BR112020021358A2 - Métodos de proteção da atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa, de uma pluralidade de moléculas de uma molécula biologicamente ativa, e, da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa - Google Patents
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
são descritas composições e métodos que se referem à proteção da atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa, incluindo uma proteína biologicamente ativa ou modificador de resposta biológica, tal como um modificador de resposta imune, contra danos de radiação durante a esterilização por radiação. a inclusão de pelo menos um composto radioprotetor, por exemplo, cisteína, glutationa reduzida, melatonina e/ou histidina, em uma formulação de lectina mitogênica exemplar durante a secagem por pulverização em superfícies de tubos de imunoensaio, surpreendentemente protegeu a lectina contra a atividade de perda de material biológico (mitogênico) o que de outra forma resultaria a partir da esterilização por radiação por feixe de elétrons. o composto radioprotetor também protegeu outras moléculas biologicamente ativas e estabilizou suas atividades biológicas, permitindo-lhes reter a atividade biológica após armazenamento prolongado após o tratamento por radiação.
Description
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FUNDAMENTOS Campo Técnico
[001] As presentes modalidades se referem geralmente a ensaios biológicos in vitro. Mais especificamente, a presente descrição se refere a composições e métodos que preservam, protegem e/ou restauram e/ou estabilizam a atividade biológica de moléculas biologicamente ativas, incluindo, mas não se limitando a proteínas biologicamente ativas e/ou modificadores de resposta biológica, como modificadores de resposta imune, cujas atividades seriam de outra forma comprometidas e/ou diminuídas durante e/ou após a esterilização por radiação. Descrição da Técnica Relacionada
[002] Os ensaios in vitro da atividade imunológica de células, tais como células do sistema imunológico presentes em uma amostra biológica obtida de um paciente (por exemplo, linfócitos, monócitos, macrófagos, células dendríticas ou outras células do sistema imunológico) são bem conhecidos na técnica para propósitos diagnósticos e prognósticos. Por exemplo, amostras de sangue total ou glóbulos brancos separados de tais amostras podem ser testados in vitro para avaliar a capacidade de resposta imune por uma série de medições, tais como proliferação celular, liberação de mediador solúvel e/ou ativação em resposta à estimulação por mitógenos, por antígeno(s) específico(s), ou por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), receptores e outros agonistas.
[003] Os mitógenos incluem proteínas que são conhecidas por estimular a mitose celular e são usadas como reagentes imunológicos para
2 / 45 induzir a proliferação de linfócitos de um modo não específico para o antígeno. Os mitógenos de linfócitos podem ser ativadores policlonais que estimulam os linfócitos a proliferar e/ou liberar/secretar mediadores solúveis, e podem fazê-lo através do engajamento de mecanismos moleculares de linfócitos não estimulados por antígenos enquanto contornam os receptores específicos do antígeno (imunoglobulinas (Ig) ou receptores de células T (TCR) para eliciar uma resposta policlonal robusta que pode ser facilmente detectada. Mitógenos de células T exemplares incluem as proteínas biologicamente ativas fito-hemaglutinina (PHA) e concanavalina A (ConA), que são lectinas (por exemplo, ligação a carboidratos derivados de plantas). Uma outra lectina, o mitógeno pokeweed (PWM), é capaz de estimular as células T e B. Lectinas mitogênicas de uma variedade de fontes foram descritas (por exemplo, Shanmugham et al., 2006 Riv Biol. 99:227; Naeem et al., 2007 Curr. Protein Pept. Sci 8:261; Singh et al., 2014 Crit. Rev. Microbiol. 40:329). Certos anticorpos que se ligam especificamente às moléculas de superfície celular de linfócitos capazes de ativar a transdução de sinal também podem funcionar como mitógenos.
[004] Os mitógenos são, portanto, particularmente úteis para avaliar a imunorresponsividade geral em uma amostra contendo linfócitos ao induzir/estimular respostas policlonais robustas que podem ser prontamente medidas em amostras nas quais as imunodetecções de respostas monoclonais ou oligoclonais podem não ser suficientemente sensíveis devido à baixa intensidade do sinal ou baixas frequências de linfócitos que respondem aos antígenos específicos.
[005] O ensaio QuantiFERON® TB Gold Mitogen Control (por exemplo, Mazurek et al., 2005 MMWR Recomm. Rep 54:49-55; Mazurek et al., 2010 MMWR Recomm. Rep. 59:1-25; Simpson et al., 2012 Heart Lung 41:553; Cho et al., 2012 Tuberc. Respir. Dis. (Seoul) 72:416; Woo et al., 2014 Clin. Chim. Acta 430:79), por exemplo, emprega a proteína
3 / 45 biologicamente ativa PHA (uma lectina) como um mitógeno policlonal para induzir respostas robustas de células T in vitro, a partir das quais o status imunorresponsivo de células T presentes em uma amostra pode ser avaliado. Neste teste, o PHA é convenientemente provido na forma seca como um revestimento nas superfícies internas dos tubos de coleta de sangue. Os tubos revestidos com mitógeno são preparados por secagem por pulverização de uma solução contendo PHA nas superfícies internas, seguido por esterilização por radiação (por exemplo, radiação por feixe de elétrons, irradiação gama, etc.) para matar ou inativar quaisquer contaminantes microbianos potenciais que possam estar presentes. O uso de produtos químicos em vez de radiação para atingir um ambiente estéril pode não ser o ideal, pois os produtos químicos podem interferir na atividade biológica das células durante a estimulação e/ou interferir em outros sistemas de detecção de ensaio. A radiação por feixe de elétrons é uma técnica padrão conhecida na técnica para tal esterilização por radiação (por exemplo, Smith et al., Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141; Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol. 66:184; Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24; Yaman, 2001 Curr. Opin. Drug Devel. 4:760) de proteínas biologicamente ativas.
[006] É desejável ter um ambiente estéril nos tubos de coleta/cultura de sangue para que a capacidade de resposta imunológica dos linfócitos na amostra biológica (por exemplo, sangue total ou leucócitos de sangue periférico isolado) após a exposição a componentes de ensaio biologicamente ativos conhecidos (por exemplo, uma proteína mitogênica como PHA) não é alterada ou obscurecida por uma resposta celular a contaminantes microbianos presentes no ensaio/tubo de cultura. Além disso, como os tubos de coleta de sangue podem entrar em contato direto com o sangue de um paciente, existe o risco de um agente infeccioso ser transmitido ao paciente se o conteúdo do tubo não for estéril.
[007] A esterilização por radiação por feixe de elétrons, no entanto,
4 / 45 tem sido relatada como alterando significativamente as propriedades estruturais, biológicas e/ou imunológicas das proteínas, levantando assim preocupações sobre os efeitos potencialmente prejudiciais de tal radiação a produtos biológicos e biomédicos (por exemplo, Katial et al., 2002 J Allerg Clin Immunol 110:215; Terryn et al., 2007 Int J Pharm 343:4; Antebi et al., 2016 Rev Bras Ortop 51:224). Por exemplo, a esterilização por feixe de elétrons pode diminuir drasticamente a potência e afetar a consistência lote a lote das preparações de proteína nos tubos de imunoensaio/cultura estéreis, tais como as formulações de PHA em tubos de coleta de sangue QuantiFERON® TB Gold Mitogen. Como consequência, a eficiência de produção diminuirá devido à diminuição da bioatividade de um ingrediente ativo (por exemplo, um mitógeno) como resultado da esterilização por radiação terminal. Quantidades maiores de entrada de matérias-primas (por exemplo, proteína mitogênica) usadas na produção de tubos de coleta são, portanto, necessárias para compensar a perda de bioatividade, mas a necessidade de tais quantidades aumentadas resultará em custos de produção aumentados e variabilidade indesejável entre os diferentes lotes de produção.
[008] Várias publicações ensinam métodos de proteção de tecidos biológicos, células e/ou biomoléculas de danos de radiação, modificando o teor de solvente, temperatura, pH, teor de oxigênio ou outros parâmetros durante a esterilização por radiação e/ou usando vários estabilizadores durante os procedimentos de esterilização. A partir dessas descrições, é evidente que a praticabilidade, compatibilidade e radioproteção de qualquer biomolécula ou classe de biomoléculas em particular por um determinado estabilizador ou combinação de estabilizadores, ou obtenção de radioproteção por modificação de outras condições, não pode ser prevista, mas deve ser determinado empiricamente para as biomoléculas que desejam ser protegidas.
[009] Por exemplo, o documento EP2236520 descreve a estabilização de biomoléculas, incluindo estabilização de proteção de contra
5 / 45 efeitos prejudiciais da radiação eletromagnética, sob condições selecionadas para evitar o congelamento das biomoléculas. Os estabilizadores incluem o uso de um mínimo necessário de pelo menos dois aminoácidos diferentes e até 18 aminoácidos diferentes, com combinações de dois a cinco aminoácidos diferentes sendo preferidas. O documento US5730933 descreve a proteção de biomoléculas de danos de radiação por contato com uma proteína estranha (por exemplo, albumina de soro bovino ou colágeno desnaturado) e um eliminador de radical livre/antioxidante e congelamento antes da irradiação, opcionalmente com uma etapa de liofilização. O documento US6946098 descreve a adição de albumina de soro humano (HSA) a produtos biológicos como um estabilizador, seguido por esterilização por radiação para destruir príons, vírus ou outros patógenos. Uma extensa lista de agentes estabilizadores alternativos é descrita incluindo ácidos graxos, antioxidantes, sequestrantes de radicais livres, heparina e compostos de tiol, mas apenas HSA é descrito nos Exemplos trabalhados.
[0010] Os documentos US20030012687 e US20030031584 descrevem a radioproteção de tecidos ou biomoléculas, como imunoglobulinas usando estabilizadores retirados de uma ampla variedade de classes de compostos, incluindo ácidos graxos, eliminadores de radicais livres, antioxidantes, açúcares, aminoácidos e dipeptídeos selecionados, Trolox (CAS 53188-07- 1) e outros. Os documentos US20030143106 e US20040086420 descrevem a radioproteção de tecidos e de várias proteínas do sangue, soro e plasma usando uma variedade de antioxidantes, ácidos graxos, aminoácidos, vitaminas e/ou eliminadores de radicais livres. O documento US20050069453 descreve a proteção da uroquinase durante a esterilização por radiação, modificando as propriedades da amostra (por exemplo, composição do solvente, pH, temperatura, etc.) ou adicionando qualquer um de uma extensa lista de agentes estabilizadores, apenas um pequeno número dos quais é demonstrado que conferem radioproteção nos
6 / 45 exemplos trabalhados.
