KR20210013553A - 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 보호 - Google Patents

방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 보호 Download PDF

Info

Publication number
KR20210013553A
KR20210013553A KR1020207032785A KR20207032785A KR20210013553A KR 20210013553 A KR20210013553 A KR 20210013553A KR 1020207032785 A KR1020207032785 A KR 1020207032785A KR 20207032785 A KR20207032785 A KR 20207032785A KR 20210013553 A KR20210013553 A KR 20210013553A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
radiation
biologically active
mixture
activity
biological activity
Prior art date
Application number
KR1020207032785A
Other languages
English (en)
Inventor
파울 큐. 후
나디아 파트리스 앨런
제니 루이스 하워드
제프 보일
Original Assignee
퀴아젠 사이언시스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 퀴아젠 사이언시스, 엘엘씨 filed Critical 퀴아젠 사이언시스, 엘엘씨
Publication of KR20210013553A publication Critical patent/KR20210013553A/ko

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0029Radiation
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0029Radiation
    • A61L2/0035Gamma radiation
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0029Radiation
    • A61L2/007Particle radiation, e.g. electron-beam, alpha or beta radiation
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제를 비롯한 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 조성물 및 방법을 개시한다. 면역검정 튜브의 표면 상에서 분무-건조하는 동안 예시적인 유사분열촉진 렉틴 제제 중에 적어도 하나의 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 환원된 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘을 포함하는 것은 놀랍게도, 다르게는 전자 빔 방사선 멸균으로부터 발생할 수 있는 생물학적 (유사분열촉진) 활성의 상실로부터 렉틴을 보호하였다. 방사선보호제 화합물은 또한, 방사선 처리 후 연장된 보관 후에도 그가 생물학적 활성을 그대로 유지할 수 있도록 허용하면서, 다른 생물학적으로 활성인 분자도 보호하였고, 그의 생물학적 활성도 안정화시켰다.

