C) and at room temperature around 25°C. Ability is guaranteed.
  • the virus-containing composition has a difference of 1.5 log or less between the LRV of the virus titer pair when stored at 25°C for 21 days and the LRV of the virus titer when stored at -80°C for 21 days. Also preferably, the difference between the LRV of the virus titer when stored at 4° C. for 21 days and the LRV of the virus titer when stored at ⁇ 80° C. for 21 days is 1.0 log or less.
  • the virus-containing composition preferably has a logarithmic reduction in virus titer of 0.3 log or less when freeze-thaw is repeated three times. As a result, the virus-containing composition can maintain its virus titer even after repeated freezing and thawing up to three times. This allows flexibility in the use of virus-containing compositions, which is extremely convenient.
  • the LRV of virus titer in a virus-containing composition can be determined using conventional methods of measuring virus titer, eg, by determining the TCID50 of the virus in the virus-containing composition.
  • TCID50 refers to a culture dish such as a test tube or a 96-well flat-bottom plate in which cells are cultured and attached in advance, and inoculated with a virus dilution (in this specification, a dilution of the "virus-containing composition"). In some cases, it refers to the dilution of virus at which 50% infection is confirmed. The infection can be confirmed microscopically, for example, using cytopathic effect (CPE) as an indicator.
  • CPE cytopathic effect
  • the virus titer LRV can be calculated based on TCID50 according to the formula of the Beherens-Karber method.
  • a method for measuring the LRV of the virus titer can be as follows. Specifically, DMEM medium can be used as a diluent for diluting the virus-containing composition after first storing it for a predetermined period of time. For cell culture, 100 ⁇ L/well (approximately 10 4 cells/well) of a predetermined cell suspension was spread on a 96-well flat-bottom plate (manufactured by TPP) and incubated overnight in a 37° C. CO 2 incubator (CO 2 concentration 5%). It can be carried out by incubating.
  • DMEM medium can be used as a diluent for diluting the virus-containing composition after first storing it for a predetermined period of time.
  • 100 ⁇ L/well (approximately 10 4 cells/well) of a predetermined cell suspension was spread on a 96-well flat-bottom plate (manufactured by TPP) and incubated overnight in a 37° C. CO 2 incubator (CO 2 concentration
  • the virus-containing composition is then serially diluted 10-fold in DMEM medium. 50 ⁇ L/well of the diluted virus was added to predetermined cells (various cells corresponding to the virus species contained in the virus-containing composition (eg, LCC-MK2 cells, MDBK cells, HEK293 cells, etc.)) in a 96-well flat-bottom plate. Then, cultured in a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5%) at 37 ° C. On the 7th day, the virus titer (TCID50) was determined by using CPE as an index and according to the above-mentioned calculation formula, and the TCID50 value was LRV can be calculated based on
  • the LRV of the virus titer can be calculated as follows. That is, the diluted virus was added to Vero cells in a 24-well flat-bottom plate at 50 ⁇ L/well, cultured in a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5%) at 37° C. for 24 to 48 hours, and the cells were added to 0.25 mass. Recover with % trypsin EDTA (manufactured by SIGMA-Aldrich). Then wash with DMEM medium and PBS.
  • the above cells are suspended in 0.5 mass % formalin-added PBS, the number of infected cells is counted by FCM analysis or fluorescence microscopy, and the virus titer (FFU/mL) is determined according to the above-mentioned formula. LRV can then be calculated based on the virus titer (FFU/mL).
  • the virus stabilizer according to this embodiment can be preferably obtained by the following method. That is, by going through the step of preparing a gelatin hydrolyzate (first step) and the step of preparing a virus stabilizer comprising the gelatin hydrolyzate and an aqueous medium (second step), the virus stabilizing agent can be obtained.
  • the first step is to prepare a gelatin hydrolyzate.
  • the gelatin hydrolyzate is, as described above, gelatin whose isoelectric point has a pH of 4.0 or more and 7.0 or less, or gelatin whose isoelectric point has a pH of 4.0 or more and 7.0 or less by alkali treatment. It can be prepared by hydrolyzing both or either one of the collagens obtained so as to have a weight average molecular weight of 10,000 or less.
  • As gelatin having an isoelectric point pH of 4.0 or more and 7.0 or less alkali-treated gelatin is preferably used.
  • a gelatin hydrolyzate can also be prepared from a commercially available product (for example, trade name: "beMatrix (registered trademark) gelatin HG" manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.).
  • the second step is to prepare a virus stabilizer from the above gelatin hydrolyzate and aqueous medium.
  • the virus stabilizer can be prepared by mixing the gelatin hydrolyzate and the aqueous medium at a mass ratio such that the concentration of the gelatin hydrolyzate is 1% by mass or more and 20% by mass or less.
  • a conventionally known method can be used as a specific mixing method.
  • the aqueous medium can also be prepared by a conventionally known method such as adding a salt having a buffering action to deionized water so as to have a predetermined concentration.
  • a virus-containing composition can be prepared by adding a virus to the virus stabilizer.
  • a virus can be added to the virus stabilizer by a conventionally known method.
  • the virus can be added to the virus stabilizer generally so that the final virus titer (TCID50) is 10 5 /mL or more.
  • TCID50 final virus titer
  • Sample preparation Samples (Samples 1 to 17) of virus-containing compositions used in various experiments (Experiments 1 to 6) described below were prepared as described below. Samples 1 to 4, 9 to 12 and 14 to 17 are examples, and samples 5 to 8 and 13 are comparative examples.
  • Example 1 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate. Then, the virus stabilizer was obtained by dissolving in GTS buffer, which is an aqueous medium, so as to contain 5% by mass of the gelatin hydrolyzate.
  • GTS buffer which is an aqueous medium
  • a virus-containing composition was obtained by adding bovine herpes virus (BHV-1), which is an enveloped DNA virus, to the virus stabilizer so that the TCID50 was 2 ⁇ 10 8.1 /mL.
  • the virus-containing composition was further divided into 7 specimens and stored at 4°C for 21 days, 56 days and 210 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days, 56 days and 210 days, respectively.
  • Example 2 Alkali-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from pigskin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 650. to obtain a gelatin hydrolyzate. Then, the virus stabilizer was obtained by dissolving the gelatin hydrolyzate in the GTS buffer so as to contain 5% by mass. Then, a virus-containing composition was obtained by adding a virus to the virus stabilizer by the same method as for sample 1. The virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 3 Alkali-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 1980. to obtain a gelatin hydrolyzate. Then, the virus stabilizer was obtained by dissolving the gelatin hydrolyzate in the GTS buffer so as to contain 5% by mass. Then, a virus-containing composition was obtained by adding a virus to the virus stabilizer by the same method as for sample 1. The virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 4 Alkali-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 9890. to obtain a gelatin hydrolyzate. Then, the virus stabilizer was obtained by dissolving the gelatin hydrolyzate in the GTS buffer so as to contain 5% by mass. Then, a virus-containing composition was obtained by adding a virus to the virus stabilizer by the same method as for sample 1. The virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 5 Alkali-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 59,800. to obtain a gelatin hydrolyzate. Then, the virus stabilizer was obtained by dissolving the gelatin hydrolyzate in the GTS buffer so as to contain 5% by mass. Then, a virus-containing composition was obtained by adding a virus to the virus stabilizer by the same method as for sample 1. The virus-containing composition was further divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 7 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as for Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer so as to contain 0.1 mass % of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 8 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as for Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer to contain 0.5% by mass of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 9 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as in Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer so as to contain 1% by mass of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 10 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as in Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer to contain 2.5% by mass of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 11 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as for Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer so as to contain 10% by mass of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • Example 12 Alkaline-treated gelatin “beMatrix (registered trademark) gelatin LS-H (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.)” derived from swine skin with an isoelectric point pH of 5 is hydrolyzed by heat so that the weight average molecular weight becomes 3800. to obtain a gelatin hydrolyzate.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as in Sample 1, except that the gelatin hydrolyzate was dissolved in the GTS buffer so as to contain 20% by mass of the gelatin hydrolyzate to obtain the virus stabilizer.