[0011] Claramente, há uma necessidade de proteger a atividade biológica de proteínas biologicamente ativas e outras moléculas biologicamente ativas contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, para melhorar a qualidade e consistência do produto de imunoensaio e para reduzir a quantidade de matéria-prima necessária para a produção de tubo/sistema de imunoensaio/cultura. As modalidades da invenção presentemente descritas atendem a essas necessidades e oferecem outras vantagens relacionadas.
[0012] De acordo com certos aspectos da invenção presentemente descrita, é provido um método de proteção da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, compreendendo: (a) contactar a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; e (b) esterilizar por radiação a mistura radioprotegida, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa que é esterilizado por radiação sem o composto radioprotetor presente, protegendo assim a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação. Em uma outra modalidade, a mistura radioprotegida é seca antes da etapa de esterilização por radiação.
[0013] Em outra modalidade, é provido um método de proteção de uma pluralidade de moléculas de uma proteína biologicamente ativa ou outra
7 / 45 molécula biologicamente ativa contra uma perda de atividade biológica da dita pluralidade de moléculas durante um período de tempo de armazenamento, compreendendo (a) contactar a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; (c) esterilizar por radiação a mistura seca radioprotegida; e (d) armazenar a mistura radioprotegida seca por um período de tempo para obter uma mistura radioprotegida seca armazenada, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida seca armazenada após esterilização por radiação e armazenamento durante o dito período de o tempo é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa que é seca, esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, em seguida, armazenada durante o período de tempo, protegendo assim uma pluralidade de moléculas do proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra perda de atividade biológica durante o período de armazenamento.
[0014] Em certas outras modalidades, é provido um método de proteção da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa, como uma imidazoquinolina biologicamente ativa com atividade agonista de TLR contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, compreendendo (a) contactar a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa, por exemplo, a imidazoquinolina biologicamente ativa com atividade agonista de TLR, em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; e (c)
8 / 45 esterilização por radiação da mistura radioprotegida seca para obter uma mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação, em que, após reidratação da mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida reidratada esterilizada por radiação, atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outro biologicamente ativo molécula (por exemplo, a imidazoquinolina biologicamente ativa) na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa (por exemplo, imidazoquinolina biologicamente ativa) que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente, protegendo assim a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa (por exemplo, imidazoquinolina biologicamente ativa) contra danos de radiação durante a esterilização por radiação. Em certas outras modalidades, a imidazoquinolina biologicamente ativa com atividade agonista de TLR compreende um ou mais de imiquimod, gardiquimod e resiquimod (R848).
[0015] Em certas modalidades adicionais dos métodos descritos acima, a proteína biologicamente ativa é um mitógeno, que em algumas modalidades adicionais é selecionado dentre fito-hemaglutinina (PHA), concanavalina A (ConA) e mitógeno pokeweed (PWM). Em certas outras modalidades adicionais dos métodos descritos acima, a proteína biologicamente ativa compreende um ou mais dentre (i) um mitógeno, (ii) um anticorpo, (iii) uma enzima, (iv) uma citocina, (v) um fator de crescimento e (vi) um hormônio. Em certas modalidades, o composto radioprotetor compreende pelo menos um composto antioxidante, que em certas modalidades adicionais é selecionado dentre cisteína, glutationa e melatonina. Em certas modalidades, o composto radioprotetor compreende histidina. Em certas modalidades dos métodos descritos acima, o composto radioprotetor está presente na mistura radioprotegida em uma concentração de pelo menos
9 / 45 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 50 milimolar. Em certas modalidades, a atividade biológica compreende atividade mitogênica, que em certas modalidades adicionais compreende atividade de indução da proliferação de linfócitos. Em certas modalidades adicionais, a atividade de proliferação de linfócitos compreende atividade de indução da proliferação de células T.
[0016] Estes e outros aspectos e modalidades da invenção aqui descrita serão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Todas as patentes U.S., publicações de pedidos de patentes U.S., pedidos de patentes U.S., patentes estrangeiras (não U.S.), pedidos de patentes estrangeiras e publicações não relacionadas a patentes ditas nesta especificação e/ou listadas na Folha de Dados do Pedido são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, como se cada um fosse incorporado individualmente. Aspectos e modalidades da invenção podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para prover ainda outras modalidades.
[0017] A Figura 1 mostra a proteção da atividade biológica dependente da concentração em uma formulação de PHA-P tratada com esterilização por radiação por feixe de elétrons a 25 kGy em solução. Cisteína (círculos fechados) e melatonina (círculos abertos) foram dissolvidos na mesma formulação de PHA-P em várias concentrações finais. As atividades mitogênicas foram determinadas medindo a secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores de sangue usando QuantiFERON® ELISA de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN, Inc., Germantown, MD). As porcentagens médias do grupo de atividade mitogênica sobre os controles (PHA-P sozinho sem quaisquer aditivos) são apresentadas. Os resultados demonstraram proteção dependente da dose das atividades mitogênicas da cisteína e da melatonina em solução.
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[0018] A Figura 2 mostra a proteção da potência mitogênica contra a perda de atividade biológica do PHA-P seco por pulverização em um tubo de coleta de sangue QuantiTFERON® Mitogen Control durante a esterilização por radiação por feixe de elétrons. Os tubos de colheita de sangue QuantiFERON® Mitogen Control foram fabricados com uma formulação de mitógeno (PHA) suplementada com cisteína (concentração final de 5 mM na formulação de mitógeno líquido). As respostas mitogênicas foram determinadas em tubos de mitógeno formulados com e sem cisteína, tratados e não tratados com esterilização por radiação por feixe de elétrons, em um grupo de oito doadores. Os dados foram normalizados para a% de resposta do controle, que foi o tubo de mitógeno de controle não esterilizado (sem cisteína). Cada ponto na figura representa o ponto de dados de um doador. Os resultados demonstraram que a cisteína não afetou a resposta mitogênica, mas protegeu a atividade mitogênica do PHA-P seco por pulverização na esterilização por radiação por E-Beam.
[0019] A Figura 3 mostra as porcentagens das diferenças na potência do mitógeno em tubos de coleta de sangue QuantiFERON® Mitogen Control produzidos com e sem 5 mM de cisteína em PHA seguido por esterilização por radiação por feixe de elétrons e armazenados pelo número indicado de meses de pós-produção. Os tubos de colheita de sangue QuantiFERON® Mitogen Control foram produzidos com e sem cisteína (concentração final de 5,0 mM na formulação de mitógeno líquido) e esterilizados com radiação por E-Beam. As atividades biológicas (mitogênicas) dos tubos de mitógeno foram testadas ao longo do tempo e são apresentadas como % de diferenças de potência da atividade dos tubos de mitógeno formulados com cisteína em comparação com os tubos de mitógeno formulados sem cisteína. Cada ponto na figura representa a % de atividade da média do grupo em cada ponto de tempo. Os resultados demonstraram que os tubos de mitógeno formulados com cisteína apresentaram% de atividade maior do que os tubos formulados
11 / 45 sem cisteína ao longo do tempo, indicando que os tubos de mitógeno com cisteína tiveram menos perda de atividade ao longo do tempo do que os tubos sem cisteína.
[0020] A Figura 4 mostra a proteção da atividade estimuladora de células T do anticorpo anti-CD3 contra a radiação por E-Beam pelos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH), conforme avaliado pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0021] A Figura 5 mostra os efeitos da titulação dos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH) na proteção da atividade estimuladora das células T do anticorpo anti-CD3 contra a radiação por E- Beam, conforme avaliado pela secreção de IFN-γ no total amostras de sangue de seis doadores.
[0022] A Figura 6 mostra a proteção da atividade estimuladora das células NK do modificador da resposta imune agonista de TLR imidazoquinolina R848 (resiquimod) contra a radiação por E-Beam pelos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH), conforme avaliado pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0023] A Figura 7 mostra os efeitos da titulação dos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH) na proteção da atividade estimuladora das células NK do modificador da resposta imune agonista TLR imidazoquinolina R848 (resiquimod) contra a radiação de E-Beam, conforme avaliado por Secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0024] A Figura 8 mostra a proteção da atividade estimuladora de células T combinada de anticorpo anti-CD3 e atividade estimuladora de células NK do modificador de resposta imune de imidazoquinolina agonista de TLR R848 (resiquimod) contra a radiação de E-Beam pelos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH), conforme avaliado pela
12 / 45 secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0025] A Figura 9 mostra os efeitos da titulação dos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH) na proteção da atividade estimuladora de células T combinada de anticorpo anti-CD3 e atividade estimuladora de células NK do modificador de resposta imune imidazoquinolina agonista TLR R848 (resiquimod) contra a radiação por E- Beam, avaliada pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0026] A Figura 10 mostra a proteção da potência mitogênica do mitógeno pokeweed (PWM) contra a radiação por E-Beam pelos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH), conforme avaliado pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0027] A Figura 11 mostra os efeitos da titulação dos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH) na proteção da potência mitogênica do mitógeno pokeweed (NMP) contra a radiação por E-Beam, conforme avaliado pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0028] A Figura 12 mostra a proteção da atividade estimuladora de células T do mitógeno de células T conconavalina A (ConA) contra a radiação por E-Beam pelos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G- SH), conforme avaliado pela secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0029] A Figura 13 mostra os efeitos da titulação dos compostos radioprotetores cisteína (Cys) ou glutationa (G-SH) na proteção da atividade estimuladora de células T do mitógeno de células T conconavalina A (ConA) contra a radiação de E-Beam, conforme avaliado por Secreção de IFN-γ em amostras de sangue total de seis doadores.
