CN103649105A

CN103649105A - 防止(多)肽解折叠和/或诱导(多)肽(再)折叠的方法

Info

Publication number: CN103649105A
Application number: CN201280032572.7A
Authority: CN
Inventors: 马丁·肖尔茨; 延斯·阿尔特里克特; K·克姆特
Original assignee: Leukocare AG
Current assignee: Leukocare AG
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2014-03-19
Also published as: WO2013001044A1; EP3511336B1; US9321848B2; EP3511336A1; JP6838958B2; US20140099697A1; US10421776B2; JP2014522827A; EP2726495B1; EP2726495A1; US20160215015A1; JP2019052169A; JP2017075171A

Abstract

本发明涉及一种在干燥期间防止(多)肽解折叠和/或在干燥后诱导(多)肽(再)折叠的方法，所述方法包括将所述(多)肽包埋在水性溶液中的步骤，其中所述溶液包含：(i)至少三种不同的氨基酸；或(ii)至少一种二肽或三肽；并且其中所述溶液不含或基本不含：(a)糖；和(b-i)蛋白；和/或(b-ii)变性化合物；和(c)硅烷。

Description

防止(多)肽解折叠和/或诱导(多)肽(再)折叠的方法

本发明涉及一种在干燥期间防止(多)肽解折叠和/或在干燥后诱导(多)肽(再)折叠的方法，所述方法包括将所述(多)肽包埋在水性溶液中，其中所述溶液包含：(i)至少三种不同的氨基酸或(ii)至少一种二肽或三肽；并且其中，所述溶液不含或基本不含：(a)糖；和(b-i)蛋白；和/或(b-ii)变性化合物；和(c)硅烷。

在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的多篇文献。虽然不认为这些文献与本发明的专利性相关，但是通过引用将这些文献的全部公开内容并入本文中。更具体而言，通过引用将所有引用文献并入，其程度如同将每一篇单独文献都通过引用具体地或单独地并入一样。

蛋白是由氨基酸序列构成的大分子，其特征在于对应于其生物活性状态的独特三维结构。蛋白分子的天然结构是各种相互作用之间精密平衡的结果，所述相互作用包括共价键、疏水相互作用、静电相互作用(电荷排斥和离子配对=盐桥)、氢键和范德华力。在这些力中，疏水相互作用似乎是主导力。蛋白内相互作用和蛋白-溶剂相互作用在维持蛋白结构和其稳定性方面都起到重要作用。蛋白通常不是太稳定，因为天然状态的稳定化能大多为5千卡/摩尔～20千卡/摩尔，这与几个氢键的稳定化能相当。由于折叠状态仅比解折叠状态稍微稳定，蛋白环境的任何改变都可能引起蛋白的降解或失活。

蛋白稳定性是失稳力和致稳力之间平衡的结果。失稳力主要归因于解折叠熵的大幅增加，而致稳力由一些非共价相互作用提供。任何这些相互作用的破坏都会改变平衡并使蛋白失稳，并且已知有许多破坏该精妙平衡和影响蛋白稳定性的因素。这些包括例如温度、pH、离子强度、金属离子、表面吸附、剪切、振荡、添加剂、溶剂、蛋白浓度、纯度、形态、压力和冷冻/解冻-干燥。可能导致蛋白不稳定的化学转变包括例如脱酰胺、氧化、水解、异构化、琥珀酰亚胺化、二硫键形成或断裂、非二硫键交联和去糖基化。因此开发蛋白药物的最具挑战性的任务之一是应对它们的物理和化学不稳定性，并提供能够使蛋白稳定的制剂，从而实现可接受的保存期限。

蛋白不稳定性的常见现象是化学上或物理上可逆或不可逆地形成蛋白聚集体，所述蛋白聚集体是可溶或不可溶的。在某些条件下(或有时是随时间/保存期限)，蛋白的二级、三级和四级结构可能改变，导致蛋白解折叠和/或随后形成蛋白聚集体。蛋白的聚集正在快速成为造成蛋白疗法的多种有害效果的关键问题，这些有害效果包括功效、生物利用度和稳定性的损失以及不期望的针对所述蛋白疗法的宿主免疫应答的活化。具体而言，在用治疗性蛋白进行治疗期间可以产生针对该治疗性蛋白的抗体，这些抗体可以中和或削弱这些治疗性蛋白的临床效果，并且还可能与严重的副作用有关，例如与自体蛋白的交叉反应。因此，蛋白药物中任何聚集体的存在对于产品释放通常都是不可接受的。蛋白聚集可由多种物理因素诱导，但是，蛋白聚集以及蛋白聚集的速率和机制通常是蛋白依赖性的。

影响蛋白稳定性的最重要因素是温度。通常，温度越高，蛋白稳定性越低。蛋白通常在一定温度范围内是稳定的。高温使许多蛋白药物变性。虽然依赖于实验条件可以使高温下的蛋白变性可逆，但高温还会加快化学降解，例如天冬氨酸残基的水解增加、天冬酰胺或谷氨酰胺残基的脱酰胺化。最重要的是，蛋白的降解机制常常视温度而变化，这在例如冷却链可能中断的喷雾干燥或贮存和运输期间特别相关。

此外，蛋白往往仅在较窄的pH范围内稳定，并且蛋白聚集的速率极大地受到pH的影响。像温度一样，制剂pH可以既影响蛋白的物理稳定性也影响蛋白的化学稳定性。不同的化学降解可以在不同的pH下得到促进。这解释了为什么同一蛋白在不同pH下降解的产物是不同的。在温和酸性条件下，水解可以容易地发生在天冬氨酸残基处。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺化在强酸、中性和碱性条件下易于发生。在碱性条件下，可以发生许多反应，例如肽键水解、脱酰胺化、精氨酸水解成鸟氨酸、β-消除和外消旋化、以及双键形成。在存在赋性剂时可以进一步改变pH对化学稳定性的影响。

蛋白还可以吸附至许多表面和界面，例如容器表面、冰/水界面和空气/水界面。空气/水界面处的蛋白吸附始于锚定蛋白分子的区域的形成，然后是所吸附的分子在界面处的重新定向和重新排列。吸附的严重性是蛋白依赖性的，并且似乎不取决于蛋白的大小和pI。诸如IgG等蛋白的二级结构在此类吸附表面处可发生显著变化。因此，表面吸附可能导致蛋白的损失和/或失稳。

蛋白表面吸附通常是浓度依赖性的，并且在超过一定蛋白浓度时达到最大(至少对于某些蛋白而言)。用于例如对蛋白进行无菌过滤、透析或浓缩的容器或膜的种类(即材料)对蛋白的表面吸附具有显著影响。蛋白表面吸附还在例如冷冻干燥或喷雾干燥这样的干燥过程中特别相关。

对蛋白进行的处理也影响稳定性。例如，振荡或剪切可能导致蛋白变性。振荡(例如在干燥样品的重建期间使用)可以产生疏水性的空气/水或空气/表面界面，这导致蛋白分子在界面处的整齐排列(alignment)，从而引起蛋白解折叠以使疏水性残基最大程度地暴露于所述空气或表面并引发聚集。在振荡期间引起蛋白聚集的疏水性表面可以是气体或固体。类似地，剪切(例如喷雾干燥或喷雾冷冻干燥期间所遇到的)也会使蛋白的疏水性区域暴露，由此引发聚集。不同蛋白可以耐受不同程度的剪切失活。蛋白结构的刚性和蛋白表面上的疏水性残基的数量可能是这种不同的剪切耐受水平的原因。

盐也可以对蛋白稳定性具有作用，虽然它们的作用是复杂的，部分是因为在完全暴露表面上以及在完全或部分包埋的蛋白内部的复杂的离子相互作用。取决于盐的种类和浓度、离子相互作用的性质以及蛋白中带电残基的存在与否和量，盐可能使蛋白稳定、失稳或对蛋白稳定性无影响。盐的作用还强烈地取决于溶液的pH，pH决定了可离子化基团的带电状态。

取决于种类和浓度，金属离子也可以使蛋白稳定或失稳。由于带负电的抗衡离子也可以正面或负面地显著影响蛋白稳定性，应仔细解释金属离子对蛋白稳定性的贡献。每个单个蛋白分子所需的致稳金属离子的数量是蛋白依赖性的，并且对于蛋白稳定性而言金属离子可以相互替换或者不可以相互替换。金属离子可以显著影响蛋白稳定性而不会过多影响其二级结构。蛋白制剂中的痕量金属离子可以催化蛋白中的氧化(即通过Fenton途径)，特别靶向甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸或苏氨酸残基。该催化取决于金属离子的浓度，并且，金属所催化的反应在诸如抗坏血酸或RSH等还原剂的存在下可以得到促进。金属离子、氧和还原剂可以产生能够氧化蛋白的活性氧物质。

与金属离子密切相关的是诸如EDTA和柠檬酸等螯合剂，其可以通过与蛋白和/或其关键金属离子结合而使蛋白失稳，或者通过与任何有害的金属离子结合而稳定蛋白。由于过渡金属离子能够催化蛋白氧化，离子螯合剂应当能够保护蛋白免受金属催化的氧化。但是，在许多情况下，螯合剂的效应更为复杂。净效应取决于金属离子、氧化机制和螯合剂的类型。

此外，蛋白聚集通常是浓度依赖性的。蛋白浓度对其聚集的影响取决于聚集的机制和实验条件。在一些情况下，蛋白浓度还在一定程度上影响化学降解。另一方面，浓缩的蛋白溶液对于冷冻引起的蛋白聚集和活性损失更具有抗性。

蛋白制品的纯度是另一重要方面，因为痕量的酶、金属离子或其他污染物的存在能够潜在地影响蛋白稳定性。

此外，高压能够引起蛋白解折叠，这是因为蛋白-溶剂体系的体积在解折叠状态下更小。换言之，解折叠的蛋白比折叠的蛋白更为压缩，这在冷冻干燥或喷雾冷冻干燥期间可能起作用。

另外，许多化学反应是蛋白药物失活的原因。在许多情况下，在蛋白中可以同时发生数种反应，使得蛋白降解产物的分离和鉴定十分困难。为了防止蛋白化学失活，首先应鉴定并抑制主要反应。在一定程度上这可以通过将制剂的pH调节到有利范围之外而实现。蛋白中不稳定氨基酸的位置在确定它们的化学反应性时是关键的。蛋白中许多氨基酸的化学反应要求一定的局部柔性，因此，具有高柔性的变性蛋白或小肽中的反应速率可能比天然蛋白更高。因此需要保护天然蛋白构象，以防止或抑制潜在的化学降解。

脱酰胺化(其在许多情况下是蛋白的主要降解途径)似乎在蛋白药物中也是最常见的降解途径。蛋白中易受脱酰胺化影响的两种氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺，而天冬酰胺是更不稳定的氨基酸。在水性溶液中，蛋白和肽内的天冬酰胺的脱酰胺化的进行速率可以比肽键水解的速率高得多。蛋白中脱酰胺化的速率、机制和位置是pH依赖性的。此外，如同蛋白中脱酰胺位点处的相邻氨基酸一样，蛋白中天冬酰胺和/或谷氨酰胺的相对位置会影响它们的相对脱酰胺化速率。最不稳定的序列似乎是Asn-Gly，蛋白中的脱酰胺化速率还受蛋白的二级结构影响。

可以导致蛋白失活的另一化学反应是氧化。具体而言，组氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸残基的侧链是潜在的氧化位点。这些位点处的氧化可以被痕量的过渡金属离子催化(位点特异性过程)，或者被氧化剂增强或在暴露至光时增强(非位点特异性过程)。位点特异性归因于活性氧物质在特定金属结合位点处的产生及其氧化作用。最容易氧化的位点是甲硫氨酸和半胱氨酸上的巯基。蛋白中的甲硫氨酸残基容易被大气中的氧氧化。制剂的pH可以通过改变氧化剂的氧化电势、催化性金属离子和可离子化氨基酸之间结合的亲和性以及氧化中间体的稳定性来影响氧化速率。此外，将蛋白暴露至电离辐射(例如γ射线或电子束辐射)可以导致蛋白中的氨基酸侧链被所产生的活性氧物质氧化。

二硫键在控制蛋白活性和稳定性方面往往很重要。蛋白中的游离半胱氨酸残基能够被容易地氧化形成二硫键，或引发巯基-二硫键交换，从而引起蛋白聚集或聚合。蛋白中的巯基-二硫键交换是离子化的巯基(硫醇盐阴离子)和二硫键之间的交换。巯基-二硫键交换的速率取决于亲核性巯基的离子化程度，因此通常随着反应pH的升高而升高，直到超过亲核性巯基的pK。即使蛋白不具有游离半胱氨酸残基，仍然可以出现二硫键混杂(scrambling)，从而引起蛋白聚集。

作为蛋白组分的氨基酸还经受酸水解和碱水解。除了-X-Asp-Y-序列中的肽键，大多数肽键是稳定的。水解期间，天冬氨酸形成琥珀酰亚胺中间体，其与在Asn脱酰胺期间获得的琥珀酰亚胺中间体类似。另外，还可以形成环状酸酐中间体，特别是在天冬氨酸的C侧翼残基为脯氨酸时。在许多情况下，在天冬酰胺残基脱酰胺之后继续进行水解。

除了甘氨酸之外，氨基酸还具有外消旋化的可能。通过环状酰亚胺(琥珀酰亚胺)中间体，天冬氨酸-X肽键能够容易地进行天冬氨酸和异天冬氨酸之间的可逆异构化。琥珀酰亚胺中间体通常不稳定，在数小时内可以发生明显的水解。如脱酰胺化一样，天冬氨酸的异构化速率强烈受其在蛋白中的位置和迁移性的影响。在完整蛋白的相对非结构化结构域中或在易受短暂解折叠影响的结构域中，最容易形成异天冬氨酸。

在蛋白中，琥珀酰亚胺中间体的形成可以发生在天冬酰胺的脱酰胺和天冬氨酸的异构化之前。事实上，琥珀酰亚胺的形成是蛋白中异天冬氨酸衍生物形成的原因。天冬酰胺在中性和碱性条件下经由琥珀酰亚胺的形成而脱酰胺，但是在蛋白中Asp-Gly键处的形成可以在4～5的最适pH下出现。琥珀酰亚胺的形成速率强烈地受到不稳定残基的相邻基团和蛋白构象的影响。

蛋白还可以通过非二硫键途径形成共价二聚体和多聚体。例如，甲醛介导的交联使冻干的破伤风和白喉类毒素在贮存期间发生显著聚集，由此引起对贮存液体和固体形式的甲醛失活的病毒疫苗制剂的顾虑。

蛋白也可以通过去糖基化而发生化学转化，这使得蛋白对热变性更加敏感，因为蛋白中的碳水化合物部分的功能之一是保护蛋白免受热失活和水解失活。糖基化对蛋白稳定性的影响随着蛋白与蛋白的不同而具有显著差异。

最后，糖经常用作液体和固体制剂中的蛋白稳定剂，但是，还原性糖可以与蛋白中的氨基基团反应，形成碳水化合物加合物，特别是在高温时。这种极其复杂的褐变途径称为美拉德反应(Maillard reaction)。

当对蛋白施加不同类型的应激(stress)时，例如在蛋白的分离和纯化期间、通过例如冻干、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥或泡沫干燥对蛋白进行干燥期间、蛋白在溶液中或干燥后的储存期间、以及干燥后重建期间，所有上述影响可以同时或单独出现。

特别是在蛋白干燥期间，施加了相当大的应激。例如，在冷冻干燥期间，随着液体的冷冻，液体中形成纯结晶冰。将蛋白暴露至该冰水界面可以导致变性，例如冷冻损伤。此外，在不存在适合的稳定剂时，干燥期间从蛋白上除去水合外层可以进一步使蛋白结构失稳。此外，压力、pH值或离子浓度以及添加剂的浓度效应的变化、温度变化和剪切力也会影响干燥期间蛋白的稳定性。另外，氧、表面效应或水解的影响也可以使蛋白失活或变性。在干燥蛋白的贮存期间，诸如贮存期间的残留水分、光照射、氧化以及温度等应激因子也可以进一步影响干燥蛋白的变性和失活。所有以上方面都可以在蛋白重建和活性损失方面引起问题。

由于对所关注的蛋白进行结构修饰更为复杂，通常使用的蛋白致稳方法是基于添加赋形剂。赋形剂可以减少聚集，还可以延迟蛋白中的某些化学降解。其致稳效果是浓度依赖性和蛋白依赖性的，但是高浓度的赋形剂不一定会更有效，而是在一些情况下可能具有有害作用。常使用的蛋白稳定剂包括糖和多元醇、氨基酸、胺、盐、聚合物和表面活性剂，它们中的每一种都可以产生不同的致稳效果。