Description

방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 보호
본 실시양태는 일반적으로 시험관내 생물학적 검정법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용은, 활성이 다르게는 방사선 멸균 동안 및/또는 그 이후에 손상되고/거나, 감소될 수 있는, 생물학적으로 활성인 단백질 및/또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제를 포함하나 그에 제한되지 않는 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 보존, 보호 및/또는 회복 및/또는 안정화시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
진단 및 예후 목적의, 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 중에 존재하는 세포, 예컨대 면역계 세포 (예컨대, 림프구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 또는 면역계의 다른 세포)의 면역학적 활성의 시험관내 검정법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 전혈 샘플 또는 상기 샘플로부터 분리된 백혈구는 다수의 척도, 예컨대 미토겐에 의한, 특이적 항원(들)에 의한, 또는 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP), 수용체, 및 다른 효능제에 의한 자극에 대해 반응한 세포 증식, 가용성 매개인자 방출 및/또는 활성화에 의해 면역 반응 능력을 평가하기 위해 시험관내에서 시험될 수 있다.
미토겐은 세포 유사분열을 자극하는 것으로 알려져 있고, 비-항원-특이적인 방식으로 림프구 증식을 유도하는 면역학적 시약으로서 사용되는 단백질을 포함한다. 림프구 미토겐은 림프구를 자극하여 가용성 매개인자을 증식 및/또는 방출/분비하는 폴리클로날 활성화인자일 수 있고, 이는 항원-특이적 수용체 (면역글로불린 (Ig) 또는 T 세포 수용체 (TCR))는 회피하면서, 비-항원-자극 유도 림프구 분자 기전을 이용하여 쉽게 검출될 수 있는 강건한 폴리클로날 반응을 유도함으로써 이루어질 수 있다. 예시적인 T 세포 미토겐은 렉틴 (예컨대, 식물 유래 탄수화물 결합 단백질)인 생물학적으로 활성인 단백질 피토헤마글루티닌 (PHA) 및 콘카나발린 A (ConA)를 포함한다. 또 다른 렉틴인 포크위드 미토겐 (PWM)은 T 세포 및 B 세포 둘 모두를 자극할 수 있다. 다양한 공급원으로부터의 유사분열촉진 렉틴이 기술되어 있다 (예컨대, 문헌 [Shanmugham et al., 2006 Riv Biol . 99:227]; [Naeem et al., 2007 Curr . Protein Pept . Sci 8:261]; [Singh et al., 2014 Crit . Rev. Microbiol. 40:329 참조). 활성화 신호 전달이 가능한 림프구 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 특정 항체가 또한 미토겐으로서 작용할 수 있다.
따라서 미토겐은, 모노클로날 또는 올리고클로날 반응의 면역검출이 항원 특이적 반응 림프구의 낮은 신호 강도 또는 낮은 빈도에 기인하여 충분히 감수성이 아닐 수 있는 샘플 중에서 쉽게 측정될 수 있는 강건한 폴리클로날 반응을 유도/자극함으로써 림프구 함유 샘플 중 전체 면역반응을 평가하는 데 특히 유용하다.
콴티페론® TB 골드 미토겐 컨트롤(QuantiFERON® TB Gold Mitogen Control) 검정법 (예컨대, 문헌 [Mazurek et al., 2005 MMWR Recomm . Rep 54:49-55]; [Mazurek et al., 2010 MMWR Recomm . Rep. 59:1-25]; [Simpson et al., 2012 Heart Lung 41:553]; [Cho et al., 2012 Tuberc . Respir . Dis . (Seoul) 72:416]; [Woo et al., 2014 Clin . Chim . Acta 430:79])은 예를 들어, 폴리클로날 미토겐으로서 생물학적으로 활성인 단백질 PHA (렉틴)를 사용하여 강건한 시험관내 T 세포 반응을 유도하고, 그로부터 샘플 중에 존재하는 T 세포의 면역반응 상태를 평가할 수 있다. 상기 시험에서, PHA는 편리하게 건조된 형태로 채혈 튜브의 내부 표면 상의 코팅으로서 제공된다. 미토겐-코팅 튜브는 내부 표면 상에서 PHA 함유 용액을 분무 건조시킨 후, 방사선 멸균 (예컨대, 전자 빔 방사선, 감마 방사선 조사 등)하여 존재할 수 있는 임의의 잠재적 미생물 오염원을 사멸시키거나 또는 불활성화시킴으로써 제조된다. 멸균 환경을 달성하기 위해 방사선 대신 화학물질을 사용하는 것은 이상적이지 못할 수 있는데, 그 이유는 화학물질이 자극 동안 세포의 생물학적 활성을 방해할 수 있고/거나, 다른 검정 검출 시스템을 방해할 수 있기 때문이다. 전자 빔 방사선이 상기 생물학적으로 활성인 단백질의 방사선 멸균을 위한 것으로서 관련 기술 분야에 공지된 표준 기술이다 (예컨대, 문헌 [Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141]; [Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol . 66:184]; [Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24]; [Yaman, 2001 Curr. Opin . Drug Devel. 4:760]).
공지된 생물학적으로 활성인 검정 성분 (예컨대, 유사분열촉진 단백질, 예컨대 PHA)에의 노출 후, 생물학적 샘플 (예컨대, 전혈 또는 단리된 말초 혈액 백혈구) 중의 림프구의 면역 반응이 검정/배양 튜브에 존재하는 미생물 오염원에 대한 세포 반응에 의해서 변경되거나, 또는 불분명해지지 않도록 하기 위해, 채혈/배양 튜브에서 멸균 환경을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 채혈 튜브는 환자의 혈액과 직접 접촉할 수 있기 때문에, 튜브 내용물이 멸균 상태가 아닐 경우, 감염원이 환자에게 전달될 수 있는 위험이 있다.
그러나, 전자 빔 방사선 멸균은 단백질의 구조적, 생물학적 및/또는 면역학적 특성을 유의하게 변경시키고, 이에 상기 방사선이 생물학적 및 생물의학적 생성물에 미치는 잠재적으로 유해한 효과에 관한 우려가 증가하고 있다고 보고되었다 (예컨대, 문헌 [Katial et al., 2002 J Allerg Clin Immunol 110:215]; [Terryn et al., 2007 Int J Pharm 343:4]; [Antebi et al., 2016 Rev Bras Ortop 51:224]). 예를 들어, 전자 빔 멸균은 콴티페론® TB 골드 미토겐 채혈 튜브 중 예컨대, PHA 제제와 같은, 멸균 면역검정/배양 튜브 내의 단백질 제제의 효능을 현저히 감소시킬 수 있고, 로트간 일관성에 영향을 줄 수 있다. 그 결과, 최종 방사선 멸균의 결과로서 활성 성분 (예컨대, 미토겐)의 생체활성의 감소로 생산 효율이 감소하게 될 것이다. 따라서, 생체활성의 상실을 상쇄시키기 위해서는 수집 튜브 제조에서 사용되는 원료 물질 (예컨대, 유사분열촉진 단백질)의 투입량을 증가시키는 것이 요구되지만, 그러한 양 증가를 필요로 하는 것은 생산 비용을 증가시키고, 상이한 생산 배치 사이의 바람직하지 않은 가변성을 초래할 것이다.
다양한 공개문헌에는 방사선 멸균 동안 용매 함량, 온도, pH, 산소 함량 또는 다른 파라미터를 변형시킴으로써 및/또는 멸균 절차 동안 다양한 안정화제를 사용함으로써 생물학적 조직, 세포 및/또는 생체분자를 방사선 손상으로부터 보호하는 방법이 교시되어 있다. 이러한 개시내용으로부터, 주어진 안정화제 또는 안정화제들의 조합에 의한 임의의 특정 생체분자 또는 생체분자들 부류의 실용성, 그와의 화합성 및 방사선보호, 또는 다른 조건 변형에 의한 방사선보호 달성은 예측할 수는 없지만, 대신 바람직하게는 보호하고자 하는 생체분자에 대해서 경험적으로는 결정될 수 있어야 한다는 것은 자명하다.
예를 들어, EP2236520에는 생체분자를 냉동시키지 않기 위하여 선택된 조건하에서 전자기 방사선의 유해한 효과로부터 보호하기 위한 안정화를 포함하는, 생체분자의 안정화가 기술되어 있다. 안정화제는 최소 요구량의, 적어도 2개의 상이한 아미노산 내지 무려 18개 정도까지의 상이한 아미노산을 사용하는 것을 포함하고, 여기서 2 내지 5개의 상이한 아미노산의 조합이 바람직하다. US5730933에는 방사선 조사 이전에 생체분자를 외인성 단백질 (예컨대, 소 혈청 알부민 또는 변성된 콜라겐) 및 자유 라디칼 스캐빈저/항산화제와 접촉시키고, 냉동시키고, 임의적으로 동결건조 단계를 거쳐 생체분자를 방사선 손상으로부터 보호하는 것이 기술되어 있다. US6946098에는 인간 혈청 알부민 (HSA)을 안정화제로서 생물제제에 첨가한 후, 방사선 멸균을 수행하여 프리온, 바이러스 또는 다른 병원체를 파괴시키는 것이 기술되어 있다. 지방산, 항산화제, 자유 라디칼 스캐빈저, 헤파린, 및 티올 화합물을 비롯한, 대안적 안정화제 작용제의 광범위한 목록이 개시되어 있지만, 실험 실시예에는 오직 HSA만이 기술되어 있다.
US20030012687 및 US20030031584에는 지방산, 자유 라디칼 스캐빈저, 항산화제, 당, 선택된 아미노산 및 디펩티드, 트롤록스(Trolox) (CAS 53188-07-1) 등을 비롯한 매우 다양한 부류의 화합물로부터 얻은 안정화제를 이용하여 조직 또는 생체분자, 예컨대 면역글로불린을 방사선보호하는 것이 기술되어 있다. US20030143106 및 US20040086420에는 다양한 항산화제, 지방산, 아미노산, 비타민, 및/또는 자유 라디칼 스캐빈저를 사용하여 조직, 및 다양한 혈액, 혈청 및 혈장 단백질을 방사선보호하는 것이 기술되어 있다. US20050069453에는 샘플 특성 (예컨대, 용매 조성, pH, 온도 등)을 개질시켜 또는 실험 실시예에서 단지 소수의 것만이 방사선보호를 부여하는 것으로 입증된 광범위한 목록의 안정화제 중 임의의 것을 첨가함으로써 방사선 멸균 동안 우로키나제를 보호하는 것이 기술되어 있다.
분명하게는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 및 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하고, 면역검정 생성물의 품질 및 일관성을 개선시키고, 면역검정/배양 튜브/시스템 제조에서 요구되는 원료의 양을 감소시키는 것이 요구되고 있다. 개시된 본 발명의 실시양태는 이러한 요구들을 다루며, 다른 관련된 이점을 제공한다.
개시된 본 발명의 특정 측면에 따라, (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및 (b) 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균 단계 이전에 건조시킨다.
또 다른 실시양태에서, (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키는 단계; 및 (d) 건조된 방사선보호된 혼합물을 일정 기간 동안 보관하여 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 복수의 분자를 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 및 일정 기간 동안의 보관 후 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 건조되고 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균되고 이어서 일정 기간 동안 보관된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계를 포함하는, 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 복수의 분자를 상기 복수의 분자로부터의 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 방법을 제공한다.
특정의 다른 실시양태에서, (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중, 예를 들어 TLR 효능제 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린과 같은, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및 (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시켜 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (예컨대, 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린)의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 재수화시켜 재수화된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득한 후에, 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (예컨대, 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린)의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (예컨대, 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린)의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계를 포함하는, 방사선 멸균 동안, 예컨대 TLR 효능제 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린과 같은, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 특정의 추가 실시양태에서, TLR 효능제 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린은 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 및 레시퀴모드 (R848) 중 하나 이상을 포함한다.
상기 기술된 방법의 특정의 추가 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 단백질은 미토겐이고, 이는 특정의 또 다른 추가 실시양태에서, 피토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (ConA), 및 포크위드 미토겐 (PWM)으로부터 선택된다. 상기 기술된 방법의 특정의 다른 추가 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 단백질은 (i) 미토겐, (ii) 항체, (iii) 효소, (iv) 시토카인, (v) 성장 인자, 및 (vi) 호르몬 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방사선보호제 화합물은 적어도 하나의 항산화제 화합물을 포함하고, 이는 특정의 추가 실시양태에서, 시스테인, 글루타티온 및 멜라토닌으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 방사선보호제 화합물은 히스티딘을 포함한다. 상기 기술된 방법의 특정 실시양태에서, 방사선보호제 화합물은 방사선보호된 혼합물 중에 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 50 밀리몰의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 활성은 유사분열촉진 활성을 포함하고, 이는 특정의 추가 실시양태에서, 림프구 증식 유도 활성을 포함한다. 특정의 또 다른 추가 실시양태에서, 림프구 증식 활성은 T 세포 증식 유도 활성을 포함한다.
본원에 기술된 본 발명의 상기 및 다른 측면 및 실시양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면 참조시 명백해질 것이다. 본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 데이터 시트에 열거되어 있는, 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 (미국 이외의) 특허, 외국 특허 출원 및 비-특히 공개문헌들은 모두, 마치 각각이 포함된 것처럼 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 다양한 특허, 출원 및 공개문헌의 개념을 사용하기 위해 필요할 경우, 본 발명의 측면 및 실시양태는 변형될 수 있고, 이에 의해 추가의 다른 실시양태를 제공할 수 있다.