[0030] Certas modalidades atualmente descritas se referem à
13 / 45 descoberta surpreendente de que a atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa, como um modificador de resposta biológica ou um modificador de resposta imune, que de outra forma seria comprometida por esterilização por radiação, pode ser substancialmente radioprotegida (por exemplo, aumentada de uma maneira estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) se a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa for posta em contato com um composto radioprotetor como provido aqui, antes da esterilização por radiação.
[0031] Mais especificamente, e a título de exemplo não limitativo, como aqui descrito, verificou-se que a atividade mitogênica de PHA em relação aos linfócitos T era significativamente diminuída pela esterilização por radiação de tubos de imunoensaio nos quais uma solução de PHA foi seca por pulverização. Conforme descrito aqui pela primeira vez, no entanto, se o PHA foi colocado em contato com pelo menos um composto radioprotetor como provido aqui antes da esterilização por radiação, por exemplo, um ou mais compostos radioprotetores, tais como cisteína, glutationa reduzida, melatonina e/ou histidina, então a atividade biológica de PHA - isto é, atividade mitogênica para glóbulos brancos presentes na amostra de sangue total humano - após a esterilização por radiação foi surpreendentemente maior do que a atividade de uma amostra de PHA de controle que foi esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente. Além disso, e como também descrito aqui pela primeira vez, o efeito protetor de contactar a proteína biologicamente ativa (PHA) com o composto radioprotetor em solução para obter uma mistura radioprotegida persistiu inesperadamente após a secagem substancial da mistura, tal como por pulverização secar e/ou liofilizar (por exemplo, liofilização). Além disso, a mistura radioprotegida substancialmente seca exibiu estabilidade surpreendentemente de longo prazo, com proteção substancial da atividade biológica sendo demonstrada após mais
14 / 45 de oito meses de armazenamento.
[0032] Estas e modalidades relacionadas, portanto, encontrarão usos em um grande número de contextos nos quais pode ser desejado prover uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa (incluindo um modificador de resposta biológica, como um modificador de resposta imune) em um ambiente estéril, tal como uma preparação seca por pulverização, desidratada e/ou seca da proteína biologicamente ativa (ou outra molécula biologicamente ativa) sozinha ou em uma superfície de qualquer tipo de recipiente (por exemplo, tubo de ensaio, placa de ensaio, micropoço, placa de cultura, amostra de sangue recipiente, garrafa, copo, frasco, ampola, seringa ou qualquer outro recipiente apropriado) que pode ser vantajosamente esterilizado por radiação a fim de obter os benefícios associados a um ambiente estéril. Certas modalidades preferidas, conforme descrito neste documento, se referem a mitógenos de proteínas radioprotegidas para uso em qualquer um de uma variedade de ensaios imunológicos in vitro, mas as modalidades contempladas não se destinam a ser tão limitadas de modo que outras proteínas biologicamente ativas (por exemplo, anticorpos imunoestimuladores) ou outros biologicamente moléculas ativas (por exemplo, modificadores de resposta biológica, como modificadores de resposta imunológica, por exemplo, agonistas do receptor do tipo Toll de imidazoquinolina (TLR), por exemplo, a título de ilustração e não de limitação, imiquimod, gardiquimod, resiquimod, etc.) também são previstos em configurações nas quais a proteína biologicamente ativa ou molécula biologicamente ativa pode ser vantajosamente esterilizada por radiação sem perda substancial de atividade biológica.
[0033] Conforme descrito neste documento, a atividade biológica de uma substância significa qualquer atividade que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula
15 / 45 ou interação relacionada a um organismo, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, células, vírus, bactérias, bacteriófago, príons, insetos, fungos, plantas, animais e humanos. Exemplos de substâncias com atividade biológica incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos, peptídeos, proteínas e, em particular, proteínas biologicamente ativas, incluindo enzimas, anticorpos, glicoproteínas, lectinas, proteínas mitogênicas, incluindo lectinas mitogênicas, pequenas moléculas (por exemplo, uma pequena molécula bioativa ), composições farmacêuticas (por exemplo, drogas), vacinas, modificadores de resposta biológica, incluindo modificadores de resposta imune, como imidazoquinolinas com atividade agonista de TLR (por exemplo, imiquimod, gardiquimod, resiquimod (R848), etc.), carboidratos, lipídios, esteróides, hormônios, quimiocinas, fatores de crescimento, citocinas, lipossomas e toxinas.
[0034] Pessoas familiarizadas com a técnica relevante reconhecerão ensaios e métodos adequados para determinar a atividade biológica de substâncias que afetam as propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, por exemplo, uma ou mais atividades biológicas que podem incluir, mas não estão limitadas a, imunológicas, atividades imunoquímicas, de citocinas, hormônios e peptídeos bioativos e outras atividades de proliferação celular (por exemplo, mitogênica) e/ou diferenciação (ver por exemplo, Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ), transdução de sinal (ver por exemplo, Bonifacino et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Cell Biology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ), imunopotenciação e/ou atividade modificadora da resposta imune, como imidazoquinolinas, para exemplo, os agonistas de TLR imiquimod, gardiquimod, resiquimod (R848), etc. (por exemplo, Gerster et al., 2005 J. Med. Chem. 48:3481; Shukla et al., 2010 J. Med. Chem. 53:4450; Shi et al., 2012 ACS Med. Chem. Lett. 3(6):501-504; Tomai et al., Ch. 8, Toll- Like Receptor 7 and 8 Agonists for Vaccine Adjuvant Use, págs. 149-161, and
16 / 45 Skountzu et al., Ch. 20, Adjuvants for Skin Vaccination, págs.. 399-419, in Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns et al. (eds.), 2017 Academic Press, NY), expressão gênica (ver, por exemplo, Asubel, FM et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ), interações receptor-ligante (ver, por exemplo, Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ), atividade enzimática (ver, por exemplo, Eisenthal and Hanson (Eds.), Enzyme Assays, Second Edition, Practical Approaches series, No. 257. 2002, Oxford University Press, Oxford, UK; Kaplan and Colowick (Eds.), Preparation and Assay of Enzymes, Methods in Enzymology, (vols. 1, 2 and 6). 1955 and 1961, Academic Press, Ltd., Oxford, UK) e toxicidade celular (por exemplo, citotoxicidade, excitotoxicidade) (ver, por exemplo, Bus JS et al. (Eds) 2007 Current Protocols in Toxicology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ), apoptose e necrose (Green and Reed, 1998 Science 281(5381):1309-12; Green DR, 1998 Nature Dec 17: 629; Green DR, 1998 Cell 94(6):695-69; Reed, JC (Ed.), 2000 Apoptosis, Methods in Enzymology (vol. 322), Academic Press Ltd., Oxford, UK); ou outras atividades biológicas.
[0035] Em modalidades preferidas, conforme descrito neste documento, é provido um método de proteção de substancialmente a atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa e/ou outra molécula biologicamente ativa (incluindo um modificador de resposta biológica, tal como um modificador de resposta imune, por exemplo, uma imidazoquinolina tendo agonista de TLR atividade (por exemplo, imiquimod, gardiquimod, resiquimod (R848)), contra danos de radiação durante a esterilização por radiação. Em certas outras modalidades preferidas, a proteína biologicamente ativa é um ou uma pluralidade de mitógenos, por exemplo, um ou mais de PHA, ConA e/ou PWM e/ou a proteína biologicamente ativa compreende um ou mais de um anticorpo, uma citocina, uma enzima, um fator de crescimento e um hormônio e/ou a molécula biologicamente ativa compreende um
17 / 45 modificador de resposta imune que compreende um ou um pluralidade de imidazoquinolinas com atividade agonista de TLR, por exemplo, imiquimod, gardiquimod e/ou resiquimod (R848).
[0036] Em certas modalidades preferidas, conforme descrito neste documento, é provido um método de proteção de uma pluralidade de moléculas de uma molécula biologicamente ativa, que em certas modalidades preferidas pode ser uma proteína biologicamente ativa e em certas outras modalidades preferidas pode ser uma molécula biologicamente ativa que compreende um ou mais modificadores de resposta biológica, tais como modificadores de resposta imune, por exemplo, modificadores de resposta imune de imidazoquinolina com atividade agonista de TLR, contra uma perda de atividade biológica da dita pluralidade de moléculas durante um período de tempo de armazenamento, compreendendo contactar a proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; esterilizar por radiação a mistura radioprotegida seca; e armazenar a mistura radioprotegida seca por um período de tempo para obter uma mistura radioprotegida seca armazenada, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) na mistura radioprotegida seca armazenada após esterilização por radiação e armazenamento durante o dito período de tempo é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) que é seca, esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, em seguida, armazenada durante o período de tempo, protegendo assim uma pluralidade de moléculas da proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) contra a perda de atividade biológica durante o período de tempo de
18 / 45 armazenamento.
[0037] O período de tempo para armazenamento pode variar consideravelmente em função da(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) particular(es), a atividade biológica particular ou atividades de tal molécula(s), as condições de esterilização por radiação, o(s) radioprotetor(es), o grau em que o a mistura radioprotegida é seca, as condições de armazenamento (incluindo, por exemplo, temperatura, umidade relativa, atmosfera ambiente, etc.), e outros fatores. Normalmente, o período de tempo de armazenamento durante o qual a(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) (por exemplo, proteína(s) biologicamente ativa(s)) é protegida contra uma perda de atividade biológica (por exemplo, uma redução estatisticamente significativa na atividade biológica em relação a um controle apropriado) pode ser pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou mais meses.
[0038] A atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) pode ser substancialmente protegida de acordo com certas modalidades aqui descritas quando, após a esterilização por radiação de uma composição que compreende a proteína biologicamente ativa ou outra(s) molécula(s) biologicamente ativa(s), há recuperação completa da atividade biológica ou recuperação substancial (por exemplo, recuperação de pelo menos 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou 50 por cento, de preferência pelo menos 52, 54, 56, 58 ou 60 por cento, mais preferencialmente pelo menos 62, 64, 66, 68 ou 70 por cento, mais preferencialmente pelo menos 72, 74, 76 ou 80 por cento e, normalmente, em modalidades mais preferidas, pelo menos 81, 82, 83, 84 ou 85 por cento, mais preferencialmente pelo menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ou 94 por cento, mais preferencialmente pelo menos 95 por cento, ainda mais preferencialmente superior a 96, 97, 98 ou 99 por cento) da atividade
19 / 45 biológica.