因多种原因而将赋形剂添加到制剂中，并且一些赋形剂作为制剂的一部分可以具有多于一种效果或用途。在所选的赋形剂中，必须对物理和化学稳定性进行优化。经常使用赋形剂来减缓或防止物理失稳过程(蛋白聚集)。存在溶剂诱导的蛋白致稳的特定机制，这些机制特别涉及制剂中的赋形剂。通过加强蛋白致稳力、通过使变性状态失稳或通过使赋形剂与蛋白直接结合来实现致稳。

因此，稳定剂在药物制剂中的主要作用是保护蛋白免受在以下期间对蛋白施加的不同类型的应激：蛋白的分离和纯化期间，通过例如冻干、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥或泡沫干燥对蛋白进行干燥期间，蛋白在溶液中或干燥后的储存期间，以及干燥后的重建期间。

在溶液中围绕折叠蛋白的水的结构对于维持蛋白的天然结构而言极其重要。诸如糖和氨基酸等致稳赋形剂的存在可以通过使赋形剂从蛋白表面优先被排斥(这是由于赋形剂与肽主干的相互作用在热动力学上是不利的)而使蛋白稳定(所谓的优先排斥模型)，由此会使蛋白优先水化，因为在蛋白表面上发现的水分子比在本体溶液中的更多。认为该过程在蛋白暴露至常见应激条件(例如分离、纯化、溶液中贮存和液体蛋白药物制剂的制备)下时起致稳作用。通过优先排斥而实现的蛋白稳定化依赖于优先排斥的赋形剂的浓度，并且需要至少在局部存在足够量的水。

在蛋白干燥期间，赋形剂的浓度增加，在残留的湿润区域中，优先排斥效应增强。由于该过程，蛋白以其天然形式保留在水合状态，直至残留水分子被进一步干燥(冷冻干燥等)除去。在除去该残留水时，在蛋白和赋形剂的官能团之间形成越来越多的氢键，由此置换了蛋白与组成水合外层的周围水分子之间所失去的相互作用(水置换，优先相互作用)。因此，通常添加对蛋白具有冻干保护剂和/或冷冻保护剂效果的赋形剂，从而在水含量变化期间优化蛋白稳定性。此类赋形剂的实例包括例如糖和多元醇，还包括其他赋形剂，例如表面活性剂和氨基酸。在例如Kofi Bedu-Addo2004(Pharmaceutical Technology,Lyophilization;2004:10-30)中讨论了开发冻干制剂时常用的赋形剂。

冷冻干燥过程产生了含有处于玻璃态的蛋白的干燥粉末，其经常包含非晶性赋形剂和残留水。在干燥状态，化学降解和解折叠的速率受蛋白的迁移性和周围的赋形剂分子的影响。在干燥的蛋白的玻璃态下，这种迁移性大大降低，干燥蛋白可以因非晶性赋形剂(例如海藻糖)的存在而进一步稳定。残留水分将视体系的固态性质(即，非晶性还是结晶性)以及所选择的加工条件而定。

还添加赋形剂以优化干粉制剂。干燥的粉末需要具有一定的特性以被利用。例如，冷冻干燥块需要可接受的外观(因为这指示稳定性)，应该能够快速溶解且必须防止制剂的喷出(即重建后的产品起泡)。为此目的，通常选择诸如糖和多元醇等填充剂(bulking agent)，因为它们还可以充当冷冻保护剂和冻干保护剂。当选择合适的赋形剂时，首先考虑固态性质。例如，甘露醇通常会结晶，并因此产生结构稳定性良好的块。但是，甘露醇可以以稳定性不同的三种不同多晶形式(α、β、δ)和甘露醇半水合物(其可以在贮存期间释放其结晶水)形式结晶，并且甘露醇的固体状态取决于施加的冷冻干燥条件以及其他赋形剂的存在。冷冻干燥时蔗糖通常保持非晶性，这是蛋白稳定性所需要的，但是其也会在初步干燥后增加水含量，并且增加最终产物的潮解和瓦解的危险。

防止蛋白之间的直接相互作用也能够稳定蛋白，因为这些相互作用最常见的是导致聚集。例如，之前已经报道精氨酸与某些蛋白强烈结合，而还已经报道其被其他蛋白的表面排斥。

通过选择合适的制备程序、贮存条件、温度、小瓶或者通过添加诸如抗坏血酸等抗氧化剂，可以使化学不稳定性最小化。抗坏血酸充当抗氧化剂以防止蛋白氧化。另一方面，由于抗坏血酸盐的还原性质，其还在金属离子和氧的存在下促进蛋白的金属催化氧化。后一种效应通常通过共同添加螯合剂(例如EDTA、DTPA、DFO)来避免。

与界面的吸附通常通过添加(理想地)比蛋白自身更具表面活性的赋形剂来避免。主要将表面活性剂或其他蛋白用于涂布或竞争性吸附容器的内表面，或吸附至在制备递送系统时形成的表面。表面活性剂可以分为离子型和非离子型。低浓度的非离子型表面活性剂因其相对低的临界胶束浓度(CMC)而往往足以防止或减少蛋白表面吸附或聚集。常用的非离子型表面活性剂的实例包括泊洛沙姆(Pluronic F-68)和聚乙二醇十二烷基醚(Brij35)、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、人血清白蛋白等。这些表面活性剂中的一些，特别是聚山梨醇酯，可能会被在其结构中引入的醚键所产生的烷基过氧化物污染，这是不利的，因为这能够加速蛋白的氧化。聚合物和右旋糖酐也能够用于抵御表面吸附，但据报道仅有大分子量的PEG对蛋白具有致稳效果，而小分子量的PEG似乎诱导解折叠。表面活性剂的选定浓度取决于所要避免的效应，但是通常其正好高于CMC值，此时在界面处存在单层的表面活性剂。常用的离子型表面活性剂的实例包括十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

在制备制剂的过程中，例如在干燥过程中，能够发生由于蛋白微环境的变化而导致的微气候pH的变化。干燥过程中，一种组分会比其他组分在溶液中停留更长时间，这可以导致超过三个pH单位的pH改变。由于pH依赖于温度，因此在诸如冻干、喷雾干燥、贮存等温度变化期间，也会遇到较小的pH变化。但是，通常蛋白仅在窄pH范围内稳定。因此，在开发合适的制剂早期，一个重要步骤是研究pH稳定性，特别是在pH3～10范围内。

利用合适的缓冲体系来实现pH的保持。但是，不幸的是，对于特定的缓冲剂的选择没有通用规则。通常，不添加用于避免pH变化的特定赋形剂，而是如有可能应该使用浓度很低的缓冲剂。当选择缓冲剂时，必须注意的是，缓冲体系可能影响制剂的化学稳定性，因为pH值似乎是脱酰胺反应中的主要控制变量，而且聚集速率受缓冲剂选择的影响。

常使用盐来调节pH和张性。冷冻期间，纯溶剂(水)首先冻结，导致残留液相(冷冻浓缩相)中盐浓度增加，由此提高了离子强度。

最后，在某些情况下，因本体溶液的稳定性要求或因施用途径的要求，可能需要等渗制剂。诸如甘露醇、蔗糖、甘氨酸、甘油和氯化钠等赋形剂是良好的张性调节剂。还可以在稀释剂而不是在制剂中包含张性改性剂(Tonicity modifier)。

国际申请WO2005/007185描述了尝试在不添加常用稳定剂人血清白蛋白(HAS)的情况下稳定蛋白药物。WO2005/007185中使用的致稳溶液包含：(i)优选为非离子型洗涤剂的表面活性物质，即表面活性剂，和(ii)至少两种氨基酸的混合物，其中所述至少两种氨基酸是谷氨酸和谷氨酰胺或者是天冬氨酸和天冬酰胺。测试氨基酸对其自身的致稳效果的唯一实施例(表2)显示，在不存在表面活性剂聚山梨醇酯80时，未发现致稳效果，或仅发现对蛋白溶液的非实质性致稳效果——持续有限的时间。

在国际申请WO2008/000780中，当包含至少30%或至少40%的苯丙氨酸时，含有蛋白的喷雾干燥粉末稳定且具有有利的空气动力学行为。由于在粉末中添加了苯丙氨酸，粉末的内聚性和粘合性发生变化以减少颗粒间的相互作用。通过使粉末颗粒的表面更加疏水，粉末的空气动力性质得到改善，由此使得其更适于肺部施用。在WO2008/000780中未设想利用含有氨基酸的溶液来诱导蛋白折叠或防止蛋白解折叠。

欧洲专利申请EP1789019描述了用于肺部施用的喷雾干燥的蛋白药物粉末，通过添加新型的寡糖混合物而使该粉末稳定。国际申请WO2010/151703描述了用于增加稳定性、减少肽或多肽的聚集或减少其免疫原性的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种烷基糖苷。

总之，关键的是使制剂科学家彻底了解以下几个因素：如何优化活性成分的物理化学稳定性；如何在制剂中合理地包含特定的赋形剂；如何获得实现稳定性的最佳条件；如何防止扩大规模期间的稳定性问题；最后是，如何设计适于计划的施用途径的制剂，即，可以克服吸收屏障。赋形剂的选择经常是根据之前的经验和当局已批准了哪些赋形剂来进行。通常选择赋形剂(i)以确保制备过程的成功终点，例如，可以获得干燥粉末；(ii)以确保液体制剂保持恒定的pH值；或(iii)以使蛋白对一些生产所诱导的效应(例如吸附)稳定。但是，可用于一种蛋白的赋形剂可能对另一种蛋白有害。

蛋白的大尺寸、其组成多样性和两亲特性构成了特定行为，例如折叠、构象稳定性和解折叠/变性。不同蛋白之间的结构差异如此显著以致于至今尚不能成功地概括出通用的致稳策略。虽然大量研究都致力于提供合适的方法来使蛋白在暴露至不同形式的应激条件期间防止解折叠和/或确保正确折叠，但是由于蛋白误折叠，仍然存在例如聚集问题或增加的非特异性免疫原性的问题。即使到现在为止，也通常需要在开发稳定的蛋白制剂之前检查蛋白的基本性质。这些性质包括蛋白纯度、pI以及在不同pH下和不同缓冲体系中的溶解度和稳定性。使用这些数据，通常能够解决蛋白制剂的问题。

虽然期望保留尽可能低数量的功能性赋形剂，这是为了例如减少由固体状态相互作用引起的不稳定性，但是大量的潜在失稳效应往往要求必须添加数种赋形剂。此外，对于每种所关注的蛋白，需要繁重的研究来鉴定各自适合的赋形剂。因此，仍然需要提供改进的方法来使蛋白在生产和贮存过程中暴露于不同形式的应激条件时保持折叠或防止解折叠、克服这些问题并且适于大多数蛋白和肽，从而无需分别进行研究。

上述需要通过提供权利要求中表征的实施方式来解决。

因此，本发明涉及一种防止(多)肽解折叠和/或诱导(多)肽(再)折叠的方法，所述方法包括将所述(多)肽包埋在水性溶液中的步骤，其中所述溶液包含：(i)至少三种不同的氨基酸；或(ii)至少一种二肽或三肽；并且其中，所述溶液不含或基本不含：(a)糖；和(b-i)蛋白；和/或(b-ii)变性化合物；和(c)硅烷。

在替代性或优选的实施方式中，本发明涉及一种在干燥期间防止(多)肽解折叠和/或在干燥后诱导(多)肽(再)折叠的方法，所述方法包括将所述(多)肽包埋在水性溶液中，其中所述溶液包含：(i)至少三种不同的氨基酸；或(ii)至少一种二肽或三肽；并且其中，所述溶液不含：(a)糖；和(b-i)蛋白；和/或(b-ii)变性化合物。

根据本发明，术语“(多)肽”描述的是这样分子群：所述分子群包括由至多30个氨基酸组成的肽的组，和由超过30个氨基酸组成的多肽的组。术语“(多)肽”还包括蛋白以及蛋白片段。(多)肽可以形成二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即，由超过一个(多)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的(多)肽分子可以相同或不同。因此，相应的更高级结构被命名为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。同二聚体或异二聚体等也落入术语“(多)肽”的定义内。本文中术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用。术语“(多)肽”还指天然修饰的(多)肽，其中所述修饰通过例如翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化和磷酸化等)来实现。此类修饰是本领域公知的。

本文所用的术语“(多)肽解折叠”是指(多)肽的特征性三维结构丧失。本文所用的术语“(多)肽解折叠”包括(多)肽的部分解折叠和完全解折叠。解折叠的(多)肽的结构也称为无规卷曲。在例如紧接mRNA序列被翻译成线形氨基酸链之后，以及由于例如化学解折叠、热变性、因压力或氧化损伤导致的解折叠，(多)肽以解折叠状态(或无规卷曲形式)存在。(多)肽的三维结构，也称为天然状态，是氨基酸之间相互作用的结果，因此由(多)肽的氨基酸序列决定。通常，(多)肽的解折叠或至少部分解折叠会导致所述(多)肽的生物活性的丧失，因为三维结构对功能而言必不可少。

本文所用的术语“(多)肽(再)折叠”是指之前已经因例如变性或化学解折叠而解折叠的(多)肽的折叠或再折叠，以使(多)肽返回其天然三维结构。

本文所用的术语“干燥”是指减少或除去样品的液体成分。优选的是，残留的液体含量小于20%，例如小于10%，例如小于5%，更优选小于3%，例如小于2%或小于1%。最优选的是，液体小于0.5%或更少。

本文所用的术语“包埋”是指将(多)肽完全插入本发明的溶液中。

根据本发明，在干燥之前或期间将蛋白包埋在溶液中，由此防止蛋白在干燥步骤期间解折叠。作为另一选择，或额外地，可以在重建经干燥的蛋白时将蛋白包埋在溶液中，由此确保重建蛋白的正确再折叠。本领域技术人员应该意识到的是，当将蛋白在本发明的溶液中干燥时，可以在与根据本发明的方法定义的溶液不同的溶液中进行重建，反之亦然。优选的是，蛋白的干燥和重建都在本发明方法的溶液中进行，其中这些步骤中使用的溶液可以相同，或可以包含不同的化合物。

本文所用的术语“水性溶液”对本领域技术人员而言是公知的，指其中溶剂是水的溶液。

根据本发明，术语“氨基酸”是指具有羧酸基团、氨基和在不同氨基酸之间变化的侧链的有机分子。氨基酸是蛋白必须的构造单元。根据本发明，术语“氨基酸”是指未相互结合形成寡聚体或多聚体(例如二肽、三肽、寡肽或(多)肽)的游离氨基酸。

本发明的溶液中包含的氨基酸可以选自天然存在的氨基酸以及人工氨基酸或这些天然存在的氨基酸和人工氨基酸的衍生物。

天然存在的氨基酸是例如20种蛋白原性(proteinogenic)氨基酸，即甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。其他天然存在的氨基酸是例如肉碱、肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羟基赖氨酸或β-丙氨酸。

人工氨基酸是具有不同的侧链长度和/或具有不同的侧链结构和/或在不同于α碳原子的位置具有氨基的氨基酸。氨基酸的衍生物是经修饰的氨基酸，包括但不限于，n-乙酰基色氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、黑色素(melanin)、精氨基琥珀酸及其盐和DOPA。

关于本发明，所有这些术语都还包括相应氨基酸的盐。

根据本发明，溶液中包含彼此不同的三种以上氨基酸。例如，术语“至少三种不同的氨基酸”还指至少四种不同的氨基酸，例如至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种不同的氨基酸，或更多种氨基酸，例如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种或至少18种不同的氨基酸。该术语还包括正好三种、正好四种、正好五种、正好六种、正好七种、正好八种、正好九种、正好十种、正好11种、正好12种、正好13种、正好14种、正好15种、正好16种、正好17种或正好18种不同的氨基酸。本领域技术人员应该容易理解，当本文中提及氨基酸时，意在指多于一个分子的所述氨基酸。因此，所描述的不同氨基酸的量意在指限定氨基酸的不同种类的量，而不是限定一种氨基酸的分子数量。因此，例如术语“三种不同的氨基酸”是指三种不同种类的氨基酸，而对每种单独氨基酸的量不作特别限定。优选的是，不同氨基酸的数量不超过18种。

本文所用的术语“二肽或三肽”分别是指由两个或三个氨基酸构成的肽。示例性二肽是甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，与单独的谷氨酰胺相比其产生增强的稳定性)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr，与单独的酪氨酸相比其产生增加的水溶性)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln，与单独的谷氨酰胺相比其产生增强的水溶性)。