  • the virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively.
  • a virus stabilizer was obtained by dissolving recombinant human albumin "Recombumin (registered trademark) Elite" (manufactured by Albumedix) in the GTS buffer so as to contain 1% by mass.
  • a virus-containing composition was obtained by adding the virus to the reagent, and the virus-containing composition was divided into four specimens and incubated at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days. days and 56 days Sample 13 is a known virus stabilizer.
  • Example 14 A virus-containing composition was prepared in the same manner as in Sample 1, except that parainfluenza virus (PI-3), which is an enveloped RNA virus, was added to the virus stabilizer so that the TCID50 was 2 ⁇ 10 5.5 /mL. Obtained.
  • the virus-containing composition was divided into 7 specimens and stored at 4° C. for 21 days, 56 days and 210 days, 25° C. for 21 days, and ⁇ 80° C. for 21 days, 56 days and 210 days, respectively.
  • Example 15 A virus-containing composition was prepared in the same manner as in Sample 1, except that reovirus (Reo-3), an RNA virus having no envelope, was added to the virus stabilizer so that the TCID50 was 2 ⁇ 10 6.5 /mL. got The virus-containing composition was divided into 7 specimens and stored at 4° C. for 21 days, 56 days and 210 days, 25° C. for 21 days, and ⁇ 80° C. for 21 days, 56 days and 210 days, respectively.
  • Reo-3 reovirus
  • Example 16 A virus-containing composition was obtained in the same manner as in Sample 1, except that adenovirus (Ad5), which is a DNA virus without an envelope, was added to the virus stabilizer so that the TCID50 was 2 ⁇ 10 8 /mL. rice field.
  • the virus-containing composition was divided into 7 specimens and stored at 4° C. for 21 days, 56 days and 210 days, 25° C. for 21 days, and ⁇ 80° C. for 21 days, 56 days and 210 days, respectively.
  • Example 17 A paramyxovirus (Newcastle disease virus: rNDV-GFP), which is an oncolytic virus with an enveloped RNA virus into which GFP is introduced, is added to the virus stabilizer so that the FFU contains 4 ⁇ 10 6 /mL.
  • a virus-containing composition was obtained in the same manner as for sample 1, except that it was added. The virus-containing composition was divided into four specimens and stored at 4°C for 56 days, 25°C for 21 days, and -80°C for 21 days and 56 days, respectively. Table 1 shows a list of samples 1 to 17.
  • the pH of the isoelectric point of the gelatin hydrolyzate contained in the virus stabilizers of Samples 1 to 4, Samples 9 to 12, and Samples 14 to 17 is the isoelectric point with the above-mentioned zeta potential as an index.
  • sample 1 sample 2, sample 3, sample 4 and sample 5
  • the LRV of the virus titer in each sample stored at 25 ° C. for 21 days and the virus titer in each sample stored at -80 ° C. for 21 days was calculated as the difference between the LRV of Table 2 shows the results.
  • Table 3 regarding samples 1, 2, 3 and 4, the LRV of the virus titer in each sample stored at 4°C for 56 days and the LRV of the virus titer in each sample stored at -80°C for 56 days and shows the result of calculating the difference.
  • Sample 1, Sample 2, Sample 3 and Sample 4 have a difference in the LRV of 1.0 log or less and 1.5 log or less, respectively, so 4°C (refrigeration temperature) and 25°C. It can be evaluated that the virus can be stably stored and transported at room temperature. Sample 5 gelled so that the above LRV difference exceeded 1.5 log at 25°C. Sample 5 was not evaluated at 4°C for 56 days because of gelation.
  • Sample 1, Sample 2, Sample 3 and Sample 4 have a difference in the LRV of 1.0 log or less and 1.5 log or less, respectively, so 4°C (refrigeration temperature) and 25°C. It can be evaluated that the virus can be stably stored and transported at room temperature. For sample 6, the LRV difference exceeded 1.5 log at 25°C and exceeded 1.0 log at 4°C.
  • Sample 1 Sample 9
  • Sample 10 Sample 11 and Sample 12 had differences in the LRV of 1.0 log or less and 1.5 log or less, respectively. ) and 25° C. (room temperature), the virus can be stably stored and transported.
  • Both Sample 7 and Sample 8 exceeded 1.5 log difference in LRV at 25°C and exceeded 1.0 log at 4°C.
  • Table 8 shows the results. Furthermore, in Table 9, for samples 1 and 13, the difference between the LRV of the virus titer in each sample stored at 4°C for 56 days and the LRV of the virus titer in each sample stored at -80°C for 56 days was calculated. Show the results.
  • Sample 1 can suppress the decrease in virus titer at 4°C (refrigeration temperature) and 25°C (room temperature) compared to Sample 13.
  • Sample 14 Sample 15 and Sample 16
  • the TCID50 of each specimen stored at 4°C for 21 days, 56 days and 210 days was determined, and based on the TCID50 value, the virus titer at 4°C LRV was calculated.
  • Sample 14 Sample 15, and Sample 16
  • the TCID50 of each specimen stored at -80°C for 21 days, 56 days, and 210 days was also determined, and the virus titer at -80°C was determined based on the TCID50 values. was calculated.
  • Sample 1, Sample 14, Sample 15, Sample 16 and Sample 17 have a difference in the LRV of 1.0 log or less and 1.5 log or less, respectively, so the refrigeration temperature ) and 25° C. (room temperature), the virus can be stably stored and transported.
  • each example of Samples 1 to 4, Samples 9 to 12, and Samples 14 to 17 stably contained viruses for 21 days in an environment of 4°C. It can be evaluated as being storable and transportable.