[0039] Em certas modalidades que são aqui descritas, uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa (incluindo um modificador de resposta biológica biologicamente ativa, como um modificador de resposta imune, por exemplo, um modificador de resposta imune imidazoquinolina com atividade agonista de TLR) em uma solução aquosa é contactada com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação.
[0040] A esterilização por radiação da mistura radioprotegida pode ser alcançada de acordo com qualquer um de uma série de procedimentos conhecidos, por exemplo, radiação por feixe de elétrons conforme descrito por, por exemplo, Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141; Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol. 66:184; Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24; Yaman, 2001 Curr. Opin. Drug Devel. 4:760; Katial et al., 2002 J Allerg Clin Immunol 110:215; Terryn et al., 2007 Int J Pharm 343:4; and Antebi et al., 2016 Rev Bras Ortop 51:224.
[0041] Em certas modalidades preferidas, a mistura radioprotegida é seca ou substancialmente seca antes da esterilização por radiação, que normalmente pode ser a secagem completa (por exemplo, com significância estatística, todo ou substancialmente todo o solvente detectável foi removido). Em certas modalidades que podem variar de acordo com a natureza da amostra a ser armazenada e seus usos pretendidos, mais de 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% do solvente detectável foi removido para fins de obtenção de uma mistura radioprotegida seca, seca, substancialmente seca ou substancialmente seca.
[0042] Após a etapa de contato da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa, conforme provido neste documento, com o composto radioprotetor para obter a mistura radioprotegida, a mistura radioprotegida pode ser seca de acordo com qualquer uma de uma variedade
20 / 45 de metodologias de secagem. Um método de secagem preferido é a liofilização (por exemplo, liofilização, como a secagem de uma solução aquosa congelada sob vácuo parcial ou completo para promover a remoção de água por sublimação do estado sólido congelado para a fase de vapor sem formação de água líquida). Outras técnicas de secagem também podem ser empregadas, por exemplo, secagem por evaporação de solvente (por exemplo, água) à temperatura e pressão ambiente, ou em uma capela de fluxo laminar ou câmara de dessecação, ou sob pressão atmosférica reduzida, incluindo sob vácuo (por exemplo, com bomba de vácuo como um SpeedVac®). Outros métodos de secagem também são contemplados e incluem, por exemplo, sem limitação, secagem por calor radiante, secagem sob uma fonte de luz, dessecação, secagem sob nitrogênio ou outro gás (por exemplo, de preferência sob uma corrente de um gás inerte fluindo), o uso de solventes de secagem ou outros produtos químicos, por exemplo, solventes orgânicos voláteis, tais como álcoois inferiores, alcanos inferiores e haloalcanos (por exemplo, pentanos, hexanos, cloreto de metileno, clorofórmio, tetracloreto de carbono), éteres (por exemplo, tetra-hidrofurano), acetato de etila, acetonitrila, ácido trifluoroacético, piridina, acetona ou outros solventes (de preferência na forma anidra), pressão do ar e outros métodos para facilitar e acelerar a evaporação.
[0043] A secagem da amostra pode ser determinada por simples inspeção visual ou toque (ou seja, batendo com uma ponta de pipeta) para garantir que toda a umidade foi evaporada ou removida. Em algumas modalidades, um indicador de umidade pode ser incluído preferencialmente para determinar um grau de secagem que foi alcançado. Por exemplo, cloreto de cobalto pode ser opcionalmente incluído como um indicador detectável (por mudança de cor visível ou colorimetria) do teor de umidade em uma amostra. Um indicador de umidade, como um dispositivo eletrônico que mede o conteúdo dielétrico do material para determinar o conteúdo de umidade (por
21 / 45 exemplo, Aqua-Spear™, Mastrad Limited, Douglas, Reino Unido) também é contemplado para uso em algumas dessas modalidades e outras relacionadas. Um agente de secagem, tal como sulfato de cálcio (isto é, Drierite®, W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH) ou pentóxido de fósforo com um indicador de umidade também é contemplado para uso em certas modalidades da presente descrição.
[0044] Como também descrito em outro lugar neste documento, a presente descrição se refere à descoberta inesperada de que a atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa, tal como provida neste documento, tal como uma proteína biologicamente ativa, cuja atividade seria de outra forma comprometida por esterilização por radiação, pode ser substancialmente radioprotegida (por exemplo, aumentou de forma estatisticamente significativa em relação à atividade biológica de um controle apropriado desprotegido, como aquele da mesma molécula biologicamente ativa (por exemplo, proteína biologicamente ativa) que foi submetida a esterilização por radiação na ausência de um radioprotetor) se o biologicamente ativo molécula é posta em contato com um composto radioprotetor como provido neste documento, antes da esterilização por radiação, para formar uma mistura radioprotegida que sofre esterilização por radiação.
[0045] Apesar das observações anteriores (por exemplo, conforme resumido acima) de certos efeitos radioprotetores conferidos por certos agentes estabilizadores para preservar ou preservar parcialmente pelo menos alguns atributos estruturais e/ou funcionais de tecidos biológicos, células ou moléculas biológicas, o especialista na técnica não teria razoavelmente esperado chegar à combinação de recursos descrita atualmente.
[0046] Assim, é descrito pela primeira vez neste documento um método de proteção de substancialmente a atividade biológica de uma
22 / 45 proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, compreendendo contactar a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; e esterilizar por radiação a mistura radioprotegida, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior (por exemplo, aumentada de uma maneira estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) do que a atividade biológica de um controle amostra da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, assim, protegendo substancialmente a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação. Em certas modalidades adicionais, a mistura radioprotegida é substancialmente seca antes da etapa de esterilização por radiação.
[0047] Também é descrito pela primeira vez neste documento um método de proteção de substancialmente a atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, compreendendo contactar a proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; secar substancialmente a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida substancialmente seca; e esterilizar por radiação a mistura radioprotegida substancialmente seca para obter uma mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca, em que, após reidratação da mistura radioprotegida esterilizada por radiação
23 / 45 substancialmente seca para obter uma mistura radioprotegida reidratada esterilizada por radiação, atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outro biologicamente ativo molécula na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior (por exemplo, aumentada de uma maneira estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, assim, protegendo substancialmente a atividade biológica da proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
[0048] Mais particularmente, de acordo com a presente descrição é demonstrado pela primeira vez que a atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa, tal como PHA, ConA ou PWM, ou anticorpo anti-CD3, que atua como um mitógeno para humanos e outros mamíferos periféricos linfócitos sanguíneos, é sensível à esterilização por radiação por feixe de elétrons e é diminuída (por exemplo, reduzida de maneira estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) em relação à atividade do mesmo mitógeno que não foi submetido à esterilização por radiação. Além disso, e como também descrito aqui pela primeira vez, a atividade biológica de tal mitógeno pode ser protegida (por exemplo, aumentada de uma maneira estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) dos efeitos comprometedores da radiação por feixe de elétrons ao ser contatado em pelo menos um composto radioprotetor conforme provido neste documento para formar uma mistura radioprotegida que é então submetida a esterilização por radiação.
[0049] A presente descrição também ensina pela primeira vez que nos métodos descritos neste documento, o composto radioprotetor que confere proteção de bioatividade nos presentes mitógenos pode compreender (ou
24 / 45 consistir em) um ou mais dentre cisteína, melatonina, glutationa e histidina.
[0050] Além disso, a presente descrição ensina pela primeira vez que o composto radioprotetor presentemente provido (por exemplo, como pode compreender ou consistir em um ou mais de cisteína, melatonina, glutationa e histidina) pode ser combinado com a presente proteína mitogênica biologicamente ativa (por exemplo , PHA, ConA e/ou PWM ou anticorpo anti-CD3) ou modificador de resposta imune (por exemplo, imidazoquinolina com atividade agonista de TLR, como imiquimod, gardiquimod, resiquimod (R848), etc.) para formar uma mistura radioprotegida que pode ser substancialmente seco (por exemplo, liofilizado), conforme provido neste documento, para sofrer esterilização por radiação como uma mistura radioprotegida substancialmente seca, em que mesmo nessa forma seca a presença do composto radioprotetor preserva a atividade biológica do mitógeno (por exemplo, cuja atividade é aumentada de uma maneira estatisticamente significativa quando comparado a um controle apropriado) em relação à atividade mitogênica de uma amostra de controle da qual o composto radioprotetor é omitido.
[0051] A presente descrição, portanto, ensina a radioproteção de mitógenos e outras moléculas biologicamente ativas por um método que a técnica anteriormente falhou em apreciar, usando compostos radioprotetores que anteriormente não seriam esperados ter tais capacidades, incluindo capacidade protetora quando presente junto com o mitógeno na forma de uma mistura radioprotegida substancialmente seca como aqui descrito. Por exemplo, os agentes anteriormente reconhecidos como tendo propriedades radioprotetoras em solução para proteínas diferentes dos mitógenos presentes são descritos neste documento como exibindo surpreendentemente efeitos radioprotetores para proteínas diferentes (por exemplo, os mitógenos instantâneos) quando presentes junto com o mitógeno em um estado físico diferente (por exemplo, como uma mistura radioprotegida substancialmente
25 / 45 seca liofilizada em vez de em solução) como aqui descrito. Essas propriedades não teriam sido previstas antes da presente descrição.
[0052] Consequentemente e em certas modalidades preferidas, uma ou mais proteína(s) biologicamente ativa(s), como um mitógeno aqui descrito, por exemplo, anticorpo anti-CD3, PHA, ConA e/ou PWM, e/ou um ou mais modificadores de resposta imune biologicamente ativos(s) tal como um agonista de TLR de imidazoquinolina aqui descrito, por exemplo, imiquimod, resiquimod (R848) e/ou gardiquimod, pode ser colocado em contato com pelo menos um composto radioprotetor solúvel, por exemplo, cisteína, glutationa, melatonina e/ou histidina, para permitir a secagem da(s) proteína(s) biologicamente ativa(s) e/ou modificador(es) de resposta imune e o(s) composto(s) radioprotetor(es) para prosseguir ao mesmo tempo, desse modo para obter uma mistura radioprotegida substancialmente seca, que pode então ser radiação esterilizado para obter uma mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca.