도 1은 용액 중 25 kGy로의 전자 빔 방사선 멸균으로 처리된 PHA-P 제제에서 생물학적 활성의 농도-의존적 보호를 보여준다. 시스테인 (채워진 원) 및 멜라토닌 (빈 원)을 동일한 PHA-P 제제 중에 다양한 최종 농도로 용해시켰다. 제조사의 설명서에 따라 콴티페론® ELISA (퀴아젠 인크.(QIAGEN, Inc.: 미국 메릴랜드주 저먼타운))를 사용하여 6명의 혈액 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비를 측정함으로써 유사분열촉진 활성을 측정하였다. 대조군 (어떤 첨가제도 포함하지 않는 PHA-P 단독) 대비 유사분열촉진 활성의 군 평균 비율(%)이 제시되어 있다. 결과는 용액 중 시스테인 및 멜라토닌의 유사분열촉진 활성의 용량 의존적 보호를 입증하였다.
도 2는 전자 빔 방사선 멸균 동안 콴티페론® 미토겐 컨트롤 채혈 튜브 중 분무 건조된 PHA-P의 생물학적 활성의 상실로부터의 미토겐 효능 보호를 보여준다. 시스테인 (액체 미토겐 제제 중 최종 농도 5 mM)으로 보충된 미토겐 (PHA) 제제를 이용하여 콴티페론® 미토겐 컨트롤 채혈 튜브를 제조하였다. 시스테인 존재 및 부재하에서 제제화되고, 전자 빔 방사선 멸균으로 처리 및 비처리된 미토겐 튜브에서, 8명의 기증자의 군에서의 미토겐 반응을 측정하였다. 데이터는 비멸균처리된 대조군 미토겐 튜브 (시스테인 부재)인 대조군의 반응(%)에 대해 정규화하였다. 도면에서 각각의 점은 기증자 1명당 그로부터의 데이터 점을 나타낸다. 시스테인은 미토겐 반응에 영향을 주지 않았지만, E-빔 방사선 멸균시 분무 건조된 PHA-P의 유사분열촉진 활성을 보호하였다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다.
도 3은 PHA 중 5 mM 시스테인의 존재 및 부재하에서 제조된 후, 전자 빔 방사선 멸균 처리되고, 제조 후 명시된 기간 (개월) 동안 보관된 콴티페론® 미토겐 컨트롤 채혈 튜브 중 미토겐 효능 차이의 비율(%)을 보여준다. 시스테인 (액체 미토겐 제제 중 최종 농도 5.0 mM)의 존재 및 부재하에서 콴티페론® 미토겐 컨트롤 채혈 튜브를 제조하고, E-빔 방사선으로 멸균시켰다. 미토겐 튜브의 생물학적 (유사분열촉진) 활성을 시간 경과에 따라 시험하였고, 이는 시스테인의 부재하에서 제제화된 미토겐 튜브와 비교한, 시스테인의 존재하에서 제제화된 미토겐 튜브의 활성의 효능 차이의 비율(%)로서 제시되어 있다. 도면에서 각각의 점은 각 시점에서의 군 평균 활성(%)을 나타낸다. 시간 경과에 따라, 시스테인의 존재하에서 제제화된 미토겐 튜브가 시스테인의 부재하에서 제제화된 미토겐 튜브보다 더 높은 활성(%)을 보였다는 것이 본 결과를 통해 입증되었고, 이는 시스테인 존재하의 미토겐 튜브가 시스테인 부재하의 튜브보다 시간 경과에 따른 활성의 상실이 더 작았다는 것을 시사한다.
도 4는 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)에 의한 E-빔 방사선으로부터의 항-CD3 항체의 T 세포 자극 활성의 보호를 보여준다.
도 5는 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)의 적정이 E-빔 방사선으로부터의 항-CD3 항체의 T 세포 자극 활성의 보호에 미치는 효과를 보여준다.
도 6은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)에 의한 E-빔 방사선으로부터의 TLR 효능제 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제 R848 (레시퀴모드)의 NK 세포 자극 활성의 보호를 보여준다.
도 7은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)의 적정이 E-빔 방사선으로부터의 TLR 효능제 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제 R848 (레시퀴모드)의 NK 세포 자극 활성의 보호에 미치는 효과를 보여준다.
도 8은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)에 의한 E-빔 방사선으로부터의, 조합된, 항-CD3 항체의 T 세포 자극 활성 및 TLR 효능제 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제 R848 (레시퀴모드)의 NK 세포 자극 활성의 보호를 보여준다.
도 9는 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)의 적정이 E-빔 방사선으로부터의 조합된, 항-CD3 항체의 T 세포 자극 활성 및 TLR 효능제 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제 R848 (레시퀴모드)의 NK 세포 자극 활성의 보호에 미치는 효과를 보여준다.
도 10은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)에 의한 E-빔 방사선으로부터의 포크위드 미토겐 (PWM)의 유사분열촉진 효능 보호를 보여준다.
도 11은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)의 적정이 E-빔 방사선으로부터의 포크위드 미토겐 (PWN)의 유사분열촉진 효능 보호에 미치는 효과를 보여준다.
도 12는 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)에 의한 E-빔 방사선으로부터의 T 세포 미토겐 콘카나발린 A (ConA)의 T 세포 자극 활성의 보호를 보여준다.
도 13은 6명의 기증자로부터의 전혈 샘플 중 IFN-γ 분비로 평가된 바와 같은, 방사선보호제 화합물 시스테인 (Cys) 또는 글루타티온 (G-SH)의 적정이 E-빔 방사선으로부터의 T 세포 미토겐 콘카나발린 A (ConA)의 T 세포 자극 활성의 보호에 미치는 효과를 보여준다.
특정의 본 발명의 개시된 실시양태는, 다르게는 방사선 멸균에 의해 손상될 수 있는, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자, 예컨대 생물학적 반응 개질제 또는 면역 반응 개질제의 생물학적 활성이, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자가 방사선 멸균 이전에 본원에서 제공되는 바와 같은 방사선보호제 화합물과 접촉한다면, 실질적으로 방사선보호될 수 있다는 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가될 수 있다는) 놀라운 발견에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 및 비제한적인 예에 의하면, 본원에 기술된 바와 같이, T 림프구를 향한 PHA의 유사분열촉진 활성은, PHA 용액이 분무 건조되어 있는 면역검정 튜브의 방사선 멸균에 의해 유의하게 감소된 것으로 나타났다. 그러나, 본원에 최초로 개시되어 있는 바와 같이, PHA가 방사선 멸균 이전에 본원에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 방사선보호제 화합물, 예를 들어 하나 이상의 방사선보호제 화합물, 예컨대 시스테인, 환원된 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉하게 되면, 방사선 멸균 후 PHA 생물학적 활성은 - 즉, 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 백혈구에 대한 유사분열촉진 활성은 -- 놀랍게도, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 대조군 PHA 샘플의 활성보다 더 컸다. 추가로, 및 또한 본원에 최초로 개시되어 있는 바와 같이, 생물학적으로 활성인 단백질 (PHA)을 용액을 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 것이 갖는 보호 효과는 예상외로, 예컨대 분무 건조 및/또는 냉동 건조 (예컨대, 동결건조)에 의한 혼합물의 실질적인 건조 이후에도 지속되었다. 또한, 실질적으로 건조된 방사선보호된 혼합물은 놀랍게도 장기간의 안정성을 보였고, 여기서 생물학적 활성의 실질적인 보호는 8개월 초과의 보관 이후에도 나타난다.
그러므로, 상기 및 관련된 실시양태는 멸균 환경에서 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제)를, 예컨대 분무 건조된, 탈수된, 및/또는 건조된 생물학적으로 활성인 단백질 (또는 다른 생물학적으로 활성인 분자) 제제를 단독으로, 또는 이롭게는 멸균 환경과 연관된 이익을 얻기 위해 방사선 멸균될 수 있는 임의 유형의 용기 (예컨대, 시험 튜브, 검정 플레이트, 마이크로웰, 배양 접시, 혈액 표본 용기, 병, 비이커, 바이알, 앰플, 시린지, 또는 임의의 다른 적절한 용기) 표면 상의 것으로 제공하는 것이 바람직할 수 있는 다수의 상황하에서 사용될 수 있을 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 특정의 바람직한 실시양태는 다양한 시험관내 면역학적 검정법 중 임의의 것에서 사용하기 위한 방사선보호된 단백질 미토겐에 관한 것이지만, 고려되는 실시양태는 그렇게 제한되는 것으로 의도되지 않으므로, 다른 생물학적으로 활성인 단백질 (예컨대, 면역자극성 항체) 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (예컨대, 생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제, 예를 들어 이미다조퀴놀린 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제, 예를 들어 예로서, 단, 제한 없이, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드 등) 또한 생물학적으로 활성인 단백질 또는 생물학적으로 활성인 분자가 실질적인 생물학적 활성의 상실 없이 이롭게 방사선 멸균될 수 있는 구성에 포함된다.
생물학적 활성
본원에 기술된 바와 같이, 물질의 생물학적 활성은 예를 들어, 세포, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 유기체와 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 활성을 의미한다. 생물학적 활성을 갖는 물질의 예로는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 및 특히, 효소, 항체, 당단백질, 렉틴을 비롯한, 생물학적으로 활성인 단백질, 유사분열촉진 렉틴을 비롯한, 유사분열촉진 단백질, 소분자 (예컨대, 생체활성 소분자), 제약 조성물 (예컨대, 약물), 백신, 면역 반응 개질제를 비롯한, 생물학적 반응 개질제, 예컨대 TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 (예컨대, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드 (R848) 등), 탄수화물, 지질, 스테로이드, 호르몬, 케모카인, 성장 인자, 시토카인, 리포솜 및 독소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 생물학적 시스템의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 주는 물질의 생물학적 활성, 예를 들어 면역학적, 면역화학적, 시토카인, 호르몬 및 생체활성 펩티드 활성 및 다른 세포 증식 (예컨대, 유사분열촉진) 및/또는 분화 활성 (예를 들어, 문헌 [Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ] 참조), 신호 전달 (예를 들어, 문헌 [Bonifacino et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Cell Biology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ] 참조), 면역강화 및/또는 면역 반응 개질제 활성, 예컨대 이미다조퀴놀린, 예를 들어 TLR 효능제 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드 (R848) 등 (예컨대, 문헌 [Gerster et al., 2005 J. Med . Chem. 48:3481]; [Shukla et al., 2010 J. Med . Chem . 53:4450]; [Shi et al., 2012 ACS Med . Chem . Lett . 3(6):501-504]; [Tomai et al., Ch. 8, Toll-Like Receptor 7 and 8 Agonists for Vaccine Adjuvant Use, pp. 149-161], 및 [Skountzu et al., Ch. 20, Adjuvants for Skin Vaccination, pp. 399-419, in Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns et al. (eds.), 2017 Academic Press, NY]), 유전자 발현 (예컨대, 문헌 [Asubel, FM et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ] 참조), 수용체-리간드 상호작용 (예를 들어, 문헌 [Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ] 참조), 효소 활성 (예컨대, 문헌 [Eisenthal and Hanson (Eds.), Enzyme Assays, Second Edition, Practical Approaches series, No. 257. 2002, Oxford University Press, Oxford, UK]; [Kaplan and Colowick (Eds.), Preparation and Assay of Enzymes, Methods in Enzymology, (vols. 1, 2 and 6). 1955 and 1961, Academic Press, Ltd., Oxford, UK] 참조), 및 세포 독성 (예컨대, 세포독성, 흥분성독성) (예를 들어, 문헌 [Bus JS et al. (Eds) 2007 Current Protocols in Toxicology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ] 참조), 아포톱시스 및 괴사 (Green and Reed, 1998 Science 281(5381):1309-12; Green DR, 1998 Nature Dec 17: 629; Green DR, 1998 Cell 94(6):695-69; Reed, JC (Ed.), 2000 Apoptosis, Methods in Enzymology (vol. 322), Academic Press Ltd., Oxford, UK); 또는 다른 생물학적 활성을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 생물학적 활성을 측정하는 데 적절한 검정법 및 방법에 관해 알고 있을 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 바람직한 실시양태에서, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 및/또는 또 다른 생물학적으로 활성인 분자 (생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제, 예를 들어 TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 (예컨대, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드 (R848) 포함))의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호하는 방법을 제공한다. 특정의 추가로 바람직한 실시양태에서, 생물학적으로 활성인 단백질은 하나의 또는 복수의 미토겐, 예를 들어 PHA, ConA, 및/또는 PWM 중 하나 이상이고/거나, 생물학적으로 활성인 단백질은 항체, 시토카인, 효소, 성장 인자, 및 호르몬 중 하나 이상을 포함하고/거나, 생물학적으로 활성인 분자는 하나의 또는 복수의 TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린, 예를 들어 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 및/또는 레시퀴모드 (R848)를 포함하는 면역 반응 개질제를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 특정의 바람직한 실시양태에서, 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키는 단계; 및 건조된 방사선보호된 혼합물을 일정 기간 동안 보관하여 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)의 복수의 분자를 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 및 일정 기간 동안의 보관 후 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)의 생물학적 활성이, 건조되고 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균되고 이어서 일정 기간 동안 보관된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 분자의 복수의 분자를 보관 기간 동안 상기 복수의 분자로부터의 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 방법이며, 여기서 생물학적으로 활성인 분자는 특정의 바람직한 실시양태에서 생물학적으로 활성인 단백질일 수 있고, 특정의 다른 바람직한 실시양태에서 하나 이상의 생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제, 예를 들어 TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제를 포함하는 생물학적으로 활성인 분자일 수 있는 것인 방법이 제공된다.