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Abstract

ウイルス安定化剤は、ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからなるウイルス安定化剤であって、前記ウイルス安定化剤は、前記ゼラチン加水分解物を１質量％以上２０質量％以下含み、前記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、前記ゼラチン加水分解物は、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。

Description

ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物
　本発明は、ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物に関する。
　ウイルスの保存および輸送は、感染力等のウイルスの能力の維持のため、またはその低下を防ぐため、一般に－８０～－６０℃の環境が必要であるとされる。あるいは、室温でウイルスを保存および輸送する場合、ウイルスを含む製剤を凍結乾燥品とすることが必要となる。このようにウイルスの保存および輸送は、従来から煩雑となることが知られている。これに対し特開２０１３－０３５８６１号公報（特許文献１）は、冷蔵温度（たとえば２～８℃）で安定性を有する冷蔵庫安定型インフルエンザウイルス組成物を開示している。
特開２０１３－０３５８６１号公報
　上記特許文献１は、０．５～２％ゼラチン水解物等を含む組成物により、インフルエンザウイルス株の冷蔵温度での安定的な保存および輸送を達成したことを開示している。しかしながら上記特許文献１は、２５℃前後の室温で上記ウイルス株の安定的な保存および輸送が達成可能であるか否かについては開示していない。上記特許文献１によれば、等電点が９付近であるブタＡ型ゼラチンから上記のゼラチン水解物を得ているために、当該ゼラチン水解物は、ウイルス表面の特定のタンパク質と強く相互作用することによって、ウイルスの室温での安定的な保存および輸送が困難になると推定される。さらに－８０～－６０℃の環境下で保存したウイルスを含む製剤等を、使用に供するために加熱によってゾル化し、冷蔵温度（２～８℃）または室温に戻した場合、感染力等のウイルスの能力の低下が避けられないことが公知である。したがって、煩雑な操作を不要とし、かつ冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者で感染力等のウイルスの能力を低下させることなくウイルスを含む製剤等を保存および輸送することを可能とする材料は未だ実現されておらず、その開発が切望されている。
　以上の点に鑑み、本発明は、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者においてウイルスの能力の低下を抑制することによって、冷凍装置等を要することなくウイルスを含む製剤等の保存および輸送を可能とするウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、本発明に到達した。すなわち、まず等電点のｐＨが５付近であるゼラチンを、所定の重量平均分子量となるように加水分解することにより得たゼラチン加水分解物に注目した。さらに当該ゼラチン加水分解物を所定濃度で含む製剤にウイルスを含ませた場合、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者において感染力等のウイルスの能力の低下を抑制することができ、もって冷凍装置等を要することなくウイルスを含む製剤等を安定的に保存および輸送できることを知見し、本発明を完成させた。
　本発明は、以下のとおりの特徴を有する。
〔１〕　本発明に係るウイルス安定化剤は、ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからなるウイルス安定化剤であって、上記ウイルス安定化剤は、上記ゼラチン加水分解物を１質量％以上２０質量％以下含み、上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、上記ゼラチン加水分解物は、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。
〔２〕　上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が６０００以下であることが好ましい。
〔３〕　上記ゼラチン加水分解物は、アルカリ処理ゼラチンの加水分解物であることが好ましい。
〔４〕　上記ウイルス安定化剤は、上記ゼラチン加水分解物を２質量％超１０質量％以下含むことが好ましい。
〔５〕　上記水性メディウムは、緩衝作用を有する塩を含むことが好ましい。
〔６〕　上記水性メディウムは、ショ糖、乳糖、ソルビトール、イノシトール、トレハロース、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリトリトールおよびグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１種の糖類を含むことが好ましい。
〔７〕　上記水性メディウムは、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含むことが好ましい。
〔８〕　本発明に係るウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、かつ等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。
〔９〕　上記ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、液体または粉体であることが好ましい。
〔１０〕　本発明に係るウイルス含有組成物は、上記ウイルス安定化剤と、ウイルスとを含む。
〔１１〕　上記ウイルスは、エンベロープを有するＤＮＡウイルス、エンベロープを有さないＤＮＡウイルス、エンベロープを有するＲＮＡウイルスおよびエンベロープを有さないＲＮＡウイルスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
〔１２〕　上記ウイルスは、遺伝子導入されていることが好ましい。
〔１３〕　上記ウイルス含有組成物は、２５℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値と、－８０℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値との差が１．５ｌｏｇ以下であることが好ましい。
〔１４〕　上記ウイルス含有組成物は、４℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値と、－８０℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値との差が１．０ｌｏｇ以下であることが好ましい。
〔１５〕　上記ウイルス含有組成物は、凍結融解を３回繰り返した場合のウイルス力価の対数減少値が０．３ｌｏｇ以下であることが好ましい。
　上記によれば、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者においてウイルスの能力の低下を抑制することによって、冷凍装置等を要することなくウイルスを含む製剤等の保存および輸送を可能とするウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物を提供することができる。
　以下、本発明に係る実施形態（以下、「本実施形態」とも記す）について、さらに詳細に説明する。ここで本明細書において「Ａ～Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。本明細書において「ウイルス力価」とは、検体（本明細書において「ウイルス含有組成物」）中のウイルスが細胞に感染可能となる最低濃度、すなわち最高の希釈倍率をいう。さらにウイルス力価が「低下」するとは、上記の希釈倍率が低下することをいい、感染可能となる上記の最低濃度が上昇することを意味する。本明細書において「ゼラチン」の用語については、物質名、ゼラチンゲルおよびゼラチン溶液をいう場合にそれぞれ用いることがある。また「ゼラチン加水分解物」の用語についても、上記ゼラチンと同様に、ゼラチン加水分解物の溶液をいう場合に用いることがある。
　〔ウイルス安定化剤〕
　本実施形態に係るウイルス安定化剤は、ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからなるウイルス安定化剤である。上記ウイルス安定化剤は、上記ゼラチン加水分解物を１質量％以上２０質量％以下含む。さらに上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下である。上記ゼラチン加水分解物は、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。このような特徴を備えることにより、本実施形態に係るウイルス安定化剤は、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者においてウイルス力価の低下を抑制することができ、もってウイルス安定化剤とウイルスとを含むウイルス含有組成物を構成した場合、当該ウイルス含有組成物を冷凍装置等を要することなく安定的に保存および輸送することができる。
　＜ゼラチン加水分解物＞
　上記ウイルス安定化剤は、上述のようにゼラチン加水分解物を含む。本明細書において「ゼラチン加水分解物」とは、ゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方を加水分解することにより得られるペプチドの集合体（加水分解物）をいう。すなわち「ゼラチン加水分解物」は、一般にコラーゲンペプチドまたはコラーゲン加水分解物と称されるペプチドの集合体と等価なものを意味する。その中で、本実施形態に係るウイルス安定化剤に含まれるゼラチン加水分解物は、上記のとおりの重量平均分子量および等電点のｐＨを有する。さらにゼラチン加水分解物は、上述のとおりのペプチドの集合体を意味するため、ペプチド鎖を構成するアミノ酸配列において、グリシンが３残基ごとに繰り返される一次構造を有する等のコラーゲンおよびゼラチンと同じ特徴を有している。
　本明細書において「ゼラチン」とは、コラーゲンの三重らせん構造が熱変性、酸変性等によってほどけたポリペプチド、その化学修飾体およびその薬学上許容される塩を意味する。具体的には、以下の第１群～第６群からなる群より選ばれる少なくとも１種を由来とするコラーゲンを、脱脂処理、脱灰処理、酸またはアルカリ処理、熱水抽出処理等の従来公知の処理を施すことにより得ることができる。ゼラチンは、微生物を用いた発酵法により得たポリペプチド、化学合成または遺伝子組換え操作により得たリコンビナントポリペプチドまたは合成されたポリペプチドであってもよい。また「コラーゲン」とは、以下の第１群～第６群に分類される脊椎動物の皮膚などにおける細胞外基質を由来とするタンパク質をいう。コラーゲンは、３本のペプチド鎖からなる右巻きのらせん構造を有し、そのペプチド鎖を構成するアミノ酸残基は、グリシン残基が３残基ごとに繰り返される一次構造（所謂コラーゲン様配列）を有している。