[0053] Em certas modalidades preferidas, uma ou mais proteína(s) biologicamente ativa(s) podem incluir anticorpos para receptores de superfície celular, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CD3, OX40, CD40L, CD152 e/ou CD28, cujos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser colocados em contato com pelo menos um composto radioprotetor solúvel, por exemplo, cisteína, glutationa, melatonina e/ou histidina, para permitir a secagem da(s) proteína(s) biologicamente ativa(s) e do(s) composto(s) radioprotetor(es) para proceder ao mesmo tempo, desse modo para obter uma mistura radioprotegida substancialmente seca, que pode então ser esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca.
[0054] Em certas outras modalidades preferidas, uma ou mais proteínas biologicamente ativas podem incluir antígenos, por exemplo,
26 / 45 peptídeos ou proteínas que podem ser reconhecidos em interações de ligação específicas por elementos seletivos do sistema imune adaptativo (por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes, receptores de células T ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, etc.), cujos antígenos podem ser postos em contato com pelo menos um composto radioprotetor solúvel, por exemplo, cisteína, glutationa, melatonina e/ou histidina, para permitir a secagem do proteína(s) biologicamente ativa(s) e o(s) composto(s) radioprotetor(es) para prosseguir ao mesmo tempo, desse modo para obter uma mistura radioprotegida substancialmente seca, que pode então ser esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca.
[0055] Em certas outras modalidades preferidas, uma ou mais proteínas biologicamente ativas podem incluir citocinas, por exemplo, TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-2, etc., que podem ser colocadas em contato com pelo menos um solúvel composto radioprotetor, por exemplo, cisteína, glutationa, melatonina e/ou histidina, para permitir a secagem da(s) proteína(s) biologicamente ativa(s) e do(s) composto(s) radioprotetor (es) para prosseguir ao mesmo tempo, desse modo para obter um produto radioprotegido substancialmente seco mistura, que pode então ser esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca.
[0056] Em certas modalidades preferidas, uma ou mais moléculas biologicamente ativas podem incluir uma ou mais de proteína(s), DNA e/ou RNA que podem ser colocados em contato com pelo menos um composto radioprotetor solúvel, por exemplo, cisteína, glutationa, melatonina e/ou histidina, para permitir a secagem da(s) molécula(s) biologicamente ativa(s) e do(s) composto(s) radioprotetor (es) para prosseguir ao mesmo tempo, desse modo para obter uma mistura radioprotegida substancialmente seca, que pode então ser esterilizada por radiação para obter uma radiação substancialmente
27 / 45 seca mistura radioprotegida esterilizada.
[0057] Após a esterilização por radiação, a mistura radioprotegida esterilizada por radiação substancialmente seca pode ser reidratada (por exemplo, por ressuspensão e/ou dissolução em água ou um solvente aquoso, tal como um tampão à base de água, como seria familiar para aqueles versados nas técnicas bioquímica, biológica e/ou imunológica) para obter uma mistura radioprotegida reidratada esterilizada por radiação. A atividade biológica da proteína biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior (por exemplo, aumentada de forma estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente. As modalidades aqui descritas, assim, inesperadamente protegem substancialmente a atividade biológica da proteína biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
[0058] Os compostos radioprotetores preferidos de acordo com a presente descrição incluem cisteína, melatonina, glutationa e histidina. Em certas modalidades, o composto radioprotetor pode compreender um, dois, três ou todos os quatro dos compostos radioprotetores cisteína, melatonina, glutationa e histidina; em certas outras modalidades, o composto radioprotetor pode consistir em um, dois, três ou todos os quatro compostos radioprotetores cisteína, melatonina, glutationa e histidina. Em uso, a origem, manuseio, armazenamento e solubilização desses compostos são bem conhecidos e podem ser prontamente adaptados aos presentes métodos de acordo com metodologias conhecidas e a presente descrição, incluindo os Exemplos abaixo. Um composto radioprotetor, conforme provido neste documento, pode estar presente na mistura radioprotegida aqui descrita em uma concentração que é eficaz de proteção de substancialmente a atividade biológica (por exemplo, atividade mitogênica) de uma proteína
28 / 45 biologicamente ativa (por exemplo, mitógeno, tal como anticorpo anti-CD3, PHA, ConA, PWN) ou outra molécula biologicamente ativa, conforme provido neste documento. Normalmente, o composto radioprotetor pode estar presente em uma concentração de pelo menos 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300 ou 400 mM, incluindo qualquer concentração intermediária entre os mesmos. As estruturas dos compostos radioprotetores aqui descritos são mostradas abaixo.
[0059] Sem desejar ser limitado pela teoria, alguns dos compostos radioprotetores aqui descritos podem exibir propriedades funcionais características de antioxidantes e/ou de captadores de radicais livres. As presentes modalidades não se destinam, no entanto, a ser tão limitadas no que diz respeito à capacidade desses compostos radioprotetores de proteção de as proteínas biologicamente ativas aqui descritas ou outras moléculas biologicamente ativas e, em particular, as proteínas biologicamente ativas aqui descritas que são mitógenos para mamíferos linfócitos do sangue periférico, provenientes da atividade biológica comprometida que, de outra forma, surgiria como resultado da esterilização por radiação.
[0060] A L-Cisteína (ácido 2-amino-3-sulfidrilpropanóico) tem a seguinte estrutura (I): [I]
[0061] A Glutationa (forma reduzida) (γ-L-Glutamil-L- cisteinilglicina) tem a seguinte estrutura (II):
29 / 45 [II]
[0062] A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) tem a seguinte estrutura (III): [III]
[0063] A histidina tem a seguinte estrutura (IV): [IV]
[0064] Será apreciado que a prática das várias modalidades da presente invenção irá empregar, a menos que indicado especificamente em contrário, métodos convencionais em virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante que estão dentro da habilidade na técnica, e muitos dos quais são descritos abaixo com o propósito de ilustração. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons,
30 / 45 New York 1995; Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Ed., 2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.), 2nd Ed., 1995, Oxford Univ. Press, UK; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984) IRL/ Oxford Univ. Press, UK; Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985) IRL/ Oxford Univ. Press, UK; Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984) IRL/ Oxford Univ. Press, UK; Culture of Animal Cells (R. Freshney, 2010) John Wiley & Sons, NY; Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), John Wiley & Sons, NY; e outras referências semelhantes.
[0065] Técnicas padrão podem ser usadas para ensaios imunológicos, incluindo ensaios imunoquímicos e imunológicos celulares, e para coleta e processamento de amostras biológicas (por exemplo, sangue, linfa, saliva, expectoração, pus, biópsia, etc.), cultura de tecidos e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações imunoquímicas e enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas usando reagentes disponíveis comercialmente de acordo com as especificações dos fabricantes ou como comumente realizado na técnica, ou conforme descrito neste documento. Estas e técnicas e procedimentos relacionados podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação. A menos que definições específicas sejam providas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de biologia molecular, imunologia celular e molecular, bioquímica, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem-conhecidos e comumente usados na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para tecnologia recombinante, metodologias biológicas moleculares e/ou celulares ou microbiológicas, sínteses químicas, análises
31 / 45 químicas, preparação farmacêutica, formulação, entrega e diagnóstico e/ou tratamento de pacientes.
[0066] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referências no plural, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra “compreende”, ou variações como “compreende” ou “compreendendo”, serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros. Cada modalidade nesta especificação deve ser aplicada mutatis mutandis a todas as outras modalidades, a menos que expressamente indicado de outra forma.
[0067] Embora etapas, elementos, modalidades e aplicações particulares da presente invenção tenham sido mostrados e descritos aqui para fins de ilustração, será entendido, é claro, que a invenção não está limitada aos mesmos, uma vez que modificações podem ser feitas por pessoas versadas na técnica, particularmente à luz dos ensinamentos anteriores, sem se desviar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, a invenção não está limitada exceto pelas reivindicações anexas.
[0068] Meltz ML, Reiter RJ, Herman TS, Kumar KS (March 1999). “Melatonin and protection from whole-body irradiation: survival studies in mice”. Mutat. Res. 425 (1): 21–7. Reiter RJ, Herman TS, Meltz ML (December 1996). “Melatonin and radioprotection from genetic damage: in vivo/in vitro studies with human volunteers”. Mutat. Res. 371 (3–4): 221–8. Reiter RJ, Herman TS, Meltz ML (February 1998). “Melatonin reduces gamma radiation-induced primary DNA damage in human blood lymphocytes”. Mutat. Res. 397 (2): 203–8. Tan DX, Manchester LC, Terron
32 / 45 MP, Flores LJ, Reiter RJ (January 2007). “One molecule, many derivatives: a never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species?”. J. Pineal Res. 42 (1): 28–42.
[0069] Tan DX, Chen LD, Poeggeler B, Manchester LC, Reiter RJ (1993). “Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger”. Endocrine J. 1: 57–60.Pohanka M (2011). “Alzheimer´s disease and related neurodegenerative disorders: implication and counteracting of melatonin”. Journal of Applied Biomedicine 9 (4): 185–196..Reiter RJ, Manchester LC, Tan DX (September 2010). “Neurotoxins: free radical mechanisms and melatonin protection”. Curr Neuropharmacol 8 (3): 194–210.Poeggeler B, Saarela S, Reiter RJ, Tan DX, Chen LD, Manchester LC, Barlow-Walden LR (November 1994). “Melatonin – a highly potent endogenous radical scavenger and electron donor: new aspects of the oxidation chemistry of this indole accessed in vitro”. Ann. N. Y. Acad. Sci. 738: 419–20. Arnao MB, Hernández-Ruiz J (May 2006). “The physiological function of melatonin in plants”. Plant Signal Behav 1 (3): 89–95. Pieri C, Marra M, Moroni F, Recchioni R, Marcheselli F (1994). “Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E”. Life Sci. 55 (15): PL271–6.
[0070] Wade et al. 1998 J. Nutritional Biochem. 9(6):308-315).