此外，天然存在的二肽的非限制性实例是肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)、N-乙酰基肌肽(N-乙酰基-(β-丙氨酰-L-组氨酸))、鹅肌肽(β-丙氨酰-N-甲基组氨酸)、高鹅肌肽(N-(4-氨基丁酰基)-L-组氨酸)、京都啡肽(L-酪氨酰-L-精氨酸)、鲸肌肽(或蛇肌肽)(β-丙氨酰-Nτ-甲基组氨酸)、格里肽(Glorin)(N-丙酰-γ-L-谷氨酰-L-鸟氨酸-δ-乳糖乙酯(lac ethylester))和巴蒂肽(Barettin)(环-[(6-溴-8-烯-色氨酸)-精氨酸])。

人工二肽的实例包括但不限于阿斯帕坦(N-L-a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲基酯)和假脯氨酸。

三肽的实例是谷胱甘肽(γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)及其类似物视晶酸(L-γ-谷氨酰-L-α-氨基丁酰基-甘氨酸)以及去甲视晶酸(y-谷氨酰-丙氨酰-甘氨酸)。此外，三肽的非限制性实例包括异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(glypromate)(Gly-Pro-Glu)、促甲状腺素释放激素(TRH，促甲状腺素释放素或普罗瑞林)(L-焦谷氨酰-L-组氨酰-L-脯氨酰胺)、促黑激素抑制素(脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺)、亮肽素(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨醛)和爱森肽(eisenin)(pGlu-Gln-Ala-OH)。优选的是，当涉及医学应用时，所述至少一种二肽或三肽(更优选所有二肽或三肽)不产生任何药理学性质。

优选的是，至少一种二肽选自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺。

根据本发明，所述溶液包含一种或多种二肽或三肽。例如，术语“至少一种二肽或三肽”还指至少两种二肽或三肽，例如至少三种、至少四种，例如至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种二肽或三肽。该术语进一步包括正好一种、正好两种、正好三种、正好四种、正好五种、正好六种、正好七种、正好八种或正好九种二肽或三肽。在溶液中包含超过一种二肽或三肽时，本文明确地想到二肽和三肽的混合物。二肽和三肽的种类数可以相互独立地选择，例如，溶液可以包含两种二肽和三种三肽。本领域技术人员容易理解，当本文提到某一数量的二肽和三肽时，所述数量是指限定二肽和三肽的不同种类的量，而不是一种二肽或三肽的分子数量。因此，例如术语“四种二肽或三肽”是指四种不同类型的二肽和/或三肽，而每种单独的二肽和/或三肽的量不受特别限制。优选的是，(不同的)二肽或三肽的数量不超过九种。

待使用的氨基酸、二肽和/或三肽的优选量是0.1mg/ml～150mg/ml，优选1mg/ml～100mg/ml，更优选10mg/ml～50mg/ml，还更优选20mg/ml～35mg/ml，最优选所述量是25mg/ml。

根据本发明，术语“不含或基本不含糖”是指没有或基本没有任何种类的糖的溶液，所述糖即单糖、二糖或寡糖形式的碳水化合物以及糖醇。蛋白折叠方法中常用但本发明中不用的糖的实例包括但不限于白糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇或甘露醇。如果溶液含有小于0.1%(w/v)、更优选小于0.01%(w/v)、还更优选小于0.001%(w/v)、最优选小于0.0001%(w/v)的糖，则认为该溶液基本不含糖。

如本文以上所述，本领域中经常使用糖来使蛋白分别对冷冻应激(冷冻保护剂)和干燥应激(冻干保护剂)稳定。此外，还将糖作为张性调节剂和填充剂添加到制剂中。

本文所用的术语“不含或基本不含蛋白”是指除了要(再)折叠或防止解折叠的(多)肽之外不包含或基本不包含任何蛋白。本领域技术人员会意识到，可以存在例如与溶液污染相关的痕量蛋白，并且溶液不含蛋白的要求并不排除这种蛋白。因此，如果溶液中含有的除了要(再)折叠或待防止解折叠的(多)肽之外的蛋白小于0.1%(w/v)，更优选小于0.01%(w/v)，还更优选小于0.001%(w/v)，最优选小于0.0001%(w/v)，则认为该溶液基本不含蛋白。

为了避免界面吸附、不必要的搅动和使小瓶中不必要的气体或泡沫的形成最小化，经常将诸如HAS、BSA等附加的蛋白添加至蛋白或肽溶液中。将诸如其他蛋白等表面活性剂添加到制剂中，用来涂布或竞争性吸附容器内表面，或吸附至在制备递送系统时形成的表面。

根据本发明，溶液还可以“不含或基本不含变性化合物”，即该溶液不包含或基本不包含在使表现为不溶性蛋白聚集体(包涵体)的蛋白(再)折叠的方法中常用的任何变性剂。此类变性化合物的实例包括但不限于离液溶剂(chaotropic solvent)添加剂，例如尿素、胍氯化物或十二烷基硫酸钠(SDS)。如果溶液含有小于0.01%(w/v)、更优选小于0.001%(w/v)、最优选小于0.0001%(w/v)的变性化合物，则认为该溶液基本不含变性化合物。

本文所用的术语“不含或基本不含硅烷”是指不包含或基本不包含任何硅烷的溶液，所述硅烷为例如烷氧基硅烷、有机官能硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷和有机硅烷，包括具有其他官能团的甲硅烷基化合物。如果溶液含有小于0.01%(w/v)、更优选小于0.001%(w/v)、最优选小于0.0001%(w/v)的硅烷，则认为该溶液基本不含硅烷。

在本发明的方法的溶液的上下文中，术语“包含”表示除了明确提到的化合物之外，溶液中可以存在其他组分。此类其他组分的非限制性实例包括下文所述的皂苷或脂肪酸或其衍生物。优选的是，所述溶液由所提到的氨基酸或二肽或三肽以及皂苷或脂肪酸或其衍生物组成，但没有其他成分。更具体而言，本发明的方法的溶液仅由所提到的氨基酸或二肽或三肽组成。

如以上所讨论的，目前在选择合适的稳定剂时没有一条成熟的规则可以遵循，这在部分上归因于对蛋白-共-溶质相互作用缺乏清楚明确的理解，还归因于上述多种失活机制，还归因于蛋白的大尺寸、其组成多样性和两亲特性，它们影响特定行为，例如折叠、构象稳定性和解折叠/变性。此外，传统上使用的赋性剂组合的致稳效应强烈依赖于具体蛋白，因此仅可以以有限的量提高蛋白的稳定性。由于不同蛋白之间的这些结构差异，迄今为止尚未成功地概括出通用的致稳策略。

根据本发明，令人惊奇地发现，根据本发明的方法定义的溶液防止了天然(多)肽在干燥期间解折叠和/或促进了(多)肽在重建时的正确(再)折叠。换言之，当(多)肽在本发明的溶液中干燥时会维持其三维结构。蛋白的三维结构特征的保持是其功能性和功效的不可缺少的先决条件。如上文所讨论的，一定的条件或应激可以改变蛋白的二级、三级和四级结构，随后导致蛋白解折叠和/或聚集，这是物理失稳的主要事件。蛋白三维结构的改变会影响潜在的化学降解、脱酰胺化、二硫键改变或琥珀酰亚胺形成。此外，诸如IgG等蛋白的二级结构可以在吸附界面处发生显著改变，并且该蛋白结构的刚性和蛋白表面上的疏水性残基的数量可以影响剪切耐受性。虽然本文讨论的降解途径在性质上存在差异，但它们都取决于各蛋白的三维结构或受各蛋白的三维结构影响。因此，通过提供本方法来维持蛋白的天然三维结构，可以防止由这些多种影响因素中的大多数因素引起的降解。因此，本发明的方法相对于现有技术方法提供显著的优势，而现有技术的方法需要检查蛋白的基础性质来开发蛋白药物。

本发明的发现是特别令人惊讶的，因为长期以来氨基酸一直都与其他赋性剂一起用于致稳溶液中。但是，由于蛋白结构和特性的复杂性、影响蛋白稳定性的大量物理化学因素和可能导致蛋白降解的大量应激，从未想到在溶液中存在至少三种氨基酸或至少一种二肽或三肽就足以能够防止溶液中蛋白的解折叠，特别是在干燥过程中。

如所附实施例所示，即使在照射后也能保持蛋白的三维结构。此外，在冷冻和解冻期间未观察到晶体形成，因此减少了通常与冷冻干燥方法有关的有害作用。

由于本发明的溶液的致稳效应，避免了蛋白三维结构的改变，并降低了宿主对此类蛋白产生不需要的免疫应答的风险。此外，本发明的溶液不包含本领域中常用的任何上述添加剂，因此，提供了额外的优点，即降低了与制备溶液相关的成本，不需要另外的纯化步骤来除去在例如在治疗应用中使用(多)肽时可能有害的添加剂。经干燥的蛋白对温度应激具有抗性，因此使它们在储存期间(例如在缺少连续冷却链的条件下)特别稳定。

在本发明的特别优选的实施方式中，所述溶液不含十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N-月桂酰基肌氨酸、Tween、Brij35和/或聚山梨醇酯。化合物十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N-月桂酰基肌氨酸、Tween、Brij35和/或聚山梨醇酯是常用的离子型或非离子型洗涤剂的实例。在本发明的更优选的实施方式中，所述溶液不含任何离子型和/或非离子型洗涤剂。

在另一优选实施方式中，所述至少三种氨基酸不包括：(i-a)谷氨酸和谷氨酰胺的组合和/或(i-b)天冬氨酸和天冬酰胺的组合。

在替代性的优选实施方式中，所述至少三种氨基酸不包括苯丙氨酸。

在本发明方法的又一优选实施方式中，所述至少三种氨基酸选自以下氨基酸组：(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；(b)具有极性不带电R基团的氨基酸；(c)具有带正电R基团的氨基酸；(d)具有带负电R基团的氨基酸；和(e)具有芳香族R基团的氨基酸。

天然存在的氨基酸，以及除了天然存在的氨基酸之外的氨基酸，例如人工氨基酸，可以归类为以上特征组(Nelson D.L.&Cox M.M.,"Lehninger Biochemie"(2005),第122-127页)，可以从中选择至少三种氨基酸用在本发明的溶液中。

在更优选的实施方式中，所述至少三种氨基酸选自(a)～(e)的不同组。换言之，在该优选实施方式中，当溶液中包含三种氨基酸时，所述三种氨基酸可以选自至少两个不同组，更优选的是，选自三个不同组，以使一个来自(a)组，一个来自(b)组，一个来自(c)组。本文还明确涵盖其他组合，例如(b)-(c)-(d)、(c)-(d)-(e)、(e)-(a)-(b)、(b)-(d)-(e)等。当溶液中包含四种氨基酸时适用相同的考虑，在该情况下氨基酸必须来自选自(a)～(e)中的至少两个不同组，更优选来自至少三个不同组，最优选来自四个不同组。特别是，当溶液中包含五种氨基酸时，氨基酸必须来自选自(a)～(e)中的至少两个不同组，更优选来自至少三个不同组，更优选来自至少四个不同组，最优选来自五个不同组。当溶液中包含超过五种氨基酸(例如六种或七种氨基酸)时适用相同的考虑，在该情况下这些氨基酸选自从(a)～(e)中选出的至少两个不同的组，更优选选自至少三个不同组，还更优选选自至少四个不同组，最优选选自五个不同组。

在本发明方法的更优选实施方式中，所述溶液包含选自以下各组中每一组的至少一种氨基酸：(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；(b)具有极性不带电R基团的氨基酸；(c)具有带正电R基团的氨基酸；(d)具有带负电R基团的氨基酸；和(e)具有芳香族R基团的氨基酸。

本领域技术人员还理解，在根据本发明使用的溶液中，各组的氨基酸的存在数量不必相同。而是可以选择氨基酸的任何组合，只要存在各组中的至少一种氨基酸即可。

此外，在溶液中氨基酸可以以单分子和/或以二肽和/或三肽的形式存在。

在本发明方法的另一优选实施方式中，所述溶液包含至少以下氨基酸：(a)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸；(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸；(c)脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸；(d)酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸；或(e)精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸。在另一优选实施方式中，所述溶液包含至少以下氨基酸：(f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸。

根据该实施方式，在本发明的溶液中至少存在上述(a)、(b)、(c)、(d)或(e)组的氨基酸。换言之，当在发明性溶液中可以包含不止上述氨基酸时，要求存在至少所述氨基酸。更优选的是，所述溶液精确包含所述氨基酸而不包含其他氨基酸。相同的考虑在必要地调整后适用于(f)组的氨基酸。

在本发明的另一优选实施方式中，一种或多种氨基酸选自由天然非蛋白原性氨基酸与合成氨基酸组成的组。

根据本发明，术语“非蛋白原性氨基酸”是指不是天然引入多肽和蛋白中的氨基酸。非蛋白原性氨基酸可以通过翻译后修饰而源自蛋白原性氨基酸(L-α-氨基酸)。此类非蛋白原性氨基酸是例如羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸和神经递质γ-氨基丁酸。蛋白原性L-氨基酸的D-对映异构体也是非蛋白原性氨基酸。非蛋白原性氨基酸的其他非限制实例包括肉碱、肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羟基赖氨酸或β-丙氨酸。

本文所用的术语“合成氨基酸”是指非天然存在于自然界的氨基酸。合成氨基酸的非限制性实例包括(2R)-氨基-5-磷戊酸、D-苯基甘氨酸或(S)-和(R)-叔亮氨酸。

在另一优选实施方式中，(多)肽选自由治疗性蛋白组成的组，例如抗体、生长因子、细胞因子、蛋白或肽激素、生长激素、血液因子、治疗性酶、治疗性疫苗或保留它们生物学活性的片段。这些(多)肽可用于例如治疗性或诊断性用途。此类用途是本领域公知的。

术语“抗体”包括多克隆抗体或单克隆抗体以及它们的保留其结合特异性的衍生物。该术语还包括合成的、嵌合、单链和人源化抗体或这些抗体的仍然保留有它们的结合特异性的衍生物或片段。抗体的片段特别包括Fab片段、F(ab')2或Fv片段。生产抗体或其片段的技术是本领域公知的，并且例如描述于Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988，以及Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998。此外，可以使用转基因动物来表达人源化抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供连续细胞系培养物所产生的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(

和Milstein Nature256(1975),495-497)、三源杂交瘤、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today4(1983),72)和用来生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。抗体可以是任何种类的抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体，并且是IgG、IgM或IgY类别。IgY抗体是鸡IgG抗体的类似物。

本文使用的术语“生长因子”是指与细胞表面上的受体结合的蛋白，主要效果是激活细胞增殖和/或分化。许多生长因子是通用的，刺激许多不同细胞类型中的细胞分裂，而其他细胞因子则对于特定细胞类型具有特异性。本发明中优选的生长因子包括但不限于红细胞生成素、胰岛素样生长因子1(IGF-1，最初称为生长素介素C)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)。

根据本发明，术语“细胞因子”是指在细胞通信、免疫功能和胚胎发生中广泛使用的一类信号传导蛋白。细胞因子由多种造血细胞和非造血细胞类型生产，并且能够如同激素那样产生自分泌、旁分泌和内分泌效果。但是，许多细胞因子展示出生长因子活性。细胞因子是生长因子的独特家族。细胞因子主要由白细胞分泌，刺激体液和细胞免疫应答以及吞噬细胞的激活。由淋巴细胞分泌的细胞因子被称为淋巴因子，而由单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子被称为单核因子。细胞因子的大家族由身体的各种细胞产生。许多淋巴因子被称为白介素(IL)，因为它们不仅由白细胞分泌，还能够影响白细胞的细胞应答。具体而言，白介素是靶向造血源的细胞的生长因子。细胞因子包括但不限于白介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。