　第１群：牛の皮、皮膚、骨、軟骨および腱からなる群
　第２群：豚の皮、皮膚、骨、軟骨および腱からなる群
　第３群：羊の皮、皮膚、骨、軟骨および腱からなる群
　第４群：鶏の皮、皮膚、骨、軟骨および腱からなる群
　第５群：ダチョウの皮、皮膚、骨、軟骨および腱からなる群
　第６群：魚の骨、皮および鱗からなる群。
　ここで上記ポリペプチド（ゼラチン）の「化学修飾体」とは、ゼラチンを構成するアミノ酸残基におけるアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基またはチオール基等が化学修飾されたポリペプチドを意味する。化学修飾を受けたゼラチンは、水に対する溶解性、等電点などを変化させることができる。具体的には、ゼラチンにおけるヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基に対しては、Ｏ－アセチル化などの化学修飾を実行することができる。ゼラチンにおけるグリシン残基のα－カルボキシル基に対しては、エステル化、アミド化などの化学修飾を実行することができる。ゼラチンにおけるプロリン残基のα－アミノ基に対しては、ポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化などの化学修飾を実行することができる。
　ゼラチンの化学修飾の具体的手段および処理条件は、従来公知の化学修飾方法を適用することができる。ヒドロキシプロリン残基のヒドロキシ基の化学修飾については、水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどにより、たとえばＯ－アセチル化を実行することができる。グリシン残基のα－カルボキシル基の化学修飾については、メタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどにより、たとえばエステル化を実行することができる。グリシン残基のα－カルボキシル基の化学修飾については、カルボジイミドなどを作用させることによりアミド化を実行することができる。
　さらに上記ポリペプチド（ゼラチン）の「誘導体」には、ゼラチンに官能基を導入したゼラチン誘導体、およびゼラチンと乳酸、グリコール酸などとの共重合体、ゼラチンとポリエチレングリコール、プロピレングリコールとの共重合体などが含まれる場合がある。ゼラチン誘導体としては、ゼラチンに対してグアニジル基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基、アルキル基、アシル基、フェニル基、ベンジル基などの官能基を導入した誘導体を例示することができる。
　上記ポリペプチド（ゼラチン）の「薬学上許容される塩」とは、薬学上許容され、かつ元となるポリペプチド（ゼラチン）の所望の活性（たとえば、ゲル化能）を有する塩を意味する。薬学上許容される塩としては、たとえば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩および臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩およびマレイン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機塩基塩などを例示することができる。常法に従ってゼラチン中の特定のペプチドを薬学上許容される塩にすることができる。
　ゼラチンは、多くの生物が保有するコラーゲンに由来するポリペプチドであるため、生体適合性に優れている。このため上記コラーゲンおよびゼラチンを加水分解することにより得られるゼラチン加水分解物も、生体適合性に優れており、医薬用途のウイルス安定化剤の一成分として好適である。
　ゼラチン加水分解物は、溶媒（たとえば水）に溶解した場合、２５℃前後の室温下ではもちろん、２～８℃の環境下でもゲル化せず、ゾルの状態を維持する。したがって上記ウイルス安定化剤は、２５℃前後の室温で使用する際にゾル化のための加熱操作が不要となる。本実施形態において「ゾル」とは、分散質と分散媒とからなる分散系において、分散媒が液体状である分散系を意味する。「ゲル」とは、分散質と分散媒とからなる分散系において、分散質が架橋構造を形成し、分散系全体として流動性を失った状態を意味する。
　ゼラチン加水分解物は、上述のとおりゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方を加水分解することにより得られる。この場合の「加水分解」には、酸を用いる加水分解、塩基を用いる加水分解、酵素を用いる加水分解、および熱を用いる加水分解がいずれも含まれる。ゼラチン加水分解物は、不純物のコンタミネーションを防止する観点から、熱を用いる加水分解により得ることが好ましい。さらにゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方を酵素を用いて加水分解する場合、上記酵素としては、たとえばコラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等が挙げられる。上述の酵素は、これらを単独でまたは複数組み合わせて用いることができる。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼ等が挙げられる。上記セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤ等が挙げられる。上記酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
　使用する酵素としては、ゼラチン加水分解物を医薬に利用することを考慮すると、病原性微生物由来の酵素以外の酵素（たとえば、非病原性の微生物に由来する酵素）を用いることが好ましい。上記酵素の由来となる非病原性の微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。上記酵素は、１種の上述した非病原性の微生物に由来する酵素を用いてもよいし、複数種の上述した非病原性の微生物に由来する酵素を組み合わせて用いてもよい。酵素処理の具体的な方法は、従来から知られている方法を用いればよい。
　なお「ゼラチン加水分解物」を、上記ゼラチンから１種の酵素を単独で用いた加水分解によって得る場合、当該酵素はコラゲナーゼではないことが好ましい。上記ゼラチンをコラゲナーゼ単独で加水分解した場合、アミノ酸配列のＮ末端がグリシンとなる特定のペプチドが主成分（５０質量％超）となる可能性があるからである。上記ゼラチン加水分解物は、２種以上のペプチドからなる集合体であるが、その組成において上記の特定のペプチドは５０質量％未満となる。
　ゼラチン加水分解物は、上述した方法によりゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方を加水分解した後、精製することにより液体として得ることができる。さらに上記液体を公知の手段によって加熱乾燥または凍結乾燥することにより粉体として得ることも可能である。
　（濃度）
　ウイルス安定化剤は、上記ゼラチン加水分解物を１質量％以上２０質量％以下含む。ウイルス安定化剤に含まれる上記ゼラチン加水分解物の濃度が１質量％未満である場合、当該ウイルス安定化剤とウイルスとを含むウイルス含有組成物を構成したとき、ウイルス力価の低下を抑制する作用が些少となるので、所望の効果を奏することが困難となる。ウイルス安定化剤に含まれる上記ゼラチン加水分解物の濃度が２０質量％を超える場合、当該ウイルス安定化剤は、操作性が悪化する恐れがある。ウイルス安定化剤は、ウイルス力価の低下をより抑制する観点から、上記ゼラチン加水分解物を２質量％超１０質量％以下含むことが好ましい。ウイルス安定化剤中の上記ゼラチン加水分解物の濃度は、ハイドロキシプロリン定量等の公知の方法により測定することができる。
　（重量平均分子量）
　上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下である。上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が６０００以下であることが好ましい。上記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が５０００以下であることがさらに好ましい。これによりウイルス安定化剤は、２～３０℃程度の環境においてゾル状態を維持することができる。さらにウイルス安定化剤とウイルスとを含むウイルス含有組成物を構成した場合、上記組成物中でゼラチン加水分解物は、ウイルスが凝集することを抑制することができ、もってウイルス力価の低下を抑制することができる。詳細なメカニズムは不明であるが、ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が上述の範囲である場合、分子中の親水性領域および疎水性領域の両者が分子表面側（外側）に露出し、エンベロープの有無とは無関係にウイルスの表面と適度な強さの相互作用をすることが可能となるため、ゼラチン加水分解物がウイルスの表面を被覆することによって保護することができると推定されるからである。
　上記ゼラチン加水分解物の重量平均分子量が１００００を超える場合、２～８℃においてゲル化する恐れがある。ゼラチン加水分解物の重量平均分子量の下限は、特に制限されないが、たとえばグリシンの分子量である７５である。
　上記ゼラチン加水分解物の重量平均分子量は、以下の測定条件の下でゲル濾過クロマトグラフィを実行することにより求めることができる。
機器　：高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（東ソー株式会社製）
カラム：ＴＳＫＧｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷXL
カラム温度：３０℃
溶離液：４０質量％アセトニトリル（０．０５質量％ＴＦＡを含む）
流速　：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出　：ＵＶ２２０ｎｍ
分子量マーカー：以下の３種を使用
　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ　Ｃ　　　　　Ｍｗ：１２３８４
　Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ　　　　　　　Ｍｗ：６５１２
　Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ　　　　　　Ｍｗ：１４２３。
　具体的には、上記ゼラチン加水分解物を含む０．５ｇ相当のウイルス安定化剤を約１００ｍｌの蒸留水に添加し、撹拌した後、０．２μｍフィルターを用いてろ過することにより、重量平均分子量を測定する試料（被測定物）を調製する。この被測定物を上述したゲル濾過クロマトグラフィの条件に基づいて測定することにより、上記ゼラチン加水分解物の重量平均分子量を求めることができる。