[0071] Os Exemplos a seguir são apresentados a título de ilustração e não de limitação.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[0072] Resumidamente, tubos de ensaio de controle de mitógeno QuantiFERON®-TB Gold Mitogen Control foram obtidos do fabricante (QIAGEN, Inc., Germantown, MD) e foram produzidos por secagem por pulverização de uma solução de fito-hemaglutinina (PHA-P) nas paredes
33 / 45 internas dos tubos de coleta de sangue padrão. Os tubos de coleta de sangue foram posteriormente esterilizados por radiação usando tratamento por feixe de elétrons de alta energia (E-Beam) de acordo com os procedimentos padrão.
[0073] A atividade mitogênica de PHA nos tubos de coleta de sangue esterilizados por radiação para amostras de sangue total foi avaliada pela determinação da concentração de IFN-γ no plasma, a partir de amostras de sangue total incubadas nos tubos de coleta de sangue, usando QuantiFERON® ELISA de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN, Inc., Germantown, MD). Os resultados de um experimento representativo são mostrados na Tabela 1. A esterilização por radiação de PHA seco por pulverização em tubos de coleta de sangue, por tratamento com feixe de elétrons (por exemplo, E-Beam) ou por irradiação γ, diminuiu drasticamente a potência mitogênica dos tubos coleta de sangue quando foram testados quanto à capacidade de induzir a liberação de IFN-γ em amostras de sangue total. O tratamento com E-Beam padrão diminuiu a atividade mitogênica do PHA seco por pulverização para cerca de 55% do nível de controle. A atividade mitogênica do PHA diminuiu ainda mais após duas rodadas de esterilização por radiação (2x E-Beam). Essa perda de atividade foi proporcional ao aumento da dosagem de radiação (Tabela 1). Tabela 1. Potência do tubo de mitógeno QFN após o tratamento Potência Mitogênica após Tx E-Beam Irradiação γ 2x de E-Beam 55% 30,8% 29,6%
[0074] As percentagens médias do grupo de potência mitogênica dos tubos de coleta de sangue QFN-Mitogen Control tratados foram determinadas contra o mesmo lote de tubos de mitógeno sem qualquer tratamento (potência 100%).
[0075] Tubos de controle de mitógenos de um único lote de produção foram esterilizados com E-Beam (16,6-30 kGy), iradiação γ (25 kGy) e 2 vezes de E-Beam (2x E-Beam). A atividade mitogênica, ou seja, os níveis de IFN-γ dos tubos de mitógeno foram avaliados com amostras de sangue total
34 / 45 de um grupo de 11 doadores de sangue. A potência mitogênica dos tubos esterilizados foi apresentada como a média dos percentuais de potência do grupo em relação aos tubos sem nenhum tratamento.
[0076] Estes resultados indicaram que quantidades aumentadas de PHA teriam que ser secas por pulverização em cada tubo, a fim de prover tubos esterilizados por radiação com níveis de atividade mitogênica de PHA que seriam mais próximos dos níveis de atividade mitogênica de PHA em tubos que não foram submetidos a esterilização por radiação.
[0077] Os compostos radioprotetores candidatos foram selecionados e avaliados quanto aos seus efeitos na atividade mitogênica do PHA. Como uma primeira seleção, foi identificado que os compostos radioprotetores candidatos por si próprios não alteraram significativamente (por exemplo, aumentaram ou diminuíram de forma estatisticamente significativa em relação a um controle apropriado) a atividade mitogênica quando incluídos na formulação de PHA seca por pulverização, mesmo antes da esterilização por radiação. Como mostrado na Tabela 2, as formulações de PHA-P que continham 50 mM da cisteína do composto radioprotetor candidato, ou 10 mM da melatonina do radioprotetor composto candidato, exibiram atividade mitogênica de PHA que era comparável às preparações de PHA não suplementadas. Tabela 2 Atividade de PHA-P quando Formulada com Cisteína ou Melatonina Potência de Formulação de PHA-P com Aditivos L-Cisteína (50 mM) Melatonina (10 mM) 101% 98,6% * A potência das formulações de PHA-P com Cys e MLT foi determinada contra à mesma formulação sem aditivos (potência de 100%).
[0078] A potência da formulação PHA-P foi avaliada em amostras de sangue total de 6 doadores de sangue. Os resultados são apresentados como a porcentagem média da potência da formulação com aditivos em relação àquela sem quaisquer aditivos.
[0079] Os compostos radioprotetores candidatos que não interferiram
35 / 45 com a atividade mitogênica do PHA foram testados em seguida quanto à sua capacidade de proteger o PHA contra a perda da atividade mitogênica durante a esterilização por radiação. A adição de L-cisteína, glutationa reduzida ou melatonina na formulação líquida de PHA para a concentração final de 5,0 mM evitou parcialmente a perda de atividade mitogênica de PHA após tratamentos de esterilização por radiação por E-Beam de 8,3, 16,7 e 25 kGy (Tabela 3). A formulação líquida de PHA na ausência de qualquer um dos compostos radioprotetores candidatos (Tabela 3, “Controle”) teve apenas 11% de sua atividade mitogênica após o tratamento de esterilização por radiação de 8,3 kGy. Em comparação, as formulações de PHA secas por pulverização que incluíam L-cisteína, glutationa reduzida ou melatonina exibiram 68%, 53% e 53% do nível de controle da atividade mitogênica, respectivamente, seguindo a mesma dosagem de tratamento de esterilização por radiação a 8,3 kGy e assim, reteve a atividade mitogênica substancialmente protegida. Tabela 3 Proteção de perda de atividade na formulação de PHA-P tratada com E-Beam Percentagens Médias do Grupo de Atividade Mitogênica Tx de Controle L-Cisteína Glutationa Reduzida Melatonina E-Beam (kGy) 0,0 100% 99% 116% 111% 8,30 11% 68% 53% 53% 16,7 2,7% 43% 23% 26% 25,0 1,2% 26% 10% 7,7%
[0080] As percentagens médias do grupo de atividade mitogênica das formulações de PHA-P foram determinadas contra o controle sem tratamento com E-Beam (0,0 kGy).
[0081] A atividade média do grupo de formulações de PHA-P com aditivos na concentração final de 5,0 mM foi determinada em amostras de sangue total de 6 doadores de sangue. Os resultados são apresentados como as percentagens médias de potência em relação à amostra de controle não tratada sem aditivos.
[0082] As formulações líquidas de PHA contendo compostos de
36 / 45 proteção aqui identificados também exibiram a capacidade de proteger substancialmente a atividade mitogênica de PHA após esterilização por radiação a dosagens mais altas, isto é, tratamento com E-Beam a 16,7 e 25 kGy.
[0083] As capacidades de proteção do efeito da dose de L-cisteína e melatonina foram avaliadas posteriormente. A L-cisteína foi dissolvida em uma formulação PHA-P para 1,0-50 mM. Devido à sua menor solubilidade em água, a solução estoque de melatonina a 200 mM foi primeiro preparada em álcool etílico 100%. Os estoques foram então adicionados à formulação de PHA-P para fazer concentrações finais de 0,2-10 mM. Após o tratamento com E-Beam, as potências das formulações de PHA-P foram testadas com amostras de sangue total e a atividade mitogênica foi determinada usando QuantiFERON® ELISA (QIAGEN, Inc., Germantown, MD) de acordo com as instruções do fabricante.
[0084] Os resultados estão resumidos na Figura 1. O aumento da concentração de L-cisteína de 1,0 mM para 10 mM na formulação de PHA-P aumentou significativamente sua proteção contra radiação da atividade mitogênica de PHA a 25 kGy de 5,9% a 38% do nível de atividade mitogênica da formulação de controle de PHA (que não continha nenhum composto radioprotetor como aditivo e não foi submetida a tratamento de esterilização por radiação).
[0085] A L-Cisteína foi posteriormente testada quanto à sua capacidade de diminuir a perda de potência mitogênica de PHA que resulta da esterilização por radiação de PHA seco por pulverização em tubos de coleta de sangue. Tubos de coleta de sangue contendo PHA seco por pulverização (sem composto radioprotetor na etapa de secagem por pulverização) foram submetidos à esterilização por radiação e a atividade mitogênica de PHA em relação a uma amostra de sangue total foi testada como descrito acima. Quando a cisteína (5 mM) estava presente na formulação de PHA seca por
37 / 45 pulverização, mas os tubos não foram submetidos à esterilização por radiação, as respostas mitogênicas de PHA em relação a uma amostra de sangue total tiveram em média 94,8% dos níveis de controle (sem radioprotetor, sem esterilização por radiação) (Fig. 2, coluna da esquerda) mostrando que a cisteína não alterou as respostas do mitógeno em tubos de mitógeno não esterilizados. A etapa de esterilização por radiação diminuiu a atividade mitogênica de PHA para 56% dos níveis de controle (sem radioprotetor, sem esterilização por radiação) (Fig. 2, coluna do meio). Quando a cisteína (5 mM) estava presente na formulação de PHA seca por pulverização e os tubos foram submetidos à esterilização por radiação, as respostas mitogênicas de PHA em relação a uma amostra de sangue total aumentaram de 56% (sem cisteína) para 72% (5 mM de cys) em relação ao controle (sem radioprotetor, sem esterilização por radiação) (Fig. 2, coluna da direita). EXEMPLO 2
[0086] Tubos de mitógeno (PHA seco por pulverização) foram produzidos e esterilizados por radiação como descrito no Exemplo 1, comparando preparações de PHA sem cisteína adicionada com preparações de PHA contendo 5,0 mM de cisteína. A estabilidade de armazenamento a longo prazo do efeito radioprotetor da cisteína na atividade mitogênica do PHA seco por pulverização também foi avaliada.