术语“蛋白或肽激素”是指分泌到血流中并且在活动物中具有内分泌功能的一类肽。如其他蛋白一样，肽激素在细胞中根据mRNA模板用氨基酸合成，所述mRNA模板自身从细胞核内的DNA模板合成。然后肽激素前体(前激素原)分多个阶段被加工(通常在内质网中)，包括除去N末端信号序列和有时进行的糖基化，从而产生激素原。然后激素原被包裹到膜结合的分泌囊泡中，其可以在响应特定刺激(例如细胞质中的钙和cAMP浓度的增加)时通过胞吐作用从细胞中分泌出。这些激素原经常含有过多的氨基酸残基，需要这些残基来引导激素分子折叠成其活性构造，但是一旦激素完成折叠，这些残基就不再具有功能。细胞中的特定肽内切酶在激素原即将释放到血流中之前切割激素原，产生该分子的成熟激素形式。然后成熟的肽激素通过血液扩散到达身体的所有细胞，在那里它们与其靶细胞表面上的特异性受体相互作用。一些肽/蛋白激素(血管紧张素II、碱性成纤维细胞生长因子-2、甲状旁腺激素相关蛋白)还通过胞分泌机制与位于细胞质或细胞核中的细胞内受体相互作用。数种重要的肽激素由脑垂体分泌。垂体前叶分泌催乳素(其作用于乳腺)、促肾上腺皮质激素(ACTH)(其作用于肾上腺皮质以调节糖皮质激素的分泌)和生长激素(其作用于骨、肌肉和肝脏)。垂体后叶分泌抗利尿激素(也称为加压素)和缩宫素。然而，肽激素由许多不同的器官和组织产生，包括心脏(心房钠尿肽(ANP)或心房钠尿因子(ANF))和胰腺(胰岛素和生长抑素)、胃肠道(胆囊收缩素、胃泌素)和脂肪组织存储(瘦素)。一些神经递质的分泌和释放方式与肽激素类似，并且当释放到血液中时，一些“神经肽”除了充当激素之外，还可用作神经系统中的神经递质。当肽激素与细胞表面上的受体结合时，在细胞质中出现第二信使，其触发细胞内应答。肽激素包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、促性腺激素、人促甲状腺激素、血管紧张素II、碱性成纤维细胞生长因子-2、甲状旁腺激素相关蛋白、加压素、缩宫素、心房钠尿肽(ANP)或心房钠尿因子(ANF)、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和脂肪组织存储(瘦素)。

术语“生长激素(GH)”是指基于蛋白的肽激素，由191个氨基酸组成，为单链多肽，由前叶垂体的侧翼内的促生长激素细胞贮存和分泌。生长激素对身体组织的作用通常可以描述为是合成代谢的(积累)。像大多数其他蛋白激素一样，其通过与细胞表面上的特异性受体相互作用而起作用。儿童时期的身高增加是GH最广为人知的作用。身高似乎通过至少两种机制而得到刺激：1.由于多肽激素不是脂溶性的，它们不能穿透肌膜。因此，GH通过与靶细胞上的受体结合而发挥其部分效应，其中其激活MAPK/ERK途径。通过该机制，GH直接刺激软骨的软骨细胞的分裂和增殖。2.GH还通过JAK-STAT信号传导途径刺激胰岛素样生长因子1(IGF-1,之前称为生长介素C，是一种与胰岛素原同源的激素)的产生。肝是该过程中GH的主要靶器官，并且是IGF-1产生的主要位置。IGF-1对多种组织都具有组织刺激效应。另外的IGF-1在靶组织内产生，使得其看起来既是内分泌激素也是自分泌/旁分泌激素。IGF-1还对成骨细胞和软骨细胞活性具有刺激效应，以刺激骨生长。除了增加儿童和青少年的身高之外，生长激素对身体具有许多其他效应：增加钙滞留，加强和增加骨的矿化，通过肌节增生来增加肌肉质量，促进脂解，增加蛋白合成，刺激除了脑之外的所有内部器官的生长，在内环境稳定中起作用，减少肝脏对葡萄糖的摄入，促进肝中的糖质新生，有助于胰岛的维持和功能，刺激免疫系统。

促生长激素(somatotropin)是指动物中天然产生的生长激素1，而术语生长激素(somatropin)是指通过重组DNA技术产生的生长激素，而且在人体中缩写为“HGH”。其刺激生长、细胞繁殖和再生。

术语“血液因子”是指管理血液凝集级联功能的蛋白。人体的凝集级联由一系列复杂的生化反应组成，并且受到血液因子蛋白的调控。这些蛋白包括例如促凝血因子(例如因子VIII和因子IX)以及抗凝血因子(包括蛋白C和抗凝血酶III)。

本文所用的术语“治疗性酶”是指催化化学反应从而将起始分子(即底物)转化成另一分子(即产物)的蛋白。治疗性酶的功能直接取决于其分子结构和构象。不可逆的构象变化和不可逆的聚集会导致治疗性酶的失活。优选的本发明的酶包括但不限于：用于通过酶替代疗法治疗溶酶体贮积症的治疗性酶(即人β-葡糖脑苷脂酶)(戈谢病)、人半乳糖苷酶A(法布里病)、溶血栓药物(即链激酶)(治疗缺血性中风时的血栓溶解剂)、尿激酶、(重组)组织纤溶酶原激活剂、TNK酶、L-天冬酰胺酶(细胞稳定药)、尿酸氧化酶、木瓜蛋白酶。

根据本发明，术语“治疗性疫苗”是指减弱或被杀死的病原体(抗原)的免疫原性部分、病毒裂解物的抗原性组分或重组产生的单个蛋白原性病毒抗原。

本领域存在大量合适的方法来生产(多)肽。例如，可以在合适的宿主中生产(多)肽。如果宿主是单细胞生物(例如原核生物)、哺乳动物细胞或昆虫细胞，则本领域技术人员能够设想各种培养条件。方便的是，通过成熟技术从培养基、培养生物体的裂解物或从分离的(生物)膜收获所产生的(多)肽。在多细胞生物的情况下，宿主可以是作为该生物体一部分或源自该生物体一部分的细胞，例如所述宿主细胞可以是植物的可收获部分。优选方法包括如上所述的在宿主中重组生产(多)肽。例如，编码本发明的待折叠/防止解折叠的(多)肽的核酸序列可以通过PCR来合成，并将其插入表达载体中。随后可以用该表达载体转化合适的宿主。而后，培养该宿主以产生所需的(多)肽，将其分离，并且可选地进行纯化，然后用于本发明的方法中。

生产待用于本发明的方法中的(多)肽的替代性方法是体外翻译mRNA。合适的无细胞表达系统包括兔网织红细胞裂解物、小麦胚提取物、犬胰腺微粒体膜、大肠杆菌S30提取物、成对转录/翻译系统(例如TNT-系统(Promega))。这些系统使得在添加含有编码区和合适的启动子元件的克隆载体、DNA片段或RNA序列后可以表达重组(多)肽。

除了重组生产之外，用于本发明的方法中的(多)肽可以合成产生，例如通过使用固相技术的直接肽合成(参见Stewart等(1969)Solid Phase Peptide Synthesis;FreemanCo,San Francisco;Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85(1963),2149-2154)。合成肽的合成可以使用手动技术进行或自动化进行。自动化合成可以例如根据制造商提供的说明书使用Applied Biosystems431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer,Foster City CA)来实现。各种片段可以使用化学方法单独地或组合地进行化学合成，以生产全长分子。如上所述，可以使用诸如Houghton Proc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985),5131-5135所述的固相方法等化学合成。此外，(多)肽可以半合成产生，例如通过组合重组生产和合成生产。

(多)肽的分离和纯化可以用多种已知技术中的任何一种来实现，例如但不限于离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC和预制圆盘凝胶电泳。

在本发明方法的另一优选实施方式中，所述溶液还包含皂苷或脂肪酸或它们的衍生物。

皂苷是一类形成次级代谢产物的化合物，其发现于天然来源、源自天然来源或能够化学合成。发现皂苷在多种植物物种中特别丰富。皂苷是两性糖苷，皂苷通过其在水性溶液中振荡时所产生的肥皂样泡沫来从现象学上分类，并且通过其与亲脂性甾体或三萜类糖苷配基结合的一种或多种亲水性糖苷部分的组成来从结构上分类。它们的结构多样性反映在它们的物理化学性质和生物学性质上。皂苷的实例是甘草酸(glycyrrhizic acid)、甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、葡萄糖醛酸、七叶素、常春藤苷(hederacoside)和洋地黄皂苷。

脂肪酸是具有长的无支链的脂肪族链(尾)的羧酸，其可以是饱和或不饱和的。它们是重要的能量来源，因为它们的代谢产生大量的ATP。大多数天然存在的脂肪酸具有偶数碳原子(4～28)的链，通常源自甘油三酯或磷脂。脂肪酸具有不同的长度，用来将脂肪酸分成短链、中链或长链脂肪酸。短链脂肪酸(SCFA)是具有小于6个碳的脂肪族尾的脂肪酸，中链脂肪酸(MCFA)是具有6～12个碳的脂肪族尾的脂肪酸(其可形成中链甘油三酯)，长链脂肪酸(LCFA)是具有大于12个碳的脂肪族尾的脂肪酸，超长链脂肪酸(VLCFA)是具有大于22个碳的脂肪族尾的脂肪酸。脂肪酸的非限制性实例包括诸如肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、杉皮酸(sapienic acid)、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸等不饱和脂肪酸，以及诸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸和蜡酸等饱和脂肪酸。

在本发明方法的另一更优选实施方式中，皂苷是甘草酸或其衍生物。

甘草酸还称为甘草皂苷(glycyrrhicic acid)、甘草甜素(glycyrrhizin)或甘草皂甙(glycyrrhizinic acid)，并具有以下结构：

甘草酸是水溶性的，并且作为阴离子存在，该阴离子可以是与阳离子性分子活性成分形成静电结合复合物的潜在配体。不希望受理论限制，本发明人假设阴离子性甘草酸与本发明的溶液中存在的氨基酸(即精氨酸或赖氨酸)通过静电相互作用和/或氢键形成复合物。认为该复合会增强本发明的溶液使蛋白保持天然三维结构的能力。此外，在干燥期间，甘草酸与阳离子性分子活性成分形成复合物的能力能够产生与蛋白表面上暴露的阳离子性侧链的相互作用，由此使天然蛋白结构进一步稳定。

甘草酸的衍生物是本领域公知的，并且包括通过在羧基和羟基上转化甘草酸、将氨基酸残基缀合到碳水化合物部分中或将2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的糖苷链中而产生的衍生物。其他衍生物是甘草酸的酰胺、带有两个氨基酸残基以及游离30-COOH官能团的甘草酸缀合物、以及在甘草酸分子的碳水化合物部分中具有至少一个氨基酸残基烷基酯的缀合物。具体衍生物的实例可见于例如Kondratenko等(Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 第30(2)卷, (2004), 第148-153页)中。

根据本发明，令人惊奇地发现将甘草酸添加至上述溶液中会进一步有助于(多)肽的折叠或再折叠以及防止其解折叠。具体而言，发现甘草酸会使通常倾向于形成不想要的聚集体的(多)肽减少聚集。因此，甘草酸的添加通过增强或支持(多)肽正确折叠成活性所需的三维结构而有助于保持或重新建立该(多)肽的生物活性。

在本发明方法的另一更优选实施方式中，脂肪酸选自由短链脂肪酸和中链脂肪酸组成的组。

由于与更长链的脂肪酸相比具有更佳的水溶性，特别优选短链脂肪酸和中链脂肪酸。

在本发明方法的另一优选实施方式中，所述溶液的赋性剂和(多)肽之间的重量比是约1:1～约500:1。

根据该实施方式，所述溶液的赋性剂是溶液的非水性组分，其不是待折叠或待防止解折叠的(多)肽。

更优选的是，溶液组分和(多)肽之间的重量比为约1:1～约350:1，例如约5:1～约200:1或约10:1～约100:1。最优选的是，该重量比为约2:1。应该理解的是，落入这些比率之间的任何值都明确地包括在本文范围内。此外，本文所用的术语“约”包括明确提到的比率以及其±10%的偏差。

在本发明方法的另一优选实施方式中，所述(多)肽是重组(多)肽。

在本发明方法的又一优选实施方式中，所述(多)肽具有一个或多个分子内二硫键。

(多)肽可以通过形成至少一个分子内或分子间二硫桥而稳定。合适的半胱氨酸残基可以天然存在于所述(多)肽中，或可以通过将合适的氨基酸突变成半胱氨酸而引入所述(多)肽中。例如，在WO2009/007124中已经公开将二硫桥引入scFv的免疫球蛋白结构域时会极大地增强这些分子的稳定性，且不会影响其特异性或减少其亲和力和功能性，并且不会损失所述分子的溶解性。

在本发明方法的另一优选实施方式中，折叠的(多)肽具有生物活性。

术语“生物活性”是指(多)肽的天然存在的活性。生物活性依赖于特定(多)肽，并且包括与其他分子的结合亲和力(对于例如抗体、配体或转录因子而言)或催化活性(对于例如酶而言)。抗体的生物活性要求例如与其抗原的特异性结合。在这点上，术语“具有生物活性”是指折叠或再折叠的(多)肽(即，干燥和重建后)的生物活性是所述(多)肽的天然存在的生物活性的至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、最优选至少80%。更优选的是，折叠或再折叠的(多)肽的生物活性是所述(多)肽的天然存在的生物活性的至少90%、更优选100%。

如本文之前所述，任何给定的(多)肽的生物活性直接取决于其三维结构。因此，通过提供(再)折叠(多)肽和/或防止(多)肽解折叠的方法，本文提供了保持或恢复所述(多)肽的生物活性的方法。应该意识到的是，(多)肽的生物活性可以在再折叠的情况下恢复，并且可以在防止解折叠的情况下得到保持。

本文所用的术语“干燥的制品”是指其中已经除去或减少了液体成分的制品。用于干燥病毒或细菌制品的合适方法包括但不限于冻干(冷冻干燥)、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、风干或泡沫干燥。

如果将液体减少至小于体积的20%，例如小于体积的10%，例如小于5%，更优选小于3%，例如小于2%或小于1%，则认为液体含量已经减少。最优选的是，将液体减少至0.5%以下。

在本发明方法的进一步优选的实施方式中，干燥是冷冻干燥、喷雾干燥、风干、喷雾冷冻干燥或泡沫干燥。

冻干，也称为冷冻干燥，是本领域公知的，并且包括以下步骤：冷冻有机材料，随后降低周围压力，同时施加足够的热以使该材料中的冷冻水直接从固相升华成气相。优选的是，随后将冻干制品密封，以防止重新吸收水分。

喷雾干燥也是本领域公知的，其是将溶液、悬浮液或乳液以一个处理步骤转化成固体粉末的方法。通常而言，将液体产品的浓缩物泵入雾化装置，并在其中将浓缩物破碎成小滴。这些小滴在仍悬浮在干燥气体中的同时遇到热气流并快速失去其水分。通过离心作用在旋风分离器中将干粉末与湿空气分开——迫使致密的粉末颗粒移向旋风分离器壁，同时通过排出管将较轻的湿空气导出。

风干通过以下方法来实现：将样品暴露至空气直到湿气减少或被完全除去。

喷雾冷冻干燥也是本领域公知的，其是将冷冻干燥和喷雾干燥的相同处理步骤合并在一起的方法。将本发明的溶液中提供的(多)肽喷雾到低温介质(例如液氮)中，其产生快速冷冻小滴的分散液。然后在冻干器中使该分散液干燥。

泡沫干燥是用于保存干燥状态的敏感性生物治疗剂的规模可缩放的技术。真空泡沫干燥(VFD)可用于使在中等温度和压力下稳定的治疗性生物分子(例如促红细胞生成素、酶和疫苗)稳定。通过在超过凝固点但显著低于100℃的温度下在真空中沸腾，将生物制剂的悬浮液或溶液转化成泡沫。该泡沫由材料的薄膜组成，能够在升高的温度下从中有效地除去水。该方法基于低温下真空蒸发的原理。

根据该实施方式，之前在干燥或非晶性条件下贮存(即作为冻干或喷雾干燥的组合物)的(多)肽，可以用本发明的方法来重建。其令人惊奇地显示，在发明性溶液的存在下，(多)肽可以再折叠成其天然状态，其分别不会损失活性和其结构完整性。

如上文所讨论的，经干燥的蛋白提供了对温度应激更具抗性的优点，由此使它们在贮存期间(例如在缺少连续冷却链的条件下)特别稳定。此外，如所附实施例所示，可以对经干燥的蛋白进行灭菌而不会丧失该蛋白的天然三维结构。因此，本发明使得能够对蛋白制品进行灭菌以减少细菌和/或病毒的数量，同时还保护蛋白免受β射线、γ射线或X射线照射导致的降解。因此，减少了在灭菌条件下制备治疗性蛋白所涉及的时间和成本。

除非有另外定义，本文使用的所有科技术语的含义都与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。在冲突情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。

附图说明：

图1：甘草酸的结构式。(3β,18α)-30-羟基-11,30-二氧代齐墩果-12-烯-3-基2-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-β-D-吡喃葡萄糖苷酸。

图2：广角X射线衍射图和广角X射线粉末衍射图。(A)非包埋表面的X射线衍射图，所使用载体材料具有四个特征峰。(B)未使用甘草酸的包埋表面(非晶性结构)。(C)具有甘草酸的包埋表面(非晶性结构，包埋遮盖了未包埋载体的衍射信号)，和(D)存在包埋时，冷冻干燥的抗体样品的X射线粉末衍射图。