　（等電点）
　上記ゼラチン加水分解物は、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。上記ゼラチン加水分解物の等電点のｐＨは４．０～５．５であることが好ましく、ｐＨ４．０以上４．８以下であることがより好ましい。そのような範囲の等電点のｐＨを有するゼラチン加水分解物は、アルカリ処理を施したコラーゲンを加水分解することにより、あるいはアルカリ処理を施したコラーゲンから得られたゼラチン（所謂アルカリ処理ゼラチン）を加水分解することによって効率的に得ることができる。すなわち上記ゼラチン加水分解物は、アルカリ処理ゼラチンの加水分解物であることが好ましい。とりわけ上記ゼラチン加水分解物は、等電点がｐＨ４．８～５．５程度であるアルカリ処理ゼラチンの加水分解物であることが好ましい。一般に、コラーゲンを無機酸を用いて処理することにより得たゼラチンを酸処理ゼラチンと称し、コラーゲンを無機塩基を用いて処理することにより得たゼラチンをアルカリ処理ゼラチンと称する。アルカリ処理ゼラチンは、具体的にはコラーゲンを水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化カリウム等の無機塩基を用いて処理することにより得ることができる。酸処理ゼラチンは、等電点のｐＨが８～９である。これに対し、アルカリ処理ゼラチンは、等電点のｐＨは４．０～７．０である。このようなアルカリ処理ゼラチンとしては、たとえば豚皮由来アルカリ処理ゼラチン（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ」、新田ゼラチン株式会社製）を例示することができる。
　上記範囲の等電点のｐＨを有するゼラチン加水分解物を含むウイルス安定化剤と、ウイルスとからウイルス含有組成物を構成した場合、上記組成物中でゼラチン加水分解物は、ウイルスが凝集することを抑制することができ、もってウイルス力価の低下を抑制することができる。詳細なメカニズムは不明であるが、このような範囲の等電点のｐＨを有するゼラチン加水分解物は、分子内において負の電荷が正の電荷よりも相対的に多く存在するため、全体としては負の電荷を示すものの、正の電荷を示す部位および負の電荷を示す部位の両者を有することとなる。このためゼラチン加水分解物は、正の電荷を示す部位と、ウイルスにおいて負の電荷を示すカプシドタンパク質、スパイクタンパク質およびウイルス表面のエンベロープタンパク質等との間で弱い静電相互作用を呈することにより、ウイルスと結合することができる。一方、ゼラチン加水分解物は、負の電荷を示す部位においてウイルスおよびゼラチン加水分解物を構成する他のペプチド鎖と相互に反発する。以上により、ゼラチン加水分解物は、ウイルスの凝集を抑制しつつ、ウイルスの表面を被覆することによって、これを保護することができると推定される。一方、等電点のｐＨが９付近である酸処理ゼラチンから得たゼラチン加水分解物（たとえば上記特許文献１に開示されたゼラチン水解物）は、正の電荷を有するため、負の電荷を示すカプシドタンパク質等と強く静電相互作用を示すことによってウイルスを凝集させる可能性がある。酸処理ゼラチンから得たゼラチン加水分解物は、特に２５℃前後の温度環境において、ウイルスを凝集させる作用が顕著に現れると推定される。
　ゼラチン加水分解物の等電点のｐＨは、ゼラチン加水分解物の原料となるゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方の等電点のｐＨを従来公知の方法を用いて測定することにより求めることができるが、以下のゼータ電位を指標とした等電点の測定方法を用いることが、より正確に等電点の値を求めることができるので好ましい。すなわち、まず酢酸緩衝液（ｐＨ４．０～５．５）に測定対象とするゼラチン加水分解物を溶解し、０．４ｗ／ｖ％の被測定溶液を得る。次に当該被測定溶液を０．２２μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社製）でろ過した後、被測定溶液０．８ｍＬを気泡が入らないようにしてキャピラリーセルに充填する。続いて、上記被測定溶液が充填された当該キャピラリーセルをゼータ電位測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）にセットし、２５℃の各ｐＨにおけるゼータ電位を測定する。このとき、ゼータ電位が０となるｐＨ値を被測定溶液（測定対象としたゼラチン加水分解物）の等電点として求めることができる。
　＜水性メディウム＞
　ウイルス安定化剤は、上述のように水性メディウムを含む。本明細書において「水性メディウム」とは、ゼラチン加水分解物を溶解または分散させる媒体をいい、後述するアミノ酸、糖類および緩衝作用を有する塩などの水以外の成分を含み得る媒体を意味する。たとえば水性メディウムは、緩衝作用を有する塩を含む緩衝液である場合がある。具体的には、水性メディウムは、ＧＴＳバッファーである場合がある。すなわち上記水性メディウムは、緩衝作用を有する塩を含むことが好ましい。これによりウイルス安定化剤は、ウイルスを含むことによってウイルス含有組成物を構成した場合、上記緩衝作用によってウイルスの安定化に寄与することができる。
　（緩衝作用を有する塩）
　緩衝作用を有する塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを例示することができる。水性メディウムは、上記緩衝作用を有する塩を１種単独で含んでもよく、２種以上を組合せて含んでもよい。上記緩衝作用を有する塩を含む水性メディウムとしては、上記ＧＴＳバッファー、ＰＢＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファーなどを例示することができる。ＧＴＳバッファーの組成としては、たとえば２．５質量％グリセロール、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８、２５ｍＭ　ＮａＣｌとすることができる。
　（アミノ酸）
　水性メディウムは、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含むことが好ましい。水性メディウムは、これらの群から選ばれる１種のアミノ酸を単独で含んでもよく、２種以上を組合せて含んでもよい。水性メディウムは、メチオニン、アルギニンの両者またはいずれか一方のアミノ酸を含むことがより好ましい。これによりウイルス安定化剤は、ウイルスを含むことによってウイルス含有組成物を構成した場合、ウイルスの安定化により寄与することができる。
　（糖類）
　上記水性メディウムは、ショ糖、乳糖、ソルビトール、イノシトール、トレハロース、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリトリトールおよびグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１種の糖類を含むことが好ましい。水性メディウムは、これらの群から選ばれる１種の糖類を単独で含んでもよく、２種以上を組合せて含んでもよい。水性メディウムは、ショ糖、乳糖またはソルビトールのいずれかを少なくとも含むことがより好ましい。これによりウイルス安定化剤は、ウイルスを含むことによってウイルス含有組成物を構成した場合、ウイルスの安定化により寄与することができる。本明細書において「糖類」に含まれる化合物としては、一般に糖類として分類される有機化合物だけでなく、糖アルコールに分類される有機化合物を含むものとする。上記の群の糖類において糖アルコールに分類される有機化合物は、上記ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリトリトールおよびグリセロールである。
　（その他の成分）
　水性メディウムは、本発明の効果が奏される限りにおいて、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、たとえば成長因子、分化因子、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、細胞接着分子、走化因子、酵素、酵素インヒビター、補酵素（ビタミン類）、鉱物、脂肪、脂質、安定剤および保存剤等を挙げることができる。
　＜作用効果＞
　本実施形態に係るウイルス安定化剤は、上述のように水性メディウムと、１質量％以上２０質量％以下の濃度で含まれるゼラチン加水分解物とからなる。ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、かつ等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。本実施形態に係るウイルス安定化剤は、ウイルスを含むことによって後述するようなウイルス含有組成物を構成した場合、当該ウイルス含有組成物中でウイルスが凝集することを抑制し、ウイルスの感染力等に悪影響が及ぶことを防ぐことができる。もってウイルス力価の低下を抑制することができるので、当該ウイルス含有組成物を冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者において安定的に保存および輸送することができる。
　〔ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物〕
　本実施形態に係るウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、かつ等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である。上記ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が６０００以下であり、あるいは等電点のｐＨは４．０～５．５であることが好ましい。具体的には、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物については、ゼラチン加水分解物として＜ゼラチン加水分解物＞の項目で説明したとおりの特徴を有するので、重複する説明は繰り返さない。ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、ゼラチン加水分解物の従来知られていない属性、すなわち未知の属性として、ウイルスを含むことによって後述するようなウイルス含有組成物を構成した場合、当該ウイルス含有組成物中でウイルスが凝集することを抑制する作用を備える。もってウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、ウイルス安定化剤の用途に供することができ、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者において上記ウイルス含有組成物を冷凍装置等を要することなく安定的に保存および輸送することができる。