보관 기간은 특정 생물학적으로 활성인 분자(들), 상기 분자(들)의 특정 생물학적 활성 또는 활성들, 방사선 멸균 조건, 방사선보호제(들), 방사선보호된 혼합물의 건조 정도, 보관 조건 (예컨대, 온도, 상대 습도, 주변 대기 등), 및 다른 인자의 함수로서 크게 달라질 수 있다. 전형적으로, 생물학적으로 활성인 분자(들) (예컨대, 생물학적으로 활성인 단백질(들))가 생물학적 활성의 상실 (예컨대, 적절한 대조군 대비 생물학적 활성의 통계학상 유의한 감소)로부터 보호되는 보관 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 또는 그 초과일 수 있다.
생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)를 포함하는 조성물의 방사선 멸균 후, 생물학적 활성이 완전히 회복될 때, 또는 생물학적 활성이 실질적으로 회복될 때 (예컨대, 적어도 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 또는 50%, 바람직하게, 적어도 52, 54, 56, 58, 또는 60%, 더욱 바람직하게, 적어도 62, 64, 66, 68, 또는 70%, 더욱 바람직하게, 적어도 72, 74, 76, 또는 80%, 및 전형적으로, 더욱 바람직한 실시양태에서, 적어도 81, 82, 83, 84, 또는 85%, 더욱 바람직하게, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94%, 더욱 바람직하게, 적어도 95%, 더욱더 바람직하게, 96, 97, 98 또는 99% 초과 회복), 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자(들)의 생물학적 활성은 본원에 개시된 특정 실시양태에 따라 실질적으로 보호된 것일 수 있다.
본원에 기술된 특정 실시양태에서, 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자 (생물학적 활성 생물학적 반응 개질제, 예컨대 면역 반응 개질제, 예를 들어 TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제)를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득한다.
방사선보호된 혼합물의 방사선 멸균은 다수의 공지된 방법들 중 임의의 것에 따라, 예를 들어 예컨대 문헌 [Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141]; [Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol . 66:184]; [Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24]; [Yaman, 2001 Curr . Opin . Drug Devel. 4:760]; [Katial et al., 2002 J Allerg Clin Immunol 110:215]; [Terryn et al., 2007 Int J Pharm 343:4]; 및 [Antebi et al., 2016 Rev Bras Ortop 51:224]에 기술된 바와 같은 전자 빔 방사선에 의해 달성될 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 방사선보호된 혼합물은 방사선 멸균 이전에 건조 또는 실질적으로 건조되고, 전형적으로는 완전한 건성일 수 있다 (예컨대, 통계학상 유의하게, 모든 또는 실질적으로 모든 검출가능한 용매가 제거된 상태이다). 보관하고자 하는 샘플의 성질 및 그의 의도되는 용도에 따라 달라질 수 있는 특정 실시양태에서, 건조된, 건성, 실질적으로 건조된, 또는 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득하기 위한 목적으로 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 검출가능한 용매가 제거된다.
본원에서 제공되는 바와 같은 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계 후, 방사선보호된 혼합물을 다양한 건조 방법 중 임의의 것에 따라 건조시킬 수 있다. 바람직한 건조 방법은 동결건조 (예컨대, 냉동 건조, 예컨대 액체 상태의 물 형성 없이, 냉동된 고체 상태에서 기상으로의 승화에 의해 부분 또는 완전 진공하에 냉동된 수용액을 건조시켜 수분 제거를 촉진시키는 것)이다. 다른 건조 기술, 예를 들어 주변 온도 및 압력에서, 또는 층류 후드 또는 건식화 챔버에서, 또는 진공하에서 (예컨대, 진공 펌프, 예컨대 스피드백(SpeedVac)® 사용)를 포함한 감소된 대기압하에서 용매 (예컨대, 물)를 증발시킴으로써 건조시키는 것이 또한 사용될 수 있다. 다른 건조 방법도 고려되고, 이는 예를 들어, 제한 없이, 복사열 건조, 광원하 건조, 건식화, 질소 또는 다른 기체하에서의 (예컨대, 바람직하게, 유동 불활성 기체의 기류하에서의) 건조, 건조 용매 또는 다른 화학물질, 예를 들어 휘발성 유기 용매, 예컨대 저급 알콜, 저급 알칸 및 할로알칸 (예컨대, 펜탄, 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소), 에테르 (예컨대, 테트라히드로푸란), 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산, 피리딘, 아세톤 또는 다른 용매 (바람직하게, 무수 형태)의 사용, 기압, 및 증발을 촉진 및 가속화시키는 다른 방법을 포함한다.
샘플 건조는 간단한 육안 검사 또는 터치 (즉, 피펫 팁을 이용한 태핑(tapping))에 의해 모든 수분이 증발 또는 제거되었는지 확인함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직하게는 달성된 건조 정도를 확인하기 위하여 수분 표시계가 포함될 수 있다. 예를 들어, 염화코발트가 임의적으로 샘플 중 수분 함량의 (시각적 변색 또는 비색법에 의해) 검출가능한 표시계로서 포함될 수 있다. 수분 표시계, 예컨대 물질의 유전체 함량을 측정함으로써 수분 함량을 측정하는 전자 장치 (예컨대, 아쿠아-스피어(Aqua-Spear)™, 마스트래드 리미티드(Mastrad Limited: 영국 더글라스)) 또한 특정의 상기 및 관련 실시양태에서의 사용을 위해 고려된다. 수분 표시계와 함께, 건조제, 예컨대 황산칼슘 (즉, 드라이어라이트(Drierite)®, W.A. 해먼드 드라이어라이트 컴퍼니(W.A. Hammond Drierite Co.: 미국 오하이오주 제니아) 또는 오산화인 또한 본 개시내용의 특정 실시양태에서의 사용을 위해 고려된다.
방사선보호제 화합물
본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 본 개시내용은 다르게는 활성이 방사선 멸균에 의해 손상될 수 있는, 본원에서 제공되는 것과 같은 생물학적으로 활성인 분자, 예컨대 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성이, 생물학적으로 활성인 분자가 방사선 멸균 이전에 본원에서 제공되는 바와 같은 방사선보호제 화합물과 접촉하여 방사선 멸균되는 방사선보호된 혼합물을 형성한다면, 실질적으로 방사선보호될 수 있다는 (예컨대, 비보호된 적절한 대조군의 생물학적 활성과 비교하여, 예컨대 방사선보호제의 부재하에서 방사선 멸균된 동일한 생물학적으로 활성인 분자 (예컨대, 생물학적으로 활성인 단백질)의 생물학적 활성과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가될 수 있다는) 예상외의 발견에 관한 것이다.
생물학적 조직, 세포, 또는 생물학적 분자의 적어도 일부의 구조적 및/또는 기능적 속성을 보존 또는 부분적으로 보존하는 특정의 안정화제에 의해 부여되는 특정의 방사선보호 효과에 관한 이전의 관찰결과 (예컨대, 상기 요약된 것과 같은 결과)에도 불구하고, 통상의 기술자들은 합리적으로 본 발명의 개시된 특징의 조합에 이르게 될 것이라고는 예상하지 못했을 것이다.
따라서, 본원에서는 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가된 것인) 단계를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호하는 방법을 최초로 개시한다. 특정의 추가 실시양태에서, 방사선보호된 혼합물은 방사선 멸균 단계 이전에 실질적으로 건조된다.
본원에서는 또한 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 방사선보호된 혼합물을 실질적으로 건조시켜 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시켜 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호하는 단계이며, 여기서 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 재수화시켜 재수화된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득한 후에, 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가된 것인) 단계를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호하는 방법을 또한 최초로 개시한다.
더욱 특히, 본 개시내용에 따라, 인간 및 다른 포유동물 말초 혈액 림프구에 대하여 미토겐으로서 작용하는, 생물학적으로 활성인 단백질, 예컨대 PHA, ConA 또는 PWM, 또는 항-CD3 항체의 생물학적 활성은 전자 빔 방사선 멸균에 감수성이고, 방사선 멸균되지 않은 동일한 미토겐의 활성과 비교하여 감소된다는 것이 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 감소된다는 것이) 최초로 입증된다. 추가로, 및 또한 본원에서 최초로 개시된 바와 같이, 상기 미토겐의 생물학적 활성은 본원에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 방사선보호제 화합물과 접촉하여 추후 방사선 멸균되는 방사선보호된 혼합물을 형성함으로써 전자 빔 방사선의 손상 효과로부터 보호될 수 있다 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가될 수 있다).
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 방법에서 본 발명의 미토겐에 생체활성 보호를 부여하는 방사선보호제 화합물이 시스테인, 멜라토닌, 글루타티온 및 히스티딘 중 하나 이상을 포함할 수 있다 (또는 그로 이루어질 수 있다)는 것을 최초로 교시한다.
또한 추가로, 본 개시내용은 (예컨대, 시스테인, 멜라토닌, 글루타티온 및 히스티딘 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있는 바와 같은) 제공된 본 발명의 방사선보호제 화합물이 본 발명의 생물학적으로 활성인 단백질 미토겐 (예컨대, PHA, ConA 및/또는 PWM, 또는 항-CD3 항체) 또는 면역 반응 개질제 (예컨대, TLR 효능제 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 예컨대, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드 (R848) 등)와 함께 조합되어 방사선보호된 혼합물을 형성하고, 본원에서 제공되는 바와 같이 실질적으로 건조될 수 있고 (예컨대, 동결건조될 수 있고), 이에 의해 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물로서 방사선 멸균될 수 있고, 여기서 심지어 상기 건조된 형태에서도 방사선보호제 화합물의 존재는 방사선보호제 화합물이 생략된 대조군 샘플의 유사분열촉진 활성과 비교하여 미토겐의 생물학적 활성을 보존시킨다 (예컨대, 상기 활성은 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가된다)는 것을 최초로 교시한다.
그러므로, 본 개시내용은 이전에는 관련 기술분야에서 인지되지 못했던 방법에 의해, 본원에 기술된 바와 같이 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물 형태로 미토겐과 함께 존재할 때, 보호 능력을 비롯한, 상기와 같은 능력을 가질 것으로 이전에는 예상하지 못했던 방사선보호제 화합물을 사용하여 미토겐 및 다른 생물학적으로 활성인 분자를 방사선보호하는 것을 교시한다. 예를 들어, 용액 중에서 본 발명의 미토겐 이외의 다른 단백질에 대해 방사선보호 특성을 갖는 것으로 이전에 인정받았던 작용제는 본원에서 놀랍게도, 본원에 기술된 바와 같이 상이한 물리적 상태로 (예컨대, 용액 대신 동결건조된 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물로서) 미토겐과 함께 존재할 때, 다른 단백질 (예컨대, 본 발명의 미토겐)에 대해 방사선보호 효과를 보이는 것으로 기술된다. 이러한 특성은 본 개시내용 이전에는 예측되지 못했던 것이다.
따라서 및 특정의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 단백질(들), 예컨대 본원에 기술된 미토겐, 예를 들어 항-CD3 항체, PHA, ConA 및/또는 PWM, 및/또는 하나 이상의 생물학적 활성 면역 반응 개질제(들), 예컨대 본원에 기술된 이미다조퀴놀린 TLR 효능제, 예를 들어 이미퀴모드, 레시퀴모드 (R848) 및/또는 가르디퀴모드는 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉될 수 있고, 생물학적으로 활성인 단백질(들) 및/또는 면역 반응 개질제(들) 및 방사선보호제 화합물(들)의 건조가 동시에 진행될 수 있도록 허용하여 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있고, 이어서 상기 혼합물은 방사선 멸균되어 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 단백질(들)은 세포 표면 수용체에 대한 항체, 예를 들어 CD3, OX40, CD40L, CD152 및/또는 CD28에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉될 수 있고, 생물학적으로 활성인 단백질(들) 및 방사선보호제 화합물(들)의 건조가 동시에 진행될 수 있도록 허용하여 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있고, 이어서 상기 혼합물은 방사선 멸균되어 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다.
특정의 다른 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 단백질(들)은 적응 면역계의 선택적 요소 (예컨대, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, T 세포 수용체 또는 그의 항원-결합 단편 등)에 의해 특이적 결합 상호작용에서 인식될 수 있는 항원, 예를 들어 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있고, 상기 항원은 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉될 수 있고, 생물학적으로 활성인 단백질(들) 및 방사선보호제 화합물(들)의 건조가 동시에 진행될 수 있도록 허용하여 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있고, 이어서 상기 혼합물은 방사선 멸균되어 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다.
특정의 다른 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 단백질(들)은 시토카인, 예를 들어 TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-2 등을 포함할 수 있고, 상기 시토카인은 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉될 수 있고, 생물학적으로 활성인 단백질(들) 및 방사선보호제 화합물(들)의 건조가 동시에 진행될 수 있도록 허용하여 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있고, 이어서 상기 혼합물은 방사선 멸균되어 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자는 단백질(들), DNA 및/또는 RNA 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 이는 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물, 예를 들어 시스테인, 글루타티온, 멜라토닌, 및/또는 히스티딘과 접촉될 수 있고, 생물학적으로 활성인 분자(들) 및 방사선보호제 화합물(들)의 건조가 동시에 진행될 수 있도록 허용하여 실질적으로 건성인 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있고, 이어서 상기 혼합물은 방사선 멸균되어 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다.