图3：差示扫描量热实验的热谱图。(A)不具有甘草酸的包埋溶液(顶部曲线)、用甘草酸([2mg/ml]、中部曲线)包埋和用甘草酸([5mg/ml]，底部曲线)包埋的冷冻液的差示扫描量热法(DSC)显示出箭头指示的两个玻璃化转变点(甘草酸将氨基酸溶液的较低T_g降低了几乎2.5℃)，(B)进行或不进行β照射时在包埋溶液的存在下冷冻干燥的抗体固体的DSC。在冷冻干燥之前将包埋溶液与110mg(顶部两条曲线)和77mg(底部两条曲线)的抗体以1.2:1的比率混合，并在DSC测定前静置不处理(从顶部起第1和第3条曲线)或进行β照射(从底部起第1和第3条曲线)。箭头指示了玻璃化转变点。

图4：在Si上进行的包埋光谱反射率分析。(A)经干燥甘露醇-白蛋白混合物(晶体)的显微照片，和(B)在Si上的纳米涂层(非晶性)。(C)纳米范围内的纳米涂层的代表性“彩虹”效应。

图5：官能化的开孔聚氨酯泡沫的SAXS图像。IgM分子的自相似性和对分形维度的影响能够通过该图顶部上的几何褶皱结构模型来描绘，其中分形维度D=3表示封闭物体。物理上，IgM完全脱水，分形维度D的降低导致该模型的开放。后者可以被完全开放的IgM单元预期(再水化)。另外，在Y模型中基于IgM分子的特征性Y样结构绘出了不同长度尺度的IgM分子的自相似性。对于D=3，IgG臂的平均直径κ小于直径κ_p。对于D=2，两个半径相等，对于D=1，适用方程式2κ=κ_p。IgG结构模型由灰色珠模型(gray bead model)给出。绿色珠模型：IgM被构建成IgG亚基的五聚体。在上方框图中，较大的红色圆圈对应于经背景校正的散射强度。虚线表示分析的形状因子。黑线给出了基于灰色IgG结构模型和它们的平均力的SAXS数据的完整拟合。在下方框图中，较小的连接的圆圈表示相应的平均力。(A)干燥样品的经背景校正的散射强度*PU-IgM_Fas、PU-IgM_Fas–NC和*PU-IgM_Fas–NC(星号表示β照射)。给出了它们相对于PU-IgM_Fas的形状因子的相对变化ΔP(Q)(分别是较小的红色、灰色和黑色圆圈)。对于D=3，平均力保持明显的起伏度(corrugation)，并且作为多种kT给出，其中k是玻耳兹曼常数，T是系统温度。(B)将样品PU-IgM_Fas再水化。系统的分形维度降低至2.5。相应的平均力的起伏度减少。(C)由于缺乏可测量信号，因此不能分析*PU-IgM_Fas的再水化样品，而*PU-IgM_Fas–NC样品展示出了1.5的分形维度和相应平均力的起伏度的减少。

图6：通过ELISA验证包埋后IgM_Fas表位识别的保留。(A/B)在β照射和/或包埋后固定的IgM_Fas((A)CH-11;(B)LO-MM-3)与梯度量的重组人Fas抗原片段(hFas::Fc)的结合。(C)在β照射和/或包埋后固定的IgM_Fas与梯度量的表位肽的结合。为了确定K_D，将数据拟合至1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型。

图7.通过PU-IgM_Fas进行的凋亡诱导。PU泡沫样品的宏观照片(A)和光栅电子显微镜照片(B)。将PU泡沫样品切成圆柱形片(此处为3cm³)用于凋亡诱导测定。开孔PU泡沫的孔径为约1.5mm～2mm。(C)含有不同浓度的抗Fas IgM的PU-IgM_Fas对Fas阳性和Fas阴性Jurkat T细胞的凋亡诱导的影响。(D/E)通过荧光染色((D)，细胞核的固缩)和通过碘化丙啶染色和流式细胞术((E)，DNA链片段)对来自严重受伤的患者的中性粒细胞的凋亡进行的离体检测。

图8：腺病毒5型(Ad5)感染性测定。(A/B)在包埋和不包埋的情况下对Ad5样品进行25kGy(A)和40kGy(B)的β照射。示出了照射前后感染性病毒颗粒的滴度。(C/D)以相同的设置照射IgM抗体。示出了照射前后的相对抗原结合能力。

图9：提出的包埋溶液的机制。(A)溶液中(特别是干燥期间)的氨基酸的多种官能团之间的相互作用。(B)氨基酸的碱性官能团与甘草酸分子内的阴离子性羧基之间的相互作用，其触发了高度非晶性状态的形成。(C)在干燥的非晶性状态下通过使蛋白、氨基酸和甘草酸之间的分子相互作用稳定来依次替换蛋白和水分子(水合外层)之间的致稳氢键。

图10：(A)SDS-PAGE；泳道1：OVA对照，泳道2：OVA降解，泳道3：(OVA+发明性溶液)SD，泳道3：标记(Pageruler^TM)；(B)OVA对照、OVA降解和(OVA+发明性溶液)SD(仅蛋白的谱)的CD谱。

图11：ANS在与OVA结合时的荧光强度增强。

图12：与ANS结合后OVA对照和(OVA+发明性溶液)SD(仅蛋白的光谱)的荧光强度。

图13：治疗性抗TNF-α抗体结合TNF-α。

用蛋白微芯片(

)分析抗体结合。A)TNF-α结合(t₀是指新鲜重建的抗体；t₆是指在40℃贮存6周后的重建抗体)和荧光强度信号损失随时间的时间进程。误差条表示四个点(两个独立微芯片测定的代表性数据)的平均值+/-SD。将胎牛血清白蛋白(BSA)用作阴性对照，并且不显示任何TNF-α结合活性。t₀和t₆之间*p<0.05或**p<0.005。B)在第0天和6周后的四个点(每个点20fmol抗原)的荧光强度损失。显示出亮荧光(左侧)和中等荧光(右侧)。

图14：治疗性抗TNF-α抗体的稳定化。

示出了相对于抗TNF-α对照抗体(液体贮存)的在使用或不使用SPS制剂进行冻干后抗体对特定抗原的结合强度值。误差条表示以每点20fmol的浓度打印的四个点(两个独立微芯片测定的代表性数据)的平均值+/-SD。*p<0.05针对“抗TNF-α抗体t₆”组；**p<0.005针对“抗TNF-α抗体t₀”组。

图15：抗体与微芯片的特异性结合和非特异性结合的示意性说明以及所获得的信号强度的差异。

图16：抗-ErbB2-ELISA的建立和验证。该测定包括：将ErbB2抗原偶联至微量滴定板，使用封闭缓冲液封闭该板上的游离蛋白结合位点，使抗ErbB2抗体与ErbB2抗原结合，使检测抗体结合，并酶促转化碱性磷酸酶底物对硝基苯酚磷酸盐。读数是在405nm下依赖于时间和浓度的显色反应，其用来监视已结合(功能性)的抗ErbB2抗体的量。此处展示出，对逐渐增加的抗ErbB2抗体浓度的响应之间的关系是连续的且可再现的。使用新鲜重建的治疗性抗ErbB2抗体，用10个独立实验来检验实验间的精确度。发现对于5ng/mL～50ng/mL的抗ErbB2抗体浓度范围，浓度相应关系的线性依赖性具有良好的拟合R²=0.989且仅有较小的标准偏差。

图17：功能性ELISA数据。该图绘出了对在不暴露和暴露至不同剂量的β照射和γ照射的情况下重建的冻干抗ErbB2抗体制剂中的抗ErbB2抗体的计算出的结合活性(占对照的百分比)的比较。用20ng/mL的在供应商原制剂中的新鲜重建的抗ErbB2抗体(对照)充当参照(100%)。所有用来监视冻干和照射后的抗ErbB2抗体的功能性的实验都使用20ng/mL的重建的抗ErbB2抗体来进行。所有实验都至少以一式三份方式完成，并且数据表示为平均值±SD。使用SigmaStat3.0和曼-怀氏秩和检验(Mann-Whitney Rank Sum Test)来进行非参数分析。认为p<0.01的差异是显著的。用星号来强调计算出的显著性。

图18：冻干并随后使用不同的策略进行照射后的抗ErbB2抗体的非还原性SDS-PAGE凝胶。对各凝胶进行分子量标准分析以确定所检测的条带的分子量(标记物)。关于制剂，以下述顺序加载各处理条件所对应的样品：SPS、供应商原制剂和PBS。从左到右处理条件是：未照射、25kGyβ照射、40kGyβ照射、25kGyγ照射和40kGyγ照射。对于相应的剂量和照射种类，显示出了在室温(RT)和-80℃下照射之间的区别。凝胶中的主要条带对应于分子量为约160kDa的完整IgG1抗体。在未采用SPS制剂的经照射的样品中，这些条带的强度的降低程度与对应于超过260kDa的共价聚集体的条带的强度的增加程度相同。所有泳道中的降解痕迹是具有以下分子量匹配的条带的凝胶的样品制品的结果：110kDa–重链二聚体，80kDa～60kDa–重链/轻链二聚体，50kDa—重链，30kDa～20kDa–轻链。

图19：基于荧光的微孔板聚集测定。图19中来自半定量

基于荧光的聚集测定的结果证实了非还原性SDS-PAGE的图谱。在未照射样品中仅测到痕量的聚集体。在所有经照射SPS配制的样品中，仅检测到聚集轻微增加。聚集的倾向以下述制剂顺序增加：SPS<<原制剂<PBS。聚集体的测定量取决于照射的剂量和种类，并且跟随照射温度以不同的程度减少。

图20：在冻干和随后进行照射后的治疗性抗ErbB2抗体的尺寸排阻色谱(SEC)。使用对重建的未照射和照射样品的SEC分析对聚集进行定量，分别确认了图19和20中描绘的半定量观察。与分子量标准进行比较，得到了洗脱峰的以下匹配：在5.5mL～8mL之间洗脱的高分子量聚集体(四聚体、三聚体、二聚体)；8.5mL的洗脱体积处的主峰对应于分子量为约160kDa的完整IgG单体；以及在10～11mL之间的洗脱体积处检测到的痕量降解。

A和B：在冻干和40kGy的γ照射后的配制在SPS中、原制剂中和PBS中的治疗性抗ErbB2抗体的色谱比较。对应于完整IgG的主峰的强度的下降程度与未使用SPS制剂的样品中的聚集体峰的强度的增加程度相同。在图20B中以上述比较的放大版本强调了聚集体的这种增加。

图21：冻干后通过傅里叶变换红外光谱法对治疗性抗ErbB2抗体进行的二级结构分析。经干燥样品的标准化FT-IR吸收光谱与新鲜重建的抗体对照的比较。

图22：多种不同组成的保护溶液对吸附到96孔ELISA平板上的人抗IL6-IgG抗体在40kGyβ照射下的致稳情况，使用在对应的抗IL6-ELISA模型中的抗原结合活性(占未经处理的对照的百分比)来监视所述致稳情况。使用了具有7种氨基酸(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸(分别为氨基酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys，和氨基酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp)的组合物。将甘草酸补充至上述氨基酸混合物中，特别是与二肽肌肽及其他二肽组合，结果在不同程度上恢复了照射介导的功能损失。

图23：与不同组成的本发明的保护溶液组合干燥的重组乳酸脱氢酶在40kGy的β照射下的酶活性保留情况。在该酶的还原态辅酶NADH被氧化成NADH⁺且底物丙酮酸同时被还原成乳酸时，在340nm处监视NADH的吸收值的减少，由此以光度测定法测量酶活性。将酶活性表示为占未处理的对照的百分比。使用具有7种氨基酸(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸(氨基酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys)的组合物。将甘草酸补充至氨基酸混合物中，特别是与二肽肌肽以及其他二肽组合，导致在不同程度上恢复了照射介导的功能损失。

图24：与不同组成的保护溶液一起配制的失活的甲型流感病毒H1N1裂解疫苗在不同种类的应激(如冷冻干燥和40kGy的β照射)下的活性，即相应的凝血活性。将甲型流感病毒H1N1裂解疫苗重新缓冲在本发明的组合物中，所述组合物含有7种氨基酸(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或5种氨基酸(分别为氨基酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys，和氨基酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp)，并且分别补充有二肽肌肽、其它二肽和甘草酸。

实施例说明了本发明。

实施例1：材料和方法

包埋溶液

通过将不同的氨基酸L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸单氢氯化物和L-色氨酸——以及可选的甘草酸——组合起来以达到100g/L的原液浓度，从而制备包埋用保护溶液。用于特异性地保护蛋白的最终溶液(1～25g/L)的重量:重量比(w/w)大于2:1。所有组分都是无毒的。氨基酸已经被批准用于静脉内输注(Fong和Grimley)。甘草酸已经被批准用于在治疗慢性肝炎时静脉内施用，并且其安全性已在数个临床研究中得到良好证明。

在包埋溶液中，可以以1μg/mL～10000μg/mL使用甘草酸。

生物官能化PU表面的制备

将医疗级开孔聚氨酯泡沫(KCI,San Antonio,TX,USA)切成3cm³的圆柱状样品，并且与4μg/mL抗-Fas IgM(克隆CH11)偶联1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤样品4次后，封闭非特异性反应位点。样品用H₂O洗涤，用25mg/mL包埋溶液进行包埋步骤30分钟，随后干燥至少90分钟。用25kGy的β照射进行灭菌(BGS,Bruchsal,德国)。

X射线衍射

使用广角X射线衍射(XRD)来研究包埋溶液的干燥层的形态学。使用配备有铜阳极(40kV，30mA，波长0.154nm)和闪烁计数器的X射线衍射仪XRD3000TT(Seifert,德国)。将经干燥的膜置于样品载台上，并在5°～45°的2θ角范围内进行分析，使用0.05°2θ的步骤且每步持续2秒。由Coriolis Pharma Service GmbH(Munich,德国)进行分析。

差示扫描量热法

使用Mettler Toledo821e(Giessen,德国)中的差示扫描量热法来确定液体制剂的最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度(T_g’)。将T_g’样品以约10K/分钟的冷却速率冷却至-80℃。将基线的吸热位移的中点认为是T_g’。由Coriolis Pharma Service GmbH(Munich,德国)进行分析。

光谱反射率

通过使膜反射光并在一定波长范围内分析所获得的反射光谱来测量薄膜特性(Filmetrics Inc.,Munich,德国)。从所述膜的不同界面反射出的光可以是同相或反相的，因此，根据光的波长和膜厚度及膜指数，这些反射会叠加或消减。结果是反射光谱中的强度振荡，其为膜的特性。为了确定膜厚度，使用特定软件(Filmetrics Inc.)来计算尽可能相近地匹配所测光谱的理论反射光谱。该过程在开始时，基于名义膜堆叠(nominal film stack)来对反射光谱应当具有的样子进行初始评估。这包括不同的层和包含所述样品的基板的厚度和折射率的有关信息。然后利用膜的性质调整理论反射光谱，直到发现对所测光谱的最佳拟合。

粘度测量

使用落球粘度计(型号AMVn,Anton Paar,Ostfildern,德国)在25℃用α=60°的角度确定样品的粘度。AVMn根据滚球原理测量通过透明和不透明液体的球的滚动时间。每次测量由10次运行组成，然后计算平均粘度。由Coriolis Pharma Service GmbH(Munich,德国)进行分析。

小角度X射线散射

所有小角度X射线散射(SAXS)实验都使用由旋转阳极发生器(Nanostar,BRUKER AXS)发出的Cu Ka照射来进行。该系统配备有针孔摄像机和平面检测器(VANTEC2000)。将样品固定在载物台附着器上。以109cm的样品至检测器距离拍摄SAXS强度图案20分钟～6小时。相对于背景散射校正所有数据，然后取径向平均值以获得函数I(Q)，其中Q=(4π/λ)sinθ为散射矢量，2θ是入射光束和衍射光束之间的夹角，并且λ=0.1542nm为X射线的波长。发明人选择了人IgM的同源溶液结构(2RCJ)(Perkins等)作为起始构象，SAXS与其拟合并且施加内部拟合代码。使用MC算法，随机创建具有下述限制的散射：散射位置在相对于同源模型为2nm的尺寸限度内。因此同源模型用SAXS数据进行精细化，并且在每个步骤后都充当数值再现过程的永久性校正。提供了针对单体和自组装体的最终拟合散射曲线。