　上記ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、液体または粉体であることが好ましい。これにより、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物が液体である場合、ウイルスを水性メディウムとともに添加することによってウイルス含有組成物を容易に調製することができる。ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物が粉体である場合、水性メディウムに溶解または分散させてウイルス安定化剤を調製し、これにウイルスを添加することによってウイルス含有組成物を容易に調製することができる。ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、ゼラチンおよびコラーゲンの両方またはいずれか一方を加水分解した後、精製することにより液体として調製することができる。ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、上述のようにして調製したウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物の液体を、公知の方法によって加熱乾燥または凍結乾燥することにより粉体として調製することができる。
　〔ウイルス含有組成物〕
　本実施形態に係るウイルス含有組成物は、上記ウイルス安定化剤と、ウイルスとを含む。ウイルス含有組成物は、ウイルス安定化剤を含むことにより、上記組成物中でウイルスが凝集することを抑制することができるので、ウイルス力価の低下を抑制することができる。もって冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者において当該ウイルス含有組成物を冷凍装置等を要することなく安定的に保存および輸送することができる。ここでウイルス含有組成物に含まれるウイルス安定化剤は、具体的には、〔ウイルス安定化剤〕の項で説明したとおりの特徴を有するので、重複する説明は繰り返さない。
　＜ウイルス＞
　ウイルス含有組成物は、上述のとおりウイルスを含む。上記ウイルスは、エンベロープを有するＤＮＡウイルス、エンベロープを有さないＤＮＡウイルス、エンベロープを有するＲＮＡウイルスおよびエンベロープを有さないＲＮＡウイルスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。すなわちウイルス含有組成物を構成するウイルスは、その種類によって用いることが制限されない。さらにウイルス含有組成物は、上記の群から選ばれる１種のウイルスを単独で含んでもよく、２種以上のウイルスを組合せて含んでもよい。このような場合であってもウイルス含有組成物は、ウイルス安定化剤を含むことによって当該ウイルスを冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者において安定的に保存および輸送することができる。
　上記ウイルスは、具体的には、インフルエンザウイルス、ロタウイルス等の生ワクチンまたは不活化ワクチンとして用いられるウイルス、腫瘍を溶解する作用を有する腫瘍溶解性ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラプドウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、ワラビウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス等を例示することができる。さらに上記ウイルスは、遺伝子導入されていてもよい。
　＜その他の成分＞
　ウイルス含有組成物は、本発明の効果が奏される限りにおいて、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、たとえば成長因子、分化因子、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、細胞接着分子、走化因子、酵素、酵素インヒビター、補酵素（ビタミン類）、鉱物、脂肪、脂質、安定剤および保存剤等を挙げることができる。
　＜ウイルス力価の対数減少値（ＬＲＶ）＞
　ウイルス含有組成物は、２５℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値（以下、「ＬＲＶ」とも記す」と、－８０℃で２１日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶとの差が１．５ｌｏｇ以下であることが好ましい。上記の差は、１．０ｌｏｇ以下であることがより好ましい。ウイルス含有組成物は、上記の差の下限値としては０であることが好ましい。
　ウイルス含有組成物は、４℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶと、－８０℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶとの差が１．０ｌｏｇ以下であることが好ましい。上記の差は０．５ｌｏｇ以下であることがより好ましい。ウイルス含有組成物は、上記の差の下限値としては０であることが好ましい。
　ウイルス含有組成物は、上述のようなウイルス力価のＬＲＶに関する特徴を備える場合、冷蔵温度（２～８℃）および２５℃前後の室温の両者においてウイルスを安定的に保存および輸送することができる能力が担保される。
　さらにウイルス含有組成物は、２５℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対のＬＲＶと、－８０℃で２１日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶとの差が１．５ｌｏｇ以下であり、かつ４℃で２１日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶと、－８０℃で２１日間保存した場合のウイルス力価のＬＲＶとの差が１．０ｌｏｇ以下であることも好ましい。
　上記ウイルス含有組成物は、凍結融解を３回繰り返した場合のウイルス力価の対数減少値が０．３ｌｏｇ以下であることが好ましい。これにより上記ウイルス含有組成物は凍結融解を３回まで繰り返し行った場合であっても、ウイルス力価を維持することができる。もってウイルス含有組成物を柔軟に使用することができるので、極めて便宜となる。
　（ウイルス力価の対数減少値（ＬＲＶ）の測定方法）
　ウイルス含有組成物においてウイルス力価のＬＲＶは、ウイルス力価を測定する従来の方法を用いて求めることができ、たとえばウイルス含有組成物中のウイルスのＴＣＩＤ５０を求めることにより得ることができる。「ＴＣＩＤ５０」とは、予め細胞を培養して付着させた試験管または９６穴平底プレート等の培養皿上にウイルス希釈液（本明細書においては「ウイルス含有組成物」の希釈液）を接種した場合に、５０％の感染が確認されるウイルスの希釈度をいう。上記感染は、たとえば細胞変性効果（ＣＰＥ）を指標として顕微鏡により確認することができる。ウイルス力価のＬＲＶは、Ｂｅｈｅｒｅｎｓ－Ｋａｒｂｅｒ法の計算式に従ったＴＣＩＤ５０を基に算出することができる。
　ウイルス力価のＬＲＶの測定方法は、次のとおりとすることができる。具体的には、まず所定期間保存した後のウイルス含有組成物の希釈に、希釈液としてＤＭＥＭ培地を用いることができる。細胞培養は、所定の細胞懸濁液１００μＬ／ｗｅｌｌ（約１０4個／ｗｅｌｌ）を９６穴平底プレート（ＴＰＰ社製）に撒き、３７℃のＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度５％）で一晩インキュベートすることにより行うことができる。
　その後、ＤＭＥＭ培地にてウイルス含有組成物を１０倍段階希釈する。希釈したウイルスは、９６穴平底プレート内の所定の細胞（ウイルス含有組成物に含まれるウイルス種に対応した種々の細胞（たとえばＬＣＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等））に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度５％）で培養し、７日目にＣＰＥを指標とし、かつ上述した計算式に従うことによりウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）を求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいてＬＲＶを算出することができる。
　また、ウイルス含有組成物に含まれるウイルス種が、ｒＮＤＶ－ＧＦＰである場合、次のようにしてウイルス力価のＬＲＶを算出することができる。すなわち希釈した上記ウイルスを、２４穴平底プレート内のＶｅｒｏ細胞に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度５％）で２４～４８時間培養し、上記細胞を０．２５質量％トリプシンＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡアルドリッチ社製）により回収する。その後、ＤＭＥＭ培地およびＰＢＳにより洗浄する。さらに上記細胞を０．５質量％ホルマリン加ＰＢＳに浮遊させ、ＦＣＭ解析あるいは蛍光顕微鏡により感染細胞数を計測し、かつ上述した計算式に従うことによりウイルス力価（ＦＦＵ／ｍＬ）を求める。その後、当該ウイルス力価（ＦＦＵ／ｍＬ）に基づいてＬＲＶを算出することができる。
　＜ウイルス安定化剤の調製方法＞
　本実施形態に係るウイルス安定化剤は、好ましくは次の方法により得ることができる。すなわちゼラチン加水分解物を調製する工程（第１工程）と、上記ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからなるウイルス安定化剤を調製する工程（第２工程）とを経ることにより、ウイルス安定化剤を得ることができる。
　（第１工程）
　第１工程は、ゼラチン加水分解物を調製する工程である。ゼラチン加水分解物は、上述したように、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下であるゼラチン、またはアルカリ処理することにより等電点のｐＨを４．０以上７．０以下としたコラーゲンの両方またはいずれか一方を、重量平均分子量が１００００以下となるように加水分解することにより調製することができる。等電点のｐＨが４．０以上７．０以下であるゼラチンとしては、アルカリ処理ゼラチンを用いることが好ましい。さらに市販品（たとえば商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＨＧ」、新田ゼラチン株式会社製）により、ゼラチン加水分解物を準備することもできる。
　（第２工程）
　第２工程は、上記ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからウイルス安定化剤を調製する工程である。ウイルス安定化剤は、上記ゼラチン加水分解物と上記水性メディウムとを上記ゼラチン加水分解物の濃度が１質量％以上２０質量％以下となるような質量比率で混合することにより調製することができる。具体的な混合方法は、従来公知の方法を用いることができる。水性メディウムについても、緩衝作用を有する塩を所定の濃度となるようにイオン交換水に添加する等の従来公知の方法により調製することができる。