[0087] Após secagem por pulverização e esterilização por radiação, os tubos foram mantidos por vários períodos de tempo antes de serem testados quanto à atividade mitogênica, conforme descrito anteriormente. No primeiro momento de teste (dentro de um mês após a produção), os tubos contendo mitógeno feitos sem cisteína tinham níveis semelhantes de atividade mitogênica aos produzidos com a cisteína presente (Figura 3). Testes em pontos de tempo subsequentes estendendo-se além de oito meses após a
38 / 45 produção, entretanto, mostraram que os tubos contendo cisteína retinham níveis relativamente mais altos de atividade mitogênica do que os tubos produzidos sem cisteína. EXEMPLO 3
RADIOPROTEÇÃO DE ATIVIDADE ESTIMULATÓRIA DE CÉLULAS T ANTICORPO ANTI-CD3 CONTRA A ESTERILIZAÇÃO POR
[0088] Este exemplo descreve o uso de um composto radioprotetor conforme descrito aqui de proteção da atividade de um anticorpo biologicamente ativo contra os efeitos da esterilização por radiação. Neste exemplo, os materiais e métodos foram essencialmente conforme descritos acima nos Exemplos 1 e 2, exceto quando especificado de outra forma aqui.
[0089] As amostras de anticorpos anti-CD3 foram dissolvidas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e diluídas em uma concentração de 66,7 µg/mL, depois expostas a várias doses de irradiação de E-Beam na presença ou ausência de 10 mM de cisteína (Cys) ou 3 mM de glutationa (G-SH). As amostras de anticorpos tratadas foram testadas quanto à sua atividade estimuladora de células T, determinando sua capacidade de induzir a secreção de interferón-gama (IFN-γ) por células T presentes em uma amostra de sangue humano total obtida de um grupo de seis doadores selecionados aleatoriamente, usando 0,10 µg de anticorpo anti-CD3 por mL de sangue total em tubos QuantiFERON® (QFN) Nil (QIAGEN, Inc., Germantown, MD). Após a incubação das amostras de sangue total com o anticorpo anti-CD3 nos tubos QFN Nil, o processamento do sangue, a coleta de plasma e a detecção de IFN-γ por ensaio imunoenzimático (ELISA) foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, conforme encontrado no Folheto informativo QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFN-TB Gold Plus, QIAGEN, Inc., Germantown, MD), exceto que as amostras de plasma foram diluídas 1 a 10 no kit ELISA Green Diluent imediatamente antes do teste em
39 / 45 curvas padrão de 8 pontos.
[0090] O anticorpo anti-CD3 funcional é capaz de induzir respostas de células T para induzir interferón gama (secreção de IFN-γ em culturas de sangue total. Resultados representativos das respostas de IFNγ induzidas em amostras de sangue total por anticorpo anti-CD3 que foi protegido durante E a irradiação por feixe com 10 mM de cisteína ou de 3,0 mM de G-SH, em comparação com as amostras de controle não protegidas (irradiadas em DPBS não suplementado), são apresentadas na Figura 4. O tratamento com E-Beam em doses de 8,3 kGy e superiores aboliu completamente a atividade de o anticorpo anti-CD3 (resposta IFN-γ média do grupo no eixo y, Figura 4) quando o anticorpo foi irradiado apenas em DPBS (círculos abertos). Em contraste, as amostras de anticorpo anti-CD3 tratadas com E-Beam que foram irradiadas em DPBS que também continha 10 mM de cisteína (Cys, quadrados fechados) ou 3,0 mM de G-SH (círculos fechados), manteve as atividades estimulatórias mesmo em doses de E-Beam de até 25 kGy (Figura 4). Portanto, tanto Cys quanto G-SH protegeu claramente as atividades do anticorpo anti-CD3 corante tratado com radiação por E-Beam.
[0091] O efeito protetor sobre a atividade anti-CD3 conferida por ambos os radioprotetores, Cys e G-SH, em amostras de anticorpos que foram tratadas com irradiação de E-Beam de 25 kGy, exibiu um aumento dependente da dose de 1,0 a 10 mM para ambos os Cys (círculos fechados) e G-SH (quadrados fechados) (Figura 5). EXEMPLO 4 RADIOPROTEÇÃO DE ATIVIDADE DE AGONISTA DE TLR R848 (RESIQUIMOD) CONTRA A ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO
[0092] Este exemplo descreve o uso de um composto radioprotetor conforme descrito aqui de proteção da atividade agonista de TLR de um modificador de resposta imune de imidazoquinolina (R848) contra os efeitos da esterilização por radiação. Neste exemplo, os materiais e métodos foram
40 / 45 essencialmente conforme descritos acima nos Exemplos 1-3, exceto quando especificado de outra forma aqui.
[0093] R848 (resiquimod, CAS 144875-48-9) é um agonista do receptor do tipo Toll (TLR) que pode estimular respostas biológicas por células exterminadora natural (NK), e sua atividade pode ser medida nos tubos QuantiFERON® Nil (QIAGEN, Inc., Germantown, MD) Sistema de cultura de sangue total QFN. Amostras R848 foram dissolvidas em DPBS em uma concentração de 66,7 µg/mL e tratadas com várias doses de irradiação de E-Beam na presença ou ausência de 10 mM de Cys ou 3 mM de G-SH. As amostras R848 tratadas foram testadas quanto à sua atividade biológica (capacidade de induzir a liberação de IFNγ durante uma incubação in vitro) em leucócitos presentes em amostras de sangue total humano, coletadas de um grupo de seis doadores selecionados aleatoriamente, usando 1,0 µg R848 por mL de sangue total em tubos QFN Nil. Após a incubação com as amostras R848 nos tubos QFN, o processamento da amostra de sangue total, a coleta de plasma e IFN-γ ELISA foram realizados de acordo com a bula QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFN-TB Gold Plus, QIAGEN, Inc., Germantown, MD), exceto que as amostras de plasma foram diluídas 1:10 no kit ELISA Green Diluent imediatamente antes do teste em curvas padrão de 8 pontos.
[0094] Um resultado representativo mostrando os efeitos radioprotetores que foram conferidos em amostras R848 que foram irradiadas na presença de 10 mM de Cys ou 3,0 mM de G-SH, em comparação com R848 que foi irradiado no controle de veículo (DPBS), é apresentado em Figura 6. O tratamento com E-Beam em doses de 8,3 kGy e superiores aboliu completamente a atividade (resposta IFN-γ média do grupo no eixo y Figura 6) de R848 que foi preparado em DPBS sozinho (círculos abertos). Em contraste, as amostras de R848 tratadas com E-Beam que continham 10 mM de Cys (quadrados fechados) ou 3,0 mM de G-SH (círculos fechados)
41 / 45 retiveram as atividades estimulatórias de R848.
[0095] O efeito protetor de Cys e G-SH na atividade de R848, em amostras tratadas com E-Beam de 25 kGy, exibiu um aumento dependente da dose de 1,0 a 10 mM para Cys (círculos fechados) e G-SH (quadrados fechados) (Figura 7). EXEMPLO 5
RADIOPROTEÇÃO DE ATIVIDADE ESTIMULATÓRIA DE CÉLULAS T DE ANTICORPO ANTI-CD3 COMBINADA E ATIVIDADE DE AGONISTA TLR R848 (RESIQUIMOD) CONTRA A ESTERILIZAÇÃO
[0096] Este exemplo descreve o uso de um composto radioprotetor conforme descrito aqui de proteção de as atividades combinadas de um anticorpo biologicamente ativo e um modificador da resposta imune agonista de TLR imidazoquinolina (R848), contra os efeitos da esterilização por radiação. Neste exemplo, os materiais e métodos foram essencialmente conforme descritos acima nos Exemplos 1-4, exceto quando especificado de outra forma aqui.
[0097] O reagente QuantiFERON® Monitor (QFM) (QIAGEN, Inc., Germantown, MD), uma combinação de quantidades iguais de anti-CD3 e R848, foi dissolvido em DPBS em uma concentração de 33,5 µg/mL e tratado com várias doses de irradiação por E-Beam na presença ou ausência de 10 mM de cisteína (Cys) ou 3 mM de glutationa (G-SH). As amostras tratadas foram testadas quanto à sua atividade biológica (capacidade de eliciar a liberação de IFNγ durante uma incubação in vitro) em leucócitos presentes em amostras de sangue total humano, coletadas de um grupo de seis doadores selecionados aleatoriamente, usando 0,05 µg de QFM por mL de sangue total em tubos QFN Nil. Após a incubação com as amostras QFM nos tubos QFN, o processamento da amostra de sangue total, a coleta de plasma e IFN-γ ELISA foram realizados de acordo com a bula QuantiFERON®-TB Gold
42 / 45 Plus (QFN-TB Gold Plus, QIAGEN, Inc., Germantown, MD), exceto que as amostras de plasma foram diluídas 1:10 no kit ELISA Green Diluent imediatamente antes do teste em curvas padrão de 8 pontos.
[0098] Os resultados representativos que mostram os efeitos radioprotetores que foram conferidos às amostras QFM que foram irradiadas na presença de 10 mM de Cys ou 3,0 mM de G-SH em comparação com o controle (DPBS) são apresentados na Figura 8. Tratamento com E-Beam em doses de 8,3 kGy e superior aboliram completamente a atividade (resposta IFN-γ média do grupo no eixo y Figura 8) da combinação estimuladora anti- CD3/R848 que foi preparada em DPBS não suplementado sozinho (círculos abertos). Em contraste, as atividades estimuladoras de anti-CD3 e R848 foram preservadas nas amostras contendo radioprotetor que foram irradiadas com E- Beam em PBSD contendo 10 mM de Cys (quadrados fechados) ou 3,0 mM de G-SH (círculos fechados).
[0099] O efeito protetor de Cys e G-SH na atividade combinada de anti-CD3 e R848, em amostras tratadas com E-Beam de 25 kGy, exibiu um aumento dependente da dose de 1,0 a 10 mM para Cys (círculos fechados) e G-SH (quadrados fechados) (Figura 9). EXEMPLO 6
[00100] Este exemplo descreve o uso de um composto radioprotetor como descrito aqui de proteção da atividade de uma lectina biologicamente ativa contra os efeitos da esterilização por radiação. Neste exemplo, os materiais e métodos foram essencialmente conforme descritos acima nos Exemplos 1-5, exceto quando especificado de outra forma aqui.