灭菌

使用25～40kGy的β照射由Beta-Gamma Service(Bruchsal,德国)进行灭菌。

关于根据ISO11137VD_max(Paunel-Gorgulu,Logters等)的无菌性的验证，主要问题是包埋是否有利于细菌/真菌的生长。通过无菌冲洗外壳并收集无菌容器内的流体来进行取样。对样品进行膜过滤后，将膜转移至CASO琼脂平板上以确定好氧性细菌、真菌和孢子形成性细菌的集落形成单位。由Medical Device Services(MDS,Munich,德国)进行分析。

病毒感染性测定

为了进行感染性/失活研究，使5型腺病毒，即Adenoid75病毒株(American Typeculture collection,ATCC-VR-5)，在人肺癌细胞系A549(ATTC-CCL-185)上增殖。对于病毒传播，使细胞在37℃和5%CO₂下在补充有5%胎牛血清(FCS)的最低必需培养基(MEM)中生长。通过终点滴定手段(在96孔微量滴定板中，每个稀释度8个孔)确定病毒滴度，其中每孔50μL病毒稀释液和50μL A549细胞(10～15×10³细胞)。对于所述试验，使用1.1×10⁹组织培养物感染剂量(TCID50)/mL的滴度。具体而言，在无菌聚苯乙烯管底部上使体积为50μL的病毒悬浮液在37℃下干燥。然后使用50μL包埋溶液将经干燥的病毒覆盖，再次在37℃下干燥。进行25kGy或40kGy的β照射(不照射对照)后，将病毒/保护溶液双层重悬浮在1mL MEM中。再次如上所述确定病毒滴度。接种后7天观察培养物的细胞病变效应(CPE)。同样地处理病毒对照，但不进行β照射。将病毒滴度表示为TCID50/mL，包括标准偏差。将滴度减少表示为β照射后的病毒滴度与对照病毒滴度之差。

功能表征

ELISA：为了对开孔聚氨酯泡沫表面上的固定IgM的量进行总定量，实施了酶联免疫吸附测定(ELISA)。作为检测抗体，使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgM抗体。使用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺;Sigma)用于底物反应。

抗原结合：为了获得固定的抗Fas IgM的特异功能性的相关信息，使用重组抗原进行实验。按照标准程序，使用HiTrap Protein A柱一步纯化，从稳定转染有hFas:Fc表达质粒(ps299-hFasFc；由Pascal Schneider,Lausanne,Switzerland提供)的中国仓鼠卵巢细胞中纯化出重组hFas:Fc蛋白。通过抑制FasL介导的RKO细胞(人结肠癌细胞系)的细胞死亡，并通过碘化丙啶染色(Nicoletti等)对具有低倍体DNA内容物的细胞进行流式细胞术定量，从而测试hFas:Fc的生物活性。

肽结合：如之前描述过的(Brandt,Dietrich and Koch;Koch and Mahler)在MultiPepRS仪器(Intavis,

德国)上进行自动平行肽合成，从而在纤维素膜上的活化PEG间隔臂处利用Fmoc化学法合成人Fas的亚型1(第1～177位氨基酸和重排的肽；登录号P25445)的肽阵列。根据出版的程序(Hilpert,Winkler和Hancock;Koch和Mahler)研究与抗体的相互作用。通过化学发光成像使结合的抗体可视化。从Diana Imhof(Institute of Biochemistry,University of Jena,德国)获得N末端生物素化的所选择的可溶性表位肽。

T细胞和中性粒细胞中的凋亡诱导：为了评价临床相关功能，将Fas阴性T细胞和Fas阳性T细胞(Jurkat细胞系)和从创伤患者新鲜分离出的中性粒细胞(获得了德国杜塞尔多夫大学伦理审查委员会的研究批准)用PU-IgM_Fas激发4小时。随后，收获细胞，用碘化丙啶对细胞染色，从而确定凋亡。流式细胞术遵循Nicoletti(Nicoletti等)的操作规程。

统计学

所有实验进行至少5次。如果相关的话，将数据表示为平均值+/-SEM。通过学生t检验(GraphPad Prism Program,version5,GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析。小于0.05的P值认为是统计学上显著的。

实施例2：发明性溶液的物理特性

虽然糖因其溶解度和形成氢键的OH基而成为常用的冻干保护剂，但是它们在较高浓度下的快速结晶是明显的缺点(Y.Han等)。如果起始摩尔比为500:1(糖:蛋白)，该比率在干燥期间会进一步增加。因此出现结晶，这减少了糖分子的可利用度，因此它们提供氢键的能力也会降低。发明人发现诸如甘草酸(图1)等一些糖苷植物代谢产物可充当合适的冻干保护剂，这可能是因为糖苷OH基的存在。

与糖相反，获得医疗批准的皂苷甘草酸(Baltina)并不结晶，而是形成非晶性凝胶(玻璃态)，特别是当与氨基酸组合时(Fuchs等)，由此提供OH基以用于形成氢键，直到蛋白完全干燥。为了研究包含甘草酸以及所选的氨基酸的本发明的溶液的玻璃态是否有助于防止冷冻干燥过程中不期望的微晶形成，采用了多个实验方法(参见下文)。

通过广角X射线衍射(XRD)确定了在载体材料上的发明性溶液的干燥膜的物理特性(图2A-C)。涂布表面的XRD图显示了所用载体材料的四个特征峰(图2A)。用不含甘草酸的共溶剂溶液涂布该材料产生了相同的XRD图，表明不具有另外的结晶峰的非晶性结构(图2B)。将甘草酸补充到本发明的溶液中导致了更明显的非晶性特性，并且形成了对涂布载体的衍射信号的干扰(图2C)。另外，在本发明的溶液的存在下，冷冻干燥的抗体固体展示出了晕轮状的粉末XRD图(图2D)，其对于非结晶固体是典型的。峰的缺失表明所分析的样品以非晶性状态存在。

通过差示扫描量热法(DSC)对冷冻共溶剂溶液进行分析，该分析揭示了冷冻浓缩的非冰相的两个热转变(T_g’：最大冷冻浓缩相的玻璃化转变)：在-60℃的T_g1’和在-49℃的T_g2’，它们对于氨基酸是典型的。在本发明的冷冻溶液的热谱图中没有发现特征性结晶事件(图3A)。另外，在本发明的溶液的存在下，冷冻干燥的抗体固体的DSC热谱图与没有任何结晶证据的非晶性固体一致(图3B)。

为了调查发明性溶液是否能够在表面上形成均质薄膜，对涂布有甘露醇(糖醇)-白蛋白混合物或涂布有本发明的溶液的硅进行光谱反射率分析(图4)。光谱反射率显示了在甘露醇-白蛋白混合物中甘露醇的结晶(图4A)，而在本发明的溶液的存在下形成了均质膜(图4B)。相应的振荡曲线分别确认了结晶性和非晶性层的特性(数据未显示)。根据所观察到的特征性“彩虹”效应(图4C)，本发明的溶液的膜展示出了1.15mPa*s的粘度(水：0.89mPa*s)和低纳米范围内的厚度。

基于所确定的本发明的溶液的关键物理参数，发明人推断出——并进一步检验了——发明性溶液适合在冷冻干燥期间使蛋白稳定。

实施例3：本发明的溶液对抗-Fas IgM的结构稳定化作用，其通过小角度X射线散射(SAXS)来监视

在本发明的溶液中包埋的目标是在例如贮存或灭菌程序期间保持蛋白的结构和功能完整性。通过SAXS(Horejs,Gollner等；Horejs,Pum等)分析了发明性溶液对干燥后(图5A)、β照射和再水化后(图5B和图5C)的聚氨酯(PU)-IgMFas的三维结构完整性的保护性效果。

测量得到经干燥和再水化的样品的背景校正的散射反差(scattering contrast)，即I(Q)，其与倒易空间Q[nm-1]中的IgM的特征性空间排列(图5A-C，上方框图，较大的红色圆圈)匹配。为了从这些曲线重构所固定的IgM的结构，发明人将IgM五聚体考虑成是数学上自相似的并因此是分形的(Horejs,Gollner等；Horejs,Pum等)。不同长度尺度的IgM分子的自相似性基于其特征性的Y样结构(图5，Y模型)。

发明人研究了包埋在发明性溶液中后(PU-IgMFas-NC)、暴露至照射(*PU-IgMFas)后或者包埋并随后暴露至照射(*PU-IgMFas–NC)后相对于干燥固定的IgM分子的结构变化。当与单独PU的背景信号相比时，未经处理的固定PU-IgMFas的信号处于分辨率的下限。因此，计算了经干燥PU-IgMFas的形状系数ΔP(Q)的相对变化(图5A，上方框图，红色、灰色和黑色的小圆圈)。相对散射反差是负的。当将未处理的PU-IgMFas样品与PU-IgMFas–NC比较时，发现了最大差异(图5A，上方框图，红色小圆圈)。包埋降低了ζ=3nm～ζ=15nm的特征距离上的散射反差。这些距离对应于IgM分子的平均外延并且提供了IgM分子被完全包埋的证据。

当将PU-IgMFas样品与*PU-IgMFas比较时(图5A，上方框图，灰色小圆圈)，再次观察到散射反差的显著降低，其在ζ=3nm～ζ=12nm之间是可检测的。该结果可能主要反映了以下事实：照射引起了构象变化(Gianfreda和Scarfi；Kapoor和Priyadarsini；Stadtman和Levine；Zbikowska、Nowak和Wachowicz)或导致蛋白内键的断裂，因此减小了电子反差(electronic contrast)。当将PU-IgMFas与*PU-IgMFas–NC比较时，散射反差的相对差异低于PU-IgMFas和*PU-IgMFas之间所观察到的差异(图5A，上方框图，黑色小圆圈)。

根据所用的分析模型，拟合了所测得的散射图，对于经干燥的固定IgM分子，得到IgG臂的平均尺寸κ≈4.0～6.0nm(图5A，虚线)。另外，基于作为起始构造的IgG晶胞的已知三维结构(Protein Data Bank:2RCJ)(Perkins等)，能够重建经干燥固定的IgM分子的IgG亚基，正如图5A中的灰色珠模型所描绘的。进一步的计算操作确定了五聚体IgM分子内的IgG亚基的空间排布，特别是κ_p，跨越两个相对的IgG臂的弧度，以及随后它们的张开角θ。分形维度D与包含5个IgG臂的特定的张开角θ(图5)相关。所有干燥体系都具有共同的分形维度D=3。对于IgG臂，发明人预期所有的干燥样品都具有共同的θ≈0.51°或θ≈29.22°的IgM超结构。经干燥样品*PU-IgMFas、PU-IgMFas-NC和*PU-IgMFas-NC的预期IgM结构模型在图5A中通过绿色珠模型给出。

为了重建全部的SAXS信号，使用互补方法确定了IgG臂之间的平均力。这些在图5A的底部给出(连接的小圆圈)。平均力的高起伏度表明了稳定但是塌陷的蛋白结构。在任何经干燥样品中，发明人将该高起伏度与水合外层的缺失关联起来。

在使包埋在发明性溶液中的样品或未包埋的样品再水化并重建水合外层之后，所有样品的散射反差与干燥样品相比是正的。对于再水化的PU-IgMFas，分形维度减少至D=2.5，而对于*PU-IgMFas，则未获得可测量的信号。该发现表明，不使用发明性溶液时的IgM分子被照射破坏，并且PU-IgMFas的再水化产生了部分开放的IgM超结构，所述超结构具有由重新施加的水合外层带来的增加的角度θ。相应平均力的起伏度有所减少(图5B的底部)，表明IgG臂的相互吸引减少，这与IgM超结构的部分开放构造一致。

当*PU-IgMFas–NC样品再水化时，IgM超结构的打开和由此发生的再折叠甚至更佳。计算了IgG臂的结构模型(图5C中的灰色珠模型)。当分形维度减少至D=1.5时，可以预期角度θ会增加。发明人预期，包埋有利于蛋白的再水化。如果将结构模型与张开角θ组合起来，则可以重建IgM分子的更开放的结构模型。这由图5C中的绿色珠模型给出。再次计算了平均力，并且发现起伏度小于图5中给出的其他实例(底部)。

这些结果显示，干燥后，蛋白包埋在由发明性溶液形成的外层中，并且蛋白的三维结果得以保存，并且重建后的再折叠得到改善。

实施例4：对固定的抗Fas IgM的抗原结合的功能评价

接下来，研究了在发明性溶液中进行包埋是否能够保持IgM_Fas的功能性。因此，将IgM_Fas固定在ELISA平板上，并且在进行和不进行发明性溶液中的包埋和/或β照射的情况下探测与高度特异性重组人Fas抗原片段(hFas::Fc)(Schneider等)的结合。

如图6A/B所示，hFas::Fc以浓度依赖性的方式被IgM_Fas识别。不保护的话，抗原结合能力的完全丧失证明了>25kGy的β照射导致IgM_Fas的功能受损。与之相反，发明性溶液中的包埋不影响IgM_Fas的抗原结合，而且在宽范围的浓度下保护了IgM_Fas免受照射介导的损伤。为了研究分子水平上的IgM_Fas互补位的功能完整性，使用了N末端生物素化的表位肽(生物素-RCKPNFFCNSTVCEHCDP-NH2)，该表位肽通过肽阵列筛选来鉴定。将IgM_Fas固定在ELISA平板上(使用和不使用β照射和/或包埋)，并且用梯度量的表位肽进行探测，然后在比色测定中利用抗生蛋白链菌素-HRP偶联物来检测(图6C)。为了进行参照，IgM_Fas在不进行包埋和β照射的情况下对表位肽的K_D经确定为160±13nM(数据未示出)。如图6C中所示，β照射导致IgM_Fas对表位肽的亲和力显著降低(K_D=855±129nM)，证明照射引起了严重损伤。与之相反，当在β照射之前进行了包埋时，IgM_Fas对表位肽的K_D的保留(188±25nM)证明完全保持了抗体互补位的完整性。

这些结果确认发明性溶液保存了蛋白的三维结构，即使在暴露至诸如干燥和照射等应激条件时也保持了它们的功能。

实施例5：对PU-IgM_Fas-NC的激动性生物活性的功能评价

为了进一步研究生物活性的保持，研究了PU-IgM_Fas-NC在体外诱导凋亡(Logters等;Paunel-Gorgulu,Logters等;Paunel-Gorgulu,Zornig等.;Scholz等)和使Fas敏感性细胞失活(Zamzami和Kroemer)的潜力。为了证明PU-IgM_Fas–NC诱导凋亡是受体特异性的，使用了Fas阳性和Fas阴性Jurkat T细胞系作为靶标。如图7C中所示，在与PU-IgM_Fas–NC一起温育后，凋亡诱导唯独出现在Fas阳性细胞中。此外，为了确认PU-IgM_Fas–NC在临床相关场合中的潜在治疗功效，使用了从严重受损的外伤患者(创伤严重度评分>16)获得的高度激活的表达Fas的中性粒细胞(Paunel-Gorgulu,Zornig等)，以确认在患者的中性粒细胞中PU-IgM_Fas-NC介导的凋亡。具体而言，在用PU-IgM_Fas–NC离体激发这些中性粒细胞4小时后，细胞核染色(图7D)和流式细胞术(图7E)证明，在经PU-IgM_Fas–NC处理的细胞中发现中性粒细胞的细胞核的凋亡相关固缩(Zamzami和Kroemer)，但是在未处理的细胞中未发现此现象。

这些结果提供了进一步的证据证明发明性溶液保存了蛋白的三维结构，即使在暴露至诸如干燥和照射等应激条件时也保持了它们的功能。

实施例6：灭菌减少了污染，同时保持了多肽的功能性

为了测试在发明性溶液中包埋多肽是否会不期望地保护在灭菌过程期间可能污染多肽制品的细菌或病毒，确定了功能化的包埋的聚氨酯泡沫的生物负荷量。制造了六个不同批次(每批次>70个)的含有PU-IgM_Fas–NC的塑料外壳，以用于体外免疫调节的潜在应用。测量了来自每个批次的10个未灭菌的PU-IgM_Fas–NC样品的生物负荷量作为参照。平均生物负荷量是每个模块151±18个细菌/真菌。通过≥25kGy的β照射进行灭菌，并且根据ISO11137VD_max(Paunel-Gorgulu,Logters等)方法来验证灭菌。发现用参照剂量(8.5±0.8kGy)照射的所有60个PU-IgM_Fas–NC模块都是无菌的，确认了使用NC的灭菌方法的有效性。