　＜ウイルス含有組成物の調製方法＞
　ウイルス含有組成物の調製は、上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより行うことができる。ウイルスは、上記ウイルス安定化剤に従来公知の方法により添加することができる。ウイルスは、上記ウイルス安定化剤に通常、ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）が最終的に１０5／ｍＬ以上となるように添加することができる。以上により、本実施形態に係るウイルス含有組成物を得ることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　〔試料の準備〕
　後述する各種の実験（実験１～実験６）に用いるウイルス含有組成物の各試料（試料１～試料１７）を、次に説明するようにして準備した。試料１～試料４、試料９～試料１２および試料１４～試料１７が実施例であり、試料５～試料８および試料１３が比較例である。
　＜試料１＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように水性メディウムであるＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。上記ウイルス安定化剤に、エンベロープを有するＤＮＡウイルスであるウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ－１）をＴＣＩＤ５０が２×１０8.1／ｍＬとなるように添加することによりウイルス含有組成物を得た。さらに上記ウイルス含有組成物を７つの検体に分け、それぞれ４℃で２１日間、５６日間および２１０日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した。
　＜試料２＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が６５０となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料３＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が１９８０となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料４＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が９８９０となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料５＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が５９８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。さらに上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料６＞
　等電点のｐＨが９である豚皮由来酸処理ゼラチンから得たゼラチン加水分解物（新田ゼラチン株式会社製）を重量平均分子量が２０６０となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料７＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を０．１質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料８＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を０．５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料９＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を１質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料１０＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を２．５質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料１１＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を１０質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料１２＞
　等電点のｐＨが５である豚皮由来アルカリ処理ゼラチン「ｂｅＭａｔｒｉｘ（登録商標）ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン株式会社製）」を重量平均分子量が３８００となるように熱により加水分解することによりゼラチン加水分解物を得た。次いで上記ゼラチン加水分解物を２０質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得たこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。
　＜試料１３＞
　組換えヒトアルブミン「Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ社製）を１質量％含むように上記ＧＴＳバッファーに溶解することによりウイルス安定化剤を得た。その後、試料１と同じ方法により上記ウイルス安定化剤にウイルスを添加することにより、ウイルス含有組成物を得た。さらに上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。試料１３は、従来公知のウイルス安定化剤である。
　＜試料１４＞
　ウイルス安定化剤に、エンベロープを有するＲＮＡウイルスであるパラインフルエンザウイルス（ＰＩ－３）をＴＣＩＤ５０が２×１０5.5／ｍＬとなるように添加したこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を７つの検体に分け、それぞれ４℃で２１日間、５６日間および２１０日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した。
　＜試料１５＞
　ウイルス安定化剤に、エンベロープを有さないＲＮＡウイルスであるレオウイルス（Ｒｅｏ－３）をＴＣＩＤ５０が２×１０6.5／ｍＬとなるように添加したこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を７つの検体に分け、それぞれ４℃で２１日間、５６日間および２１０日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した。
　＜試料１６＞
　ウイルス安定化剤に、エンベロープを有さないＤＮＡウイルスであるアデノウイルス（Ａｄ５）をＴＣＩＤ５０が２×１０8／ｍＬとなるように添加したこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を７つの検体に分け、それぞれ４℃で２１日間、５６日間および２１０日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した。
　＜試料１７＞
　ウイルス安定化剤に、ＧＦＰを遺伝子導入した腫瘍溶解性ウイルスであって、エンベロープを有するＲＮＡウイルスであるパラミクソウイルス（ニューカッスル病ウイルス：ｒＮＤＶ－ＧＦＰ）をＦＦＵが４×１０6／ｍＬ含むように添加したこと以外、試料１と同じ方法によりウイルス含有組成物を得た。上記ウイルス含有組成物を４つの検体に分け、それぞれ４℃で５６日間、２５℃で２１日間、ならびに－８０℃で２１日間および５６日間保存した。表１に、試料１～試料１７の一覧を示す。ここで試料１～試料４、試料９～試料１２および試料１４～試料１７のウイルス安定化剤に含まれるゼラチン加水分解物の等電点のｐＨは、上述したゼータ電位を指標とした等電点の測定方法により測定した値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔実験１：ゼラチン加水分解物の適切な重量平均分子量の検討〕
　試料１、試料２、試料３、試料４および試料５に関し、４℃で５６日間および２５℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて４℃でのウイルス力価のＬＲＶ、および２５℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。さらに試料１、試料２、試料３、試料４および試料５に関し、－８０℃で２１日間および５６日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき、試料１、試料２、試料３、試料４および試料５に関し、２５℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。結果を表２に示す。さらに表３において、試料１、試料２、試料３および試料４に関し、４℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記表２および表３によれば、試料１、試料２、試料３および試料４は、それぞれ上記ＬＲＶの差が１．０ｌｏｇ以下および１．５ｌｏｇ以下であるため、４℃（冷蔵温度）および２５℃（室温）においてウイルスを安定的に保存および輸送することができると評価することができる。試料５は、ゲル化することにより上記ＬＲＶの差が２５℃において１．５ｌｏｇを超えた。なお試料５については、ゲル化を理由に４℃５６日間における評価を行わなかった。
　〔実験２：ゼラチン加水分解物の適切な等電点の検討〕
　試料１、試料２、試料３、試料４および試料６に関し、４℃で５６日間および２５℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて４℃でのウイルス力価のＬＲＶ、および２５℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。さらに試料１、試料２、試料３、試料４および試料６に関し、－８０℃で２１日間および５６日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき、試料１、試料２、試料３、試料４および試料６のウイルス含有組成物に関し、２５℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。結果を表４に示す。さらに表５において、試料１、試料２、試料３、試料４および試料６に関し、４℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記表４および表５によれば、試料１、試料２、試料３および試料４は、それぞれ上記ＬＲＶの差が１．０ｌｏｇ以下および１．５ｌｏｇ以下であるため、４℃（冷蔵温度）および２５℃（室温）においてウイルスを安定的に保存および輸送することができると評価することができる。試料６は、上記ＬＲＶの差が２５℃において１．５ｌｏｇを超え、４℃において１．０ｌｏｇを超えた。