방사선 멸균 후, 실질적으로 건성인 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물은 (예컨대, 생화학, 생물학 및/또는 면역학 분야의 통상의 기술자가 잘 알고 있는 바와 같이, 물 또는 수성 용매, 예컨대 수성 완충제 중에 재현탁 및/또는 용해시킴으로써) 재수화되어 재수화된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득할 수 있다. 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 크다 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가된다). 따라서, 본원에 개시된 실시양태는 예상외로 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 실질적으로 보호한다.
본 개시내용에 따른 바람직한 방사선보호제 화합물은 시스테인, 멜라토닌, 글루타티온, 및 히스티딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방사선보호제 화합물은 방사선보호제 화합물 시스테인, 멜라토닌, 글루타티온, 및 히스티딘 중 1, 2, 3 또는 4개 모두를 포함할 수 있고; 특정의 다른 실시양태에서, 방사선보호제 화합물은 방사선보호제 화합물 시스테인, 멜라토닌, 글루타티온, 및 히스티딘 중 1, 2, 3 또는 4개 모두로 이루어질 수 있다. 사용시, 이들 화합물들의 구매, 취급, 보관 및 가용화는 널리 공지되어 있고, 공지된 방법 및 하기 실시예를 포함하는 본 개시내용에 따라 본 발명의 방법에 맞게 쉽게 적합화될 수 있다. 본원에 제공된 방사선보호제 화합물은 본원에 제공된 바와 같은 생물학적으로 활성인 단백질 (예컨대, 미토겐 예컨대, 항-CD3 항체, PHA, ConA, PWN) 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성 (예컨대, 유사분열촉진 활성)을 실질적으로 보호하는 데 효과적인 농도로 본원에 기술된 방사선보호된 혼합물 중에 존재할 수 있다. 전형적으로 방사선보호제 화합물은 적어도 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 또는 400 mM의 농도 (그 사이의 중간 농도 포함)로 존재할 수 있다. 본원에 개시된 방사선보호제 화합물의 구조는 하기에 제시된다.
이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 본원에 기술된 특정 방사선보호제 화합물은 항산화제 및/또는 자유 라디칼 스캐빈저 특유의 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러나, 본 실시양태는 본원에 기술된 생물학적으로 활성인 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 분자, 및 특히, 포유동물 말초 혈액 림프구에 대한 미토겐인, 본원에 기술된 생물학적으로 활성인 단백질을, 다르게는 방사선 멸균의 결과로서 유발될 수 있는 생물학적 활성 손상으로부터 보호하는 이들 방사선보호제 화합물의 능력과 관련하여 그와 같이 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
L-시스테인 (2-아미노-3-술프히드릴프로판산)은 하기 구조식 (I)을 갖는다:
Figure pct00001
.
글루타티온 (환원된 형태) (γ-L-글루타밀-L-시스테이닐글리신)은 하기 구조식 (II)를 갖는다:
Figure pct00002
.
멜라토닌 (N-아세틸-5-메톡시 트립타민)은 하기 구조식 (III)을 갖는다:
Figure pct00003
.
히스티딘은 하기 구조식 (IV)를 갖는다:
Figure pct00004
.
본 발명의 여러 실시양태의 실시는 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야 범위 내에 있는 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술에서 통상적인 방법을 사용할 것으로 이해될 것이며, 그러한 방법들 다수는 예시되는 목적으로 하기 기술된다. 상기 기술은 문헌에서 상세하게 설명된다. 예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (2009)]; [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, New York 1995]; [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Ed., 2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.), 2nd Ed., 1995, Oxford Univ. Press, UK]; [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984) IRL/ Oxford Univ. Press, UK]; [Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985) IRL/Oxford Univ. Press, UK]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984) IRL/Oxford Univ. Press, UK]; [Culture of Animal Cells (R. Freshney, 2010) John Wiley & Sons, NY]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), John Wiley & Sons, NY]; 및 다른 유사 참고문헌을 참조한다.
면역화학적 및 세포 면역학적 검정법을 비롯한 면역학적 검정법을 위해, 및 생물학적 샘플 수집 및 프로세싱 (예컨대, 혈액, 림프, 타액, 객담, 고름, 생검 등), 조직 배양 및 형질전환 (예컨대, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용될 수 있다. 면역화학적 및 효소적 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라, 또는 관련 기술분야에서 보편적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 시약을 사용함으로써 수행될 수 있다. 이러한 기술 및 관련 기술 및 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 논의된 각종의 일반 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분자생물학, 세포 및 분자 면역학, 생화학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의료 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 및 그의 실험 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되고, 보편적으로 사용되는 것이다. 재조합 기술, 분자 생물학적 및/또는 세포 또는 미생물학적 방법, 화학 합성, 화학 합성, 제약 제조, 제제화, 전달, 및 환자의 진단 및/또는 치료를 위해 표준 기술이 사용될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, "하나"라는 단수 형태는 내용상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 본 명세서 전역에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 파생어는 언급된 한 요소 또는 정수, 또는 요소들 또는 정수들의 군을 포함하는 것이며, 임의의 다른 요소 또는 정수, 또는 요소들 또는 정수들의 군을 배제시키는 것은 아님을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 각각의 실시양태는 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 모든 다른 실시양태에 적용될 것이다.
등가물
본 발명의 특정 단계, 요소, 실시양태 및 적용이 예시 목적으로 본원에 제시되고, 기술되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 특히 상기 교시내용에 비추어 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 변형될 수 있는 바, 본 발명은 그에 제한되지 않는다는 것도 물론 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 것을 제외하면 제한되지 않는다.
인용된 다른 문헌
Figure pct00005
하기 실시예는 제한하는 것이 아니라, 예로서 제공되는 것이다.
실시예
실시예 1
PHA 유사분열촉진 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
간략하면, 콴티페론® TB 골드 미토겐 컨트롤 검정 튜브를 제조사 (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)로부터 입수하였고, 표준 채혈 튜브의 내부 벽 상에 피토헤마글루티닌 (PHA-P) 용액을 분무 건조함으로써 제조하였다. 이어서, 표준 방법에 따라 고에너지 전자 빔 처리 (E-빔)를 사용하여 방사선에 의해 채혈 튜브를 멸균시켰다.
방사선 멸균된 채혈 튜브 중의 PHA의 유사분열촉진 활성은 제조사의 설명서 (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따라 콴티페론® ELISA를 사용하여, 채혈 튜브에서 인큐베이션된 전혈 샘플로부터 혈장 중 IFN-γ 농도를 측정함으로써 평가하였다. 한 대표적인 실험의 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다. 채혈 튜브 상의 분무 건조된 PHA를 전혈 샘플에 의한 IFN-γ 방출을 유도할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하였을 때, 전자 빔 (예컨대, E-빔) 처리에 의한 또는 γ선 조사에 의한 채혈 튜브 상의 분무 건조된 PHA의 방사선 멸균은 채혈 튜브의 유사분열촉진 효능을 대폭 감소시켰다. 표준 E-빔 처리는 분무 건조된 PHA의 유사분열촉진 활성을 대조군 수준의 약 55%로 감소시켰다. 심지어 추가로 2 라운드의 방사선 멸균 (2x E-빔) 후에도 PHA 유사분열촉진 활성은 감소되었다. 이러한 활성의 상실은 방사선 선량 증가에 비례하였다 (표 1).
표 1. 처리 후 QFN 미토겐 튜브 효능
Figure pct00006
처리된 QFN-미토겐 컨트롤 채혈 튜브의 유사분열촉진 효능의 군 평균 비율(%)은 어떠한 처리도 받지 않은 동일한 미토겐 튜브 로트 (100% 효능) 대비로 결정되었다.
단일 생산 로트로부터의 미토겐 컨트롤 튜브를 E-빔 (16.6-30 kGy), γ선 조사 (25 kGy) 및 E-빔 2회 (2x E-빔)로 멸균시켰다. 미토겐 튜브의 유사분열촉진 활성, 즉, IFN-γ 수준을 11명의 혈액 기증자 군으로부터의 전혈 샘플을 이용하여 평가하였다. 멸균된 튜브의 유사분열촉진 효능은 어떠한 처리도 받지 않은 튜브의 것 대비 효능의 군 평균 비율(%)로서 제시되었다.
본 결과는 방사선 멸균되지 않은 튜브 중의 PHA 유사분열촉진 활성 수준에 더 가까운 PHA 유사분열촉진 활성 수준을 갖는 방사선 멸균된 튜브를 제공하기 위해서는 증가된 양의 PHA가 각 튜브에 분무 건조되어야 한다는 것을 시사하였다.
그러므로, 후보 방사선보호제 화합물을 PHA 유사분열촉진 활성에 미치는 효과에 대해 선택하고, 스크리닝하였다. 제1 선택에서는 심지어 방사선 멸균 이전에도 분무 건조된 PHA 제제 중에 포함되었을 때, 그 자체적으로는 유사분열촉진 활성을 유의하게 변경 (예컨대, 적절한 대조군과 비교하여 통계학상 유의한 방식으로 증가 또는 감소)시키지 않는 후보 방사선보호제 화합물이 확인되었다. 하기 표 2에 제시된 바와 같이, 50 mM의 후보 방사선보호제 화합물 시스테인, 또는 10 mM의 후보 방사선보호제 화합물 멜라토닌을 함유한 PHA-P 제제는 비보충된 PHA 제제와 유사한 PHA 유사분열촉진 활성을 보였다.
표 2. 시스테인 또는 멜라토닌 존재하에 제제화되었을 때의 PHA -P 활성
Figure pct00007
* 첨가제가 부재하는 동일한 제제 (100% 효능)와 비교하여 Cys 및 MLT가 존재하는 PHA-P 제제의 효능을 결정하였다.
PHA-P 제제의 효능을 6명의 혈액 기증자로부터의 전혈 샘플에서 평가하였다. 결과는 첨가제가 부재하는 제제의 효능 대비 첨가제가 존재하는 제제의 효능의 평균 비율(%)로서 제시되어 있다.
이어서, PHA 유사분열촉진 활성을 방해하지 않은 후보 방사선보호제 화합물을 방사선 멸균 동안 PHA를 유사분열촉진 활성의 상실로부터 보호할 수 있는 상기 화합물의 능력에 대해 시험하였다. L-시스테인, 환원된 글루타티온 또는 멜라토닌을 최종 농도 5.0 mM로 PHA 액체 제제에 첨가한 것이 8.3, 16.7 및 25 kGy E-빔으로 방사선 멸균 처리 후 PHA 유사분열촉진 활성의 상실을 부분적으로 막았다 (하기 표 3). 후보 방사선보호제 화합물 중 어떠한 것도 없는 PHA 액체 제제 (표 3, "대조군")는 8.3 kGy로의 방사선 멸균 처리 후 그의 유사분열촉진 활성 중 단지 11%만을 보였다. 비교하면, L-시스테인, 환원된 글루타티온, 또는 멜라토닌을 포함하는 분무 건조된 PHA 제제는 8.3 kGy의 동일한 선량의 방사선 멸균 처리 후, 각각 대조군의 유사분열촉진 활성 수준의 68%, 53% 및 53%를 보였고, 이에 의해 실질적으로 보호된 유사분열촉진 활성을 유지하였다.
표 3.
E-빔으로 처리된 PHA -P 제제에서의 활성의 상실 보호
Figure pct00008
PHA-P 제제의 유사분열촉진 활성의 군 평균 비율(%)은 E-빔 처리되지 않은 대조군 (0.0 kGy) 대비로 결정되었다.
5.0 mM 최종 농도로 첨가제를 포함하는 PHA-P 제제의 군 평균 활성은 6명의 혈액 기증자로부터의 전혈 샘플에서 측정하였다. 결과는 첨가제가 부재하는 비처리된 대조군 샘플 대비 효능의 평균 비율(%)로서 제시되어 있다.
여기서 확인된 보호 화합물을 함유하는 액체 PHA 제제는 또한 더 높은 선량의 방사선 멸균, 즉, 16.7 및 25 kGy의 E-빔 처리 후 PHA 유사분열촉진 활성을 실질적으로 보호할 수 있는 능력을 보였다.
L-시스테인 및 멜라토닌의 용량-효과 보호 능력을 추가로 평가하였다. L-시스테인을 PHA-P 제제 중에 1.0-50 mM로 용해시켰다. 그의 수용해도가 더 낮은 것에 기인하여, 200 mM의 멜라토닌 스톡 용액을 먼저 100% 에틸 알콜에서 제조하였다. 이어서, 스톡을 PHA-P 제제에 첨가하여 최종 농도가 0.2-10 mM가 되도록 만들었다. E-빔 처리 후, 전혈 샘플에서 PHA-P 제제의 효능을 시험하고, 제조사의 설명서에 따라 콴티페론® ELISA (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 유사분열촉진 활성을 측정하였다.
결과는 도 1에 요약되어 있다. PHA-P 제제 중에서 L-시스테인의 농도를 1.0 mM에서 10 mM로 증가시켰을 때, 25 kGy에서 그의 PHA 유사분열촉진 활성 방사선 보호는 (첨가제로서 어떠한 방사선보호제 화합물도 함유하지 않았고, 방사선 멸균 처리되지 않은) PHA 대조군 제제의 유사분열촉진 활성 수준 대비 5.9%에서 38%로 유의하게 증강되었다.
채혈 튜브 중 분무 건조된 PHA의 방사선 멸균으로부터 초래되는 PHA 유사분열촉진 효능 상실을 감소시킬 수 있는 그의 능력에 대해 L-시스테인을 추가로 시험하였다. 분무 건조된 PHA (분무 건조 단계에서 방사선보호제 화합물 비포함)를 함유하는 채혈 튜브에 대해 방사선 멸균을 수행하였고, 전혈 샘플에 대한 PHA 유사분열촉진 활성을 상기 기술된 바와 같이 시험하였다. 시스테인 (5 mM)이 분무 건조된 PHA 제제 중에 존재하였고, 튜브에 대해 방사선 멸균이 수행되지 않았을 때, 전혈 샘플에 대한 PHA 유사분열촉진 반응은 대조군 (방사선보호제 비포함, 방사선 멸균 비수행) 수준 대비 평균 94.8%였고 (도 2, 좌측 칼럼), 이는 시스테인이 비-멸균된 미토겐 튜브에서 미토겐 반응을 변경시키지 않았다는 것을 보여준다. 방사선 멸균 단계 결과, PHA 유사분열촉진 활성은 대조군 (방사선보호제 비포함, 방사선 멸균 비수행) 수준 대비 56%로 감소되었다 (도 2, 중간 칼럼). 시스테인 (5 mM)이 분무 건조된 PHA 제제 중에 존재하고, 튜브에 대해 방사선 멸균을 수행하였을 때, 전혈 샘플에 대한 PHA 유사분열촉진 반응은 대조군 (방사선보호제 비포함, 방사선 멸균 비수행) 수준 대비 56% (시스테인 비포함)에서 72% (5 mM cys)로 증가하였다 (도 2, 우측 칼럼).