另外，使用5型人腺病毒(Ad5)进行病毒失活研究，该病毒是用于测试化学消毒剂的病毒杀灭功效的参照病毒(Kim等；Sauerbrei等)。具体而言，将50μL的病毒悬浮液在无菌聚苯乙烯管的底部上在37℃下干燥。然后用50μL的发明性溶液覆盖干燥的病毒，再次在37℃下干燥。在进行25kGy或40kGy(不照射对照)的β照射后，将病毒/保护性溶液双层重悬浮在1mL MEM中，通过终点滴定法确定感染性病毒的滴度(图8A/B)。平行地，使用IgM进行相同的实验设置(LO-MM-3;图8C/D)。

如图8所示，β照射导致Ad5的定量失活(25kGy,≥99.9%的减少；40kGy，≥99.999%的减少，图8A/B)，同时维持了IgM抗体的功能性。这些结果证明，发明性溶液选择性地稳定和保护了蛋白结构，但是不防止照射引起的对病毒复制的损伤。因此，在发明性溶液中进行包埋不构成在生产过程期间病毒污染的风险。

实施例7；发明性溶液的活性的机制模型

不希望受理论限制，本发明的发明人假设，如图9中示意性描绘的，诸如氨基酸(图9A)等小分子之间、氨基酸与甘草酸之间(图9B)以及氨基酸/甘草酸与蛋白结构(图9C)之间的相互作用介导了发明性溶液的活性。在该模型中，甘草酸既与蛋白相互作用(经由离子性相互作用和氢键)也与小分子相互作用(例如经由糖苷部分和糖苷配基的三个羧基与氨基酸相互作用)。根据优先排斥概念，在水的存在下，与不带电分子在一起的甘草酸可以通过增加水性溶液的表面张力来支持蛋白周围的水合外层的渗透物稳定化。在该实施例中，不同氨基酸之间、以及氨基酸和甘草酸之间的相互作用导致发明性溶液具有强烈的非晶性特征。此外，在干燥期间，蛋白与甘草酸以及带电氨基酸相互连接，甘草酸与带电氨基酸在根据优先结合概念通过氢键与蛋白相互作用时置换掉水分子(图9C)。非晶性特征与特定组分的抗氧化性、自由基清除性和金属螯合特征组合，可以支持对蛋白周围外层的保护效果。

实施例8：喷雾干燥期间蛋白的稳定化

为了确认发明性溶液在喷雾干燥期间稳定蛋白的可用性，使用了卵清蛋白(OVA)作为模型蛋白，并且用发明性溶液对其进行喷雾干燥。然后使用圆二色性(CD)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和荧光光谱学来表征经干燥的粉末的完整性。

材料和方法

卵清蛋白购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。发明性溶液如上所述(参见包埋溶液)。1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)也购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。所有其他试剂是分析级。

制备喷雾干燥的蛋白

使用Büchi B-290实验室喷雾干燥器(Büchi,Flawil,瑞士)将3%(w/v)的卵清蛋白和6%(w/v)的发明性溶液喷雾干燥。入口空气温度设定为120℃，空气流速为470L/h，泵送速率为7.5ml/分钟，出口空气温度为50℃～55℃。

SDS-PAGE

使用Bio-Red Mini-Protean3凝胶电泳系统(Bio-Red Laboratories,Hercules,USA)进行SDS-PAGE。与10μl样品缓冲液温育(95℃,5分钟)后，将10μl蛋白样品(0.5mg/ml)加载至各孔中，并在200V的电压下进行电泳约55分钟。使用考马斯亮蓝染色使蛋白可视化。

圆二色性(CD)

使用Jasco J-715分光偏振计(JASCO International Co.Ltd,Hachioji city，日本)来评估喷雾干燥前后的蛋白二级结构。在远紫外范围(200～250nm)区以1.0nm的取样间隔在0.05cm路径长度的比色皿中记录CD光谱。使用超滤器材(Vivaspin6，来自Sartorius Stedim biotech,

德国)将本发明的溶液与蛋白分开，这是因为本发明的溶液在CD中具有一些信号。所有光谱是两次扫描的平均值，并且经过背景校正和标准化。然后将光谱与纯/未处理的蛋白进行比较。

荧光光谱

在荧光光度计(LS55，来自PerkinElmer,Waltham,USA)中使用1cm路径长度的比色皿记录荧光光谱。通过在360nm激发ANS来测定ANS的固有荧光，并且在390～550nm范围内记录发射光谱。相对于溶剂的背景光谱校正荧光光谱。

结果

对OVA对照和用发明性溶液喷雾干燥的OVA的SDS-PAGE分析示于图10(A)中。在两种样品中观察到相同的凝胶图案，并且不存在低分子量条带，表明在喷雾干燥时未发生OVA分子的降解。

此外，如图10(B)所示，使用发明性溶液进行喷雾干燥后OVA的CD光谱与OVA对照相似，表明再分散后不能观察到二级结构的改变。

1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)在水中实际上是非荧光的，但是当与存在于蛋白上的疏水性部位结合时会显示荧光。因此，该荧光在蛋白变性时大大增加，因此充当变性程度的量度(图11)。使用该现象来表征喷雾干燥后OVA的完整性。从图12中看出，对照和使用发明性溶液喷雾干燥的OVA具有相同的荧光强度，表明在喷雾干燥期间未发生变性事件。

总之，经一组不同的技术确认，发明性溶液适于在卵清蛋白的喷雾干燥期间保存蛋白结构。

实施例9：冻干并在40℃下贮存6周后的蛋白的稳定化

为了确定本发明的致稳保护溶液(SPS)对治疗性抗TNF-α抗体的影响，使用了蛋白微阵列作为简单快速的工具。设计了

高密度蛋白微阵列用于对抗体结合模式和特征进行定量分析(Feyen等，2008;Lueking等，2008;Lueking等，2005)。

微阵列在涂布有硝酸纤维素的载玻片上含有384种预定的经His标记纯化的重组人蛋白。其中有膜蛋白组、细胞内蛋白组和细胞外蛋白组。对抗体结合模式的筛选对于例如表征治疗性抗体的特异性、避免因抗体交叉反应性而引起的副作用或检测患者血液中的自体免疫抗体而言是重要的工具。

9.1材料和方法

蛋白微阵列

蛋白微阵列由Protagen在硝酸纤维素涂布的载玻片上制造(

AV-400Premium,Lot0421104;Protagen,Dortmund,德国)。每个微阵列上打印有一组384种不同的重组人蛋白，代表不同的基因本体类别。另外，

AV-400微阵列的内含物中包括19种人血清蛋白和10种对照蛋白。这些蛋白源自大肠杆菌蛋白表达文库，并且使用之前公开的His标记进行纯化(Feyen等，2008)。将每种重组人蛋白以20fmol/点的平均量一式四份地打印在该生物芯片上。此外，将来自常用作抗体生成宿主的不同物种的IgG以不同浓度打印，作为用于二抗免疫检测的过程对照。该蛋白芯片还打印有下述浓度的天然TNF-α(Sigma,St Louis,MO)的连续稀释液：10、8、6、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01、0.001、0.0005、0.0001pmol/μl。这分别对应于每点20、16、12、8、4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.002fmol的TNF-α。

AV-400上的温育条件

除非另外指出，对于所有实验都将治疗性抗TNF-α抗体在两个蛋白芯片上温育。如之前确定的，使用2.5mg/ml的最佳工作浓度(Feyen等，2008)。

在室温下在2%(w/v)胎牛血清白蛋白(BSA/TBST,0.1%[v/v]Tween20)中将蛋白微阵列封闭1小时。将抗体添加至2%(w/v)BSA/TBST中，并在加湿氛围下温育16小时。进行三次TBST洗涤，随后在室温下在2%(w/v)BSA/TBST中与0.002mg/ml的二抗(山羊抗人-IgG-Cy3(Dianova,Hamburg,德国))温育1小时，而后，在TBST中洗涤蛋白微阵列三次。在自动化杂交站(Tecan HS4800Pro;Tecan,Crailsheim,德国)中以200μl的体积进行所有抗体温育步骤。对于所有蛋白微阵列使用相同的设置并用共聚焦微阵列读取器(ScanArray4000,Perkin Elmer Life Science;San Jose,CA)进行结果读取。

样品制备

制造以下样品：

a)用本发明的SPS溶液(七种氨基酸的混合物；Arg、Ala、Gly、Lys、Glu、His、Trp；pH5.2～7.5)再缓冲过的5mg治疗性抗TNF-α抗体；

b)未用SPS再缓冲过的5mg治疗性抗TNF-α抗体。

将每种制品按1.25mg等分至小瓶中并冻干。用增加的温度和时间使样品经受应激。重建后，通过

AV-400分析样品。作为对照，按照制造商说明书重建治疗性抗TNF-α抗体，并且在溶解状态下利用增加的温度(40℃)和时间(6周；t₆)使其经受应激。

缓冲液

根据标准操作规程制备缓冲液。TBS缓冲液：10mMTris-HCl，pH7.5(Merck,Darmstadt,德国)，150mM NaCl(Diagonal,Münster,德国)。封闭缓冲液：10mMTris-HCl，pH7.5(Merck)，150mM NaCl(Diagonal)，2%BSA(Sigma)。TBS-T缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.5(Merck)，0.5M NaCl(Diagonal)，0.1%(v/v)Tween20(Sigma)。

图像和数据分析

使用软件包GenePix Pro6.0(Molecular Devices,Ismaning,德国)进行图像分析。

减去背景值后确定每个蛋白点的平均强度。在减去背景值时，使用中值背景荧光强度。

为了报告脱靶活性(OTA)，确定了每种蛋白的四个蛋白点(一式四份)的中值强度。

基于针对一种抗体的所有实验，使用相应的IgG过程对照(例如，源自二抗与宿主IgG蛋白点的结合的荧光强度)将每种蛋白或蛋白浓度的中值强度的平均值标准化。使用以下计算进行标准化：信号抗原/IgG过程对照的平均信号×100=X单位。

为了确定与所打印的抗原连续稀释液的结合，使用了所测试的每种浓度的四个蛋白点(一式四份)的平均值+/-SD。为了确定数据组之间的统计学显著性，使用了学生t检验。当p<0.05时，认为数据组之间的差异具有统计学显著性。

9.2对减少的抗体功能的定量

为了确定点加在微芯片上的最佳抗原(TNF-α)浓度，打印了不同量的靶抗原(范围，0～20fmol/点)。在结合研究中，将治疗性抗TNF-α抗体(新鲜重建(t₀)的或贮存了6周后(t₆)的)以2.5mg/ml的浓度添加至微芯片。随时间测量了荧光信号强度所显示的结合亲和力。如图13A所示，在抗原浓度为12、16和20fmol/点时观察到了在40℃下贮存6周后的治疗性抗TNF-α抗体的功能损失(p<0.05)，但是在抗体浓度为0～8fmol/点的范围时未观察到其功能损失。例如，当使用20fmol/点时，在时间点t₀时标准化的信号强度为700～800单位，而6周后发现了信号强度的降低(450单位)。荧光强度随时间的损失在图13B中定性地绘出。

这些结果表明，20fmol抗原/点的浓度适于进一步实验，而且，可用来监视抗体功能损失的信号强度范围足以测试致稳制剂。因此，在以下实验中，使用20fmol/点的抗原浓度和2.5mg/ml的治疗性抗TNF-α抗体作为标准品。

9.3利用SPS来保存抗体结合强度

为了评价发明性溶液(SPS)在稳定抗体方面的功效，使治疗性抗TNF-α抗体在SPS中再缓冲或在制造商推荐的缓冲液中再缓冲，并进行冻干。冻干后，将样品贮存在升高的温度下，并且在规定时间点在水中重建，并在第0天(t₀)和在40℃下贮存6周后(t₆)用于微阵列研究。将这两种制剂的功能活性与在t₀时重建并作为在制造商的原始缓冲液中的流体制剂贮存的新鲜重建的抗体(对照)进行比较。刚刚在t₀和t₆时重建后，无SPS的冻干样品的制品反应显示出高达779/889的更高的信号强度(标准化信号强度；为对照的108%/123%)。重建抗体的t₆制品(未经冻干的)显示了降低的信号强度(456单位；63%)。相比之下，如图14所示，使用了SPS的制剂导致在t₆时间点时进一步增加的信号强度(138%)。

这些结果确认了SPS保持抗体与特异性抗原的结合强度的致稳效果。

9.4结合特异性————脱靶活性(OTA)的数量

为了研究SPS配制的治疗性抗TNF-α抗体是否展示了非特异性结合模式，通过对OTA的数量进行计数来对与不相关蛋白的亲和力进行定量。

将原始再缓冲的治疗性抗TNF-α抗体(对照)和未使用SPS再缓冲并随后冻干的样品进行比较，结果表明，冻干步骤产生了大量的高OTA(表1)。但是，与制造商推荐的制剂相比(t₀时212个OTA；t₆时286个OTA)，在SPS配制的样品中OTA的数量在t₀和t₆这两个时间点时均减少(分别是36和150个OTA)。

因此，上文所示的SPS介导的结合强度保存主要是抗原特异性的，而不是由OTA表示的非特异性结合的结果。

表1.在三种不同制剂中随时间推移检测到的OTA的数量

OTA：脱靶活性；SPS：致稳保护溶液；t₀：实验开始；t₆：实验开始后6周

9.5OTA信号强度值的确定

除了评价OTA数量之外，还定量了非特异性结合强度，其为表征抗体结合模式的一个重要方面(概览见图15)。

相对于过程对照(人IgG;250μg/ml)来标准化脱靶活性(OTA)。直接溶解的治疗性抗TNF-α抗体制品(对照)在t₀时间点时显示出高达212个OTA，且具有非常低的平均OTA信号强度值6%(表1)。取该对照的平均OTA值加上该平均值的标准偏差的两倍，从而自定义了20%的显著性阈值。具体而言，仅有14个OTA高于该显著性阈值，表明认为大多数OTA不具有显著性。在T6时间点时，OTA的数量增加至286，且平均OTA值小幅增加至10%。SPS配制的抗体在t₀时揭示了仅36个OTA。但是，平均信号强度是23%，因此稍高于用对照获得的信号强度。此外，有15个OTA高于20%的信号强度值，包括具有在约50%范围内的更高值的OTA。在应激条件下，OTA的数量增加至150个OTA，包括信号强度值高于20%的76个OTA(未示出)。总之，这产生了45%的平均信号强度值(表1)。

不使用SPS重建然后冻干的抗体制品在T0时显示了多达94个OTA。获得的平均信号强度值为41%。更具体而言，有51个OTA的信号强度值>50%。在应激条件下，OTA的数量增加至135个OTA，同时平均信号强度值为83%。

总之，这些结果表明SPS制剂产生了OTA更少的治疗性抗TNF-α抗体。

因此，该实施例显示出，在SPS技术的保护下，抗体对各同种抗原(cognate antigen)TNF-α的识别有所改善。在一方面，冻干改善了对特异性抗原的结合活性，另一方面，冻干还显著增加了冻干后的OTA；而用SPS配制的抗体与根据制造商的推荐配制的抗体相比产生了较少的OTA。

这些结果表明，与使用原制剂进行相同处理的治疗性抗TNF-α抗体相比，用SPS配制且冻干的治疗性抗TNF-α抗体在重建后显著减少了重建后的脱靶活性(OTA)，并且即使在40℃贮存6周后也保存了结合强度。总之，如保存的抗体功能性所显示的，可以确认SPS的蛋白致稳效果。

实施例10：SPS对经照射的IgG1抗体的致稳效果

通过使用治疗性抗ErbB2人源化IgG1抗体作为模型抗体，研究了本发明的致稳保护溶液(SPS)防止照射介导的蛋白损伤的功效。

10.1材料和方法

ELISA

建立使用固定的重组ErbB2抗原(Sino Biological Inc.，北京，中国)的ELISA测定，并对其进行验证以对可溶性抗ErbB2抗体的抗原特异性结合进行定量(RochePharma AG,Grenzach-Wyhlen,德国)。将ErbB2抗原与微量滴定板偶联后，使用含有FCS和Tween20的封闭缓冲液(Sigma-Aldrich,Munich，德国)将游离的蛋白结合位点封闭。添加抗ErbB2抗体，随后洗涤板，并且添加碱性磷酸酶偶联的二抗(Dianova,Hamburg，德国)。利用碱性磷酸酶底物对硝基苯酚磷酸盐的酶促转化，在405nm以光度测定法检测抗ErbB2抗体与ErbB2的特异性结合。时间和浓度依赖性的显色反应使得可以对功能性抗ErbB2抗体进行定量。

对于5ng/mL～50ng/mL的抗ErbB2抗体浓度范围，在405nm处ELISA展示了线性的剂量应答曲线。应用线性回归来将线性方程拟合至数据点。在照射实验期间用可商购的抗ErbB2抗体制剂充当阳性对照。