　〔実験３：ウイルス安定化剤中のゼラチン加水分解物の適切な濃度の検討〕
　試料１、試料７、試料８、試料９、試料１０、試料１１および試料１２に関し、４℃で５６日間および２５℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて４℃でのウイルス力価のＬＲＶ、および２５℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。さらに試料１、試料７、試料８、試料９、試料１０、試料１１および試料１２に関し、－８０℃で２１日間および５６日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき、試料１、試料７、試料８、試料９、試料１０、試料１１および試料１２関し、２５℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。結果を表６に示す。さらに表７において、試料１、試料７、試料８、試料９、試料１０、試料１１および試料１２に関し、４℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記表６および表７によれば、試料１、試料９、試料１０、試料１１および試料１２は、それぞれ上記ＬＲＶの差が１．０ｌｏｇ以下および１．５ｌｏｇ以下であるため、４℃（冷蔵温度）および２５℃（室温）においてウイルスを安定的に保存および輸送することができると評価することができる。試料７および試料８は、いずれも上記ＬＲＶの差が２５℃において１．５ｌｏｇを超え、４℃において１．０ｌｏｇを超えた。
　〔実験４：従来のウイルス安定化剤との比較〕
　試料１および試料１３に関し、４℃で５６日間および２５℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて４℃でのウイルス力価のＬＲＶ、および２５℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。さらに試料１および試料１３に関し、－８０℃で２１日間および５６日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき試料１および試料１３に関し、２５℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。結果を表８に示す。さらに表９において、試料１および試料１３に関し、４℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で５６日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記表８および表９によれば、試料１は試料１３に比べ、４℃（冷蔵温度）および２５℃（室温）においてウイルス力価の低下を抑制できると評価することができる。
　〔実験５：ウイルスの種類毎のウイルス安定化剤の効果の検討〕
　試料１、試料１４、試料１５、試料１６および試料１７に関し、２５℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて２５℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。さらに試料１、試料１４、試料１５、試料１６および試料１７に関し、－８０℃で２１日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき試料１、試料１４、試料１５、試料１６および試料１７に関し、２５℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。なお、試料１７についてはＴＣＩＤに代えてＦＦＵを求めた。結果を表１０に示す。
　さらに試料１、試料１４、試料１５および試料１６に関し、４℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０をそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて４℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。試料１、試料１４、試料１５および試料１６に関し、－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した各検体のＴＣＩＤ５０もそれぞれ求め、当該ＴＣＩＤ５０の値に基づいて－８０℃でのウイルス力価のＬＲＶを算出した。これらに基づき試料１、試料１４、試料１５および試料１６に関し、４℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶと－８０℃で２１日間、５６日間および２１０日間保存した各検体におけるウイルス力価のＬＲＶとの差を算出した。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記表１０および表１１によれば、試料１、試料１４、試料１５、試料１６および試料１７は、それぞれ上記ＬＲＶの差が１．０ｌｏｇ以下および１．５ｌｏｇ以下であるため、４℃（冷蔵温度）および２５℃（室温）においてウイルスを安定的に保存および輸送することができると評価することができる。なお、上記表１０および表１１によれば、２５℃で３週間活性を維持した試料１、試料１４～試料１６は、いずれも４℃で３０週間まで活性を維持できているため、試料１７も同様に４℃（冷蔵温度）で３０週間まで活性を維持できる可能性が高いと推定される。
　上述した実験１～５の結果を考慮すれば、試料１～試料４、試料９～試料１２および試料１４～試料１７の各実施例は、４℃の環境下で２１日間、ウイルスを安定的に保存および輸送することができると評価することができる。
　〔実験６：ウイルス安定化剤の凍結融解を繰り返した場合の影響〕
　試料１を－８０℃で凍結した後、これを氷水の中で融解した。このような操作を３回繰り返した。融解する毎（凍結融解１回目、２回目および３回目）にそれぞれ試料１のウイルス力価を測定し、試料１の凍結融解前のウイルス力価と比較するための対数減少値（ＬＲＶ）を算出した。結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上記表１２によれば、試料１は、１～３回の凍結融解でいずれも上記ＬＲＶが０付近に維持されたため、凍結融解を行った場合もウイルス力価を維持できると評価することができる。
　以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
　今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (15)

  1. 　ゼラチン加水分解物と水性メディウムとからなるウイルス安定化剤であって、
    　前記ウイルス安定化剤は、前記ゼラチン加水分解物を１質量％以上２０質量％以下含み、
    　前記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が１００００以下であり、
    　前記ゼラチン加水分解物は、等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である、ウイルス安定化剤。
  2. 　前記ゼラチン加水分解物は、重量平均分子量が６０００以下である、請求項１に記載のウイルス安定化剤。
  3. 　前記ゼラチン加水分解物は、アルカリ処理ゼラチンの加水分解物である、請求項１または請求項２に記載のウイルス安定化剤。
  4. 　前記ウイルス安定化剤は、前記ゼラチン加水分解物を２質量％超１０質量％以下含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のウイルス安定化剤。
  5. 　前記水性メディウムは、緩衝作用を有する塩を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のウイルス安定化剤。
  6. 　前記水性メディウムは、ショ糖、乳糖、ソルビトール、イノシトール、トレハロース、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリトリトールおよびグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１種の糖類を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のウイルス安定化剤。
  7. 　前記水性メディウムは、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のウイルス安定化剤。
  8. 　重量平均分子量が１００００以下であり、かつ等電点のｐＨが４．０以上７．０以下である、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物。
  9. 　前記ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物は、液体または粉体である、請求項８に記載のウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物。
  10. 　請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のウイルス安定化剤と、ウイルスとを含む、ウイルス含有組成物。
  11. 　前記ウイルスは、エンベロープを有するＤＮＡウイルス、エンベロープを有さないＤＮＡウイルス、エンベロープを有するＲＮＡウイルスおよびエンベロープを有さないＲＮＡウイルスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１０に記載のウイルス含有組成物。
  12. 　前記ウイルスは、遺伝子導入されている、請求項１０または請求項１１に記載のウイルス含有組成物。
  13. 　前記ウイルス含有組成物は、２５℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値と、－８０℃で２１日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値との差が１．５ｌｏｇ以下である、請求項１０から請求項１２のいずれか１項に記載のウイルス含有組成物。
  14. 　前記ウイルス含有組成物は、４℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値と、－８０℃で２１０日間保存した場合のウイルス力価の対数減少値との差が１．０ｌｏｇ以下である、請求項１０から請求項１３のいずれか１項に記載のウイルス含有組成物。
  15. 　前記ウイルス含有組成物は、凍結融解を３回繰り返した場合のウイルス力価の対数減少値が０．３ｌｏｇ以下である、請求項１０から請求項１４のいずれか１項に記載のウイルス含有組成物。
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