실시예 2
PHA 유사분열촉진 활성의 방사선보호제 보호의 보관 안정성
미토겐 (분무 건조된 PHA) 튜브를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 방사선 멸균시켰고, 시스테인이 첨가되지 않은 PHA 제제를 5.0 mM 시스테인을 함유하는 PHA 제제와 비교하였다. 분무 건조된 PHA의 유사분열촉진 활성에 미치는 시스테인의 방사선보호 효과의 장기간 보관 안정성을 또한 평가하였다.
분무 건조 및 방사선 멸균 후, 앞서 기술된 바와 같이 유사분열촉진 활성에 대해 시험하기 전에 다양한 기간 동안 튜브를 유지시켰다. (제조 후 1개월 이내의) 제1 시험 시점에, 시스테인 없이 제조된 미토겐 함유 튜브는 시스테인 존재하에 제조된 것과 유사한 수준의 유사분열촉진 활성을 보였다 (도 3). 그러나, 제조 후 8개월 이후로까지 연장된 후속 시점에서의 시험에서는 시스테인을 함유한 튜브가 시스테인 없이 제조된 튜브보다 상대적으로 더 높은 수준으로 유사분열촉진 활성을 유지하였다.
실시예 3
항-CD3 항체 T 세포 자극 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
본 실시예는 생물학적으로 활성인 항체의 활성을 방사선 멸균 효과로부터 보호하는 본원에 기술된 바와 같은 방사선보호제 화합물의 용도를 기술한다. 본 실시예에서, 물질 및 방법은 본원에서 달리 언급되는 것을 제외하면, 본질적으로 상기 실시예 1 및 2에서 기술된 것과 같았다.
항-CD3 항체 샘플을 둘베코스 포스페이트 완충처리된 염수 (DPBS)에 용해시키고, 66.7 ㎍/mL 농도로 희석시킨 후, 10 mM 시스테인 (Cys) 또는 3 mM 글루타티온 (G-SH)의 존재 또는 부재하에서 다양한 선량의 E-빔 방사선 조사에 노출시켰다. 콴티페론® (QFN) 닐(Nil) 튜브 (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운) 중 전혈 1 mL당 0.10 ㎍의 항-CD3 항체를 이용하여, 무작위로 선택된 6명의 기증자의 군으로부터 수득된 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 T 세포에 의한 인터페론-감마 (IFNγ) 분비를 유도할 수 있는 그의 능력을 측정함으로써 처리된 항체 샘플을 그의 T 세포 자극 활성에 대해 시험하였다. QFN 닐 튜브 중에서 항-CD3 항체와 함께 전혈 샘플을 인큐베이션시킨 후, 혈액 프로세싱, 혈장 수거 및 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의한 IFN-γ 검출을, 콴티페론®-TB 골드 플러스(QuantiFERON®-TB Gold Plus) 패키지 인서트 (QFN-TB 골드 플러스, 퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 제시되어 있는 바와 같이 제조사의 설명서에 따라 수행하되, 단 예외적으로, 혈장 샘플을 8-포인트 표준 곡선으로 시험하기 직전에 ELISA 키트 그린 딜루언트(Green Diluent) 중에 1 대 10으로 희석시켰다.
기능성 항-CD3 항체는 전혈 배양물 중에서 인터페론 감마 (IFN-γ) 분비를 유도하는 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 전혈 샘플 중에서, E-빔 방사선 조사 동안 10 mM 시스테인 또는 3.0 mM G-SH로 보호된 항-CD3 항체에 의해 유도된 IFNγ 반응의 대표적인 결과는 (비보충된 DPBS 중에서 방사선 조사 처리된) 비보호된 대조군 샘플과 비교하여 도 4에 제시되어 있다. 8.3 kGy 이상의 선량으로 E-빔 처리한 경우, 항체를 DPBS 단독하에 방사선 조사 처리하였을 때, 항-CD3 항체의 활성 (y축에서 군 평균 IFN-γ 반응, 도 4)은 완전히 폐기되었다 (빈 원). 그에 반해, 10 mM 시스테인 (Cys, 채워진 사각형) 또는 3.0 mM G-SH (채워진 원)를 또한 함유한 DPBS 중에서 방사선 조사 처리 E-빔 처리된 항-CD3 항체 샘플은 심지어 E-빔 선량 최대 25 kGy에서도 자극 활성을 유지하였다 (도 4). 그러므로, Cys 및 G-SH 둘 모두 E-빔 방사선으로 처리된 항-CD3 항체의 활성을 확실히 보호하였다.
25 kGy E-빔 방사선 조사로 처리된 항체 샘플에서 두 방사선보호제, Cys 및 G-SH, 모두에 의해 부여되는 항-CD3 활성에 대한 보호 효과는 Cys (채워진 원) 및 G-SH (채워진 사각형) 둘 모두의 경우 1.0 mM에서 10 mM로의 용량에 의존하는 방식으로 증가한 것으로 나타났다 (도 5).
실시예 4
R848 (레시퀴모드) TLR 효능제 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
본 실시예는 이미다조퀴놀린 면역 반응 개질제 (R848)의 TLR 효능제 활성을 방사선 멸균 효과로부터 보호하는 본원에 기술된 바와 같은 방사선보호제 화합물의 용도를 기술한다. 본 실시예에서, 물질 및 방법은 본원에서 달리 언급되는 것을 제외하면, 본질적으로 상기 실시예 1-3에서 기술된 것과 같았다.
R848 (레시퀴모드, CAS 144875-48-9)은 자연 살해 (NK) 세포에 의한 생물학적 반응을 자극시킬 수 있는 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제이고, 그의 활성은 콴티페론® 닐 튜브 (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운) QFN 전혈 배양 시스템에서 측정될 수 있다. R848 샘플을 DPBS 중에 66.7 ㎍/mL 농도로 용해시키고, 10 mM Cys 또는 3 mM G-SH의 존재 또는 부재하에서 다양한 선량의 E-빔 방사선 조사로 처리하였다. QFN 닐 튜브 중 전혈 1 mL당 1.0 ㎍의 R848을 이용하여, 무작위로 선택된 6명의 기증자의 군으로부터 수집된 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 백혈구에서, 처리된 R848 샘플을 그의 생물학적 활성 (시험관내 인큐베이션 동안 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력)에 대해 시험하였다. QFN 튜브 중에서 R848 샘플과 함께 인큐베이션시킨 후, 전혈 샘플 프로세싱, 혈장 수거 및 IFN-γ ELISA를 콴티페론®-TB 골드 플러스 패키지 인서트 (QFN-TB 골드 플러스, 퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따라 수행하되, 단 예외적으로, 혈장 샘플을 8-포인트 표준 곡선으로 시험하기 직전에 ELISA 키트 그린 딜루언트 중에 1:10으로 희석시켰다.
10 mM의 Cys 또는 3.0 mM의 G-SH의 존재하에 방사선 조사 처리된 R848 샘플에 부여된 방사선보호 효과를 보여주는 대표적인 결과가 비히클 대조군 (DPBS) 중에서 방사선 조사 처리된 R848과 비교하여 도 6에 제시되어 있다. 8.3 kGy 이상의 선량으로 E-빔 처리한 경우, DPBS 단독하에 제조된 R848의 활성 (도 6의 y축에서 군 평균 IFN-γ 반응)은 완전히 폐기되었다 (빈 원). 그에 반해, 10 mM Cys (채워진 사각형) 또는 3.0 mM G-SH (채워진 원)를 함유한 E-빔 처리된 R848 샘플은 R848의 자극 활성을 유지하였다.
25 kGy E-빔으로 처리된 샘플에서 Cys 및 G-SH가 R848 활성에 미치는 보호 효과는 Cys (채워진 원) 및 G-SH (채워진 사각형) 둘 모두의 경우 1.0 mM에서 10 mM로의 용량에 의존하는 방식으로 증가한 것으로 나타났다 (도 7).
실시예 5
조합된 항-CD3 항체 T 세포 자극 활성 및 R848 (레시퀴모드) TLR 효능제 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
본 실시예는 생물학적으로 활성인 항체 및 이미다조퀴놀린 TLR 효능제 면역 반응 개질제 (R848)의 조합된 활성을 방사선 멸균 효과로부터 보호하는 본원에 기술된 바와 같은 방사선보호제 화합물의 용도를 기술한다. 본 실시예에서, 물질 및 방법은 본원에서 달리 언급되는 것을 제외하면, 본질적으로 상기 실시예 1-4에서 기술된 것과 같았다.
콴티페론® 모니터(QuantiFERON® Monitor) (QFM) 시약 (퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)인 동량의 항-CD3 및 R848의 조합을 DPBS 중에 33.5 ㎍/mL 농도로 용해시키고, 10 mM 시스테인 (Cys) 또는 3 mM 글루타티온 (G-SH)의 존재 또는 부재하에서 다양한 선량의 E-빔 방사선 조사로 처리하였다. QFN 닐 튜브 중 전혈 1 mL당 0.05 ㎍의 QFM을 이용하여, 무작위로 선택된 6명의 기증자의 군으로부터 수집된 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 백혈구에서, 처리된 샘플을 그의 생물학적 활성 (시험관내 인큐베이션 동안 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력)에 대해 시험하였다. QFN 튜브 중에서 QFM 샘플과 함께 인큐베이션시킨 후, 전혈 샘플 프로세싱, 혈장 수거 및 IFN-γ ELISA를 콴티페론®-TB 골드 플러스 패키지 인서트 (QFN-TB 골드 플러스, 퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따라 수행하되, 단 예외적으로, 혈장 샘플을 8-포인트 표준 곡선으로 시험하기 직전에 ELISA 키트 그린 딜루언트 중에 1:10으로 희석시켰다.
10 mM Cys 또는 3.0 mM의 G-SH의 존재하에 방사선 조사 처리된 QFM 샘플에 부여된 방사선보호 효과를 보여주는 대표적인 결과가 대조군 (DPBS)과 비교하여 도 8에 제시되어 있다. 8.3 kGy 이상의 선량으로 E-빔 처리한 경우, 비보충된 DPBS 단독하에 제조된 자극성 항-CD3/R848 조합의 활성 (도 8의 y축에서 군 평균 IFN-γ 반응)은 완전히 폐기되었다 (빈 원). 그에 반해, 항-CD3 및 R848의 자극 활성은 10 mM Cys (채워진 사각형) 또는 3.0 mM G-SH (채워진 원)를 함유한 PBSD 중에서 E-빔 방사선 조사 처리된 방사선보호제 함유 샘플에서 보존되었다.
25 kGy E-빔으로 처리된 샘플에서 Cys 및 G-SH가 조합된 항-CD3 및 R848 활성에 미치는 보호 효과는 Cys (채워진 원) 및 G-SH (채워진 사각형) 둘 모두의 경우 1.0 mM에서 10 mM로의 용량에 의존하는 방식으로 증가한 것으로 나타났다 (도 9).
실시예 6
포크위드 미토겐 (PWM) 유사분열촉진 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
본 실시예는 생물학적으로 활성인 렉틴의 활성을 방사선 멸균 효과로부터 보호하는 본원에 기술된 바와 같은 방사선보호제 화합물의 용도를 기술한다. 본 실시예에서, 물질 및 방법은 본원에서 달리 언급되는 것을 제외하면, 본질적으로 상기 실시예 1-5에서 기술된 것과 같았다.
포크위드 미토겐 (PWM) 샘플을 DPBS 중에 33.3 ㎍/mL 농도로 용해시키고, 10 mM 시스테인 (Cys) 또는 3 mM 글루타티온 (G-SH)의 존재 또는 부재하에서 다양한 선량의 E-빔 방사선 조사로 처리하였다. QFN 닐 튜브 중 전혈 1 mL당 1.0 ㎍의 PWM을 이용하여, 무작위로 선택된 6명의 기증자의 군으로부터 수집된 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 백혈구에서, 처리된 PWM 샘플을 그의 생물학적 활성 (시험관내 인큐베이션 동안 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력)에 대해 시험하였다. QFN 튜브 중에서 PWM 샘플과 함께 인큐베이션시킨 후, 전혈 샘플 프로세싱, 혈장 수거 및 IFN-γ ELISA를 콴티페론®-TB 골드 플러스 패키지 인서트 (QFN-TB 골드 플러스, 퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따라 수행하되, 단 예외적으로, 혈장 샘플을 8-포인트 표준 곡선으로 시험하기 직전에 ELISA 키트 그린 딜루언트 중에 1:10으로 희석시켰다.
10 mM Cys 또는 3.0 mM의 G-SH의 존재하에 방사선 조사 처리된 PWM 샘플에 부여된 방사선보호 효과를 보여주는 대표적인 결과가 대조군 (DPBS)과 비교하여 도 10에 제시되어 있다. 8.3 kGy 이상의 선량으로 E-빔 처리한 경우, 비보충된 DPBS 단독하에 제조되고, 방사선 조사 처리된 대조군 PWM 샘플의 활성 (도 10의 y축에서 군 평균 IFN-γ 반응)은 완전히 폐기되었다 (빈 원). 그에 반해, PWM의 자극 활성은 10 mM Cys (채워진 사각형) 또는 3.0 mM G-SH (채워진 원)를 함유한 PBSD 중에서 E-빔 방사선 조사 처리된 방사선보호제 함유 샘플에서 보존되었다.
25 kGy E-빔으로 처리된 샘플에서 Cys 및 G-SH가 PWM 활성에 미치는 보호 효과는 Cys (채워진 원) 및 G-SH (채워진 사각형) 둘 모두의 경우 1.0 mM에서 10 mM로의 용량에 의존하는 방식으로 증가한 것으로 나타났다 (도 11).
실시예 7
콘카나발린 A (ConA) 유사분열촉진 활성의 방사선 멸균으로부터의 방사선보호
본 실시예는 생물학적으로 활성인 렉틴의 활성을 방사선 멸균 효과로부터 보호하는 본원에 기술된 바와 같은 방사선보호제 화합물의 용도를 기술한다. 본 실시예에서, 물질 및 방법은 본원에서 달리 언급되는 것을 제외하면, 본질적으로 상기 실시예 1-6에서 기술된 것과 같았다.
콘카나발린 A (ConA)는 T-림프구를 활성화시키는 렉틴으로 알려져 있다. ConA 샘플을 을 DPBS 중에 3333 ㎍/mL 농도로 용해시키고, 10 mM 시스테인 (Cys) 또는 3 mM 글루타티온 (G-SH)의 존재 또는 부재하에서 다양한 선량의 E-빔 방사선 조사로 처리하였다.
QFN 닐 튜브 중 전혈 1 mL당 100 ㎍의 ConA를 이용하여, 무작위로 선택된 6명의 기증자의 군으로부터 수집된 인간 전혈 샘플 중에 존재하는 백혈구에서, 처리된 ConA 샘플을 그의 생물학적 활성 (시험관내 인큐베이션 동안 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력)에 대해 시험하였다. QFN 튜브 중에서 ConA 샘플과 함께 인큐베이션시킨 후, 전혈 샘플 프로세싱, 혈장 수거 및 IFN-γ ELISA를 콴티페론®-TB 골드 플러스 패키지 인서트 (QFN-TB 골드 플러스, 퀴아젠 인크.: 미국 메릴랜드주 저먼타운)에 따라 수행하되, 단 예외적으로, 혈장 샘플을 8-포인트 표준 곡선으로 시험하기 직전에 ELISA 키트 그린 딜루언트 중에 1:10으로 희석시켰다.
10 mM Cys 또는 3.0 mM의 G-SH의 존재하에 방사선 조사 처리된 ConA 샘플에 부여된 방사선보호 효과를 보여주는 대표적인 결과가 대조군 (DPBS)과 비교하여 도 12에 제시되어 있다. 8.3 kGy 이상의 선량으로 E-빔 처리한 경우, 비보충된 DPBS 단독하에 제조되고, 방사선 조사 처리된 대조군 ConA 샘플의 활성 (도 12의 y축에서 군 평균 IFN-γ 반응)은 완전히 폐기되었다 (빈 원). 그에 반해, ConA의 자극 활성은 10 mM Cys (채워진 사각형) 또는 3.0 mM G-SH (채워진 원)를 함유한 PBSD 중에서 E-빔 방사선 조사 처리된 방사선보호제 함유 샘플에서 보존되었다.
25 kGy E-빔으로 처리된 샘플에서 Cys 및 G-SH가 ConA 활성에 미치는 보호 효과는 Cys (채워진 원) 및 G-SH (채워진 사각형) 둘 모두의 경우 1.0 mM에서 10 mM로의 용량에 의존하는 방식으로 증가한 것으로 나타났다 (도 13).
상기 기술된 다양한 실시양태는 조합되어 추가 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 데이터 시트에 열거되어 있는, 2018년 5월 18일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 62/673,671을 비롯한, 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개는 모두 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 다양한 특허, 출원 및 공개문헌의 개념을 사용하기 위해 필요할 경우, 실시양태의 측면은 변형될 수 있고, 이에 의해 추가의 다른 실시양태를 제공할 수 있다.
상기 상세한 설명에 비추어 실시양태에 따라 상기 및 다른 변경이 실시양태에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적인 실시양태로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 청구범위의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께 가능한 모든 실시양태를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