使用重建的赫赛汀(Herceptin)(20ng/mL)进行监视冻干和照射后抗ErbB2抗体的功能性的所有试验。

傅里叶变换红外光谱FT-IR

使用配备有汞-镉-碲化物(MCT)检测器、金刚石-ATR-单元DuraSampI/RII^TM(SensIR)和OPUS65软件(Bruker Optics)的FT-IR光谱仪Equinox55(Bruker OpticsGmbH,Ettlingen，德国)来分析抗ErbB2抗体的二级结构。对于每个光谱，从4000～400cm^-1以4cm^-1的分辨率收集240个扫描的累积。在每次实验之前用相应的缓冲剂和赋形剂的溶液记录参照光谱，以针对背景效应进行校正。用OPUS-65软件计算二阶导数光谱，并且用13点函数使最终的蛋白光谱平滑化。

电泳

使用非还原性SDS-PAGE来监视抗体制剂的聚集和片段化。使用Novex XCell IIMini Cell系统和Novex NuPAGE Bis-Tris凝胶(4%～12%)(10个孔，厚度1mm)(Invitrogen,Darmstadt,德国)以及NuPAGE MOPS电泳缓冲液进行分析。在LDS-样品缓冲液(Invitrogen)中将重建的冻干物稀释至终浓度为0.4mg/mL。在95℃下使样品变性10分钟，然后将10μL样品加载至凝胶的孔中。所施加的蛋白量为4μg/孔。以200V的恒定电压完成分离，运行时间为约90分钟。

用考马斯亮蓝R250染色和脱色溶液(BioRad,Hercules,CA,USA)将凝胶染色。对各凝胶分析分子量标准，以确定所检测条带的分子量(Novex Sharp Pre-StainedStandard,Invitrogen)。

蛋白聚集测定

根据制造商推荐进行微孔板聚集测定(

Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY,USA)。简言之，在室温下在测定缓冲液中制备用于聚集测定的样品。将用于监视和检测蛋白聚集的

阳性对照(聚集的溶菌酶)和阴性对照(天然溶菌酶)以冻干粉末(各300μg)的形式提供，并且在500μl去离子水中重建，从而生成可以在4℃贮存数周的40μM原液。用测定缓冲液进行1:2稀释后(20μM)应用所述溶液。在测定缓冲液中将重建的抗ErbB2抗体样品(20mg/mL)稀释至浓度为4.5mg/mL。作为对照，将新鲜重建的抗ErbB2抗体(20mg/mL)稀释至4.5mg/mL。将98μL的这些蛋白溶液准备到底部透明的96孔微孔板(μClear black;Greiner,Frickenhausen，德国)中。将2μL新鲜制备的

检测试剂加载溶液分配到每个孔中。将含有测试样品的微孔板在室温下在黑暗中温育15分钟。用融合荧光微孔板读取器(激发：550nm；发射：603nm；PerkinElmer,Massachusetts,USA)对荧光进行定量。

尺寸排阻色谱(SEC)

通过SE-HPLC对蛋白的聚集和降解进行定量。在30℃以0.5mL/分钟的流速在配备有UV-280nm检测器(Malvern Instruments,Worcestershire，英国)和TSK-凝胶G3000SWXL7.8×300nm柱(Tosoh Bioscience，东京，日本)的HPLC系统上进行分析。上样体积为50～100μL。用于SE-HPLC的运行缓冲液是Dulbecco’s PBS pH7.1(PAA Laboratories,Pasching，奥地利)。在每个序列中都运行分子量标准物(BSA,Thermo Scientific;Waltham,MA,USA)和安慰剂缓冲液。通过比较单体峰的曲线下面积、高分子量物质的总和和低分子量物质的总和来确定聚集和片段化的定量(以%计)。

照射操作规程

使用25kGy或40kGy的β照射或γ照射由Sterigenics(Leuven,Belgium)进行灭菌。作为对标准照射操作规程的修改，将部分样品在-80℃下照射。

透析

使用购自Thermo Scientific的

透析盒(截留阈值3.5kDa；体积3～12mL)使抗ErbB2抗体(20mg/mL)在pH6的SPS(40mg/mL)、原制剂和pH调为6的Dulbecco’s PBS中透析过夜。透析后立即冻干，以确保最佳稳定性。对一部分抗体样品进行透析以用于在SPS或PBS中再缓冲。

冻干

根据下表2所示的操作规程使用EPSILON2-6D(Martin Christ;Osterode am Harz，德国)进行冻干。

表2：冻干操作规程

数据分析

所有实验都以至少一式三份的方式进行，并且将数据表示为平均值±SD。使用SigmaStat3.0并使用曼-怀氏秩和检验来进行非参数分析。认为p<0.01的差异是显著的。

10.2照射对ErbB2识别的影响

建立了抗ErbB2ELISA来研究照射对功能性抗原结合的影响。图17描绘了用固定的重组ErbB2和新鲜重建的抗ErbB2抗体建立的标准曲线。借助于该标准曲线，选择20ng/mL的抗ErbB2抗体作为标准浓度用于以下实验。

将经受应激后的抗ErbB2抗体样品的功能活性与新鲜重建的原始抗ErbB2抗体的功能活性进行比较，将该新鲜重建的原始抗ErbB2抗体定义为100%阳性对照。当将抗ErbB2抗体在SPS中再缓冲、冻干并在ELISA中测试时，抗原结合活性为115±13.7%，而在原始缓冲液中再缓冲的样品的抗原结合为95±5.2%(图2)。在进行25kGy的β照射和γ照射后发现，在SPS配制的样品中结合活性几乎为100%，而对于原始缓冲液的情况，结合活性为83.2±6.4%～87.4±1.9%。用40kGy处理样品后，SPS配制的样品的活性为93.0±2.1%～102.6±5.1%，而对于原始缓冲液的情况，结合活性为63.19±2.1%～71.8±4.5%(图16)。

10.3照射对聚集体和片段的形成的影响

为了分析照射后治疗性抗ErbB2IgG1抗体的分子结构的完整性，将经照射样品的聚集状态与对照比较。治疗时施用的生物制品的聚集体含量应当尽可能低(例如低于2%)，并且对符合规定来说是至关重要的参数。借助于半定量非还原性SDS-PAGE(图18)和基于荧光的微孔板测定(图19)，在25kGy和40kGy的β照射和γ照射后都观察到抗ErbB2抗体明显形成了聚集体和降解产物。当将样品冻干并在SPS中照射时，发现照射介导的聚集体和降解产物明显减少。通过尺寸排阻色谱(SEC)分析确认了该半定量观察结果(图20)。在图20A和20B(放大)中描绘了与原制剂和与PBS(阴性对照)相比的从经照射的SPS制剂样品获得的选定色谱图。对应于分子量为约160kDa的完整IgG1单体(M)的主峰在保留体积为8.5mL时洗脱出。由IgG单体的二聚体、三聚体、四聚体构成的高分子量聚集体(HMW)和可能更高分子量的聚集体的洗脱范围位于5.5ml和8mL之间。在10～11mL的保留体积处观察到仅非常小倾向的片段化，其形式为低分子量物质(LMW)。HMW、LMW和单体(M)的百分比数值列于表3中。在所有实验中，SPS制剂导致聚集体和降解产物减少了至多20倍(p<0.05)。

表3.不进行或进行了不同的照射操作的抗ErbB2IgG1单体、聚集体和片段的百分比

10.4SPS防止了由冷冻干燥介导的二级结构变化。

为了研究冷冻干燥的分子的二级结构，进行了FT-IR分析(图21)。在所有光谱中都未检测到在1638cm-1处的酰胺I吸收带变化。但是，在原制剂中和在阴性对照PBS中配制的经干燥抗体的光谱在峰位置和1547cm-1处酰胺II吸收带形式方面都显示出了明显变化，表明在冻干后α螺旋二级结构含量有很大损失，但β折叠片含量没有。对于经干燥的SPS配制的抗体，未检测到二级结构变化(图21和表4)。

表4.从所监视的FT-IR光谱计算出的以百分比表示的二级结构含量

因此，这些实施例揭示，在用SDS-PAGE和荧光聚集测定分析了经照射的样品后，在用供应商原制剂和用PBS配制的样品中存在显著的聚集。聚集体的形成对患者而言是严重的风险，因为其可能引起副作用和不期望的免疫应答。因此在治疗性蛋白的生产和贮存期间，保持高百分比的单体至关重要。可以显示，当在SPS中再配制治疗性抗ErbB2IgG1抗体时能够实现该重要目标。

SEC分析显示，在原制剂中两种照射类型都引起了治疗性抗ErbB2IgG1抗体的严重聚集和降解，而在SPS配制的样品中却非如此，由此确认了SDS-PAGE和荧光聚集测定所揭示的结果。令人感兴趣的是，即使在用40kGy进行照射后，SPS配制的生物分子也能实现该目标，且高分子量聚集体的含量为约2%以下。

实施例11：将吸附在表面上的人抗IL6-IgG抗体包埋在组成不同的保护溶液中

分析了多种不同组成的本发明的保护溶液的使人抗IL6-IgG抗体抵御40kGy的β照射的保护作用。

在用人抗IL6-IgG抗体包被96孔ELISA板之后，向各孔中添加保护溶液，随后对板进行真空干燥。对经干燥的板进行40kGy的β照射，并且在相应的抗IL6-ELISA中测量抗原结合活性。利用辣根过氧化物酶的底物TMB的酶促转化，在450nm处以光度测定法检测重组人IL-6与抗IL6-IgG抗体的特异性结合。在图22中，绘出了以占未处理对照的百分比表示的抗原结合活性。使用了具有7种氨基酸的组合物(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸的组合物(分别为氨基酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys，和氨基酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp)。这些实验揭示，在排除了在长期贮存时可能具有不期望的副作用(氧化敏感；吸湿)的氨基酸后，导致了保护效果减小。当将GA和/或肌肽、和/或二肽(Gly-Tyr、Gly-GLy、Gly-Gln)补充到这些组合物中时，可以提高所述组合物的保护效果。

将甘草酸补充至氨基酸混合物，特别是与二肽肌肽和其他二肽组合，导致了在不同程度上恢复了照射介导的功能损失(表5)。

	氨基酸	补充物
			制剂1	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,His,Trp
制剂2	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,
			制剂3	Ala,Gly,Glu,His,Trp
制剂4	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<5%
			制剂5	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<10%
制剂6	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<12%
			制剂7	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<18%
制剂8	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<20%
			制剂9	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,Trp	肌肽
制剂10	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽,N-乙酰基-Trp
			制剂11	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,Trp	His,β-丙氨酸(肌肽的单个成分)
制剂12	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	N-乙酰基-Trp,N-乙酰基-His,β-丙氨酸
			制剂13	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	Gly-Gly,Gly-Gln
制剂14	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽,Gly-Gly,N-乙酰基-Trp,N-乙酰基-His
			制剂15	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽,Gly-Gln,N-乙酰基-Trp,N-乙酰基-His
制剂16	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	Gly-Tyr,Gly-Gly,Gly-Gln

表5.所采用的制剂1～16的组成，在使真空干燥后的固定抗IL6-IgG抗体针对40kGy的β照射稳定时，这些制剂单独使用以及与甘草酸组合使用。

实施例12：与不同组成的保护溶液组合干燥后的重组乳酸脱氢酶在β照射后的酶活性保留情况

以酶/赋形剂为约1:2.5的比例将冻干的重组乳酸脱氢酶(LDH)溶解在多种不同组成的本发明的保护溶液中，随后冷冻干燥。在100μl体积中完成冷冻干燥，对经干燥样品进行40kGy的β照射。样品重建后，在该酶的还原态辅酶NADH被氧化成NADH⁺且底物丙酮酸同时被还原成乳酸时，在340nm处监视NADH的吸收值的减少，由此以光度测定法测量LDH的酶活性。将该酶促活性表示为占未处理对照的百分比。使用了具有7种氨基酸的组合物(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸的组合物(氨基酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys)。将甘草酸补充至氨基酸混合物，特别是与二肽肌肽和其他二肽组合，导致在不同程度上恢复了照射介导的功能损失(表6)。

	氨基酸	补充物
			制剂1	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys
制剂2	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<5%
			制剂3	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽浓度<10%
制剂4	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,	His,β-丙氨酸,N-乙酰基-Trp,
			制剂5	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,Trp	N-乙酰基-His,β-丙氨酸,
制剂6	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	肌肽,Gly-Tyr
			制剂7	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	Gly-Tyr,Gly-Gly,
制剂8	Ala,Arg,Gly,Glu,Lys	Gly-Tyr,Gly-Gly,Gly-Gln

表6.所采用的制剂1～8的组成，在使冷冻干燥的酶乳酸脱氢酶针对40kGy的β照射稳定时，这些制剂单独使用以及与甘草酸组合使用。

实施例13：凝血测定监测显示，在冷冻干燥并对经干燥的制剂进行40kGy的β照射后，失活的甲型流感病毒H1N1裂解疫苗的凝血活性得以保留

在2℃～8℃将失活的甲型流感病毒H1N1裂解疫苗的供应商原制剂对不同组成的本发明的保护溶液进行交换。重量比(疫苗/保护溶液的赋形剂)为约1:50～1:12.5。在100μl体积中完成冷冻干燥，并对冻干物进行40kGy的β照射。

在照射和重建后，在凝血测定(HA)中评价样品的功能性。如图24所示，与在供应商原制剂中干燥的甲型流感病毒裂解疫苗(其在冷冻干燥后显示出凝血活性的完全丧失)截然不同的是，在不同组成的本发明溶液中干燥的甲型流感病毒裂解疫苗在重建后几乎完全保持了凝血活性。

此外，与冷冻干燥前后的活性相比，在对经干燥的样品进行40kGy的β照射和重建后，在多种不同组成的本发明溶液中配制的冷冻干燥样品的凝血活性几乎完全保持。使用了具有7种氨基酸的组合物(氨基酸混合物1：Ala、Arg、Glu、Gly、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸的组合物(分别为氨基酸混合物2：Ala、Arg,Glu、Gly、Lys，和氨基酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp)。含有二肽肌肽、甘草酸、其他二肽或其组合的组合物产生了针对冻干介导和/或照射介导的功能性损失的最佳保护(表7)。在用二肽和/或GA代替所选择的氨基酸后，组合物的容积渗克分子浓度更低，因此可以有益于治疗用途。

表7.所采用的制剂1～18的组成，用于在不同类型的应激条件下使失活的甲型流感病毒H1N1裂解疫苗稳定。

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Claims

1.一种在干燥期间防止(多)肽解折叠和/或在干燥后诱导(多)肽(再)折叠的方法，所述方法包括将所述(多)肽包埋在水性溶液中的步骤，其中，所述溶液包含

(i)至少三种不同的氨基酸；或

(ii)至少一种二肽或三肽；

并且其中，所述溶液不含或基本不含：

(a)糖；和

(b-i)蛋白；和/或

(b-ii)变性化合物；和

(c)硅烷。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少三种氨基酸不包括：

(i-a)谷氨酸和谷氨酰胺的组合；和/或

(i-b)天冬氨酸和天冬酰胺的组合。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少三种氨基酸选自以下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)各组：

(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；

(b)具有极性不带电R基团的氨基酸；

(c)具有带正电R基团的氨基酸；

(d)具有带负电R基团的氨基酸；

(e)具有芳香族R基团的氨基酸。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述溶液包含选自以下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中每一组的至少一种氨基酸：

(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；

(b)具有极性不带电R基团的氨基酸；

(c)具有带正电R基团的氨基酸；

(d)具有带负电R基团的氨基酸；

(e)具有芳香族R基团的氨基酸。

5.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其中，所述溶液包含至少以下氨基酸：

(a)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸；

(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸；

(c)脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和/或天冬氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸；

(d)酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸；或

(e)精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和色氨酸；或

(f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸。

6.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，至少一种所述氨基酸选自由天然非蛋白原性氨基酸和合成氨基酸组成的组。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述溶液还包含皂苷或脂肪酸或它们的衍生物。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述皂苷是甘草酸或其衍生物。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述脂肪酸选自由短链脂肪酸和中链脂肪酸组成的组。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述溶液的赋形剂与所述(多)肽的重量比为1:1～500:1。

11.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述(多)肽是重组(多)肽。

12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述(多)肽具有一个或多个分子内二硫键。

13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，(再)折叠的(多)肽具有生物活性。

14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，所述干燥是冷冻干燥、风干、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥或泡沫干燥。

15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，权利要求1的(ii)中所述的至少一种二肽选自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺组成的组。