[00101] Amostras de Mitógeno Pokeweed (PWM) foram dissolvidas em DPBS em uma concentração de 33,3 µg/mL e tratadas com várias doses de irradiação de E-Beam na presença ou ausência de 10 mM de cisteína (Cys)
43 / 45 ou 3 mM de glutationa (G-SH). As amostras PWM tratadas foram testadas quanto à sua atividade biológica (capacidade de induzir a liberação de IFNγ durante uma incubação in vitro) em leucócitos presentes em amostras de sangue total humano, coletadas de um grupo de seis doadores selecionados aleatoriamente, usando 1,0 µg de PWM por mL de sangue total em tubos QFN Nil. Após a incubação com as amostras PWM nos tubos QFN, o processamento da amostra de sangue total, a coleta de plasma e IFN-γ ELISA foram realizados de acordo com a bula QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFN- TB Gold Plus, QIAGEN, Inc., Germantown, MD), exceto que as amostras de plasma foram diluídas 1:10 no kit ELISA Green Diluent imediatamente antes do teste em curvas padrão de 8 pontos.
[00102] Resultados representativos que mostram os efeitos radioprotetores que foram conferidos em amostras de PWM que foram irradiadas na presença de 10 mM de Cys ou 3,0 mM de G-SH em comparação com o controle (DPBS) são apresentados na Figura 10. Tratamento com E- Beam em doses de 8,3 kGy e superior aboliram completamente a atividade (resposta IFN-γ média do grupo no eixo y Figura 10) da amostra de controle de PWM que foi preparada e irradiada apenas em DPBS não suplementado (círculos abertos). Em contraste, a atividade estimuladora de PWM foi preservada nas amostras contendo radioprotetor que foram irradiadas com E- Beam em PBSD contendo 10 mM de Cys (quadrados fechados) ou 3,0 mM de G-SH (círculos fechados).
[00103] O efeito protetor de Cys e G-SH na atividade de PWM, em amostras tratadas com E-Beam de 25 kGy, exibiu um aumento dependente da dose de 1,0 a 10 mM para ambos Cys (círculos fechados) e G-SH (quadrados fechados) (Figura 11). EXEMPLO 7
44 / 45
[00104] Este exemplo descreve o uso de um composto radioprotetor como descrito aqui de proteção da atividade de uma lectina biologicamente ativa contra os efeitos da esterilização por radiação. Neste exemplo, os materiais e métodos foram essencialmente conforme descritos acima nos Exemplos 1-6, exceto quando especificado de outra forma aqui.
[00105] A Concanavalina A (ConA) é conhecida como uma lectina que ativa os linfócitos T. As amostras de ConA foram dissolvidas em DPBS em uma concentração de 3333 µg/mL e tratadas com várias doses de irradiação de E-Beam na presença ou ausência de 10 mM de cisteína (Cys) ou 3 mM de glutationa (G-SH).
[00106] As amostras de ConA tratadas foram testadas quanto à sua atividade biológica (capacidade de induzir a liberação de IFNγ durante uma incubação in vitro) em leucócitos presentes em amostras de sangue total humano, coletadas de um grupo de seis doadores selecionados aleatoriamente, usando 100 µg de ConA por mL de sangue total em tubos QFN Nil. Após a incubação com as amostras de ConA nos tubos QFN, o processamento da amostra de sangue total, a coleta de plasma e IFN-γ ELISA foram realizados de acordo com a bula QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFN-TB Gold Plus, QIAGEN, Inc., Germantown, MD), exceto que as amostras de plasma foram diluídas 1:10 no kit ELISA Green Diluent imediatamente antes do teste em curvas padrão de 8 pontos.
[00107] Os resultados representativos que mostram os efeitos radioprotetores que foram conferidos às amostras de ConA que foram irradiadas na presença de 10 mM de Cys ou 3,0 mM de G-SH em comparação com o controle (DPBS) são apresentados na Figura 12. Tratamento com E- Beam em doses de 8,3 kGy e superior aboliram completamente a atividade (resposta IFN-γ média do grupo no eixo y Figura 12) da amostra de ConA de controle que foi preparada e irradiada apenas em DPBS não suplementado
45 / 45 (círculos abertos). Em contraste, a atividade estimuladora de ConA foi preservada nas amostras contendo radioprotetor que foram irradiadas com E- Beam em PBSD contendo 10 mM de Cys (quadrados fechados) ou 3,0 mM de G-SH (círculos fechados).
[00108] O efeito protetor de Cys e G-SH na atividade de ConA, em amostras tratadas com E-Beam de 25 kGy, exibiu um aumento dependente da dose de 1,0 a 10 mM para ambos Cys (círculos fechados) e G-SH (quadrados fechados) (Figura 13).
[00109] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para prover outras modalidades. Todas as patentes U.S., publicações de pedidos de patentes U.S., pedidos de patentes U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patenteadas ditas nesta especificação e/ou listadas na Folha de Dados do Aplicativo, incluindo o Pedido de Patente Provisório U.S. nº 62/673.671, depositado em 18 de maio de 2018, são incorporados neste documento por referência, em sua totalidade. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para prover ainda outras modalidades.
[00110] Estas e outras alterações podem ser feitas nas modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas descritas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados de modo que inclua todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito. Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela descrição.
Claims (27)
1. Método de proteção da atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; e (b) esterilizar por radiação a mistura radioprotegida, em que a atividade biológica da molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da molécula biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, assim, proteger a atividade biológica da molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura radioprotegida é seca antes da etapa de esterilização por radiação.
3. Método de proteção de uma pluralidade de moléculas de uma molécula biologicamente ativa contra uma perda de atividade biológica da dita pluralidade de moléculas durante um período de tempo de armazenamento, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; (c) esterilizar por radiação a mistura seca radioprotegida; e (d) armazenar a mistura radioprotegida seca por um período de tempo para obter uma mistura radioprotegida seca armazenada, em que a atividade biológica da molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida seca armazenada após esterilização por radiação e armazenamento durante o dito período de tempo é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da molécula biologicamente ativa que é seca, esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, em seguida, armazenada durante o período de tempo, protegendo assim uma pluralidade de moléculas da molécula biologicamente ativa contra a perda de atividade biológica durante o período de tempo no armazenamento.
4. Método de proteção da atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a molécula biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; e (c) esterilizar por radiação a mistura radioprotegida seca para obter uma mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação, em que, após a reidratação da mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida reidratada esterilizada por radiação, a atividade biológica da molécula biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da molécula biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, assim, protegendo a atividade biológica da molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
5. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a molécula biologicamente ativa compreende um ou mais dentre (i) uma proteína biologicamente ativa, (ii) um mitógeno,
(iii) um anticorpo, (iv) uma enzima, (v) uma citocina, (vi) um fator de crescimento, (vii) um hormônio e (viii) uma imidazoquinolina biologicamente ativa com atividade agonista de TLR.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mitógeno é selecionado dentre fito-hemaglutinina (PHA), concanavalina A (ConA) e mitógeno pokeweed (PWM).
7. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor compreende pelo menos um composto antioxidante.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o composto antioxidante é selecionado dentre cisteína, glutationa e melatonina.
9. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor compreende histidina.
10. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor está presente na mistura radioprotegida em uma concentração de pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 50 milimolar.
11. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a atividade biológica compreende atividade mitogênica.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a atividade mitogênica compreende atividade de indução da proliferação de linfócitos.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a atividade de proliferação de linfócitos compreende atividade de indução da proliferação de células T.
14. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a imidazoquinolina biologicamente ativa com atividade agonista de TLR compreende um ou mais de imiquimod, gardiquimod e resiquimod (R848).
15. Método de proteção da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a proteína biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; e (b) esterilizar por radiação a mistura radioprotegida, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente, e assim proteger a atividade biológica da proteína biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a mistura radioprotegida é seca antes da etapa de esterilização por radiação.
17. Método de proteção de uma pluralidade de moléculas de uma proteína biologicamente ativa contra uma perda de atividade biológica da dita pluralidade de moléculas durante um período de tempo de armazenamento, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a proteína biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca;
(c) esterilizar por radiação a mistura seca radioprotegida; e (d) armazenar a mistura radioprotegida seca por um período de tempo para obter uma mistura radioprotegida seca armazenada, em que a atividade biológica da proteína biologicamente ativa na mistura radioprotegida seca armazenada após esterilização por radiação e armazenamento durante o dito período de tempo é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa que é seca, esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente e, em seguida, armazenada durante o período de tempo, protegendo assim uma pluralidade de moléculas da proteína biologicamente ativa contra a perda de atividade biológica durante o período de tempo no armazenamento.
18. Método de proteção da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a proteína biologicamente ativa em uma solução aquosa com pelo menos um composto radioprotetor solúvel para obter uma mistura radioprotegida antes da esterilização por radiação; (b) secar a mistura radioprotegida para obter uma mistura radioprotegida seca; e (c) esterilizar por radiação a mistura radioprotegida seca para obter uma mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação, em que, após a reidratação da mistura radioprotegida seca esterilizada por radiação para obter uma mistura radioprotegida reidratada esterilizada por radiação, a atividade biológica da proteína biologicamente ativa na mistura radioprotegida após a esterilização por radiação é maior do que a atividade biológica de uma amostra de controle da proteína biologicamente ativa que é esterilizada por radiação sem o composto radioprotetor presente, protegendo assim a atividade biológica da proteína biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação.
19. Método de acordo com as reivindicações 15, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a proteína biologicamente ativa compreende um ou mais dentre (i) um mitógeno, (ii) um anticorpo, (iii) uma enzima, (iv) uma citocina, (v) um fator de crescimento e (vi) um hormônio.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o mitógeno é selecionado dentre fito-hemaglutinina (PHA), concanavalina A (ConA) e mitógeno pokeweed (PWM).
21. Método de acordo com as reivindicações 15, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor compreende pelo menos um composto antioxidante.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto antioxidante é selecionado dentre cisteína, glutationa e melatonina.
23. Método de acordo com as reivindicações 15, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor compreende histidina.
24. Método de acordo com as reivindicações 15, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o composto radioprotetor está presente na mistura radioprotegida em uma concentração de pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 50 milimolar.
25. Método de acordo com as reivindicações 15, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a atividade biológica compreende atividade mitogênica.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a atividade mitogênica compreende atividade de indução da proliferação de linfócitos.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a atividade de proliferação de linfócitos compreende atividade de indução da proliferação de células T.
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