Claims (27)

  1. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (b) 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균 단계 이전에 건조시키는 것인 방법.
  3. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키는 단계; 및
    (d) 건조된 방사선보호된 혼합물을 일정 기간 동안 보관하여 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 분자의 복수의 분자를 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 및 일정 기간 동안의 보관 후 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 건조되고 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균되고 이어서 일정 기간 동안 보관된 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 분자의 복수의 분자를 상기 복수의 분자로부터의 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 방법.
  4. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 분자를 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시켜 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 재수화시켜 재수화된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득한 후에, 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 분자의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적으로 활성인 분자가 (i) 생물학적으로 활성인 단백질, (ii) 미토겐, (iii) 항체, (iv) 효소, (v) 시토카인, (vi) 성장 인자, (vii) 호르몬 및 (viii) TLR 효능제 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미토겐이 피토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (ConA), 및 포크위드 미토겐 (PWM)으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 적어도 하나의 항산화제 화합물을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항산화제 화합물이 시스테인, 글루타티온 및 멜라토닌으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 히스티딘을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 방사선보호된 혼합물 중에 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 50 밀리몰의 농도로 존재하는 것인 방법.
  11. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성이 유사분열촉진 활성을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 유사분열촉진 활성이 림프구 증식 유도 활성을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 림프구 증식 활성이 T 세포 증식 유도 활성을 포함하는 것인 방법.
  14. 제5항에 있어서, TLR 효능제 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 이미다조퀴놀린이 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 및 레시퀴모드 (R848) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  15. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질을 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (b) 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균 단계 이전에 건조시키는 것인 방법.
  17. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질을 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시키는 단계; 및
    (d) 건조된 방사선보호된 혼합물을 일정 기간 동안 보관하여 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 복수의 분자를 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 단계이며, 여기서 방사선 멸균 및 일정 기간 동안의 보관 후 보관된 건조된 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성이, 건조되고 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균되고 이어서 일정 기간 동안 보관된 생물학적으로 활성인 단백질의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 보관 기간 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 복수의 분자를 상기 복수의 분자로부터의 생물학적 활성의 상실로부터 보호하는 방법.
  18. (a) 방사선 멸균 이전에 수용액 중 생물학적으로 활성인 단백질을 적어도 하나의 가용성 방사선보호제 화합물과 접촉시켜 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계;
    (b) 방사선보호된 혼합물을 건조시켜 건조된 방사선보호된 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (c) 건조된 방사선보호된 혼합물을 방사선 멸균시켜 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득하고, 이에 의해 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 단계이며, 여기서 건조된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 재수화시켜 재수화된 방사선 멸균된 방사선보호된 혼합물을 수득한 후에, 방사선 멸균 후 방사선보호된 혼합물 중 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성이, 방사선보호제 화합물의 부재하에서 방사선 멸균된 생물학적으로 활성인 단백질의 대조군 샘플의 생물학적 활성보다 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 단백질의 생물학적 활성을 방사선 손상으로부터 보호하는 방법.
  19. 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적으로 활성인 단백질이 (i) 미토겐, (ii) 항체, (iii) 효소, (iv) 시토카인, (v) 성장 인자, 및 (vi) 호르몬 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 미토겐이 피토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (ConA), 및 포크위드 미토겐 (PWM)으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 적어도 하나의 항산화제 화합물을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항산화제 화합물이 시스테인, 글루타티온 및 멜라토닌으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 히스티딘을 포함하는 것인 방법.
  24. 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제 화합물이 방사선보호된 혼합물 중에 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 50 밀리몰의 농도로 존재하는 것인 방법.
  25. 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성이 유사분열촉진 활성을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 유사분열촉진 활성이 림프구 증식 유도 활성을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 림프구 증식 활성이 T 세포 증식 유도 활성을 포함하는 것인 방법.
KR1020207032785A 2018-05-18 2019-05-17 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 보호 KR20210013553A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862673671P 2018-05-18 2018-05-18
US62/673,671 2018-05-18
PCT/US2019/032885 WO2019222638A1 (en) 2018-05-18 2019-05-17 Protection of biologically active molecules during radiation sterilization

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210013553A true KR20210013553A (ko) 2021-02-04

Family

ID=66770587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207032785A KR20210013553A (ko) 2018-05-18 2019-05-17 방사선 멸균 동안 생물학적으로 활성인 분자의 보호

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210260225A1 (ko)
EP (1) EP3793621A1 (ko)
JP (2) JP7487184B2 (ko)
KR (1) KR20210013553A (ko)
CN (1) CN112135641A (ko)
AU (1) AU2019269671A1 (ko)
CA (1) CA3096717A1 (ko)
MX (1) MX2020012237A (ko)
SG (1) SG11202009795PA (ko)
WO (1) WO2019222638A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621467B (zh) * 2022-05-17 2022-07-29 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法
CN115611978B (zh) * 2022-11-21 2023-03-07 成都奇璞生物科技有限公司 一种辐照保护剂在制备胶原蛋白产品中的用途

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027878A1 (fr) * 1996-02-05 1997-08-07 Asahi Medical Co., Ltd. Agent protecteur sterile et procede de sterilisation
US5730933A (en) * 1996-04-16 1998-03-24 Depuy Orthopaedics, Inc. Radiation sterilization of biologically active compounds
US20030012687A1 (en) * 2000-03-23 2003-01-16 Macphee Martin J. Methods of sterilizing biological materials
MXPA02009321A (es) * 2000-03-23 2003-05-23 Clearant Inc Metodos de esterilizacion de materiales biologicos.
US20040086420A1 (en) 2000-03-23 2004-05-06 Macphee Martin J. Methods for sterilizing serum or plasma
US6682695B2 (en) * 2001-03-23 2004-01-27 Clearant, Inc. Methods for sterilizing biological materials by multiple rates
US6696060B2 (en) * 2001-06-14 2004-02-24 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of monoclonal immunoglobulins
US6946098B2 (en) 2001-08-10 2005-09-20 Clearant, Inc. Methods for sterilizing biological materials
US20030031584A1 (en) 2001-08-10 2003-02-13 Wilson Burgess Methods for sterilizing biological materials using dipeptide stabilizers
US6749851B2 (en) * 2001-08-31 2004-06-15 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of digestive enzymes
US7252799B2 (en) * 2001-08-31 2007-08-07 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations containing albumin
EP1415669A1 (en) * 2002-09-19 2004-05-06 Aventis Behring GmbH Process for sterilization of protein containing biological compositions
US20050069453A1 (en) 2003-09-29 2005-03-31 Ren-Yo Forng Methods for sterilizing preparations of urokinase
GB0626021D0 (en) * 2006-12-29 2007-02-07 Insense Ltd The stabilisation of proteins
EP2236520A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Stabilizing composition for immobilized biomolecules
US8999720B2 (en) * 2011-11-17 2015-04-07 Medtronic Minimed, Inc. Aqueous radiation protecting formulations and methods for making and using them
JP6951243B2 (ja) * 2015-03-12 2021-10-20 三洋化成工業株式会社 タンパク質組成物の製造方法及びタンパク質組成物
US20160354500A1 (en) * 2015-06-02 2016-12-08 Medtronic Minimed, Inc. Protective agents against e-beam irradiation for proteins in optical sensing chemistry
EP3478283A4 (en) * 2016-06-29 2020-07-22 Menlo Therapeutics Inc. USE OF NEUROKININ-1 ANTAGONISTS FOR TREATING VARIOUS PRURIGINAL DISORDERS

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024073470A (ja) 2024-05-29
MX2020012237A (es) 2021-03-25
EP3793621A1 (en) 2021-03-24
WO2019222638A1 (en) 2019-11-21
JP7487184B2 (ja) 2024-05-20
CA3096717A1 (en) 2019-11-21
AU2019269671A1 (en) 2020-10-22
CN112135641A (zh) 2020-12-25
JP2021524362A (ja) 2021-09-13
SG11202009795PA (en) 2020-12-30
BR112020021358A2 (pt) 2021-01-19
US20210260225A1 (en) 2021-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230225939A1 (en) Means and methods of sterilization of biofunctional compositions
JP2024073470A (ja) 放射線滅菌中の生物学的活性分子の防護
JP5680055B2 (ja) 固定化生体分子のための組成物の安定化
US10632188B2 (en) Compositions containing ambient-temperature stable, inactivated but therapeutically active biopharmaceuticals and methods for formulation thereof
CN105636609A (zh) 一种新颖的生产稳定疫苗的方法
CN103649105A (zh) 防止(多)肽解折叠和/或诱导(多)肽(再)折叠的方法
Nomura et al. A biological study establishing the endotoxin limit for in vitro proliferation of human mesenchymal stem cells
Anamur et al. Stability of collapse lyophilized influenza vaccine formulations
Maurer et al. Activation of Neutrophils by the extracellular polymeric substance of Sepidermidis biofilms is mediated by the bacterial heat shock protein Groel
EP3269725A1 (en) Method for producing protein composition, and protein composition
BR112020021358B1 (pt) Método de proteção da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa ou outra molécula biologicamente ativa contra danos de radiação durante a esterilização por radiação
Pizzuto et al. Improving heat stability of haemagglutinating antigens for avian influenza
Sandle Peer Reviewed: Pharmaceutical Processing

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal